JP2000502995A

JP2000502995A - Ｂリンパ球による抗体放出を刺激する組成物および方法

Info

Publication number: JP2000502995A
Application number: JP9521404A
Authority: JP
Inventors: ジェームズジェイ．モンド; クリフォードエム．スナッパー
Original assignee: ヘンリーエム．ジャクソンファウンデーションフォーザアドバンスメントオブミリタリーメディスン
Priority date: 1995-12-06
Filing date: 1996-12-05
Publication date: 2000-03-14
Also published as: AU1146597A; EP0866871A1; CA2239868A1; WO1997020940A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、B細胞による抗体放出の刺激に有用な、顆粒球マクロファージコロニー剌激因子（GM-CSF）、インターロイキン-3（IL-3）、またはその組合せを加えることを含む組成物について記述する。組成物、薬学的組成物、ワクチン、およびワクチンアジュバントを用いる方法についても記述する。さらに、本発明は、B細胞による抗体放出を刺激することが可能な化合物の同定に有用なアッセイシステムについて記述する。

Description

【発明の詳細な説明】 B リンパ球による抗体放出を刺激する組成物および方法関連出願の相互参照本出願は、本明細書に参照として組み入れられる1993年11月10日に提出された出願第08/150,510号の一部継続出願である、1994年９月30日に提出された出願第 08/315,492号の継続出願である、1995年６月６日に提出された親係属出願第08/4 67,146号の一部継続出願である。政府の利権本明細書に記載する本発明は、本発明者らまたは代理人にいかなる特許権使用料を支払うことなく、政府の目的のために製造、認可、および使用してもよい。発明の分野本発明は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-3（IL-3）および万能（universal）T細胞エピトープ（TCE）のようなT細胞刺激ペプチドを、単独または組み合わせて含む組成物、およびインターフェロン-γ（IFN-γ）と共に、そのような因子を単独または組み合わせて含む組成物に関する。組成物は、哺乳類Bリンパ球による抗体放出の刺激に有用である。本発明はまた、Bリンパ球による抗体放出を刺激する組成物を同定するためのインビトロアッセイ系にも関する。 Bリンパ球による抗体放出の刺激は、感染症および疾患の有害な効果を予防、治療および／または改善しようとする動向において有用である。この有用性は、正常な条件下で、および免疫抑制または免疫無防備条件下で、哺乳類の免疫応答を強めるためのアジュバントにも及ぶ。新規組成物はまた、ヒト免疫系を強める他の免疫療法と併せて用いることができる。発明の背景ヒト免疫系は、病気および疾患に対してヒトの体を防御するために共に作用する、重複する機能を有する多数の異なるタイプの細胞から成る。免疫系の細胞は、複雑な多機能および相互連絡関係を有する。 GM-CSF、IL-2、IL-3、およびIFN-γは全てサイトカインである。「サイトカイン」とは、BおよびTリンパ球細胞（「B細胞」および「T細胞」）ならびにナチュラルキラー（「NK」）細胞のような、免疫系の細胞の応答を制御する化合物の一クラスである。「サイトカイン」は、インデューサーとの接触時に特定の細胞集団によって放出され、細胞間メディエーターとして作用する非抗体蛋白質の一般名である。「リンフォカイン」は、特定の抗原またはその他の刺激との接触時に、感作されたリンパ球によって放出され、細胞性または液性免疫の発揮に役立つ可溶性物質である。「サイトカイン」および「リンフォカイン」という用語は相互交換可能となった。これらの化合物の名称を単純にしようとして、1979年に開催された第二回国際リンフォカインワークショップの参加者のあるグループが、異なる集団の白血球間の伝達シグナルとして作用する蛋白質の能力に基づいて、統一命名系を開発するために、「IL」と省略される「インターロイキン」という用語を提唱した。今日まで、その全てではないがほとんどがT細胞によって産生される、21個の異なるサイトカインが同定されている。それぞれが独自の分子配置を有し、異なる作用を果たす。多くの既知のサイトカインが、B細胞において明白な活性を有することが示されている。インビトロでは、リンフォカインIL-1、IL-2、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-10、IFN-γ、およびTGF-β（トランスフォーミング増殖因子-β ）が、B細胞増殖、免疫グロブリン分泌を増強させ、さもなければ分泌されたIg のサブクラスに影響を及ぼすような働きをすることが示されている。調べたシステムに応じて、上記リンフォカインの一つまたは多くを加えれば、インビボでの抗体産生を増加させ、または分泌された抗体のアイソタイプ（すなわち、IgG、I gM、IgE、IgA等）を変化させることが示された。B細胞増殖に影響を及ぼすと報告されているリンフォカインには、IL-1、IL-2、IL-4、およびIL-10が含まれ、B 細胞分化およびIg分泌に影響を及ぼすと報告されているものには、IL-2、IL-5、 IL-6、TGF-β、およびIFN-γが含まれる。インビトロでIg分泌を増強すると報告されたサイトカインのいずれも、インビボでは顕著な役割を持たないことが示された。このように、IL-2、IL-5、IL-6またはIFN-γに特異的なモノクローナル抗体を注入しても、抗原刺激抗体産生は有意に抑制されない。このことから、生理的条件下では、B細胞分化は単に直接的なT細胞相互作用にのみ依存する、またはまだ知られていないその他のサイトカインがこの段階を媒介することが示唆される。 T細胞活性化を刺激する抗原（いわゆる胸腺依存性抗原または「TD抗原」）に対する免疫応答は、Igを分泌するためにはB細胞とT細胞との直接的な相互作用に依存するが、これは、T細胞活性化を誘導できない抗原には当てはまらない。T細胞非依存型である抗原（「TI抗原」）は、直接的なまたは間接的なT細胞の助けがなくとも高レベルの抗体産生を誘導する。このように、B細胞分化およびTI抗原に対する免疫グロブリン分泌を制御する事象は、まだ定義されていない経路に依存するに相違ない。免疫グロブリン分泌に至るB細胞分化は、コンピテント液性抗体系の基礎をなす最終的事象であるため、この段階を制御する事象またはサイトカインを定義することは、免疫応答を増強または抑制するための方法をデザインするのに非常に貴重である。本発明の速やかな認識を可能にするため、免疫グロブリン、抗体、リンパ球、 B細胞、T細胞、およびNK細胞の主な既知の機能を、バックグラウンドとして以下に簡単に説明する。同様に、B細胞増殖または抗体分泌に影響を及ぼすと報告されているサイトカイン、すなわち、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、TGF -β、およびIFN-γの既知の活性についても簡単な概要を示す。GM-CSFおよびIL- 3の既知の活性の概要も同様に提供する。参考文献材料は、基礎免疫学（Fundamn ental Immunology ）、第二版、ウィリアムE.ポール（William E. Paul,M.D.）編（Raven Press,New York 1989）；基礎免疫学（Fundamnental Immunology）、第三版、ウィリアムE.ポール（William E．Paul,M.D.）編（Raven Press,New York 1993）；インターフェロン：原理と医学的応用（Interferon:Principles and M edicalApplications ）、バロンら（S.Baron）編（ガルベストンのテキサス大学医学分校(The University of Texas Medical Branch)、ガルベストン、テキサス 1992）；サイトカインハンドブック（The Cytokine Handbook）、アンガス・トンプソン（Angus Thompson）編（Academic Press Inc.，サンジエゴ、CA 1992）；およびサイトカインハンドブック（The Cytokine Handbook）、第二版、アンガス・トンプソン（Angus Thompson）編（Academic Press Inc.，サンジエゴ、C A 1994）を含み、これらは全て本明細書に特に参照として組み入れられる。ヒトを含む哺乳類は、無数の有機体に毎日直面している。これら有機体による感染症に対して宿主を守る本質的役割を果たす免疫系の主要な成分は、液性抗体である。抗体は免疫グロブリンとしても知られる蛋白質分子で、抗体産生を刺激する異物粒子に対して強い特異性を有する。例えば、「細菌A」による全身感染では、「細菌A」に対して強い親和性で結合するが「細菌B」には結合しない抗体が誘導される。同様に、「細菌B」は、「細菌A」と交叉反応しない抗「細菌B」抗体を誘導する。免疫グロブリン（Ig）は、１対の軽（L）[低分子量]κ鎖（κまたはλ）、および１対の重（H）鎖（γ、α、μ、δ、およびε）という２対のポリペプチド鎖からなり、４つ全てがジスルフィド結合で互いに結合している、構造的に関連する蛋白質のクラスである。H鎖およびL鎖は共に、抗原結合に関与し、Ig分子が異なれば高度に可変的である領域を有する。さらに、HおよびL鎖は、非可変または定常である領域を含む。H鎖の構造的および抗原的特性に基づき、Igは、IgG、 IgA、IgM、IgD、およびIgEアイソタイプに分類される。H鎖の違いに基づくIgGのサブクラスは、IgG1等と呼ばれる。リンパ球は、リンパ節、脾臓、胸腺、扁桃、パイエル板（小腸組織）、および時には骨髄のような、体内のリンパ組織において形成される白血球細胞である。個々のリンパ球は、構造的に関係する抗原の限られたグループに反応することに関するという点において専門化されている。この関与は、所定の抗原と免疫系の最初の接触前から存在し、リンパ球の膜上の抗原特異的受容体（すなわち、免疫グロブリン）の存在によって発現される。有機体が事実上いかなる抗原にも反応する能力は、それぞれが明確な抗原に特異的な受容体を有する、異なるクローンのリンパ球が非常に大多数存在することによって得られる。その結果、リンパ球は非常に不均一な細胞集団である。リンパ球は、それらの受容体の特異性のみならず、機能的特性においても互いに異なる。大きく分けて２つのクラス、すなわちBリンパ球およびTリンパ球、のリンパ球が認識されている。これらの２つのクラスに加えて、特定の「非特異的」細胞障害反応を媒介するリンパ様細胞が知られている。これらはナチュラルキラー（NK）細胞を含む。「B細胞」としても知られるBリンパ球は、ごく部分的にわかっているに過ぎない複雑な一連の分化事象によって造血幹細胞に由来するある種のリンパ球である。B細胞は、抗体分泌細胞の前駆体であり、このように、免疫グロブリンの産生に関与する。B細胞の細胞表面受容体は、細胞表面上の発現を専門とする抗体または免疫グロブリン分子である。新たに分化したB細胞は、初め、唯一IgMクラスの表面Igを発現する。B細胞の成熟に関連して、B細胞表面には別の免疫グロブリンアイソタイプが出現する。サイトカインに反応して抗体を放出するためには、B細胞をまず活性化しなければならない。