JP2000503528A - 第ＶＩＩａ因子の新規阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はＦＶＩＩａを阻害するために第ＶＩＩａ因子活性部位阻害ドメインおよび組織因子ドメインを有する合成物を提供する。本発明はこの新規合成物を含む医薬的組成物ならびに診断、治療および予防におけるそれらの使用も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 第ＶＩＩａ因子の新規阻害剤 発明の背景 発明の分野 本発明は血漿第ＶＩＩ因子／第ＶＩＩａ因子に結合し、血漿第ＶＩＩ因子／第 ＶＩＩａ因子に関連する活性を阻害する新規な合成物に関する。特に本発明は第 ＶＩＩａ因子活性部位阻害ドメインおよび組織因子ドメインを有する分子を提供 する。好適な側面に従えば本発明のハイブリッド分子のこのドメイン２個は柔軟 なぺプチドリンカードメインを経て連結している。また本発明はこの新規合成物 を含む医薬的組成物ならびに診断、治療、および予防の方法におけるそれらの使 用も提供する。関連する開示の記載 第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）は５０キロダルトン（ｋＤａ）のビタミンＫ依 存性２本鎖血漿セリンプロテアーゼであって、これは生体内恒常性の複雑な調節 に関与している。第ＶＩＩａ因子は血漿中に約０．５μｇ／ｍＬの濃度で存在す る単鎖チモーゲンである第ＶＩＩ因子のぺプチド結合１個の蛋白質分解によって 作製される。チモーゲンである第ＶＩＩ因子が２本鎖分子へ変換される活性化は 内部ぺプチド結合の切断によって発生する。ヒト第ＶＩＩ因子ではその切断部位 はＡｒｇ１５２〜Ｉｌｅ１５３にある（Ｈａｇｅｎほか、（１９８６年）、Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３巻：２４１２〜２４１６頁； Ｔｈｉｍほか（１８８８年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７巻：７７８５〜７７９３ 頁）。カルシウムイオンの存在下、第ＶＩＩａ因子は高度な親和性で膜内在性蛋 白質である組織因子（ＴＦ）に結合する。ＴＦは第ＶＩＩａ因子の補助因子であ って、その基質である第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）および 第Ｘ因子（ＦＸ）の蛋白質分解的活性化を増強する。 ＴＦは２６３アミノ酸残基の糖蛋白質であって２１９残基の細胞外ドメイン、 １個の膜貫通ドメイン、および短い細胞質ドメインからなる（Ｍｏｒｒｉｓｓｅ ｙ，Ｊ．Ｈ．ほか、（１９８７年）、５０巻：１２９頁）。ＴＦの細胞外ドメイ ンは各アミノ酸約１０５個のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン２個からなる。 ＦＶＩＩａの結合はＴＦ細胞外ドメインが完全に媒介する（Ｍｕｌｌｅｒほか、 （１９９４年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３３巻：１０８６４〜１０８７０頁；Ｇｉ ｂｂｓほか、（１９９４年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３３巻:１４００３〜１４０ １０頁；Ｒｕｆほか、（１９９４年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３３巻：１５６５〜 １５７２頁）。ＴＦの細胞外ドメインの構造は最近Ｘ線結晶解析によって決定さ れた（Ｈａｒｌｏｓほか、（１９９４年）、Ｎａｔｕｒｅ、３７０巻：６６２〜 ６６６頁；Ｍｕｌｌｅｒほか、（１９９４年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３ ３巻：１０８６４頁）。 ＴＦの細胞外ドメインはアラニンスキャンニング突然変異誘発によって詳細に 解析された（Ｋｅｌｌｅｙほか、（１９９５年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ３４巻：１０３８３〜１０３９２頁；Ｇｏｂｂｓほか、（１９９４年）、前出； Ｒｕｆほか、（１９９４年）、前出）。アミノ酸番号１６〜２６および１２９〜 １４７の領域にある残基はＦＶＩＩａとの結合ならびにこの分子の血液凝固機能 に寄与している。Ｌｙｓ２０、Ｔｒｐ４５、Ａｓｐ５８、Ｔｙｒ９４、およびＰ ｈｅ１４０の各残基はＦＶＩＩａとの結合のための自由エネルギー（ΔＧ）に大 きな寄与（１キロカロリー／モル）をしている（Ｋｅｌｌｅｙほか、（１９９５ 年）、前出）。 アミノ酸番号１５７〜１６８の領域にある残基はＴＦ−ＦＶＩＩａの血液凝固 促進に寄与する（Ｋｅｌｌｅｙほか、（１９９５年）前出；Ｒｕｆほか、（１９ ９２年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７巻:２２２０６〜２２２１０頁） が、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ結合には重要ではない。１６５番および１６６番にあ るリジン残基がＴＦ補助因子機能に重要なことが証明されているがＦＶＩＩａ複 合体の形成には関与していない（Ｒｏｙほか、（１９９１年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６６巻：２２０６３頁；Ｒｕｆほか、（１９９２年）、Ｊ．Ｂｉ ｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７巻：６３７５頁）。これらのリジン残基をアラニンで 置換すると、ＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体が触媒するＦＸ活性化速度の低下を起こす （Ｒｕｆほか、（１９９２年）、前出）。リジン１６５〜１６６両残基はＴＦの フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインＣ末端に存在し、突然変異誘発の結果に基づ いてＦＶＩＩａ結合に重要であることが判明している残基とは反対側の分子表面 にある（Ｋｅｌｌｅｙほか、（１９９５年）、前出）。残基Ｔｒｐ１５８、Ｌｙ ｓ１５９、Ｓｅｒ１６３、Ｇｌｙ１６４、Ｌｙｓ１６５、Ｌｙｓ１６６およびＴ ｙｒ１８５の一群は可溶性ＴＦの血液凝固機能に一定の役割を果たしているが、 ＦＶＩＩａの結合には関与していない（Ｋｅ１１ｅｙほか、（１９９５年）、前 出）。 ＴＦは血管内皮によって血漿から分離された血球上に構成的に発現される（Ｃ ａｒｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．とＪ．Ｐ．Ｂｒｏｚｎａ、（１９９３年）、Ｂｌｏｏｄ・ Ｃｏａｇ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌ．、４巻：２８１〜２９２頁）。内皮細胞および単 球上におけるＴＦの発現は炎症性サイトカインまたは細菌性リポポリサッカライ ドとの接触によって誘導される（Ｄｒａｋｅほか、（１９８９年）、Ｊ．Ｃｅｌ ｌ・Ｂｉｏｌ．、１０９巻：３８９頁）。組織が損傷を受けると露出したＴＦの 細胞外ドメインはＦＶＩＩと親和性の高いカルシウム依存性複合体を形成する。 一旦ＴＦと結合すると、ＦＶＩＩはぺプチド結合切断によって活性化されてセリ ンプロテアーゼＦＶＩＩａを与える。この段階を生体内で触媒する酵素はまだ確 認されていないが、試験管内ではＦＸａ、トロンビン、ＴＦ−ＦＶＩＩａ、およ びＦＩＸａはこの切断を触媒できる（Ｄａｖｉｅほか、（１９９１年）、３０巻 ：１０３６３〜１０３７０頁）。ＦＶＩＩａはその生理学的基質であるＦＸおよ びＦＩＸに弱い活性しか示さないが、他方では、ＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体はＦＸ およびＦＩＸを急速に活性化する。 ＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体は外因性血液凝固経路の第一次的な開始剤を構成する （Ｃａｒｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．とＪ．Ｐ．Ｂｒｏｚｎａ、（１９９３年）、Ｂｌｏｏ ｄ・Ｃｏａｇ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌ．、４巻:２８１〜２９２頁；Ｄａｖｉｅ，Ｅ ．Ｗ．ほか、（１９９１年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻：１０３６３ 〜１０３７０頁；Ｒａｐａｐｏｒｔ，Ｓ．Ｉ．とＬ．Ｖ．Ｍ．Ｒａｏ、（１９９ ２年）、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．、１２巻：１１１１〜１１ ２１頁）。この複合体はＦＸから第Ｘａ因子（ＦＸａ）への、ＦＩＸから第ＩＸ ａ 因子（ＦＩＸａ）への、およびそれに加えてＦＶＩＩからＦＶＩＩａへの活性化 により外因性経路を開始する。ＴＦ−ＦＶＩＩａの作用は最終的にプロトロンビ ンからトロンビンへの変換を誘導し、多数の生物学的機能を実行する（Ｂａｄｉ ｍｏｎ，Ｌ．ほか、（１９９１年）、Ｔｒｅｎｄｓ・Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍ ｅｄ．、１巻：２６１〜２６７頁）。トロンビンの最重要な機能はフィブリノー ゲンをフィブリンに変換するもので、後者が重合して血塊を形成する。ＴＦ−Ｆ ＶＩＩａ複合体は接触活性化システムの生理学的効果を拡張する二次的な因子と しても関与している。 この血漿プロテアーゼ系の関与は種々の臨床的表現型に重要な役割を果たして いることが示唆されているが、これらには動脈および静脈の血栓症、敗血症ショ ック、成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、播種性血管内血液凝固症（ＤＩＣ）、 およびその他の様々な疾患容体を含む（Ｈａｓｋｅｌ，Ｅ．Ｊ．ほか、（１９９ １年）、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８４巻：８２１〜８２７頁；Ｈｏｌｓｔ，Ｊ ．ほか、（１９９３年）、Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、２３巻（補１）：１１２〜 １１７頁；Ｃｒｅａｓｅｙ，Ａ．Ａ．ほか、（１９９３年）、Ｊ．Ｃ１ｉｎ．Ｉ ｎｖｅｓｔ．、９１巻：２８５０〜２８６０頁；またＣｏｌｍａｎ，Ｒ．Ｗ．、 （１９８９年）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２０巻：１２０７〜１２０９ 頁；Ｂｏｎｅ，Ｒ．Ｃ．、（１９９２年）、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ． 、１５２巻：１３８１〜１３８９頁も参照）。ＴＦの過剰発現および／または異 常な利用は血栓症および敗血症双方の病理生理学にリンクするとされている（Ｔ ａｙｌｏｒほか、（１９９１年）、Ｃｉｒｃ．Ｓｈｏｃｋ）３３巻：１２７頁； Ｗａｒｒほか、（１９９０年）、Ｂｌｏｏｄ、７５巻:１４８１頁；Ｐａｗａｓ ｈｅほか、（１９９４年）、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、７４巻：５６頁）。ＴＦは動 脈硬化症プラーク内にある細胞の表面に発現される（Ｗｉｌｃｏｘほか、（１９ ８９年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａd．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６巻：２８３９ 頁）。これに加え、ＴＦは腫瘍転移に影響するとされている（Ｂｒｏｍｂｅｒｇ ほか、（１９９５年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２ 巻：８２０５頁）。 ＴＦ−ＦＶＩＩａに対する内因性阻害剤が血清に存在することは以前から認識 されていた（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｃ．Ｌ．、（１９４６年）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈ ｙｓｉｏｌ．、１４９巻：１２３頁）。ＴＦ−ＦＶＩＩａは血液凝固経路開始に 続きそれ以上のチモーゲン基質活性化を防止するフィードバック阻害剤、組織因 子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）によって調節される（Ｂｒｏｚｅ・Ｊｒ．，Ｇ．Ｊ． ほか、（１９９０年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９巻：７５３９〜７５４ ６頁;Ｂｒｏｚｅ・Ｊｒ．