JP2000503215A

JP2000503215A - ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶポリメラーゼから由来するＲＮａｓｅＨ酵素、その製造方法及びこれをビールス増殖抑制剤の探索に使用する用途

Info

Publication number: JP2000503215A
Application number: JP10510606A
Authority: JP
Inventors: ヨーン，スン―ジュン; キム，ジョン―ウォー; フー，ヨン; ロー，ユン―モ; ジュン，グ―フン
Original assignee: ドンワファーマシューティカルインダストリアルカンパニーリミテッド
Priority date: 1996-08-16
Filing date: 1997-08-09
Publication date: 2000-03-21
Also published as: CN1231695A; CA2262515A1; AU3952797A; US6071734A; AU721695B2; US5968781A; WO1998007869A1; EP0934417A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒスチジン標識を含むＢ型肝炎ビールス（Hepatitis B Virus、以下、”HBV”と略す）のポリメラーゼ、これから由来したＲＮａｓｅＨ酵素及びその製造方法に関するものである。より詳しくは、本発明は、再結合したＨＢＶポリメラーゼ、酵素活性を有するそのＲＮａｓｅＨ部位、大腸菌中で酵素を生産する発現ベクター、および、ヒスチジンの標識によって容易の精製されるＨＢＶポリメラーゼおよびＲＮａｓｅＨ酵素に関する。本発明はＨＢＶポリメラーゼおよびＲＮａｓｅＨ酵素を利用してビールス増殖抑制剤を探索する方法に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶポリメラーゼから由来するＲＮａｓｅＨ酵素、その製造方法及びこれをビールス増殖抑制剤の探索に使用する用途発明の分野本発明は、ヒスチジン標識を含むＢ型肝炎ビールス（Hepatitis B Virus、以下、”HBV”と略す）のポリメラーゼ、これから由来したＲＮａｓｅＨ酵素及びその製造方法に関するものである。本願発明は、より詳しくは、再結合したＨＢＶポリメラーゼ、酵素活性を有するそのＲＮａｓｅＨ部位、大腸菌中で酵素を生産する発現ベクター、および、ヒスチジンの標識によって容易の精製されるＨＢＶポリメラーゼおよびＲＮａｓｅＨ酵素に関する。また、本発明はＨＢＶポリメラーゼおよびＲＮａｓｅＨ酵素を利用してビールス増殖抑制剤を探索する方法に関するものである。ＨＢＶは全世界的に３億余りの人口が感染されている肝炎の主な病原体である。ＨＢＶは、急性または慢性肝炎を起こさせるばかりでなく肝硬変または肝癌へ移行させる（Tiollais and Buenda，Scientific American，264 ：48-54，1991; Blumberg，B.S.,reserch，F.V.Chisari，ed．，New York，：Mason publishing ，1984）。ＨＢＶポリメラーゼの分子的特徴と肝疾患に対するそれの密接な関係から、ＨＢＶポリメラーゼに関するさまざまな研究がなされている。ＨＢＶは、ヘパドナビールス科（Hepadnavirus family）に属するＤＮＡビ− ルスとして、ヌクレオカプシド（nucleocapsid）と中心（core）とからなる球型構造を有する。ＨＢＶのゲノムは、円形ではなく、わずか３．２ｋｂサイズの部分的に二つのらせん鎖である。詳しくは、ＨＢＶのゲノムは、ポリメラーゼ（Ｐ）遺伝子、表而蛋白質（ＨＢｓＡｇ；ｐｒｅ−Ｓ１，ｐｒｅ−Ｓ２）遺伝子、中心蛋白質（ＨＢｃＡｇ；ｐｒｅ−Ｃ，Ｃ）遺伝子およびＸ蛋白質（ＨＢｘ）遺伝子の４重の遺伝子から構成される。これらの遺伝子のうち、Ｘ蛋白質遺伝子は調節蛋白質を発現し、これ以外の遺伝子は構造蛋白質を発現する。ポリメラーゼ遺伝子は全体ビールスゲノムの８０％を占め、８４５個のアミノ酸で構成された９４ＫＤサイズの蛋白質を発現する。ＨＢＶは、以下に示す過程を経て、肝細胞に感染する。肝細胞特異収容体（sp ecific receptor）がビリオン（virion）外部の表面蛋白質を認識し、肝細胞内にビリオンを引っ張るようにして、それらと結合する。このとき、ＨＢＶポリメラーゼが部分的な２重らせんＤＮＡの１重らせん部分を合成し、完全なＨＢＶゲノムが得られる。そして、３．２ｋｂのＨＢＶゲノムは、細胞ＲＮＡポリメラーゼ（RNA polymerase）に転写され、約３．５ｋｂの前ゲノム（pre−genomic）のｍＲＮＡと、中心蛋白質（Ｃ）ｍＲＮＡ、表面蛋白質（Ｓ）ｍＲＮＡおよびＸ蛋白質ｍＲＮＡを生産する。ビールス蛋白質がこれらのｍＲＮＡから作られる。特に、ＨＢＶポリメラーゼはその逆転写活性により、ビールスゲノムを合成する鋳型を作り、中心蛋白質及び前ゲノムｍＲＮＡとレプリカゾム（replicasome）という構造物を形成する。これをカプシド化（encapsidation）という。グルタミン酸が反復される部位を含むポリメラーゼの３’−末端は、核酸に対して親和性を有するので、ＨＢＶポリメラーゼは容易にカプシド化する。レプリカゾム中の上記ＲＮＡ中間体が、ＤＮＡ合成のマイナスらせん型を提供し、さらに、マイナスらせん型全長が、前ゲノムｍＲＮＡ全体を最終的に作るために、ポリメラーゼのＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ(DDDP)活性により、ＤＮＡ合成のプラスらせん型を提供する。このような過程が反復されることで、細胞内に２００−３００個以上のゲノムＤＮＡプール（pool）が維持され、上述のビールス蛋白質が発現される（Tiollais and Buenda，Scientific American，264：48-54，1991；Ganem, D.and Varmus，H.E.，Anml．Rev．Biochem.，56:651-693，1987）。興味あることに、ＨＢＶがＤＮＡビールスであるにも拘わらず、ＲＮＡ中間体の逆転写を用いて複製する。レトロビールスが、そのゲノムを複製するために、逆転写を利用することが知られている。特に、レトロビールスのポリメラーゼが、ＤＮＡ依存ポリメラーゼ活性、逆トランスクリプターゼ活性およびＲＮａｓｅＨ酵素活性を示す多機能酵素であることが知られている。ＨＢＶポリメラーゼがビールスゲノムが複製されるのに必要な一連の機能を含むことは注目すべきことである。即ち、（ｉ）蛋白質プライマー（protein primer）、（ii）ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＴ）、（iii）ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＤＤＰ）、iv）ＲＮａｓｅＨ活性が、１つのポリペプチドに存在する。このようなＨＢＶポリメラーゼ逆転写酵素は、カプラン（Kaplan）によって最初に報告され、ＨＢＶの複製機構を解明するために利用されている。上記の通り、逆転写酵素（reverse transcriptase）、通常、ＲＮａｓｅＨ酵素活性部位を有し、このＲＮａｓｅＨ酵素部位はＲＮＡ／ＤＮＡ複合体を認識し、ＲＮＡ鎖のみを選択的に加水分解する。逆転写酵素は、ＲＮａｓｅＨ酵素活性によりＲＮＡ中間体が加水分解された後のみに、持続的にＤＮＡを複製できるので、ＲＮａｓｅＨ酵素活性は逆転写に必須的な機能である。