抗原による膜Ig蛋白質分子のクロスリンケージ（クロスリンケージ依存性B細胞活性化）、T細胞との直接遭遇（ヘルパーT細胞または例えば、CD4 0リガンドのようなヘルパーT細胞関連分子）、またはマイトゲンとの遭遇を含む、B細胞を活性化する多くの方法がある。そのような遭遇では、抗原はB細胞表面 Igによって認識されるエピトープを提示する。各B細胞は、同一の可変領域を有する多数の膜Ig分子を有するため、最適な膜I g媒介クロスリンケージ活性化は、細胞表面受容体の高レベルクロスリンケージによって得られ、これには細胞表面Igが認識するエピトープの１つ以上のコピーを抗原が提示することが必要である。多くの単純な蛋白質抗原はこの能力を有しないが、そのような必要条件は、多糖類ならびに、微生物およびDNAの表面のような反復エピトープを有する他の抗原によって満たされる。これらの抗原には、肺炎球菌、連鎖球菌、および髄膜炎菌のような、多くの医学的に重要な微生物の被膜多糖類がある。膜Igのクロスリンケージも同様に、B細胞の消失または不活化に至ることを示す多くのデータがある。一般に、特定のタイプの受容体クロスリンケージ事象は、それらが特異的刺激シグナルの非存在下で起これば、活性化よりむしろ不活化に至ると考えられている。多糖類上に発現される高度反復エピトープは、おそらく受容体媒介刺激の大きさのため、共刺激が存在しなくとも活性化に至る可能性がある。 Tリンパ球、または「T細胞」は、胸腺由来の、長期生存する（数ヶ月から数年）免疫学的に重要な細胞で、細胞性免疫に関与する。T細胞は、「ヘルパーT細胞」、「サプレッサーT細胞」、および「キラーT細胞」として知られる機能的に異なる集団からなる。遅延型過敏症および関連する免疫現象に関与するT細胞もまた知られている。ナチュラルキラー細胞、または「NK細胞」は、特定の「非特異的」細胞障害反応を媒介するリンパ様細胞である。そのような非特異的細胞障害反応は、TまたはB細胞によって用いられる系とは異なる認識系を用いて、特定のタイプの腫瘍細胞を殺す。接触相互作用を通じて一つの細胞タイプから他の細胞タイプを殺すことは、免疫系の自己防御の主なイフェクター効果の一つを構成する。これらの細胞に加えて、他の化合物、サイトカインは宿主の防御に重要な役割を果たしている。サイトカインの一つのグループがインターロイキンである。 IL-1は、主として炎症性サイトカインであるが、IL-2および他のサイトカインは主としてリンパ球の増殖因子である。IL-1は、単球によって合成されるポリペプチドホルモンである。炎症、損傷、免疫チャレンジ、または感染症の際にIL-1 が産生されるが、その多様な生物学的特性のため、このサイトカインは疾患の発病に影響を及ぼすように思われる。動物では、IL-1は低血圧症およびショックの強力な誘発物質である。IL-1は視床下部に作用して発熱を引き起こし、および骨格筋に直接作用して蛋白質異化を促進する。 T細胞増殖因子としても知られるIL-2は、Tヘルパーおよびサプレッサーリンパ球の双方によって産生されるリンフォカインおよびペプチドホルモンである。このサイトカインはT細胞、B細胞、NK細胞、リンフォカイン活性化キラー（LAK）細胞、単球、マクロファージ、および乏突起膠細胞の増殖および分化に直接作用を及ぼす。多コロニー刺激因子としても知られるIL-3は、造血系内の多数の標的細胞に作用する。このサイトカインは造血増殖因子（HPGF）のいずれに対しても最も広い標的特異性を有し、造血幹細胞（すなわち、血球の前駆体）の産生および分化を刺激することができ、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、巨核球、および赤血球系細胞を生じる。 IL-3とB細胞との関連は、本発明より以前は不明であった。実際1994年の時点では、IL-3の標的細胞の範囲には、TおよびB-リンパ球系列に関与する細胞は含まれないと考えられており、IL-3がB細胞の発達に重要な直接作用を有するという強力な証拠はなかった。シュレーダー（J.W.Schrader）、「第５章：インターロイキン-3」サイトカインハンドブック（The Cytokine Handbook）第二版、アンガス・トムソン（Angus Thomson）編、84頁（Academic Press，New York，1994）。 IL-3はT細胞および肥満細胞によって合成されるが、B細胞によるIL-3の分泌は報告されていない。いくつかの報告により、IL-3はSAC（ポリクローナルアクチベーター）およびIL-2によって活性化されたヒトB細胞によるIg分泌の適度の増強を誘導することができることが証明された。例えば、シャ（Xia）ら「ヒト組換え型IL-3は正常なB細胞の増殖因子である」、J.of Inmmunology,148,491〜497 （1992）は、IL-3がB細胞に富む細胞集団の増殖を増強すると報告した。同様に、タドモリら（Tadmori）「ヒト組換え型IL-3はB細胞分化を刺激する」、J.of I mmunolog y,142,1950〜1955（1989）は、IL-3が、B細胞を含む扁桃細胞からの、または細菌抗原によって活性化される末梢血由来のB細胞に富む集団における、I gG分泌を刺激すると報告した。さらに、マツモトら（Matsumoto）「組換え型インターロイキン-3による抗IgM活性化非アトピー性ヒトB細胞におけるIgE合成の誘導」、Int.Arch.Allergy Appln.Immunol.89,24〜30（1989）は、ヒト組換え型 IL-3が正常なB細胞またはTおよびBリンパ球の混合物によるIgE合成を増強し、IL -1、IL-2、IL-5、IL-6、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、およびIFN-γはIgE合成を誘導できないことを報告した。マツモトら（Matsumoto）はまた、抗IL-3抗体を加えてもその活性を逆転できないため、IgE合成の誘導に関与するT細胞上清中の因子としてIL-3を結論的に特定することができないと述べた。これらの結果は、細胞増殖におけるIL-3媒介増強に起因していた。これらの試験では、B細胞は電子的にソーティングされておらず、したがって、高度に精製されていなかった。このように、Ig増強効果は、集団に数多く混入している非B 細胞、非T細胞に対するIL-3の作用を反映する可能性があり、したがってこれらの実験からIL-3がB細胞に直接作用しているか否かを決定することができない。さらに、先行の実験では、B細胞はサイズに従って分画されていなかった。このように、B細胞の前活性化状態について考えられる役割は扱われていなかった。本発明とはさらに対照的に、キモトら（Kimoto）「組換え型マウスIL-3はインビボでTまたはBリンパ球発生を刺激することができないが、T細胞依存型抗原に対する免疫応答を増強する」、J.of Immunology，140，1889〜1894（1988）は、マウス組換え型IL-3を装填した浸透圧ミニポンプを有するマウスが、リンパ様臓器においてBおよびT細胞の総数に増加を示さないと報告した。さらに、キモトら（Kimoto）は、IL-3がリンパ球またはそれらの前駆体に直接作用しないが、おそらくアクセサリ細胞に作用することによって、T細胞依存型抗原に対する液性免疫応答を増強する可能性があることを示唆した。 IL-4はB細胞刺激因子1（BSF-1）およびB細胞分化因子としても知られる糖蛋白質である。これは、B細胞増殖、Igクラススイッチ、T細胞増殖および分化、マクロファージ活性化を共刺激し、肥満細胞増殖を制御、および造血前駆細胞を共刺激するように機能する。 B細胞増殖因子II（BGF-II）、T細胞代行因子、IgA-増強因子および好酸球コロニー刺激因子としても知られるIL-5は、Tリンパ球および肥満細胞によって産生される糖蛋白質である。このサイトカインは、骨髄における好酸球コロニーの分化を促進すると共に、コロニー刺激因子としての２つの機能を有する。IL-5は、インビボで抗原によってプライミングされたB細胞による特異的インビトロ抗体産生を誘導する。IL-5はインビトロで分化因子として作用するが、インビボでは分化因子として作用しないように思われる。 BSF-II、ハイブリドーマ／プラスマサイトーマ増殖因子、インターフェロン- β2、および肝細胞刺激因子としても知られるIL-6は、リンパ様および非リンパ様細胞の双方によって産生される糖蛋白質である。このサイトカインは、免疫応答、急性期反応、および造血を制御する。IL-6は、mRNAレベルでB細胞株に作用し、分泌型のIgの生合成を誘導する。IL-5に加えて、IL-6もまた、非常に厳密な条件下で分化因子として機能することが示されている。調べた他の全ての既知の T細胞またはマクロファージ由来因子は、増殖因子を加えなければB細胞を活性化してIgを分泌させることができない。サイトカイン合成阻害因子としても知られるIL-10は、T細胞、マクロファージ、および他の細胞タイプによって生成される。このサイトカインは、肥満細胞およびB細胞の増強または刺激に加えて、サイトカイン合成およびいくつかの微生物活性を含む、いくつかのマクロファージ機能を阻害する。IL-10は、抗CD40抗体または抗原受容体のクロスリンクによって活性化されるヒトB細胞の強い増殖を引き起こす。インターロイキンに加えて、他のサイトカインの特徴付けもなされている。コロニー刺激因子（CSF）は造血に主に関するグループの因子である。それらは、インビトロで骨髄細胞のクローン的増殖を刺激する蛋白質として定義される。顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）は、造血細胞の増殖または分化を調節する糖蛋白質増殖因子である。この増殖因子は、異なる条件下で、 T細胞、マクロファージ、内皮細胞、間質細胞、繊維芽細胞、肥満細胞、およびその他を含む多くの異なる細胞によって産生される。GM-CSFの主な作用は、顆粒球-マクロファージ集団における、生存、分化、ならびに増殖および機能活性の制御を含む。本発明より以前には、GM-CSFがB細胞による抗体の放出を刺激することができることを示す報告はない。最後に、生体免疫系において機能するもう一つのクラスのサイトカインは、インターフェロン（IFN）である。IFNは、細胞に対してその他の多くの重要な作用を発揮することに加えて、ウイルス複製を阻害することによって、抗ウイルス防御の第一線への主な関与物質である。IFNは感染から細胞を防御するように直接的には作用しない。むしろ、それらは、隣接細胞においてウイルスの増殖を停止させる蛋白質の生成を刺激し、このようにして感染から細胞を保護する。 IFNは、細胞の起源および誘導方法に基づいて、３つのグループ、α、βおよびγに分類される。IFN-αおよびIFN-βの産生は専門化された細胞機能ではなく、おそらく有機体の全ての細胞がこれらのIFNを産生することが可能である。いかなる細胞にも起こりうるIFN-αおよびIFN-β合成とは対照的に、IFN-γの産生はT細胞およびNK細胞の機能である。IFN-γ誘発物質は全て、ポリクローナル的に（マイトゲンまたは抗原）、またはクローン的に制限された抗原特異的な方法でT細胞を活性化する。ヒトIFN-γは活性化ヒトB細胞の増殖を促進し、ヒト B細胞の培養において、IL-2と相乗作用して免疫グロブリン軽鎖合成を増強することができる。＊＊＊＊＊様々なヒト免疫細胞の機能を記述した短い考察、およびIL-1、IL-2、IL-3、IL -4、IL-5、IL-6、IL-10、GM-CSF、およびIFN-γの既知の活性から、ヒト免疫系が極めて多様であることが示される。