，Ｇ．Ｊ．、（１９９２年）、Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａ ｔｏｌ．、２９巻：１５６〜１６９頁）。また、ＴＦＰＩはリポプロテイン関与 凝血阻害剤および外因性経路阻害剤であるＬＡＣＩまたはＥＰＩとしても知られ ている。ＴＦＰＩは酸性アミノ末端領域、続いて３個のクニッツ型ドメインおよ び塩基性カルボキシル末端領域を含む。ＴＦＰＩはＦＸａ依存的様式でＴＦ−Ｆ ＶＩＩａを阻害すると考えられ、まず第二クニッツドメインでＦＸａを結合し、 続いて第一クニッツドメインでＦＶＩＩａを結合する（Ｇｉｒａｒｄ，Ｔ．Ｊ． 、（１９８９年）ほか、Ｎａｔｕｒｅ、３３８巻：５１８〜５２０頁）。ＦＸａ が不在なら、ＴＦＰＩはＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体の弱い阻害剤である（Ｇｉｒａ ｒｄ，Ｔ．Ｊ．、（１９８９年）ほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８巻：１４２１〜 １４２４頁）。 ＴＦ−ＦＶＩＩａ活性も阻害するＴＦＰＩの変異体が製造されている。クニッ ツドメインの始めの２個（残基１〜１６１）を有する変異体が製造され、特性を 解析されている（Ｈａｍａｍｏｔｏほか、（１９９３年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ ｅｍ．、２６８巻：８７０４〜８７１０頁；Ｐｅｔｅｒｓｅｎほか、（1９９３ 年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８巻：１３３４４〜１３３５１頁）。国 際公表ＷＯ９１／０２７５３号ならびに米国特許第５３１２７３６号にはセリン プロテアーゼ阻害活性は保持するが、ヘパリンに対する結合親和性が減少したＴ ＦＰＩ変異体が記載されている。ＴＦＰＩ−ＦＸａハイブリッド蛋白質の一つは ＴＦ−ＦＶＩＩａに誘導される正常な血漿の凝固を試験管内凝固検定法によれば ＴＦＰＩ単独よりもかなり大きな活性で阻害することができる（Ｇｉｒａｒｄほ か、（１９９０年）、Ｎａｔｕｒｅ、２４８巻：１４２１〜１４２４頁）。 ＴＦＰＩおよびその変種は血栓溶解後動脈再狭窄（Ｈａｓｋｅｌ，Ｅ．Ｊ．ほ か、（１９９１年）、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８４巻：８２１〜８２７頁）、 静脈血栓症（Ｈｏｌｓｔ，Ｊ．ほか、（１９９３年）、Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ 、２３巻（補１）：１１２〜１１７頁）および敗血症性ショックの結果として起 きる播種性血管内凝固（Ｃｒｅａｓｅｙ，Ａ．Ａ．ほか、（１９９３年）、Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９１巻：２８５０〜２８６０頁）の動物モデルで恒 常性に影響を与えることが証明されている。しかしながら、ＴＦＰＩは血栓症の 治療に用いる抗凝固剤に望まれる性質を全て有するものではない。 最近、セルピンであるアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）がヘパリン存在 下にＴＦ−ＦＶＩＩａ活性を阻害することが証明された（Ｒａｏ，Ｌ．Ｖ．Ｍ． ほか、（１９９３年）、Ｂｌｏｏｄ、８１巻：２６００〜２６０７頁；Ｌａｗｓ ｏｎ，Ｊ．Ｈ．、（１９９３年）ほか、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８巻： ７６７〜７７０頁；Ｂｒｏｚｅ・Ｊｒ．，Ｇ．Ｊ．、（１９９３年）、Ｂｌｏｏ ｄ、８２巻：:１６７９〜１６８０頁；Ｍａｎｎ，Ｋ．Ｇ．、（１９９３年）、 Ｂｌｏｏｄ、８２巻：１６８０〜１６８１頁）。ＴＦＰＩによるＴＦ−ＦＶＩＩ ａの阻害は可逆的であるが、他方では、ＡＴＩＩＩによる阻害は本質的に不可逆 的である。ＡＴＩＩＩ／ヘパリンとＴＦＰＩとの間の生体内ＴＦ−ＦＶＩＩａ阻 害についての相対的重要性の比較は知られていない。 ウシの膵トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ）はアプロチニンとも呼ばれ、親和性は 弱いが（Ｋｉ＝３０μＭ）ＴＦ−ＦＶＩＩａ活性を競合的に阻害することが最近 証明された（Ｃｈａｂｂａｔ，Ｊ．ほか、（１９９３年）、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅ ｓ．、７１巻：２０５〜２１５頁）。これに加えて、ＢＰＴＩがＴＦ−誘導血液 の凝固を阻害することが証明された；しかしながら、血液凝固時間をＰＴ検定で １．４倍に延長するためには約７５μＭが必要であった（ｖａｎ・ｄｅｎ・Ｂｅ ｓｓｅｌａａｒ，Ａ．Ｍ．Ｈ．Ｐ．ほか、（１９９３年）、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａ ｅｍｏｓｔａｓ．、６９巻：２９８〜２９９頁）。 最近、構造的にＢＰＴＩと類似（Ｈｙｎｅｓ，Ｔ．ほか、（１９９０年）、Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９巻：１００１８〜１００２０頁）するアルツハイ マー病アミロイドβ−蛋白質前駆体（ＡＰＰＩ）のクニッツドメインが、組織因 子−第ＶＩＩａ因子の強力で特異的な活性部位阻害剤を選択するために、変異体 の大きなライブラリーのファージディスプレーにおけるスカフォールドに利用さ れた（Ｄｅｎｎｉｓ，Ｍ．Ｓ．とＬａｚａｒｕｓ，Ｒ．Ａ．、（１９９４年）、 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻：２２１２９〜２２１３６頁；Ｄｅｎｎｉ ｓ，Ｍ．Ｓ．とＬａｚａｒｕｓ，Ｒ．Ａ．、（１９９４年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ ｈｅｍ．、２６９巻：２２１３７〜２２１４４頁）。国際公表ＷＯ９５／２３８ ６０号は第ＶＩＩａ因子に対するクニッツ型阻害剤の作製を記載している。 前記のＦＶＩＩａ阻害剤はクニッツ型セリンプロテアーゼ阻害剤（例えばＴＦ ＰＩ、ＢＰＴＩ、ＡＰＰＩ）に分類される。クニッツ型セリンプロテアーゼ阻害 剤はよく特性解析されている一群の蛋白質であって、同系セリンプロテアーゼの 活性部位に適合する長い結合ループを含む特徴的な三次元的折畳みを含む広範囲 な構造的相同性を示す（Ｂｏｄｅ，Ｗ．とＨｕｂｅｒ，Ｒ．、（１９９２年）、 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０４巻：４３３〜４５１頁）。クニッツ型の セリンプロテアーゼ阻害剤は、たとえばＦＶＩＩａのようなセリンプロテアーゼ の遅く、強く結合する可逆的な阻害剤であって、標準的機構に従って活性部位に 結合し、阻害する（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｊｒ．Ｍ．とＫａｔｏ，Ｉ．、（１９ ８０年）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４９巻：５９３〜６２６頁）こ とが知られている。 クニッツ型ドメイン／セリンプロテアーゼ複合体ではクニッツ型ドメインの残 基１５の側鎖が切断されるぺプチド結合に先行するＰ₁位を満たしている。この Ｐ₁残基は基質または切断される阻害剤ぺプチド結合に先行する位置を示すが、 ＳｃｈｅｃｔｅｒとＢｅｒｇｅｒ、（１９６７年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２７巻：１５７〜１６２頁が定義したＳ₁結 合部位に適合する。Ｐ₁残基とＰ₁’残基との間の切断は起きるとしても非常に遅 い（Ｂｏｄｅ，Ｗ．とＨｕｂｅｒ，Ｒ．、（１９９２年）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏ ｃｈｅｍ．、２０４巻：４３３〜４５１頁；Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｊｒ． とＫａｔｏ，Ｉ．、（１９８０年）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４９ 巻：５９３〜６２６頁）。 セリンプロテアーゼのサブサイトとクニッツ型ドメインのセリンプロテアーゼ 阻害剤の一次結合ループにおける側鎖（Ｐ₅−Ｐ₄'）との間に起きる相互作用多 数（Ｂｏｄｅ，Ｗ．とＨｕｂｅｒ，Ｒ．、（１９９２年）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏ ｃｈｅｍ．、２０４巻：４３３〜４５１頁；Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｊｒ． とＫａｔｏ，Ｉ．、（１９８０年）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４９ 巻：５９３〜６２６頁）について、Ｐ₁残基と特異性ポケットとの相互作用はエ ネルギー的に最も重要で、それ故に一次的特異性決定基を代表する。Ｐ₁位にあ るアミノ酸は一般に阻害剤のセリンプロテアーゼ活性部位への親和性を支配する けれども（Ｓｃｏｔｔ，Ｃ．Ｆ．ほか、（１９８７年）、Ｂ１ｏｏｄ、６９巻： １４３１〜１４３６頁；Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｊｒ．とＫａｔｏ，Ｉ．、 （１９８０年）前出；Ｂｅｃｋｍａｎｎ，Ｊ．ほか、（１９８８年）、Ｅｕｒ． Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７６巻：６７５〜６８２頁；Ｓｉｎｈａ，Ｓ．ほか、 （１９９１年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻：２１０１１〜２１０１ ３頁）、この領域外にある残基（第二次結合ループの１１〜１４位および１６〜 １９位ならびに残基３４）も結合親和性およびセリンプロテアーゼに対する特異 性に一定の役割を果たすことが知られている（Ｋｏｓｓｉａｋｏｆｆ，Ａ．Ａ． ほか、（１９９３年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．、２１巻：６１ ４〜６１８頁；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｂ．Ｌ．ほか、（１９９２年）、Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻：２４２９〜２４３３頁）。クニッ ツ型ドメインの結晶構造は一次結合ループ内にあってセリンプロテアーゼと接触 を起こすと思われる残基を提示している（Ｈｙｎｅｓ，Ｔ．Ｒ．ほか、（１９９ ０年）、前出；Ｂｏｄｅ，Ｗ．およびＨｕｂｅｒ，Ｒ．、（１９９２年）、前出 ；Ｋｏｓｓｉａｋｏｆｆ，Ａ．Ａ．、（１９９３年）、前出）。 組織因子の拮抗剤も証明されている。抗ＴＦモノクローナル抗体の中和はヒヒ 敗血症モデルで死亡を予防し（Ｔａｙｌｏｒほか、（１９９１年）、Ｃｉｒｃ． Ｓｈｏｃｋ、３３巻：１２７頁）、ウサギにおけるエンドトキシン誘導ＤＩＣを 弱め（Ｗａｒｒほか、（１９９０年）、Ｂｌｏｏｄ、７５巻：１４８１頁）、お よびウサギの動脈血栓症モデルで血栓再形成を予防する（Ｐａｗａｓｈｅほか、 （１９９４年）、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、７４巻：５６頁）ことが証明された。可 溶性組織因子のアミノ酸残基１６５および１６６におけるリジンからアラニンヘ の突然変異誘発で野生型組織因子に匹敵する親和性でＦＶＩＩａに結合する分子 を得た（Ｋｅｌｌｅｙほか、（１９９５年）、前出）。ＴＦの残基Ｌｙｓ１６５ およびＬｙｓ１６６はＴＦＰＩ−ＦＸａ複合体によるＴＦ−ＦＶＩＩａの阻害に とって重要であることが証明されている（ＲａｏとＲｕｆ、（１９９５年）、Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４巻：１０８６７〜１０８７１頁）。１６５位およ び１６６位でのＬｙｓからＡｌａへの置換を含むＴＦ突然変異体と複合体を形成 しているＦＶＩＩａについては、野生型ＴＦと複合体を形成しているＦＶＩＩａ と比較してＴＦＰＩ−ＦＸａによる阻害速度が減少する。機能性を有するＦＶＩ Ｉａには結合するが、血液凝固促進作用が少ない組織因子の変異体が製造されて いる（国際公表ＷＯ９４／２８０１７号）。これらの分子はＴＦ−ＦＶＩＩａ複 合体中にある組織因子の補助因子活性を不活化するが、その分子がＦＶＩＩａと 複合体を形成する性能には変化を与えない。 発明の要約 本発明は、たとえばＦＶＩＩからＦＶＩＩａへ、ＦＩＸからＦＩＸａへまたは ＦＸからＦＸａへのような触媒的変換およびそれによって血液凝固の外因性経路 の最初のイベントを遮断してＴＦ−ＦＶＩＩａが媒介するかまたは関連する過程 を阻害する合成物を提供する。