JP2000503213A - カポジ肉腫関連ウイルスのユニークな配列およびその使用 - Google Patents

カポジ肉腫関連ウイルスのユニークな配列およびその使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、カポシ肉腫関連のヘルペスウイルス（KSHV）ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。本発明は、KSHVの単離されたポリペプチドを提供する。本発明は、このペプチドに対して徳地的な抗体を提供する。アンチセンスで勝つトリプレックスのオリゴヌクレオチド分子もまた提供される。本発明は、カポシ肉腫（ＫＳ）のためのワクチンを提要する。本発明は、ＫＳに関して対称を予防接種し、予防し、診断し、治療治療する方法と、カポシ肉腫に関連したＤＮＡウイルスの細胞ないでの発現を検出する方法とを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 カボジ肉腫関連ウイルスのユニークな配列およびその使用 本明細書に開示される発明は、疾病管理・防止センターからの共同実施協定Ｃ ＣＵ２１０８５２の下で、また保険社会福祉省の国立衛生研究所、国立癌研究所 承認ＣＡ６７３９１の下での政府の支援を受けてなされたものである。従って、 米国政府が本発明の一定の権利を有する。 本願は、１９９６年１１月２９日に出願された米国特許第０８／７５７，６６ ９号、および１９９６年１月２９日に出願された米国特許第０８／５９２，９６ ３号の優先権を主張するＰＣＴ国際出願であり、この基礎出願のうちの後者は、 １９９５年４月１１日に出願された米国特許出願第０８／４２０，２３５、およ び１９９４年１１月２１日に出願された米国特許出願第０８／３４３，１０１号 の優先権を主張する、１９９５年１１月２１日に出願されたＰＣＴ国際出願ＰＣ Ｔ／ＵＳ９５／１５１３８号および１９９５年８月１１日に出願されたＰＣＴ／ ＵＳ９５／１０１９４号の一部継続出願であり、後者は１９９４年８月１８日に 出願された米国特許出願第０８／２９２，３６５号の一部継続である。これらの 出願は、本明細書の一部をなす参照として本願に組み込まれる。 本願を通じて種々の刊行物が括弧内のアラビア数字によって参照される。これ らの刊行物に関する完全な引用は、発明の詳細な記載の末尾に掲載してある。本 明細書に引用される全ての刊行物の開示は、本発明が属する技術の状況を更に十 分に記載するために、全体として本明細書の一部をなす参照として本願に組み込 まれる。 〔発明の背景〕 カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）は、カポジ肉腫（ＫＳ）を引き 起こすと考えられる新たなヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶＳ）である。 カポジ肉腫は先天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の患者に生じる最も一般的な 腫瘍である。ＡＩＤＳ患者のおよそ１５−２０％で、免疫適格者にはめったに生 じないこの腫瘍が発生する。疫学的証拠は、ＡＩＤＳ関連ＫＳ（ＡＩＤＳ−Ｋ Ｓ）が感染性の病因を有していることを示す。ゲイやバイセクシャルのＡＩＤＳ 患者は血友病のＡＩＤＳ患者よりおよそ２０倍ＫＳを発生し易く、ＫＳはＡＩＤ Ｓを患うゲイ男性の間の特異的な性習慣と関連していると考えられる。異性愛的 、または腸管外のＨＩＶ伝播を通じて感染した成人ＡＩＤＳ患者間やＨＩＶの垂 直伝播を通じて感染した小児ＡＩＤＳ患者間では、ＫＳは珍しい。これまでにＫ Ｓを引き起こす疑いがある病原体としては、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマ ウイルス、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、６型ヒトヘルペスウイル ス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびマイコプラズマ・ペネトランス(Myc oplasma penetrans)が挙げられる。また、亜硝酸塩吸収剤のごとき非感染性環境 薬剤もＫＳ腫瘍形成における役割を果たすと提案されてきた。しかしながら、こ れら何れの病原体も、ＡＩＤＳ−ＫＳの間の病因論的関連は示されていない。 〔発明の要約〕 本発明は、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）ポリペプチドをコー ドする単離した核酸分子を提供する。本発明はＫＳＨＶの単離したポリペプチド を提供する。本発明は、該ポリペプチドに対して特異的な抗体を提供する。また 、アンチセンスおよびトリプレックスオリゴヌクレオチド分子も提供される。本 発明は、カポジ肉腫（ＫＳ）に対するワクチンを提供する。本発明はＫＳを持つ 患者の予防接種、予防、診断および治療の方法および細胞におけるカポジ肉腫に 関連するＤＮＡウイルスの発現を検出する方法を提供する。 〔図面の簡単な説明〕 図 １： ＫＳＨＶゲノムの長い特異的領域（ＬＵＲ）および末端反復（ＴＲ）。ＬＵＲ 中、同定されたＯＲＦｓの方向は矢印の方向で示され、紺青色で示されたＨＶＳ と類似したＰＲＦｓと淡青色で示された比類似ＯＲＦｓを持つ。（文字入りの） 非保存ブロック間領域を伴う保存されたヘルペスウイルス遺伝子の（番号をつけ られた）７つのブロックは、キロ塩基表示の下に示されているが、このブロック のナンバリング方式はＣｈｅｅ(Cheeら，1990，Curr．Topics Microbiol. Immunol．154，125-169)による元の記載とは異なっている。ＫＳＨＶゲノムをマ ッピングするために用いられる重複コスミド（Ｚプレフィックス）およびλ（Ｌ プレフィックス）クローンは、ＫＳ病変部由来のＫＳ５λファージクローンと比 較され、下に示される。特徴および推定コーディング領域は、特に明示されない が、ＯＲＦマップの上に示される。反復領域は白線で示される（ｆｒｎｋ、ｖｎ ｃｔ、ｗａｋａ／ｊｗｋａ、ｚｐｐａ、ｍｏｉ、ｍｄｓｋ）。推定コーディング 領域および他の特徴（実験の詳細の部第１章を参照のこと）はＯＲＦｓとして明 示されないが、実線で示される。 図２Ａ−２Ｄ： （図２Ａ）その高Ｇ＋Ｃ含量を示す末端反復単位（ＴＲ）の配列（配列番号： １６）。保存ヘルペスウイルスｐａｃ１部位と類似性の高い配列は、イタリック 体で表示された特異的ｐａｃ１およびｐａｃ２配列に対して類似性の低い部位と 共に下線で示されている。（図２Ｂ）ＴＲ配列内で１回切断するＮｄｅＩＩを用 いて消化し、次いで、ＴＲ配列を含むプラスミドでプローブしたＢＣ−１（レー ン１）、ＢＣＰ−１（レーン２）およびＫＳ病変部（レーン３）由来ＤＮＡのサ ザンブロット。０．８ｋｂの強いハイブリダイゼーション結合は、ＮｄｅＩＩで 消化した単一ユニットＴＲの多重コピーを示す（図２Ｃ）。（図２Ｂ）および（ 図２Ｄ）で示されたデータに一致するＢＣＰ−１およびＢＣ−１細胞株のＫＳＨ Ｖのゲノム構造の概略説明（図２Ｃ）。ＴＲ領域に隣接するＴａｑ１（Ｔ）部位 およびＮｄｅＩＩ（Ｎ）部位ＴＲ内にある。下のケースではＴＲとは、特異的領 域の右末端で欠失切断されたＴＲユニットをいう。ＤＲは、ＴＲ内に埋め込まれ たＬＵＲの重複領域を示す。（図２Ｄ）ＴＲ内での切断はしないＴａｑ Ｉで消 化したＢＣ−１（レーン１）、ＢＣＲ−１（レーン２）、ＫＳ病変部（レーン） ＨＢＲ−６（レーン４）由来ＤＮＡのＴＲプローブとのサザンブロットハイブリ ダイゼーション。ＢＣ−１（レーン１）およびＨＢＲ−６（レーン４）双方由来 の、Ｔａｑ−１で消化したＤＮＡは、同様のＴＲハイブリダイゼーションパター ンを示し、このことは配列が決定研究が証明する、ＴＲ領域への特異的配列の同 一の挿入が、ＬＵＲの重複部分であることを示すものである（実験の詳細の部を 参照のこと）。ＢＣＰ−１ＴＲハイブリダイゼーション（レーン ２）は、この細胞株内に溶菌複製により可変ＴＲ領域長を有するウイルス集団と 一致したラダリングを示す。ＫＳ病変部ＤＮＡ（レーン３）にＴＲラダリングが 見られない場合、クローン性ウイルスの集団が腫瘍内に存在することを示すこと になる。 図３Ａ−３Ｃ： 対応するヒト細胞シグナリング経路ポリペプチド配列に対する、ＫＳＨＶがコ ードするポリペプチド配列のＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ整列。図３Ａ。２種のＫＳＨＶ ＭＩＰ様ポリペプチド（ｖＭＩＰ−ＩおよびｖＭＩＰ−ＩＩ）を、ヒトＭＩＰ− １α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳと比較する。黒色反転の陰付けによって 示されたｖＭＩＰ−Ｉ、灰色反転の陰付けによるｖＭＩＰ−ＩＩ単独に対するア ミノ酸一致とＣＣ二量体モチーフがイタリックで表示されている。ＫＳＨＶ Ｍ ＩＰ双方の遺伝子は、比較的保存程度が低い１９残基のＮ−末端疎水性分泌リー ダー配列をコードする（ｖＭＩＰ−Ｉも、ケモカインジシステインモチーフとの 類似性を持たない疎水性リーダー配列中に第二のＣ−Ｃ二量体を持つ）。ｖＭＩ Ｐ−Ｉに対する可能性あるＯ−結合グリコシル化部位（ギャップ部位２２および ２３）は、ｖＭＩＰ−Ｉには見られない推定される可能なセリングリコシル化部 位（５１位）を一つしか持たないｖＭＩＰ−ＩＩ内には存在しない。図３Ｂ。ヒ トＩＬ−６に対するＫＳＨＶ ｖＩＬ−６の配列。図３Ｃ−１および３Ｃ−２。 イタリック体のＩＣＳＢＰおよびＩＳＧＦ３に対する推定ＩＣＳ結合トリプトフ ァン（Ｗ）を伴うヒトＩＣＳＢＰおよびＩＳＧＦ３に対するＫＳＨＶ ｖＩＲＦ ポリペプチドの配列。 図４Ａ−４Ｆ： ＴＰＡおよびＴＰＡインキュベーション後の対照Ｐ３ＨＲ１細胞と共に４８時 間のインキュベーションを伴った、または伴わないＢＣＰ−１およびＢＣ−１細 胞から抽出された全ＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーション。４種全ての遺伝 子（図４Ａ、ｖＭＩＰ−Ｉ；図４Ｂ、ｖＭＩＰ−ＩＩ：図４Ｃ、ｖＩＬ−６；図 ４Ｄ、ｖＩＲＦ）はＴＰＡ誘導性であるが構成的であり、ｖＩＬ−６（図４Ｃ） およびｖＩＲＦ（図４Ｄ）の発現が誘導されないことはまた、ＢＣＰ−１および ＢＣ−１に対して、またＢＣＰ−１に対するｖＭＩＰ−１についても明白である （図４Ａ）。ヒトβ−アクチンプローブとの典型的ハイブリダイゼーション（図 ４Ｅ−４Ｆ）は、細胞調製物に関してＲＮＡの含有量を比較できることを示すも のである。 図５Ａ−５Ｂ： 図５Ａ。ＴＰＡ誘導（レーン１−６）、１μｇヒトｒＩＬ−６（レーン７）、 並びに濃縮ＣＯＳ７ ｒｖＬＩ−６および６−ＬＩＶ上清（レーン８−９）を用 いて、または用いないで、ＢＣＲ−ＬＢＣ−１、Ｐ３ＨＲ１細胞株の細胞ライゼ ートに対して、ｖＩＬ−６、ＴＨＹＳＰＰＫＦＤＲ（配列番号：２）およびＰＤ ＶＴＰＤＶＨＤＲ（配列番号：３）のアミノ酸配列から作製された、ウサギ抗ペ プチド抗体のイムノブロット。抗−ｖＩＬ−６抗体は、組換え体の上清および細 胞株の双方における、ヒトＩＬ−６でなく、ウイルス性ＩＬ−６ポリペプチドを 特異的に認識する。ＢＣＰ−１細胞株は低レベルのｖＬＩ−６を構成的に発現す るが、ポリペプチド発現はＢＣ−１（ＫＳＨＶおよびＥＢＶ同時感染）およびＢ ＣＰ−１（ＫＳＨＶ単独感染）の双方に対するＴＰＡ処理の際に増加し、このこ とは溶菌相発現であることを示す。免疫感作させたウサギ由来の前免疫性血清は 、何れの調製物ともイムノブロッティングで反応しなかった。図５Ｂ。抗−ｈｕ ＩＬ−６モノクローナル抗体は、細胞を含んだ、または組換え体のｖＩＬ−６調 製物とは交差反応しない。 図 ６： ｒｈｕＩＬ−６の連続希釈液（黒四角）並びにｒｖＩＬ−６（黒丸）およびｒ ６−Ｌｌｖ（中抜き四角）のＣＯＳ７上清、もしくは対照ＬａｃＺ（中抜き丸） ｐＭＥＴ７トランスフェクションを用いたＩＬ−６依存Ｂ９マウスプラスマ細胞 腫細胞3Ｈ−チミジン取り込みに関する用量反応曲線。このトランスフェクショ ンロット由来の未希釈ｒｖＩＬ−６上清は、ｈｕＩＬ−６、＞０．０２ｎｇ／ｍ ｌと同様のＢ９増殖活性を示すが、逆位構築体（ｒ６−ＬＩｖ）およびＬａｃＺ 対照はＢ９を誘導する能力を増強しないことを示す。１：１よりも高い希釈率で 濃縮された上清は、ＣＯＳ７コンディショニング因子の濃度により活性を増強さ せ得た。 図７Ａ−７Ｆ： ヘマトキシリン対比染色（青）による、ヤギ−抗ウサギ免疫グロブリンペルオ キシダーゼ複合体（褐色）を用いて、１００倍で位置推定されたウサギ抗−ｖＩ Ｌ−６ペプチド抗体活性は、ＫＳＨＶ感染した細胞株と組織の双方でｖＩＬ−６ 産生を示している。対照ＥＢＶ感染細胞株Ｐ３ＨＲ１（図７Ｂ）ではなく、ＫＳ ＨＶ感染細胞株ＢＣＰ−１（図７Ａ）が、顕著な細胞質ｖＩＬ−６の局在化を示 す。（図７Ｃ）ＡＩＤＳ−ＫＳ病変部由来の紡錘体形成細胞におけるｖＩＬ−６ 細胞質位置推定。８種類のＫＳ病変部の内１つだけが、容易に確認できる細胞副 次集団のｖＩＬ−６染色を有していた。これに対し、非ＡＩＤＳであるＥＢＶ陰 性ＰＥＬ由来のペレット状のリンパ腫細胞の大多数が、強いｖＩＬ−６染色を有 していた（図７Ｄ）。対照血管肉腫（図７Ｄ）または多重ミエローマ組織（図７ Ｆ）では免疫染色は見られない。 図８Ａ−８Ｄ： 抗−ｖＩＬ−６および細胞表面抗体の二重抗体標識。ｖＩＬ−６を用いたＣＤ ３４およびＣＤ２０双方の同時位置推定の例は、ＫＳ病変部で認められた。図８ Ａ。ＣＤ３４（赤色）およびｖＩＬ−６は、ＫＳ紡錘体細胞（矢印）に局在化す る（青色）。紫色の着色は二重クロマゲン染色（１００Ｘ）によるものである。 図８Ｂ。カポジ肉腫細胞（１００Ｘ）を表すｖＩＬ−６におけるＣＤ４５通常白 血球抗体染色（青色、矢印）。図８Ｃ。ＫＳを患う患者由来のリンパ節で造血細 胞（赤色）を産生する多くのｖＩＬ−６を示す低電力倍率（２０Ｘ）。矢印は最 も顕著な染色細胞だけを示す。核はへマトキシリンで対比染色。図８Ｄ。ＡＩＤ Ｓ−ＫＳ患者のリンパ節におけるｖＩＬ−６を用いたＣＤ２０の同時位置推定（ 褐色、矢印）（１００Ｘ）。 図 ９： ＣＣＣ／ＣＤ４細胞感染の、ｖＭＩＰ−Ｉの存在または不在化で、原初のＮＳ Ｉ ＳＦ１６２並びにＭ２３ ＨＩＶ−１系統およびＨＩＶ−２系統ＲＯＤ／Ｂ による定量。ＣＣＣ／ＣＤ４細胞は、ＣＣＲ５単独、ＣＣＲ５およびエンプティ ーｐＭＥＴ７ベクター、ＣＣＲ５およびｐＭＥＴ７ベクター中のｖＭＩＰ−Ｉ、 またはＣＣＲ５および逆方向Ｉ−ＰＩＭｖで一時的に同時トランスフェクトされ た。各々のレトロウイルスと共にインキュベーション７２時間後の結果は、ＣＣ Ｒ５単独でトランスフェクトされた細胞に対する病巣形成単位のパーセンテージ として表示される。前進ｖＭＩＰ−Ｉ構築体は、ＨＩＶ−２の増殖ではなく、Ｎ シ ＨＩＶ−１の増殖を阻害したが、逆位Ｉ−ＰＩＭｖ構築体は何れのレトロウ イルスの増殖に対する効果も持たなかった。 〔発明の詳細な説明〕定義 本明細書を通じて、以下の標準的な略語を用いて特定のなヌクレオチドを示す ； Ｃ＝シトシン Ａ＝アデノシン Ｔ＝チミジン Ｇ＝グアノシン 本明細書で用いられる場合、「核酸」とは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノ ムＤＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を始めとするＤＮＡまたはＲ ＮＡの何れかをいう。本明細書で用いられる場合、「ゲノムの」とは、単離した 核酸分子のコーディング領域および非コーディング領域の双方を意味する。「核 酸配列」とは、５’から３’末端へ読みとられるデオキシリボヌクレオチドまた はリボヌクレオチド塩基の１本鎖または２本鎖ポリマーをいう。それは自己複製 プラスミドと、ＤＮＡまたはＲＮＡの感染性ポリマーおよび非機能的なＤＮＡま たはＲＮＡとの双方を含む。 本明細書で用いられる場合、「ポリペプチド」とは、核酸によってコードされ る全長遺伝子産物またはその一部の何れかをいう。かくして、「ポリペプチド」 には全長蛋白質だけでなく、長さが５０アミノ酸残基よりも短いペプチドを含む 一部長断片も含まれる。 「ＳＳＣ」の用語は、０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび２０ｍＭクエン酸ナト リウムのクエン酸塩−生理食塩水溶液をいう。溶液は、しばしばこの濃度の倍数 または分数として表される。例えば、６ＸＳＳＣは、この量の６倍の塩化ナトリ ウムおよびクエン酸ナトリウム、すなわち０．９Ｍ塩化ナトリウムおよび１２０ ｍＭクエン酸ナトリウムを有する溶液をいう。０．２ＸＳＳＣは、０．２倍ＳＳ Ｃ濃度の溶液、すなわち０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび４ｍＭクエン酸ナトリ ウムをいう。 「選択的にハイブリダイズする」および「特異的ハイブリダイゼーション」は 、その標的配列が全細胞ＤＮＡまたはＲＮＡの調製物中に存在する場合、核酸プ ローブが特定の標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列とハイブリダイズすること、二重ら せんを形成すること、または結合することをいう。選択的にハイブリダイズする とは、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションの条件下で、非標的配列 とは違った様式で、プローブが検出可能な様式で所与の標的と結合することを意 味する。 「相補的」または「標的」核酸配列とは、核酸プローブに選択的にハイブリダ イズする核酸配列をいう。好ましいアニーリング条件は、例えば、プローブの長 さ、塩基組成およびプローブ上での誤対合の数やその位置に依存し、ほとんどの 場合経験的に決定される。核酸プローブ設計およびアニーリング条件の考察に関 しては、例えば、Sambrookら（1989）Molecular Cloning：A Laboratory Manual （第２版），Cold Spring Harbor Laboratory，Vols．1-3またはAusubel，F. ら(1987)Current Protocols in Molecular Biology，New Yorkを参照されたい。 「コードする核酸分子」とは、特異的ポリペプチドの発現を指示する核酸分子 をいう。該核酸分子配列は、ＲＮＡに転写されたＤＮＡ鎖配列、蛋白質に翻訳さ れた相補的ＤＮＡ鎖およびＲＮＡ配列の双方を含む。該核酸分子は全長核酸配列 並びに非全長配列の双方を含む。さらに、該配列は特定の宿主細胞に導入されコ ドン選択を提供し得る天然の配列または複数配列の縮重したコドンを含むことも 理解される。 もしそれが検出された場合に、蛋白質および他の生物製剤の不均一な集団の存 在下でその生物の存在の決定因である核酸配列を含むならば、核酸プローブは注 目する標的生物に対して「特異的」である。特異的核酸プローブはその生物の決 定因である配列の一部に対して標的とされ、他の配列特に病原性が検出される宿 主の配列とはハイブリダイズしないであろう。 「発現カセット」とは、かかる配列と適合する宿主の構造遺伝子の発現に影響 を与えることができる核酸配列をいう。かかるカセットは、少なくともプロモー ターおよび所望により転写終結シグナルを含む。また、発現を果たすのに必要な 、または有用な付加因子も本明細書に記載したごとくに使用してよい。 「作動可能に連結する」とは、本明細書で用いる場合、そのプロモーターがＤ ＮＡ配列の転写を仲介するように、ＤＮＡ配列から上流にプロモーターを連結す ることをいう。 「ベクター」とは、ウイルス性発現系、自律性自己複製環状ＤＮＡ（プラスミ ド）をいい、発現プラスミドおよび非発現プラスミドの双方を含む。組換え微生 物または組換え細胞培養体が「発現ベクター」を宿していると記載されている場 合、これは染色体外環状ＤＮＡおよび宿主染色体に組み込またＤＮＡの双方を含 む。ベクターが宿主細胞によって維持される場合、該ベクターは自律性構造とし て有糸分裂中に細胞によって安定して複製されているか、または宿主のゲノム内 に組み込まれるかの何れかである。 「プラスミド」とは、細胞内での複製が可能な自律性環状ＤＮＡ分子をいい、 発現型および非発現型の双方を含む。組換え微生物または組換え細胞培養体が「 発現プラスミド」を宿していると記載されている場合、これは宿主の染色体に組 み込まれた潜伏ウイルスＤＮＡを含む。プラスミドが宿主細胞によって維持され る場合、該プラスミドは、自律性構造として有糸分裂中に細胞によって安定して 複製されているか、または宿主のゲノム内に組み込まれているかの何れかである 。 「組換え蛋白質」または「組換えにより産生された蛋白質」とは、非天然細胞 を用いて産生されたポリペプチドをいう。該細胞は適当な核酸配列の組み込みに より遺伝的に改変されているので、該蛋白質を産生する。 ２以上の核酸分子配列関係を記載するために以下の用語が用いられる：「対照 配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の割合（％）」お よび「実質的同一性」。「対照配列」は、配列比較のための基礎として用いられ る定義された配列であり、対照配列はより大きな配列のサブセット、例えば配列 一覧表の中に与えられた全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列のセグメントであっても よいし、または完全ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列から構成されていてもよい。 比較ウインドウの配列の最適な整列は、SmithおよびWaterman(1981)Adv.Appl ．Math．2:482のアルゴリズムよって、NeedlemanおよびWunsch(1970)J.Mol．Bio l．48:443のアルゴリズムによって、PearsonおよびLlpman(1988)Proc．Natl．Ac ad．Sci．85:2444の類似性のための検索方法、またはこれらのアルゴリズムのコ ンピュータ化装置(GAP，BESTFITPackage Release 8.0,Genetics Computer Group ，575 Science Dr.，Madison，WI)によって行われる。 ポリペプチドに対して適用される場合、「実質的同一性」または「実質的配列 の同一性」とは、２つのペプチド配列が、デフォールトギャップを用いたＧＡＰ またはＢＥＳＴＦＩＴなどにより最適に整列された場合に、少なくとも９０％の 配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、さらに好ましくは少な くとも９９％を超える配列同一性を共有することを意味する。 「アミノ酸の同一性の割合（％）」または「アミノ酸配列の同一性の割合（％ ）」とは、最適に配置された場合、ほぼ示された割合（％）の同一のアミノ酸を 有する２つのポリペプチドのアミノ酸の類似性をいう。例えば、「９５％のアミ ノ酸の同一性」とは、最適に整列された場合に、９５％のアミノ酸の同一性を持 つ２つのポリペプチドのアミノ酸の類似をいう。同一ではない残基部位は同類ア ミノ酸置換基に変更することが望ましい。例えば、電荷や極性のごとき類似の化 学的特性を持つアミノ酸の置換基は、恐らく蛋白質の特性に影響を与えないであ ろう。その例としては、アスパラギンに対するグルタミン、またはアスパラギン 酸に対するグルタミン酸が挙げられる。 「実質的に精製された」または「単離された」とは、ヘルペスウイルスポリペ プチドに対していう場合、他の細胞内成分を実質的に含まない化学組成物を意味 する。それは乾燥物または水溶液の何れであってもよいが、均一な状態であるこ とが好ましい。純度および均一性は典型的にはポリアクリルアミドゲル電気泳動 もしくは高速液体クロマトグラフィーのごとき分析化学的技術を用いて求められ る。調製物に存在する優勢種である蛋白質は、実質的に精製されている。一般的 に実質的に精製されまたは単離された蛋白質は、その調製物中に存在する全ての 高分子種の８０％を上回って含まれる。該蛋白質が９５％を上回るまで精製され ていることがより好ましく、他の高分子種が常法により検出されない、実質的に 均一な状態まで精製されていることが最も好ましい。 「抗体に特異的に結合する」または「特異的に免疫反応可能な」とは、ポリペ プチドに対していう場合、ポリペプチドおよびＫＳＨＶ以外のウイルスを含む他 の生物製剤の不均一な集団の存在中に、本発明のＫＳＨＶポリペプチドが存在す ることの決定因である結合反応をいう。かくして、明示されたイムノアッセイ条 件の下、同定された抗体はＫＳＨＶ抗原に結合し、試料中に存在する他の抗原と は有意な量では結合しない。 かかる条件の下での抗体との「特異的結合」は、その特定の抗原に対する特異 性について選択された抗体を要求すると考えられる。例えば、本明細書で記載さ れたＫＳＨＶ抗原に対して作出された抗体を選択して、ＫＳＨＶポリペプチドと 特異的に免疫反応性を有し、他のポリペプチドとは免疫反応性をもたない抗体を 得ることができる。 本明細書で用いられる場合、「生物学的試料」とは、生命のある生物に由来す る、または死亡した生物に由来する何れの試料をもいう。生物学的試料の例とし ては、体液および組織標本が挙げられる。 特定の配列リストに言及する場合、かかる言及は、少数の配列決定エラー、単 一の塩基変化、欠失、置換などに関する許容を含む、当該リストおよびその相補 体に実質的に相当する配列およびその相補体を含み、その結果、かかる配列変化 が、それに対して関係配列リストが関与する病原生物または疾病マーカーの核酸 配列に相当することを当業者ならば容易に理解するであろうし、これは本明細書 の意図するところである。 Ｉ．ＫＳＨＶ由来の核酸分子 本発明はカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(Kaposi's sarcoma-associatedherp esvirus；ＫＳＨＶ）ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する 。 １つの態様では、ＫＳＨＶポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、 ジーンバンク受付番号(Genebank Accession Number)Ｕ７５６９８に示されるご とき核酸配列を有し、その開始コドンおよび停止コドンは表１に示される。もう １つの態様では、ＫＳＨＶポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、ジ ーンバンク受付番号Ｕ７５６９８に示される核酸配列の翻訳によって定義された アミノ酸配列を有し、その開始コドンおよび停止コドンは表１に示される。 １つの態様では、ＫＳＨＶポリペプチドについて単離された核酸分子は、ＡＴ Ｇ開始コドンの上流に、ジーンバンク受付番号Ｕ７５６９８に示されるごとき５ ’非翻訳配列を有する。もう１つの態様では、ＫＳＨＶポリペプチドについて単 離された核酸分子は、停止コドンの下流に、ジーンバンク受付番号Ｕ７５６９８ に示されるごとき３’非翻訳配列を有する。 １つの態様では、単離された核酸分子はゲノムＤＮＡである。もう１つの態様 では、単離された核酸分子はｃＤＮＡである。またもう１つの態様では、ＲＮＡ は該単離された核酸分子に由来するか、または該単離された核酸分子とハイブリ ダイズする能力を有する。 さらに、前記核酸分子は、限定されるものではないが、ホジキン病、非ホジキ ンリンパ腫、リンパ性白血病、リンパ肉腫、脾腫、細網肉腫、セザリー症候群、 菌状息肉腫、中枢神経系リンパ腫、ＡＩＤＳ関連中枢神経系リンパ腫、移植後リ ンパ組織増殖障害、およびバーキットリンパ腫を含むリンパ組織増殖障害と関連 していると考えられる。リンパ組織増殖障害は、リンパ節、リンパ球様組織およ び他の器官に含まれるリンパ球の制御されないクローン性またはポリクローン性 の拡大であることに特徴付けられる。 Ａ．ＫＳＨＶの単離および増殖 ＫＳＨＶはイン・ビトロで増殖できる。例えば、ヘルペスウイルスを増殖させ る方法が文献（Ablashiら，in Virology 184，545-552）に記載されている。便 宜には、ＰＨＡに刺激される索血球細胞、マクロファージ、神経細胞または神経 膠細胞株を、脳脊髄液、血漿、抹消血液白血球、またはウイルス感染細胞もしく は精製ウイルスを始めとする組織抽出物と共に培養する。感染に先立ち、該受容 細胞を５μｇ／ｍｌポリブレンで３７℃にて２時間処理する。形態的変化を指摘 すると共にウイルス抗原に対し陽性であることにより、感染細胞を確認する。 ＫＳＨＶを単離するには、該ウイルスを遠心分離により細胞培養液から直接回 収するか、或いは、感染細胞を回収し、ホモジナイズするかまたは溶菌し、次い でウイルスを細胞残渣から単離し、標準法である密度差を利用したショ糖密度勾 配遠心分離により精製されるかの何れかである。 当業者は、以下のプロトコールを用いてＫＳＨＶを単離し、次いで増殖させて もよい。ＫＳＨＶで感染させた長期樹立Ｂリンパ系細胞株（例えば、ＲＣＣ−１ 、ＨＢＬ−６またはＢＣＢＬ−１）は、リンパ腫に基づく体腔と標準法を用いて 達成される(Glick，1980，Fundamentals of Human Lymphoid Culture，Marcel D ekker，New York; Knowlesら，1989，Blood 73，792−798; Metcalf，1984,Clon al Culture of Hematopoetic Cells: Techniques and Applications,Elsevier， New York)。 感染した生細胞を含む新鮮リンパ腫組織を濾過して単一細胞懸濁物を樹立する 。 フィコール−プラーク遠心分離により細胞を分離し、次いでリンパ球層を取り出 す。次いで該リンパ球を、１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ１６４０のご とき標準リンパ球組織培養培地へ、１×１０6細胞／ｍｌを超える密度で移す。 ＫＳＨＶを含む不死化したリンパ球は培地中で無期限に増殖するが、非不死化細 胞は長期の培養過程の間に死滅する。 さらに、ＫＳＨＶは、感染維持細胞株に由来するウイルスを１×１０6細胞／ ｍｌを超える密度で含む培地上清を除去することにより、新規の細胞株で増殖さ せてもよい。培地を２０００ｘｇで１０分間遠心分離し、次いで０．４５μフィ ルターを通して濾過して細胞を取り出す。培地は１：１容量で使用すし、細胞は ４８時間で１×１０6細胞／ｍｌを超える密度で増殖する。