しかし、このレベルの知識をもってしても、免疫系の複雑さを完全に理解することはできない。数多くのギャップが依然として存在する。例えば、サイトカインが免疫系の細胞の反応を制御することによって、細胞間メディエーターとして作用することを除いて、サイトカインの特性に関して一般的言明を行うことは不可能である。このように、当技術分野には、免疫系をよりよく理解し、免疫障害を治療するさらなるおよび優れた方法を提供するための必要性が依然として存在する。発明の概要本発明は、新規かつ改良された免疫療法に対する当技術分野の必要性を満たす。IL-2、IL-3、GM-CSF、万能TCE、およびIFN-γを用いた新規組成物および方法は、現在の免疫療法のアジュバントと共に、免疫障害の改善および新規治療を可能にする。本発明は、B細胞による抗体放出の刺激に有効な量が存在する、GM-CSFおよびI L-2またはIL-3を、単独または組合せのいずれで含む組成物を目的とする。本発明のもう一つの目的は、得られた複合体が蛋白質と結合し、その複合体がさらに多糖類と結合される、B細胞による抗体放出の刺激に有効な量が存在する、GM-CS FおよびIL-2またはIL-3を、単独または組合せのいずれで含む組成物である。本発明はまた、インビトロでのTもしくはB細胞増殖またはインビトロ抗体産生によって確立されたように、免疫応答に関わる細胞の応答性を増加させることによって免疫反応性を増強させることができるその他のリンフォカインの併用を含む。 GM-CSF、IL-2、またはIL-3活性を保持しているGM-CSF、IL-2、またはIL-3の分子的に操作された断片もそれぞれ、本発明に用いることができる。本発明のもう一つの目的は、その全てがB細胞による抗体放出の刺激に有効量存在する、GM-CSF、IL-2、またはIL-3を、単独または組合せでIFN-γと共に含む組成物である。本発明のもう一つの目的は、多糖類にさらに結合しうる、蛋白質に非抗原特異的に結合された万能TCEを含む組成物である。もう一つの態様において、万能TCE は、多糖類に直接的に結合される。本発明のもう一つの目的は、新規組成物および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物である。 B細胞による抗体放出を刺激するために、GM-CSF、IL-2、IL-3、IFN-γ、および万能TCEを含む新規組成物を利用することもまた発明に含まれる。B細胞による抗体放出の刺激法を用いて、例えば、正常または免疫無防備状態でのワクチン接種に対する哺乳類の免疫応答を増強することができる。本発明のもう一つの目的は、ワクチンのアジュバントとしての新規組成物の利用である。例えば、血液系に存在する免疫細胞の迅速な刺激を可能にするように、多くのワクチンが現在静脈内または筋肉内に投与されている。新規組成物を、担体分子に共有結合された融合蛋白質として、混合された融合蛋白質として、またはその他のあらゆる組合せとして、投与されるワクチンと組み合わせることによって、抗体反応の程度は全身および局所レベルの双方で増加しうる。本発明のもう一つの目的は、抗体産生が、自己免疫疾患のように病原性であるような条件でのGM-CSF、IL-3、およびIFN-γの中和である。組成物を用いて、インビトロまたはインビボにおけるモノクローナル抗体産生を最適にすることもできる。例えば、動物をインビボで抗原および組成物で感作することができる。または、リンパ球のインビトロでの刺激または感作による抗体の産生は、新規組成物の存在下で増強することができる。これは、ヒトモノクローナル抗体の産生には特に有用である。本発明はまた、B細胞による抗体放出の刺激に有用な組成物の同定を可能にする新規アッセイ系を目的とする。インビボ抗体刺激を模したこのアッセイ系には、デキストラン結合型抗Ig抗体と高度精製B細胞とが含まれる。抗Igデキストラン結合物は、インビボで抗原によって誘導されるB細胞の活性化に匹敵するメカニズムによって、膜Igを通じてB細胞を有効かつポリクローナル的に活性化させる。本発明のその他の目的および利点は、以下の説明に一部記載し、本説明から一部明らかとなると思われ、または本発明を実践することにより理解されると思われる。本明細書に組み入れられ、その一部を構成している添付の図面および表は、本説明と共に本発明の原理を図示し、説明するのに役立つ。図面の簡単な説明図１：様々な培地におけるB細胞によるIgM分泌（ng/ml）を測定した。培養培地は図面の左側に沿って記載する。調べた組成物は、デキストラン結合型抗IgD抗体、IL-1、およびIL-2を含む培地において最高のIgM分泌を示した。この培地に親出願に記述した細胞培養からの上清、RA5-SN、およびGM-CSF、またはIL-3を加えた。対照組成物もまた測定した。RA5-SN上清は、GM-CSFおよびIL-3を共に含むが、調べた他の組成物と比較してB細胞による有意なIgM分泌を示した。図２：様々な濃度のIL-3またはGM-CSFの存在下または非存在下において、B細胞をデキストラン結合型抗IgD抗体（３ng/ml）＋IL-1（150 U/ml）＋IL-2（150 U/ ml）によって活性化した。IgM分泌は培養開始後６日目にELISAによって測定した。図３：GM-CSFおよびIL-3を様々な濃度で加えて、活性化B細胞によるIgM分泌（ng /ml）を測定した。GM-CSFを10 U/mlおよびIL-3を約３ U/ml加えると、約4650 ng /mlという最大IgM分泌が得られた。図４：IL-3（10 U/ml）またはGM-CSF（10 U/ml）の存在下または非存在下で、B 細胞をデキストラン結合型抗IgD抗体（３ ng/ml）＋IL-1（150 U/ml）＋IL-2（1 50 U/ml）によって活性化した。さらに、抗IL-3（10 μg/ml）および／または抗 GM-CSF（10 μg/ml）抗体を加えた。抗IL-3または抗GM-CSFを加えない対照も作製した。IgM濃度は培養開始後６日目にELISAによって測定した。図５：AF7上清におけるデキストラン結合型抗IgD抗体活性化B細胞について、活性化B細胞によるIgH分泌（ng/ml）を測定した。IgM分泌は以下の２つ以上を含む様々な培地中で測定した：IL-1、IL-2、αIL-3、およびαGM-CSF。図６：IL-3（100 U/ml）および／またはGM-CSF（100 U/ml）の存在下または非存在下で、B細胞をデキストラン結合型抗IgD抗体（３ ng/ml）＋IL-1（150 U/ml）＋IL-2（150 U/ml）によって活性化させた。生存細胞（トリパンブルーを排除した細胞）を培養開始後４日目に血球計算盤を用いて計数した。複製培養における IgM濃度は培養開始後６日目にELISAによって測定した。データは２つの培養の平均値±平均の標準誤差として表す。図７：IL-3（100 U/ml）＋GM-CSF（100 U/ml）の存在下または非存在下で、B細胞をデキストラン結合型抗IgD抗体（３ ng/ml）＋IL-1（150 U/ml）＋IL-2（150 U /ml）によって活性化した。複製培養中のIgM濃度を、対照組成物、０時間にIFN- γを加えた組成物、および24時間にIFN-γを加えた組成物について、ELISAによって測定した。データは２つの培養の平均値±平均の標準誤差として表す。図８：酵母発現ベクターの概略図。図９：ニッケルアガロースカラムおよびサイジングゲルでの精製前後のプロテインA-IL2（PA-IL2）産物を含むクーマシーブルー染色ゲル。図10 ：抗IL-2（左側のゲル）および抗プロテインA（PA）（右側のゲル）でブロットしたプロテインA-IL2（PA-IL2）のイムノブロット。IL2およびPAは対照として泳動させる；プロテインAは、プロテインAの切断型で融合を行ったため、融合産物より高い分子量で泳動する。図11 ：融合産物におけるIL2の機能的活性。IL2反応性であるCTLL株５×10³個のH T2細胞を、IL2またはプロテインA-IL2と共にし、48時間後にチミジンの取り込みを測定した。図12 ：A）精製プロテインA-IL2（PA-IL2）融合産物、B）プロテアーゼを含まない酵母からのPA-IL2を含む非精製濃縮上清、のサイズ排除HPLC（ベックマンSEC 2000）。上清については精製は行わず、より低い分子量の切断産物と共に「クリーナー」産物がプロテアーゼ・フリーのトランスフェクト酵母において得られたことを示している。図13 ：精製プロテインD（レーン１および２）ならびに分子操作した万能TCE-プロテインD（TCE-プロテインD、レーン４）およびプロテインA（対照として、レーン５）をSDS PAGE上で流し、クーマシーブルーによって染色した（上段パネル）。第二のゲルは抗プロテインDとイムノブロットした（下段のパネル）。図は、蛋白質およびTCE-プロテインDが均一になるまで精製されたことを示している。好ましい態様の説明本発明は、単独および併用してB細胞による抗体分泌を100倍増強させるサイトカインの組成物について記述する。組成物は、B細胞による抗体の放出を刺激するのに有効な量の、IL-2、IL-3、およびGM-CSFを、単独または組み合わせて含む。IFN-γと共に、全て、B細胞による抗体の放出を刺激するのに有効な量で存在する、IL-2、IL-3、およびGM-CSFを単独または組み合わせて含む組成物も本発明に含まれる。より好ましくは、組成物は、CD40リガンド（CD40L）、または少なくとも一つの別のサイトカイン、またはその組合せをさらに含む。また、より好ましくは、組成物は、CD40リガンド（CD40L）、万能TCE、または少なくとも１つの他のサイトカイン、またはその組合せをさらに含む。万能TCEとは、非抗原特異的な強いT細胞刺激ペプチドで、B細胞エピトープを有しないものを意味する。強い T細胞刺激とは、当業者に既知のT細胞増殖アッセイにおいて反映されるように、強力にT細胞を刺激できることを意味する。ペプチドとは、約８個〜20個のアミノ酸残基の分子、好ましくは11〜18残基の分子を意味する。非抗原特異的とは、ペプチドが、多様な抗原特異性にわたって、遺伝的背景が異なるT細胞を刺激することを意味する。B細胞エピトープを有しないことは、エピトープがB細胞によって認識されず、したがって、エピトープに対して特異的な抗体産生を誘導しないことを意味する。ペプチドは蛋白質に化学結合していてもよく、または当業者に周知の方法に従って融合蛋白質を構築してもよい。ペプチドは当業者に既知の方法に従って、CDAPを含む多糖類に結合してもよい。最も好ましくは、組成物は、GM-CSF、IL-3、またはその組合せ、IFN-γ、CD40 L、およびIL-1＋IL-2を含む。もう一つの最も好ましい態様において、組成物は、GM-CSF、IL-3、またはその組合せ、IFN-γ、CD40L、万能TCEおよびIL-1＋IL-2 を含む。また、最も好ましくは、組成物は、GM-CSF、IL-3、IFN-γ、CD40L、万能TCE、およびIL-1＋IL-2、または蛋白質に結合されさらに多糖類に結合された、上記のいくつかもしくは全ての組合せを含む。 IL-2またはIL-3またはGM-CSFによって媒介されるIg分泌の増強は、典型的に10 〜50倍の範囲内で、IL-3とGM-CSFを併用すれば100倍までの増強が誘導される。好ましくは、GM-CSFおよびIL-3は、インビトロで約１〜約10 U/mlで存在する。インビボの量は、当技術分野で周知のように、しかるべくスケールアップされる。より好ましくは、GM-CSFおよびIL-3は約10〜約100 U/mlで存在し、特に約100 U/mlで存在する。 