これに加えて、本発明の合成物はＦＶＩＩまたは ＦＶＩＩａへの結合について内因性組織因子と競合することによって内因性組織 因子の血液凝固効果を中和できる。有利には本合成物はＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体 の好適な態様では低用量の医薬的製剤を提供することによって強力な阻害を可能 にする。本発明の合成物はＴＦ−ＦＶＩＩａが媒介するかまたは関連する過程を 阻害する治療法および予防法において有用である。 本発明の合成物はＦＶＩＩａ活性部位阻害ドメインおよびＴＦドメインを含ん でいる。本発明の好適な側面によれば、このＴＦドメインがＦＶＩＩ／ＦＶＩＩ ａへの結合について内因性ＴＦと競合するが、ＦＶＩＩからＦＶＩＩａへの、Ｆ ＩＸからＦＩＸａへ、またはＦＸからＦＸａへの変換に対する補助因子として作 用する性能は低下している。本発明合成物のＦＶＩＩａ活性部位阻害ドメインは ＦＶＩＩａのセリンプロテアーゼ活性部位に結合してそのチモーゲン基質の触媒 的活性化を予防する。好適な態様では、本発明合成物の活性部位阻害ドメインは 可逆的活性部位セリンプロテアーゼ阻害性分子である。 本発明のある種の好適な側面に従えば、本合成物はさらにＦＶＩＩａ活性部位 阻害ドメインとＴＦドメインとの間に存在するリンカードメインを含む。このリ ンカードメインは好ましくは（Ｇｌｙ）₄−Ｓｅｒ−リンカーモジュールを含む 親水性の柔軟なドメインである。 態様の一つでは、本発明の合成物はポリペプチドである。また、本発明は本発 明のポリペプチドをコードする分離された核酸、好ましくはＤＮＡも包含する。 この側面によれば、この発明はさらにそのＤＮＡ分子に作動可能に結合する発現 制御配列、そのＤＮＡ分子を含みその制御配列がそのべクターで形質転換された 宿主細胞に認識される発現ベクター、好ましくはプラスミド、およびそのベクタ ーで形質転換された宿主細胞、を含む。 本発明の合成物は本発明のアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸配列を分 離または合成し、この核酸配列を適当な宿主内で核酸配列を発現することのでき る適当な発現ベクターに連結し、この宿主を本核酸配列を連結した発現ベクター で形質転換し、この核酸配列の発現に適する条件下にこの宿主を培養して、選択 した核酸配列がコードする蛋白質を宿主に発現させる各段階を包含する工法によ って製造してもよい。好ましくは次に、このポリペプチドを宿主細胞培養物から 回収する。この工法ではこの連結段階をさらにこの核酸を適当な分泌シグナルに 作動可能に連結して宿主がこのアミノ酸配列を分泌するようにこの核酸を適当な 発現べクターに連結するような計画をしてもよい。この分泌シグナルはリーダー 配列、例えばｓｔＩＩ、ｌａｍＢ、ヘルペスｇＤ、ｌｐｐ、アルカリホスファタ ーゼ、インベルターゼ、およびアルファ因子のものなどから構成される群から選 択してもよく、好ましくはｓｔＩＩである。 本発明はさらに本明細書に記載する合成物の治療的な応用にまで展開される。 そこで本発明は本発明の合成物および医薬的に許容される添加剤を含む医薬的組 成物を包含する。これらの分子を含む医薬的組成物は脈管病および炎症性反応を 包含する血栓性または凝固障害性関連の疾患または障害の処置または予防に使用 できる。これらの応用には、例えばＴＦ−ＦＶＩＩａの阻害が指示される哺乳類 を処置する方法であって、その哺乳類に医薬的組成物を医薬的に有効な用量投与 することを包含する。このような適応症は深部静脈血栓症、動脈血栓症、術後血 栓症、冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）、経皮経管冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）、 発作、腫瘍転移、炎症、敗血症ショック、低血圧、ＡＲＤＳおよびＤＩＣを包含 する。本発明の組成物はまた血栓溶解療法におけるアジュバントとしても使用で きよう。 図面の簡単な説明 図１は凝固、接触、フィブリン分解、炎症および補体の各経路を変調する酵素 およびメディエーターを選んで、その概要を図式的に描く。これら経路の活性化 は記載してある臨床的な病状に誘導することがある。 図２は合成物の例示的なモデルを描く。この合成物はＴＦドメイン、活性部位 阻害ドメイン（ＡＰＰＩ）、およびリンカードメインを有する融合蛋白質からな る。この分子のＴＦ部分には、分解能２．４Åで決定されたＴＦの構造（Ｍｕｌ ｌｅｒなど、（１９９４年）、前出）を使用した。クニッツ型ドメインはＡＰＰ Ｉで決定された構造（Ｈｙｎｅｓほか、（１９９０年）、前出）に基づく。残基 ２２個のポリペプチドリンカーはクニッツドメインのＣ末端をＴＦのＮ−末端に 結合するための伸長された立体配座に設計した。両末端間の距離は約６０Åであ る。ＴＦのＣ−末端は分子の下端にある。 図３は代表的なハイブリッド蛋白質合成物の細菌での発現のための融合遺伝子 の構築を図式的に描く。このプラスミドの融合遺伝子とプロモーター領域のみを 示す。この融合遺伝子はＴＦ７Ｉ−Ｃクニッツ型ドメインをコードするｐｓｔ／ ＢａｍＨｌ断片とｐＺＴＦＡＡおよび化学合成的に調製したオリゴヌクレオチド とを連結することによって構築した。 図４は代表的なハイブリッド分子の様々な精製段階で得た試料が示す代表的な ポリアクリルアミドゲルの見取図を描く。この各段階は細胞を凍結−解凍し、次 に浸透圧的ショックを与えて周縁細胞質ショック産物を得る工程（レーン１）、 Ｄ３モノクローナル抗組織因子抗体を使用する免疫親和性クロマトグラフィーで ＴＦ含有蛋白質を分離する工程（レーン２）、および続いてサイズ排除クロマト グラフィーによゥて高分子量分子種を除去する工程（レーン３）である。 図５はリンカーモジュール１〜６個を有する融合蛋白質（ＫＤＴＦＩ〜ＫＤＴ Ｆ６）がＴＦ−ＦＶＩＩａ依存性ＦＸ活性化におよぼす効果を描く。融合蛋白質 によるＴＦ−ＦＶＩＩａ相互作用の阻害はＦＸ活性化検定法によって定量した。 この検定は１００ｐＭ−ＦＶＩＩａを１ｎＭ−阻害剤と共に５ｍＭ−ＣａＣｌ₂ 含有ＴＢＳ、ｐＨ７．５、中で１時間インキュベーションし、次に１０ｎＭ−膜 結合ＴＦを含む溶液１／２０倍容を添加して行った。さらに１時間インキュベー ションした後、ＦＸを１９０ｎＭまで添加した。適当な時間後に適量を採取し、 ５０ｍＭ−ＥＤＴＡ等容で反応を止めた。次に反応停止試料中の活性化ＦＸａを ＳＰＥＣＴＲＯＺＹＭＥ^TM−ＦＸａを発色性基質に用いて定量した。 図６は代表的なハイブリッド分子ＫＤＴＦ５（▼）、可溶性Ｋ１６５Ａ、Ｋ１ ６６Ａ−ＴＦ突然変異体（ｈＴＦＡＡ）（■）およびＴＦ−ＦＶＩＩａに対する クニッツ型セリンプロテアーゼ阻害剤ＴＦ７Ｉ−Ｃ（●）によるＴＦ−ＦＶＩＩ ａの阻害を描く。数値は２倍濃厚なＦＶＩＩａおよび膜ＴＦを用い、様々な阻害 剤濃度を用いる修正ＦＸ活性化検定法で測定した。Ｋ_i*測定は速度分率対阻害剤 濃度のデータを等式１（下記）に適合させることによって行った。 図７はＴＦ−ＦＶＩＩａ阻害剤がプロトロンビン（ＰＴ）時間検定法によって 測定した血液凝固時間におよぼす効果を描く。凝固は阻害剤を含有するクエン酸 添加ヒト血漿と膜結合ＴＦ（ｍＴＦ）およびＣａＣｌ₂を含む溶液とを等容混合 して開始した。凝固時間延長倍数は阻害剤存在下の凝固時間を不在下（ＰＢＳ対 照）の凝固時間で割った商であるとして定義した。後者の凝固時間は５３．２± ２．７秒であった。ＫＤＴＦ５（▼）、ＴＦ７Ｉ−Ｃ（●）、ｈＴＦＡＡ（■） およびＴＦ７Ｉ−ＣとｈＴＦＡＡとの等モル混合物（▲）のデータを示す。 図８は活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）検定法によって測定し た血液凝固時間に及ぼすＴＦ−ＦＶＩＩａ阻害剤の効果を描く。試料（クエン酸 添加ヒト血漿および阻害剤）と活性化剤（Ｉｎｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ・Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社のセファリン＋活性化剤ＡＰＴＴ試薬）とを混合して７ ０秒間３７℃でインキュベーションし、次にＣａＣｌ₂を添加して凝固時間を測 定した。凝固時間の延長倍数は指定濃度の阻害剤存在下における凝固時間を不在 下（ＰＢＳ対照）における凝固時間で割った商として定義した。後者の凝固時間 は６３．７±９．０秒であった。ＫＤＴＦ５（▼）、ＴＦ７Ｉ−Ｃ（●）、ｈＴ ＦＡＡ（■）およびＴＦ７Ｉ−ＣとｈＴＦＡＡとの等モル混合物（▲）について データを示す。 好適な態様の詳細な説明 定義 本明細書で使用する略号には次のものを含む：第ＩＸａ因子をＦＩＸａ；第Ｘ Ｉａ因子をＦＸＩａ；第Ｘａ因子をＦＸａ；組織因子をＴＦ；第ＶＩＩ因子チモ ーゲンをＦＶＩＩ；第ＶＩＩａ因子をＦＶＩＩａ；組織因子−第ＶＩＩａ因子複 合体をＴＦ−ＦＶＩＩａ；ＦＶＩＩおよび／またはＦＶＩＩａをＦＶＩＩ／ＦＶ ＩＩａ；塩基性膵トリプシン阻害剤をＢＰＴＩ；アルツハイマーアミロイドβ− 蛋白質前駆体阻害剤のクニッツプロテアーゼ阻害ドメインをＡＰＰＩ（Ｈｙｎｅ ｓほか、（１９９０年）、前出）；アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌ ｙ−Ｓｅｒを有するアミノ酸５個のポリペプチドを−（Ｇｌｙ）₄−Ｓｅｒおよ びＧ₄Ｓ；組織因子経路阻害剤をＴＦＰＩ；見掛けの平衡解離定数をＫ_i*；プロ トロンビン時間をＰＴ；活性化部分トロンボプラスチン時間をＡＰＴＴ；と略記 する。 ＴＦ−ＦＶＩＩａ仲介または関連過程またはイベントまたはこれと等価に血漿 ＦＶＩＩａに関連する活性は、本発明によればＴＦ−ＦＶＩＩａの存在を必要と するイベントのいずれかである。血液凝固体形成の一般的機構はＧａｎｏｎｇが 「医学生理学（Ｍｅｄｉｃａｌ・ｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）」、１３版、Ｌａｎｇｅ 社、Ｌｏｓｔ・Ａｌｔｏｓ・ＣＡ、４１１〜４１４頁、（１９８７年）に綜説を 書いている。血液凝固には２種の経路、すなわち血小板凝集を誘導するトロン ビン生産および血小板プラグを安定化するフィブリン形成の双方を必要とする。 図１に略記するように、この経路は各々別々のプロ酵素およびプロ補助因子の存 在を必要とする数段階を含む。この過程はフィブリンの交差結合および血栓形成 で終了する。フィブリノーゲンはトロンビンの作用でフィブリンに変換される。 その前にトロンビンはプロトロンビンの蛋白質分解的切断によって形成される。 この蛋白質分解は活性化された血小板表面に結合するＦＸａによって行われ、Ｆ Ｖａとカルシウムの存在下にプロトロンビンを切断する。ＴＦ−ＦＶＩＩａは凝 固の外因性経路によるＦＸの蛋白質分解的活性化のために必要である。それ故、 ＴＦ−ＦＶＩＩａが仲介または関連する過程またはＦＶＩＩａに関連する活性に はＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体形成からフィブリン血小板凝血形成までおよび最初に ＴＦ−ＦＶＩＩａの存在を必要とするものなど凝固カスケードにおけるいずれの 段階も含む。例えばＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体はＦＸをＦＸａへ、ＦＩＸをＦＩＸ ａへ、およびこれに加えてＦＶＩＩをＦＶＩＩａへ、の活性化によって外因性経 路を開始する。ＴＦ−ＦＶＩＩａ媒介または関連プロセスまたはＦＶＩＩａ活性 はたとえばＲｏｙ，Ｓ．、（１９９１年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６ 巻：４６６５〜４６６８頁およびＯ’Ｂｒｉｅｎ，Ｄ．ほか、（１９８８年）、 Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８２巻：２０６〜２１２頁に記載されたように して第ＶＩＩ因子およびその他の必要な試薬の存在下に第Ｘ因子を第Ｘａ因子に 変換するもののような標準的な検定法を採用すれば容易に測定できる。 ＴＦ−ＦＶＩＩａ関連疾患または障害はフィブリン形成に関連する慢性血塞性 疾患または障害を意味し、たとえば深部脈管血栓症、動脈血栓症、発作、腫瘍転 移、血栓分解、動脈硬化症および血管形成術後の再狭窄のような脈管病、たとえ ば炎症、敗血症ショック、毒血症、低血圧、成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、 汎発性血管内血液凝固（ＤＩＣ）およびその他の疾患のような急性および慢性の 徴候を含む。ＴＦ−ＦＶＩＩａ関連障害はたとえば前記のような生体内凝固疾患 に限定されるものではなく、たとえば透析操作、血液濾過または外科手術の間の 血液バイパスのような操作で患者から連続して移動する血液を含むたとえば体外 血液循環に起因する血液凝固のような生体外ＴＦ−ＦＶＩＩａ関連過程も含む。 