細胞を洗浄し、ペレ ット状にして新鮮培地に移し、次いで１４時間後にＫＳＨＶについて試験を行う 。 ＫＳＨＶは以下の方法を用いて細胞株から単離してよい。感染細胞株を低浸透 圧ショックまたはドーンス均質化(Dounce homogenization)のごとき標準法を用 いて、或いは少容量での（３ｍｌより少ない）解凍・冷凍反復サイクルを用いて 溶菌させ、次いで２０００ｘｇで１０分間遠心分離してペレット状にする。上清 を取り出し、次いで１０，０００ｘｇで１５分間遠心分離して、核およびオルガ ネラを除去する。得られた低速での細胞フリー上清を０．４５μフィルターを通 して濾過し、次いで１００，０００ｘｇで１時間遠心分離してウイルスをペレッ ト状にする。次いで、該ウイルスを洗浄し、再度ペレット状にする。標準法（例 えば、フェノール／クロロホルム）によって該ウイルスペレットからＤＮＡを抽 出し、次いで前記した特異的プローブを用いてサザンブロッティングおよび／ま たはＰＣＲによりＫＳＨＶの存在について試験する。 結合している全ビリオンに関しては、低速での細胞フリー上清を７％ＰＥＧ− ８０００を含むように調整する。ＰＥＧ−上清を、１０，０００ｘｇで３０分回 転させる。上清を流し出し、次いでペレットを回収し、少容量（１−２ｍｌ）の ウイルス緩衝液（ＶＢ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍトリス、ｐＨ７．５） に細懸濁させる。ＶＢで作製した１０−１５％のショ糖密度勾配中において、２ ５，０００ｒｐｍでの遠心分離によりビリオンを単離する。標準法（例えば、フ ラクショネーターを用いる）によって勾配の画分を得、次いで特異的ハイブリダ イズプローブを用いてドット・ブロッティングによって各画分を試験して、精製 ウイルスを含有する勾配画分を求める（該画分の調製はウイルスの存在を検出す るために必要である。すなわち標準的ＤＮＡ抽出）。 ＫＳＨＶゲノムを単離する方法は、Pellicerら，1978，Cell 14，133-141並び にGibsonおよびRoizmann，1972，J．Virol．10，1044-57に基づく。 ＫＳＨＶゲノムを単離する最終的な方法は、クランプ均一電場（ＣＨＥＦ）ゲ ル電気泳動である。アガロースプラグは、４２℃で１％ ＬＭＰアガロース(Bior ad)および０．９％ ＮａＣｌ中にＲＳＨＶで感染させた細胞を再懸濁させて、最 終濃度を２．５ｘ１０7細胞／ｍｌとすることによって調製する。固化したアガ ロースプラグを溶菌緩衝液（０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、１％ サルコシル 、プロテナーゼＫで最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）に移し、次いで２４時間インキュベ ートする。約１０7個の細胞を各々のレーンに充填する。ＣＨＥＦ Ｍａｐｐｅｒ ＸＡ パルス電場電気泳動装置(Biorad)上で、泳動時間を２８時問とし、６．０ Ｖ／ｃｍの勾配でゲルを泳動させ、サザンブロッティングを行い、ＫＳ６ ３１Ｂａｍ、ＫＳ３３０ＢａｍおよびＥＢＶ末端反復配列とハイブリダイズさせ る。 ＫＳＨＶで感染させた新規な細胞株を作製するために、すでに感染した細胞を Ｒａｊｉ細胞株と共に培養し、０．４５μフィルターで単離する。約１−２ｘ１ ０6個の既に感染したＢＣＢＬ−１および２ｘ１０6個のＲａｊｌ細胞を、２−２ ０日問ＲＰＭＩ単独を補足した培地の中で、または２０ｎｇ／ｍｌ １２−Ｏ− テトラデカノールフォルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）と共に培養する。 ２−２０日の共培養後、Ｒａｊｉ細胞を除去し、洗浄し、次いでＲＰＭＩ １６ ４０を補足した培地に置く。２日間２０ｎｇ／ｍｌ ＴＰＡ中でＢＣＢＬ−１と 共に培養したＲａｊｉ培養物生存し、１０週間を超える連続懸濁培養でも維持さ れる。ＲＣＣ−１（Ｒａｊｉ Ｃｏ−Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｎｏ．１）と名づけられ たこの細胞株は、複数回経過した後も、ＫＳＨＶ配列に関してＦＣＲ陽性のまま である。ＲＣＣ−１細胞は、ＫＳＨＶの溶菌増殖を暗示する急速な細胞分解を周 期的に行う。かくして、ＲＣＣ−１はＫＳＨＶで新たに感染したＲａｊｉ細胞株 である。 特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、Ｒ ＣＣ−１およびＲＣＣ−１2F5を１９９４年１０月１９日に、American Type Cul ture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852 U.S.Aの the Patent Culture Depositoryに、各々ＡＴＣＣ受付番号ＣＲＬ１１７３４お よびＣＲＬ１１７３５として寄託した。特許手続上の微生物の寄託の国際的承認 に関するブダペスト条約に従って、ＨＢＬ−６を（ＢＨＬ−６として）１９９４ 年１１月１８日に、アメリカン・タイプ・アンド・カルチャー・コレクション（ American Type Culture Collection，12301 Parklawn Drive,Rockville，Maryla nd 20852 U.S.Aのthe Patent Culture Depository）に、ＡＴＣＣ受付番号Ｎｏ ．ＣＲＬ１１７６２として寄託した。 Ｂ．ＫＳＨＶのハイブリダイゼーションプローブ 本発明は、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号Ｕ７５６９８、Ｕ７５６９９、Ｕ７５７０ ０で示されるごとき、単離した核酸分子と特異的にハイブリダイズすることがで きる少なくとも１４個のヌクレオチドを有する核酸分子を提供する。 １つの態様では、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号Ｕ７５６９８で示される核酸分子は 、ＫＳＨＶポリペプチドをコードする長い特異的領域（ＬＵＲ）を含む。もう１ つの態様では、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号Ｕ７５６９９で示される核酸分子は、プ ロトタイプ末端反復（ＴＲ）を含む。もう１つの態様では、ＧｅｎＢａｎｋ受付 番号Ｕ７５７００で示される核酸分子は、不完全末端反復（ＩＴＲ）を含む。 １つの態様では、該分子は８個ないし３６個のヌクレオチドである。もう１つ の態様では、該分子は１２個ないし２５個のヌクレオチドである。もう１つの態 様では、該分子は１４個のヌクレオチドである。 １つの態様では、該分子はＤＮＡである。もう１つの態様では、該分子はＲＮ Ａである。 １つの態様では、該ＴＲ分子は、ＤＮＡの複製およびパッケージングに必要な シス活性要素を含む。もう１つの態様では、該ＴＲ分子は遺伝子クローニングベ クター中に含まれる。もう１つの態様では、該ＴＲ分子は遺伝子治療ベクター中 に含まれる。もう１つの態様では、該遺伝子治療ベクターはリンパ系細胞中に発 現する。もう１つの態様では、該ＴＲは腫瘍のクローン性を決定するための分子 マーカーを含む。もう１つの態様では、該マーカーは診断上の分析において腫瘍 の自然な進展の特徴の決定付けを提供する。 本発明は、８０１ｂｐ ＫＳＨＶ ＴＲもしくはその一部を含むプラスミドまた は他の自己複製可能なＤＮＡ分子を含むＢ−リンパ栄養性ＤＮＡベクターを提供 する。 高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、規定したイオン強度 およびｐＨでの特異的配列のための熱融点（Ｔm）よりも約５℃低く選択されて いる。該Ｔmは、塩濃度の５０％がｐＨ７で少なくとも約０．０２モルである（ 規定したイオン強度およびｐＨ下での）温度であり、該温度は少なくとも約６０ ℃である。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに著しく影響を及ぼし 得る他の因子として、数ある中で、塩基組成および相補鎖のサイズ、有機溶媒の 存在、すなわち、塩またはホルムアミドの濃度、および塩基の誤対合する程度が 挙げられ、パラメーターの組み合わせがどれか１つの絶対値よりもより重要であ る。例えば、高ストリンジェンシーは、６Ｘ ＳＳＣ溶液中において約６８℃ で一晩ハイブリダイズさせ、室温にて６Ｘ ＳＳＣ溶液で洗浄し、次いで約６８ ℃で０．６Ｘ ＳＳＣ溶液中で洗浄することによって達成されてよい。 中程度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションは、例えば、１）フ ィルタープレハイブリダイゼーションを行い、ｐＨ７．５にて３Ｘ ＳＳＣ、５ ０％ホルムアミド、０．１Ｍ トリス緩衝液の溶液、５Ｘ デンハルト溶液でハ イブリダイズさせ、２）４時間３７℃でのプレハイブリダイゼーション、３） １６時間３７℃において、全体で３，０００，０００ｃｐｍに等しい量の標識プ ローブでのハイブリダイゼーション、４）ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ溶液で 洗浄、５）室温で１分ごとに４回、６０℃で３０分ごとに４Ｘ ＳＳＣで洗浄、 次いで６）乾燥およびフィルムに感光させることによって達成してよい。 核酸クローブ技術は当業者に周知であり、当業者は、かかるプローブは長さが 著しく変化し、該プローブの検出を容易にするために放射性同位体または蛍光染 料のごとき検出可能な標識でラベルし得ることを容易に理解するであろう。ＤＮ Ａプローブ分子は、単離したＤＮＡウイルスの核酸分子の全長または断片を有す るＤＮＡ分子を、プラスミドまたはバクテリオファージのごとき適切なベクター に挿入し、次いで適切な細菌性宿主細胞へ形質転換させ、形質転換した細菌性宿 主細胞中で複写させ、当該分野において公知の方法を用いて該ＤＮＡプローブを 回収することによって生産すればよい。別法として、ＤＮＡ合成装置から化学的 にプローブを作製してもよい。 ＲＮＡプローブは、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６のごときバクテリオファージプロ モーターの下流にＤＮＡウイルスの単離核酸分子の全長または断片を挿入するこ とによって作製すればよい。標識したヌクレオチドをＤＮＡウイルスの単離した 核酸分子を線状化したもの、または適切なＲＮＡポリメラーゼの存在下で上流に プロモーターを含むその断片と共にインキュベートすることにより、多量のＲＮ Ａプローブを作製してもよい。 本明細書で定義したように、核酸プローブはＤＮＡまたはＲＮＡ断片であって よい。ＤＮＡ断片は、例えば、プラスミドＤＮＡを消化することによって、また はＰＣＲの使用によって調製してもよく、あるいは文献（BeaudageおよびCarrut hers，1981，Tetrahedron Lett．72，1859-1862）に記載されたホスホル アミダイト法、または文献（Metteucciら、1981，Am．Chem．Soc．103:3185）に 従うトリエステル法の何れかによって合成してもよい。次いで、所望により、適 切な条件下で化学的に合成された一本鎖と共にアニーリングすることによるか、 または適切なプライマー配列を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を合成 することによって、二本鎖断片を得てもよい。核酸プローブの特異的な配列が与 えられた場合、その相補鎖断片もまた同定され、含まれることが理解される。該 相補鎖は、標的が二本鎖核酸である状況の下で、同様に十分に作用すると考えら れる。核酸プローブを使用のために特異的配列が同定される場合には、長さが２ ５個以上の塩基対（ｂｐ）である配列表に記した配列のサブ配列もまた、プロー ブとしての使用に関して含まれることが理解される。 また、本発明の核酸分子には、１個以上のアミノ酸残基の同定または位置決定 の点からみて自然に生じる形態とは異なっている抗原性ポリペプチドのポリペプ チド類縁体、断片または誘導体（ポリペプチドに対して指定した全部より少ない 残基を含む欠失類縁体、指定した１個以上の残基が他の残基によって置換されて いる置換類縁体および１個以上のアミノ酸残基をポリペプチドの末端または中央 部分に付加している付加類縁体）であって、かつ自然に生じる形態の性質のいく つかまたは全てを分けもっている類縁体をコードする分子をも含む。これらの分 子には、選択された非哺乳類宿主による発現のために「好ましい」コドンの組み 込み、制限エンドヌクレアーゼ酵素による開裂のための部位の提供、および容易 に発現するベクターの構築を容易にする付加した開始部の、末端部のまたは中間 部のＤＮＡ配列の提供が含まれる。 Ｃ．ＫＳＨＶのポリペプチドおよびそれに対する抗体（ＡＢ’ｓ） 本発明は、単離したＫＳＨＶポリペプチド、表１および以下に示すリストから の１つを提供する。 本発明は、ウイルスのマクロファージ炎症性蛋白質III（ｖＭＩＰ−III）を含 む単離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。１つの態様では、ｖＭＩＰ−IIIはオ ルフォンサイトカインを含む。もう１つの態様では、ｖＭＩＰ−IIIはヌクレオ チド２２，５２９−２２，１８５によってコードされている。もう１つの態様で は、ｖＭＩＰ−IIIは抗炎症薬を含む。好ましい態様では、該薬剤は自己免疫 障害の治療に有用である。最も好ましい態様では、慢性関節リウマチの治療に有 用である。 本発明は、ＯＲＦ２によってコードされるジヒドロホレートレダクターゼ（Ｄ ＨＦＲ）を含む単離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。１つの態様では、ＤＨＦ ＲはＫＳＨＶヌクレオチド合成に関与する。もう１つの態様では、ＤＨＦＲはウ イルスの複製に必須な、すなわちウイルスの産生を防ぐことを阻害する酵素を含 む。もう１つの態様では、ＤＨＦＲはサブユニットワクチンを含む。もう１つの 態様では、ＤＨＦＲは免疫学的分析のための抗原を含む。 もう１つの態様では、ＤＨＦＲは配列番号１に示すごときアミノ酸配列を有す る。 もう１つの態様では、ＫＳＨＶ ＤＨＦＲは、細菌性ＤＨＦＲを阻害すること が知られているサルファ剤によって阻害される。好ましい態様では、ＫＳＨＶＤ ＨＦＲは、哺乳類のＤＨＦＲを阻害することが知られているメトトレキセートま たはその誘導体によって阻害されている。もう１つの態様では、該サルファ剤、 メトトレキセートまたはその誘導体は、ＫＳＨＶの阻害のためのヒトヘルペスウ イルスの中から選択できる。 本発明は、ＯＲＦ７０によってコードされるチミジレートシンターゼ（ＴＳ） を含む単離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。１つの態様では、ＴＳはＫＳＨＶ ヌクレオチド代謝に関与する。もう１つの態様では、ＴＳはウイルスの複製に必 須な、すなわちウイルスの産生を防ぐことを阻害する酵素を含む。もう１つの態 様では、ＴＳはサブユニットワクチンを含む。もう１つの態様では、ＴＳは免疫 学的分析のための抗原を含む。 本発明は、ＯＲＦ９によってコードされるＤＮＡポリメラーゼを含む単離ＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。１つの態様では、ＤＮＡポリメラーゼはウイルス の複製に必須な、すなわちウイルスの産生を防ぐことを阻害する酵素を含む。も う１つの態様では、ＤＮＡポリメラーゼはサブユニットワクチンを含む。もう１ つの態様では、ＤＮＡポリメラーゼは免疫学的分析のための抗原を含む。 本発明は、ＯＲＦ３７によってコードされるアルカリ性エキソヌクレアーゼを 含む単離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。１つの態様では、アルカリ性エキソ ヌクレアーゼはＫＳＨＶ ＤＮＡをウイルス粒子中に封入する。もう１つの態様 では、アルカリ性エキソヌクレアーゼは、ウイルスの複製に必須な、すなわちウ イルスの産生を防ぐことを阻害する酵素を含む。もう１つの態様では、アルカリ 性エキソヌクレアーゼはサブユニットワクチンを含む。もう１つの態様では、ア ルカリ性エキソヌクレアーゼは免疫学的分析のための抗原を含む。 本発明は、各々ＯＲＦ４０、４１および４４によってコードされるヘリカーゼ −プライマーゼ、サブユニット１、２および３を含む単離ＫＳＨＶポリペプチド を提供する。１つの態様では、ヘリカーゼ−プライマーゼはウイルスのＤＮＡ複 製に必須な酵素活性を有する。もう１つの態様では、ヘリカーゼ−プライマーゼ はヌクレオチド類縁体によって阻害される。もう１つの態様では、ヘリカーゼ− プライマーゼは公知の抗ウイルス剤によって阻害される。もう１つの態様では、 ヘリカーゼ−プライマーゼの阻害はＫＳＨＶ複製を防ぐ。 本発明は、ＯＲＦ４６によってコードされるウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ ＵＤＧ）を含む単離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。１つの態様では、ウラシ ルＤＮＡグリコシラーゼは、ＤＮＡ複製の間にＫＳＨＶのＤＮＡ修復に必須な酵 素を含む。もう１つの態様では、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼは公知の抗ウイ ルス剤によって阻害される。もう１つの態様では、ウラシルＤＮＡグリコシラー ゼはサブユニットワクチンを含む。もう１つの態様では、ウラシルＤＮＡグリコ シラーゼは免疫学的分析のための抗原を含む。 本発明は、ＯＲＦ０６によってコードされる一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（ＳＳＢ Ｐ）を含む単離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。１つの態様では、ＳＳＢＰは ＫＳＨＶのＤＮＡ複製に必須な酵素を含む。もう１つの態様では、ＳＳＢＰは公 知の抗ウイルス剤によって阻害される。もう１つの態様では、ＳＳＢＰはＤＮＡ 増幅のための従来のＰＣＲ法におけるごときポリメラーゼ反応のプロセシビティ ーを増強させる。 本発明は、ＯＲＦ３６によってコードされるウイルス性蛋白質キナーゼを含む 単離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。もう１つの態様では、ウイルス性蛋白質 キナーゼは免疫学的分析のための抗原を含む。もう１つの態様では、ウイルス性 蛋白質キナーゼはサブユニットワクチンを含む。 本発明は、ＯＲＦ５０によってコードされる溶菌サイクルトランスアクチベー ター蛋白質（ＬＣＴＰ）を含む単離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。１つの態 様では、ＬＣＴＰは潜伏状態から生産的感染の活性化のために必要とされる。も う１つの態様では、ＬＣＴＰは公知の抗ウイルス剤によって阻害される。もう１ つの態様では、ＬＣＴＰ発現の防止は、複製できない潜伏状態にウイルスを維持 する。 本発明は、リボヌクレオチドレダクターゼ、その小サブユニットおよび大サブ ユニットが各々ＯＲＦ６０およびＯＲＦ６１によってコードされる２つのサブユ ニット酵素を含む単離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。もう１つの態様では、 リボヌクレオチドレダクターゼは、リボヌクレオチドのＤＮＡ複製のためのデオ キシリボヌクレイチドへの変換を触媒する。もう１つの態様では、リボヌクレオ チドレダクターゼは、末端で区別された細胞のリボヌクレオチドレダクターゼを 発現しない細胞において、公知の抗ウイルス剤によって阻害される。もう１つの 態様では、リボヌクレオチドレダクターゼは免疫学的分析のための抗原を含む。 もう１つの態様では、リボヌクレオチドレダクターゼはサブユニットワクチンを 含む。もう１つの態様では、リボヌクレオチドレダクターゼは、不死化された細 胞株の樹立のための形質転換剤を含む。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ１によってコードされる蛋白質を含む単離したＫＳＨＶ ポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ４によってコードされる相補的結合性蛋白質（ｖ−ＣＢＰ； ＣＣＰ）を含む単離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ７によつてコードされる輸送蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリ ペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ８によってコードされる糖蛋白質Ｂを含む単離ＫＳＨＶポリ ペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ１０によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリペ プチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ１１によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリペ プチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ２によってコードされるウイルス性インターロイキン６ （ｖＩＬ−６）を含む単離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。１つの態様では、 ｖＩＬ−６を選択的に認識する抗体はリンパ腫間で区別を可能にする。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ３によってコードされるＢＨＶ４−ＩＥ１ Ｉを含む単 離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ４によってコードされるｖＭＩＰ−ＩＩを含む単離ＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。１つの態様では、ｖＭＩＰ−ＩＩは抗炎症薬を含 む。好ましい態様では、該薬剤は自己免疫障害の治療に有用である。最も好まし い態様では、該薬剤は慢性関節リウマチの治療に有用である。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ５によってコードされるＢＨＶ４−ＩＥ１ ＩＩを含む 単離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ６によってコードされるｖＭＩＰ−Ｉを含む単離ＫＳＨ Ｖポリペプチドを提供する。１つの態様では、ｖＭＩＰ−Ｉは抗炎症薬を含む。 好ましい態様では、該薬剤は自己免疫障害の治療に有用である。最も好ましい態 様では、該薬剤は慢性関節リウマチの治療に有用である。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ７によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリ ペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ１６によってコードされるＢｃｌ−２を含む単離ＫＳＨＶポ リペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ１７によってコードされるキャプシッド蛋白質Ｉを含む単離 ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ１８によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリペ プチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ１９によってコードされる外被蛋白質Ｉを含む単離ＫＳＨＶ ポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ２０によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリペ プチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ２１によってコードされるチミジンキナーゼを含む単離ＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ２２によってコードされる糖蛋白質Ｈを含む単離ＫＳＨＶポ リペプチドを提供する。 １つの態様では、ＯＲＦ２３によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶ ポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ２４によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリペ プチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ２５によってコードされる主要キャプシッド蛋白質を含む単 離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ２６によってコードされるキャプシッド蛋白質ＩＩを含む 単離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ２７によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリ ペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ２８によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリペ プチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ２９ｂによってコードされるパッケージング蛋白質ＩＩを含 む単離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ３０によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリペ プチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ３１によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリペ プチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ３２によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリペ プチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ３３によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリペ プチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ２９ａによってコードされるパッケージング蛋白質Ｉを含む 単離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ３４によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリペ プチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ３５によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリペ プチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ３８によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリペ プチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ３９によってコードされる糖蛋白質Ｍを含む単離ＫＳＨＶポ リペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ４２によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリペ プチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ４３によってコードされるキャプシッド蛋白質ＩＩＩを含む 単離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ４５によってコードされるビリオンアッセンブリー蛋白質を 含む単離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ４７によってコードされる糖蛋白質Ｌを含む単離ＫＳＨＶポ リペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ４８によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリペ プチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ４９によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリペ プチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ８によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリ ペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ５２によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリペ プチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ５３によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリペ プチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ５４によってコードされるｄＵＴＰアーゼを含む単離ＫＳＨ ｖポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ５５によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリペ プチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ５６によってコードされるＤＮＡ複製蛋白質Ｉを含む単離Ｋ ＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ５７によってコードされる初期蛋白質ＩＩ（ＬＥＰ−II）を 含む単離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ９によってコードされるウイルス性インターフェロン調 節因子１（ｖＩＲＦ１；ＩＣＳＢＰ）を含む単離ＫＳＨＶポリペプチドを提供す る。