B 細胞刺激剤としてのIL-3、GM-CSF、およびIFN-γの同定本発明より以前には、GM-CSFまたはIL-3が、B細胞に直接作用して抗体の放出を刺激すること、またはGM-CSFおよびIL-3がB細胞に対して相乗的におよび直接的に作用して抗体の放出を刺激することは知られていなかった。その上、GM-CSFはこれまで、成熟B細胞機能の直接制御には関与していなかった。同様に、IFN-γを刺激後24時間に加えても、それ自身は最適な抗体分泌を刺激することができないこと、またIL-3およびGM-CSFを単独または併用した場合に活性がさらに増強されることもわかっていなかった。親出願第08/150,510号において記述された組成物には、IL-3およびGM-CSFが含まれていた。初期の実験で、電子的にソーティングされた高度精製B細胞のIg分泌反応は、少数の「非T非B」細胞を含むB細胞に富む集団より有意に低いことが決定された。これらの所見に基づき、最初の出願は、NK細胞および／またはNK細胞由来サイトカインが、抗Igデキストラン刺激B細胞においてIg分泌を増強しうることを示した。親出願はまた、B細胞によるIg分泌を増強するT細胞クローン（TH1またはTH2）に由来する上清を開示した。実験で、この増強がIL-1、IL-2、IL-5、IL-6、またはIL-10によるものではないと決定された。驚くべきことに、分化誘導活性は、G M-CSFおよびIL-3の存在によることが発見された。GM-CSFおよびIL-3を抗Igデキストラン刺激細胞に加えると、Ig分泌が誘導された。逆に、抗GM-CSFおよび／または抗IL-3を加えると、T細胞上清の刺激活性は減少した。 Ig分泌はさらに、IL-2を加えることによって、IFN-γを培養24時間後に加えることによって、またはIFN-γ＋IL-2を加えることによってさらに増強しうることが判明した。Ig分泌の最高レベルは、培養開始時にIL-2、IL-3、およびGM-CSFを抗Igデキストラン刺激細胞に加えた場合、ならびにIFN-γを１日後（抗Igデキストランによる刺激後24時間）に加えた場合に誘導された。B細胞活性化の直後にI FN-γを加えても、刺激効果は増強されないか、またはIL-3もしくはGM-CSFの刺激効果の増強が最小である。このように、IFN-γを加える時期は、B細胞による抗体の放出をさらに増強するために重要である。この知見は本発明より以前には報告されていなかった。 IL-3もしくはGM-CSF、またはIL-3＋GM-CSFの活性によりTH1またはTH2由来上清の分化活性が説明できるか否か調べるために、抗IL-3または抗GM-CSF抗体の中和量を加えることによるIg分泌に及ぼされる効果を分析した。各抗体はIg分泌の有意な抑制を媒介したが、抗IL-3および抗GM-CSFの併用では、TH1-またはTH2由来上清の存在下で抗Igデキストラン刺激細胞のIg分泌の80％以上の抑制を誘導した。 IL-3およびGM-CSFは、B細胞によるIg分泌を増強しうるという所見および抗IL- 3＋抗IL-GM-CSFはIg分泌を抑制できるという所見は、完全に予想外であった。その上、培養開始後24時間に加えたIFN-γが、IL-3およびGM-CSFの刺激効果を増強することも驚くべきことであった。これらの所見はこれまで報告されていなかった。薬学的組成物薬学的組成物もまた本発明に含まれる。該組成物は、有効量のIL-3およびGM-C SFの、単独または組合せのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。薬学的に許容される担体と共に、有効量のIL-3およびGM-CSFの単独または組合わせと、有効量のIFN-γとを含む薬学的組成物もまた本発明に含まれる。治療は、薬学的組成物を静脈内、腹腔内、体内注射、関節内、脳室内、くも膜下、筋肉内、皮下、鼻腔内、膣内、経口によって、またはいかなるその他の適当な投与法によって投与することを含む。該組成物はまた、特定の部分へ筋肉内または皮下のいずれかによる注射のように、局所的に投与してもよい。 GM-CSF、IL-3、およびIFN-γについては、いかなる薬学的に許容される担体も用いることができる。担体は、水、石油、動物油、植物油、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油等を含む油のような滅菌液体であることができる。静脈内投与の場合、水が好ましい担体である。生理食塩液、水溶性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、特に注射可能な溶液の場合、液体担体として用いることができる。適当な薬学的担体は、参照として組み入れられる、「レミントンの製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」、第18版（ゲナロ（A．Ge nnaro）編、Mack Pub.，Easton，Pa.，1990）に記述されている。組成物を含むワクチンアジュバント本発明はまた、本発明の組成物を含むワクチンアジュバントを包含する。多くのワクチンが現在、血液系に存在する免疫細胞を迅速に刺激するため、静脈内または筋肉内投与されている。新規組成物を投与すべき薬物と併用することによって、抗体反応の程度は局所的にも全身的にも増加する。インビトロアッセイでは、抗IgMまたは抗IgD抗体は、デキストランのような多価の形状で存在する場合、効率よく作用して全てのB細胞を活性化する。この高レベルの活性化により、高度精製B細胞の利用と併せて、B細胞による抗体の放出を刺激する化合物の同定が可能となる。しかし、この反応はインビボでは望ましくない。患者において、目標は、抗原に対して特異的な受容体を有するごく少数のB細胞だけを活性化することである。ワクチンの特異的抗原は、特異的B細胞受容体とクロスリンクするように作用する。対照的に、抗Igデキストランを用いたインビトロモデルは全ての抗原受容体とクロスリンクするように作用する。ワクチンアジュバントとして用いる場合、好ましくは、本発明の組成物は、デキストランまたは細菌の被膜多糖類のような、多価担体分子と結合させる。肺炎球菌、連鎖球菌、および髄膜炎菌の被膜多糖類が好ましい。GM-CSF、IL-2または IL-3、GM-CSFもしくはIL-3活性を保持しているGM-CSF、IL-2もしくはIL-3の分子的操作断片、またはその組合せは、独立して多価担体に結合させることができる。または、GM-CSF、IL-2、およびIL-3を共に融合して、または別の蛋白質と融合して融合蛋白質を形成することができ、これを同様に多価担体に結合することができる。ワクチンのその他の多様な変形は当業者には明らかであると思われる。本出願は、サイトカインの遅いが長期にわたる輸送を可能にする抗サイトカイン-サイトカイン複合体の利用を含む。複合体はワクチンの抗原との混合物として投与することができ、または複合体はワクチンの抗原に結合することができる。さらにもう一つの態様において、ワクチンアジュバントは、CD40L、GM-CSF、I L-3、またはIFN-γ以外の１つ以上のサイトカイン、またはその組合せを含む。C D40Lおよび１つ以上のサイトカイン、または万能TCEもまた、多価担体に結合させることができる。結合型ワクチンにおいて用いられる組成物結合型ワクチンを形成するためには、ワクチンの抗原および本発明の組成物を、デキストランまたは細菌の被膜多糖類のような、多価担体分子に共有結合することができる。肺炎球菌、連鎖球菌、および髄膜炎菌の被膜多糖類が好ましい。抗原は、ワクチン接種すべき疾患に対して特異的なペプチドまたは蛋白質である。ワクチン投与時の液性免疫応答をさらに最適にするため、CD40もしくは少なくとも１つの他のサイトカイン、または万能TCE、またはその組合せを多価担体に結合させることができる。表IIIは、本発明の組成物を用いる典型的なワクチンを示す。表に記すように、いくつかのワクチンは結合型ワクチンである。結合の方法は当業者に周知で、参照として組み入れられる、ブランズウィックら（Brunswick）、J ．Immunol.14 0 :3364（1988）のヘテロライゲーション法；ウォン（Wong S.S.）「蛋白質結合とクロスリンクの化学（Chemistry of Protein Conjugates and Crosslinking）」、CRC Press，Boston（1991）；およびブレンクレーら（Brenkeley）「色素、ハプテン、およびクロスリンク剤による蛋白質結合物の調製法の簡単な概要（Br iefSurvey of Methods for Preparing Protein Conjugates With Dyes，Haptens and Cross-Linking Agents）」、Bioconjugate Chemistry、3、１号（1992年１月）を含む。好ましい共有結合法は、その開示が本明細書に参照として特に組み入れられる、1993年９月23日に提出された、いわゆる「CDAP」結合法の出願第07 /124,491号の一部継続出願である、1995年３月22日に提出された出願第08/408,7 17号の一部継続出願である、1995年６月７日に提出された出願第08/482,661号に述べられている。組成物の使用法本発明のさらなる目的は、B細胞による抗体放出を刺激するために、IL-2、IL- 3、およびGM-CSFを単独または組み合わせて含む組成物、ならびにIFN-γと共に、IL-2、IL-3、およびGM-CSFを単独または組み合わせて含む組成物の利用である。治療に適当な宿主には、適当ないかなる哺乳類も含まれる。好ましい宿主は、新生児、成人、および免疫欠損患者を含むヒトである。組成物は、適当ないかなる投与法でも投与することができる。組成物の好ましい投与法は、皮下、静脈内、鼻腔内、粘膜経路、経口、筋肉内、またはその組合せを含む。用いる化合物の投与量は、年齢、個人差、症状、投与方法等に応じて変化し、当業者には容易に決定することができる。GM-CSFおよびIL-3の典型的な投与量は、ネムナイティス（J.Nemunaitis）、「顆粒球マクロファージコロニー刺激因子：前臨床開発から臨床応用までのレビュー（Granulocyte-macrophage-colony-st imulating factor：a review from preclinical development to clinical appl ication）」、Transfusion,33,70〜83（1993）；リーシュケら（Lieschke）、「顆粒球コロニー刺激因子と顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Granulocyt e-Colony-Stimulating Factor and Granulocyte-Macrophage-Colony-Stimulatin g Factor（前半）」The N.Eng J.of Med．327,28〜35（1992）；リーシュケら（ Lieschke）、「顆粒球コロニー刺激因子と顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Granulocyte-Colony-Stimulating Factor and Granulocyte-Macrophage-Col ony-Stimulating Factor（後半）」The N.Eng J.of Med．327,99〜106（1992）；シュルツら（Schulz）「組換え型インターロイキン-3および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子によるアジュバント療法」、Pharmc.Ther．