用語「組織因子蛋白質」および「野生型組織因子」は天然起源哺乳類組織因子 に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは天然起源組織因子のアミノ 酸配列を有し、血漿ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａとの相互作用を経て血液凝固を誘導す ることのできる組換え組織因子を示すために使用する。天然起源ＴＦにはヒトの 分子種ならびにたとえばウサギ、ラット、ブタ、人以外の霊長類、ウマ、マウス およびヒツジの組織因子ようなその他の動物種の組織因子を含む。哺乳類組織因 子蛋白質のアミノ酸配列は一般的に知られているか、または通常の技術によって 入手できる。ヒトの配列ならびにアミノ酸に与えた番号はＭｏｒｒｉｓｓｅｙ， Ｊ．Ｈ．らが（１９８７年）、５０巻：１２９頁に記載したものである。 「ｈＴＦＡＡ」および「Ｋ１６５Ａ：Ｋ１６６ＡｓＴＦ」は前記のヒトのＴＦ アミノ酸１からアミノ酸２１９までのアミノ酸配列を有する可溶性組織因子蛋白 質変異体であるが、その１６５位および１６６位にある天然起源Ｌｙｓアミノ酸 がＡｌａ残基で置換されたものを示す。 アミノ酸の「置換」は野生型組織因子のアミノ酸を化学的または酵素的または その他の適当な手段で野生型アミノ酸以外の基に置き換えることを意味する。 用語「クニッツ型セリンプロテアーゼ阻害ドメイン」、「クニッツ型ドメイン 」、「クニッツドメイン」、「ＫＤ」、その他は本明細書では互換的に使用され てアミノ酸約５８残基のポリペプチドを示し、セリンプロテアーゼ阻害剤ＢＰＴ Ｉ（ウシ膵トリプシン阻害剤；ＣｒｅｉｇｈｔｏｎとＣｈａｒｌｅｓ、（１９８ ７年）、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉ ｏｌ．、５２巻：５１１〜５１９頁）とシステイン残基の保存によって特徴付け られ、最初に結晶型で１９３６年に分離されたものである（Ｋｕｎｉｔｚ，Ｍ． とＮｏｒｔｈｏｐ，Ｊ．Ｈ．、（１９３６年）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ． 、１９巻：９９１〜１００７頁）。クニッツドメインはシステイン残基の配置、 ３次元折り畳み、および構造的特徴を共有する。一群の蛋白質が１個、２個また は３個のクニッツドメインを含むことが確認されている。この群には；ＬＡＣＩ （リポ蛋白質−関連凝固阻害剤；ＴＦＰＩとも呼ばれる；Ｂｒｏｚｅ，Ｊｒ．Ｇ ．Ｊ．ほか、（１９９０年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９巻：７５３９〜 ７５４ ６頁）；ＡＰＰＩ（アルツハイマーアミロイドβ−蛋白質前駆体；Ｈｙｎｅｓ， Ｔ．Ｒ．、（１９９０年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９巻：１００１８〜 １００２２頁）；ヒトＶＩ型コラーゲンのα−３鎖（ＷＯ９３／１４１１９参照 ）およびインター−α−トリプシン阻害剤（Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ，Ｋ．Ｅ ．、（１９８５年）、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ、３６６ 巻：４７３頁）を包含する。 クニッツドメインは特異的間隔をあけてシステイン６個を含み、これが天然に はジスルフィド結合として存在する（Ｂｏｄｅ，Ｗ．とＨｕｂｅｒ，Ｒ．、（１ ９９２年）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０４巻：４３３〜４５１頁）。 このジスルフィド橋３個が蛋白質を安定化し、クニッツドメインの第三次元的折 り畳み特性の原因の一部である。５８残基クニッツ型セリンプロテアーゼＢＰＴ ＩおよびＡＰＰＩでは、システインは第５、１４、３０、３８、５１および５５ 位に存在する。ジスルフィド橋１個を除去しても構造的に著しい変化は伴わない （Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔ，Ｃ．ほか（１９９０年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ・Ｅｎｇ．、 ３巻：５９１〜５９８頁。 クニッツドメイン型セリンプロテアーゼ阻害剤の結晶構造はＢＰＴＩおよびＡ ＰＰＩ（Ｈｙｎｅｓ，Ｔ．Ｒ．ほか（１９９０年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２９巻 ：１００１８〜１００２２）について決定された。中心にある逆平行的な３本鎖 のβ−シートおよびＣ−末端のα−ヘリックスがこのドメインのコアを形成する （Ｂｏｄｅ，Ｗ．とＨｕｂｅｒ，Ｒ．、前出）。このコアドメインのセグメント が正しく折り畳まれた蛋白質の露出した一次結合ループを支える骨格を形成する （本明細書中に定義する「一次結合ループ」）（Ｂｏｄｅ，Ｗ．とＨｕｂｅｒ， Ｒ．、前出）。第二次結合ループは一次結合ループとともにクニッツドメインと 同族プロテアーゼ標的との間の接触面を規定することに関与している（Ｒｕｅｈ ｌｍａｎ，Ａ．ほか、（１９７３年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、７７巻：４１ ７〜４３６頁）。 クニッツドメインの「一次結合ループ」（ＡＰＰＩの１１〜１９残基）は Ｐ₅−Ｐ₄−Ｐ₃−Ｐ₂−Ｐ₁−Ｐ₁'−Ｐ₂'−Ｐ₃'−Ｐ₄' で表される。用語「Ｐ₁」は本明細書では前記で定義したこのセリンプロテアー ゼ阻害剤の切断されるペプチド結合に先行する位置を示すために使用する。同様 にして「Ｐ₁'」はこの阻害剤の切断されるペプチド結合の後の位置を示すために 使用する。数字が増すものはペプチド切断結合の前方（たとえばＰ₂およびＰ₃） および後方（たとえばＰ₂'およびＰ₃'）に連続する順番の位置を示す。残基番号 はＰ₁位が残基１５であるようにＢＰＴＩのものに対応している。 ＦＶＩＩａを参照して本明細書使用する用語「活性部位」その他は触媒的部位 およびチモーゲン基質の結合部位を示し、ＦＶＩＩａの「Ｓ₁」部位を含み、こ の語はＳｃｈｅｃｔｅｒ，Ｉ．とＢｅｒｇｅｒ，Ａ．が（１９６７年）、Ｂｉｏ ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２７巻：１５７〜１６２ 頁で命名したものである。 用語「アミノ酸」は本発明の範囲内では天然起源Ｌ−α−アミノ酸または残基 を意味する。各アミノ酸について通常に使用される用語および三文字略号をこの 明細書では使用する（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ａ．Ｌ．、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ」、第２版、７１〜９２頁（１９７５年）、Ｗｏｒｔｈ・Ｐｕｂｌｉｓｈｅ ｒｓ社、ニューヨーク）。本発明実施のモード 本発明のハイブリッド分子は特徴的なドメインを少なくとも２個持っている。 本発明の各分子はＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａの活性部位に結合する第ＶＩＩａ因子活 性部位阻害ドメインおよび補助因子結合部位における蛋白質−蛋白質相互作用に よってＦＶＩＩａ／ＦＶＩＩａに結合する組織因子ドメインを含有する。本発明 に従えば、この活性部位阻害ドメインは組織因子ドメインのＮ−末端に、好まし くは柔軟なアミノ酸リンカードメインを通して、結合する。 １．組織因子ドメイン 本発明合成物の組織因子ドメインは、例えば哺乳類組織因子蛋白質のアミノ酸 配列へのアミノ酸置換、挿入、または欠失によるもの、または脱グリコシル化ま たは非グリコシル化組織因子分子を含むグリコシル化変異によるものなど、組織 因子蛋白質の変異体の一つであって、少なくとも第ＶＩＩ因子／第ＶＩＩａ因子 に結合する性能を保持しながら、組織因子が血液凝固を誘導する性能を中和する ことができる。特定の態様では、ＦＶＩＩａとの複合体にある時のＴＦドメイン は第Ｘ因子から第Ｘａ因子生成物への変換を触媒する性能が低下している。そこ で本発明の組織因子ドメインは、これに限定するものではないが、第ＶＩＩ因子 ／第ＶＩＩａ因子の補助因子結合部位について野生型組織因子と競合し、そこで 血液凝固カスケードで野生型組織因子が補助因子として作用するのを中和または 予防するものと信じられる。 本発明の組織因子ドメインは存在する組織因子蛋白質が外因性凝固経路を経て 血液凝固を誘導することを阻害または中和することができる（Ｂａｃｈ，Ｒ．、 （１９８８年）、ＣＲＣ・Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２３巻：３３ ９〜３６８頁参照）。熟練した専門家は認識することになるが、用語「中和」は 相対的な用語である。そこで本発明の組織因子ドメインの生物学的活性を記述す るために使用する時には、用語「中和する」は標準的クロモーゲン検定法（Ｒｏ ｙ，Ｓ．、（１９９１年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻：４６６５〜 ４６６８頁；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｄ．ほか、（１９８８年）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎ ｖｅｓｔ．、８２巻：２０６〜２１２頁参照）において野生型組織因子に１０倍 モル過剰に添加する時に第ＶＩＩ因子およびその他の必要な試薬の存在下に第Ｘ 因子から第Ｘａ因子への変換を少なくとも５０％阻害する組織因子蛋白質変異体 を意味する。この組織因子ドメインは５倍モル過剰で少なくとも５０％阻害する ものが好ましく、２倍モル過剰で少なくとも５０％阻害するものがさらに好まし いことになる。さらに好適な態様では本発明の組織因子ドメインは野生型の組織 因子蛋白質と１：１化学量論的比率で存在する時に第Ｘ因子から第Ｘａ因子への 変換を少なくとも５０％阻害する。本発明によればＴＦドメインはこれに限定す るものではないが、全長の燐脂質会合組織因子ドメインであって膜貫通ドメイン と細胞質ドメインを有するものならびに野生型組織因子の膜貫通ドメインおよび ／または細胞質ドメインの全部または一部が欠失したＴＦドメインを包含する。 従って、前記クロモーゲン検定法で本発明ＴＦドメインの生物学的活性を測定す るに際し、野生型組織因子の型は特定被験ＴＦドメインに対応させる。それ故、 野生型組織因子の膜貫通ドメインの全部または一部を含み、また燐脂質会合全長 ＴＦドメインは類似した燐脂質環境下において膜貫通ドメインの全部または一部 を含む対応する型の野生型ＴＦとの生物学的検定で検査する。同様にして膜貫通 ドメインおよび細胞質ドメインを除去した可溶性ＴＦドメインは膜貫通ドメイン および細胞質ドメインを除去した野生型ＴＦドメインで検定する。 本蛋白質がＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａに結合することが本発明ＴＦドメインの特徴 である。従って本発明のＴＦドメインは野生型ＴＦ蛋白質とＦＶＩＩ／ＦＶＩＩ ａへのＴＦの結合に必要な残基を共有する。「ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａへの結合」 は本発明のＴＦドメインは生理学的濃度での結合についてＴＦドメインが野生型 ＴＦと競合できる程度にＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａに結合する性能を持つことを意味 する。ＴＦドメインの中で好適なものはたとえばＫｅｌｌｅｙほか、（１９９５ 年）、前出、に記載のような標準的な結合検定法によって測定するとＦＶＩＩ／ ＦＶＩＩａについて約１０．０ピコモル（ｐＭ）と約１マイクロモル（μＭ）と の間のＫＤを持つものである。さらに好ましくはこのＴＦドメインはＦＶＩＩ／ ＦＶＩＩａについて約１０ｐＭと約１０ナノモル（ｎＭ）との間、最も好ましく は約１０ｐＭと１ｎＭとの間のＫＤを持つ。 熟練した専門家はＦＶＩＩａ結合に寄与するＴＦの残基を認識することになる （Ｋｅｌｌｅｙほか、（１９９５年）、前出；Ｇｉｂｂｓほか、（１９９４年） 、前出；Ｒｕｆほか、（１９９４年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３巻：１ ５６５〜１５７２頁；Ｓｃｈｕｌｌｅｋほか、（１９９４年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６９巻：１９３９９〜１９０４３頁；Ｍｕｌｌｅｒほか、（１９ ９４年）、３３巻：１０８６４〜１０８６９頁）。本発明によれば、ＴＦドメイ ンは野生型ＴＦと少なくとも前記ＦＶＩＩａ／ＦＶＩＩ結合のために必要な残基 を共有する。