１つの態様では、ｖＩＲＦ１は形質転換性ポリペプチドである。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ１０によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポ リペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ１１によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポ リペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ５８によってコードされるリン酸蛋白質を含む単離ＫＳＨＶ ポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ５９によってコードされるＤＮＡ複製蛋白質ＩＩを含む単離 ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ６２によってコードされるアッセンブリー／ＤＮＡ成熟蛋白 質を含む単離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ６３によってコードされる外被蛋白質ＩＩを含む単離ＫＳＨ Ｖポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ６４によってコードされる外被蛋白質ＩＩＩを含む単離ＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ６５によってコードされるキャプシッド蛋白質ＩＶを含む単 離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ６６によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリペ プチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ６７によってコードされる外被蛋白質ＩＶを含む単離ＫＳＨ ｖポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ６８によってコードされる糖蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリ ペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ６９によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポリペ プチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ１２によってコードされるカポジンを含む単離ＫＳＨＶ ポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ１３によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポ リペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ７２によってコードされるサイクリンＤを含む単離ＫＳＨＶ ポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ７３によってコードされる前初期蛋白質（ＩＥＰ）を含む単 離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ１４によってコードされるＯＸ−２を含む単離ＫＳＨＶ ポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ７４によってコードされるＧ−蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポ リペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ７５によってコードされる外被蛋白質／ＦＧＡＲＡＴを含む 単離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ１５によってコードされる蛋白質を含む単離ＫＳＨＶポ リペプチドを提供する。 本発明は、ヌクレオチド８８，９１０−８８，４１０によってコードされるウ イルス性インターフェロン調節因子２（ｖＩＲＦ２）を含む単離ＫＳＨＶポリペ プチドを提供する。 本発明は、ヌクレオチド９０，５４１−８９，６００によってコードされるウ イルス性インターフェロン調節因子３（ｖＩＲＦ３）を含む単離ＫＳＨＶポリペ プチドを提供する。 本発明は、ヌクレオチド９４，１２７−９３，６３６によってコードされるウ イルス性インターフェロン調節因子４（ｖＩＲＦ４）を含む単離ＫＳＨＶポリペ プチドを提供する。 本発明は、ヌクレオチド９０，１７３−９０，６４３によってコードされる分 泌性糖蛋白質Ｘ（ｇＸ）の前駆物質を含む単離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する 。 本発明は、ヌクレオチド２８，６６１−２９，７４１によってコードされる蛋 白質Ｔ１．１を含む単離ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 さらに、単離した核酸分子を第二の核酸分子に連結し、適切な宿主内で発現さ せることにより、単離ポリペプチドを第二のポリペプチドと連結させて融合蛋白 質を形成してもよい。１つの態様では、第二の核酸分子はβ−ガラクトシダーゼ をコードする。融合蛋白質を形成するために用いられる他の核酸分子は当業者に 公知である。 本発明は単離した核酸分子によってコードされるポリペプチドに特異的に結合 する抗体を提供する。１つの態様では、該抗体はモノクローナル抗体である。も う１つの態様では、該抗体はＫＳＨＶポリペプチドのエピトープを認識する。も う１つの態様では、該抗体はＫＳＨＶポリペプチドの１以上のエピトープを認識 する。もう１つの態様では、該抗体は抗−イディオタイプ抗体である。 抗体、ポリペプチドまたは単離核酸分子は、限定されるものではないが、放射 性標識、または比色定量性マーカー、ルミネセンスマーカー、または蛍光マーカ ー、もしくは金を始めとする検出可能なマーカーで標識してもよい。放射性標識 としては、限定されるものではないが、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ、36Ｃｌ 、51Ｃｒ、57Ｃｏ、59Ｃｏ、59Ｆｅ、90Ｙ、125Ｉ、135Ｉおよび136Ｒｅが挙げ られる。蛍光マーカーとしては、限定されるものではないが、フルオレセイン、 ローダミンおよびオーラミンが挙げられる。比色定量マーカーとしては、限定さ れるものではないが、ビオチンおよびジゴキシゲニンが挙げられる。ポリクロー ナル抗体またはモノクローナル抗体を生産する方法は、当業者に公知である。 さらに、該抗体、ポリペプチドまたは核酸分子は、アルカリ性ホスファターゼ またはセイヨウワサビペルオキシダーゼのごとき酵素と結合させた二次抗体によ って検出してもよい。使用されてよい他の酵素は当業者には十分公知である。 本発明は、適切な条件の下で、ポリペプチドを産生させ、次いでかくのごとく に産生されたポリペプチドを回収する、宿主ベクター系を増殖させることを特徴 とする、単離した核酸分子によりコードされたポリペプチドを生産する方法を提 供する。適切な宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物、昆虫および哺乳 類細胞が挙げられる。ポリペプチドを生産し、次いでポリペプチドを回収するた めの宿主ベクター系は当業者に十分公知であり、限定されるものではないが、リ ポフェクチン(Gibco-BRD)またはリン酸カルシウム沈殿、もしくは細胞内へのベ クター導入を達成するための他の方法によって、哺乳類発現ベクターでトランス フェクトされたイー・コリ(E．coli)およびｐＭＡＬ(New England Biolabs)、Ｓ ｆ９昆虫細胞バキュロウイルス発現系、および哺乳類発現ベクター（例えば、Ｈ ｅＬａ、ＣＯＳ、ＮＩＨ ３Ｔ３およびＨＥＫ２９３）が挙げられる。当業者な らば、ＫＳＨＶポリペプチドの発現のために利用できる多くの発現系をよく知っ ている。 本発明は、ＤＮＡウイルスの単離核酸分子によってコードされるポリペプチド 上の特異的領域を選択して抗体を作製する方法を提供する。アミノ酸配列は当業 者に公知の方法によって分析して、それらが、それらが形成するポリペプチド中 の疎水性または親水性領域を産生するかどうかを決定してもよい。細胞膜ポリペ プチドの場合、疎水性領域が細胞膜の脂質二重層に挿入されるポリペプチドの一 部を形成することが公知であるが、親水性領域は水性環境中、細胞表面上に位置 する。通常、親水性領域は疎水性領域より免疫原性が高いと考えられている。従 って、親水性アミノ酸配列を選択し、ＤＮＡウイルスをコードする単離核酸分子 によってコードされるポリペプチドに対して特異的な抗体を作製するために用い てよい。選択抗体は商業的に入手可能な機械を用いて調製してよい。別法として 、核酸をクローン化して発現させ、得られたポリペプチドを回収して免疫原とし て用いてもよい。 選択したＫＳＨＶポリペプチドを用いて動物を免疫感作させることにより、該 ポリペプチドに対するポリクローナル抗体を生産してもよい。モノクローナル抗 体はハイブリドーマ技術を用い、さらに以下に記載されるごとくに、免疫感作さ せた動物由来の抗体産生Ｂ細胞をミエローマ細胞と融合させ、次いでその結果得 られた所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を選択することにより調製す る。 ＩＩ．イムノアッセイ ＫＳＨＶポリペプチド抗原に対して作製した抗体を、前記したようにして、当 該技術分野において十分公知である従来の標識技術を利用して、検出可能なよう に標識してよい。 さらに、標識として酵素を用いてもよい。適切な酵素としては、アルカリ性ホ スファターゼ、β−ガラクトシダ−ゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロ ゲナーゼ、マレエートデヒドロゲナーゼおよびペルオキシダーゼが挙げられる。 酵素イムノアッセイの２つの主要なタイプは、酵素結合イムノソルベント検定法 （ＥＬＩＳＡ）、および均一酵素イムノアッセイであり、これはまた酵素増幅免 疫測定法(ＥＭＩＴ，Syva Corporation，Palo Alto，CA)として公知である。Ｅ ＬＩＳＡ系においては、例えば固相に結合させた抗体の使用によって分離が達成 され得る。ＥＭＩＴ系は、トレーサー−抗体複合体中での酵素の失活に依存し、 かくして活性は分離工程を必要とせずに測定される。 さらに、標識として化学発光化合物を用いてもよい。典型的な化学発光化合物 としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミ ダゾール、アクリジニウム塩、およびオキサレートエステルが挙げられる。同様 に、生物発光化合物がラベリングに用いられてもよく、該生物発光化合物として はルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンが挙げられる。 ラジオイムノアッＧＳＥ七イ（ＲＩＡ）の記載は、文献（Laboratory Techniq ues in Biochemistry and Molecular Biology（1978）North Holland Publishin g Company，New York）の中に見られ、特にT．Chardによる「ラジオイムノアッ セイおよび関連技術への序論（An Introduction to Radioimmune Assay and Rel ated Techniques）」という標題の章で述べられている。種々のタイプの一般的 な免疫定量法の記載を、以下の米国特許第4,376,110号(Davidら)または第4,098, 876号(Piasio)中に見つけることができる。 Ａ．ＫＳＨＶポリペプチド抗原に関するアッセイ ウイルス、その成分、またはそれに対する抗体を検出するためには、イムノア ッセイを用いることができる。適用できる技術の全般的な総論としては、Harlow およびLane（1988）Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Pu blication，New Yorkがある。 １つの態様では、ＫＳＨＶポリペプチド抗原に対する抗体を用いることができ る。便宜には、抗体を生産するために、標的となるポリペプチドを発現させて精 製する。該生成物を、抗体を産生する能力を持つ哺乳類に注入する。該遺伝子産 物に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体（組換え抗体を含む ）の何れかを種々のイムノアッセイに用いることができる。かかるアッセイとし ては、競合イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット、ＥＬ ＩＳＡ、間接免疫蛍光法などが挙げられる。競合イムノアッセイについては、Ha rlowおよびLaneの５６７−５７３ページおよび５８４−５８９ページを参照のこ と。 モノクローナル抗体または組換え抗体は、当業者にとってはよく知られた技術 によって得ることができる。便宜には、所望の抗原で免疫感作させた動物由来の 脾臓細胞または他のリンパ細胞を、通常、ミエローマ細胞と融合させることによ って不死化させる(KohlerおよびMilstain，1976，Eur．J．Immunol．6，511-519 参照）。不死化の別法としては、エスタイン・バールウイルス、癌遺伝子、また はレトロウイルスでの形質転換、あるいは当該技術分野において十分公知の他の 方法がある。単一の不死化細胞に由来するコロニー形成を、抗原に対して所望の 特異性および親和性を有する抗体の産生についてスクリーニングしかかる細胞に よって産生されたモノクローナル抗体の収量を、脊椎動物宿主の腹膜腔に注射す ることを始めとする種々の技術によって増大させてもよい。また、組換えファー ジ抗体発現系を用いるより新しい技術も、モノクローナル抗体を作製するために 用いることができる。例えば、McCaffartyら，（1990）Nature 348，552；Hooge nboomら，（1991）Nuc．Acids Res．19，4133；およびMarksら，（1991）J.Mol Biol，222，581-597を参照されたい。 ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）Ｉ分子と結合する自然にプロセッシング を受けたペプチドを同定する方法を用いることができる。Falkら，1991,Nature 351，290および１９９２年１１月２６日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ９２／２１ ０３３を参照されたい。典型的には、これらの方法としては、適切な細胞または 細胞株からの免疫沈降またはアフィニティークロマトグラフィーによるＭＨＣク ラスＩ分子の単離が挙げられる。他の方法としては、Ｂ型細胞のクラス Ｉ分子から溶出したペプチドの公知の自動配列決定による種々のＨＰＬＣ画分に おける、さらに大量のペプチドの直接アミノ酸配列決定（Jardetzkeyら，1991,N ature 353，326）、および質量分析法によるヒトＭＨＣクラスＩ分子、ＨＬＡ− Ａ２．１型の直接アミノ酸配列決定(Huntら，1991，Eur．J．Immunol．21,2963- 2970)が挙げられる。ＭＨＣクラスＩ中で自然にプロセッシングを受けたペプチ ドの同定の全般的な総論としては、RotzschkeおよびFalk，1991，Immunol.Today 12，447もまた参照されたい。さらに、Marloesら，1991，Eur．J.Immunol．21 ，2963-2970は、クラスＩ結合モチーフを、イン・ビトロにおける潜在ウイルス の免疫原性あるペプチドの同定にいかに応用できるかを記載している。 組換え技術によって生産された、本明細書に記載のポリペプチドは、当業者に 周知の標準技術によって精製してもよい。組換えによって生産されたウイルスの ポリペプチドは、直接発現させることができるか、または融合蛋白質として発現 させることができる。次いで該蛋白質を細胞溶菌（例えば音波処理）およびアフ ィニティークロマトグラフィーの併用によって精製する。融合産物については、 それに続く、適切な蛋白質分解酵素での該融合蛋白質の消化が所望のペプチドを 放出させる。 硫酸アンモニウムのごとき物質での選択的沈殿、カラムクロマトグラフィー、 免疫精製法、および他の方法を始めとする当該技術分野において周知の標準技術 によって、該ポリペプチドを実質的な純度まで精製してよい。例えば、Scopes,1 982，Protein Purification: Principles and Practice，Springer-Verlag,New Yorkを参照されたい。 Ｂ．ＫＳＨＶポリペプチドに特異的に結合する抗体のアッセイ また、ＫＳＨＶのポリペプチド抗原と反応性のある抗体は、抗原の測定につい て前記した方法と同様である種々のイムノアッセイ法によって測定することもで きる。イムノアッセイ技術による抗体の測定に応用できる免疫学的およびイムノ アッセイ上の総論としては、Basic and Clinical Immunology，第７版、Stites およびTerr.編、およびHarlowおよびLane，1988，Antibodies，A Laboratory Ma nual，Cold Spring Harbor，New Yorkを参照されたい。 手短に言うと、ＫＳＨＶのポリペプチド抗原と反応性のある抗体を測定するイ ムノアッセイは、競合または非競合結合アッセイの何れかであってよい。競合結 合アッセイでは、試料被験体は、固体表面に結合した捕捉剤上の特異的結合部位 に対する標識被験体と競合する。好ましくは、該捕捉剤は、前記したようにして 生産された精製組換えヒトヘルペスウイルスポリペプチドである。また、単離さ れるか、または部分的に精製された天然に生じるポリペプチドを始めとする、ヒ トヘルペスウイルスポリペプチドの他の供給源も用いてよい。 非競合アッセイは、典型的には、試料被験体が２つの被験体特異的な結合性試 薬の間に結合されるサンドイッチアッセイである。該結合性試薬の１つを捕捉剤 として用いて、固体表面に結合させる。第２の結合性試薬は標識して、肉眼また は機械的手段により、結果として生じた複合体を測定または検出するために用い る。捕捉剤および標識された結合性試薬の多くの組み合わせを用いることができ る。また、種々の異なるイムノアッセイ形式、分離技術および標識も、ＫＳＨＶ ポリペプチド抗原の測定に関して前記したものと同様に用いることができる。 血球凝集反応阻害（ＨＩ）および補体結合（ＣＦ）は、ウイルスまたはウイル スの抗原に対する抗体の存在について試験することによって、ヒトヘルペスウイ ルスへの感染を検出するのに用いることができる２つの実験室的試験である。 特異的なウイルス変異体に対する抗体を検出したければ、血清学的方法も有用 であり得る。例えば、患者の血清の分析による新たな製剤に対して、ワクチンの 受容者がいかに首尾よく反応したかを見たい場合があるであろう。 ＩＩＡ．ベクター、細胞株および形質転換哺乳類 本発明は、ＫＳＨＶポリペプチドをコードする単離された核酸分子を含む複製 可能なベクターを提供する。該ベクターとしては、限定されるものではないが、 該単離された核酸分子を含むプラスミド、コスミド、λファージまたは酵母人工 染色体（ＹＡＣ）が含まれる。 該ベクターを得るためには、例えば、挿入およびベクターＤＮＡを双方ともに 、制限酵素に曝して、塩基が互いに対合する双方の分子上に相補的末端作り出し 、次いでＤＮＡリガーゼで共に連結させることができる。別法としては、リンカ ー を該ベクターＤＮＡ中の制限部位に相当する挿入ＤＮＡと連結させ、次いでその 部位で切断する制限酵素で消化する。他の方法も利用でき、当業者には周知であ る。 本発明は、該ベクターを含む宿主細胞を提供する。適切な宿主細胞としては、 限定されるものではないが、（大腸菌(E.coli)のごとき）細菌、酵母、糸状菌、 植物、昆虫および哺乳類細胞が挙げられる。適切な動物細胞としては、限定され るものではないが、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃｏｓ細胞、ＣＶ１細胞およ び種々の主要な哺乳類細胞が挙げられる。 本発明は、胎児の段階で哺乳類に導入された該単離された核酸分子を含む形質 転換非ヒト哺乳類を提供する。形質転換非ヒト哺乳類を作出する方法は、当該技 術分野において公知である。 ＩＩＩ．ＫＳに関する診断アッセイ 本発明は、皮膚試料または他の冒された組織のごとき生物学的試料中における ＫＳＨＶの存在を検出するための診断試験キットであって、ＫＳＨＶポリペプチ ドに対して特異的な核酸配列を含む容器および試験を実施するための使用説明書 から構成される診断試薬キットを包含する。かかる配列の何れか１つに対する核 酸プライマーを含む容器が所望により含まれる。 本発明はさらに、血清または固体組織試料のごとき生物学的試料中におけるＫ ＳＨＶの存在を検出するための診断試験キットであって、ＫＳＨＶポリペプチド に対する抗体を含む容器および試験を実施するための使用説明書から構成される 診断試薬キットを包含する。別法としては、ヘルペスウイルスから誘導した不活 性化ウイルス粒子またはポリペプチドを、診断試験キットで用いて、ＫＳＨＶポ リペプチドに対して特異的な抗体を検出してもよい。 Ａ．核酸アッセイ 本発明は、（ａ）患者の腫瘍病変部または適切な体液から核酸分子を得、（ｂ ）ハイブリダイズ条件の下、ＫＳＨＶの単離した核酸分子と特異的にハイブリダ イズする能力を持つ少なくとも１５個のヌクレオチドの標識核酸分子と該核酸分 子を接触させ、次いで（ｃ）その存在が患者におけるカポジ肉腫を示唆する ハイブリダイズした核酸分子の存在を決定することにより、患者においてカポジ 肉腫を診断することを具備した、患者におけるカポジ肉腫の診断方法を提供する 。 １つの具体例では、該腫瘍病変部由来の核酸分子を、工程（ｂ）以前に増幅さ せる。もう１つの具体例では、該核酸分子を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反 応（ＰＣＲ）を使用する。核酸分子を増幅する方法は当業者に公知である。 当業者ならば、患者においてカポジ肉腫を診断するための適切な核酸試料を得 ることができよう。前記した方法によって得られたＤＮＡ試料を、分析の前に、 当該技術分野において周知の制限酵素により切断してもよい。 前記した方法では、ポリアクリルアミドゲルによって達成されるサイズ分画が 使用されてもよい。１つの具体例では、該サイズ分画は、アガローズゲルによっ て達成される。さらに、ハイブリダイゼーション工程の前に、固体マトリックス への核酸断片の転写を行ってもよい。かかる固体マトリックスの１つの例は、ニ トロセルロース紙である。 本発明は、細胞由来のｍＲＮＡを得、該ｍＲＮＡをハイブリダイズ条件の下で ＫＳＨＶの標識核酸分子と接触させ、該分子にハイブリダイズしたｍＲＮＡの存 在を決定し、それによって該ＫＳＨＶ遺伝子の発現を検出することを特徴とする 、細胞中におけるＫＳＨＶ遺伝子の発現の検出方法を提供する。１つの具体例で は、ｃＤＮＡは該細胞から得られたｍＲＮＡから調製され、ＫＳＨＶ発現の検出 に用いられる。 ハイブリダイゼーションアッセイを実施するために許容される方法は公知であ り、該技術の全般的な総論は、Nucleic Acid Hybridization:A Practical Appro ach(1985)HamesおよびHiggins編,IRL Press:Hybridization of Nucleic Acids I mmobilized on Solid Supports,MeinkothおよびWahl;Analytical Biochemistry( 1984)238,267-284およびInnisら,PCR Protocols(1990)Academic Press,San Dieg oの総説から得られる。 ＫＳの核酸ハイブリダイゼーション診断アッセイには、標的特異的プローブを 用いてよい。該プローブは、注目する標的に対して特異的または相補的である。 正確な対立遺伝子を区別するためには、該プローブは約１４個のヌクレオチドの 長さであるべきであり、好ましくは約２０−３０個のヌクレオチドであるべきで ある。ＫＳＨＶをさらに普遍的に検出するためには、核酸プローブは約５０ない し１０００個のヌクレオチドであり、最も好ましくは約２００ないし４００個の ヌクレオチドである。 特異的核酸プローブは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、またはそれら の類縁体であり得る。該プローブは、一本または二本鎖核酸分子であってよい。 本発明のプローブを、当該技術分野で周知の方法を用いて、酵素的に（例えば、 ニックトランスレーション、プライマー伸長、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応他 ）または化学的に（例えば、BeaucageおよびCarruthersまたはMatteucciら，前 記によって記載された方法によって）合成してもよい。 該プローブは、試料中にその標的核酸を有する安定な二重らせんを形成するこ とができるに十分な長さ、すなわち、少なくとも約１４個のヌクレオチドでなけ ればならず、さらに長くてもよい（例えば、少なくとも約５０または１００塩基 の長さ）。しばしば該プローブは、約１００塩基の長さよりも長くなってもよい 。例えば、標識ヌクレオチドの存在下でのＤＮＡのニックトランスレーションに よってプローブを調製する場合には、平均プローブ長は約１００−６００塩基で あってよい。 核酸プローブ設計およびアニーリング条件についての考察に関しては、例えば 、Ausubelら，前記；BergerおよびKimmcl編、Methods in Enzymology 152巻、(1 987)Academic Press,New York；またはHybridization with Nucleic Acid Probe s,pp.495-524,(1993)Elsevier,Amsterdamを参照のこと。 通常、該プローブの少なくとも一部は、標的核酸とかなりの配列同一性を有し ていると考えられる。特異的ハイブリダイゼーションに必要な配列同一性の程度 は該プローブの長さおよびハイブリダイゼーション条件にもよるが、通常、該プ ローブは標的核酸と少なくとも７０％の同一性を有し、さらに通常は少なくとも ８０％の同一性を有し、なおさらに通常は少なくとも９０％の同一性を有し、最 も通常は少なくとも９５％または１００％の同一性を有する。 以下の緊縮ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、特異的でないプロー ブから特異的なプローブ（例えば、蛍光標識した核酸プローブ）を区別するのに 十分であろう：変性プローブ、５０％ホルムアミド、２Ｘ ＳＳＣ、および０． １％（ｗ／ｖ）硫酸デキストランを含む溶液中、３７℃にて１２時間、該プロー ブを試料とインキュベーションし、次いで５分間７０℃にて１Ｘ ＳＳＣで、５ 分間３７℃にて２Ｘ ＳＳＣで、５分間室温にて０．２Ｘ ＳＳＣで、次いで５ 分間室温にてＨ2Ｏで洗浄する。核酸ハイブリダイゼーション（すなわち、ｉｎ ｓｉｔｕサザン、またはノーザン）においては、ハイブリダイゼーションまた は洗浄溶液中に洗浄剤（例えば、硫酸ドデシルナトリウム）、キレート化剤（例 えば、ＥＤＴＡ）または他の試薬（例えば、緩衝液、デンハート溶液、硫酸デキ ストラン）を含むことがしばしば有利であることを、当業者は承知している。特 異性を評価するためには、プローブをＫＳＨＶを含む宿主細胞上で試験して、非 ＫＳＨＶウイルスを含む細胞から得られた結果と比較することができる。 プローブがＫＳＨＶ核酸分子に対して特異的であるかどうかを決定するための 従来法は、ウイルスから調製したＤＮＡを用いサザンブロット（またはドットブ ロット）を利用することは、当業者にとっては明白であろう。便宜には、標的特 異的プローブを同定するためには、ＤＮＡをウイルスから単離する。試験ＤＮＡ 、ウイルス性または細胞性の何れかを、固体（例えば、帯電したナイロン）マト リックスに転写する。プローブは定法により標識する。以下の変性および／また はプレハイブリダイゼーション工程は当該技術分野で公知であり、該プローブを 、先に定義したごとき緊縮条件下で固定化したＤＮＡへハイブリダイズさせる。 さらには、プローブの特異性を決定する際に、またＫＳＨＶの検出に本発明の 方法を使用する際に、一定量のバックグラウンドシグナルは典型的であり、当業 者ならば特異的シグナルと容易に区別できることは認識される。バックグラウン ドの２倍のシグナルが許容される。 ＫＳＨＶポリペプチドを検出する好ましい方法は、ＰＣＲおよび／またはドッ トブロットハイブリダイゼーションの使用である。