52.85〜94（19 92）；ホールツァーら（Hoelzer）「新生物疾患患者の治療におけるインターロイキン3単独とGM-CSFとの併用」、Seminars in Hematology，28，suppl.2（４月）17〜24（1991）に示される。組成物を用いた中和方法本発明のもう一つの目的は、狼瘡、全身性ループスエリテマトーデス（SLE）、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、血管炎、グレーヴス病、アレルギー反応等のような自己免疫疾患におけるように、抗体の産生が病原性である条件下でGM -CSF、IL-3、およびIFN-γの活性を中和する方法である。中和ワクチンの構築に関しては、サイトカインに対する抗体を作製する。当業者は、特異的抗体を得るためのよく確立された方法に通じている。次に抗体を患者に投与する。抗体の半減期を増加させるため、抗体を担体に結合することができる。モノクローナル抗体産生を最適にするための組成物の利用法組成物を同様に用いて、インビトロまたはインビボでのモノクローナル抗体産生を最適にすることができる。例えば、関係する抗原および組成物を含む溶液をインビボで注射することによって、動物を感作することができる。組成物はB細胞による抗体の放出を刺激するため、特定の抗原と結合した組成物の投与により特異的抗原に対する抗体産生が最適化される。当業者は、そのような免疫のための技法と共に、本明細書の開示に照らして抗体を誘導し、その放出を刺激するために必要な抗原および組成物の用量を熟知していると思われる。または、抗体産生のためのリンパ球のインビトロ刺激または感作は、新規組成物の存在下で増強することができる。そのような刺激および感作の教示は、本明細書の開示に照らして適用する抗原および組成物の適当量の決定と共に、当技術分野の通常技術の範囲内である。該方法はヒトモノクローナル抗体の産生に特に有用である。B 細胞による抗体の放出を刺激するのに有用な組成物を同定するアッセイ系本発明のさらなる態様は、インビボ抗体刺激を模する新規インビトロアッセイ系の開発である。このアッセイ系では、B細胞による抗体の放出を刺激する組成物の同定が可能である。休止B細胞は抗体を放出しないため、抗体放出を測定する前に、まずそれらを活性化させなければならない。本発明において、抗IgMまたは抗IgD抗体は、特に参照として組み入れられる、スナッパーら（Snapper）「マウス辺縁帯および濾胞B細胞による増殖、Ig分泌、およびIgクラススイッチのインビトロ比較分析（C omparative In Vitro Analysis of Proliferation，Ig Secretion，and Ig Clas s Switching by Murine Marginal Zone and Follicular B Cells）」、J.of lmm unology .150.2737〜2745（1993）に述べるように、高分子量デキストラン（すなわち、MW＝2.0×10⁶）に共有結合し、多糖類担体上に多価抗原を作製する。この技法は、２価の抗Ig分子を、ピコモル濃度においてもB細胞膜Igを通じて持続的および反復的にシグナル伝達を誘導することができる、極めて刺激的な多価結合物に変換する。抗Igデキストラン結合物は、高レベルのB細胞増殖を、非結合抗I gによって刺激されたよりも10,000倍低い濃度である、１ pg/mlもの低濃度で刺激する。B細胞の活性化は、抗原特異性に関わりなく起こる。抗Igデキストランは、サイトカインの非存在下では、休止B細胞による抗体放出を刺激しない。B細胞による抗体の放出を刺激するサイトカインを加えると、高レベルのIg分泌が認められる。これまで、抗原受容体を通じてのB細胞の活性化は、例えば、デキストランのような高分子量多糖類に結合した抗免疫グロブリン（Ig）抗体を用いて最適に得ることができることが知られていた。しかし、これまでアッセイで用いられるB細胞は高度に精製されていなかったため、B細胞による抗体の放出を刺激する組成物をスクリーニングすることは不可能であった。B細胞上清中に混入している細胞はしばしば、B細胞による抗体放出を刺激することができる十分量のサイトカインを分泌する。したがって、調べた組成物の刺激効果が、加えられた組成物または混入物質によるものであるか否かを決定することができなかった。対照的に、本発明は、アッセイ系に高度精製B細胞を用いる。好ましくは、B細胞は電子的にソーティングして高度精製B細胞を得る。高度精製B細胞を用いれば、多価mIgクロスリンクを通じて活性化されたB細胞による抗体の放出に及ぼす物質の刺激効果を測定することが可能になる。この系は本発明より以前には記述されていなかった。実際、このアッセイ系の発見前には、B細胞による抗体の放出に及ぼす唯一の特徴的な刺激活性について組成物を試験することができなかった。＊＊＊＊＊本発明の予想外の効果は、以下の実験に示し、図１〜12に描写する。本発明を全般的に記述してきたが、例示の目的でのみ本明細書に提供され制限を意図するものではない特定の実施例を参照することによって、より完全な理解が得られる。実施例１この実施例は、親出願で報告された細胞上清のB細胞抗体刺激活性が一つの既知のサイトカインによるものではなかったことを示している。材料および方法：国立癌研究所（Naitonal Cancer Institute）（フレデリック、MD）から雌性DBA/2マウスを得て、７〜10週齢で使用した。用いた培養培地は、10％ウシ胎児血清（シグマ、セントルイス、MO）、L-グルタミン（２ mM）、2-メルカプトエタノール（0.05 mM）、ペニシリン（50 μg/ml）およびストレプトマイシン（50 μg/ml）を補添したRPMI1640（バイオフルーイッズ(Biofluid s)、ロックビル、MD）であった。デキストラン結合抗IgD抗体は、Hδ^a/1（モノクローナルマウスIgG2b（bアロタイプ））抗マウスIgD（ａアロタイプ）を高分子量デキストラン（２×10⁶ MW ）に結合することによって調製した。約９個のデキストラン結合抗IgD抗体を各デキストラン分子に結合させた。FITC-抗-CD3εmAb（2C11）はファーミンゲン(Pharmin gen)（サンジエゴ、CA）から購入した。 PE-標識アフィニティー精製ポリクローナルヤギ抗マウスIgM抗体は、サザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ(Southern Biotechnology Associates)（バーミンガム、AL）から購入した。マウス組換え型IL-1およびIL-2はそれぞれ、ステファニー・ボーゲル（Stephanie Vogel）博士（USUHS、ベセスダ、MD）およびモーリス・ゲイトリー（Maurice Gately）博士（ホフマン・ラ・ロッシュ、ナトレー、NJ）の厚意により供与された。組換え型マウスIL-3およびGM-CSFはファーミンゲン(Pharmingen)より購入した。ポリクローナルヤギ抗マウスIL-3およびGM -CSF抗血清はいずれも、R＆Dシステムズ(R&D Systems)（ミネアポリス、MN）より購入した。機能的アッセイは96ウェル平底コスタープレート（コスター(Costar)、ケンブリッジ、MA）で実施した。培養細胞を、６％CO₂を含む湿潤大気中で37℃で、１ ×10⁵細胞／mlを全量200 μLでインキュベートした。ポリクローナルIgM濃度はELISAによって測定した。毎回のアッセイで用いたIg M標準曲線との比較によって定量を行った。 B細胞の調製および培養：B細胞に富む集団を脾細胞から得た。ラット抗Thy-1 、抗CD4、および抗CD8モノクローナル抗体で処置し、その後モノクローナルマウス抗ラットIgkおよび補体によって、T細胞を除去した。細胞を70、65、60、および50％パーコール溶液（密度はそれぞれ、1.086、1.081、1.074、および1.062 g /ml）から成る不連続パーコール勾配上での密度に基づいて分画した。高密度（小さい、休止）細胞は70〜65％界面から回収し、〜90％B細胞を含んでいた。次に、FITC-抗-CD3ε＋PE-抗-IgM抗体で染色後、EPICSエリートサイトメーター（コールター・コーポレーション(Coulter Corp.)、ヒアラ、FL）上で膜(m)IgM+CD 3-細胞の電子的細胞ソーティングによって高度精製B細胞を得た。ソーティングした細胞を直ちに再分析したところ、一貫して＞99％B細胞であることが判明した。これらの細胞を全ての実験に用いた。 TH1マウス細胞株をクローニングして実験に用いた。親出願に記述のように、B 細胞による抗体の放出を刺激する組成物を単離した。組成物の成分の同一性を決定するために、IL-1、IL-2、IL-3等に対して特異的なモノクローナル抗体を組成物に加え、次に活性を測定することによって、既知の全てのサイトカインの活性を系統的に抑制した。組成物は、２つの独立したB細胞抗体放出剌激剤である、IL-3およびGM-CSFを含むため、既知のサイトカインをそれぞれ一つずつ抑制する実験を行っても、測定された活性を完全に抑制する結果にはならなかった。実施例２この実施例は、親出願において同定されたT細胞培養の上清、GM-CSF、およびI L-3の相対的な刺激効果を測定する。様々な培地におけるB細胞によるIgM分泌（ng/ml）を測定した。培養培地を図１の左側に沿って記載する。培養培地は、抗IgDデキストランおよびIL-1＋IL-2; 抗IgDデキストランおよびIL-4；可溶性CD40リガンドおよびIL-1＋IL-2；可溶性C D40リガンドおよびIL-4、膜CD40リガンド；膜CD40リガンドおよびIL-1＋IL-2；ならびに膜CD40およびIL-4であった。調べた組成物は、親出願において記述された細胞培養上清、RA5-SN、GM-CSFNおよびIL-3であった。各培地について対照の組成物も同様に調べた。図１に示すように、調べた組成物は、デキストラン結合抗IgD抗体、IL-1およびIL-2を含む培地において最高のIgM分泌を示した。GM-CSFおよびIL-3の双方を有するRA5-SN上清は、調べた他の組成物と比較してB細胞による有意なIgM分泌を示した。実施例３この実施例は、IL-3およびGM-CSFが活性化B細胞によるIg分泌を刺激することを示している。様々な濃度のIL-3またはGM-CSFの存在下または非存在下で、デキストラン結合抗IgD抗体（３ng/ml）＋IL-1（150 U/ml）＋IL-2（150 U/ml）によって、B細胞を活性化した。IgM分泌は培養開始後６日目にELISAによって測定した。電子的にソーティングした精製休止B細胞は増殖したが、デキストラン結合抗I gD抗体またはデキストラン結合抗IgD抗体＋IL-1＋IL-2による活性化に反応してI gを分泌することができなかった。親出願で報告したように、抗CD3-活性化CD4+T H1およびTH2クローンから得られた上清は、デキストラン結合抗IgD抗体＋IL-1＋ IL-2で刺激したB細胞による強いIg分泌反応を誘導する。この剌激はIL-4およびI L-5非依存的である。 TH1およびTH2クローンは、活性化によってIL-3、GM-CSF、およびTNF-αを分泌する能力を有するため、これらのサイトカインがIg分泌を誘導するか否かを調べた。サイトカインは、対数で0.1〜1000 U/mlの最終濃度で増加させて力価を測定した。TNF-αはIg合成に全く作用を及ぼさなかった。対照的に、IL-3およびGM-CSF は、デキストラン結合抗IgD抗体＋IL-1＋IL-2のみで認められた分泌を上回るIg 分泌の有意な増強を刺激した（図２）。