好ましくは、この組織因子ドメインは野生型組織因子蛋白質との間 に少なくとも約８０％、さらに好ましくは約８５〜９５％の配列相同性を共有す るものとしたい。 ＴＦドメインはこれに限定するものではないが、膜貫通ドメインおよび細胞質 ドメインの両方を有する全長の膜結合または燐脂質関連組織因子ドメインを包含 する。このＴＦドメインはまた野生型組織因子の膜貫通ドメインおよび／または 細胞質ドメインの全部または一部が欠失する組織因子ドメインも包含する。従っ て、この分子の組織因子ドメインはカルボキシル末端膜アンカー部分および細胞 質部分が除去された可溶性蛋白質としても作成できる。これとは別に、ＴＦ蛋白 質を膜アンカーを有する膜内在性蛋白質としても製造できる。完全な膜アンカー ドメインを持つ組織因子ドメインはリポソーム剤のような燐脂質組成物とともに 提供される。 本発明のＴＦドメインの中で好適なものは、野生型組織因子の膜貫通ドメイン および細胞質ドメインの全部または一部が除かれたＴＦドメインである。本発明 のこの側面に従えば、このＴＦドメインは野生型組織因子のＮ−末端フィブロネ クチンＩＩＩ型ドメインの少なくとも一部を含む。好ましくはこのＴＦドメイン は少なくとも野生型組織因子の１〜１０２位アミノ酸を含む。より好ましくは、 本発明のＴＦドメインは野生型組織因子の両フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン を含む。好ましくは、本発明のこの側面によれば少なくとも野生型ＴＦの１〜２ １９位アミノ酸が存在する。 本発明のＴＦドメインはＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａを結合する性能を保持し、さら に前記の野生型組織因子の凝固促進活性を中和することのできるポリペプチドを 含む。例として、全長野生型ＴＦに沿った特定アミノ酸の置換、挿入または欠失 はＦＶＩＩａに対する補助因子として作用する性能の低下したＴＦ変異体を産生 する。熟練した専門家はＴＦの凝固促進機能に寄与する野生型ＴＦの残基を認識 することになる。例えば１５７〜１６８位アミノ酸の領域にある残基はＴＦ−Ｆ ＶＩＩａの凝固促進機能に寄与する（Ｋｅｌｌｅｙほか、（１９９５年）、前出 ；Ｒｕｆほか、（１９９２年）、前出）が、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ結合には重要 ではない。本発明に従えば、これらのアミノ酸の全部または一部を選択的に置換 するかまたは欠失させて、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａには結合するが野生型組織因子 の凝固促進活性を中和することができるＴＦドメインを提供する。 好適な態様において、野生型組織因子のＴｒｐ１５８、Ｌｙｓ１５９、Ｓｅｒ １６３、Ｇｌｙ１６４、Ｌｙｓ１６５、Ｌｙｓ１６６、およびＴｙｒ１８５残基 の一部または全部を選択的に置換または欠失させて本発明のＴＦドメインを提供 する。好適な置換は米国特許第５３４６９９１号に記載されており、生理学的な ｐＨで実質的に正に帯電した側鎖を有するもの以外のアミノ酸による置換を包含 する。例示的な置換にはＴｒｐ１５８Ｐｈｅ、Ｌｙｓ１５９Ａｌａ、Ｓｅｒ１６ ３Ａｌａ、Ｌｙｓ１６５Ａｌａ、Ｌｙｓ１６６Ａｌａ、およびＴｙｒ１８５Ａｌ ａの一部または全部を含む。本発明の最も好適な側面では、ＴＦ補助因子機能に 重要であるがＦＶＩＩａ複合体形成を阻害しない１６５位および１６６位リジン 残基（Ｒｏｙほか、（１９９１年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻：２ ２０６３頁；Ｒｕｆほか、（１９９２年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７ 巻：６３７５頁）を選択的に置換する。それ故、本発明の好適な側面に従えば、 少なくとも野生型組織因子の１６５位および１６６位の残基を選択的に置換して ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａを結合する性能は保持するが、前記のような補助因子とし て作用する性能が低下した分子を得る。 特定的側面では、これらの残基のアラニン置換は好適である。しかし、ＴＦ− ＦＶＩＩａ複合体が触媒するＦＸ活性化（Ｒｕｆほか、（１９９２年）、前出） の率を低下させるいずれの置換も適当である。１６５位および１６６位のリジン 残基は、ＦＶＩＩａ結合に重要なことが突然変異誘発実験から判明している残基 （Ｋｅｌｌｅｙほか、（１９９５年）、前出）とは反対側の分子表面に存在する ＴＦのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインのＣ−末端に存在する。 本発明の好適な組織因子ドメインは、ここに開示を参考のために特に引用する 「心筋梗塞および凝固障害性疾患の処置に有用な組織因子突然変異体」と題する 米国特許第５３４６９９１号が記載している。この特許は内因性組織因子が血液 凝固を誘導する性能を阻害することのできる組織因子変異体の作製を記載する。 これらの変異体は正に帯電した１６５位と１６６位アミノ酸残基の一方または両 方を生理学的ｐＨで実質的に正に帯電する側鎖を持たないα−アミノ酸で置換し たものである。これらの変異体には野生型組織因子の細胞質部分２４４〜２６３ 残基ならびに膜貫通領域２２０〜２４３残基が除去された前記ヒト組織因子の分 子を含む。これらいずれの組織因子変異体も適切に本発明のＴＦドメインを形成 することもある。国際公表ＷＯ９４／２８０１７号もＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａを結 合することができるが凝固促進性補助因子活性の低下したＴＦ変異体を記載して いる。これに記載された分子の中で最も適当な分子は野生型組織因子蛋白質に相 同的なアミノ酸配列を持つ組織因子蛋白質であって、その分子ではＴＦ補助因子 機能に関連するアミノ酸の少なくとも１個が選択的に置換、欠失または移動され てＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａを結合する性能は保持するが前記補助因子として作用す る性能が低下した分子を与える。 ２．活性部位ドメイン 本発明に従えば、本合成物の「活性部位阻害ドメイン」は第ＶＩＩａ因子活性 部位に指向する阻害剤の数群のいずれかから選択してもよい。これらの活性部位 阻害剤は本発明の目的からは広義に：ｉ）ＦＶＩＩａの活性部位を可逆的に結合 し、第ＶＩＩａ因子によって切断される活性部位阻害剤；ｉｉ）第ＶＩＩａ因子 の活性部位に可逆的に結合するが切断されない活性部位阻害剤；およびｉｉｉ） 第ＶＩＩａ因子活性部位に不可逆的に結合する活性部位阻害剤；に分類される。 セリンプロテアーゼ阻害剤の綜説としては「プロテイナーゼ阻害剤（Ｐｒｏｔｅ ｉｎａｓｅ・Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）」、（細胞および組織生理学における研究 論文集、１２版、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ科学出版社、ニューヨーク、１９９０年）を 参照。 第一の群では、第ＶＩＩａ因子の活性部位に可逆的に結合し、その活性部位で 切断される活性部位阻害ドメインであるクニッツ型およびカザル型セリンプロテ アーゼ阻害剤は好適であり、中でもクニッツ型が最も好適である。可逆的な活性 部位阻害ドメインは、たとえばイオン結合、疎水性相互作用または水素結合のよ うな非共有結合的相互作用によって第ＶＩＩａ因子の活性部位に結合する。熟練 した専門家はクニッツドメインをセリンプロテアーゼに遅く、強固に結合する可 逆的な阻害剤であると認識している。 本発明のクニッツドメイン活性部位阻害ドメインにはいずれの既知哺乳類クニ ッツ型ドメインも包含するが、特にクニッツドメインＡＰＰＩ（ヒトのアルツハ イマー病アミロイドβ−蛋白質前駆体から、Ｃａｓｔｒｏ，Ｍ．ほか、（１９９ ０年）、ＦＥＢＳ・Ｌｅｔｔ．、２６７巻：２０７〜２１２頁）の残基１〜５８ ；ヒトのＴＦＰＩ（組織因子蛋白質阻害剤またはＬＡＣＩ、Ｂｒｏｚｅ・Ｊｒ． Ｇ．Ｊ．ほか、（１９９０年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９巻：７５３９ 〜７５４６頁）のＴＦＰＩ−ＫＤＩ（残基２２〜７９）、ＴＦＰＩ−ＫＤ２（残 基９３〜１５０）およびＴＦＰＩ−ＫＤ３（残基１８５〜２４２）；ヒトのイン ター−α−トリプシン阻害剤（Ｖｅｔｒ，Ｈ．ほか、（１９８９年）、ＦＥＢＳ ・Ｌｅｔｔ．、２４５巻：１３７〜１４０頁）のＩＴＩ−ＫＤＩおよびＩＴＩ− ＫＤ２（残基２２〜７９および７８〜１３５）；コラーゲンα３（ＶＩ）鎖前駆 体（Ｃｈｕ，Ｍ．Ｌ．、（１９９０年）ほか、ＥＭＢＯ・Ｊ．、９巻：３８５〜 ３９３頁）のコラーゲンα３（ＶＩ）（残基２８９９〜２９５６）；ヒトのクニ ッツ型プロテアーゼ阻害剤ＨＫＩＢ９（Ｎｏｒｒｉｓ，Ｋ．、Ｇｅｎｂａｎｋデ ータベース、（１９９３年１２月３１日、リリース３９．０）、１９９４年１月 １９日付託）のＨＫＩＢ９（７〜６０）；ＢＰＴＩ（１〜５８）、アプロチニン ；ウシ塩基性膵トリプシン阻害剤（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．とＣｈａｒｌ ｅｓ，Ｉ．Ｇ．、（１９８７年）、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｓ ｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、５２巻：５１１〜５１９頁）；を包含する。 クニッツ型セリンプロテアーゼの中で好適なものはＦＶＩＩａに十分な親和性で 結合してこの分子を可逆的に阻害する分子である。これはクニッツ型ドメインが ＦＶＩＩａに結合して常用の検定法（下記）によって測定されるＦＶＩＩａの触 媒的作用を阻害することができることを意味する。このような分子はＴＦ−ＦＶ ＩＩａに関する見掛けの解離定数（Ｋ₁*）が約１００ｎＭまたはそれ以下、より 好まし くはこの分子は見掛けの解離定数約１０ｎＭまたはそれ以下を有する。クニッツ 型のドメインの中で最も好適なものはＴＦ−ＦＶＩＩａについて約５ｎＭまたは それ以下のＫ₁*を持つものである。 見掛けの平衡解離定数（Ｋ₁*）はクニッツ型ドメインとＦＶＩＩａセリンプロ テアーゼとの相互作用について観察（Ｂｏｄｅ，Ｗ．とＲ．Ｈｕｂｅｒ）（１９ ９２年）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０４巻：４３３〜４５１頁；Ｌａ ｓｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．Ｊｒ．とＩ．Ｋａｔｏ、（１９８０年）、Ａｎｎｕ．Ｒｅ ｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４９巻：５９３〜６２６頁）されているような、強固に 結合する阻害剤について酵素および阻害剤が可逆的な１：１化学量論的複合体を 形成すると仮定して誘導した方法（Ｂｉｅｔｈ，Ｊ．、（１９７４年）、Ｐｒｏ ｔｅｉｎａｓｅ・Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、４６３〜４６９頁；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ，Ｊ．Ｗ．とＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｆ．、（１９７９年）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ ｙｍｏｌ．、６３巻：４３７〜４６７頁）を用いて測定する。得られたデータは 非線形回帰分析によって等式１： ［式中、Ｖ_i／Ｖ₀は活性率（安定状態の阻害速度を非阻害速度で割った商）であ る；［Ｅ₀］は全ＦＶＩＩａ濃度である；および［Ｉ₀］は全阻害剤濃度である］ に適合させる。 これらに限定するものではなく例示として好適なクニッツ型ドメインはアミノ 酸５８個の骨格構造を持ち、その１１〜１９位アミノ酸はセリンプロテアーゼの 活性部位に適合する一次結合ループに対応する。一次結合ループにある特定アミ ノ酸配列を有するクニッツ型ドメインは前記のように好適な阻害を示す。前記の ように第ＶＩＩａ因子の好適な阻害を示す例示的なクニッツドメインはＰ５位に Ｐｒｏ；Ｐ４位にＧｌｙ；Ｐ３位にＰｒｏ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＴｒｐ；Ｐ２ 位にＣｙｓ；Ｐ１位にＡｒｇ、ＬｙｓまたはＭｅｔ；Ｐ1'位にＡｌａ；Ｐ2'位に Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＩｌｅ；Ｐ3'位にＭｅｔ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＴｙｒ； およびＰ4'位にＬｅｕ、ＬｙｓまたはＡｒｇを持つクニッツ型ドメインである。 