ＫＳについての検出または予 後、もしくは危険性評価のためにＫＳＨＶの存在または不在を試験する他の方法 としては、全て当業者に周知である、サザントランスファー、溶液ハイブリダイ ゼーションまたは非放射性検出系が挙げられる。プローブを用いてハイブリダイ ゼーションを行う。ハイブリダイズした部分の視覚化することによって、原因と なる試薬の存在または不在を定性的に決定が可能になる。 同様に、ノーザントランスファーまたは逆転写酵素ＰＣＲを、試料中のＫＳＨ ＶメッセンジャーＲＮＡの検出に用いてもよい。これらの方法もまた当該技術分 野においては十分に知られたものである。Sambrookら,(1989)Molecular Clonlng :A Laboratory Manual（第２版),Cold Spring Harbor Laboratory，第1-3巻を参 照。 ヒトヘルペスウイルスの存在を決定するための代替手段は、ｉｎ ｓｉｔｕハ イブリダイゼーションであり、さらに最近ではｉｎ ｓｉｔｕポリメラーゼ連鎖 反応である。in ｓｉｔｕ ＰＣＲは、Neuvoら(1993)American Journal of Surg inal Pathology 17(7),683-690中のＰＣＲ増幅したＣ型肝炎ＤＮＡの細胞間局在 、Bagasraら,(1992)New England Journal of Mcdicinc 326(21),1385-1391中の ｉｎ ｓ１ｔｕＰＣＲによる単核細胞中のＨＩＶ−１プロウイルスの検出、およ びHcnifordら,(1993)Nucleic Acids Research 21,3159-3166中のｉｎ ｓｉｔｕ 逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応によって実証された細胞のＥＧＦ受容体ｍＲＮ Ａ発現の変化に記載されている。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセ イは周知であり、一般には、Methods Enzymol.第152巻、(1987)BergerおよびKim mel編,Academic Press,New Yorkに記載されている。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイ ゼーションにおいて、細胞は固形支持体、典型的にはスライドグラスに固定され る。次いで該細胞を適度な温度にてハイブリダイゼーション溶液に接触させて、 標識した標的特異的プローブをアニーリングさせる。該プローブは好ましくは放 射性同位体または蛍光性リポーターで標識される。 また、前記したプローブはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために、 または遺伝子を発現する組織の場所を特定するために、あるいは種々の生物学的 組織中の遺伝子またはそのｍＲＮＡの存在に関する他のハイブリダイゼーション アッセイのために有用である。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ポリ ペプチド抗原の発現または自然条件、変性条件によらない鋭敏な位置決定方法で ある。 また、ＫＳＨＶファージミドまたはプラスミドから作製した合成オリゴヌクレ オチド（オリゴ）プローブおよびリボプローブも提供される。組織切片で成功し たハイブリダイゼーション条件は、１つのプローブからもう１つのプローブへ容 易に転移する。商業的に合成したオリゴヌクレオチドプローブは、同定された遺 伝子のヌクレオチド配列を用いて調製されている。これらのプローブは、長さ（ ４５−６５量体）、高Ｇ−Ｃ含量（５０−７０％）に関して選択され、ＧｅｎＢ ａｎｋにおける他のウイルス配列に対する特異性についてスクリーニングされる 。 オリゴは、１ｘ１０10ｄｐｍ／μｇの範囲の比活性にまで、末端デオキシヌク レオチジルトランスフェラーゼを用いて、［α−35Ｓ]ｄＡＴＰで３’末端を標 識されている。取り込まれていない標識ヌクレオチドを、オリゴプローブから、 ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムを通す遠心分離によって、またはＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐ Ｐａｋ Ｃ−１８カラムからの溶出によって除去する。 ＯＣＴ化合物中に包埋されたＫＳ組織およびドライアイスで冷却した冷凍イソ ペンタン中の凍結材料を６μｍ間隔に切断し、３−アミノプロピルトリエトキシ ランで処理したスライド上で解凍させて風乾させる。次いで該スライドを新たに 調製した４％パラホルムアルデヒド中で固定させ、水中で洗浄する。また、ホル マリンで固定し、パラフィンに包埋したＫＳ組織を６μｍで切断し、スライドグ ラス上で焼き付けたものも用いることができる。次いで、これらの薄片をキシレ ン中で脱パラフィン化して徐々に変化させたアルコールで水和させる。３７℃で ３０分間２０ｍＭトリスｐＨ７．５、０．０２％デンハート溶液、１０％硫酸デ キストラン中でプレハイブリダイゼーションし、続いて４２℃にて、５０％ホル ムアミド（ｖ／ｖ）、１０％硫酸デキストラン（ｗ／ｖ）、２０ｍＭリン酸ナト リウム（ｐＨ７．４）、３ｘ ＳＳＣ、１ｘデンハート溶液、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ、１２５μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡおよびオリゴプローブ（１０6 ｃｐｍ／ｍｌ）の溶液中で一晩ハイブリダイゼーションを行う。該スライドを、 室温で各々１５分間３ｘＳＳＣで２回、１ｘＳＳＣで２回洗浄し、オートラジオ グラフィーによって可視化する。便宜には、切片を０．３Ｍ酢酸アンモニウムを 含む徐々に変化させたアルコールで脱水して風乾する。該スライドをコダックＮ ＴＢ２エマルジョン中に浸漬し、数日間ないし数週間感光させ、現像し、ヘマト キシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で対比染色する。 当業者に周知の別法としての免疫組織化学的プロトコールを用いてもよい。 Ｂ．免疫学的アッセイ 本発明は、（ａ）患者から適切な体液サンプルを得ることと、（ｂ）抗体が特 異的ＫＳＨＶポリペプチド抗原に結合するように、患者の適切な体液をＫＳＨＶ ポリペプチドを認識する抗体がそこに既に結合している支持体に接触させること と、（ｃ）該支持体から結合していない体液を除去することと、次いで（ｄ）該 抗原が結合している抗体のレベルを測定し、それによってカポジ肉腫を診断する こととを具備した、患者におけるカポジ肉腫の診断方法を提供する。 本発明は、（ａ）患者から適切な体液サンプルを得ることと、（ｂ）抗原が特 異的カポジ肉腫抗体に結合するように、患者の適切な体液をＫＳＨＶポリペプチ ド抗原にそこにすでに結合している支持体に接触させることと、（ｃ）該支持体 から結合していない体液を除去することと、次いで（ｄ）該カポジ肉腫抗体が結 合している抗原のレベルを測定し、それによってカポジ肉腫を診断することとを 具備した、患者におけるカポジ肉腫の診断方法を提供する。 該適切な体液サンプルは、カポジ肉腫抗体、抗原またはその断片を含む何れの 体液サンプルでもよい。適切な体液サンプルとしては、限定されるものではない が、血清、血漿、脳脊髄液、リンパ液、尿、漏出液、または滲出液が挙げられる 。好ましい具体例では、適切な体液サンプルは血清または血漿である。さらに、 該サンプルは骨髄由来の細胞、または細胞培養由来の上清であってもよい。患者 から適切な体液サンプルを得る方法は、当業者には公知である。抗体または抗原 のレベルを測定する方法としては、限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡ、Ｉ ＦＡ、およびウェスタンブロッティングが挙げられる。他の方法も当業者には公 知である。さらに、ＫＳＨＶに感染した患者は、前記した方法を用いて、感染し たものと診断され得る。 ＫＳＨＶの検出およびウイルス関連のＫＳの検出は、本質的には同一の方法で ある。基本原理は、正常なヒト細胞またはその周囲において他のポリペプチドま たは核酸にではなく、ウイルスに結合する特異的なリガンドを用いてウイルスを 検出することである。該リガンドは、核酸分子、ポリペプチドまたは抗体であり 得る。該リガンドは、天然に存在するもの、もしくは非天然ヌクレオチド塩基を 有する核酸のような遺伝的にまたは物理的に改変されたもの、あるいは抗体誘導 体、すなわちＦａｂまたはキメラ抗体であり得る。また、患者の血清中に存在す るウイルスに対する抗体の検出に関する血清学的試験も、本明細書において記載 したようにして、抗原としてＫＳＨＶポリペプチドを用いることにより行えばよ い。 サンプルは、ＫＳを患う患者から、またはＡＩＤＳ患者のごときＫＳのおそれ がある患者から採取され得る。典型的には、該サンプルは、血液（細胞、血清お よび／または血漿）から、または皮膚病変部のごとき固体組織試料から採取され る。ＫＳの最も正確な診断は、該ウイルスの力価の上昇が、血液中でまたは病変 を含むものの中で検出された場合になされる。また、該ウイルスに対する抗体が 検出された場合およびＫＳに関する他の診断因子が存在する場合、ＫＳであるこ とが指摘され得る。 ＫＳの診断アッセイにおいて使用するための本発明の免疫試薬についてのさら なる詳細は、前記イムノアッセイを参照されたい。 ＩＶ．ヒトヘルペスウイルス誘発ＫＳの治療 本発明は、カポジ肉腫（ＫＳ）の患者の治療方法であって、ＫＳの患者に対し て、医薬上許容される担体中の、医薬的有効量の抗ウイルス剤を投与することを 具備し、該抗ウイルス剤はＫＳの患者を治療するのに有効である方法を提供する 。 さらに、本発明は、カポジ肉腫（ＫＳ）の予防または治療方法であって、ＫＳ のおそれがある患者に対して、医薬上許容される担体中の、ＫＳＨＶに結合する 抗体を投与することによる方法を提供する。 本発明は、カポジ肉腫（ＫＳ）の患者の治療方法であって、該患者に対して、 アンチセンス分子が選択的に患者のＫＳ腫瘍細胞に入り込むような条件下で、Ｋ ＳＨＶの単離されたＤＮＡ分子にハイブリダイズすることが可能な有効量のアン チセンス分子を投与して、該患者を治療することを具備した方法を提供する。 Ａ．核酸治療 本発明は、ＫＳＨＶの単離核酸分子とハイブリダイズすることができるアンチ センス分子を提供する。１つの具体例では、該アンチセンス分子はＤＮＡである 。もう１つの具体例では、該アンチセンス分子はＲＮＡである。もう１つの具体 例 では、該アンチセンス分子は核酸誘導体（例えば、蛋白質骨格を持ったＤＮＡま たはＲＮＡ）である。 本発明は、それぞれアンチセンス核酸でｍＲＮＡをマスキングするか、または リボザイムでそれを切断するかの何れかによって、ポリペプチドの発現を阻害す るために用いることができる、アンチセンス核酸類およびリボザイム類の調製へ と拡張される。 本発明は、ＫＳＨＶの単離された核酸分子に結合することによって、ＫＳを患 う患者でヘルペスウイルスの活性を阻害することができる、阻害性核酸治療を提 供する。阻害性核酸は、相補的核酸配列に特異的に結合することができる１本鎖 の核酸であってよい。適当な標的配列に結合することによって、ＲＮＡ−ＲＮＡ 、ＤＮＡ−ＤＮＡ、またはＲＮＡ−ＤＮＡ二重らせんまたは三重らせんが形成さ れる。これらの核酸は通常、遺伝子のセンス鎖すなわちコーディング鎖に対して 相補性を持つので、しばしば「アンチセンス」と呼ばれるが、最近「センス」核 酸の使用に関する試みも開発されてきた。本発明で用いる場合、 「阻害性核酸 」とは「センス」拡散および「センチヤンス」核酸の双方をいう。 標的核酸に結合することによって、該阻害性核酸は、標的核酸の機能を阻害す ることができる。このことは、例えば、ＤＮＡ転写、プロセッシング、またはｍ ＲＮＡへのポリ（Ａ）付加、ＤＮＡ複製、翻訳を阻害すること、或いはＲＮＡ変 成を誘導するような細胞の阻害性機構を誘導することの結果であり得る。従って 阻害性核酸法は、ヘルペスウイルス遺伝子の発現を修正する多くの異なる試みを 包含する。これら異なるタイプの阻害性核酸技術は、HeleneおよびToulme(1990) Biochim.Biophys.Acta.1049,99-125に記載されており、れについては、以降「He lcncおよびToulmeto」という。 便宜には、阻害性核酸治療の試みは、ＤＮＡ配列を標的とするもの、ＲＮＡ配 列を標的とするもの、および標的核酸の切断、または化学的修飾を引き起こすも のに大別できる。 ＤＮＡを標的とする試みは幾つかのカテゴリーに分けられる。核酸を二重らせ んＤＮＡの主溝に結合するように設計して、三重螺旋構造、すなわち「トリプレ ックス」構造を形成することができる。別法としては、複製または転写の間に、 二重らせんＤＮＡの開裂の結果得られる１本鎖ＤＮＡの領域に結合するように該 阻害性核酸を設計する。 より一般的には、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体に結合するように、阻害性核 酸を設計する。阻害性核酸を用いて、前ｍＲＮＡの成熟を阻害する。ＲＮＡプロ セッシング、スプライシングまたは翻訳を阻害するように、阻害性核酸を設計し てもよい。 該阻害性核酸はｍＲＮＡを標的とすることができる。このアプローチでは、該 阻害性核酸を、コードされた蛋白質の翻訳を特異的に阻害するように設計する。 このアプローチを用いれば、該阻害性核酸を用いて、決定的な蛋白質をコードす るｍＲＮＡの翻訳の阻害により、特定の細胞の機能を選択的に抑制することがで きる。例えば、ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡの領域に対して相補性を持つ阻害性核酸は 、ｃ−ｍｙｃ前癌遺伝子を過剰発現するヒト前骨髄白血病細胞株、ＨＬ６０での ｃ−ｍｙｃ蛋白質の発現を阻害する。Wickstromら(1988)PNAS 85,1028-1032およ びHarel-Bellanら(1988)Exp.Med.168,2309-2318参照。HeleneおよびToulmetoに 記載されたように、ｍＲＮＡを標的とする阻害性核酸は、幾つかの異なるメカニ ズムにより作用して、コードされる蛋白質の翻訳を阻害することが示されている 。 また細胞に導入される阻害性核酸も、HeleneおよびToulmetoに記載されたよう に、遺伝子またはｍＲＮＡの「センス」鎖を包含し、ｍＲＮＡの翻訳に関与する 酵素または結合性蛋白質をトラップし、またはこれと競合することができる。 最後に、該阻害性核酸を用いて、標的遺伝子またはｍＲＮＡの化学的不活性化 または切断を誘導することができる。化学的不活性化は、細胞内で阻害性核酸と 標的核酸との間の架橋を誘導することにより引き起こすことができる。また、適 切に誘導された阻害性核酸により誘導される、標的核酸他の化学的修飾が用いら れてもよい。 標的核酸の切断、およびそれゆえの不活性化は、阻害性核酸に、活性化して切 断反応を誘導することができる置換基を付加することにより果たすことができる 。該置換基は、化学的切断または酵素的切断の何れかに影響するものであってよ い。別法として、切断はリボザイムまたは触媒性ＲＮＡの使用によって誘導され る。 このアプローチでは、該阻害性核酸は、自然に生じるＲＮＡ（リボザイム）また は触媒活性を有する合成核酸の何れかから構成されるであろう。 これら細胞の表面上の受容体に結合するターゲッティング部分との結合による 、免疫系の特異的細胞に対する阻害性核酸のターゲッティングは、前記阻害性核 酸治療のあらゆる形態に用いることができる。本発明は、前記したような、また HeleneおよびToulmetoに記載されたような阻害性核酸治療のあらゆる形態を包含 する。 抗ヘルペスウイルス阻害性核酸の例は、ＣＭＶに対する活性を有するＩＳＩＳ ２９２２(ISIS Pharmaceuticals)である（Biotcchnology News14:5参照）。 阻害性核酸治療に付随する問題は、イン・ビボ標的細胞への阻害性核酸の効果 的な送達とそれに続く細胞による該阻害性核酸の取り込みである。これは、該阻 害性核酸を標的部分と結合して、標的感染細胞の表面上の特異的受容体と結合す る複合体を形成することにより達成でき、それは結合後に取り込まれる。 Ｂ．抗ウイルス剤 抗ウイルス剤と連続処理の併用は、ヘルペスウイルス感染症の治療に有用であ り、また、ヘルペスウイルス誘発性ＫＳの治療にも有用であると考えられる。例 えば、Snoeckら(1992)Eur.J.Clin.Micro.Infect.Dis.11,1144-1155は、抗ヘルペ ス剤を併用した場合（例えばジドブジン[３’−アジド−３’−デオキシチミジ ン、ＡＺＴ]とＨＰＭＰＣ、ガンシクロバー、フォスカーネットまたはアンサイ クロバーとの組み合わせ、もしくはＨＰＭＰＣの他の抗ウイルス剤との組み合わ せ）、ＣＭＶに対する付加的または相乗的効果を見出した。同様にサイトメガロ ウイルス・レチニティス(retinitis)の治療では、ガンシクロバーでの誘導、そ れに続くフォーカネットでの維持が、効率を最大化し、一方で各々単独の処理の 有害な副作用を最小化する方法として示されて来た。アシクロバーおよび、例え ば、２−アセチルピリジン−５−（（２−ピリジルアミノ）チオカルボニル）− チオカルボノヒドラゾンを含む抗庖疹性組成物が、米国特許第５，１７５，１６ ５（Burroughs Welcom Co.へ譲渡）に記載されている。抗庖疹性医薬におけるＴ Ｓ−インヒビターとウイルス性ＴＫ−インヒビターの併用については、Stiching Rega ＶＺＷに譲渡された米国特許第５，１３７，７２４号に記載されている。 Ｈ ＰＭＰＣとＡＺＴの特定の併用割合を用いたＥＢＶ増殖における相乗的阻害効果 については、Linら(1991)Antimicrob Agents Chemother 35:2440-3によって報告 されている。 米国特許第５，１６４，３９５号および第５，０２１，４３７号(Blumenkopf; Burroughs Wellcome)は、アシクロバーとの併用するアセチルピリジン誘導体の 使用を含む、ヘルペス感染症の治療ためのリボヌクレオチドレダクターゼインヒ ビター（アセチルピリジン誘導体）の使用について記載している。米国特許第５ ，１３７，７２４号(Balzariら(1990)Mol.Pharm.37,402-7)は、ウイルス性チミ ジンキナーゼ阻害活性を有する化合物と併用するチミジレートシンターゼインヒ ビター（例えば、５−フルオロ−ウラシルおよび５−フルオロー２’−デオキシ ウリジン）の使用について記載している。 新しく同定されたＫＳのための病因薬剤の発見に伴い、ヘルペスウイルス関連 ＫＳの症状を緩和するまたは防護する効果的な治療上または予防上のプロトコー ルが確立できた。該疾病のウイルス特性により、抗ウイルス剤は本明細書で、イ ンターフェロン、核酸類縁体、リバビリン、アマンタジン、およびホスホノ酢酸 のピロリン酸塩類縁体（フォスカーネット）(Gorbachら,1992,Infectious Disea se Ch.35,289,W.B.Saunders,Philadelphla,Pcnnsylvania)など、治療のための適 用を持つ。また、免疫療法も本明細書に記載される疾病薬によって引き起こされ た症状を管理し、緩和する多くの場合で効果的であると考えられる。抗ウイルス 剤としては、ウイルスの増殖またはウイルス力価に直接強い影響を与えない与え ない薬剤を除き、ウイルス産物に直接結合して疾病の進行を阻害する薬剤または 組成物を含む。抗ウイルス剤としては、ウイルス力価に直接影響を及ぼさないか 、またはウイルス産物と結合しない免疫調節剤は含まれない。抗ウイルス剤がウ イルスを不活性化するか、またはそうでなくともその感染性や増殖を阻害するか 、またはＫＳの症状を緩和するならば効果的である。 ウイルス誘発性ＫＳを治療するために有用であると考えられる抗ヘルペスウイ ルス剤は、それらの推定される作用様式に基づいて、広範なクラスに分類される 。これらのクラスは、（１）ウイルスＤＮＡポリメラーゼの阻害により、（２） 他のウイルス酵素および蛋白質をターゲッティングすることにより、（３）種々 雑 多なまたは不完全な理解しかされていない機構により、または（４）標的核酸を 結合させることにより（すなわち、前記阻害性核酸療法）作用して、相乗的また は付加的効果もしくは他の利点を達成する薬剤を含む。 それらの確認された作用機構により、抗ウイルス剤を分類するのが都合がよい が、本出願者らは、抗ウイルス作用の何れか特定の機構によって拘束されること を意図しない。さらに、当業者ならば、薬剤がウイルス中のまたはウイルス感染 細胞中の１を超える標的上で、もしくは１を超える機構を介して作用してもよい ことを理解するであろう。 ｉ）ＤＮＡポリメラーゼのインヒビター 臨床用途または今日の開発における多くの抗ヘルペスウイルス剤は、ウイル スＤＮＡ複製の阻害を介して、特にウイルスＤＮＡポリメラーゼの阻害を介して 作用すると確信されている核酸類縁体である。これらの核酸類縁体は、ウイルス ＤＮＡポリメラーゼに対する二者択一の基質として、もしくはＤＮＡポリメラー ゼ基質の競合インヒビターとして作用する。通常、これらの薬剤は、もし１つが 存在すれば、ウイルス性チミジンキナーゼ（ＴＫ）によって優先的にリン酸化さ れ、および／または細胞性ＤＮＡポリメラーゼに対するよりもウイルス性ＤＮＡ ポリメラーゼに対して更に高い親和性を有し、その結果、選択的抗ウイルス活性 が生じることとなる。ヌクレオチド類縁体が該ウイルス性ＤＮＡに組み込まれる と、ウイルス活性または再生産が様々な様式で影響され得る。例えば、該類縁体 は鎖のターミネーターとして作用し、不安定性（例えば、切断に対する感受性） を増強し、および／または置換されたＤＮＡの転写または複製にための鋳型とし て作用する能力を修復する（例えば、前記のBalzariniら参照）。 ヘルペスウイルス感染症の治療に有用な多くの薬剤、多くの試薬が、宿主、宿 主細胞、またはウイルス感染宿主細胞代謝酵素によって修飾される（すなわち、 「活性化される」）ようなことは当業者ならば公知であろう。例えば、アシクロ バーは、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（もし存在すれば）によって行われ る第一のリン酸化で、その活性型へと三リン化される。他の例としては、３段階 代謝経路で報告された化合物ＨＯＥ６０２のガンシクローバーへの変換(Winkler ら,1990,Antiviral Research 14,61-74)、およびガンシクロバーの、例えばＣＭ Ｖ ヌクレオチドキナーゼによる、その活性型へのリン酸化が挙げられる。ウイルス の特異的代謝能が特異的薬剤に対するそのウイルス感受性に影響を与えることが でき、また抗ウイルス剤の選択における一要因となることは、当業者にとっては 明らかであろう。特定の抗ヘルペスウイルス剤の作用機能については、De Clercq (1993,Antimicrobial Chemotherapy 32,Suppl.A,121-132)、並びに前記および後 記に引用される他の参照文献で考察されている。 ウイルス誘発性ＫＳを治療するために適した抗ヘルペスウイルス薬物療法とし ては、限定されるものではないが、非環式ホスホン酸ヌクレオシド類縁体（例え ば、ホスホニル−メトキシアルキルプリンおよび−ピリミジン類）および環式ヌ クレオシド類縁体を始めとするヌクレオシド類縁体が挙げられる。これらには、 ビダラビン(９−β−アラビノフラノシルアデニン；アデニンアラビノ、ａｒａ −Ａ、Ｖｉｒａ−Ａ、パーク−ダビス(Park-Davis)；１−β−Ｄ−アラビノフラ ノシルウラシル（ａｒａ−Ｕ）；１−β−Ｄ−アラビノフラノース−シトシン（ ａｒａ−Ｃ）；ＨＰＭＰＣ[（Ｓ）−１−[３＝ヒドロキシ−２＝(ホスホニルメ トキシ）プロピル]シトシン（例えば、ＧＳ５０４、Gilead Science）]およびそ の環状型（ｃＨＰＭＰＣ）；（Ｓ）−ＨＰＭＰＤＡＰ[（Ｓ）−９−（３−ヒド ロキシ−２−ホスホニルメトキシプロピル）−２，６−ジアミノプリン]；ＰＭ ＥＤＡＰ[９−（２−ホスホニル−メトキシエチル）−２，６−ジアミノプリン] ；ＨＯＥ６０２[２−アミノ−９−（１，３−ビス（イソプロポキシ）−２−プ ロポキシメチル）プリン]；ＰＭＥＡ[９−（２−ヒスホニルメトキシエチル）ア デニン]；ブロモビニル−デオキシウリジン(BurnsおよびStandford,1990,J.Infe ct.Dis.162:634-7)；１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−Ｅ−５−（２−ブロモ ビニル）−ウリジンまたは−２’−デオキシウリジン；ＢＶａｒａＵ（１−β− Ｄ−アラビノフラノシル−Ｅ−５−（２−ブロモビニル）−ウラシル、ブロババ ー、Bristol Myers Squibb,Yamsa Shoyu）；ＢＶＤＵ[（Ｅ）−５−（２−ブロ モビニル）−２’−デオキシウリジン、ブリブジン、例えば、Helpin]およびそ の炭素環式類縁体（そこで糖部分がシクロペンタン環で置換されている）；ＩＶ ＤＵ[（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−２’−デオキシウリジン]およびその 炭素環式類縁体、Ｃ−ＩＶＤＵ（Balzariniら，前記）；および２’−デオキシ ウ リジンの５−メルクチチオ類縁体(HollidayおよびWilliams,1992,Antimicrob.Ag ents Chemothcr.36,1935)；アンシクロバー[９−（[２−ヒドロキシエトキシ]メ チル）グアニン；例えば、ゾビラックス(Zovirax)(Burroughs Wellcome)]；ペン シクロバー（９−[４−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）ブチル]−グアニ ン）；ガンシクロバー[(９−[１，３−ジヒドロキシ−２−プロポキシメチル]− グアニン）例えば、シメベン(Cymevene)、シトベン(Syntex)、ＤＨＰＧ(Stalsら ,1993,Antimicrobial Agents Chcmothcr.37,218-223；ガンシクロバーのイソプ ロピルエーテル誘導体（例えば、Winkelmannら,1988,Drug Res.38,1545-1548） ；シガロバー；ファムシクロバー[２−アミノ−９−（４−アセトキシ−３−（ アセトキシメチノレ）ブト−１−イル）プリン(Smithkline Beecham)]；バラシ クロバー(Burroughs Wellcome)；デスシクロバー[(２−アミノ−９−（２−エト キシメチル）プリン）]および２−アミノ−９−（２−ヒドロキシエトキシメチ ル）９Ｈ−プリン、アシクロバーの前駆薬剤]；ＣＤＧ（炭素環式２’−デオキ シグアノシン）；およびシクロブタン環で置換されたペンタフラノシル環を有す るプリンヌクレオシド（例えば、シクロブト−Ａ[(+−)−９−[１β、２α、３ β)−２，３−ビス（ヒドロキシメチル）−１−シクロブチル]アデニン]、シク ロブト−Ｇ[（+−）−９−[１β、２α、３β）−２，３−ビス（ヒドロキシメ チル）−１−シクロブチル]グアニン]、ＢＨＣＧ[（Ｒ）−（１α、２β、１α ）−９−（２，３−ビス（ヒドロキシメチル）シクロブチル]グアニン]、および ラセミＢＨＣＧの活性型異性体、配列３４，５１４[１Ｒ−１α、２β、３α） −２−アミノ−９−[２，３−ビス（ヒドロキシメチル）シクロブチル]−６Ｈ− プリン−６−オン]（Braitmanら,1991,Antimicrob.AgentsおよびChemotherapy 3 5,1464−1468参照）を始めとするヌクレオシド類縁体が挙げられる。これら抗ヘ ルペスウイルス剤のあるものについては、Gorachら,1992,Infectious Disease C h.35,289,W.B.Saunders,Philadelphia;Saundersら,1990,J.Acquir.Immune Defic .Syndr.3,571;Yamanakaら,1991,Mol.Pharmacol.40,446;および Greenspanら，19 90,J.Acquir.Immune Defic.Syndr.3,571に考察されている。 トリシリビン(triciribine)およびトリシリビン−リン酸は、ヘルペスウイ ルスに対する強力な阻害剤であり(Ickesら,1994,Antiviral Research 23,Sevent h Intcrnational Conf.on Antiviral Research,Abstract No.122,Supp.1.)、HIV− １およびＨＩＶ−２(Kuceraら,1993,AIDS Res.Human Retroviruses 9,307-314) 、またＫＳを治療するために用いられ得る核酸類縁体である。これらの薬剤のた めのプロトコールを例示すれば、一週間に一度、約０．３５ｍｇ／ｍ2（０．７ ｍｇ／ｋｇ）、または少なくとも２用量につき１週間おきの静脈注射であり、８ 週間に４回を超えることが好ましい。 アシクロバーおよびガンシクロバーは、臨床環境で許容されるそれらの用途の ゆえに注目される。アシクロバー、すなわちグアニンの非環式類縁体は、ヘルペ スウイルスチミジンキナーゼによりリン酸化され、次いで、更にリン酸化を受け て、ウイルス複製中にウイルス性ＤＮＡポリメラーゼによりチェーンターミネー ターとして組み込まれる。それは広範なヘルペスウイルス、単純ヘルペス１型お よび２型、帯状ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルスおよびエプスタイン・ バールウイルスに対する治療活性を有し、ヘルペス脳炎、新生児ヘルペスウイル ス感染症、免疫無防備状態の宿主の水痘、帯状ヘルペス再発、ＣＭＶ網膜炎、Ｅ ＢＶ感染症、慢性疲労症候群、およびＡＩＤＳ患者の毛の白斑症のごとき疾病の 治療に用いられる。静脈投与量または経口投与量を例示すれば、７日間８時間お きの２５０ｍｇ／ｋｇ／ｍ2体表面積、または再発を抑制するためには、１日２ 回の２００−４００ｍｇ静脈注射の継続投与もしくは経口投与である。ガンシク ロバーはアシクロバーより、あるヘルペスウイルスに対する活性がより高いこと が示されてきた。例えば、OrenおよびSoble,1991,Clinical Infectious Disease s 14,741-6参照。ガンシクロバーに関する治療プロトコールは、５ｍｇ／ｋｇ１ 日２回の静脈注射、または２．５ｍｇ／ｋｇ１０−１４日間１日３回である。継 続投与量は５−７日間に５−６ｍｇ／ｋｇである。 またＨＰＭＰＣも注目される。