このようなＲＮａｓｅＨ酵素は、レトロビールスの逆転写酵素の部位として最近知られているが、実際にＲＮａｓｅＨ酵素ハンセンとスタインにより牛の胸腺（calfthym us）で最初に発見され、それ以降に多様な原核生物及び真核生物から継続的に発見され報告された（Stein，Hans and Hausen，P.,Science，166：393−395，196 9）。一般的にいって、ＨＢＶポリメラーゼに存在するＲＮａｓｅＨ酵素活性部位はＣ−末端にある。ポリメラーゼのアミノ酸配列およびヌクレオチト配列は、モロニリュケミアビールスのものと非常に類似していることが報告されていた。さらに、ＨＢＶポリメラーゼのＲＮａｓｅＨ活性部位は、推定上、前ゲノムＲＮＡから由来されうるプラス鎖プライマーを合成することが知られていた。特に、突然変異を分析する実験によって、ＲＮａｓｅＨ酵素中の保存序列（conserve d sequence）がビールスの増殖に必須的な序列であることが確認された。さらに、あひるＨＢＶポリメラーゼのＲＮａｓｅＨ酵素活性部位の突然変異によって、ＲＮａｓｅＨ酵素部位がプラス鎖ＤＮＡばかりでなく、マイナス鎖ＤＮＡの合成や、ＲＮＡのパッケージングにも関与することが確認された。しかし、あひるＨＢＶポリメラーゼは、人間ＨＢＶの前ゲノムＲＮＡに存在するポリメラーゼ付着部位（binding regionε）を認識することができないことが最近明かになっている。従って、人間ＨＢＶ及びそのポリメラーゼの作用機構を理解するために、あひるＨＢＶポリメラーゼを用いた間接的な研究に加えて、人間ＨＢＶポリメラーゼ及びその部位であるＲＮａｓｅＨ部位が、直接的に研究されるべきである。今まで、ワクチンの開発および肝ガンへの移行過程での転写調節のために必要な表面蛋白質およびＸ蛋白質が、活発に研究された。しかしながら、ＨＢＶポリメラーゼは、ビールス増殖抑制剤の開発に用いることができるのに、ほとんど利用されていなかった。これはＨＢＶポリメラーゼがビールス粒子からの分離が難しく、特に活性を有する重合酵素を十分な量得るのが難しいためである（Radziwill, G.etal.,Virology，163：123−132，1988）。現在、新しい肝炎治療剤を開発するためにＨＢＶが感染した細胞株が、ビールス増殖抑制剤の探索に利用されてきた。しかしながら、細胞株を用いる方法は、ＨＢＶポリメラーゼまたはそのＲＮａｓｅＨ酵素を利用して探索する方法よりその開発に長期間が必要であるし費用も大いにかかるので、現在まで効果的な治療剤が開発されていない。最近、ＨＢＶを解明するために、上述のように、ＨＢＶポリメラーゼおよびそのＲＮａｓｅＨ部位が研究されていた。特に、上記酵素の大量生産のため研究は、再結合ＤＮＡ技術を用いて行われていた。本発明者らは、Ｅ．ｃｏlｉ変換体から発現された再結合ＨＢＶポリメラーゼを製造し、その酵素活性を測定し、これに関する特許出願をした（大韓民国特許出願第９４−３９１８号）。再結合ＨＢＶポリメラーゼはマルトース結合蛋白質（maltose binding protein，MBP ）に結合した形態で大腸菌中で生産され、マルトース結合蛋白質親和カラムクロマトグラフィーを通して容易に精製される。しかし、ポリメラーゼは、そのＣ− 末端が分解され、純度が低いため、活性のあるＨＢＶポリメラーゼを大量に得るには困難があった。外来蛋白質が、遺伝子再結合方法でヒスチジン標識を再結合遺伝子に挿入することによって、大量に得られうる。ヒスチジン標識（Histidine tag）を暗号化するヌクレオチド序列が、遺伝子の５’−または３’−末端部位に挿入され、そして、ヒスチジン標識は安定した酵素を作るために、再結合蛋白質の分解を防ぐ。さらに、金属キレート親和カラム（metal chelating affinity cohlmn）のようなヒスチジン標識親和カラムを利用して、活性の高い再結合蛋白質が容易に精製できる。効果的な肝炎治療剤を開発するために、本発明の方法によって、ＨＢＶポリメラーゼとそのＲＮａｓｅＨ酵素蛋白質は生産された。本発明者らは、結合蛋白質のＣ−末端にヒスチジン標識を暗号化するヌクレオチドとともにＨＢＶポリメラーゼ遺伝子を含む発現ベクターと、ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子の３’−末端に由来するＲＮａｓｅＨ部位遺伝子とを含む発現ベクターとを製造した。さらに、上記発現ベクターを利用して、ＨＢＶポリメラーゼ及びそのＲＮａｓｅＨ部位が融合蛋白質形態として大腸菌で大量生産され、これをアミロースカラム及びヒスチジン標識親和カラムを用いて容易に精製した。このようにして、高活性で安定なＨＢＶポリメラーゼ及びそのＲＮａｓｅＨ酵素は、分解されることなく製造された。さらに、本発明者らは、本発明のＨＢＶポリメラーゼ及びそのＲＮａｓｅＨ部位を用いて、ビールス増殖抑制剤の新しい探索方法を開発した。発明の概要本発明の目的は、ヒスチジン標識を含むＨＢＶポリメラーゼ、これから由来したＲＮａｓｅＨ及びそれらの製造方法を提供することである。特に、本発明は、ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子を含む発現ベクターと大腸菌中でのＨＢＶポリメラーゼの製造方法とを提供する。さらに、本発明は、人間ＨＢＶポリメラーゼから由来したＲＮａｓｅＨ遺伝子を含む発現ベクター及び大腸菌中でのＲＮａｓｅＨ酵素の製造方法を提供することである。そして、本発明の目的は、ビールス増殖抑制剤を探索するためのＨＢＶポリメラーゼおよびＲＮａｓｅＨ酵素の用途を提供することである。特に、本発明は、ＨＢＶポリメラーゼおよびＲＮａｓｅＨ酵素の阻害剤を探索方法を提供する。図面の簡単な説明図１は、ヒスチジン標識を含むＨＢＶポリメラーゼを生産する発現ベクターｐＭＰＨの製造過程を示す。図２は、大腸菌ＮＭ５２２／ｐＭＰＨ形質変換体から、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、生産、精製されたＨＢＶポリメラーゼを示す。レ−ン１：アミロ−スカラムで１次精製されたＨＢＶポリメラーゼレ−ン２：ヒスチジン標識親和カラムで２次精製されたＨＢＶポリメラーゼ図３は、ＨＢＶポリメラーゼから由来したＲＮａｓｅＨ酵素を生産する発現ベクターｐＭＰＲＬの製造過程を示す。図４は、人間ＨＢＶポリメラーゼから由来しヒスチジンが標識された活性なＲＮａｓｅＨ酵素を生産する発現ベクターｐＭＲＨの製造過程を示す。図５は、大腸菌ＮＭ５２２／ｐＭＲＨ形質変換体から、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、生産、精製されたＲＮａｓｅＨ酵素を示す。レ−ン１：標準標識（それぞれの分子量９７、６８、４３及び２９ＫＤ）レ−ン２：大腸菌形質転換体の粗溶出液レ−ン３：アミロ−スカラムで１次精製されたＲＮａｓｅＨ酵素レ−ン４：ヒスチジン標識親和カラムで２次精製されたＲＮａｓｅＨ酵素図６は、大腸菌ＮＭ５２２／ｐＭＲＨ形質変換体から、ウェスタンブロット分析（western blotting analysis）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、生産、精製されたＲＮａｓｅＨ酵素を示す。Ａ．抗−マルト−ス結合蛋白質を利用した結果Ｂ．ヒスチジン標識（^MRGSHIS）に対する抗体を利用した結果各レーンは上記図５に説明した通りである。図７は、本発明のＲＮａｓｅＨ酵素の活性の分析に使用したＲＮＡ／ＤＮＡ複合体を示す。