IL-3およびGM-CSFはいずれも、100 U/ml で最適なIg分泌反応を刺激し、それぞれ19倍および９倍増強した。IL-3またはGM -CSFに反応した、低いが有意な量のIg合成の誘導は、１〜10 U/mlでもなお認められた。多数の実験では、IL-3およびGM-CSFによって媒介されるIg分泌の増加の程度は、典型的に10〜50倍の範囲であった（図３）。用量反応、またはIg分泌の誘導の最適レベルのいずれに対しても、IL-3とGM-CSFとの間で有意差は認められなかった。実施例４この実施例は、抗IL-3および抗GM-CSF抗体がIL-3およびGM-CSFに反応してそれぞれIg分泌の誘導を特異的に阻害することを示している。 IL-3（10 U/ml）またはGM-CSF（10 U/ml）の存在下または非存在下でデキストラン結合抗IgD抗体（３ng/ml）＋IL-1（150 U/ml）＋IL-2（150 U/ml）によって、B細胞を活性化した。さらに、抗IL-3（10 μg/ml）および／または抗GM-CSF（ 10 μg/ml）抗体を加えた。抗IL-3または抗GM-CSF（10 μg/ml）を加えない対照も同様に調製した。IgM濃度は培養開始後６日目にELISAによって測定した。抗IL-3および抗GM-CSF抗体は、IL-3およびGM-CSFのそれぞれのIg誘導活性を特異的および完全に阻害した（図４）。これらの抗体は、単独または組合せで、デキストラン結合抗IgD抗体＋IL-5活性化に反応するIg分泌に効果を及ぼさなかった（データは示していない）。また結果から、抗IL-3および抗GM-CSF抗体の組合せが、CD4⁺TH1またはTH2クローンのいずれかからの上清のIL-4＋IL-5非依存的Ig誘導活性を有意に減少させうることが証明された。IL-3およびGM-CSFは、CD40媒介シグナル伝達系路を通じて活性化されたB細胞によるIg分泌を誘導できないことも証明された。実施例５この実施例は、IL-3およびGM-CSFがデキストラン結合抗IgD抗体によって活性化されたB細胞によるIg分泌を誘導するが、非結合型の抗IgD抗体による活性化ではIg分泌を誘導しないことを証明している。この実施例はまた、IL-3およびGM-C SFがIL-1＋IL-2と相乗的に作用することを示している。多価であるが、２価ではないmlgクロスリンケージは、サイトカイン媒介Ig分泌およびクラススイッチを共刺激する。この実施例では、IL-3またはGM-CSFに反応するIg分泌の共剌激に対して、デキストラン結合抗IgD抗体（Hδ^a/1 mAb）を非結合型の抗IgD抗体（Hδ^a/1 mAb）と比較した。 B細胞をまず、AF7上清、αIL-4、およびαIL-5と共に培養した。AF7上清に関して、C57BL/6マウスに由来するKLH-特異的、Ia^b-制限、CD4+T細胞クローンを確立し、標準的な方法によって維持した。AF7は、IL-4の産生に基づくTH2クローンで、IL-2およびIFN-γの産生が欠如している。以下のようにAF7細胞の培養から、サイトカインを含む上清を得た。組織培養ウェルを37℃で３時間、抗CD3 mAb（2C11）10 μg/mlのPBS溶液でインキュベートし、次に新鮮なPBSで３回洗浄した。休止状態に戻らせ、抗原、APC、およびIL -2による刺激後７日目のAF7細胞を、抗CD3-コーティングプレートに様々な時間、１×10⁶細胞／mlで加え、そこから無細胞上清を得て、-20℃または４℃のいずれかで保存した。後者の場合では、上清は回収して１〜２週間以内に細胞アッセイに用いた。次に、IL-1（150 U/ml）＋IL-2（150 U/ml）の存在下または非存在下で、B細胞をデキストラン結合抗IgD抗体（Hδ^a/1-dex、３ng/ml）または非結合（Hδ^a/1 、30 μg/ml）抗IgD抗体と共に培養した。対照組成物は、結合型または非結合型デキストランを含まなかった。IL-3（100ml）および／またはGM-CSF（100 U/ml ）を加え、IL-3またはGM-CSFを加えない対照組成物を調製した（図５）。IgM濃度は、培養開始後６日目にELISAによって測定した。結合型デキストラン（Hδ^a/1-dex）とは対照的に、非結合型デキストラン（H δ^a/1）は、IL-3またはGM-CSFの存在下ではIg分泌の共刺激剤としては無効であった（表１）。非結合型デキストランは、細胞サイズの増加およびMHCクラスII 誘導の増加のような、初期B細胞活性化事象を誘導できるにも関わらず、これらの結果が得られた。IL-3またはGM-CSF単独では、Igを検出可能なほど分泌するように休止B細胞を誘導することができなかった（表１）。しかし、IL-3およびGM- CSFをデキストラン結合抗IgD抗体活性化細胞の培養中に加えると、細胞外IL-1＋ IL-2の非存在下では、デキストラン結合抗IgD抗体単独による刺激と比較してそれぞれ、7.4倍および5.4倍のIg分泌誘導が起こった。デキストラン結合抗IgD抗体のみで活性化した細胞にIL-1＋IL-2を加えても、Ig分泌はそれ以上増加しなかった。 IL-3またはGM-CSFとIL-1＋IL-2との併用により、デキストラン結合抗IgD抗体＋IL-1＋IL-2単独で活性化したB細胞培養で認められた場合と比較して、Ig分泌は48倍および75倍増強された。このように、IL-1＋IL-2は、デキストラン結合抗 IgD抗体活性化休止B細胞によるIg分泌の誘導に関して、IL-3またはGM-CSFと強く相乗的である。表Ｉ培地刺激レベル Hδ^a/1-dex 65 IL-3 ＜24 GM-CSF ＜24 Hδ^a/1-dcx＋IL-3 480 Hδ^a/1-dex＋GM-CSF 350 Hδ^a/1-dex＋IL-1＋IL-2 57 Hδ^a/1-dex＋IL-1＋IL-2＋IL-3 2750 Hδ^a/1-dex＋IL-1＋IL-2＋GM-CSF 4250 Hδ^a/-1 ＜24 Hδ^a/-1＋IL-1＋IL-2 ＜24 Hδ^a/-1＋IL-1＋IL-2＋IL-3 ＜24 H δ^a/-1＋IL-1＋IL-2＋GM-CSF ＜24 実施例６この実施例はIL-3およびGM-CSFが共に、主にIg分泌へのB細胞分化の剌激を通じて作用することを示している。 IL-3およびGM-CSFがIg分泌を増強するメカニズムを明らかにするため、IL-3およびGM-CSFが細胞の過増殖に及ぼす効果をIg分泌と比較して決定した。 B細胞を、IL-3（100 U/ml）および／またはGM-CSF（100 U/ml）の存在下または非存在下で、デキストラン結合抗IgD抗体（３ng/ml）＋IL-1（150 U/ml）＋IL -2（150 U/ml）で活性化した。生存細胞（トリパンブルーを排除した細胞）を血球計算盤を用いて培養開始後４日目に計数した。複製培養におけるIgM濃度は、培養開始後６日目にELISAによって測定した。データは２つの培養の平均値±平均の標準誤差として表す。 IL-3は、生存細胞過増殖（outgrowth）において有意な、しかし２倍未満の増強を剌激したのに対し、GM-CSFは細胞増殖の程度に有意な効果を示さなかった（図６）。³H-チミジンの取り込みに基づいてDNA合成を評価する試験は、これらの知見と一致している。 IL-3およびGM-CSFに反応した複製培養のIg分泌の誘導はそれぞれ、13.8倍および13.6倍であった。これらの結果は、IL-3およびGM-CSFの主な効果が、細胞当たりに分泌されたIgの平均量の強い増加を刺激することで、培養中に存在する細胞の総数を増強しないことを示している。このように、このデータから、IL-3およびGM-CSFが、多価抗原受容体クロスリンクを通じて活性化される休止B細胞に対する分化因子であることが強く示唆される。IL-3およびGM-CSFの組合せ作用は、それぞれのサイトカインの最適用量を用いると、一貫して、付加的なIg分泌反応以上の反応を引き起こした（図６）。これらのデータは、IL-3およびGM-CSFが相乗的に作用することを示している。同様の程度の相乗効果は、IL-1＋IL-2の非存在下でデキストラン結合抗IgD抗体によって活性化した細胞に対するIL-3とGM-CS Fとの併用によっても認められた（データは示していない）。実施例７この実施例は、CD40LをB細胞組成物に加えた場合のB細胞の抗体分泌に及ぼす刺激効果を証明する。 B細胞を、デキストラン結合抗IgD抗体（３ng/mlまたは0.3ng/ml）＋IL-1（150 U/ml）＋IL-2（150 U/ml）で活性化させた。対照組成物、IL-3＋GM-CSFを加えた組成物、およびIL-3＋GM-CSF＋CD40リガンド（CD40L）を加えた組成物に関して、複製培養でのIgM濃度をELISAによって測定した（表II）。IL-3およびGM-CSF は、100 U/mlで存在していた。CD40Lは最終濃度10 μg/mlで加えた組換え型可溶性CD8-CD40リガンド融合蛋白質の形状であった。融合蛋白質は、コネチカット州リッジフィールドにあるベーリンガー・インゲルハイム・ファーマシューティカルズ・インク（Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals，Inc.）のケーリー博士（M.Kehry）から供与された。最も有意な結果（61,250 ng/ml）は、３ng/mlの抗IgD-dexおよびIL-3＋GM-CSF ＋CD40Lを含む組成物で得られた。しかし、低濃度の多価活性化因子（抗IgD-deX の0.3ng/ml）においても、有意なIgM分泌が得られた（42,125 ng/ml）。このように、低濃度の結合物においても、CD40Lを担体に含めることによって、極めて強力な抗体放出反応を得ることができる。実施例８この実施例は、IFN-γをB細胞の刺激後24時間に加えた場合のB細胞の抗体分泌に及ぼす剌激効果を示している。 B細胞を、IL-3（100 U/ml）＋GM-CSF（100 U/ml）の存在下または非存在下で、デキストラン結合抗IgD抗体（３ng/ml）＋IL-1（150 U/ml）＋IL-2（150 U/ml ）で活性化させた。複製培養におけるIgM濃度は、対照組成物、IFN-γを０時間に加えた組成物、およびIFN-γを24時間に加えた組成物に関して、ELISAによって測定した。データは２つの培養の平均値±平均の標準誤差として表す（図７）。抗-IgD-dex活性化B細胞およびIL-1＋IL-2を含む組成物は、IFN-γを加えない場合では最少のIgM分泌（885 ng/ml）、およびIFN-γを０時間に加えた場合でも最少の分泌（975 ng/ml）を示した。IFN-γをB細胞の刺激後24時間に加えたところ、抗体分泌は11,250 ng/mlに跳ね上がった。抗-IgD-dex活性化B細胞、IL-1＋IL-2、およびIL-3＋GM-CSFを含む組成物では、さらに有意な結果が得られた。IFN-γを含まない培地では、抗体分泌は21,250 ng/mlと測定された。驚くべきことに、IFN-γを０時間に加えると抗体分泌は7, 250 ng/mlに抑制された。しかし、IFN-γをB細胞の刺激後24時間に加えると、相乗反応が起こり、ほぼ200,000 ng/mlもの抗体分泌を生じた。実施例９この実施例は、本発明の組成物を用いた典型的ワクチンおよびワクチンアジュバントを提供する。表IIIは、本発明の組成物を用いた典型的ワクチンを示す。表に示すように、いくつかのワクチンは結合ワクチンである。結合法は当業者には周知で、参照として組み入れられる、ブランズウィックら（Brunswick）、J ．