ＨＰＭＰＣは、動物モデルの種々のＨＳＶ−Ｌ ＨＳＶ−２、ＴＫ−ＨＳＶ、ｖＺｖまたはＣＭＶ感染症の化学療法および予防に けるアシクロバーまたはガンシクロバー何れかよりも活性が高いと報告されてい る（De Clercq、前記）。 ＢＶａｒａＵのごときヌクレオシド類縁体は、動物の脳炎モデルにおけるアシ クロバーよりも高い活性を有するＨＳＶ−１、ＥＢＶおよびＶＺＶの効力あるイ ンヒビターである。ＦＩＡＣ（フルロイドアラビノシルシトシン）およびその関 連フルロエチルおよびヨウ素化合物（例えば、ＦＥＡＵ、ＦＩＡＵ）は、ヘルペ スウイルスに対する効力ある選択的活性を有し、またＨＰＭＰＡ（（Ｓ）−１− （[３−ヒドロキシ−２−ホスホリルメトキシ]プロピル）アデニン）は、アンサ イクロバーまたはガンシクロバーよりＨＳＶおよびＣＭＶに対してより効力があ ることが示されており、ＫＳが進行した場合には群を抜いている。クラドリビン （２−クロロデオキシアデノシン）は、高度に特異的な抗リンパ球剤（すなわち 、免疫抑制薬）として知られているもう１つのヌクレオシド類縁体である。 他の有用な抗ウイルス剤としては、５−チエン−２−イル−２’−デオキシウ リジン誘導体、例えば、ＢＴＤＵ[５−５（５−ブロモチエン−２−イル）−２ ’−デオキシウリジン]およびＣＴＤＵ[ｂ−（５−クロロチエン−２−イル）− ２’−デオキシウリジン]；およびＯＸＴ−Ａ[９−（２−デオキシ−２−ヒドロ キシメチル＝β−Ｄ−エリトローオキセタノシル）アデニン]およびＯＸＴ−Ｇ[ ９−（２−デオキシ−２−ヒドロキシメチル）−β−Ｄ−エリトロ−オキセタノ シル）グアニン]が挙げられる。ＯＸＴ−ＧはウイルスのＤＮＡ合成を阻害する ことによって作用すると信じられているが、その作用機構はまだ解明されていな い。これらおよび他の化合物は、Andreiら,1992,Eur.J.Clin.Microbiol.Infect. Dis.11,143-51に記載されている。ヘルペスウイルス感染症を治療するのに有用 なさらなる抗ウイルス性プリン誘導体は、米国特許第５，１０８，９９４号（Be echam Group P.L.C.へ譲渡）に開示されている。６−メトキシプリンアラビノシ ド（ａｒａ−Ｍ；Burroughs Wellcome）は、帯状ヘルペスウイルスの効力あるイ ンヒビターであり、ＫＳの治療に有用であると考えられる。 公表時に紛失していた。 ｉｉ）他の抗ウイルス剤 出願人らは、特定の抗ウイルス作用機構により拘束されるつもりもないが、 前記した抗ウイルス剤がウイルスＤＮＡポリメラーゼの阻害を介して作用すると 確信している。しかしながら、ウイルスの複製には、ウイルス核酸の複製がけで なくウイルス蛋白質および他の必須成分の産生も必要である。従って、本発明は 、ＤＮＡポリメラーゼ以外のウイルス蛋白質を標的とすることによるウイルス増 殖の阻害によって（例えば、それらの合成または活性化の阻害、もしくは合成後 のウイルス蛋白質の破壊により）ＫＳの治療を行おうとするものである。例えば 、ウイルス外被の発達に重要であるもののごときウイルスのセリンプロテアーゼ を阻害する薬剤の投与が、ウイルス誘発性ＫＳの治療に有用であろう。 他のウイルスの酵素標的としては、ＯＭＰデカルボキシラーゼインヒビター（ 例えば、パラゾフリンの標的）、ＣＴＰシンテターゼインヒビター（例えば、シ クロペンテニルシトシンの標的）、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ、リボヌクレオチド レダクターゼ（例えば、米国特許第５，１１０，７９９(Tolmanら,Merck)に記載 されたごときカルボキシル含有Ｎ−アルキルジペプチドの標的）、チミジンキナ ーゼ（例えば、米国特許第４，８６３，９２７および４，７８２，０６２(Tolma nら,Merck)に記載されたごとき１−[２−（ヒドロキシメチル）シクロアルキル メチル]−５−置換−ウラシルおよび−グアニンの標的）、並びに他の酵素が挙 げられる。この他にも同定されているか、またはまだ発見されていないかの双方 のウイルス蛋白質があり、抗ウイルス剤に対する標的としての役割を果たし得る ことは、当業者には明白であろう。 クタプレシン(Kutaprcssin)は、２５ｍｇ／ｍｌの注射可能な形態で、ワシン トンのミルウォーキーのSchwarz Parmaから入手可能な肝臓誘導体である。ヘル ペスウイルスに対する推奨投与量は、１５０ポンドの平均的な成人に対し、１日 につき２００ないし２５ｍｇ／ｍｌである。 ロックビル，ＭＤのHEM Pharmaceuticalsからのアンプリゲン(Ampligen)とし て知られる許容抗ウイルス剤、ポリ（Ｉ）ポリ（Ｃ12Ｕ）は、ヘルペスウイルス を阻害することが知られており、ＫＳを治療するために適切なもう１つの抗ウイ ルス剤である。静脈注射が好ましい投与経路である。平均１５０ポンドの成人に 対して約１００ないし６００ｍｇ／ｍ2の投与量が、１週間に２ないし３回投与 される。１週間に少なくとも２００ｍｇ／ｍ2投与することが最良である。 ヘルペスウイルス（例えば、帯状ヘルペスおよび単純ヘルペス）に対して活性 を示し、ヘルペスウイルス誘発性ＫＳの治療に有用であろうことが報告された他 の抗ウイルス剤としては、マッピシンケトン(mappicine keton)(SmithK1ineBeec ham)；帯状ヘルペスに対する化合物Ａ，７９２９６およびＡ，７３２０９(Abbot t)；および化合物８８２Ｃ８７(Burroughs Wellcome)が挙げられる（１９９３年 ５月１７日、The Pink Sheet 55(20)参照）。 インターフェロンはヘルペスウイルス類の複製を阻害することが知られている 。OrenおよびSoble前記参照。インターフェロンには公知の毒性問題があり、副 作用は軽減されるが、インターフェロンの抗ウイルス特性を保持する第二世代が 間もなく利用できるようになるであろうと期待される。 また、ヘルペスウイルス再活性化剤を投与して潜伏ウイルスの再活性化を誘導 することにより、ヘルペスウイルス誘発性ＫＳを治療し得るということも考えら れる。該再活性化は抗−ヘルペスウイルス剤の同時投与または逐次投与と併用さ れることが好ましい。短期間にわたる制御された再活性化、または抗ウイルス剤 の存在下での再活性化は、特定のヘルペスウイルス感染症の悪影響を最小限にす ると信じられている（例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／０４６８３に記載されたご とくに）。再活性化剤としては、エストロゲン、ホルボールエステル、フォルス コリンおよびβ−アドレナリン阻害剤が挙げられる。 ヘルペスウイルス感染症の治療およびヘルペスウイルス誘発性ＫＳの治療に有 用な薬剤は、多数の米国特許に記載されている。例えば、ガンシクロバーは、米 国特許第４，３５５，０３２号および第４，６０３，２１９号に記載のタイプの 抗ウイルス性グアニン非環式ヌクレオチドの例である。 アンシクロバーは、９−（２−ヒドロキシエチルメチル）アデニンを始めとす る、米国特許第４，２８７，１８８号および第４，１９９，５７４号に記載の抗 ウイルス性プリン誘導体クラスの例である。 ブリブジンは、米国特許第４，４２４，２１１号に記載のタイプの抗ウイルス 性デオキシウリジン誘導体の例である。 ビダラビンは、英国特許第１，１５９，２９０号に記載のタイプの抗ウイルス 性プリンヌクレオシドの例である。 ブロバビールは、米国特許第４，５４２，２１０号および第４，３８６，０７ ６号に記載のタイプの抗ウイルス性デオキシウリジン誘導体の例である。 ＢＨＣＧは、米国特許第５，１５３，３５２号、第５，０３４，３９４号およ び第５，１２６，３４５号に記載のタイプの抗ウイルス性炭素環式ヌクレオシド 類縁体の例である。 ＨＰＭＰＣは、米国特許第５，１４２，０５１号に記載のタイプの抗ウイルス 性ホスホニルメトキシアルキル誘導体の例である。 ＣＤＧ（炭素環式２’−デオキシグアノシン）は、米国特許第４，５４３，２ ５５号、第４，８５５，４６６号および第４，８９４，４５８号に記載のタイプ の抗ウイルス性炭素環式ヌクレオシド類縁体の例である。 フォスカーネットは米国特許第４，３３９，４４５号に記載されている。 トリフルリジンおよびその関連リボヌクレオシドは、米国特許第３，２０１， ３８７号に記載されている。 米国特許第５，３２１，０３０号(Kaddurah-Daoukら,Amira)は、抗ヘルペスウ イルス剤としてのクレアチン類縁体の使用について記載している。米国特許第５ ，３０６，７２２号(Kimら,Bristol-MeyersSquibb)は、ＨＳＶ感染症を治療する ために、またヘルペスチミジンキナーゼを阻害するために有用なチミジンキナー ゼインヒビターについて記載している。他の抗ヘルペスウイルス組成物は、米国 特許第５，２８６，６４９号および第５、０９８、７０８号(Konishiら,Bristol -Meyers Squibb)および第５，１７５，１６５号(Blumenkopfら,Burroughs Wellc ome)に記載されている。米国特許第４，８８０，８２０号(Ashtonら,Merk)は、 抗ヘルペスウイルス剤（Ｓ）−９−（２，３−ジヒドロキシ−１−プロポキシメ チル）グアニンについて記載している。 米国特許第４，７０８，９３５号(Suhadolnikら,Research Corporation)は、 ＨＳＶおよびＥＢＶを阻害するのに効果的な３’−デオキシアデノシン化合物に ついて記載している。米国特許第４，３８６，０７６号(Machldaら,Yamasa Shoy u株式会社)は、抗ヘルペスウイルス剤としての（Ｅ）−５−（２−ハロゲノビニ ル）−アラビノフラノシルウラシルの使用について記載している。米国特許第４ ，３４０，５９９号(Licbら,Baycr Akticngcscllschaft)は、抗ヘルペス剤とし て有用なホスホノヒドロキシ酢酸誘導体について記載している。米国特許第４， ０９３，７１５号および第４，０９３，７１６号(Linら,Research Corporation) は、単純ヘルペスウイルスの効力あるインヒビターとして５’−アミノ−５’− デオキシチミジンおよび５−ヨード−５’−アミノ−２’，５’−ジデオキシシ チジンについて記載している。米国特許第４，０６９，３８２号(Bakerら,Parkc ,Davis &Company)は、抗ウイルス剤として有用な９−（５−Ｏ−アシル−ベータ −Ｄ−アラビノフラノシル）アデニン化合物について記載している。米国特許第 ３，９２７，２１６号(Witkowskiら)は、ヘルペスウイルス感染症を治療するた めの１，２，４−トリアゾール−３−カルボキシアミドおよび１，２，４−トリ アゾール−３−チオカルボキシアミドの使用について記載している。米国特許第 ５，１７９，０９３号(Afonsoら,Schcring)は、単純ヘルペスウイルス１型およ び２型、サイトメガロウイルス並びにエプスイン・バールウイルスに対するキノ リン−２，４−ジオン誘導体活性化剤について記載している。 ｉｉｉ）投与法 本明細書で治療される対象または使用され得るその組織は、哺乳類であって もよく、さらに例示すれば、ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、サルまたは齧歯 類であってよい。好ましい具体例では、対象はヒトである。 組成物は投与処方と適合する様式で、かつ医薬上有効な量で投与される。投与 に必要な有効成分の正確な量は臨床医の判断に依存し、また各患者に固有なもの である。 また、初期投与と追加抗原注射のための適切な管理も異なるが、初期投与に続 く、逐次注射またはその他の投与法による１時間以上の間隔での反復投与によっ て特徴付けられる。 本明細書で用いられる投与法とは、患者に投与する方法を意味する。かかる方 法は当業者に公知であり、限定されるものではないが、局所、非経口、経口、静 脈内、筋肉内、皮下、またはエアゾールによる投与が挙げられる。該薬剤の投与 は持続的または断続的に効果を与えると考えられ、かくして患者内の該医薬はカ ポジ肉腫を患う患者またはＤＮＡウイルス関連カポジ肉腫に感染した患者を治療 するのに効果的である。 ヘルペスウイルス誘発ＫＳを治療するための抗ウイルス性組成物は、好ましく は経口、静脈内または非経口投与および他の全身性形態を介してヒト患者に投与 される。当業者ならば、医師により使用される個々の組成物に対する適当な投与 プロトコールを理解するであろう。 本発明の医薬処方または医薬組成物は固形、半固形、または例えば、懸濁液、 エアゾールなどのごとき液体の投与形態であってよい。好ましくは、該組成物は 、正確な投与量の一回投与に適した単位投与形態で投与される。また該組成物は 、所望の処方により、動物またはヒト投与のための医薬組成物を処方するために 一般的に使用される賦形剤と定義される医薬上許容される無毒の担体または希釈 剤をも含む。希釈剤は該組成物の生物学的活性に影響を及ぼさないように選択さ れる。かかる希釈剤の例としては、蒸留水、生理食塩水、リンガー液、デキスト ラン溶液、およびハンクス液が挙げられる。さらに、該医薬組成物または医薬処 方はまた他の担体、アジュバント；または無毒の、非治療学上の、非免疫原性の 安定剤なども含む。かかる希釈剤または担体の有効量とは、成分の溶解性または 生物学的活性などの点で医薬上許容される処方を得るために有効な量のことであ る。 Ｖ．治療への免疫学的アプローチ 新規なヒトヘルペスウイルスとしてヒトにおけるＫＳの主要な病因薬剤を同定 したので、ウイルス感染組織の存在から生じる免疫学的機能不全を調節し得る免 疫抑制療法が存在する。特に、該ウイルス感染細胞の免疫学的な攻撃を阻害する 薬剤は、ＫＳの症状を改善し、および／または疾病の進展を軽減すると考えられ る。かかる療法は、ウイルス感染細胞が免疫系を標的とするのを防ぐ抗体を含む 。かかる薬剤は、さもなくばウイルスの感染に応答する免疫系をアップレギュレ ートするサイトカイン類に結合する抗体を含む。 該抗体は、単独か、または２つ以上の抗体、限定されるものではないが、免疫 抑制剤、増強剤および副作用緩和剤を含む、他の治療剤、組成物などを含む反応 混液としての何れかで、患者に投与してよい。特に注目するのは、宿主のアレル ギー反応を抑制するのに有用な免疫抑制剤である。注目する免疫抑制剤としては 、プリドニソン、プレドニソロン、デカドロン（ＤＥＣＡＤＲＯＮ）(Mcrck,Sha rp&Dohme,West Point,PA)、シクロホスファミド、シクロスポリン、６−メルカ プトプリン、メソトレキセート、アザチオプリンおよび静脈注射用ガンマグロブ リンまたはそれらの併用が挙げられる。注目する増強剤として、モネンシン、塩 化アンモニウムおよびクロロキニーネが挙げられる。これらの薬剤の全てを、Ph ysician Desk Rcfercnce,第41版、(1987)，発行者 Edward R,Barnhart,New Jers eyに開示されたもののごとき、一般に効能があると認められている投与量範囲で 投与する。 予めヒトヘルペスウイルスまたは関連ウイルスに感染させたヒト由来の免疫グ ロブリンは、標準技術を用いて得ることができる。抗体の適切な力価はこの療法 に関して公知であり、ＫＳの治療に容易に適応される。免疫グロブリンを、非経 口注射または鞘内短絡によって投与することができる。便宜には、免疫グロブリ ン製剤を、ＫＳ関連ヒトヘルペスウイルスに対する抗体についてスクリーニング された個々の供与者から得、高力価の供与者由来の血漿がプールされてよい。別 法として、供与者由来の血漿をプールし、次いで本発明のヒトヘルペスウイルス に対する抗体について試験し、次いで高力価のプールをＫＳ患者に使用するため に選択する。 抗体を注射可能な製剤に処方してよい。非経口処方は公知であり、本発明にお ける使用に適しており、筋肉内または静脈内投与が好ましい。治療上の有効量の 抗体またはイムノトキシンを含む処方は、無菌の溶液、懸濁液または凍結乾燥形 態の何れかであり、所望により安定剤または賦形剤を含んでもよい。凍結乾燥し た組成物は、宿主体重の約０．０１ｍｇ／ｋｇないし１０ｍｇ／ｋｇまでの適当 なレベルで、適切な希釈剤、例えば注射用水、食塩水、０．３％グリシンなどと 共に再構成される。典型的には、該抗体またはイムノトキシンを含む医薬組成物 を、治療する哺乳類の約０．０１ｍｇ／ｋｇないし約５ｍｇ／ｋｇまでの範囲内 の治療上有効な投与量で投与されよう。抗体またはイムノトキシンを含む医薬組 成物の治療上好ましい有効量は、逐次に患者の投与量を増加させる養生法にて、 毎日それぞれ１時間以上にわたって与えられる静脈内点滴によって、数日ないし ２週間にわたって投与される、治療する動物の体重の約０．０１ｍｇ／ｋｇない し約０．５ｍｇ／ｋｇまでの範囲であると考えられる。筋肉内、皮下または腹膜 内または直接ＫＳ病変部に注射することによって、抗体を全身に投与してよい。 投与量は、十分医師の技量の範囲内である、用いる抗体またはイムノトキシンの 性質、例えばその活性および生物学的半減期、処方中の抗体の濃度、投与の部位 および速度、関係する患者の臨床上の抵抗性、患者を苦しめている疾病などに依 存する。 本発明の抗体は、溶液として投与されてもよい。該溶液のｐＨは、ｐＨ５ない し９．５までの範囲であるべきであり、好ましくはｐＨ６．５ないし７．５であ る。該抗体またはその誘導体は、リン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノ メタン−ＨＣｌまたはクエン酸塩などのごとき、医薬上許容される適切な緩衝剤 を有する溶液であるべきである。緩衝剤の濃度は、１ないし１００ｍＭの範囲で あるべきである。また、抗体の溶液は、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムのご とき塩を、５０ないし１５０ｍＭの濃度で含んでもよい。また、アルブミン、グ ロブリン、ゼラチン、プロタミンまたはプロタミンの塩のごとき、有効量の安定 剤を含んでもよく、抗体またはイムノトキシンを含む溶液に、またはそれから該 溶液が調製される組成物に添加してもよい。 抗体の全身投与は、静脈内点滴が許容されるが、一般に毎日の筋肉注射によっ て行われる。また投与は鼻腔内のまたは他の非経口経路によって行われてもよい 。また、抗体またはイムノトキシンは、ミクロスフェア、リポソームまたは血液 に含まれる特定の組織中に置かれた他の微粒子化送達系を介して投与されてもよ い。 治療上の適用において、本発明に従って用いられる化合物の投与量は、化合物 のクラスおよび治療する条件によって異なる。受容患者の年齢、体重、および臨 床条件、並びにその療法を投じる臨床家または医師の経験および判断が、投与量 の選択に影響を与える因子の中にある。例えば、免疫グロブリンの投与量は、ポ リクローナル抗体では１日当たり体重１キログラム当たり約０．１ミリグラムな いし１日当たり約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、モノクローナル抗体ではその量 の約５％ないし約２０％の範囲である得る。かかる場合には、該免疫グロブリン を静脈内点滴として毎日１回投与してよい。好ましくは、治療結果が達成される までか、または副作用が治療の中止を是認するまでの何れかまで、投薬を毎日繰 り返す。一般に、該投与量は、患者にとって許容されない毒性を生じることなく 、ＫＳの症状または徴候を治療または改善するのに十分であるはずである。 有効量の該化合物は、症状の主観的軽減あるいは臨床医または他の資格ある観 観察者が気付くごとき客観的に同一視できる改良の何れかを提供するものである 。投与範囲は、用いる化合物、投与経路および特定の化合物の効力により異なる 。 ＶＩ．ＫＳのためのワクチンおよび予防 本発明は、ＫＳ予防のためのワクチンとして用いるのに適切な物質およびそれ らの投与方法を提供する。該ワクチンはＫＳＨＶに対して向けられ、最も好まし くはＫＳＨＶから得られた抗原を含む。１つの具体例では、該ワクチンは弱毒し たＫＳＨＶを含む。もう１つの具体例では、該ワクチンは殺したＫＳＨＶを含む 。もう１つの具体例では、該ワクチンはＫＳＨＶポリペプチドをコードする核酸 ベクターを含む。もう１つの具体例では、該ワクチンはＫＳＨＶポリペプチドを 含むサブユニットワクチンである。 本発明は、ゲノムから欠失したＫＳＨＶポリペプチドをコードする遺伝子を有 する組換えＫＳＨＶウイルスを提供する。該組換えウイルスは、ＫＳＨＶ感染を 予防するための弱毒ワクチンとして有用である。 本発明は、単離したＤＮＡ分子によってコードされる有効量のペプチドまたは ポリペプチド、および適切な許容される担体を患者に投与し、それによって患者 にワクチン注射することを特徴とする、患者にカポジ肉腫に対するワクチン注射 をする方法を提供する。１つの具体例では、患者に裸のＤＮＡをカポジ肉腫に対 するワクチン注射としての有効量で投与する。 本発明は、有効免疫感作量の単離ヘルペスウイルスサブユニットワクチンを患 者に投与することを特徴とする、ＫＳＨＶによって引き起こされた疾病に対して 患者を免疫感作させる方法を提供する。 Ａ．ワクチン 合成ペプチドまたは抗原として前記した組換えによって生産されたポリペプチ ドを用いて、ワクチンを作製することができる。典型的には、ワクチンは約１な いし５０マイクログラムの抗原を含む。さらに好ましくは、ポリペプチドの量は 約１５ないし約４５マイクログラムである。典型的には、該ワクチンは、投与量 が約０．５ミリリットルを含むように処方される。該ワクチンは、当該技術分野 において公知の何れの経路によって投与されてもよい。好ましくは、経路は非経 口である。さらに好ましくは、それは皮下または筋肉内投与である。 特にワクチンの技術に関するものとして、抗原の有効性を増強するための多く の戦略が存在する。例えば、ペプチドの環化または円形化はペプチドの抗原能力 および免疫原性能力を増加させることができる。米国特許第５，００１，０４９ 号参照。さらに一般的には、抗原を適切な担体、通常は蛋白質分子に共役させる ことができる。この方法はいくつかの面を持つ。それによって、単一のより大き い担体分子に共役させるために、ペプチドのごとき抗原の多重コピーが与えられ る。さらに、該担体は、該抗原の輸送、結合、吸収または転移を促進する性質を 有し得る。 皮下注射のごとき非経口投与について、適切な担体の例としては、破傷風トキ ソイド、ジフテリアトキソイド、血清アルブミン、およびヤツメウナギ、または カサガイ、ヘモシアニンである。なぜならば、それらは結果として生じた最小の 遺伝制限を有する複合体を提供するからである。これらの普遍的な担体を含む複 合体は、非常に異なる遺伝子セットを有する固体において、Ｔ細胞クローンアク チベーターとして作用することができる。 ペプチドと担体との間の共役は、当該技術分野において公知の方法の１つを用 いて達成できる。例示すれば、該共役は、例えば、MeansおよびFccney，“蛋白 質改変技術の最近の総論”Bioconjugate Chem.1,2-12(1990)によって詳述される ごとくき結合剤として二機能性架橋剤を用いることができる。 多数のヘルペスウイルスに対するワクチンが、首尾よく開発されている。生き た弱毒Ｏｋａ系統を用いる水痘帯状ヘルペスウイルスに対するワクチンは、大人 における水痘帯状ヘルペスを予防するのに、および免疫無防備状態のおよび正常 な子供の双方における水庖瘡を予防するのに効果がある（Hardy,I.ら,1990,Inf. Dis.Clin.N.Amcr.4,159;Hardy,I.ら,1991,New Engl.J.Med.325,1545;Levin,M.J. 1992,J.Inf.Dis.166,253;Gershon,A.A.,1992,J.Inf.Des.166(増補),563）。また 、 単純ヘルペス１型および２型は、主要な疾病に対する防護にいくらか成功して市 販されているが、感覚神経節における潜伏感染の確立を予防することにおいては あまり成功していない(Roizman,B.,1991,Rev.Inf.Disease 13(増補11),S892;Ski nncr,G.R.ら,1992,Mcd.Microbiol.Immunol.180,305)。 ＫＳＨＶに対するワクチンは、ＫＳＨＶ包膜糖蛋白質から作製できる。これら のポリペプチドを精製し、ワクチン注射に用いることができる(Lasky,L.A.,1990 ,J.Med.Virol.31,59)。ヒトヘルペスウイルスに感染した細胞由来のＭＨＣ−結 合ペプチドを、Marlocsら,1991,Eur.J.Immunol.21,2963-2970の方法によって、 ワクチン候補として同定することができる。 ＫＳＨＶ抗原を、種々の溶液および当該技術分野において公知である他の化合 物と結合または混合してもよい。例えば、種々のアジュバントまたは免疫希釈剤 を含むまたは含まない水、食塩水、または緩衝化した伝達体の形で、それを投与 してもよい。かかるアジュバントまたは薬剤の例としては、水酸化アルミニウム 、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（アルム）、硫酸ベリリウム 、シリカ、カオリン、炭素、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、ムラミ ルジペプチド、バクテリアエンドトキシン、脂質Ｘ、コリネバクテリウム・パル ブム(Corynebacterium parvum)(プロピオニバクテリウム・アクネス(Propioniba ctcrium acnes))、ボルデテラ・ペルトゥシス(Bordetella pertussis)、ポリリ ボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リソレシチン、ビタミンＡ 、サボニン、リポソーム、レバミソール、ＤＥＡＥ−デキストラン、ブロック共 重合体類または他の合成アジュバントが挙げられる。かかるアジュバントは、種 々の供給源、例えば、Merck Adjuvant 65(Merckand Company,Inc.,Rahway,N.J.) またはFreund's Incomplete Adjuvant and Complete Adjuvant(Difco Laborator les,Detroit,Michigan)から商業的に入手できる。他の適切なアジュバントは、 アンヒゲン(Amphigcn)(水中油)、アルヒドロゲル(Alhydrogcl)(水酸化アルミニ ウム)、またはアンヒケンおよびアルヒドロゲルの混合物である。アルミニウム だけがヒトへの使用を認可されている。 抗原およびアジュバントの割合は、双方が有効量で存在する限りにおいて広範 囲にわたって変化し得る。例えば、水酸化アルミニウムは、ワクチン混合物の約 ０．５％（Ａｌ2Ｏ3基準）の量で存在し得る。投与量当たりを基準として、該抗 原の量は、患者当たり約０．１μｇないし約１００μｇの蛋白質の範囲であり得 る。好ましい範囲は、投与量当たり約１μｇないし約５０μｇである。さらに好 ましい範囲は、約１５μｇないし約４５μｇである。適切な投与量は、約０．５ ｍｌである。従って、筋肉内注射のための投与量は、例えば、０．５％水酸化ア ルミニウムを有する混合物中に４５μｇの抗原を含む０．５ｍｌで構成される。 処方化の後、該ワクチンを滅菌容器に入れ、次いで封じて低温で、例えば４℃で 保存するか、または凍結乾燥させてもよい。凍結乾燥により、安定化された形態 で長期の保存が可能になる。 経口または非経口（例えば、皮下または筋肉内）注射を含むワクチンの投与に 関する何れの従来法で該ワクチンを投与してもよい。筋肉内投与が好ましい。治 療は、ワクチンの単回投与または一定期間にわたる複数回の投与から構成される 。その投与量は耐用期間の最初の８か月内にヒト患者に与えられるのが好ましい 。本発明の抗原は、インフルエンザＡ型抗原のごときインフルエンザ抗原を含む 化合物の適切な投与量と併用することができる。また、該抗原は、経口投与に適 応できる組換えワクチンの成分ともなり得る。 本発明のワクチンを他の疾病のためのワクチンと組み合わせて、多価ワクチン を作製してもよい。医薬上有効量の該抗原は、蛋白質のごとき医薬上許容される 担体、または哺乳類、特にヒトのワクチン注射に有用な希釈剤と共に用いること ができる。他のワクチンは、当業者に周知の方法に従って調製されてよい。 有効な免疫保護をもたらすためには、哺乳類を適切なエピトープに曝すだけで よいことを、当業者ならば容易に認識できる。該エピトープは、典型的には全蛋 白質のごく一部であるアミノ酸のセグメントである。組換え遺伝学を用いて、天 然の蛋白質の一次構造を変化させて、自然に生じるエピトープと同一であるまた は実質的には同様である（免疫学的に同等である）エピトープを含む誘導体を作 出するのが通常である。かかる誘導体は、ペプチド断片、アミノ酸置換、アミノ 酸欠失およびヒトヘルペスウイルス由来のウイルスポリペプチドのアミノ酸配列 のアミノ酸付加を含んでもよい。例えば、あるアミノ酸残基が蛋白質の生物学的 活性に過度に作用することなく、同様の大きさおよび極性のアミノ酸で置換され てもよいことは、当該蛋白質技術においては公知である。該ヒトヘルペスウイル スポリペプチドは重要な三次構造を有し、該エピトープは通常コンホメーション を有する。かくして、保護免疫応答を生じるために、改変は一般にコンホメーシ ョンを保持すべきである。 Ｂ．抗体の予防 治療の、静脈内の、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、周産期水痘 およびＣＭＶを含むヘルペスウイルス疾病の受動的な免疫療法の形態として用い られてきた。従前に該ヒトヘルペスウイルスに感染し、該ウイルスに対して適切 に高い力価を抗体を有するヒト由来免疫グロブリンは、抗ウイルス剤（例えば、 ガンシクロバー）と組み合わせて、または一般にＫＳの治療として免疫応答を調 節するために標的としていることが評価されている免疫療法の他の形態と組み合 わせて与えることができる（すなわち、共重合体−１、抗イディオタイプモノク ローナル抗体、Ｔ細胞“ワクチン注射”を用いた治療）。ヒトヘルペスウイルス に対する抗体を、本明細書中に記載したごとくに、患者に投与することができる 。該ヒトヘルペスウイルスに感染した細胞上に発現したエピトープに対して特異 的な抗体が好ましく、前記したごとくに得ることができる。 ポリペプチド、類縁体または活性断片を、中和した医薬上許容される塩の形態 として治療組成物に処方することができる。医薬上許容される塩としては、酸付 加塩（ポリペプチドまたは抗体分子の遊離アミノ基で形成した）が挙げられ、こ れらは、例えば塩酸またはリン酸のごとき無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石 酸、マンデル酸などのごとき有機酸などで形成されている。