図８は、以下のサンプルのＲＮａｓｅＨ活性を比較した結果を示す。（ｉ）マルト−ス結合蛋白質、（ｉｉ）培養された大腸菌形質転換体の粗溶出液、（ｉｉｉ）発現ベクターｐＭＰＲＬおよびアミロ−スカラムで、発現、精製されたＲＮａｓｅＨ、（ｉｖ）発現ベクターｐＭＲＨおよびアミロ−スカラムで、発現、精製されたＲＮａｓｅＨ、（ｖ）モロニ白血病ビールス(Molon eymurine Leukemia Virus)逆転写酵素図９は、ＲＮａｓｅＨ酵素の活性がＲＮａｓｅＨ酵素の量に従い増加することを示す。図１０は、ＲＮａｓｅＨ酵素の活性がＲＮａｓｅＨ酵素の反応時間に従い増加することを示す。図１１は、ＲＮａｓｅＨ酵素の活性が反応温度に従い変化することを示す。図１２は、ＲＮａｓｅＨ酵素の活性が反応溶液のｐＨに従い変化することを示す。図１３は、ＲＮａｓｅＨ酵素の活性が塩化カリウムの濃度に従い変化することを示す。図１４は、ＲＮａｓｅＨ酵素の活性がマグネシウムイオンの濃度に従い変化することを示す。図１５は、ＲＮａｓｅＨ酵素の活性がマンガンイオンの濃度に従い変化することを示す。好適な実施形態の詳細な説明本発明は、ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子の末端にヒスチジン標識（histidine ta g）のヌクレオチド序列を挿入して製造されたヒスチジン標識を含むＨＢＶポリメラーゼを提供する。ヒスチジンが標識されたＨＢＶポリメラーゼは、安定で容易に精製でき、その逆転写活酵素の活性等を適切に測定できる。特定部位挿入ミュタゼネシス（site −specific insertion mutagenesis）方法などを利用して、ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子の５’−末端または３’−末端にヒスチジン標識のヌクレオチド序列を挿入できる。特に、本発明はマルト−ス結合蛋白質（maltose binding protein，MBP）が融合されたＨＢＶポリメラーゼを生産する、既に確立された発現ベクターを利用した（大韓民国特許出願第９４−３９１８号）。６個のヒスチジン残基のヌクレオチド序列を、ＨＢＶポリメラーゼの３’−末端に挿入する。特に、終結コドン（ stop codon）のすぐ前にヒスチジンコドンが連続的に挿入されるので、ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子の転写解読枠（open reading frame，ORF）がちょうど配置される。その結果、発現ベクターｐＭＰＨが製造され、この発現ベクターは、マルトース結合蛋白質及びヒスチジン標識と融合されたＨＢＶポリメラーゼを生産できる（図１参照）。再結合ポリメラーゼを発現させるために、形質転換体を製造するための発現ベクターｐＭＰＨで微生物が形質転換される。上記微生物は再結合蛋白質の発現に適合した全ての大腸菌菌株を含む。特に、発現ベクターｐＭＰＨで大腸菌ＮＭ５２２菌株は形質転換させられ、その形質転換体は、１９９６年７月１９日に韓国微生物培養協会に寄託された（受託番号：ＫＣＣＭ−１００８４）。本発明は、大腸菌で再結合ＨＢＶポリメラーゼを大量製造する方法を提供する。発現ベクターを含む大腸菌形質転換体を再結合蛋白質の発現のために誘導し、粗溶出液を得るために破壊し、それから、ＨＢＶポリメラーゼをヒスチジン標識親和カラムクロマトグラフィーとその他カラムクロマトグラフィーを利用して精製する。正確には、発現ベクターｐＭＰＨ含む大腸菌形質転換体は、Ｎ−末端にマルト −ス結合蛋白質（MBP）が融合された再結合ＨＢＶポリメラーゼを生産するので、ＨＢＶポリメラーゼは、アミロースレジン（amylose resin）を用いて融合蛋白質形態に精製される。そして、ヒスチジンが標識されたポリメラーゼだけが、プロテア−ゼ因子Ｘａ（protease factor Xa）等を処理することによって、マルトース結合蛋白質を分離して得られる。これに加えて、ヒスチジンが標識されたポリメラーゼは、ヒスチジン標識親和カラムのような金属キレート親和カラム（metal chelating affinity column）を利用して、高純度で容易に精製される。ＨＢＶポリメラーゼが親和カラムクロマトグラフィーで容易に精製されるのと同様に、蛋白質分解が防がれるので、ヒスチジン標識は、精製過程中の蛋白質の酵素活性をそのまま維持する。また、本発明は、ＨＢＶポリメラーゼから由来したＲＮａｓｅＨ酵素を提供する。人間ＨＢＶポリメラーゼはそのＮ−末端に酵素活性を表すＲＮａｓｅＨ部位があるので、本発明のＲＮａｓｅＨ部位は、ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子の３’ −末端を発現ベクターに挿入し、大腸菌形質転換体を誘導することによって、大量生産される。本発明は、ＨＢＶポリメラーゼから由来したＲＮａｓｅＨ酵素を生産するために、マルトース結合蛋白質（maltose binding protein、MBP）と融合されたＲＮａｓｅＨ酵素を生産する発現ベクターを提供する。正確には、ＨＢＶポリメラーゼのＲＮａｓｅＨ酵素副部位（subdomain）の遺伝子は、重合酵素連鎖反応（polymerase chain reaction、PCR）によって得られることができるが、プライマーとしては序列２及び序列３のオリゴヌクレオチトを利用し（序列リスト参照）、鋳型としては既存の発現ベクターｐＭＰＬＸを利用する。その発現ベクターはＨＢＶポリメラーゼ蛋白質をマルトース結合蛋白質が融合された形態で生産することができる（大韓民国特許出願第９４−３９１８号）。上記で得られたＲＮａｓｅＨ酵素遺伝子は、発現ベクターｐＭＰＬＸを生産するために、プラスミッドベクタ−ｐＭＡＬ−ｃ２に挿入される（図３参照）。特に、大腸菌ＮＭ５２２菌株は、発現ベクターｐＭＰＲＬで形質転換され、その形質転換体を１９９６年１１月２９日韓国微生物培養協会に寄託した（受託番号:ＫＣＣＭ−１００９２）。さらに、本発明は、ＨＢＶポリメラーゼから由来したＲＮａｓｅＨ酵素を生産するために、ヒスチジン標識とマルト−ス結合蛋白質と融合したＲＮａｓｅＨ酵素を生産する発現ベクターを提供する。正確には、ヒスチジン標識のヌクレオチド序列を含むポリメラーゼ遺伝子切片が発現ベクターｐＭＰＨから得られ、発現ベクターｐＭＲＨを製造するために、上記発現ベクターｐＭＰＲＬに挿入される（図４参照）。特に、大腸菌ＮＭ５２２菌株は、発現ベクターｐＭＲＨで形質転換させ、その形質転換体を１９９６年１１月１１日韓国微生物培養協会に寄託した（受託番号：ＫＣＣＭ−１００９１）。本発明は、上記発現ベクター及び形質転換体を使用して、ＨＢＶポリメラーゼから由来したＲＮａｓｅＨ酵素を製造する方法を提供する。正確には、ＨＢＶポリメラーゼのＲＮａｓｅＨ部位を精製するために、その発現ベクターを含む大腸菌形質転換体が、蛋白質の発現のために誘導され、粗溶出液を得るために破壊され、その後、これをアミロースレジンとマルト−スを含む緩衝溶液を用いて、融合蛋白質形態のＲＮａｓｅＨ酵素が精製される。そして、ヒスチジン標識されたＲＮａｓｅＨ酵素のみが、プロテア−ゼ因子Ｘａprotease factor Xa）などを処理することによって、マルト−ス結合蛋白質を分離して得られうる。ヒスチジンが標識されたＲＮａｓｅＨ酵素は、ヒスチジン標識親和カラムを利用する上記と同一の方法で、高純度に精製される。