Immunol.140:3364 （1988）のヘテロライゲーション法；ウォン（Wong S.S.）「蛋白質結合物とクロスリンクの化学（Chemistry of Protein Conjugates and Crosslinking）」、 CRCPress，Boston（1991）；およびブレンクレーら（Brenkeley）「色素、ハプテン、およびクロスリンク剤による蛋白質結合物の調製法の簡単な概要（Brief Survey of Methods for Preparing Protein Conjugates With Dyes,Haptens and Cross-Linking Agents）」、Bioconjugate Chemistry、3、１号（1992年１月）を含む。多価担体は、インビトロで用いられる多価結合物（すなわち抗-IgD-dex）に置き換えられる。そのような担体は、例えば、デキストラン、または肺炎球菌、連鎖球菌、または髄膜炎菌のような細菌からの被膜多糖類でありうる。多糖類は、ワクチンについて想定される使用により、医学的に適切であっても適切でなくともよい。サイトカインはGM-CSF、IL-3、IFN-γまたはその組合せであることができる。この実施例は制限することを意図しているわけではなく、ワクチンの他のタイプは、本発明の明細書および実践を考慮することにより当業者には明らかとなると思われる。表IIIワクチンの構造および成分１．サイトカイン^*＋抗原（混合）；水溶液で同時投与、徐放粒子、アジュバント等。２．サイトカイン＋抗原＋多価担体；サイトカイン、抗原、またはその双方を直接担体に結合することができる；すなわち：３．サイトカイン−抗原；共有結合による直接結合４．多価担体に結合（共有結合）したサイトカイン−抗原、すなわち：５．サイトカイン−抗原（融合蛋白質）６．多価担体に結合（共有結合）したサイトカイン−抗原（融合蛋白質）７．ペプチド−サイトカイン（融合蛋白質）＋抗原８．融合蛋白質、抗原または双方が多価担体に結合している、ペプチド−サイトカイン（融合蛋白質）＋抗原９．サイトカイン−多価担体、すなわち： 10．抗体複合体（すなわち、IL-3＋抗IL-3）＋抗原 11．抗体複合体（すなわち、IL-3＋抗IL-3）＋抗原＋多価担体（サイトカイン、抗原、またはその双方を担体に結合することができる） 12．抗サイトカイン抗体；これは中和ワクチンである 13．抗サイトカイン抗体＋多価担体；これは中和ワクチンである 14．実施例１〜13のワクチンは、CD40Lを混合または多価担体に結合して加えることによってさらに修飾することができる 15．実施例１〜14のワクチンは、IL-1＋IL-2のような、GM-CSF、IL-3またはINF- γ以外のサイトカインを、混合または多価担体に結合させて１つ以上加えることによって、さらに修飾することができる。^* サイトカインはGM-CSF、IL-3、IFN-γまたはその組合せでありうる。＊＊＊＊＊まとめると、実験結果は、IL-3および／またはGM-CSFがB細胞による抗体の放出を刺激すること、および併用するとこれらのサイトカインは相乗的に作用して B細胞による抗体の放出を刺激することを示している。この誘導は、抗IL-3および抗GM-CSF抗体によってそれぞれ特異的に阻害される。培養後24時間に加えたIF N-γの刺激効果も同様に示す。 IL-3およびGM-CSFの効果は、実験モデルにおいてデキストラン結合抗Ig抗体によって媒介されるように、多価抗原受容体クロスリンケージによって増強される。IL-3およびGM-CSFの効果も同様に、高レベルの膜Igクロスリンクを誘導しない抗原によって増強してもよい。デキストラン結合抗Ig抗体およびIL-1＋IL-2は共に、最適なIL-3およびGM-CSF媒介Ig分泌にとって必要であるが、IL-3およびGM-C SFは共に、デキストラン結合抗Ig抗体単独で活性化された細胞による適度のIg分泌反応を剌激する。これは、IL-3およびGM-CSFが、B細胞の分化因子として直接作用できることを証明する最初の報告である。さらに、GM-CSF、IL-3、IL-1＋IL-3、および培養後24時間に加えたIFN-γの使用により、最大抗体分泌が得られたが、抗体分泌の適度の増加もまた、培養後24 時間にIFN-γを加えただけでも認められた。実施例10 この実施例は、サイトカイン-蛋白質融合産物の調製を示す。 A．プラスミドの構築 YEpFlag-1発現プラスミド（コダック・サイエンティフィック・イメージング・システムズ）を、融合蛋白質のクローニングおよび発現に用いた。YEpFlag-1ベクターは：酵母における制御発現のためのADH2プロモーター、酵母における選択のためのトリプトファンマーカー、および酵母における蛋白質分泌のためのα因子を含む。ベクターはまた、多クローニング部位、アンピシリン耐性遺伝子、およびFlagペプチド配列も含む。KpnlおよびBamHI制限部位への融合蛋白質DNAの挿入により、Flagペプチド配列および、α因子ペプチド配列から14塩基対が除去された。融合蛋白質の精製を容易にするため、６個のヒスチジン残基をそのC末端に加え、それによりNi-NTA樹脂への結合およびNi-NTA樹脂からの酸溶出が可能となった。この方法は、Flagペプチドをその後酵素的に除去する必要がなく、大量の精製が可能となるため、Flag依存的精製より優れている。α因子細胞外分泌ペプチド配列の3'末端から除去された14塩基対は、PCRによって戻された。融合蛋白質を構築する前に、個々の蛋白質をまず個別にクローニングした。プロテインD、肺炎球菌表面蛋白質A（プロテインA）およびニューモリジン（pneum olysin）は、ソンら（son）、Infect.and Immun.632,696〜699（1995年２月）；ランゲルマンら（Langermann）、J.Exp.Med．180、2277〜2286（1994年12月）；およびウォーカーら（Walker）Infect.and Immun.55,5,1184〜1189（1987年５月）に記述の方法に従ってクローニングした。融合蛋白質は、N末端上のサイトカインを、６個のグリシン残基によって、C末端上の６個のヒスチジンテール部を含む抗原蛋白質と結台させることによって構築した。 B．IL-2、GM-CSFプラスミドの構築プラスミドを含むヒトIL-2またはマウスG M-CSF cDNAを用いて、PCRの鋳型とした。5'プライマーはKpnl制限部位および除去されたα因子の塩基対、ならびに蛋白質のN-末端の最初の18塩基を含んでいた。 3'プライマーは蛋白質のC-末端の最後の18塩基、リンカーとしてサイトカイン配列とSmal制限部位との間の３個のグリシンコドンを含んでいた。PCR産物およびY EpFlagプラスミドをKpnlおよびSmal制限エンドヌクレアーゼで消化し、ライゲーションした。大腸菌DH 10Bコンピテント細胞をライゲーション混合物によって形質転換し、アンピシリン耐性クローンを選択して、プラスミドDNAをいくつかのクローンから精製した。IL-2およびGMCSF遺伝子の存在はPCRによって決定した。配列はアプライド・バイオシステムズ（Applied BioSystems）DNAシークエンシングシステムを用いてチェックし、組換え型プラスミドをpYIL2およびpYGMとして同定した。 C．肺炎球菌表面蛋白質A（PA）、プロテインD、およびニューモリジン（Ply）プラスミド構築肺炎球菌（S.pneumonia）Rx1からのゲノムDNAをPAおよびPly双方の鋳型として用いた。インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）の免疫グロブリンD-結合蛋白質（PD）のクローニング遺伝子を有するプラスミド（pHIC 3 48）をPCRの鋳型として用いて、末端での都合のよい制限部位（SmaIおよびBamHI ）でPD-遺伝子断片を得た。3'プライマーはヒスチジンの６コドンおよび停止コドンを含んでいた。蛋白質のC-末端のヒスチジンテールはNi-NTA樹脂（キアゲン (Qiagen)）を用いる精製に役立つ。PCR産物を、酵母培養において発現および分泌を提供させる、pYEPFLAG-1発現ベクター（コダック・サイエンティフィック・イメージング・システム(Kodak Scientific Imaging System))のSma IとBam HI 部位との間でクローニングした。正しいPD-遺伝子コピーを含むプラスミドをp Y PDと同定した。PAの遺伝子は切断されて888 bpとなり、T細胞活性化のエピトープ（アラバマ大学のラリー・マクダニエル（Larry McDaniel）博士から入手）と共に、そのB細胞抗原性エピトープを保持しているPAのその部分をコードする。P CR断片はSmaI制限部位、融合蛋白質の成分間のリンカーとして３個のグリシンコドン、PA配列（Ply配列）、６個のヒスチジンコドン（蛋白質精製に用いられるヒスチジン６個の配列）、停止コドンおよび3'末端でのBamHI制限部位を含む。P CR産物をSmaIとBamHI部位との間のYEpFlag1にクローニングした。形質転換後、クローンをアンピシリン耐性によって選択した。PAまたはPly遺伝子の存在はPCR によって検出した。プラスミドをpYPAおよびPlyと命名し、クローニングした配列の精度は、アプライド・バイオシステムズ・モデル373A DNAシークエンシングシステムでの配列分析によって確認した。 D．融合蛋白質プラスミドの構築 PAおよびPLYに対する配列を含むSmaI/BamHI 断片を、それぞれのプラスミドから切り出し、SmalおよびBamHIで消化したpYIL2 またはpYGMのいずれかとライゲーションした。新しい融合蛋白質発現プラスミドをシークエンシングして、pIL2PA（IL2＋PA）、pIL2Ply（IL2＋Ply）、pGMPA（G MCSF＋PA）、pGMPly（GMCSF＋Ply）と命名した。 E．Pan DRエピトープペプチド（PDREP）-MHCクラスII制限T細胞に対する「万能」エピトープに対する１本鎖配列のクローニングアレキサンダーら（Alexande r ）、Immunity，1，751〜761（1994）の記事に記述のように、PDREPの一つは構造aKFVAAWTLKAAaを有する。本発明者らの構築物では、融合蛋白質の一部を形成するこのPDREPは、同じ構造を有するが、末端のL-アラニン残基がD-アラニンに置換している。 PDREPの配列を含むDNAの断片を作製するために、２つの相補的合成オリゴヌクレオチドの混合物を90℃に加熱し、徐々に冷却した。必要であれば、オリゴヌクレオチドの5'末端をアニーリングの前にリン酸化した。アガロースゲル電気泳動により、二本鎖断片（〜60 b.p.）の存在が示された。センス鎖は53bでアンチセンス鎖は57bである。5'末端で、断片はKpnl制限部位に対応する粘着末端、クローニング時に排除されたαリーダーペプチドコドンの復元のための配列、PDREPおよびブラント3'末端に対する39 b.p.を有した。この断片は、KpnlおよびSmalで消化したPYPAとライゲーションした。アンピシリン耐性クローンからのDNAをPCRによって分析してシークエンシングする。３重のPDREP配列DNA断片を作製するため、78塩基の二本鎖配列PDREP断片をそれぞれの合成オリゴヌクレオチドのアニーリングによって生成した。ライゲーションのいくつかの段階の後、本発明者らは、KpnlとBamHI部位との間、完全な大きさのαリーダーペプチド配列、PDREPに対する３個の39塩基対配列、およびPA 切断遺伝子を含む構築物を得た。 F．