また、遊離カルボキ シル基から形成された塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カル シウム、または水酸化第二鉄のごとき無機塩基、およびイソプロピルアミン、ト リメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの ごとき有機塩基から誘導することができる。 Ｃ．治療上の効能のモニター 本発明は、（ａ）カボジ肉腫を患う患者由来の第一のサンプル中に単離した核 酸分子の存在を測定し、（ｂ）治療量の薬剤を該患者に投与して該薬剤をサンプ ル中の細胞に接触させ、（ｃ）適切な時間の後に治療した患者由来の第二のサン プル中の単離した核酸分子の量を測定し、次いで（ｄ）第一のサンプル中で測定 した単離核酸分子の量と第二のサンプル中で測定した量とを比較し、差は該薬剤 の効果を示し、それによってカポジ肉腫の治療における治療効力をモニターする ことを特徴とする、カポジ肉腫の治療における治療効能力のモニター方法を提供 する。本明細書中で定義されるごとくに、“量”はウイルス量またはコピー数で ある。ウイルス量またはコピー数を決定する方法は、当業者に公知である。 ＶＩＩ．ＫＳの症状を緩和する医薬に関するスクリーニングアッセイ ＫＳの原因または経過に関与する薬剤が同定され記載されているので、薬剤の 生物学的活性を阻害する可能性のある医薬の確認を示唆するアッセイは可能であ る。薬剤が本明細書に記載したウイルスに対して活性を有するかどうかを決定す るＫＳ薬剤スクリーニングアッセイが本発明で考慮される。かかるアッセイは、 ＫＳ関連ヒトヘルペスウイルスポリペプチドまたはペプチドを発現する細胞を用 いたＫＳ治療に使用するために評価される化合物をインキュベートし、次いでそ れからかかる薬剤の活性に関する化合物の効果を測定することを特徴とする。該 ウイルスが適切な細胞培養において維持されているイン・ビトロアッセイが好ま しいが、イン・ビトロでの動物モデルもまた効果的である。 注目する薬剤に対して活性を有する化合物またはかかる薬剤由来のペプチドが 、イン・ビトロ並びにイン・ビボアッセイ系においてスクリーニングできる。イ ン・ビトロアッセイとしては、ヌクレオチド類縁体、チェーンターミネーター、 アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびランダムポリペプチドを始めとする、濃 度を変化させたウイルス複製に対して標的とされた化合物の存在下、末梢血液の 白血球またはＭＴ−４のごとき感受性Ｔ細胞株を注目する薬剤で感染させること が挙げられる（Asadaら,1989,J.Clin.Microblol,27,2204;Kikutaら,1989,Lancet Oct.7,861）。感染した培養物またはそれらの上清を、定量的ＰＣＲによって、 ドットブロットアッセイによってまたは免疫学的方法を用いることによって、ウ イルスゲノムの存在を始めとするウイルスの総量についてアッセイすることがで きる。例えば、感受性細胞の培養物を、種々の濃度の薬剤の存在下でＫＳＨＶで 感染させ、数日後にスライドに固定し、ウイルスポリペプチドに対するモノクロ ーナル抗体を用いる間接免疫蛍光によってウイルス抗原を試験することができよ う（Kikutaら，前記）。別法として、化学的に接着させたＭＴ−４細胞単一層を 、病巣の縮小を調べるための間接免疫蛍光抗体染色を用いる伝染性薬剤アッセイ に用いることができる(Higashiら,1989,J.Clin.Micro.27,2204)。 イン・ビトロアッセイにおける全細胞に対する別法として、宿主細胞から単離 するか、または組換え技術によって生産した精製ＫＳＨＶ酵素を、酵素活性に関 して可能性のある薬剤の効果を測定する合理的薬剤設計のための標的として用い ることができる。この試みに従うＫＳＨＶ酵素として、限定されるものではない が、デヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジレートシンターゼ（Ｔ Ｓ）、チミジンキナーゼまたはＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。酵素活性の測 定は該薬剤自体の効果を示す。 ヘルペスウイルス産物を用いた薬剤スクリーニングは公知であり、ＥＰ０５１ ４８３０（ヘルペスプロテアーゼ）およびＷＯ９４／０４９２０（ＵＬ１３遺伝 子産物）に従前に記載されている。 本発明は、抗−ＫＳ化学治療をスクリーニングするアッセイを提供する。感染 細胞をＫＳに対して化学治療の可能性がある化学薬剤（例えば非環式−グアノジ ン）の存在下でインキュベートすることができる。次いで、数日後、該細胞中の ウイルスのレベルを、抗原についての免疫蛍光アッセイ、ウイルスゲノムＤＮＡ についてのサザンブロッティングまたはｍＲＮＡについてのノーザンブロッティ ングによって測定し、対照細胞と比較する。このアッセイは、ＫＳに対して有用 かもしれない多数の化学化合物を速やかにスクリーニングすることができる。 さらに、本発明は、細胞質中または細胞核中の何れかにおいて、核酸分子また は蛋白質に結合可能な薬剤または他の分子を同定するために使用されるアッセイ 系を提供し、それによって転写活性を阻害または強化する。かかるアッセイは、 特定の細胞の活性に対して特異的である、または活性の時間またはレベルにおい てかかる活性を強化すると考えられる薬剤の開発に有用である。 本発明は、（ａ）細菌栄養要求体（栄養要求性突然変異体）におけるＫＳＨＶ ＤＨＦＲまたはＫＳＨＶ ＴＳを発現させ、（ｂ）該薬剤の存在または不在下で 、細菌の増殖速度を測定し、次いで（ｃ）かくして測定した速度を比較してイン ・ ビボにおいてＫＳＨＶ ＤＨＦＲまたはＫＳＨＶ １を阻害する薬剤を同定する ことを特徴とする、イン・ビボにおけるＫＳＨＶ選択的抗ウイルス剤のスクリー ニング方法を提供する。 当業者に周知の方法によって、適切な細菌栄養要求体のスクリーニングまたは 生産および細菌の増殖測定が可能になる。 抗葉酸剤化合物についての以下の総論は、当該技術の状態をさらに十分に記載 するために提供され、特にそれはデヒドロホレートレダクターゼおよびチミジレ ートシンターゼの阻害剤に関係する。（ａ）Unger,1996,現在の医療腫瘍学にお ける治療の理論：新規な抗癌剤、Journal of Cancer Rcsearch & Clinlcal Onco logy122,189-198、（ｂ）Jackson,1995,代謝経路モデリングからの毒性推定、To xicology 102,197-205、（ｃ）Schultz,1995，癌治療におけるより新しい抗葉酸 剤、Progrcss in Drug Research 44,129-157、（ｄ）vander WiltおよびPeters, 1994,固形腫瘍の治療におけるピリミジン抗代謝物質に対する新たな標的１：チ ミジレートシンターゼ、Pharm World Sci16,167、（ｅ）Fleisher,1993,抗葉酸 剤類縁体：作用機構、分析の方法論、および臨床での効能、Therapeutic Drug M onitoring15,521-526、（ｆ）Eggottら,1993,慢性関節リウマチにおける抗葉酸 剤：仮定的な作用機構、Clinical & Experimental Rheumatology 11 増補8,S101 -S105、（ｇ）Huennekensら,1992，葉酸剤化合物の膜輸送、Journal of Nutrlti onal Science& Vitaminology 臨時増刊 No.52-57、（ｈ）FlemingおよびSchilsk y,1992，抗葉酸剤：次世代、Scminars in Oncology 19,707-719、および（ｉ）B ertinoら,1992,化学治療剤の標的としてのチミジレートサイクルの酵素：抵抗性 の機構、Mount Sinai Journal of Medicine 59,391-395。 本発明は、（ａ）ｖＭＩＰ−Ｉ、ｖＭＩＰ−ＩＩまたはｖＭＩＰ−ＩＩＩの血 漿濃度を測定し、次いで（ｂ）該測定値を、測定値に対するＡＩＤＳの臨床経過 に関する標準曲線と比較して患者の健康状態を決定することを特徴とする、ＡＩ ＤＳ患者の健康状態の決定方法を提供する。 ＶＩＩＩ．ＨＩＶの治療 本発明は、核酸分子によってコードされている有効量のポリペプチドを用いて 、患者に投与するまたは患者の細胞を治療して、ＨＩＶの複製を阻害することを 特徴とする、ＨＩＶ複製の阻害方法を提供する。１つの具体例では、該ポリペプ チドは、表１に与えられたリストから選んだものである。 以下、実験の詳細によって本発明をさらに詳しく説明する。これらは本発明の 理解を助けるためのものあって、後記の請求の範囲において示される発明を限定 するものではない。実験の詳細セクションＩ カポシ肉腫関連ヘルペスウイルスのヌクレオチド配列 カポシ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV又は HHV8）のゲノムをBC−１細胞系 からコスミド及びファージ遺伝子ライブラリーでマップした。そのヌクレオチド 配列は、ゲノムの右端のクローニングし難い３ｋｂ領域を除いて決定された。BC −1 KSHVのゲノムは、複数のＧ＋Ｃに富む801bpの末端反復配列でフランクされ た140.5kｂ長の特異的コード領域（LUR）からなる。該LUR中には、親腫瘍に明ら かに生じたゲノムの複製が、本細胞培養物派生菌株中に存在していた。少なくと も81のオープン・リーデイング・フレーム（ORFs）（その中にはヘルペスウイル ス・サイミリORFsと類似性を持つ66を含む）、及び５つの内部反復領域が存在す る。該ウイルスには、ウイルスの構造的、代謝的蛋白のみならず、相補的に結合 する蛋白、３つのサイトカイン（二つのマクロファージ炎症性蛋白及びインター ロイキン６）、ジヒドロホレート・リダクターゼ、bcl−2、インターフェロン調 節因子、lL-8受容体、NCAM様アドヘーシン、D−型サイクリンと類似の遺伝子が コードされている。KS病巣由来のウイルスＤＮＡの末端反復を分析する事によっ て、KS腫瘍中にKSHVのモノクローナルの増殖があった事が示唆される。完全なゲ ノム配列は、ジーンバンクの認識番号U75698（LUR）、U75699（TR）、U75700（I TR）に記載されている。 カポシ肉腫は、混合細胞構造物の血管系腫瘍である（Toppero et al，1993,J. AmAcod．Dermotol.28,371-395）。重篤な免疫抑制のない人においては、組織学 的に比較的良性なコースをたどる事から、ＫＳ腫瘍細胞の増殖がサイトカイン誘 導性であるという示唆が導かれる（Ensoli et al.,1992，Immunol,Rev．127，14 7-155）。疫学的研究では、腫瘍は厳密なる免疫学的制御下にあって、HIV以外の セックスによって伝染する感染性作用物によって引き起こされるらしい事が示さ れる（Peterman et al,1993,AIDS 7,605-611）。ＫＳ関連性ヘルペスウイルス（ KSHV）は、AIDS−KS病巣で、表象的相違分析（ＲＤＡ）で発見され、殆どすべて のAIDS-KS病巣に存在する事がわかった（Chang et al,1994,Sclence 265,1865-1 869）。これらの知見は実証されており、ＫＳの様々な疫学的クラスを調査して 得られた殆どすべてのＫＳ病巣にわたって当てはまる（Boshoff et al.,1995, Lancet 345,1043-1044;Dupln et al.,1995,Loncet 345,761-762;Moore and Chan g.1995,New Eng.J.Med.332,1181−1185;Schalling et al.,1995,Nolure Med.１, 707-708;Chang et al.,1996,Archlnt.Med.156,202-204）KSHVは、今までに特定 された内の第８番目のヒト・ヘルペスウイルス（HHV8）と予測される。 該ウイルスは、二つのヘルペスウイルスＤＮＡ断片であるKS330am及びKS631Ba m（Chong et al,1994,Sclence 265,1865-1869）から初めて特定された。続いて 、KS330Bamとハイブリダイズする21kb AIDS-KS遺伝子ライブラリー断片（KS5） をシークエンシングする事によって、KSHVはラデイノウイルス（Rhodinovirus） 属に属するヘルペスウイルス・サイミリ（ＨＶＳ）と関連したガンマ・ヘルペス ウイルスであることが実証された（Moore et al.,1996,J.Virol．70,549−558） 。この領域における遺伝子のシンテニー（synteny）は、エプスタイン・バーウ イルス（EBV）とウマ・ヘルペスウイルス２（EHV2）間のみならず、KSHVとHVS間 でも、維持されている。KS631Bam配列を含む12kb領域（L54及びSGL-1）には、ラ デイノウイルスに特異的なサイクリンＤ遺伝子およびlL-8Ra遺伝子が含まれる。 KSHVは、未感染細胞系に簡単には伝播しない（Moore et al.,1996,Ｊ.Virol.7 0,549-558）が、KSにしばしば関連して起こるレアＢ細胞の一次滲出（体腔起源 ）リンパ腫（PEL）中には存在している（Cesarmoan et al,1995,New Eng.Ｊ.Med .332,1186-1191）。BC-1は、KSHVゲノムコピーを数多く含むPEL細胞系である（C esarman et al.,1995,Blooｄ86,2708-2714）。BC−１中及びその親腫瘍中のKSHV ゲノム型は、270kbの直線マーカーと共に、パルスフィールドゲル電気泳動（PEC E）上を共に移動する（Moore et al,1996,Ｊ.Virol70,549−558）。しかしなが ら、EBVネガテイブの細胞系（Renne et al.,1996,Nature Med.2,342-346）に由 来する蛋白質の膜で包まれたＤＮＡゲノムに基づくゲノムのサイズは、165kbと 推定される(Moore et al,1996,J.Virol.70,549-558)。KS病巣由来の推定では、 ゲノムサイズがEBVのゲノムサイズ（172kb）Decker et al,1996,Ｊ.Exp.Med.184 ,283-288）よりも大きい事を示している。 KSHVのゲノム配列を決定し、また新規ウイルス遺伝子を特定するために、BC- １ゲノムライブラリー由来の連続的にオーバーラップしているウイルスＤＮＡ 挿入物をマップした。その右端の小さいクローン化不能な反復領域を除き、高い リダンダンシーでシークエンシングを行って、ウイルスのゲノム構造を規定し且 つKSHVに関連した病因として働く遺伝子の特定を可能にした。 ＜材料と方法＞ ライブラリーの形成およびスクリーニング： BC-1、HBL-6及びBCP-1細胞を2O %の胎児子牛血清を加えたRPMl1640中に維持した（Moore et al,1996,Ｊ.Virol70 ,549-558;Cesormon et al.,1995,Blood 86,2708-2714;Gao et al.,1996,Noture Med.2，925-928）。BC-1細胞由来のDNAは、商業的に、ラムダFlX llかまたはS-C os1ベクター（Stratagene,La Jolla,CA）のいづれかにクローン化された(Sambro o k et al.,1989,Moleculor Clonlng:A laboratorymanual,Cold Spring Horbor Press,Solem,Moss)。ファージ及びコスミド・ライブラリーは、標準法でスクリ ーンされた（Benlon etal.,1977,Sclence 196，180-182;Hanahon and Meselson, 1983,Methods Enzymol.100,333−342)。 最初のライブラリー・スクリーニングは、KS330Bam及び KS631BamRDA断片を使 用して行った(Chong et al.,1994,Sclence 265,1865-1869）。重複したクローン を、前もって特定したクローンの末端から合成したプローブを使用して、連続的 に特定した（図１）（Feinberg and Vogelstein,1983,Anal.Biochem.132,6;Melt on et al.,1984,Nucl.Acids,Res.12,7035-7056）。該マップは、コスミドZ2及び Z6中では、多数の同型のTRユニットの存在によって円形に並べ変えられていると 考えられた。各候補ファージ又はコスミドは、三次元スクリーニングによって確 認された。 ショットガンシークエンシング及び配列の解明 ラムダＤＮＡ及びコスミドＤＮＡを標準法によって精製した（Sombrook et al .,1989,MolecularClosing:A laboratoy manual,Cold Spring Horbor Press,Sale m,Mass.）。 ショットガン・シークエンシング（Deininger,1983,Anal Biochem.129,216-223; Bonkier et al,1987 Meth Enzymol 155,51-93）を超音波破砕されたＤＮＡにつ いて行なつた。１-4kbの分画を、M13mp19（New Engiond Bialabs,Inc,Beverly M A）中にサブクロ−ニングし、XL-1ブルー細胞（Stratagene,La Jalla，CA）（So mbrook et al.,1989,Molecular Clonlng:Alaboratary manual，Cold Spring Harbor Press, Salem,Moss.）中で増殖させた。M13ファージは、ファージ又はコスミド由来の挿 入DNAを使用して陽性にスクリーニンされ、ベクター・アームDNA又は隣接するゲ ノムの挿入物を用いて陰性にスクリーニングされた。 自動ジデオキシサイクルシークエンシングを、M13(−21) CS+又はＦＳ染色プ ライマーキット（Perkin-Elmer Branchburg NJ)を用いて、ABI 373A又は377シー クエネータ（ABI Foster City,CA）上で実行した。各々1Okbの挿入配列を始め にカバーするためには、約 300のM13配列が模式的に必要であった。任意の部位 において、少なくとも４つの重複配列で二方向からカバーすることにより、最小 限の配列（再現の）忠実性の規準が定義された。これらの規準に合致しない配列 ギャップ、不明瞭、又はフレームシフトを持つ領域については、汎用プライマー （Perkin-Elmer）及び染色停止化合物（FS又は既製反応キット、Perkin−Elmer ）を用いてプライマーウオーキングを行なった。Z2コスミド挿入物中の右端TR配 列に隣り合うシークエンシングされない 3kb領域は、繰り返し努力したにも拘わ らず、M13又はブルースクリプト中にクローニングする事はできなかった。 配列の組み立て及びオープン・リーデイングフレーム分析 配列データをファクチュラ(Focturo)(ABI,Foster City CA)を使用して編集し 、電気泳動写真を使用してオートアセンブラー（ABI、Foster Clty、CA）で一 続きの配列に組み立て、アセンブリーライン(assembly LIGN)(IBI-kodak,Roches ter NY)により、より大きく組み立てた。多数のシークエンシングを試みても明 瞭に解像されない塩基の位置（全部で、10未満の塩基）に対して、多数派塩基対 (mojority basegair)という名称が割り当てられた。全配列（1-5kb断片）及びす べての予測オーフ゜ン・リーデイングフレーム（ORFs）を、BLASTX、BLASTP、BL ASTN（Altschul et al,1990,J.Mol.Biol 215,403-410）を使用して分析した。該 配列は、更にMOTIFS（Moore et al,1996,J.Virol.70,549-558）,REPEAT及びBEST FIT(GCG)及びMacVectar（IBI,New Haven.CT)を使用して分析された。 ORF の指定及び命名 HVSとの類似性を有する全てのORFsを特定した。これらと他の有望なORF（100 より多いアミノ酸を持つ）が、MacVectorを使用して発見された。他の既知 の遺伝子との類似性、至適開始コドンとの前後関係（Kozak、1987,Nucl.AcidsRe s.15,8125-8148）サイズ及び位置を基にしたマップ（図１）には、HVS ORFsと類 似しないORFsも含まれていた。偽の選出を最小にするために、保存性選択(conse rvative selection)をしたので、これによって真のリーデイングフレームの数が 少なく見積もられる事になった。KSHV ORFの命名は、HVS類似性に基づいている 。即ち、HVS遺伝子と非類似のKSHV ORFsは、Ｋを前につけて順に番号づけされて いる。配列はHVS ORFと類似だが、位置的類似性を持たないORFsは、HVSORF番号 （例えば、ORF 2）が割り当てられる。新 ORFsが特定された時は、これを小数点 表記によって命名することが提唱される。KSHVゲノムの標準マップの方向（図１ ）は、HVS（Albrecht et al.,1992,J.Virol.66,5047-5058）及びEHV2（Telford et al.,1995,Ｊ.Mol.Biol.249,520-528）の方向と同じであり、EBV標準マップに 対して逆方向である(Boer et al,1984,Noture 310，207-211)。 ＜結 果＞ ゲノムマッピング及び配列の特徴 完全ゲノムマッピングが、７つのラムダ及び３つのコスミド・クローン（図１ ）を用いて完成された。BC-1KSHV ゲノムの構造は、TRユニットに隣接したロン グユニーク領域を持つ点においてHVSと類似している。〜140.5kbのLUR配列は、5 3.5%のG+C含有率を持ち、全て特定されたKSHV ORFsを含む。TR領域は、有望なパ ッケージング部位及び開裂部位を備えた84.5%のG+C含有率（図２Ａ）を持つ複数 の8O1bpの直列反復ユニットからなる。反復ユニット間には、わずかな配列の変 異が見られる。基本型TRユニットと比較すると、左(Z6)TRジャンクション（205b p）における最初のＴＲユニットはBC-1においては、欠損しかつ先端削除されて いる。 シークエンシング・ベクター中にクローニングする事ができないZ2コスミッド 挿入物中の 3kb領域のために、右末端反復領域に隣接するゲノム配列は完成され ていない。プライマー・ウオーキングから得られた部分配列情報では、この領域 には、16bpCのC+Tに富む不完全な直列反復の伸長物を少なくとも一つ有する16bp のA+Gに富む不完全な直列反復の複数の伸長物が点在している。これらは 長い逆反復を形成し得るものであり、この領域をサブクローニングするに当たっ て、我々は困難を余儀なくされた。12倍の以上の平均的配列を全LURに対して重 複させ、これに伴って、非クローン領域を除いて、少なくとも４つの重複した読 み取りによって完全に二方向的にカバーができた。 その反復構造のために、全領域のシークエンシングが不可能なので、BC−1TR 領域をサザン・ブロテイングによって調査した。BC-1、BCP-1（EBVネガテイブ、 KSHVに感染した細胞系）及びKS病巣DNAsは、TR内を一個所切断する酵素で消化さ れると単位長の反復配列と一致し、またTRプローブとハイブリダイズする〜800b pの強いシグナルを持つ（図2B,2C)。TR内を切断しない酵素で消化すると、BC-1 菌株には、7kb及び〜35kb TR配列に隣接したTR中に埋められた特異的領域が含ま れている事が示されている（図2C及び2D)。BC-1と同様の腫瘍から別個に派生し た細胞系、即ち、HBL-6中に、同一のパターンの発生が見られた。この事は、親 腫瘍中で、このような重複が存在していた事を示唆する（図2C及び2D）。Notlに よる制限パターン（Notlは、又TR内を一回だけ切断するがLUR内を殆ど切断しな い）によると、埋め込み領域は少なくとも33kbである事が示唆される。この領域 を部分的にシークエンシングすると、正確なゲノムの重複は、ORF K8に始まる事 が実証される。該LURは、右端のシークエンシングされていないギャップ（＜3kb ）を含んだ140kbである。BC-1及びHBL-6(重複領域を含む)における推定のKSHVゲ ノムサイズは、約210kbである。 クローン性の研究（Raab-Traub and Flynn,1986,Cell 47,883-889）で使用さ れるEBV複製モデルに基づくと、多形BCP-1梯子パターンが、溶解ウイルス複製及 びスーパー感染（図2C）をもたらし得る。EBV梯子パターンは、溶解複製を行な っている間にTRユニットが欠損又は重複した時に発生し、各感染細胞にとっては 、確率論的に起こるプロセスである（Raab-Traub and Flynn,1986,Cell 47,883- 889）。厳重な潜在的KSHV複製コントロール下にあるBC-1については、梯子は存 在しない（Moore et al,1996.Ｊ.Virol 70，549-558）。KS病巣ＤＮＡは又、単 一のハイブリッド・バンドを示し、これは、KS腫瘍細胞中のウイルスがモノクロ ーナル起源でありうる事を示唆している。 KSHV LUR の特徴及びコード領域 KSHVゲノムは、他のヘルペスウイルス（Chee et al.,1990,Curr.Topics Micro biol.Immunol.154,125-169）の７ブロック(B)組織を共有しており、それに伴っ てサブファミリー特異的又はユニークなORFsが、ブロック間（ブロック間領域(I B)a-h、図１）に存在する。ORF分析によって、シークエンシングされた137.5kb LURの79%のみが、81の同一とみなしうるORFsをコードしている事が示され、これ はORF位置の保存的割り当てに起因していると思われる。全LUR CpGジヌクレオチ ドの観測／予測（O／E）比は0.75で、この比は、メチル化されたシトシンが適度 に失われていることと一致していたが、場所によって変異が著しい。最低のCpG O/E比（＜0.67）は、IBa（bp 1-3200）、B5（68,602−69,405）及びIBｈ（117 ,352-137,507）で生じている。最高のO／E比（＞0.88）は、B2からB3（3O,701-4 7,849）にわたってと、IBe(67,301-68600)及びB6(77,251-83,600)で生じている 。KS5配列（Moore et al.,1996,Ｊ.Virol.70,549-558）との比較では、これら二 つの菌株の間には高い配列保存性が見られ、比較された20.7kb領域(0.1%)にわた っては21のポイント変異しか見られない。KS5ORF28と比較すると、BC-1ORF28（ ポジション49,004）内のフレームシフトは、Ks5及びBC-1から増幅されたPCR産物 を繰り返しシークエンシングしたにも拘わらず、解像不可能であった。KS5配列 と比較して、非コード領域（bp 47,862,49,338）には別に二つのフレームシフト も存在している。 LUR（図１）中には、幾つかの反復領域がある。ORF k11内のポジション92,678 -92,820及び92,852-92,994(waka/jwka)では143bp配列が、繰り返されている。ゲ ノムの他の領域には、複合反復が存在する。すなわち、24、285-24、902（ｆｒ ｎｋ）の領域には20-30bpの反復が、29、775と29、942（vnc t）塩基の間には、 13bpの反復、二つの別々の反復は、塩基118、123と118、697（zppo）間に伸びて おり、15の異なる11−16bpの反復が、124,527から126,276(moi)の領域にわたっ て存在する。複合体A−Gに富む反復領域(mdsk)は、137,099に始まり、非シーク エンス・ギャップ中に伸びている。 他のヘルペス・ウイルスに見られる類似遺伝子を持つ保存ORFsが表１に掲載さ れており、それに沿って、その極性、マップ位置、サイズ、HVS、EBV ORFsとの 関連性、及び推定機能が掲載されている。ウイルス構造蛋白及び酵素の保存さ れたORFsのコードには、ウイルスDNA複製（例えば、DNAポリメラーゼ（ORF9）） 、ヌクレオチド合成（例えば、ジヒドロフォレート・リダクターゼ（DHFR、ORF2 ）、チミジル酸シンターゼ(TS，ORF70)、遺伝子発現の調節因子（R、トランスア クチベータ(LCTP、ORF50）、５つの保存されたヘルペス・ウイルス構造キャプシ ドに関わる遺伝子、及び５糖蛋白遺伝子が含まれている。 HVS ORFsと類似の幾つかの遺伝子はまた、ユニークな特徴を持つ。ORF45は、 核及び転写因子（チックヌクレオリン及び酵母SlR3）と類似の配列を持ち、また ORF45はトランスアクチベータ蛋白に典型的な伸長酸性ドメインを、アミノ酸90 と115間に持っている。ORF73は、moi反復によってコードされるグルタミンに富 む配列によって二つの領域に分けられた伸長酸性ドメインを持つ。最初の領域は 、もっぱら殆どアスパラギン酸及びグルタミン酸残基の反復によって構成される 。これに対して、第二のグルタミン酸に富む領域は、レクチンジッパー構造を示 唆する、反復レクチン七価元素モチーフを持つ。ORF75、即ち、推定外皮蛋白は 、大腸菌のプリンのバイオ合成酵素及びD.メラノガスターのＮフォルミルグリシ ンアミド・リボタイド・アミドトランスフェラーゼ（FGARAT）と高レベルの類似 性を持っている。 ORFs K3及びK5は、HVS遺伝子と類似してはいないが、主な前初期（immediotee orly）ウシヘルペスウイルス・タイプ４(BHV4)遺伝子IE1（夫々、12及び13%類似 ）と類似している（von Sonten,1991,Ｊ.Virol.65,5211-5224）。これらの遺伝 子は、ヘルペス・シンプレックスウイルスＩ（HSV1）aO（BHV4 IE1と類似）とは 著しい類似性を持たないが、HSV1 ICPO蛋白と共通する蛋白をコードし、そのシ ステインに富む領域は、ジンクフィンガーモチーフを形成し得る（van Santen,1 991,J.Virol 65,5211-5224）。ORF k5によってコードされる蛋白は、BHV4蛋白の 後期型に存在する核の局在部位と類似する領域を持つ。ORF K8は、プリン結合モ チーフ（GLLVTGKS）を、KSHV TK(ORF21)に存在するモチーフと類似する該蛋白の C−末端に持つ（Moore et al.,1996.J.Vlrol.70,549-558）。 