上記の精製したＨＢＶポリメラーゼ及びＲＮａｓｅＨ酵素の分子量及び純度は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウェスタンブロッドを行って決定される。その結果、本発明のＨＢＶポリメラーゼ及びＲＮａｓｅＨ酵素は、末端で分解がされていない完全な形態であることが確認された（図２、図５及び図６参照）。また、本発明のＨＢＶポリメラーゼ中の逆転写酵素活性が調べられた。その結果、マルトース結合蛋白質及びヒスチジン標識との再結合重合酵素は、ヒスチジン標識のないポリメラーゼよりも、逆転写酵素活性が極めて高く表れることを示した。詳しくは、ヒスチジンが標識されたＨＢＶポリメラーゼ蛋白質の場合、ヒスチジンが標識されない完全な場合に比べて、ＤＮＡ依存ＤＮＡ重合酵素（ＤＤＤＰ）及びＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＤＤＰ）の活性は、１９倍高い特異活性度を表す（表１参照）。正確には、本発明は、ＲＮａｓｅＨ活性によるＲＮＡ分解活性を調べるために、ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体がＲＮａｓｅＨ酵素の反応基質として使用される。このときＲＮＡ／ＤＮＡ複合体の生産のためのＤＮＡ鋳型として、プラスミッドｐＢＳから由来したプラスミッドＰＢＳ−ｏｌｉｇｏが選択され、プラスミッドｐＢＳ−ｏｌｉｇｏでＴ７プロモーターの下部１０２ヌクレオチド制限部位ＳｍａＩ内で切断され、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及び放射能で標識されたヌクレオチドなどを利用して試験管内で転写反応が行われた。そして、ＱＩＡｑｉｃｋヌクレオチト除去キット（nucleotide removal kit、QIAGEN）を使用して、１０２ヌクレオチドが得られる。序列４の序列を有する合成ＤＮＡオリゴマ−（４３− ｍｅｒ）が、図７に示すＲＮＡ／ＤＮＡ複合体を製造するために加えられる（序列リスト参照）。ＲＮａｓｅＨ酵素の活性を測定するために、放射能で標識されたＲＮＡ／ＤＮＡ複合体をＲＮａｓｅＨ酵素と反応させ、反応混合物の上澄液の放射能をシンチレ−ション溶液（scintillation cocktail）などを利用して測定する。このとき対照群としてマルトース結合蛋白質を利用し、比較例として粗溶出液分画、商業的に得られるモロニリュケミアビ−ルスの逆転写酵素などを利用する。その結果、本発明のＲＮａｓｅＨ酵素の活性は、約９０％活性のモロニリュケミアビールスの逆転写酵素よりも高い（図８参照）。ＲＮａｓｅＨ部位の酵素的特性を調べるために、ＲＮａｓｅＨ酵素活性は、適当な緩衝溶液と放射能が標識されたＲＮＡ／ＤＮＡ複合体を使用した種々の反応条件で測定される。その結果、酵素の量が増加するほど、ＲＮａｓｅＨ部位の活性が高く表われ（図９参照）、酵素活性が表われるまで３時間の反応時間を必要とすることが示された（図１０参照）。また、酵素反応の望ましい反応温度は３２−４２℃であり（図１１参照）、好ましいｐＨ範囲は７．５−８．８というように比較的広い（図１２参照）。また、酵素反応の反応溶液内の好ましい塩化カリウム濃度は、２０−１００ｍＭの範囲（図１３参照）、マグネシウム濃度は４−８ｍＭの範囲（図１４参照）及びマンガン濃度は４−１２ｍＭの範囲（図１５参照）とすべきである。より好ましくは、ＲＮａｓｅＨの酵素反応の最適温度が３７℃、最適ｐＨが７．９、最適塩化カリウム濃度が４０ｍＭ、最適マグネシウムイオン濃度が４ｍＭ及び最適マンガンイオン濃度が８ｍＭである。また、本発明は、上記ＨＢＶポリメラーゼ及びこれから由来したＲＮａｓｅＨ酵素をビ−ルス増殖抑制剤の探索に使用する用途を提供する。ポリメラーゼを利用してＨＢＶ増殖段階で作用するＨＢＶ阻害剤を選択するために、（ａ）再結合ＨＢＶポリメラーゼをホモポリマ−鋳型、放射能が標識されたヌクレオチド及びビールス増殖抑制剤と反応させ、（ｂ）（ａ）段階の反応溶液を陰イオン吸着濾過紙に吸着させ、その濾過紙を乾燥させ、（ｃ）シンチレーション溶液（scintillation cocktail）を利用して、（ｂ）段階の吸着濾過紙の放射能を測定し、（ｄ）（ｃ）段階の結果をビールス増殖抑制剤を反応混合物中に含まない比較例の酵素活性と比較してＨＢＶ増殖抑制効果の計算に用いる。このとき、ｐｏｌｙ（ｄＡ）／ｏｌｉｇ（ｄＴ）_12-18は、ＤＤＤＰ活性のためのホモポリマ−鋳型として使用され、ｐｏｌｙ（ｒＡ）／ｏｌｉｇ（ｄＴ）_12-18は、ＲＤＤＰ活性のものとして使用するのが好ましく、濾過紙はＤＥ− ８ｌ陰イオン吸着濾過紙を使用するのが好ましい。さらに、ＨＢＶポリメラーゼから由来したＲＮａｓｅＨ酵素を利用してビ− ルス増殖抑制剤を選択するために、まず第１に、酵素の基質を上記と同一な方法で製造し、酵素の基質の放射能が測定されるべきである。ＨＢＶポリメラーゼのＲＮａｓｅＨ部位を利用して、増殖段階で作用するＨＢＶ阻害剤を選択するために、（ａ）ＲＮａｓｅＨ酵素を反応基質及びビールス増殖抑制剤と反応させ、（ｂ）上記（ａ）段階反応をアンモニウムアセタートを加えて中止させ、エタノ−ルで沈澱させ、遠心分離し、（ｃ）上記沈澱物の上澄液で放射能を測定し、（ｄ）（ｃ）段階の結果をビールス増殖抑制剤を反応混合物中に含まない比較例の酵素活性と比較してＨＢＶ増殖抑制効果の計算に用いる。本願発明の実際かつ現在好ましい実施形態を以下の実施例に示す。しかし、当業者がこの開示を考慮して本願発明の思想および範囲内の修飾や改良を行うと、考えられるであろう。実施例〈実施例１〉発現ベクターｐＭＰＨの製造発現ベクターｐＭＰＨを製造するために、既存の発現ベクターｐＭＰＬＸ（大韓民国特許出願第９４−３９１８号）を利用して、そのＨＢＶポリメラーゼ遺伝子の３’−末端に６ヒスチジン残基のヌクレオチド序列を特定部位挿入ミュタゼネシス（site−specific insertion mutagenesis）方法で挿入した。発現ベクターｐＭＰＬＸで大腸菌ＣＪ２３６菌株（ung-，dut-）を形質転換し、ＯＤ₆₀₀が０．３になるように培養し、そして、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパ−ファージ（helper phage）を感染させた。１時間後、カナマイシン（kanamycin）を成長する培地に加えて一昼夜培養し、ウラシル（uracil）を含むＤＮＡを得た。序列１のヌクレオチド序列（序列リスト参照）を有する突然変異用プライマーおよびクンケル（Kunkel）の方法に応じた上記単一鎖ＤＮＡ（single stranded DNA）を用いて、生体外ＤＮＡ重合反応を行うことによって、６個のヒスチジン残基を含む突然変異ベクターを得た（Kunkel,T.A.，Proc．Natl．Acad．Sci.,82 ：488，1985）。上記突然変異ベクターは、挿入されたＥｃｏＲ１制限酵素部位とＤＮＡ序列分析を用いて選択された。特に、突然変異用プライマーを、ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子の転写解読枠（op en reading frame,ORF）内の終結コドン（stop codon）の直ぐ前にヒスチジンコドン６個を連続的に有するように製造した。ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子には序列変化がないように、ヒスチジン標識のみを挿入した。さらに、既存の発現ベクターｐＭＰＬＸ内にはないＥｃｏＲ１部位（GAATTC）を終結コドンのすぐ後ろに導入することで、突然変異ベクター及び形質転換体を容易に選別することができる。