酵母の形質転換 BJ3505のトリプトフアン(-)酵母のスターター培養を、YP D培地25 mlの凍結ストックから30℃で一晩培養した。一晩の培養液から新鮮なYP D培地100 mlを接種し、280 nmでのO.D.が.3〜.5となるまで一晩インキュベートした。次に、酵母および融合蛋白質プラスミドを、刊行されているプロトコルに従って電気穿孔用に調製した。電気穿孔は、1.5KeV、200オーム、25 uFに設定したバイオラッド(BioRad)遺伝子パルサーを用いて実施した。電気穿孔した酵母を選択培地プレート上に播種すると、３〜５日で形質転換コロニーが出現した。 G．融合蛋白質発現酵母の単離形質転換したコロニーを発現プレート上で増殖させることによって、融合蛋白質分泌クローンを選択した。発現プレートは、発現培地寒天プレートの上部に、ニトロセルロースおよび次に酢酸セルロースフィルターを載せることによって調製した。コロニーをプレート上で３〜５日増殖させた後、ニトロセルロースを除去して、イムノブロットを行った。膜を１×TBS ツィーン20（TBS20）で２時間洗浄／ブロックし、各抗蛋白質抗体と共に１時間インキュベートした。膜を１×TBS20で１時間洗浄して、その後ウサギ抗マウスI gG抗体中で１時間インキュベートし、次に１×TBS20でさらに１時間洗浄した。膜をアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ウサギ1g中で１時間インキュベートし、TBS20で１時間洗浄してBCIPで展開した。蛋白質分泌が陽性のコロニーを選択して、一晩インキュベートした後60％グリセロール中で凍結した拡大用培地の25 mlを接種した。 H．バッチ融合蛋白質産生形質転換酵母のスターター培養25 mlを凍結ストックから調製した。スターター培養からの10 mlを拡大用培地の1 Lに加え、30℃で 240回転／分で振とうさせながらインキュベートした。培養液を接種３日後に回収し、上清を2000回転／分で遠心することによって回収し濾過滅菌した。次に培地を５倍濃縮し、アミクロン攪拌セルを用いて２×PBSの10倍量で透析した。 I．精製濃縮培地をもとの培養容積1L当たり１ mlのNi-NTA樹脂（キアゲン(Q iagen)）と共に２時間、回転シェーカー上でインキュベートすることによって、ヒスチジンの６残基を含む融合蛋白質を精製した。培地およびNi-NTAを小さい10 cmのカラムに加えて、Ni-NTAを１×PBS1 Lで洗浄した。蛋白質は2.5 M酢酸ナトリウム、pH 4.5を用いて溶出した。分画を回収し、280 nmでのO.D.を測定して、相対的蛋白質濃度を決定した；O. D.が0.1以上の分画をプールして１×PBS pH 7.4に対して透析した。もとの培地からの培地試料、濃縮培地、および精製蛋白質を、SDS変性ゲル上で電気泳動させ、クーマシーブルーで染色するか、イムノブロットを行った。イムノブロット用のゲルをファルマシア・ノバブロットシステム（Pharmasia's NovaBlot）を用いてニトロセルロース上に移し、上記のようにイムノブロットを行った。蛋白質同定用の対照は、融合蛋白質を有しないpYEPプラスミドを有する酵母からの培地、ならびにIL-2およびPSP-Aに対する陽性対照であった。クーマシーブルーで染色したゲル上の蛋白質バンドを分子量マーカーと比較して、融合蛋白質の大きさを推定した。ヒスチジンタグを有しない組換え蛋白質は、5100HRカラム上でのイオン交換によって単離した。純度はSDS PAGEおよび融合蛋白質の各成分のイムノブロットによりアッセイした。試料はまた、ベックマン・ウルトラスフェリゲル（Beck man Ultraspherigel）2000ゲル濾過カラム上で分析的HPLCによって調べてもよい。最終産物のサイトカイン活性を調べた。 J．蛋白質またはサイトカイン蛋白質の多糖類への結合 Pn14（スミスクライン(SmithKlin)またはATCC）は、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウム・テトラフルオロボレート（CDAP）を用いて、上記のようにアミンで誘導する。簡潔に述べると、CDAP（100 mg/mlアセトニトリル溶液）の30 μ lを加え、30秒後に0.2 Mトリメチルアミン（TEA）30 μlを加えることによって、Pn14 １ml（10 mg/ml水溶液）を活性化させた。２分の時点で、0.5Mヘキサンジアミンの0.75 M HRPES、pH 7.5溶液0.5 mlを加えた。1.5時間後、産物をP6カートリッジ（バイオラッド(BioRad)で脱塩し、生理食塩液で平衡にして限外濾過によって濃縮し、再度脱塩した。アミン含量は、ヴィダルら（Vidal）、J.Imm.M ethods，1986,86，155の方法によって、および多糖類はモンシニーら（Monsigny ）、Anal.Chem.1988，175，525の方法によってアッセイした。蛋白質は0.15 M HEPES、pH7.5中で５〜20 mg/mlにして、0.1 MストックのDMF 溶液から20倍モル過剰のN-サクシニミジルS-アセチルチオアセテート（SATA、プロケム(ProChem)、ロックフォード、IL）でチオール化した。室温にて暗所で２時間インキュベートした後、P6カートリッジ（バイオラッド）を用いてサンプルを脱塩して、10 mM NaAc、0.1 M NaCl、２ mM EDTA、pH５で平衡にし、セントリコン30(Centricon 30)装置（アミコン(Amicon)）を用いて10〜20mg/mlに濃縮した。 NH2-Pn14を、Pn14１mg当たり0.1 M Nヒドロキシサクシニミジルヨードアセテート（SIA、プロケム、ロックフォード、IL）10 μlでヨードアセチル化し、２時間後に脱塩して上記のように濃縮した。チオール化蛋白質およびヨードアセチル化Psを合わせて、0.5 Mヒドロキシルアミンの0.75 M HEPES溶液 pH7.5の1/9容量を加えることによって反応を開始させた。一晩の反応の後、溶液をメルカプトエタノール中で１時間0.2 mMにすることによって、反応を消失させ、その後10 mMヨードアセトアミドで10分インキュベートした。結合物をS400HRゲル濾過カラムに通し、PBSで平衡にした。高分子量材料をプールして、ミレックス(Millex)GVフィルター（ミリポア(Millipore)）を通過させることによって濾過滅菌した。結合物を、蛋白質についてはバイオラッド蛋白質アッセイを用いてアッセイし、多糖類については上記のモンシニーら（ Monsigny）の方法によって、上述のようにアッセイした。 K．「万能」T細胞エピトープの多糖類への結合 N末端システインを含む万能T細胞エピトープペプチドをDTTで還元し、G10カラム上で脱塩し、10 mM酢酸ナトリウム、pH ５で平衡にし、HEPES緩衝液、pH 7.5 中でヨードアセチル化多糖類と反応させた。または、１段階プロセスを用いてもよい。ペプチドをN末端ヒドラジドで合成し、CDAP活性化多糖類とpH５で直接反応させた。いずれの方法によっても、一晩の反応後、結合物を生理食塩液で透析して、濾過滅菌してもよい。ペプチドはその絶対スペクトルから定量し、多糖類はモンシニーら（Monsigny）の方法によってアッセイした。 L．抗蛋白質および抗多糖類抗体反応の増強の測定マウスに対し、蛋白質、蛋白質-サイトカインまたは蛋白質-サイトカイン-多糖類の0.01〜10 μgを皮下注射し、抗蛋白質および抗多糖類反応を14、28および 52日後に測定した。抗体反応はELISAによって決定した。得られた増強された抗蛋白質および抗多糖類反応を表IVに示す。表 IV PspA-IL2-Pn14ワクチン構築物による抗蛋白質および抗多糖類反応増強の誘導 M．万能T細胞エピトープおよび結合型肺炎球菌多糖類タイプ14で操作したワクチン構築物に反応したインビトロT細胞増殖の測定排出リンパ節からのT細胞を、対照または実験的ワクチンを接種したマウスから精製した。細胞は2.5×10⁴〜２×10⁵個／ウェルで、存在する細胞源としてマイトマイシンC処理脾細胞５×10⁴個と共に培養した。結果は表Vに示す。表 V 万能T細胞エピトープ（TCE）で操作したワクチン構築物に反応したインビトロT細胞増殖マウスを万能T細胞エピトープ（TCE）、プロテインD-TCE、またはプロテインD-T CE-肺炎球菌多糖類タイプ14のCFA溶液で免疫した。10日後、排出リンパ節を分離して、様々な刺激と共に培養した。チミジン取り込みは４日後に測定した。T細胞増殖は、PD-TCE-Pn14で免疫した群では幾分低く、これはおそらく、多くの重要なエピトープに影響を及ぼしうるPD-TCEと多糖類との化学結合の結果であると考えられる。本発明を十分に記述したため、本明細書に記述の本発明の範囲から逸脱することなく、多くの変更および修正を加えることができることは当業者には明らかであると思われる。添付の請求の範囲は、制限を加えるものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/535 Ｃ０７Ｋ 14/535 14/54 14/54 17/06 17/06 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．有効量の、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターロイキン-3（IL-3）、またはその組合せを含む、B細胞による抗体の放出を刺激するために有用な組成物。２.ａ）多価担体に共有結合している、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターロイキン-3（IL-3）、またはその組合せ；ｂ）多価担体に共有結合している、ワクチンの抗原を含む結合型ワクチン。３．GM-CSFおよびIL-3が共に融合されるか、または別の適当な蛋白質に個別に融合されて、融合蛋白質を形成し、それが多価担体に結合している、請求項２記載のワクチン。４．インターフェロン-γ（IFN-γ）をさらに含む、請求項２記載のワクチン。５．CD40リガンド、またはGM-CSF、IL-3、もしくはIFN-γ以外の少なくとも一つのサイトカイン、またはその組合せをさらに含む、請求項２記載のワクチン。６．少なくとも一つのサイトカインがインターロイキン-1（IL-1）およびインターロイキン-2（IL-2）の組合せである、請求項５記載のワクチン。７．CD40リガンド、またはGM-CSF、IL-3、もしくはIFN-γ以外の少なくとも一つのサイトカイン、またはその組合せが多価担体に共有結合されている、請求項５記載のワクチン。８.多価担体が、細菌被膜多糖類、デキストラン、および遺伝子操作ベクターからなる群より選択される、請求項２、３、４、５、６、７、または８のいずれか一項に記載のワクチン。９．細菌被膜多糖類が、肺炎球菌、連鎖球菌、または髄膜炎菌由来である、請求項８記載のワクチン。 10.ａ)顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）に対する抗体；ｂ)インターロイキン-3（IL-3）に対する抗体；およびｃ)インターフェロン-γ（IFN-γ）に対する抗体からなる群より選択される１つ以上の抗体を含む、中和ワクチンアジュバント。 11．１つ以上の抗体の少なくとも１つが多価担体に結合している、請求項10記載のアジュバント。 12．多価担体が、細菌被膜多糖類、デキストラン、および遺伝子操作ベクターからなる群より選択される、請求項11記載のアジュバント。 13．細菌被膜多糖類が、肺炎球菌、連鎖球菌、または髄膜炎菌由来である、請求項12記載のアジュバント。