HVC ORFs 1,3,5,12,13,14,15,51及び71と類似性を持つKSHV遺伝子はKSHVLUR 配列内では特定されなかった。HVC ORF１は、インビトロのHVSに誘導されるリン パ球の形質転換（Akari et la,1996,Vlrology 218,382-388）に関与する形質 転換蛋白をコードし、HVS菌株間の配列保存性は低い（Jung and Desrosiers,199 1,J.Virol.65,6953-6960.Jung and Descrosiers,1995,Molec.Cellular Biol.15, 6505-6512).この遺伝子と類似の機能的KSHV遺伝子が存在する可能性があるが、 配列比較によっては特定できなかった。このように、EBV潜伏、形質転換に関与 する蛋白と類似のKSHV遺伝子（EBNA-1,EBNA-2,EBNA-LP,LMP-1,LMP-2、及びGP35O /220）は、これらの遺伝子中に存在する反復配列が類似性しているにもかかわら ず、発見されなかった。KSHVはまた、BZLF1 EBVトランスアクチベータ遺伝子と 類似した遺伝子も持っていない。 幾つかの配列は、発現された遺伝子の特徴をもっているけれども、所与のORF 分析の課題ではなかつた。bp90,173と90、643の間の配列は、多くのαヘルペス ・ウイルス（偽狂犬病EHV１）によってコードされる分泌される糖蛋白Ｘ（gX） の前駆体と類似しており、ウイルス構造の一部を形成していない。EHV1における 同族遺伝子のように、KSHV型は、偽狂犬病遺伝子の高酸性カルボキシ末端を欠い ている。 BCBL―1中で高コピー数で発現される二つのボリアデニレート転写物は、IBｂ 中ではポジション28,661-29,741(T1.1)で、IBh中では、ポジション118、130-117 、436(T0.7)に存在し、Ibhでは、118、130-117、436（T0.7）に存在する。TO.7 は、60残基のポリペプチド(ORF K12、カポシンとも呼ばれる)をコードし、T1.1 は、URNA様転写物ではないかと推測されている。 ★細胞サイクル調節及び細胞シグナリング蛋白 KSHVに特異的であるか又はガンマヘルペスウイルスとだけ共通する多くのORF は、腫瘍蛋白及び細胞シグナルリング蛋白と類似の遺伝子をコードしている。OR F16は、EBV BHRF1及びHVS ORF1６を同様に、Boxに媒介される細胞消滅を阻止で きる機能的Bc1-2様蛋白をコードしている。ORF72は、機能的サイクリンＤ遺伝子 をコードし、又HVSでは(Nicholos et al,1992,Nature 355，362−365）網膜芽細 胞腫瘍抑制蛋白をリン酸化する際にヒトサイクリンＤに代替できる事がわかった 。 KSHVは、機能的に活性なIL−6(ORF K2)及び他のヒトヘルペス・ウイルスには 見られない、二つのマクロファージ炎症性蛋白（MIPs）(ORFsK4及びK6)をコード している。vIL−6は、ヒトIL−6と類似の62%のアミノ酸を持ち、マウスの骨髄 細胞消滅を防ぐ際に、ヒトIL−6に代替することが可能である。両MIP様蛋白は、 βケモキニンに特徴的なC−Cダイマーのサインを保存し、またそのＮ−末端領域 においてヒトMIP−1αに対してほぼ配列同一性を保存している。vM1P−1(ORFK6) は、CCR−５依存性HIV−1複製を阻止可能である。ヌクレオチド数（ｂｐ）22、5 29−22、185(vM1P−III）にわたるオープン・リーデイング・フレームは、MIP１ β（BLASTX ポアソンp=00015）については低保存性である、C−Cダイマー・モ チーフを保持している。ORF K9(vlRF1)は、ヒト・インターフェロン調節因子(IR F)(Dovid,1995,Phormoc,Ther.65,149-161）のファミリーとの類似性を持つ449残 基の蛋白をコードしている。ORF K9は、ヒト・インターフェロン・コンセンサス 配列結合蛋白及びＩＲＦ−ＤＮＡ結合ドメインの部分的保存に対して13.4%のア ミノ酸同一性を持つ。bp 88,910-88,410(vIRF2),bp 90541-89,600(vIRF3),及びb p94,127-93,636(vIRF4)にある別の三つのオープン・リーデイング・フレームは 、IRF様蛋白との類似性は低い(p＞0.35)。保存されたインターフェロンのコンセ ンサス配列は、ゲノムのこの領域には見られなかった。 シグナル伝達ポリペプチドをコードしている他の遺伝子(他のヘルペス・ウイ ルス中にも見られるが)は、補体結合蛋白(v-CBP，ORF4)、神経系細胞の付着分子 （NCAM様蛋白）（v-odh，ORFK14）、及びIL8レセプター(ORF 74)を含んでいる。 ORFs4及び74に類似の遺伝子は、他のラデイノ（rhodino）ウイルス中に存在し、 ORF4は、牛痘B19L及びD12L蛋白と類似する。ORF K14（v-adh）は、ラット及びヒ トOX−２膜抗原、種々のNCAMs及びポリオウイルス受容体関連蛋白PRRIと類似す る。また、OX-2はヒト・へルペスウイルス６及び７のORF U85と類似するが、KSH VとβへルペスウイルスOX−2／NCAM ORFsの間には顕著な類似性はない。他のイ ムノグロブリン族付着蛋白のように、v-adhは、V様、Ｃ様、膜内外及び細胞質ド メイン、及びフィブロネクチンRGD結合部位を、残基268−270に持つている。vIL -8Rは、EBVに誘導されるEBI1蛋白（Birkenbach et al,1993,JViral 67，2209-22 20）を含む、Ｇ蛋白と共役する化学誘因性受容体に特徴的な７つの膜貫通ドメイ ン構造を持っている。 ＜考 察＞ BC−1細胞におけるKSHVゲノムの完全長配列によって、KSHV関連病因の分子機 構を研究する機会が与えられる。該KSHVゲノムは、ゲノムを円形化していると推 定される部位である高G+C末端反復領域に隣接した単一の特異的コード領域を含 むラデイノウイルスゲノムの標準的特徴をもっている。ヘルペス・ウイルスの複 製及び構造に関与する66の保存されたヘルペスウイルス遺伝子を持っていること に加え、KSHVは、細胞サイクル調節及びシグナル蛋白を模した多くの蛋白をコー ドしている点で特異的である。 BC−1由来ゲノムの我々が推定したサイズ(重複部分を含む210kb)は、蛋白質の 膜で包まれたビリオンDNA（Zhong et al,1996,Proc.Natl Acd.Sci USA93,6641-6 646）を使用して発見されたものと一致している。ゲノムが再配置されることは 、培養されたヘルペス・ウイルス（Baer etal.,1984,Nature 310,207-211;Cha e t al.,1996,J.Virol.70,78-83）では一般的な事である。しかしながら、BC−1KS HV中に存在しているゲノム重複は、組織培養を行なっている間には生じなかった であろう。TRのハイブリダイゼーション研究は、重複したLUR断片のBC−1 TR中 への挿が、独立誘導されたHBL−6細胞系由来のKSHV中にも存在していることを示 している（Gaidano et al，1996，Leukemia 10，1237-40)。 このゲノムの再配置に拘わらず、KSHVゲノムはコード領域内で良好に保存され ている。BC−1とKS病巣から単離された21 kb KS5断片の間には0.1%未満の塩基対 変異がある。もっと高いレベルの変異が、他の地域由来又は他の疾病条件由来の 菌株中に存在するかもしれない。LUR内においては、HVSに対するシンテニーがOR Fs2及び70では失われているが、HVSを保存している他のすべての領域では一致が 見られる。チミジンキナーゼ（TK）（Cesarman et al.,1995,Blood 86,2708-271 4）TS及びDHFR（HVSに存在する、Albrecht et al,1992,J.Viral.66,5047-5058参 照）等の幾つかの保存された遺伝子は、現行薬物にとって適切なターゲットであ る蛋白をコードしている。 KSHVによる、細胞サイクル調節及びシグナル蛋白を分子的に真似る事は、ウ イルスの傑出した特質である。KSHVゲノムは細胞の補体結合蛋白(ORF4)、サイト カイン(ORF s k2、K4及びK6)、bcl-2蛋白（ORF 16),サイトカイン伝達経路蛋白( K9)、IL−8R様蛋白(OFR74)及びＤ−型サイクリン(ORF72)と類似の遺伝子を保持 する。 MIP及びIRF様蛋白とある類似性を持つ蛋白をコードしているその他の領域も又、 KSHVゲノムに存在する。細胞遺伝子と類似するKSHV遺伝子とEBV感染によって誘 導される事が知られた細胞遺伝子の間には、顕著な類似性がある。細胞性サイク リンD、CD21／CR2、bcl-2,IL-8様蛋白（EBl1）、IL−6及び付着分子は、EBV感染 によってアップレギュレートされる（Birkenbach et al.,1993,J.Virol.67,2209 -2220;Polmero et al.,1993,Oncogene 8,1049-1054;Finke et al.,1992,Blood 8 0,459-469;Finke et al.,1994,Leukemia & Lymphoma 12，413-419;Jones et al. ,1995,J.Exper.Med.182,1213-1221）。これによって、KSHVは、EBVが感染後変更 するのと同じ信号及び調節経路を変更するが、それは、それ自身のゲノムからの 外来遺伝子を導入する事によってなされる事が示唆される。 ウイルス感染に対する細胞防御には、通常細胞サイクルの停止、アポトーシス （概論として、Shen and Shenk,1995,Curr.Opin.Ggenet.Devel.５,105-111を参 照）及び細胞を媒介とする免疫の構築が関与する。KSHVにコードされるv−bcl− 2、v-cyclin及びv-IL-6は、アポトーシス又は細胞サイクル停止のどちらかを防 止するに活性がある（Chong et al.,1996,Nature 382,410）。 β−ケモカイン KSHV遺伝子産物の少なくとも一つ、v-MIP-1は、トランスフェクトされた細胞のC CR5に媒介されるHIV感染を防止する。EBVの感染したＢ細胞は、通常の扁桃リン パ球よりも高レベルのMIP−1αを発現するけれども（Horris et al.,1993,151,5 975-5983）、β−ケモカインが、細胞のEBV感染を成功させるに必要である事は 知られていない。EBV感染Ｂ細胞の自己分泌が、IL−6（Tosato et al,1990,Ｊ.V irol.64,3033−3041）に加えて、小さくかつ特徴付けされていない蛋白因子に対 する依存性を持つ事は、EBVのライフサイクル中でβケモカインも重要な役割を 果たしているのではないかとの見解を導く。 KSHVが、正式に形質転換ウイルスであることは示されておらず、また、HVS及 びEBVの主要形質転換遺伝子に類似した遺伝子は、BC−1菌株KSHV中には存在して いない。にも拘わらず、特定された、KSHVをコードする原癌遺伝子及びサイトカ インによって引き起こされる細胞増殖制御の調節異常は、ウイルス感染細胞の腫 瘍性増殖に貢献し得る。予備研究では、サブゲノムKSHV断片がNIH3T3細胞を形質 転換する可能性がある事が示唆されている。EBVの複製のように、KSHV 複製には、TRユニット(Raab-Traub and Flynn,1986.cell 47,883-889)の組み替 えが関与しているとするなら、KS病巣に存在する単形性ＴＲのハイブリダイゼー ション・パターンが、腫瘍中のクローン性ウイルス集団を示すことになる。これ は、KSHVが「乗客ウイルス」であるというよりも、むしろKSが単一に形質転換さ れたKS感染細胞から生じる真の腫瘍性増殖物である事と一致する。現在の研究に おいて、既知の腫瘍性蛋白及び細胞増殖因子と類似のKSHV遺伝子を特定する事は 、KSHVが形質転換ウイルスであるかもしれないという証拠を提供する。実験詳細セクションＩＩ： KSHVによる、ヒトサイトカイン及びサイトカイン反応経路 遺伝子の分子的模倣 二つのヒトマクロファージ炎症性蛋白(MIP)ケモキニンであるIL−６及びイン ターフェロン調節因子(IRF又はICSBP)ポリペプチドと類似の蛋白をコードしてい る４つのウイルス遺伝子が、カボジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)のゲノム中 に存在している。これらの遺伝子の発現は、感染細胞系で、ホボール・エステル で誘導可能である。vIL−６は、B9細胞増殖分析においては、機能的に活性であ る。vIL-6は、KS病巣よりもむしろKS感染造血細胞で、最初は発現される。vMIP −1は、CCR5依存性HiV−1菌株の複製をインビトロで阻害し、この事はvMIP−1は 機能的であって、これら二つのウイルスの間の相互作用に貢献する事を示してい る。KSHVが細胞シグナル蛋白を模倣する事は、ホスト細胞の防御を阻止して、KS HV随伴腫瘍の形成に貢献する。 カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）は、エプスタイン・バー・ウイルス (EBV)及びヘルペスウイルス・サイミリ(HVS)に関連したガンマ・ヘルペス・ウイ ルスである。KSHVは、さまざまなタイプのHIV関連及びHIV無関連KS（Chang etal ,1994,Science 265,1865-1869;Boschoff et al.,1995,Lancet 345,1043-1044;Du pin et al,1995.Lancet 345,761-762;Schalling et al.,1995,Nature Med.１,70 7-708）を含む殆どすべてのKS病巣に存在する。ウイルス性DNAは、KS腫瘍に優先 的に局在し(Boshoff、et al.1995、Nature Med.1、1274−1278)、血清学的研究 では、KSHVがKSと特異的に関連している事が示されている。初原浸出リンパ腫(P EL)、レアＢ 細胞リンパ腫、キャストルマン疾病のある型等のKS罹患患者で頻繁に発生する関 連リンパ球増殖疾患は、またKSHV感染と関連する（Cesarman et al.,1995,NewEn g.J.Med.332,1186-1191;Soulieretol.,1995,Blood 86.1276-1280）。３つのKSHV をコードするサイトカイン様ポリペプチド及びインターフェロン調節因子遺伝子 と類似のポリペプチドが、現在のところ特定されている。逆説的に言うと、サイ トカイン調節不全によってカポシ肉腫が引き起こされる（Ensoli et al.,1994,N ature 371,674-680;Miles,1992 Cancer Treatment & Reseorch 63,129-140）と いうことが提議されている一方，過去10年にわたるこれらの研究のために使用さ れたィンビトロ紡錘細胞系は、一様にKSHVには感染していない（Ambroziok et a l.,Science 268,582-583;Lebbe et al.,1995,Loncet345）。 KSHVゲノム中にある特異的な遺伝子を特定するために、BC−1、つまりKSHV及 びEBVの両者を安定的に感染させた（Cesarma et al.,1995,Blood 86,2708-2714 ）非ホジキンリンパ球細胞系由来のスーパーコス（Supercos）−1及びラムダFIX IIゲノム・ライブラリーを使用してゲノムのシークエンシング（方法の項を参 照）を行なつた。KSHV DNA断片KS330Bam及びKS631Bam（Chang et al,1994,Scien ce265,1865-1869）をマッピング及び二方向シークエンスのハイブリダイゼーシ ョンの開始点として使用した。Z6コスミッド配列のオープン・リーデイング・フ レーム(ORF)分析（方法参照）では、二つの別々のコード領域（ORFsK4及びK6） を、βケモキニンと類似性を持つ配列及びヒト・インターロイキン-6（huIL-6） と類似の第三のコード領域(ORF K2)が特定され、第４のコード領域が、インター フェロン調節因子(IRF)ポリペプチド(図3A−3C)と類似の配列を持つZ8コスミド に挿入配列中に存在していることを特定した。KSHV遺伝子はどれも他の既知のウ イルス性遺伝子と類似していない。ちなみに、βケモカイン・モチーフのサイン と類似の保存システイン・モチーフを持つ蛋白が、軟属種伝染性ウイルス（ＭＣ Ｖ）ゲノム中で最近報告されている。vMIP−IもvMIP−IIもMCV蛋白と顕著な類似 性はない。 これら４つのウイルス遺伝子と細胞相補対は、感染に対する細胞応答に関わる ポリペプチドをコードしている。例えば、8−10kDaのβ化学誘因性サイトカイン （ケモカイン）のMIP／RANTES（マクロファージ炎症性蛋白／活性化されて調節 され、通常のT細胞が発現され、分泌される）ファミリーが、ウイルス感染によ って起こる炎症に重要な役割を果たす（Cook et al.,1995;Science 269,1583-15 85）β-ケモカインは、CCR5の天然のリガンドであり、非シンシチウム誘導(NSI) の一次リンパ球及びマクロファージ刺激HIV-1菌株のインビトロでの侵入を、こ のHIV共レセプターと結合する事によって阻止できる（Cocchi et al.,1995,Scie nce270,1811-1815）。初めに記載したが、IL-6は、Ｂ細胞分化に与えるその効果 （Hirano et al.,1985,Proc Natl Acd Sci,USA85,5490;Kishimoto et al.,1995, Blood 86,1243-1254）によって、多種多様の細胞に影響を及ぼし多面発現させ、 多数の骨髄腫、多中心粒キャトルマン病（KSHV関連疾病）、AIDS−KS及びEBV関 連移植後のリンパ球増殖疾患の病因となり得る（Klein et al.,1995,Blood 85,8 63-872;Hilbert et al.,1995.,J.Exp Med 182,243-248;Brandt et al.,1990,Cur r TopicMicrobiol Immunol 166,37-41;Leger et al.,1991,Blood 78,2923-2970; Burger et a;.,1994,Annal Hematol 69,25-31：Tosato et al,1993,J Clin Inve st 91,2806-2814）。IL6産生は、EBV又はCMV感染のどちらかによって誘導され、 ヌードマウス中でその腫瘍形成性を高めるEBV感染リンパ芽細胞を自己分泌させ る因子である(Tosato et al.,1990,J.Virol 64，3033-3041;Scala et al,1990.J .Exp med 172,61-68;Almeida et al.,1994,Blood 83,370-376）。KS病巣から派 生する細胞系は、KSHVに感染していなくても、IL−6を産生しかつ反応する(Mile s et al,1990.Proc Natl Acod Sci USA 87,4068-4072;Yong et al.,1994,J.Immu nol 152,943-955）。MIP及びIL−6が分泌されたサイトカインである一方、ポリ ペプチドのIRFファミリーは、γ又はα／βインターフェロンサイトカインに反 応して、インターフェロン誘導可能なプロモータ領域内で特異的なインターフェ ロン・コンセンサス配列と結合する事によって、インターフェロン誘導可能な遺 伝子を調節する。インターフェロンに対する一連の広範な細胞反応は、IRFポリ ペプチドのリプレサー又はトランスアクチベータの作用によって変調され、数種 のメンバー(IRF-1及びIRF-2)は、相反する抗腫瘍形成性及び腫瘍形成活性を持つ （Scharf et al.,1995,J.Bial Chem 270，13063-13069;Harada et al,1993,Scie nce 259,971-974;Weisz et al,1994,Internat Immunol 6,1125−1131;Weisz et al,1992,J.Bial Chem 267,25589-25596） 289bpのORF K6（ORF MIP1）遺伝子は、huM1P-1αと37.9%のアミノ酸同一性（7 1z同等性）を持ち、また別のβケモカイン（図３Ａ）と若干低い同等性を持つ10 .5 kDaのポリペプチド（vMIP-I;MIP1）をコードしている。ORF K4は又、推定10. 5kDa のポリペプチド（vMIP-II;vMIPIα-II）コードし、これはvMIP-Iに非常に 近似し、またvMIP−Iに対してアミノ酸疎水性である。該二つのKSHVをコードす るMIPβケモキニンは、KSHVゲノム上で、少なくとも40RFs(方法参照）を含む5.5 kbの介在配列によってお互いに分離されている。両ポリペプチドは、保存された 、特徴的なC−Cジシスチン・ダイマー（図3A、残基36−37）を含むβケモカイン ・モチーフ（図3A,残基17−55)を持ち、又残基56−84でヒトMIP−1αとほぼ配列 同一性を持つ。しかしながら、該二つのポリペプチドは、お互いに僅49.0％アミ ノ酸同一性を示し、ヌクレオチドレベルでは、著しく多様である。この事は、こ の重複がクローニングによって人工に作り出されたものではない事がわかる。該 ニつのウイルス性ボリペプチドは、huIMP-1α，huMIP-1αあるいはhuRANTESに対 するよりも、系統発生学的にお互いにもっと綿密に関連している。これによって それらペプチドがホストゲノムから非依存的に獲得したというよりむしろ遺伝子 の重複によって生じた事が示唆される（方法の配列整列参照）。ウイルスゲノム のこの二重遺伝子量の理由はわからない。 KSHV ORF K2（図３）は、24.8%アミノ酸同一性及び62.2%のヒトポリペプチド との同一性を持つ疎水性19アミノ酸分泌シグナルリングペプチドを持つ仮想204 残基、23.4kDa，IL-6様ポリペプチドをコードしている。vIL-6は又、IL-６様イ ンタ一ロイキン（ギャップボリペプチドのアミノ酸101−125)に特徴的な保存配 列を持ち、のみならずIL-6ポリペプチド（ギャップ配列残基、図３中、位置72、 78、101及び111）に存在する保存された４シスチン）を持つ。IL-6は糖化された サイトカインであり、vIL-6配列中には、N-リンク被糖化部位が、図3C中のギャ ップ位置96と107に存在する。ORF K9でコードされる４４９残基KSHV vIRFポリペ プチドは、そのヒト細胞複製物との全アミノ酸同一性（約13%）がvMlPs又はvIL- 6のいずれよりも低いが、しかしポリペプチドのIRFファミリーから派生する保存 領域を持つ（図3C,ギャップ残基88−121)。この領域は トリプトファンに富むI RF ICS DNA結合ドメインを含むけれども、DNA結合に関与すると考え られている４つのトリプトファンのうち二つだけが位置的に保存されている。 IRF同一性が明らかに低い87残基の親水性Ｎ末端がこの領域に先行している。IRF ファミリーのトランスアクチベータ／レプレサー領域に対応するＣ末端のアミノ 酸同一性の程度は低い。 ４つのKSHV細胞シグナル経路遺伝子は、ウイルスが感染した細胞系において、 ノーザレン・ブロテイングによる同様の発現パターンを示す（方法参照）。全RN AをBCP-1（KSHVのみが感染した細胞系）及びBC−1（EBV及びKSHVが共に感染して いる、Cesarman et al.,1995,Blood 86,2708-2714参照）から、20 ng/mlの12-0- テトラデカノイル・ホルボール-13-アセテート(TRA,Sigmo,St.LoulsMO)で48時間 、前処理されてあるいはされないで抽出された。該二つの細胞系の間の、これら の遺伝子の構造的発現は多様であったが、４つの遺伝子の転写物すべての発現は 、TPA誘導の後のBCP-1細胞、BC-1細胞中では増加した（図4A-4D)。このパターン は、溶解期のウイルスが複製している間に、最初に生じる発現と一致している。 BCP-1及びBC-1ウイルスの末端反復配列を調べると、TPA誘導無しで、BCP-1中で 低レベルのウイルスの溶解性複製が生じるが、BC-1中では生じない（方法参照） 事、及びBC-1においてDNA複製の抑制があるにも拘わらず、TRA処理によって両細 胞系が誘導されて溶解フェーズ遺伝子を発現する事が実証された。特にvIL-6（ 図4C）及びvIRF（図4D）については、低レベルの潜在発現も起こつているようだ 。というのは、これらの転写物がTPA誘導無しでも厳密な潜在性規制下にあるBC- 1中で検出可能であるからである。インビトロのKS紡錘細胞培養物が、これらの 遺伝子を含む欠損又は部分ウイルス配列を保持しているかどうかを定めるために 、DNAを４つのKS紡錘細胞系(KS-2、KS-10、KS-13、KS-22)から抽出し、vMIP-I、 VMIP−II、vIL-6及びvIRF配列についてPCR増幅をした（方法参照）。紡錘細胞DN Aサンプルはどれも、該４つの遺伝子のどれについても陽性ではなかった。 vIL-6が機能的に保存されているかどうかを定めるために、バイオアッセイ及 び抗体局在化研究を使用して、vIL-6をもっと詳しく調査した。組み替えvIL-6（ rvIL−6）は、huIL-6と交差反応しない抗ペプチド抗体によって特異的に認識さ れる(図5A−5B)（方法参照）。vIL-6は、BCP-1細胞で構造的に産生され、ノーザ レ ン・ハイブリダイゼーション実験と一致して、48時間TPA誘導後著しく増加して いる。KSHV及びEBVの両者で共感染したBC-1細胞系は、TPA誘導後vIL-6ポリペプ チドを発現する（図5A、レーン3−4）、また、コントロールのEBV感染したP3HR1 細胞は、ｖＩＬ−６発現に対して、陰性であった（図5A、レーン5−6）。TPA誘 導（21−25 kDa）後に現れた複数の高分子量のバンドは、ポリペプチドの前駆 体型を示しているのかもしれない。huIL-6とvIL-6の間の非相同性領域があるに も拘わらず、ＩI-６依存性マウス形成細胞腫細胞系Ｂ９を使用した機能的バイオ アッセイにおいては、ウイルス性インターロイキン６は生物活性を持つ（方法参 照）。正方向構築物(rvIL-6)からのCOS7上澄み液によって3Ｈチミジン取り込み で測定されるB9細胞増殖が支持され、これはvIL-6がB9細胞消滅を防ぐ際に細胞 性比−６と代替可能であること（図６）を示すものである。vIL-6によって支持 されるＢ９増殖は、投与量依存性であって、非濃縮上澄み液が図６に示される実 験から、huIL-6、1mlに付き、約20pgと同等な生物活性を持つ。 非誘導BCP-1細胞(図7A)43％が細胞内細胞原形質vIL-6免疫染色(方法参照)され た事は、培養された感染細胞において構想的ウイルスポリペプチド発現される事 を示唆する。しかるに一方、非特異的免疫反応染色が、未感染のコントロールP3 HR1細胞中には見られた（図７Ｂ）。vIL-6産生はKS組織中では殆ど検出されずま た、調査された８つのKS病巣のうち僅一つが、2%未満の細胞において明瞭で特異 的なvIL-6免疫染色を示した(図7C)。この低陽性率の特異性は、前もって免疫感 作された血清及び過剰のvIL-6ペプチドによる中和を使用して確認された。KS病 巣におけるレアIL-6産生細胞は、CD34、即ち内皮細胞マーカー(図8A)又はCD45即 ちパン(pan)造血細胞マーカー(図8B)のいずれかについて陽性であった。この事 は、KS病巣中の内皮細及び造血細胞の両者がvIL-5を産生する事を実証している 。これらのレアvIL-5陽性細胞がKSHV T1.1溶解フェーズRNAプローブを使用して 起こる事が示されている溶解フェーズ複製に突入する事が可能である。対照的に 、HIVネガテイブPELからペレット化された腹水リンパ腫細胞の半分（65%）を十 分上回る細胞が、vIL-6(図7E)に対して強陽性であり、プラズマ細胞マーカーEMA を発現している(Cesarman et al.,1995,Blood 86，2708-2714）。これは、大半 のPEL細胞がインビボで、KSHVの溶解型を複製するか、又は潜在的に感染し たPEし細胞がvIL-6を高レベルで発現できるかのいずれかを示している。特異的 染色は、前もって免疫感作されたか又は後に免疫感作されたウサギの抗vIL-6抗 体を使用して調査された正常皮膚、扁桃腺組織、多形骨髄腫、又は血管肉腫を含 めたいずれのコントロール組織でも生じなかった(図7E及び7F)。 PELを発症しなかったAIDS-KS罹患患者からのリンパ節を調べる事によって、非 KS組織にウイルス播種される事が発見された。多くのvIL-6染色造血細胞が顕微 鏡的に無KSであるこのリンパ節(図8C)に存在していた。vIL-6陽性リンパ節細胞 は、比較的Ｂ細胞に富む領域に存在し、あるものはCD2OB細胞表面抗原(図8D)を 発現するが（PEL細胞とは異なり）EMA表面抗原は発現しない（Cesarman etal,19 95,Blood 86,2708-2714）。T細胞表面抗原CD3又はマクロフェージ抗原CD68につ いて陽性のvIL-6コロニーは検出されなかったが、マクロファージによるvIL−6 免疫陽性細胞の食作用は、頻繁に観察された。 vMIP-1が、NSI HIV-1ウイルスの侵入を阻止できるかどうかを調査するために 、ヒトCD4+キャット腎臓細胞（CCC/CD4）にヒトCCR5及びvMIP-I又はその逆構築 物I-PIMvを発現するプラスミドを一時的にトランスフェクトした（方法中CCR5及 びvMIP-Iクローニング参照）。これらの細胞に、共通レセプターとしてCCR5を使 用する事が知られるM23又はSF162一次NSI HIV-1の単離物（Clapham,et al,1992 ,J.Virol 66,3531-3537）のいずれか、又はヒトCCR5無しで、CD4+CCC細胞を感染 できるHIV-2変異物ROD/Bを感染させた。ウイルスの侵入及び複製を、レトロウイ ルス抗原生産についての免疫染色によって分析した（図9）。vMIP-1共トランス フェクションは、NSIHIV-1の病巣生成を、逆構築物陰性コントロールの半分未満 まで減少させたが、ROD／B HIV-2複製には何の効果もなかった。 