また、このようにして、突然変異べクターは、ＤＮＡ序列分析によって調べられて、正しい転写解読枠と発現方向を有することができる。その結果、再結合蛋白質、マルトース結合蛋白質およびヒスチジン標識が融合されたＨＢＶポリメラーゼを生産できる、本発明の発現ベクターｐＭＰＨを製造した（図１参照）。〈実施例２〉ＨＢＶポリメラーゼの発現ＨＢＶポリメラーゼを大量に得るために、再結合蛋白質、マルトース結合蛋白質およびヒスチジン標識が融合されたＨＢＶポリメラーゼを生産できる発現ベクターｐＭＰＨを使用して、大腸菌ＮＭ５２２菌株を形質転換した。上記大腸菌形質転換体を３mlの２ＸＹＴ培地に接種し、１６−２０時間培養し、成長した培地を１／１００に希釈し、再び、４００ｍｌＬＢ培地に接種した。次に成長した培地をＯＤ₆₀₀=０．５に達するまで３７℃で培養し、イソプロピルチオガラクトシド（isopropylthiogalactoside,IPTG）を大腸菌培地に加え、６−１８時間、２０−３７℃で培養した。〈実施例３〉ＨＢＶポリメラーゼの精製ＨＢＶポリメラーゼを精製するために、実施例２で発現のために誘導された大腸菌培地を４．０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。細胞ペレットを、緩衝溶液Ａ（1OmMトリス一塩酸pH7.4、2OOmM NaCl，1mM EDTA）５ｍｌに再び乳濁させ、超音波を２０秒ずつ５回処理して破砕した。マルト−ス結合蛋白質を利用してＨＢＶポリメラーゼを分離するために、粗抽出液を遠心分離し、その上澄液をアミロ−スレジンカラム（New England Biolab．）に詰めた（loading）後、上澄液の休積の５０倍である緩衝溶液Ａでレジン（resin）を洗った。次に１０ｍＭマルト−スを含む緩衝溶液Ａを使用して、マルトース結合蛋白質が融合されたＨＢＶポリメラーゼを溶出させた。さらに、ヒスチジン標識を利用してＨＢＶポリメラーゼを高度に精製するために、上記で得られた蛋白質分画を再びＮｉ²⁺−ＮＴＡレジン（QIAGEN）に詰めた。加えた蛋白質試料がカラムを通過した後、１０ｍＭイミダゾール（imidazole ）を含むレジン体積の１０倍の体積の緩衝溶液Ｂ（50mM Na₂HPO₄、300mM NaCl、 10％グリセロール、10mMイミダゾール、pH6.O）をカラムの洗浄に用い、それから、再びレジンの３０倍の体積の緩衝溶液Ｂをカラムの洗浄に用いる。次に１０ −２００ｍＭ濃度のイミダゾ−ル濃度勾配を利用してＨＢＶポリメラーゼ蛋白質を溶出させ、精製した。〈実施例４〉ＨＢＶポリメラーゼの分子量及び純度の確認上記実施例３で得られたＨＢＶポリメラーゼの分子量及び純度を確認するために、ＨＢＶポリメラーゼをレムリ（Laemmli）の方法に従ってＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけ、ウェスタンブロット（western blotting）を同様に行った。このとき、ＨＢＶポリメラーゼの量をブラッドフォード（Bradfo rd）の方法に従い定量した。ヒスチジン標識で標識された蛋白質と結合できる^MRGSＨｉｓ−Ａｇを、ウェスタンブロッドを行うために利用した。１：２，０００で希釈した^MRGSＨｉｓ−Ａｇ（QIAGEN）を１次抗体として使用し、１：１６，０００で希釈したウサギの抗 −マウスＩｇＧ（Sigma）を２次抗体として使用した。その結果、本発明のヒスチジンを含むＨＢＶポリメラーゼが、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で１４４ＫＤの蛋白質サイズを有することが確認された。このポリメラーゼは、蛋白質の加水分解のため、既に精製されたＨＢＶポリメラーゼでは、探知できなかった。発現された蛋白質の濃度は、既に精製されたＨＢＶポリメラーゼと同様に、４００μｇ／ｌであった（図２参照）。〈実施例５〉ＨＢＶポリメラーゼの活性の確認上記で方法で精製された再結合ＨＢＶポリメラーゼの活性を確認するために、基質を含む７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（４．５％stackingゲル）を利用して、再結合ＨＢＶポリメラーゼを電気泳動した。電気泳動後に、ゲルを再生（renaturation）緩衝溶液（50mMトリス−塩酸、pH7.4）に浸し、振りながら４℃で２４時間培養した。ＳＤＳを除去することで、再生したゲルは、１００ｍｌの反応混合液（50mMトリス−塩酸、pH7.4、５mM DTT、5mM MgCl₂、０．０１％NP−40、10mMdGTP、１０mM dATP、１０mM dCTP、20μCi³²P-dTTP）と混合され、その反応混合物を３７℃で１６時問培養した。次に５００ｍ１、５％ＴＣＡ− １％Ｎａ₄Ｐ₂Ｏ₇を加え、ゲルを４℃で２０時間洗浄し、乾燥したゲルをＸ線フィルム上に露光させた。マルトース結合蛋白質及びヒスチジン標識で融合された推定上のＨＢＶポリメラーゼである１４４ＫＤの蛋白質が、逆転写酵素活性を示した。さらに、ヒスチジン標識のあるＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素活性は、ヒスチジン標識のないものより、活性である。〈実施例６〉ＨＢＶポリメラーゼ活性の分析上記方法で精製されたＨＢＶポリメラーゼの活性を分析するために、精製されたＨＢＶポリメラーゼ０．５μｇ、標準ポリメラーゼ反応緩衝溶液（standard p olymerase reaction buffer）、ホモポリマ−鋳型（homopolymer template）５０ｎｇ及び２μＣｉ³²Ｐ−ｄＴＴＰ（〜3000 Ci／mmol）の混合物を、３７℃で１時間培養した。このとき、ＤＤＤＰ活性の分析を行うのに鋳型としてｐｏｌｙ（ｄＡ）)・ｏｌｙｇo（ｄＴ）_12-18を用い、そして、ＲＤＤＰ活性を分析するのに鋳型としてｐｏｌｙ（ｒＡ）・ｏｌｙｇｏ（ｄＴ）_12-18を使用した。この反応混合物をデスクフィルタ−（disc filteｒ）に吸着させ、そのデスクフィルタ−を洗浄し、液体シンチレ−ション測定器（liquid scintillation counter）を用いて³²Ｐ−ｄＴＴＰの量を測定するために、シンチレーション溶液（scinti llation cocktail、5.5g／1 PPO、0.15g／1 POPOP）と混合した。その結果、本発明のヒスチジン標識を含むＨＢＶポリメラーゼは、既存の精製されたポリメラーゼの活性に比べて、ＤＤＤＰ及びＲＤＤＰが相対的に高い特異活性度（cpm／μg）を示した。特に、本発明の発現ベクターによって生産された再結合ＨＢＶポリメラーゼのＤＤＤＰ活性は、既存の重合酵素蛋白質より１９倍高く、ＲＤＯＰ活性は５．６倍高かった。（表１参照）。〈表１〉再結合ＨＢＶポリメラーゼの酵素活性比較〈実施例７〉発現ベクターＭＰＲＬの製造ＨＢＶポリメラーゼから由来したＲＮａｓｅＨ酵素を生産する発現ベクターｐＭＰＲＬを製造するために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって、ＲＮａｓｅＨ副部位（subdomain）を暗号に書き直す３’−末端ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子の遺伝子切片を増幅した。このとき使用した５−末端プライマーは序列２の序列を有し（序列リスト録参照）、３’−末端プライマーは序列３の序列を有する（序列リスト参照）。