本発明による好適なクニッツ型ドメインは、３４位（Ｐ19'）Ｐｈｅ、Ｖａｌ、 Ｉｌｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒ；３８位（Ｐ23'）Ｃｙｓ；および３９位（Ｐ24'） Ｈｉｓ)ＴｙｒまたはＧｌｙによっても特徴付けられる。 例示的なクニッツ型活性部位阻害ドメインは国際公表ＷＯ９５／２３８６０号 にも記載され、構造式Ｉ：によって表される。 この式によれば、Ｐ５〜Ｐ４’、Ｐ１９’、Ｐ２３’およびＰ２４’は前記の ものから選択され、Ｒ₁はＡＰＰＩのアミノ酸１〜１０、ＶＲＥＶＣＳＥＱＡＥ （配列番号１）；ＴＦＰＩ−ＫＤ１のアミノ酸２２〜３１、ＭＨＳＦＣＡＦＫＡ Ｄ（配列番号２）；ＴＦＰＩ−ＫＤ２のアミノ酸９３〜１０２、ＫＰＤＦＣＦＬ ＥＥＤ（配列番号３）；ＴＦＰＩ−ＫＤ３のアミノ酸１８５〜１９４、ＧＰＳＷ ＣＬＴＰＡＤ（配列番号４）；ＩＴＩ−ＫＤ１のアミノ酸２２〜３１、ＫＥＤＳ ＣＱＬＧＹＳ（配列番号５）；ＩＴＩ−ＫＤ２のアミノ酸７８〜８７、ＴＶＡＡ ＣＮＬＰＩＶ（配列番号６）；ＨＫＩＢ９のアミノ酸１〜１０、ＬＰＮＶＣＡＦ ＰＭＥ（配列番号７）；およびＢＰＴＩのアミノ酸１〜１０、ＲＰＤＦＣＬＥＰ ＰＹ（配列番号８）から選択される。 Ｒ₂はＡＰＰＩのアミノ酸２０〜３３、ＲＷＹＦＤＶＴＥＧＫＣＡＰＦ（配列 番号９）；ＴＦＰＩ−ＫＤ１のアミノ酸４１〜５４、ＲＦＦＦＮＩＦＴＲＱＣＥ ＥＦ（配列番号１０）；ＴＦＰＩ−ＫＤ２のアミノ酸１１２〜１２５、ＲＹＦＹ ＮＮＱＴＫＱＣＥＲＦ（配列番号１１）；ＴＦＰＩ−ＫＤ３のアミノ酸２０４〜 ２１７、ＲＦＹＹＮＳＶＩＧＫＣＲＰＦ（配列番号１２）；ＩＴＩ−ＫＤ１のア ミノ酸４１〜５４、ＲＹＦＹＮＧＴＳＭＡＣＥＴＦ（配列番号１３）；ＩＴＩ− ＫＤ２のアミノ酸９７〜１１０、ＬＷＡＦＤＡＶＫＧＫＣＶＬＦ（配列番号１４ ）；コラーゲンα３（ＶＩ）のアミノ酸２９１８〜２９３１、ＫＷＹＹＤＰＮＴ ＫＳＣＡＲＦ（配列番号１５）；ＨＫＩＢ９のアミノ酸２０〜３３、ＲＷＦＦＮ Ｆ ＥＴＧＥＣＥＬＦ（配列番号１６）；およびＢＰＴＩのアミノ酸２０〜３３、Ｒ ＹＦＹＮＡＫＡＧＬＣＱＴＦ（配列番号１７）から選択される。 Ｒ₃はＹＧＧおよびＹＳＧの群から選択される。 Ｒ₄はＡＰＰＩのアミノ酸４０〜５８、（Ｍｅｔ５２Ａｌａ）ＧＮＲＮＮＦＤ ＴＥＥＹＣＡＡＶＣＧＳＡ（配列番号１８）；ＡＰＰＩのアミノ酸４０〜５８、 ＧＮＲＮＮＦＤＴＥＥＹＣＭＡＶＣＧＳＡ（配列番号１９）；ＴＦＰＩ−ＫＤ１ のアミノ酸６１〜７９、ＧＮＱＮＲＦＥＳＬＥＥＣＫＫＭＣＴＲＤ（配列番号２ ０）；ＴＦＰＩ−ＫＤ２のアミノ酸１３２〜１５０、ＧＮＭＮＮＦＥＴＬＥＥＣ ＫＮＩＣＥＤＧ（配列番号２１）；ＴＦＰＩ−ＫＤ３のアミノ酸２２４〜２４２ 、ＧＮＥＮＮＦＴＳＫＱＥＣＬＲＡＣＫＫＧ（配列番号２２）；ＩＴＩ−ＫＤ１ のアミノ酸６１〜７９、ＧＮＧＮＮＦＶＴＥＫＥＣＬＱＴＣＲＴＶ（配列番号２ ３）；ＩＴＩ−ＫＤ２のアミノ酸１１７〜１３５、ＧＮＧＮＫＦＹＳＥＫＥＣＲ ＥＹＣＧＶＰ（配列番号２４）；コラーゲンα３（ＶＩ）のアミノ酸２９３８〜 ２９５６、ＧＮＥＮＫＦＧＳＱＫＥＣＥＫＶＣＡＰＶ（配列番号２５）；ＨＫ１ Ｂ９のアミノ酸４０〜５８、ＧＮＳＮＮＦＬＲＫＥＫＣＥＫＦＣＫＦＴ（配列番 号２６）；およびＢＰＴＩのアミノ酸４０〜５８、ＡＫＲＮＮＦＫＳＡＥＤＣＭ ＲＴＣＧＧＡ（配列番号２７）から選択される。 好適なクニッツ型活性部位阻害ドメインにおいて、Ｒ₁は配列ＶＲＥＶＣＳＥ ＱＡＥ（配列番号１）、Ｒ₂は配列ＲＷＹＦＤＶＴＥＧＫＣＡＰＦ（配列番号９ ）；Ｒ₃は配列ＹＧＧ；およびＲ₄は配列ＧＮＲＮＮＦＤＴＥＥＹＣＡＡＶＣＧＳ Ａ（配列番号１８）またはＧＮＲＮＮＦＤＴＥＥＹＣＭＡＶＣＧＳＡ（配列番号 １９）を持つ。 それ故、好適なクニッツ型活性部位阻害ドメインには次表のものを含む： 当業者はクニッツ型活性部位阻害ドメインについてはクニッツ型ドメインの全 部または一部を本発明の活性部位阻害ドメインとして使用してもよいことを理解 するであろう。十分な親和性で可逆的に結合してＦＶＩＩａを阻害するクニッツ ドメインのいかなる部分も第ＶＩＩａ因子活性部位ドメインとするのに十分であ る。このような分子は一般的にクニッツドメインの少なくともＰ₁およびＰ₁'残 基を含み、好ましくはクニッツドメインの一次結合ループのＰ₅からＰ₄'までを 含有する。 本発明の活性部位阻害基は不可逆的なＦＶＩＩａセリンプロテアーゼ阻害剤で あってもよい。そのような不可逆的活性部位阻害ドメインは一般に第ＶＩＩａ因 子活性部位と共有結合を形成する。このような不可逆的阻害剤には一般的なセリ ンプロテアーゼ阻害剤、たとえばぺプチドクロロメチルケトン（Ｗｉｌｌｉａｍ ｓほか、（１９８９年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４巻：７５３６〜７ ５４０頁参照）またはぺプチジルクロロメタン；アザペプチド；たとえば種々の グアニジノベンゾエート誘導体および３−アルコキシ−４−クロロイソクマリン のようなアシル化剤；たとえばフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳ Ｆ）、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＥＰ）、トシルプロピルクロロ メチルケトン（ＴＰＣＫ）およびトシルリジルクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ） のようなスルホニルフルオリド；ニトロフェニルスルホネートおよび関連化合物 ；たとえばイソクマリンおよびクマリンのようなへテロ環状プロテアーゼ阻害剤 を包含する。 ３．リンカー 本発明によれば、組織因子ドメインは好ましくはそのＮ−末端が、柔軟なリン カードメインを介して、ハイブリッド分子のＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ活性部位阻害 ドメインに結合する。本発明ハイブリッド分子のリンカー成分は必ずしも分子の ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａへの結合に関与する必要はない。それ故本発明によればこ のリンカードメインはＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ活性部位阻害ドメインと組織因子ド メインとの間を空間的橋渡しするこの分子の中のいずれかの基である。 このリンカードメインは様々な長さと仕様のものであってもよいが、しかしな がら、本発明によれば重要なのはリンカードメインの長さであってその構造では ない。このリンカードメインはハイブリッド分子の活性部位ドメインをＦＶＩＩ ／ＦＶＩＩａのセリンプロテアーゼ活性部位溝に適合させ、その分子の組織因子 ドメインをＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ分子にあるＴＦ結合部位に結合させるものが好 ましい。それ故に、リンカードメインの長さはこのハイブリッド分子の「機能」 ドメイン２個の特性に依存する。 この分野の熟練者は距離の知られた種々の結合に基づいて（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ とＢｏｙｄ「有機化学（Ｏｒｇａｎｉｃ・Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、３版、Ａｌ ｌｙｎとＢａｃｏｎ社、ボストン、ＭＡ（１９７７年））、様々な原子の結合が 様々な長さの分子を提供することを認識することになる。例えば、リンカードメ インは様々な長さのポリペプチドであってもよい。このポリペプチドのアミノ酸 組成はリンカーの特性および長さを決定する。好適な態様では、リンカー分子は 柔軟で親水性のポリペプチド鎖を構成する。例としては、このリンカードメイン は［（Ｇｌｙ）₄−Ｓｅｒ］単位を１個またはそれ以上含有する。 好適な側面では、活性部位阻害ドメインはクニッツ型セリンプロテアーゼ阻害 剤であり、ＴＦドメインはｈＴＦＡＡであって、リンカードメインは約３０Åま たはそれ以上の距離をへだてるアミノ酸５個から３５個までの間を含むポリペプ チドである。より好ましくは、このリンカーは２０個から３０個までの間のアミ ノ酸を含む約６０Åまたはそれ以上の距離をへだてる。最も好ましくはこのリン カーはアミノ酸約２２個から２７個のポリペプチドであって、約４個から５個の ［（Ｇｌｙ）₄−Ｓｅｒ］単位を含む。 ４．合成 本発明のハイブリッド分子は当技術分野でよく知られている様々な技術によっ て合成してもよい。これらには組換えＤＮＡ技術、固相合成、液相合成、有機化 学合成技術またはこれらの技術の組合せを含む。合成法の選択は作製すべき特定 分子に依存することになる。例えば、態様の一つでは本発明のハイブリッド分子 は本質が完全な「蛋白質」ではなく、組換え技術および液相技術の組合せによっ て合成される。 例えば、アミノ酸または蛋白質部分および非蛋白質部分の双方を含む本発明の ハイブリッド分子の合成では一般に分子の蛋白質部分を下記のような組換え技術 で合成し、続いて分子の非蛋白質部分を固相または液相法によって蛋白質部分に 結合してこの分子を得る。 この分子の蛋白質部分と非蛋白質部分の結合には化学的結合法が好適である。 この操作法ではたとえば反応性基を１個またはそれ以上有して蛋白質および非蛋 白質分子の部位１個所以上と反応できる分子のような慣例的な交差結合試薬を採 用する。生体内で非癌原性で非毒性であって実質的に非免疫原的性質を持ち生適 合性のある交差結合剤が好適である。典型的にはこの交差結合剤は分子の蛋白質 部分にあるアミノ基またはスルフヒドリル基と、非蛋白質部分にあるヒドロキシ ル、アミノ、アルデヒドまたはカルボン酸基とで共有結合的に結合する。分子を 交差結合する方法に関する綜説はＭｅａｎｓとＦｅａｎｅｙ、（１９９０年）、 Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ・Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１巻：２〜１２頁に記載され ている。 本発明のハイブリッド蛋白質の組換え合成のための蛋白質をコードするＤＮＡ を製造するために採用しうる様々な技術がある。例えば得られる蛋白質のアミノ 酸配列における変化をコードする天然起源ＤＮＡ配列に基づいてＤＮＡを誘導す ることが可能である。この突然変異体ＤＮＡを相互に連結して本発明のハイブリ ッド分子を得るために使用できる。これらの技術は単純化された形で組織因子ド メインをコードする遺伝子および、たとえば構造式Ｉで示されるクニッツ型ドメ インのような活性部位阻害ドメインをコードする遺伝子を得；この遺伝子を、た とえば以下に記述するような組換え技術によって修正し；これらの遺伝子を種々 の長さのリンカーモジュールをコードする遺伝子を隔てて適当な発現べクターに 挿入し；このベクターを適当な宿主細胞に挿入し：この宿主細胞を培養してハイ ブリッド分子の発現を起こさせ;そこに産生された分子を精製すること；を意図 している。 これより幾分か特定的なものでは、本発明の双官能分子をコードするＤＮＡ配 列はＤＮＡ配列の合成的構築によって得られる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ほか、 「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、第２版、Ｃｏ ｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．、（１９ ８９年））。 例えば、野生型組織因子をコードする発現べクターを得、部位特異的突然変異 誘発（Ｋｕｎｋｅｌほか、（１９９１年）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２０ ４巻:１２５〜１３９頁；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ほか、（１９８６年）、Ｎｕｃｌ ｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、１３巻：４３３１頁；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ． ほか（１９８２年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、１０巻：６４８ ７頁）、カセット突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．ほか、（１９８５年）、 Ｇｅｎｅ）、３４巻：３１５頁）または制限選択突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓ，Ｊ ．Ａ．