ホスト細胞遺伝子の分子的剰窃は、あるDNAウイルス、特にヘルペスウイルス 及び水庖瘡ウイルスのあらたに認識された特質である（Murphy,1994,Infect Age ntsDis 3,137-154;Albrecht et al.,1992,J.Virol 66,5047-5058;Gaa and Murph y,1994,J.Biol Chem 269,28539-28542:Cheeetol,1990,Curr Top Microbil lmmun ol 154,125-169;Massung et al,1994,Virol 201 215-240）。KSHVが細胞性遺伝 子をそのゲノム中に取り込む程度は、優れている。vMIP-IとvMIP−IIに加え，vI L-6とvIRF及びKSHVは、bcl−2(ORF16)、サイクリンD(ORF72)と類似のポリペプチ ド、CD21／ CR2(ORF4)と類似の相補体結合蛋白ポリペプチド、NCAM様付着蛋白(ORF K14)及び IL−8レセプター(ORF74)をコードしている。EBVはまた、（BHRF1/bcI−2）をコ ードするか又は（CR2；サイクリンD；IL−6；bcl-2;付着分子及びIL−様EBl1蛋 白）、これらの細胞性ポリペプチドを誘導する（Cleory et al,1986,Cell 47,19 -28;Tosato et al.,1990,J.Virol64，3033-3041;Palmero et al.,1993,Oncogene 8,1049;Larcher et al.,1995,Eur J.lmmunol 25,1713-1719;Birkenbock et al. ,1993,J.Virol 67,2209-2220）このように、両ウイルスは類似のホスト細胞のシ グナリング及び調節経路を変更し得る。EBVは細胞性遺伝子発現を通してこれら の変化を実行するようだが、一方KSHVは該ポリペプチドを自身のゲノムから外因 的に導入するようだ。 これらのウイルスにコードされる細胞性ポリペプチドを特定することは、細胞 の抗ウイルス反応に対して防御に果たすそのペプチドの潜在的役割についても掘 り下げて考える事になる。huIL-6は、骨髄細胞系における、γインターフェロン に誘導され、Ｂａｘに仲介される細胞消滅を阻害する（Lichtenstein et al.,19 95,Cellular Immunology 162,248-255）及びvIL−6は、感染したB細胞において 同様の役割を果たしうる。KSHVをコードするvIRF,vbcI-2,v-サイクリンもまた、 ホスト細胞に仲介され、ウイルス感染によって誘導される細胞消滅を阻害し得る し、v-サイクリンは、感染した細胞のG1細胞サイクル阻止を防御する。インター フェロンに誘導されるMHC抗原の表出及び細胞に仲介される免疫反応（Holzinger et al.,1993,Immunol Let 35,109−117）もvIRFによって阻害する事が可能であ る。βケモキニン・ポリペプチドvMIP−I及びvMIP−IIは作動剤的又は拮抗剤的 シグナル・伝達作用を持ち得る。それらの配列保存及び重複遺伝子量が、KSHV複 製及び生存において重要な作用を果たす事が暗示される。 細胞シグナリング経路の調節障害から細胞成長が制御不可能になることは、こ のウイルス戦略の顕著で有望な副産物である。KS病巣でvIL−6を発現する細胞が 不足すると、vIL6がKS細胞の腫瘍形成に著しく貢献する事は無いようだ。しかし ながら、hu-IL6のKSHV誘導は、その後の血管形内皮細胞成長因子に媒介される血 管形成（Holzinger et al,1993,Immunol Let 35,109−117）の誘導と共に可能で ある。vIL−6はまた、PELあるいはキャスルマン病の形質細胞変種等のKSHV関連 リンパ球増殖疾患の病因にも潜在的に関与し得る。腫瘍形成が細胞性サイクリ ン及びbcl−２の過剰発現をもたらす事は、十分に立証されている。これらのウ イルスをコードするポリペプチドもまた、KSHV関連腫瘍形成に関与する。 KSHVvMIPは、NSI HIV-1複製をインビトロで阻害する（図９）。AIDSの流行初 期における研究では、AIDS−KS患者についての生存は、他のAIDS患者についての 生存より長い事が示され、３年以内に死亡と診断され生き残ったAIDS患者の28% と比較すると、３年より長く生存しているUS AIDS患者の93%は、KSを保持してい た（Hordy,1991,J.AIDS 4,386-391;Lemp et al.,1990,J.Am Med Assac 263,402- 406;Rothernberg et al,1987,New Eng J Med 317,1297-1302,Jacobson et al,19 93,Am JEpldemiol 138,953-964;Lundgren et al.,1995,Am J Epldemiol 141,652 -658）。これは比較的高いＣＤ４＋計測数でKSが発生するためと別のAIDS規定条 件についての死亡率が高い事によるのかもしれない。最近の調査データでは、AI DS−KSの疫学はAIDSの流行が増大されるに連れて変化していると指摘されている （同上）。 ＜方法＞ ゲノムシークエンシング： ゲノム挿入物は、ランダムにせん断され、M13mp1 8にクローニングされ、完全に二方向からのシークエンシングによって平均12倍 の重複になるまでシークエンシングされた。KSHVポリペプチドの表現名称は、ヘ ルペスウイルス・サイミリを誘導した命名システムに基づいている（Albrecht e t al.,1992,JVirol 66,5047-5058）。 オープン・リーデイング・フレーム(ORF)分析： 集められた配列連続体は、 マックベクター(MacVector)(IBI-Kodak Rochesler NY)を使用して、25アミノ酸 残基よりも大きいオープン・リーデイング・フレームの可能性について分析され 、またBLASTX BEAUTY-BLASTX(Altschul et al,1990,J Molbiol 215,403-410;Wor ley et al.,1995 Genome Res5,173-184;http://dot/imgen.bcm.tmc.edu:9331/se q-seorch/nucleic_acid-search html)を使用して分析した。４つのKSHVポリペプ チド（イタリック体）に対して、類似蛋白を（名称（種、配列バンク承認番号、 最小ポアソン分布確率点））を並べた。すなわち（１）vMIP-I:LD78(MIP-1α)( ヒト、gi127077,p=9,8Xe-22),MIP-Iα(Rottus,gi 790633,P=3.3xe-20)、MIP-Iα (Mus,gi127079,p=1.7xe-19),MIP-1β(Mus,gi 1346534,p=7.8xe-18);(2)nMIP-II LD78(MIP-1a)(ヒト、gi 1207077,p=71xｅ-23),MIP-1α(Mus,gi 127079,p=8.9xe- 21),MIP-1α(Rottus,gi 790633,p=1.2xe-20),MIP-1β(Mus,gi 1346534,p=3.8xe- 20):(3)vIL-6:26kDa ポリペプチド(II-6)(ヒト、gi 23835,p=7.2xe-17),IL-6(Ma caca,gi514386,p=1.6xe-16):及び (4)vIRF:ICSBP(Gallus,gi 662355,p=1.1xe-1 1),1CSBP(Mus,sp p23611,p=1.0xe-10),リンパ系特異的インターフェロン調節因 子(Mus，gi 972949,p=2.0xe-10),ISGF3(Mus gi 1263310,p=8.1xe-10),IRF4(ヒト gi 1272477,p=1.0xe-9),ISGF3(ヒトsp QOO978,3.9xe-9),ICSBP(ヒトsp QO2556, p=2.3xe-8) 配列の整列比較： アミノ酸配列をCLUSTAL W(Thompson et al,1994,NuC Aci ds Res22,4673-4680)を使用して整列させ，PAUP3.1.1を使用して比較した。累乗 根および非累乗根のブートストラップ（プログラム）による比較によって、ヒト ポリペプチドよりも多様化の程度の少ないウイルスポリペプチドによる100のブ ートストラップ式複製物全てを持つ系統樹を作成した。 ノーザレン・ブロッテイング： ノーザレン・ブロッテイングを，標準条件を 使用して，メーカー(Teltest Inc,Friendswood ＴX)の指示に従ってRNAzolで抽 出された全細胞RNAについて、各レーンに全RNAを1Oμｇ充填して、下記プライマ ー：vMIP−1:5'AGC ATA TAA GGA ACT CGG CGT TAC-3'(配列認識番号4),５'-GGT AGA TAA ATC CCC CCC CTT TG-3'(配列認識番号5);vMIP-II:5'-TGC ATC AGC TTC TTC ACC CAG−3'(配列認識番号6);5'−TGC TGT CTC GGT TAC CAG AAA AG-3'(配 列認識番号7);vIL−6'5'-TCA CGT CGC TCT TTA CTT ATC GTG-3'(配列認識番号8) ：5'−CGC CCT TCA CTC ACA CTT CGT AAC-3'(配列認識番号9);vIRF:5'-CTT CCG ATC AAC CAT CCA GG-3'(配列認識番号10),5'-ACA ACA CCC AAT TCC CCC TC-3'( 配列認識番号11)のセットについてのPCR産物からの無作為に標識したプローブで 実施した（Chong et al.,1994,science 265,1865-1869)。BCP-1、BC-1及びｐ3HR 1は、培養条件下で保持し、TRAで前に記載したように誘導された(Gao et al.,19 96,New Eng J.Med 335,233-241)。これらのウイルス遺伝子についてのPCR増幅を 、vMIP-I,vMIP-II,vIL-6及びvIRFプライマー・セットを使用して、35増幅サイク ルで実施し、陽性コントロールとして全BC−1DNAの希釈物と、前に記載したPCR 条件(Moore andChang,1995,New Eng J Med 332,1181-1185)を使用して比較した 。これらの実験 に使用されたKS紡錘細胞系DNAは、Dictor et al.,1996,Am J Pothol 148.2009-2 016に記載されていた。DNAサンプルの増幅可能性は、ヒトHLA−DQαとピルビン 酸脱水素酵素プライマーを使用して確認された。 vIL−6クロ−ニング:vIL−6を695bpポリメラーゼ・チェイン・リアクション(P CR)産物から、下記プライマーセット:5'-TCA CGT CGC TCT TTA CTT ATC GTG-3' (配列認識番号12)及び5'-CGC CCT TCA GTG AGA CTT CGT AAC-3'(配列認識番号13 ),を使用してクロ−ニングし、O.1μ９のBC−IDNAをテンプレートとして使用し 、35サイクル増幅した。PCR産物は最初、pCR2.1(Invitrogen San Diego CA)中に クローニングされ、次にEcoRV挿入物をpMET7発現べクター(Tokebe et al.,1988 ,Mol Cell Biol 8,466-472)にクローニングし、DEAE−デキストランとクロロキ ニンを使用してCOS7細胞（CRL−1651,American Type Culture Collection,Rockv ille MD）中にトランスフェクトした。該配列もpMET7ベクターに、SRaプロモー ターに対して逆方向（6-Liv）に、ネガチブコントロールとしてクローニングさ れ、両構築物の方向付け及び配列の忠実性が、ABI 377シークエネーター（Appli ed Biosystems Inc,Foster City CA）上で色素プライマー化学を使用して、二方 向性シークエンシングによって確認された。 15mlの無血清COS7上澄み液をの1.5mlまでセントリプラス10フィルター付き(A mlcon，Beverly MA)限外濾過により濃縮して、上澄み液濃縮物100μl又はrhuIL- 6(R&D Systems,Minneopolis MN)をラエムリ(Laemmli)緩衝液中で各レーンに付き 充填した。細胞溶解物のイムノブロッテングについて、TPA20ng/ml有無で48時間 で誘導した指数関数成長細胞をペレット化し、ラエムリ緩衝液に溶解された全細 胞蛋白100μｇを各レーンに充填し、15%のＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル上で 電気泳動にかけ、イムノブロットし、標準条件(Gao et al.,1996、New Eng JMed 335、233―241)を使用して、ウサギ抗ペプチド抗体(1:100−1:1000希釈)又は抗h uIL−6(1μg/ml,R&D System,Minneopolis MN)と共に現像した。 細胞系B9：B9マウス形成細胞腫細胞系をアイスコーブ(lscove)変性ダルベッコ 培地(IMDM)(Gibco,Gaithersburg,MD)、10%胎児子牛血清、1%ペニシリン／ストレ プトマイシン、1%グルタミン、50μMβメルカプトエタノール及び10ng/mlのrhuI L-6(R&D Systems,Minneopolis MN)中に保持した。3Ｈチミヂンの取り込みを使 用して、標準プリトコール（R&D System,Minneopolis MN）に従って、huIL-6又 は組み替え上澄み液に反応して起こるB9の増殖を測定した。要するに、huiL−6 又はCentriplus 10の濃縮組み替え上澄み液の１：３の連続希釈物を96ウエルプ レートのウエル当たり２ｘ１０4細胞で、24時間37℃でインキュベートし、イン キュベーションの最期の４時間は、各ウエルにチミジンストック溶液(1ml IMDM 中に 1mCi/ml 3H−チミジンの50μl)10μlを加えた。細胞を収穫し、取り込ま れた3Ｈチミジンを液体シンチレーションカウンターを使用して測定した。各デ ータポイントは、表示された標準偏差をもった６つの測定点の平均である。 vIL−６イムノブロテイング： 組織のパラフィンを除去し、PBS中で003%H2O2 で30分クエンチした後、アビデインーバイオチン複合体（ＡＢＣ）法を使用して イムノブロッテングを実行した。10%の正常ヤギ血清、1%BSA、0.5%トウイーン(T ween)20でブロックした後、一次抗体を1:1250希釈を作用させた。 第二次ビオ チン化されたヤギ抗ウサギ抗体(PBS中1：200)を30分室温で作用させ、その後PBS 中での５分洗浄３回を行った。パーオキシダーゼを連結したABC（PBS中1：100） を30分作用させ、その後、PBS中で５分洗浄三回を行った。ダイアミノーベンジ デイン(DAB)クロモゲン検出溶液(PBS中0.25% DAB，0.01%H2O2)を５分間作用させ た。次にスライドを洗浄し、ヘマトキシリンでカウンター染色し、カバーグラス をかけた。アミノエチルカルバゾール(AEC)又はべクター・レッド染色を使用し て、ある種の表面抗原についてのファストブルーによるカウンター染色による二 重標識された細胞の区別をより良好に行なえるようにした。CD68については、vI L-6細胞質染色によって染色が不明瞭化されるかもしれないので、二重標識免疫 蛍光を使用した。マイクロ波による組織切断片を、PBS中2%ヒト血清、1%ウシ血 清アルブミン(BSA)によって30分でブロックし、一次抗体と共に一晩インキュベ ートし、vIL−６局在についてはフルオレセイン抱合ヤギ抗ウサギlgG（1：100Si gma）で、またCD68局在については、ロダミン抱合ホース抗マウスIgG(1：100 S igma)で、30分現像した。洗浄後、二次抗体インキュベーションを二回繰り返し、 15分の洗浄各々施し、染色を増幅させた。残留膜抗原については、スライドを最 初はvIL-６について現像し、次に細胞抗原についてのみならず逆局在（最初に細 胞抗原抗体、次に抗vIL-6)について行い、両抗原の至適に視覚 化を成し遂げ区別を行なった。各々の場合、最初の抗体はAEC(Sigma)を使用して 現像し、前インキュベーション溶液(1% BSA,1-%正常ホース血清、0.5χトウイー ン20、30分）ブロックした。また現像はメーカーの指示に従った。二次抗体は、 ABCアルカリホスファターゼ技法を使用してファストブルークロマゲンで現像し た。マイクロ波及びトリプシン処理したものは、結果として局在化は低く、vIL- 6の免疫局在の特異性は低かった。膜抗原の至適局在化にとってこれが必要な場 合は、vIL−6AEC 局在化の後、これらの技法が適用される。至適に区別を行うた めのAECに代替する染色として、ベクター・レッド(Vector-Red)(Vector,Burling ome，CA)染色を使用し、ABCアルカィホスファターゼ技法を使用して、メーカー のプロトコールに従って実行した。調査された細胞抗原抗体には、メーカーの指 示書に従って調節された組織上にあるCD68(1:800、クローンKim6由来）、上皮膜 抗原(EMA，1:500，Doko，Corpinteria，CA),CD3(1:200,Doko),CD20(1:200,Dok。 ),OPD4(1:100,Doko),CD34(1;15,Dako）,CD45(1;400,クローン94由来）、L26(1:1 00、lmmunotech,Westbrooｋ,ME)及びLeu22(1:100,Bectdon-Dicklnson,SonJose,C A)が挙げられる。特異的vIL−６のコロニーは、KS病巣においてCD34、CD45で、P ELにおいてはEMAで、リンパ節組織においてはCD20及びCD45で発見された。 免疫組織化学的vIL−６の局在化を、生理食塩水中１％のアガーに着床させた 後、48時間のTPAインキュベーションを行ってかもしくは行なっわないで指数関 数的生育中のBCP−１細胞について行った。陽性細胞のパーセントはスライド毎 に３つの無作為に選んだ高パワー顕微鏡視野の細胞数を計測して定めた。TPA処理 （細胞溶解をもたらす可能性があり、TPAによる溶解ウイルス複製の誘導によっ て死亡する可能性のある）後、vIL−６について陽性に染色されたBCP−１細胞の パーセントは低かった。細胞及び組織の免疫染色は、抗血清の0.1μg/mlvIL−6 合成ペプチドによる４℃一晩インキュベートを使用した中和によって、また組織 又は細胞調整物についてのプレ免疫ウサギ抗血清、平行してポスト免疫血清を使 用する事によって。特異的となる事が実証された。特異的染色は、ペプチド中和 あるいはプレ免疫血清使用後には、見られなかた。 CCR5及びvMIP-Iクローニング：CCR5をpRcMVベクター(InVitrogen)中にクロー ニングし、PCR増幅後、下記プライマ一対：5'-AGC ATA TAA GGA ACT CGG CGT TAC-3'(配列認識番号14)、5'-CCT ACA TAA ACT CCC CCC CTT TC-3'(配列認識番 号15),を使用してvMIP−１遺伝子の正方向及び逆方向物をpMET７中にクローニン グした。CCR5単独及び正方向構築物(vMIP−I)を持つCCR5、逆方向構築物(1−PIM v)及び空のpMETベクターをCCC／CD4細胞（ヒトCD4を安定的に発現するCCCキャッ ト細胞、McKnight et al.,1994,Virol201,8-18参照）中に，リポフェクタミン(G ibco）を使用してトランスフェクトした。48時間後、培地をトランスフェクトと された細胞より取り除き、SF162，M23、又はROD／Bウイルス培地ストック1000 T ClD50を添加した。ウイルスインキュベーションを４時間した後、細胞を４回洗 浄し、HIV-1 p24又はHIV-2 gp105に対する免疫染色の前に、上に述べたように 5%FSC(子牛胎児血清）を添加したDMEM中で72時間生育させた。各条件を平均３− ４回繰り返し（図9）、標準偏差を表す中間の誤差バーは、CCR5単独の病巣のパ ーセンテージを表す。実験の詳細、セクションＩＩＩ： 以下の特許は、ここに記載した発明をより完全に記述するための参照として、 本明細書に組み込まれる。 表１． ＫＳＨＶゲノムの、ＯＲＦおよび他のへルペスウイルスの遺伝子に対す る類似性 ＜表１の注釈＞ 「名称」（例えばK1またはORF4）はKSHVORFの表記を表している。「Pol」はKSH Vゲノム中のORFの極性（polarity）を意味する。「開始」は、開始コドン中の最 初のLURヌクレオチドの位置を表している。「停止」は、停止コドン中の最後のL URヌクレオチドの位置を表している。「サイズ」は、KSHV ORFによってコードさ れるアミノ酸残基の数を示している。 「HVS%Sim」は、ヘルペスウイルスサイミリの対応するORFに対する、表記のKS HV ORFのパーセント類似度を示している。「HVS%Id」は、ヘルペスウイルスサイ ミリの対応するORFに対する、表記のKSHV ORFのパーセント同一性を示している 。「EBV名」は、EBV ORFの表記を示している。「EBV%Sim」は、表示されている 名称のEBウイルスのORFに対する、表記のKSHV ORFのパーセント類似度を示して いる。「EBV%Id」は、表示されている名称のEBウイルスのORFに対する、表記のK SHV ORFのパーセント同一性を示している。KSHV名の欄のアスタリスクは、HVS O RF4a（*）およびHVS ORF4b（**）に対するKSHV ORF4の比較を示している。注釈 のない全ゲノム配列は、受付番号U75698(LUR)、U75699(末端反復)、およびU7570 0(不完全末端反復)として、 れている。具体的には、LURの配列は、配列番号17〜20に5'−3'の方向で示され ている。より具体的には、LURのヌクレオチド1〜35,100は、それぞれ配列番号17 中の 1〜35,100 の番号が付されたヌクレオチドに示されており、LURのヌクレオ チド35,101〜70,200は、それぞれ配列番号18中の1〜35,100の番号が付されたヌ クレオチドに示されており、LURのヌクレオチド70,201〜105,300は、それぞれ配 列番号19中の1〜35,100の番号が付されたヌクレオチドに示されており、LURのヌ クレオチド105,301〜137,507は、配列番号20中の1〜32,207の番号が付されたヌ クレオチドに各々示されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ 39/395 39/395 Ｄ Ｎ 45/00 45/00 48/00 48/00 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 9/12 9/12 9/16 Ｚ 9/16 9/24 9/24 9/88 9/88 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/02 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 21/08 1/70 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 1/70 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/566 33/569 Ｌ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ 33/569 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，Ｍ Ｘ (72)発明者 ボヘンズキー、ロイ・エー アメリカ合衆国、カリフォルニア州 94040、マウンテン・ビュー、イースト・ エル・カミーノ・リアル 870、アパート メント 115 (72)発明者 ラッソ、ジェイムズ・ジェイ アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10032、 ニューヨーク、ヘイブン・アベニュー 60，アパートメント 25イー (72)発明者 エーデルマン、イジドア・エス アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10027、 ニューヨーク、リバーサイド・ドライブ 464、アパートメント 61 (72)発明者 ムーア、パトリック・エス アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10027、 ニューヨーク、モーニングサイド・ドライ ブ 90、アパートメント ３ジェイ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）ポリペプチドをコードする 単離された核酸。 ２．請求項１の単離された核酸であって、前記ポリペプチドが、 a.チミジル酸シンターゼ b.ウイルスタンパク質キナーゼ c.アルカリエキソヌクレアーゼ（ＡＥ） d.ヘリカーゼ−プライマーゼ、サブユニット３、および e.ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ） からなる群から選択される核酸。 ３．請求項１の単離されたゲノムＤＮＡ分子。 ４．請求項１の単離されたｃＤＮＡ分子。 ５．請求項１の単離されたＲＮＡ分子。 ６．検出可能な標識でラベルされた請求項１の単離された核酸分子。 ７．前記標識が、放射線、色素、発光、または蛍光ラベルである請求項６の単 離された核酸分子。 ８．請求項１の単離された核酸分子を含有する複製可能なベクター。 ９．請求項８のベクターを含有する宿主細胞。 １０．真核細胞である請求項９の細胞。 １１．細菌細胞である請求項９の細胞。 １２．請求項１の単離された核酸分子を含有するプラスミド、コスミド、λフ ァージまたはＹＡＣ。 １３．請求項１の単離された核酸分子と特異的にハイブリダイズし得る、少な くとも14のヌクレオチドからなる核酸分子。 １４．配列表の配列番号１に示されている配列が示されている単離されたチミ ジン酸シンターゼポリペプチド。 １５．前記ポリペプチドが第二のポリペプチドと連結されて融合タンパク質を 形成している請求項１４の単離されたポリペプチド。 １６．前記第二のポリペプチドがβ−ガラクトシダーゼである請求項１５の融 合タンパク質。 １７．請求項１４のポリペプチドと特異的に結合する抗体。 １８．前記抗体がポリクローナル抗体である請求項１７の抗体。 １９．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１７の抗体。 ２０．請求項１４のポリペプチドを発現する宿主細胞。 ２１．有効な免疫量の請求項１４のポリペプチドおよび適切な薬学的担体を具 備するワクチン。 ２２．請求項１の単離された核酸分子とハイブリダイズし得るアンチセンス分 子。 ２３．前記分子が核酸誘導体である請求項２２のアンチセンス分子。 ２４．二本鎖の請求項１の単離された核酸分子とハイブリダイズし得るトリプ レックスオリゴヌクレオチド。 ２５．胎児の段階で哺乳動物に導入された請求項１の単離された核酸分子を具 備するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。 ２６．カポジ肉腫を診断する方法であって、 (a)患者の腫瘍病変部または適切な患者の体液から核酸分子を得ることと、 (b)ハイブリダイズ条件下で、該核酸分子に請求項６の標識された核酸分子 を接触させることと、 (c)ハイブリダイズした核酸分子の存在を決定することと を具備し、ハイブリダイズした核酸の存在が、患者がカポジ肉腫であることの指 標となることにより、カポジ肉腫を診断する方法。 ２７．ステップ（ｂ）の前に、腫瘍病変部から得た核酸分子を増幅する請求項 ２６の方法。 ２８．カポジ肉腫に随伴するＤＮＡウイルスを診断する方法であって、 (a)患者から適切な体液サンプルを得ることと、 (b)請求項１７のカポジ肉腫抗体が既に結合された支持体に、患者の適切な 体液を接触させて、カポジ肉腫抗体を特異的なカポジ肉腫抗原に結合せ しめることと、 (c)前記支持体から未結合の体液を除去することと、 (d)カポジ肉腫抗原が結合したカポジ肉腫抗体のレベルを決定することにより 、カポジ肉腫を診断することと を具備する方法。 ２９．カポジ肉腫に随伴するＤＮＡウイルスを診断する方法であって、 (a)患者から適切な体液サンプルを得ることと、 (b)請求項１の単離された核酸分子によってコードされるカポジ肉腫抗原が 既に結合された支持体に、患者の適切な体液を接触させて、カポジ肉腫抗 原を特異的なカポジ肉腫抗体に結合せしめることと、 (c)前記支持体から未結合の体液を除去することと、 (d)カポジ肉腫抗体が結合したカポジ肉腫抗原のレベルを決定することによ り、カポジ肉腫を診断することと を具備する方法。 ３０．カポジ肉腫患者を治療する方法であって、アンチセンス分子が患者の腫 瘍細胞に選択的に入るような条件下で、請求項２２のアンチセンス分子を患者に 有効量投与し、患者を治療することを具備する方法。 ３１．カポジ肉腫患者を治療する方法であって、ヒトヘルペスウイルス随伴カ ポジ肉腫の患者に、薬学的に許容される担体中の薬学的に有効な量の抗ウイルス 剤であり、請求項１４のポリペプチドに特異的に結合する抗ウイルス剤を投与す ることを具備する方法。 ３２．カポジ肉腫の可能性がある患者に、薬学的に許容される担体中の請求項 １７の抗体を投与することを具備するカポジ肉腫の予防または治療法。 ３３．カポジ肉腫に対して患者を予防接種する方法であって、有効量の請求項 １７のポリペプチドおよび適切な許容される担体を患者に投与することにより、 患者を予防接種することを具備する方法。 ３４．カポジ肉腫に随伴するヘルペスウイルスによって引き起こされる疾病に 対して患者を免疫する方法であって、請求項２１のワクチンを有効免疫量患者に 投与することを具備する方法。 ３５．患者中でのＫＳＨＶの複製を阻害する化合物を同定する方法であって、 (a)細菌の増殖が、発現されたＫＳＨＶ酵素の生成物に依存する栄養要求株の 細菌にＫＳＨＶ酵素を発現させることと、 (b)該栄養要求株に化合物を与えることと、 (c)細菌の増殖を測定することと、 (d)化合物の非存在下での前記栄養要求株の細菌増殖とステップ(c)における細 菌増殖を比較して、患者中でのＫＳＨＶの複製を阻害する化合物を同定すること と を具備する方法。 ３６．請求項３５の方法であって、前記ＫＳＨＶ酵素が、請求項１で明記した ようなリストにあるものを具備する方法。 ３７．前記ＫＳＨＶ酵素がチミジン酸シンターゼを具備する請求項３５の方法 。
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