上記発現ベクターｐＭＰＬＸ（大韓民国特許出願第９４−３９１８号）をＤＮＡ鋳型として利用した。増幅されたＤＮＡ切片の大きさは、０．５ｋｂと確認された。上記ＤＮＡ切片を制限酵素部位ＸｍｎＩで切断し、プラスミッドｐＭＡＬ−ｃ２と連結した（ligated）。その連結物(ligation p roduct)は、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断され、ＲＮａｓｅＨ酵素に相当するＤＮＡ切片を分離した。上記ＤＮＡ切片を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して、プラスミッドｐＭＡＬ−ｃ２と連結した。そして、７．２ｋｂサイズの発現ベクターｐＭＰＲＬを製造した（図３参照）。ＥｃｏＲＩ部位の序列分析によって、プラスミッドｐＭＡＬ−ｃ２のマルトース結合蛋白質及びＲＮａｓｅＨ酵素遺伝子の転写解読枠（open reading frame）が、正確に連結されたことを、確認した。〈実施例８〉発現べクターｐＭＲＨの製造ヒスチジン標識を含むＨＢＶポリメラーゼから由来したＲＮａｓｅＨ部位を生産する発現ベクターｐＭＲＨを製造するために、ヒスチジン標識を含むＨＢＶポリメラーゼを生産する発現ベクターＭＰＨを利用した。発現ベクターｐＭＰＨを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで切断し、そして、ヒスチジン標識を暗号に書き直したＤＮＡ序列を含むＤＮＡ切片を得た。ＨＢＶポリメラーゼのＲＮａｓｅＨ酵素を生産するための実施例７で製造された発現ベクターｐＭＰＲＬを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで切断し、ヒスチジン標識を暗号に書き直すＤＮＡ序列を、上記発現ベクターｐＭＰＲＨに挿入した。その結果、再結合蛋白質、マルトース結合蛋白質で融合されたＲＮａｓｅＨ部位およびＣ末端のヒスチジン標識を生産する発現べクターｐＭＲＨを製造した（図４参照）。〈実施例９〉人間ＨＢＶポリメラーゼから由来したＲＮａｓｅＨ部位の発現ＨＢＶポリメラーゼから由来したＲＮａｓｅＨ部位を、発現ベクターｐＭＰＲＬ及び発現ベクターｐＭＲＨを用いて大腸菌中で発現させた。大腸菌ＮＭ５２２菌株を発現ベクターｐＭＰＲＬ及び発現ベクターｐＭＲＨを用いて形質転換させ、そして、その形質転換体を２×ＹＴ培地で一昼夜培養した。この成長する培地は、１：１００に希釈され、グルコースが豊富な媒体中で培養し、波長６００ｎｍでの吸光度が０．５に達するまで培養した。それから、最終濃度が０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧ（isopropylthiogalactoside）をその媒体に加えた。上記成長する培地を入れ、２３℃で１２時間更に培養し、再結合ＲＮａｓｅＨ部位が発現した。上記の細胞培養液を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、カラム緩衝溶液（１０mMトリス−塩酸、pH7.4、２00mM塩化ナトリウム、1mM EDTA）１０ｍ１で細胞ペレット（pellet）を洗い、再び遠心分離してペレットを乳濁させた。細胞を冷凍し、解凍する過程（freeze and thaw）を４回繰り返し、１０秒間３回の超音波(sonication)を利用して破砕した。上記の過程で製造した粗溶出液を４℃で３０分間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄液を分離した。更にこの過程を３回反復して遠心分離して上澄液をアミロースレジンに通過させた。そのカラムをレジン量の５０倍のカラム緩衝溶液で洗浄した後、１０ｍＭマルトースを含む緩衝溶液でＲＮａｓｅＨ部位を溶離した。精製された再結合蛋白質は、プロテア−ゼ因子Ｘａを処理することによって、マルト−ス結合蛋白質およびＲＮａｓｅＨ部位に加水分解された。さらに、本発明の発現ベクターｐＭＲＨから生産されるＲＮａｓｅＨ部位は、そのＣ−末端にヒスチジン標識を有しているので、ヒスチジン標識親和カラムを利用して精製された。ヒスチジン標識親和カラムに使用するレジン（Ni−NTA 、QIAGEN）を超音波破砕（sonication）緩衝溶液（５０mM燐酸ナトリウム、pH８．０、３００mM塩化ナトリウム）で活性化させ、その活性化されたレジンを直径約１ｃｍ程度のガラス管に体積４−５ｍｌで充填させた。上記で得た蛋白質試料を０．１ｍｌ／分の流速でカラムに通過させ、蛋白質試料の１００−２００倍の体積の洗浄緩衝溶液（５ＯmM燐酸ナトリウム、pH６．０、３００mM塩化ナトリウム、１０％グリセロール）でカラムを十分洗った。次にイミダゾール（imidazol e）を０．０１−０．５Ｍの濃度勾配にして、カラムを洗浄して、再結合蛋白質を溶出させた。その結果、ＲＮａｓｅＨ活性部位を、イミダゾ−ル５０ｍＭ濃度でヒスチジン標識親和カラムから分離した。ＨＢＶポリメラーゼから由来する精製されたＲＮａｓｅＨ酵素を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウェスタンブロッドを行って確認した（図５及び図６参照）。〈実施例１０〉ＲＮａｓｅＨ酵素の反応基質の製造本発明のＲＮａｓｅＨ酵素の活性を確認するために、ＲＮａｓｅＨ酵素の反応基質として使用されるＲＮＡ／ＤＮＡ複合体を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを利用した試験管内転写反応で製造した。ランーオフ転写体（Run−off transcr ipt）の製造に使用される鋳型は、プラスミッドｐＢＳに由来したプラスミッドｐＢＳ−ｏｌｉｇｏであった。プラスミッドｐＢＳ−ｏｌｉｇｏで大腸菌を形質転換させ、その形質転換体をアルカリライシス（alkaline lysis）方法でプラスミッドｐＢＳ−ｏｌｉｇｏを大量に得るために培養した。制限酵素ＳｍａＩ部位がプラスミッドｐＢＳ−ｏｌｉｇｏのＴ７プロモーターの下部１０２ヌクレオチドに位置する。制限酵素ＳｍａＩでプラスミッドＰＢＳ−ｏｌｉｇｏを切断し、０．７％アガロースゲルで電気泳動し、溶出させ、試験管内の転写反応に使用した。試験管内の転写反応は、３０μ１蒸留水、２０μｌ５×反応緩衝溶液（２００mMトリス −塩酸、pH7．５、３０mM塩化マグネシウム、１０mMスペルミジン（spermidine ）、５０mM塩化ナトリウム）、１０μｌジチオトレイトール、制限酵素ＳｍａＩで切断されたプラスミッドｐＢＳ−ｏｌｉｇｏ２−５μｇを包含する１０μｌ、５μｌ２．５ｍＭＡＴＰ、５μｌ２．５ｍＭＧＴＰ、５μｌ２．５ｍＭＵＴＰ、５μｌ０．１ｍＭＣＴＰ、３μｌＲＮａｓｉｎ、５μｌ〔³²Ｐ〕ＣＴＰ５０ μＣｉ、２μｌＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて行った。全体反応体積を１００μｌにして、上記反応混合物を３７℃で１−２時間培養した。それから、ＱＩＡｑｕｉｃｋヌクレオチド除去キット（nucleotide removal kit、QIAGEN）を使用して生成された１０２ヌクレオチト長さのＲＮＡを分離し、１−５μｌの量を８Ｍウレア−６％ＴＢＥゲルで電気泳動し、ゲルを乾燥させて、Ｘ−線フイルム上で４８時間以上露光させた。放射能を調べるために、そのＸ−線フイルムを現像した。放射能が確認された１０２ヌクレオチド長さのＲＮＡを序列４の序列を有した合成ＤＮＡオリゴマ−（４３−ｍｅｒ）の等モル（mole）量と混合し、７０−８０℃で３−１０分間加熱し、常温に冷却した。