ほか、（１９８６年）、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎ ｄｏｎ・Ｓｅｒ．Ａ．、３１７巻：４１５頁）に付してこの分子の組織因子ドメ インを得る。次に、突然変異体ＤＮＡを使用して活性部位阻害ドメインをコード するＤＮＡを含む発現ベクターに挿入しうる。次に同じ発現べクターに、たとえ ば［（Ｇｌｙ）₄−Ｓｅｒ］単位１個またはそれ以上のように様々な長さのリン カードメインをコードするＤＮＡ配列を挿入しうる。 オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発は本発明の組織因子変異体およびクニッ ツ型活性部位阻害ドメインをコードするＤＮＡを製造するに好適な方法である。 この技術は当技術分野でよく知られており、Ａｄｅｌｍａｎｎほか、（１９８３ 年）、ＤＮＡ)第２巻：１８３頁に記載されている。略述すれば、野生型の組織 因子または例えばＡＰＰＩなどのクニッツ型ドメインの在来型または非変換型の ＤＮＡをＤＮＡ鋳型への所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドにハイ ブリッド化させることによって変化させる。なお、その鋳型は無変化または在来 型ＤＮＡ配列を含むプラスミドまたはバクテリオファージ１本鎖型である 次にこれらの変異体をコードするＤＮＡをリンカードメインをコードするＤＮ Ａ配列を隔てて適当なプラスミドまたはべクターに挿入する。このベクターを用 いて宿主細胞を形質転換する。一般に宿主細胞に適合する種に由来する複製配列 および制御配列を含むプラスミドベクターをそれら宿主に使用する。通常、この ベクターは複製部位ならびに形質転換細胞での表現型選択を可能にしうる蛋白質 をコードする配列を有する。 例えば、大腸菌は大腸菌の１種から誘導したプラスミド、ｐＢＲ３２２（Ｍａ ｎｄｅｌ，Ｍ．ほか、（１９７０年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５３巻：１５ ４頁）を使用して形質転換するとよい。プラスミドｐＢＲ３２２はアンピシリン およびテトラサイクリン耐性遺伝子を含有し、選択のために簡単な方法を提供す る。その他のベクターにはたとえば発現で重要になることが多い様々なプロモー ターのような様々な特徴を含む。例えば、プラスミドｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ ７２０、およびｐＰＬ−ラムダはｔａｃ、ｔｒｐ)およびＰ_L−プロモーターを 有し、現在入手可能な（Ｐｈａｒｍａｃｉａ・Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社） 発現ベクターを代表する。 その他の好適なベクターは標準的な技術を用いて本明細書に記載するべクター の適切な特質を組合せることによって構築できる。このべクターの適切な特質に はプロモーター、リボソーム結合部位、変異体遺伝子または遺伝子融合、シグナ ル配列、抗生物質耐性マーカー、コピー数、および適当な複製開始点を含む。 大腸菌ではクニッツドメインは無処理分泌蛋白質（Ｃａｓｔｒｏ，Ｍ．ほか、 （１９９０年）、ＦＥＢＳ・Ｌｅｔｔ．、２６７巻：２０７〜２１２頁）、細胞 内発現蛋白質（Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ほか、（１９９１年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ ・Ｅｎｇ．、４巻：５９３〜６００頁）または融合蛋白質（Ｓｉｎｈａ，Ｓ．ほ か、（１９９１年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻：２１０１１〜２１ ０１３頁；Ｌａｕｒｉｔｚｅｎ，Ｃ．ほか、（１９９１年）、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ ｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．、２巻：３７２〜３７８頁；Ａｕｅｒｓｗａｌｄ，Ｅ． Ａ．ほか、（１９８８年）、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ、 ３６９巻：２７〜３５頁）として発現されている。 この宿主細胞は原核生物でも真核生物でもよい。原核生物はＤＮＡ配列をクロ ーニングおよび発現して親ポリエプチド、セグメント置換ポリペプチド、残基置 換ポリペプチドおよびポリペプチド変異体を産生するために好適である。例えば 大腸菌Ｋ１２の２９４株（ＡＴＣＣ３１４４６）は大腸菌Ｂ株、大腸菌Ｘ１７７ ６株（ＡＴＣＣ３１５３７）、大腸菌ｃ６００およびｃ６００ｈｆ１株、大腸菌 Ｗ３１１０株（Ｆ−、ガンマー、原栄養／ＡＴＣＣ２７３２５）、たとえば枯草 菌のようなバチルス属菌、およびたとえばサルモネラ・ティフムリウムまたはセ ラチア・マルセッセンスのようなその他の腸内細菌科の菌および種々のシュード モナス種と同様に使用できる。好適な原核生物は大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ ２７３２５）である。原核生物で発現すると、このポリペプチドは典型的にはＮ −末端メチオニンまたはホルミルメチオニンを含み、グリコシル化はされない。 勿論これらの例は限定ではなく、例示である。 原核生物の他に、たとえば酵母培養物または多細胞生物から誘導した細胞のよ うな真核生物を使用してもよい。原理的にそのような細胞培養物はいずれも作動 可能である。しかしながら、脊椎動物細胞が最も関心が高く、培養物中での脊椎 動物細胞の増殖（組織培養）が再現性ある操作法になっている（「組織培養（Ｔ ｉｓｓｕｅ・Ｃｕｌｔｕｒｅ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ・Ｐｒｅｓｓ社、Ｋｒｕｓ ｅとＰａｔｔｅｒｓｏｎ編、［１９７３年］）。このような有用な宿主細胞系統 の例にはＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ） 細胞系統、Ｗ１３８、２９３、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７およびＭＤＣＫ細胞系統があ る。クニッツドメインを製造するために酵母発現系が使用されている（Ｗａｇｎ ｅｒ，Ｓ．Ｌ．ほか、（１９９２年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ ｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１８６巻：１１３８〜１１４５頁；Ｖｅｄｖｉｃｋ，Ｔ. ほか、（１９９１年）、Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７巻：１９ ７〜２０２頁）。特に酵母Ｐｉｃｈｉａ・ｐａｓｔｏｒｉｓはＳａｃｃｈａｒｏ ｍｙｃｅｓ・ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ・α・のメーティング因子のプレプロシグナ ル配列とＰｉｃｈｉａ・ｐａｓｔｏｒｉｓのアルコールオキシダーゼＡＯＸ１プ ロモーターおよび終結配列とを用いて成功裏に使用された。他の酵母発現べクタ ーおよび異種蛋白質を発現するために通常使用する宿主も意図している。 ５．組成物 ＴＦドメインおよびＦＶＩＩａ活性部位ドメインを含む本発明のハイブリッド 分子は典型的には意図する使用に適する組成物の形で提供する。ＴＦドメインを 含む本発明のハイブリッド分子はたとえば本明細書に記載するｈＴＦＡＡ型のよ うな可溶性の形に製造できる。本発明のこの側面によれば本分子の組織因子ドメ インを膜アンカーなしにして製造する。これとは別に組織因子ドメインは膜アン カーのある全長膜会合型としても製造できる。 本発明のハイブリッド分子は野生型組織因子の膜貫通ドメインの全部または一 部を含むＴＦドメインを含んでいてもよい。本発明によれば膜アンカードメイン を含むＴＦドメインを含む二官能性分子を穏やかな界面活性剤または燐脂質（Ｐ Ｌ）を含む組成物に形成することは好適である。膜アンカーまたは膜貫通ドメイ ンを含む全長ＴＦドメインを有する本発明の組成物はその生物学的活性を維持し ており、好ましくは燐脂質とともに製剤化する。国際公表ＷＯ９４／２８０１７ 号は本発明の組成物に適当であるＴＦドメインを含む燐脂質組成物の調製を記載 している。 ＷＯ９４／２８０１７号に記載されており、本発明医薬的組成物に適する好適 な組成物は最高の安定性および生物学的活性を与える燐脂質組成物である。この 燐脂質組成物は当技術分野で一般によく知られているように好ましくはリポソー ム組成物として形成するように製剤化する。記載のように、本発明のリポソーム 組成物に使用するために適当な燐脂質は炭素原子１２個から２０個を有する飽和 または不飽和の脂肪酸を含む物を包含する。本発明によって使用するための好適 な燐脂質にはホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン （ＰＥ）、ホスファチジルグリセリン（ＰＧ）およびホスファチジルセリン（Ｐ Ｓ）を包含する。これらの燐脂質はいずれの天然起源から由来してもよく、その 燐脂質はそれ自体として異なる脂肪酸を有する分子から構成されていてもよい。 異なる起源からの燐脂質からなる燐脂質混合物を使用してもよい。例えばＰＣ、 ＰＧおよびＰＥは卵黄から製造してもよく；ＰＳは動物の脳および脊髄から製造 してもよい。これらの燐脂質は同様にして合成的起源から由来してもよい。この 燐脂質を適当な比率で好都合に混合して、本発明組成物を製造するために用いる 燐脂質混合物を製造する。 リポソームの製造法は一般によく知られており既に記載されている。リポソー ムの製法の例示にはリポソームの逆添加（米国特許第５１０４６６１号参照）、 または脂質ベシクルへのアンホテリシンＢの混入について記載された様式を含む （たとえばＬｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｎｓｔｅｉｎほか、（１９８５年）、Ｊ．Ｉｎ ｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１５１巻：７０４〜７１０頁；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｎｓ ｔｅｉｎ、（１９８７年）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ・Ｃｈｅｍｏ ｔｈｅｒ．、３１巻：６７５〜６７８頁；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｎｓｔｅｉｎほ か、（１９８４年）、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１５０巻：２７８〜２８３ 頁；およびＭｅｈｔａほか、（１９８４年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ ．Ａｃｔａ、７７０巻：２３０〜２３４頁参照）。サーキュレーション時間の強 化 されたリポソームは米国特許第５０１３５５６号に記載されているようにして製 造してもよい。 こうして態様の一つでは、本発明はリポソームの形におけるハイブリッド分子 の製造法であって、その分子がＴＦドメイン部分を有し、そのリポソームの脂質 性二層とともにＴＦ膜アンカードメインが二層性脂質を経て挿入されているよう なものを意図している。 本発明の他の適当な組成物は医薬的に許容される担体を有する前記組成物のい ずれをも包含するが、その担体の性質は例えば経口投与には通常固体担体、血管 内投与には液体塩溶液担体など投与方法によって異なる。 本発明の組成物は本発明の対象および本発明の蛋白質に適合する医薬的に許容 される成分を含む。これらは一般に懸濁剤、液剤およびエリキシール剤および特 にたとえば燐酸緩衝食塩水、食塩水、ダルベッコの培地、その他のような生物学 的緩衝液を包含する。エアロゾルを使用してもよく、または澱粉、糖類、微結晶 性セルロース、希釈剤、顆粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、その他（経口投与用 固体製剤の場合には、たとえば粉剤、カプセル剤および錠剤のようなもの）を使 用してもよい。 本明細書で使用する用語「医薬的に許容される」は一般的に連邦または州政府 の規制機関が承認したものまたは米国薬局方に列記されているもの、またはその 他の一般に認識されている動物、特にヒトに使用するための調剤書に列記されて いるものを意味する。 選択すべき製剤化は種々の前記緩衝液または、例えば医薬級マンニトール、乳 糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウムセルロース、炭酸 マグネシウム、その他、を包含する添加剤をも使用して達成できる。