最後に、放射能を有するＲＮＡ／ＤＮＡ複合体を、以上の過程を経て製造した。ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体の構造を図７に示す。〈実施例１１〉ＲＮａｓｅＨ酵素活性の確認実施例９で精製したＲＮａｓｅＨ酵素と実施例１０で製造した放射能を有するＲＮＡ／ＤＮＡ複合体を使用して、ＲＮａｓｅＨ酵素の活性を確認した。本発明のＲＮａｓｅＨ酵素の活性を確認するために、４０ｍＭトリス−塩酸（pH ７．９）、４ｍＭ塩化マグネシウム、４０ｍＭ塩化カリウム、ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体を添加して、ＲＮａｓｅＨ酵素１μｇに混合し、その反応混合物を３７℃ で３時間培養し、反応混合物に５０ｍＭＥＤＴＡを添加して反応を停止させた。その反応液の少量に、これと同量の氷冷した１０％ＴＣＡを加えた。上記反応混合物を、１時間、４℃で培養した。４℃、１３，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離した。その上澄液を得て、この２０μｌの放射能をシンチレーション溶液（ scintillation cocktail）で測定した。対照群として、ＲＮａｓｅＨ部位と融合されたマルト−ス結合蛋白質（malt ose binding protein）を、同条件で反応させたが、放射能は検出されなかった。さらに、以下の蛋白質について同じ条件でＲＮａｓｅＨ活性を比較した。これらの蛋白質は、実施例９で得た粗溶出液、商業的に入手可能なモロニリュウケミアビールスの逆転写酵素、発現ベクターｐＭＰＲＬから発現後にアミロ−スカラムで精製されたＲＮａｓｅＨ酵素、発現ベクターｐＭＲＨから発現後にアミロースカラムで１次精製して、ヒスチジン標識親和カラムで２次精製したＲＮａｓｅＨ酵素である。その結果、ＲＮａｓｅＨ部位の活性は、商業的に入手可能なモロニリュウケミアビールスの逆転写酵素に存在するＲＮａｓｅＨ酵素活性の９０％であった（図８参照）。〈実施例１２〉酵素の量に応じたＲＮａｓｅＨ酵素活性の変化反応条件に応じてＲＮａｓｅＨ酵素活性の変化を測定するために、ＲＮａｓｅＨ酵素の条件を変化させ、ＲＮａｓｅＨ酵素の活性を測定した。詳しくは、ＲＮａｓｅＨ酵素の量を０−１．６μｇで変化させながら、本発明のＲＮａｓｅＨ酵素を、４０ｍＭトリス−塩酸（pH7．9）、４ｍＭ塩化マグネシウム、４０ｍＭ塩化カリウム、３０，０００ｃｐｍＲＮＡ／ＤＮＡ複合体と混合し、その反応混合物を３７℃で３時間培養した。その結果、上記酵素の量が増加するほど、ＲＮａｓｅＨ酵素活性が高くなった（図９参照）。〈実施例１３〉反応時間に応じたＲＮａｓｅＨ酵素活性の変化１μｇＲＮａｓｅＨ酵素を、４０ｍＭトリス−塩酸（pH７．９）、４ｍＭ塩化マグネシウム、４０ｍＭ塩化カリウム、３０，０００ｃｐｍＲＮＡ／ＤＮＡ複合体と混合し、実施例１１と同様にして、その反応混合物を３７℃で培養し、十分に酵素活性が表れる反応時間を測定した。ＲＮａｓｅＨ酵素の活性が表れるためには、約３時間が必要であった（図１０参照）。〈実施例１４〉反応温度に応じたＲＮａｓｅＨ酵素活性の変化１μｇＲＮａｓｅＨ酵素を、４０ｍＭトリス−塩酸（pH７．９）、４ｍＭ塩化マグネシウム、４０ｍＭ塩化カリウム、３０，０００ｃｐｍＲＮＡ／ＤＮＡ複合体と混合し、実施例１１と同様にして、その反応混合物を３時間培養した。この時温度を０−５２℃の範囲で変化させた。その結果、ＲＮａｓｅＨ酵素活性を３２−４２℃の相対的広い範囲で確認した（図１１参照）。〈実施例１５〉反応溶液のｐＨに応じたＲＮａｓｅＨ酵素活性の変化１μｇＲＮａｓｅＨ酵素を、４０ｍＭトリス−塩酸（pH7．9）、４ｍＭ塩化マグネシウム、４０ｍＭ塩化カリウム、３０，０００ｃｐｍＲＮＡ／ＤＮＡ複合体と混合し、実施例１１と同様にして、その反応混合物を３７℃で３時間培養した。この時ｐＨを６．０−１０．０範囲で変化させた。ＲＮａｓｅＨ酵素活性がｐＨ７．５−８．８の範囲で高い値であった（図１２参照）。〈実施例１６〉塩化カリウムの濃度に応じたＲＮａｓｅＨ酵素活性の変化１μｇＲＮａｓｅＨ酵素を、４０ｍＭトリス−塩酸（pH7．9）、４ｍＭ塩化マグネシウム、３０，０００ｃｐｍＲＮＡ／ＤＮＡ複合体と混合し、実施例１１と同様にして、その反応混合物を３７℃で３時間培養した。この時塩化カリウム濃度を０−４００ｍＭ範囲で変化させた。ＲＮａｓｅＨ酵素活性が塩化カリウム濃度を２０−１００ｍＭ範囲で高い値であった（図１３参照）。〈実施例１７〉マグネシウムの濃度に応じたＲＮａｓｅＨ酵素活性の変化１μｇＲＮａｓｅＨ酵素を、４０ｍＭトリス−塩酸（pH7．9）、４０ｍＭ塩化カリウム、３０，０００ｃｐｍＲＮＡ／ＤＮＡ複合体と混合し、実施例１１と同様にして、その反応混合物を３７℃で３時間培養した。この時マグネシウムイオン（Mg²⁺）濃度を０−５０ｍＭに変化させた。ＲＮａｓｅＨ酵素活性がマグネシウムイオン濃度４−８ｍＭの範囲で高い値であった（図１４参照）。〈実施例１８〉マンガンイオンの濃度に応じたＲＮａｓｅＨ酵素活性の変化反応溶液の２価の陽イオンをマンガンイオン（Ｍｎ²⁺）に置き換え、１μｇＲＮａｓｅＨ酵素を、４０ｍＭトリス−塩酸（pH7．9）、４０ｍＭ塩化カリウム、３０，０００ｃｐｍＲＮＡ／ＤＮＡ複合体と混合し、実施例１１と同様にして、その反応混合物を３７℃で３時間培養した。ＲＮａｓｅＨ酵素活性がマンガンイオン濃度を４−１２ｍＭ範囲で高い値であった（図１５参照）。〈実施例１９〉ＨＢＶポリメラーゼを利用したＨＢＶ増殖抑制剤の探索本発明のＨＢＶポリメラーゼを利用して、ＨＢＶ増殖抑制剤を探索するために、次のような反応を行った。精製されたＨＢＶポリメラーゼ０．５μｇ、５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．４、５０ｍＭ塩化カリウム、０．５ｍＭ塩化マンガン、１ｍＭジチオトレートル（dithiotreitol）、０．０１％ＮＰ−４０、５０ｎｇホモポリマ−鋳型（RDDPの場合はpoly（rA）／oligo （dT）_12-18、DDDPの場合はpoly（rA）／oligo （dT）_12-18）および２μＣｉ〔α−³²Ｐ〕ＴＴＰ（3000 Ci／mmol）からなる反応混合物５０μｌを、３７℃で１時間培養した。次に反応溶液をＴＣＡで沈澱させ、ＤＥ−８１陰イオン吸着濾過紙に吸着させた。サンプルを含む吸着濾紙を０．１Ｍ燐酸緩衝溶液で洗浄し、洗浄された濾過紙を赤外線で乾燥して後、シンチレーション溶液（scitillation cocktail）を加えて、放射能（cpm）を測定して、ＲＮａｓｅＨ酵素活性を分析した。上記方法を用いてビールス増殖抑制剤を選択するために、１０μlの推定上のビールス増殖抑制剤を上記反応混台物に加え、ビールス増殖抑制剤を含まない反応サンプルとの酵素活性を比較した。〈実施例２０〉ＲＮａｓｅＨ酵素を利用したＨＢＶ増殖抑制剤の探索本発明のＲＮａｓｅＨ酵素を利用して、ＨＢＶ増殖抑制剤を探索するために、酵素基質を次の方法で製造した。ＲＮＡ転写体を製造するために、Ｍ１３ファージの単一鎖ＤＮＡを精製し、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼを使用して転写した。緩衝溶液（２００mMトリス−塩酸 pH7．５、３０mM塩化マグネシウム、１０mMスペルミジン、５０mM塩化ナトリウム）４μｌ、１００ｍＭジチオトレートル２μｌ、ＲＮａｓｉｎ（プロメガ社製品）1μｌ、２．５ｍＭＡＴＰ１μｌ、２．５ｍＭＧＴＰ１μｌ、２．５ｍＭＵＴＰ１μｌ、ＲＮａｓｅのない蒸留水０．６μｌ、０．１ｍＭＣＴＰ２．４μｌ、Ｍ１３ｍｐ１９の単一鎖ＤＮＡ（約１μｇ／μｌ）１μｌ、〔α−³² Ｐ〕ＣＴＰ（１０μCi／μｌ、エマ−シャム社製品）5μｌを含む反応混合物を、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ（プロメガ社製品）１μｌとともに、３７℃で１５時間培養した。反応混合物をセファデックス（sephadex）Ｇ−５０カラムに通過させ、残存した核酸を除去した。カラム通過液の体積を測定し、その０．５倍体積の７．５Ｍ酢酸アンモニウム、その２倍体積のエタノ−ルを、上記反応混合物に加えて、−２０℃で１時問沈澱させた。次に、これを遠心分離し、７０％エタノールで洗浄して上記ＲＮＡ転写体を得た。ＲＮＡ転写体を、１００μｌ１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．０に再乳濁させ、１μｌのＲＮＡ転写体溶液を使用して放射能を測定した。さらに、上記方法で得られたＲＮＡ転写体、および、緩衝溶液（１０mMトリス −塩酸、pH8．O、1mM EDTA、８０mM塩化カリウム）に乳濁したＭ１３ｍｐ１９の１重らせんＤＮＡを同量、８５℃で２分間加熱し、上記反応混合物を常温で冷却した。その結果、エタノールで沈澱させて、１００μｌＴＥ（pH8．O）緩衝溶液に乳濁したＤＮＡ／ＲＮＡ複合体を得た。上記ＲＮａｓｅＨ酵素の活性を測定するために、２×緩衝溶液（４０mMトリス−塩酸、pH８．０、２０mM塩化カリウム、２mM塩化マグネシウム、４mMジチオトレートル）２５μｌ、ＲＮａｓｅＨ部位５μｌ、酵素基質（約５０，０００ cpm）５μｌ、蒸留水１０μｌからなる全体体積５０μｌの反応混合物を調製し、３７℃で３０分間培養した。２５μｌ７．５Ｍ酢酸アンモニウムを加えて反応を停止させ、２３０μｌエタノールを加えて沈澱させた。ビールス増殖抑制活性を測定するために、上記反応液に阻害物質を５μｌ加えて酵素活性を測定し、阻害物質を含まない反応サンプルのＲＮａｓｅＨ酵素の酵素活性と比較した。上記で見るように、本発明のＨＢＶポリメラーゼはヒスチジン標識によって安定であるため、活性の高いＨＢＶポリメラーゼを大腸菌で大量生産することができる。また、本発明のＨＢＶポリメラーゼはヒスチジン標識親和カラムクロマトグラフィーを用いて容易に精製することができる。正確には、ＨＢＶポリメラーゼは、マルト−ス結合蛋白質及びヒスチジン標識を利用して２重に精製することができるので、ＨＢＶポリメラーゼは、既に精製されたポリメラーゼよりも、５ −２０倍高い特異活性度を示す。上記ＨＢＶポリメラーゼから由来したＲＮａｓｅＨ酵素も、大腸菌で大量生産され、容易に精製される。さらに、精製過程でＲＮａｓｅＨ活性が高く維持される。従って、本発明のポリメラーゼ及びＲＮａｓｅＨ部位は、種々のビールス増殖抑制剤の効率的な選別に用いることができる。本発明の探索方法によって選別されたビールス増殖抑制剤は、ＨＢＶ増殖機構の解釈、ビールス感染で誘発される肝炎、肝硬変及び肝癌を治療するのに用いることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，ＪＰ (72)発明者フー，ヨン大韓民国，キョンキ―ドゥ 430―050，クンポ―シ，クムジョン―ドン，トエゲエーピーティー．，368―508 (72)発明者ロー，ユン―モ大韓民国，ソウル 137―042，ソチョー― ク，バンポ２―ドン，ミジョーエーピーテイー．，１―1003 (72)発明者ジュン，グ―フン大韓民国，ソウル 151―057，クヮナク− ク，ボンチョン７―ドン，239―１

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒスチジン標識を含んでなる、ＨＢＶポリメラーゼ。２．マルトース結合蛋白質と融合している、請求項１記載のＨＢＶポリメラーゼ。３．Ｃ−末端にヒスチジン標識を含む、請求項２記載のＨＢＶポリメラーゼ。４．大腸菌中で請求項１記載のＨＢＶポリメラーゼを生産する、発現ベクター。５．発現ベクタ−ｐＭＰＨである、請求項４記載の発現ベクター。６．請求項４記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られた、大腸菌形質転換体。７．発現ベクタ−ｐＭＰＨで宿主細胞を形質転換して得られた、請求項６記載の大腸菌形質転換体（ＫＣＣＭ−１００８４）。８．（ａ）請求項６記載の大腸菌形質転換体を培養する工程と、（ｂ）ＨＢＶポリメラーゼの発現を誘導する工程と、（ｃ）大腸菌形質転換体の粗溶出液でヒスチジン標識親和カラムクロマトグラフィーを行う工程とを含む、請求項１記載のＨＢＶポリメラーゼの製造方法。９．（ａ）アミロース親和カラムクロマトグラフィーを行う工程と、（ｂ）プロテアーゼ因子Ｘａで処理する工程とをさらに含む、請求項８記載のＨＢＶポリメラーゼの製造方法。１０．人間ＨＢＶポリメラーゼから由来した、ＲＮａｓｅＨ酵素。１１．マルトース結合蛋白質と融合している、請求項１０記載のＲＮａｓｅＨ酵素。１２．Ｃ−末端にヒスチジン標識を含有する、請求項１１記載のＲＮａｓｅＨ酵素。１３．温度３２−４２℃、ｐＨ７．５−８．８で、塩化カリウム２０−１００ｍＭ、マグネシウムイオン４−８ｍＭ又はマンガンイオン４−１２ｍＭを含む反応溶液中で活性である、請求項１０記載のＲＮａｓｅＨ酵素。１４．請求項１１記載のＲＮａｓｅＨ酵素を生産する、発現ベクターｐＭＰＲＬ。１５．請求項１４記載の発現ベクターｐＭＰＲＬで宿主細胞を形質転換して得られた、大腸菌形質転換体（ＫＣＣＭ−１００９２）。１６．請求項１２記載のＲＮａｓｅＨ酵素を生産する、発現ベクターｐＭＲＨ。１７．請求項１６記載の発現ベクターｐＭＲＨで宿主細胞を形質転換して得られた、大腸菌形質転換体（ＫＣＣＭ−１００９１）。１８．（ａ）請求項１５または１７記載の大腸菌形質転換体を培養した後にＲＮａｓｅＨ酵素の発現を誘導する工程と、（ｂ）粗溶出液でアミロース親和カラムクロマトグラフィーを行う工程と、（ｃ）プロテアーゼ因子Ｘａを処理する工程とを含む、請求項１０記載のＲＮａｓｅＨ酵素の製造方法。１９．請求項１７記載の大腸菌形質転換体で、ヒスチジン標識親和カラムクロマトグラフィーを行う工程をさらに含む、請求項１０のＲＮａｓｅＨ酵素を得る請求項１８記載の製造方法。２０．人間ＨＢＶ増殖抑制剤の探索のための請求項１記載のＨＢＶポリメラーゼの使用。２１．ＲＮａｓｅＨ酵素の阻害剤および人間ＨＢＶ増殖抑制剤の探索のための請求項１０記載のＲＮａｓｅＨ酵素の使用。２２．（ａ）請求項１のＨＢＶポリメラーゼを放射能が標識されたヌクレオチド及びビールス増殖抑制剤と反応させる工程と、（ｂ）その反応溶液を陰イオン吸着濾過紙に吸着させ、その濾過紙を乾燥させる工程と、（ｃ）シンチレ−ション溶液（scintillation cocktail）を利用して、（ｂ）工程の吸着濾過紙の放射能を測定する工程と、（ｄ）（ｃ）工程の結果を（ａ）工程でビールス増殖抑制剤なしに反応させた対照群の結果と比較する工程とを含む、ビールス増殖抑制剤の探索方法。２３．（ａ）請求項１０記載のＲＮａｓｅＨ酵素をＲＮＡ／ＤＮＡ複合体及びビールス増殖抑制剤と反応させる工程と、（ｂ）（ａ）工程の反応をアンモニウムアセテートを加えて中止させ、エタノールで沈澱させ、遠心分離する工程と、（ｃ）（ｂ）工程の上澄液の放射能を測定する工程と、（ｄ）（ｃ）工程の結果を（ａ）工程でビールス増殖抑制剤なしに反応させた対照群の結果と比較する工程とを含む、ビールス増殖抑制剤の探索方法。