本組成物の 「ＰＥＧ化」は当技術分野で知られている技術（例えば、国際特許公表ＷＯ９２ ／１６５５５号；Ｅｎｚｏｎへの米国特許第５１２２６１４号；および国際特許 公表ＷＯ９２／００７４８号参照）を使用して達成してもよい。経口用組成物は 液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続性放出剤、または粉剤の形であっ てもよい。 ６．治療法 本発明の双官能性分子はＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体の生物学的作用を予防する目 的で治療に使用できる。ＴＦ−ＦＶＩＩａの阻害はＴＦ−ＦＶＩＩａ依存性血液 凝固の低下を意図する時に望ましい。これに限定するものではないがこれらの症 例には血栓溶解療法に伴う動脈再血栓症の予防を含む。ＴＦ−ＦＶＩＩａは深部 脈管血栓症、動脈血栓症、発作、ＤＩＣ、敗血症ショック、心肺バイパス手術、 成人呼吸困難症候群、先天性血管浮腫を含む、種々の臨床的容体に重要な役割を 果たしていることが示唆されている。それ故、ＴＦ−ＦＶＩＩａの阻害剤は炎症 および／または血栓症の調節に重要な役割を果たすことがある。 そこで本発明は治療的有効量の本発明のハイブリッド分子を必要とする患者に 投与することを含むヒトでＴＦ−ＦＶＩＩａが媒介するイベントを予防する方法 を含む。本発明のハイブリッド分子の治療的有効量は所望の効果を達成するよう に予め決定しておく。治療に採用する量は治療対象、投与経路および処置すべき 病状に依存して変化することになる。従って、投与する用量は存在するＦＶＩＩ ／ＦＶＩＩａに結合して不活性な複合体を形成して、処置する対象で血液凝固を 低下させるに十分な用量である。 治療的有効性はＴＦ−ＦＶＩＩａ依存性凝固に関連する症状の１種またはそれ 以上の改善によって測定される。このような治療的有効用量は熟練した専門家に よって決定され、処置すべき対象の年齢条件、病状、性および病状に依存して変 化するものである。全身的投与についての適当な用量範囲は典型的には投与経路 に依存して約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上までの間であ る。本発明によれば、好適な治療的用量は約１μｇ／ｋｇ体重と約５ｍｇ／ｋｇ 体重の間である。例えば適当な臨床管理条件は意図する治療に特定される範囲の 血中濃度を維持するに十分な静脈注射または点滴を包含する。 本発明のポリペプチドを含む医薬的組成物は非経口、局所、経口、または局部 （たとえばエアロゾルまたは経皮剤）、またはこれらの組合せのいずれかを含む 適当な様式で投与してもよい。適当な臨床管理には最初の静脈内大量注射および それに続く１回またはそれ以上の間隔を置いた反復投与を含む。 例えば血栓溶解療法の過程で血栓閉塞の再形成を予防するためなどに本発明の 組成物を血栓溶解剤と組合せて投与する時には、治療的有効用量の血栓溶解剤は 通常の用量範囲の約８０から１００％の間である。血栓溶解剤の通常の用量範囲 は治療で使用する日用量であって、臨床担当医には容易に入手可能（「フィジシ ャンズ・デスク・レファレンシズ（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ・Ｄｅｓｋ・Ｒｅｆｅ ｒｅｎｃｅｓ）」、１９９４年、５０版、Ｅｄｗａｒｄ・Ｒ．Ｂａｒｎｈａｒｔ 出版社）である。典型的な用量範囲は採用する血栓溶解剤に依存し、組織プラス ミノーゲン活性化剤（ｔ−ＰＡ）、では０．５から約５ｍｇ／ｋｇ体重；ストレ プトキナーゼでは１４００００から２５００００００単位／患者；ウロキナーゼ では５０００００から６２５０００単位／患者；およびアニソール化ストレプト キナーゼ・プラスミノーゲンアクチベータ複合体（ＡＳＰＡＣ）では０．１から 約１０単位／ｋｇ体重になろう。 本明細書で使用する組成物は時間的には少なくとも本発明の分子および少なく とも１種の血栓溶解剤を含む単一用量剤型を含む。時間的にはまた多回用量型で あって、本発明の分子を別々に投与するが、たとえば順次投与のように別々の投 与２回によって同時発生的に投与するものを含むことを意味する。これらの組合 せおよび組成物は、閉塞血栓の溶解を起こす閉塞血栓を溶解するかまたは形成を 予防するように作用する。 本発明の別の側面によれば、たとえばこのハイブリッド分子を例えば人工弁、 プロテーゼ、ステント、またはカテーテルなどを通過する血液の体外潅流で遭遇 するような生体外凝血を予防するために用いうる。本発明のこの側面によれば、 体外装置を本発明の組成物で被覆して外因性活性化経路に基づくクロット形成の 危険を低下させる。 限定のためではなく、例示のために以下の実施例を提示する。本明細書に開示 する引用文献は全て参考のために開示を明示的に引用するものである。 実施例 材料 ヒトの第ＶＩＩａ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子はＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ・ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｅｓｓｅｘ・Ｊｃｔ．ＶＴ）から購入した。膜組 織因子（ｍＴＦ）は組換え、全長（残基１〜２６３）、ヒトＴＦを発現するヒト の胚腎細胞系統（２９３）を超音波処理して調製した（Ｐａｂｏｒｓｋｙ，Ｌ． Ｒ．ほか、（１９９０年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ・Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３巻： ５４７〜５５３頁）。ウシのトリプシン、４−メチルウンベリフェリル・ｐ−グ アニジノベンゾエート、およびＣＨＡＰＳはＳｉｇｍａ・Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社 から購入した。ウシの血清アルブミン（ＢＳＡ）、画分ＶはＣａｌｂｉｏｃｈｅ ｍ社（ラホヤ、ＣＡ）から入手した。Ｎ^α−ベンゾイル-Ｌ−アルギニン−ｐ− ニトロアニリドはＢａｃｈｅｍ・Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ社（トーランス、ＣＡ） から購入した。ヒトプラスミン、Ｓ−２３０２、Ｓ−２２５１およびＳ−２３６ ６はＫａｂｉ・Ｖｉｔｒｕｍ社（スウェーデン）から購入し、ＳＰＥＣＴＲＯＺ ＹＭＥ^TMＦＸａはＡｍｅｒｉｃａｎ・Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ社（グリニッチ、 ＣＴ）から購入したもので、ＣＨＲＯＭＯＺＹＭ^TMｔ−ＰＡはＢｏｅｈｒｉｎｇ ｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ社からのものである。その他の試薬は全て商業的に入手 できる最高級品である。実施例１ 融合蛋白質の構築および発現 組織因子−クニッツドメイン融合蛋白質をコードするプラスミドは大腸菌から の分泌によるｈＴＦＡＡ発現用に設計されたプラスミドｐＺＴＦＡＡ（Ｋｅｌｌ ｅｙ，Ｒ．Ｆ．ほか、（１９９５年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４巻：１ ０３８３〜１０３９２頁）から構築した。図３に示す通り、ｐＺＴＦＡＡの発現 ユニットはｈＴＦＡＡのＮ−末端に結合するｓｔＩＩシグナル配列を有し、転写 はアルカリホスファターゼプロモーター（ｐｈｏＡ）によって運用される。ｐＺ ＴＦＡＡは単鎖または二重鎖型プラスミドの複製に必要なエレメントを有する。 ＴＦ７Ｉ−Ｃクニッツドメインのコード配列をプラスミドｐＡ４Ｇ３２−ＴＦ７ Ｉ−Ｃ（Ｄｅｎｎｉｓ，Ｍ．Ｓ．とＬａｚａｒｕｓ，Ｒ．Ａ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、（１９９４年）、２６９巻：２２１９〜２２１３６頁）からＰｓｔ ＩおよびＢａｍＨＩによる制限酵素消化で切出した。ｈＴＦＡＡのＣ−末端に結 合したクニッツドメインを有する融合蛋白質をコードする遺伝子の構築にはＳａ ｃＩＩ制限酵素部位をオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によってｐＺＴＦ ＡＡに導入した（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．ほか、Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｚ ｙｍｏｌｏｇｙ、（１９８７年）、１５４巻：３６７〜３８２頁）。得られたプ ラスミドをＳａｃＩＩおよびＳｐｈＩで消化し、続いてクニッツドメインのＰｓ ｔＩ／ＢａｍＨＩ断片と連結したが、オリゴヌクレオチドリンカー２種は化学合 成によって製造した。リンカーの一つはＳａｃＩＩ／ＰｓｔＩの結合端を有し、 Ｇ₄Ｓモジュール１コピーをコードし、クニッツドメインのＮ−末端と正しい読 取り枠内でｈＴＦＡＡと融合するように設計した。第二のリンカーはＢａｍＨＩ ／Ｓｐｈｌ結合端を有し、構築の停止コドンを供給する。ｈＴＦＡＡのＮ−末端 に接続するクニッツドメインを有する融合蛋白質遺伝子の構築には、ｐＺＴＦＡ ＡをｓｔＩＩとｈＴＦＡＡセグメントとの間の結合でＤＮＡを切断するＮｓｉＩ で切断した。ＮｓｉＩで切断したプラスミドをＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩクニッツド メイン断片と連結し、オリゴヌクレオチドリンカーは化学的合成法によって調製 した。リンカーの一つはＮｓｉＩ／ＰｓｔＩ結合端を持ち、ｓｔＩＩシグナル配 列と枠内でクニッツドメインを結合する。第二のリンカーはＢａｍＨＩ／Ｎｓｉ Ｉ結合端を持ち、Ｇ₄Ｓモジュール１個をコードし、ｈＴＦＡＡのＮ−末端と枠 内でクニッツドメインを結合する。停止コドンはｐＺＴＦＡＡに由来する。多重 コピーのＧ₄Ｓモジュールを持つ融合遺伝子はＴＦＫＤ１またはＫＤＴＦ１にあ る適当な制限酵素部位の間に（Ｇ₄Ｓ）_n単位をコードする化学的に合成したオリ ゴヌクレオチドを挿入することによって構築した。ＴＦＫＤ１にはＳａｃＩＩ／ ＰｓｔＩ部位を用い、ＫＤＴＦ１にはＢａｍＨＩ／ＮｓｉＩ部位を用いた。融合 遺伝子はすべてジデオキシヌクレオチド配列決定法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ほか、 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、（１９７７年）、７４巻：５ ４６３〜５４６７頁）によって確認した。 融合蛋白質をコードするファージミドで大腸菌Ｗ３３１０から発現用に誘導さ れた大腸菌３３Ｂ６を形質転換した。一夜飽和した培養物（１％）を用いて発酵 タンク内の培地１０Ｌに植菌した。発酵は文献記載（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ほか、 Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（１９９２年）、１０巻：１６３〜１６７頁） の通りであるが、温度は３７℃でなく３０℃で行った。ｓｔＩＩシグナル配列の ために融合蛋白質は細胞周縁質内に分泌された。植菌後３２時間目に遠心分離し て細胞を収集し、−２０℃で凍結保存した。実施例２ 融合蛋白質の精製 大腸菌細胞のペーストから融合蛋白質を抽出し、抗−ＴＦモノクローナル抗体 （Ｄ３）カラムを用いる免疫親和性クロマトグラフィー（Ｐａｂｏｒｓｋｙ，Ｌ ．Ｒ．ほか、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、（１９８９年）、２８巻：８０７２〜 ８０７７頁）によって可溶性組織因子の突然変異体について記載通りに（Ｋｅｌ ｌｅｙ，Ｒ．Ｆ．ほか、（１９９５年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４巻： １０３８３〜１０３９２頁）精製した。場合によっては最終的な燐酸緩衝液食塩 水と平衡させたスーパーデックス７５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）カラムを用いる サイズ排除クロマトグラフィー段階を導入して高質量オリゴマーから融合蛋白質 モノマーを精製した。融合蛋白質の精製過程は図４に示す通りにＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅで追跡した。この操作は高度に精製された融合蛋白質を与えた。精製された各 試料を、蛋白質質量が所望の分子組成と一致することを検証するためにアーティ キュレート電子スプレー源を装着したＳｃｉｅｘ−ＡＰＩ３質量スペクトル計に よる分析に供した。ウマミオグロブリン多荷電イオン（ＭＷ＝１６９５１Ｄａ） を用いて装置を補正した。質量スペクトルによる分析結果を表Ｉに示し、これら の融合蛋白質が期待される分子組成を持つことを証明する。精製融合蛋白質の濃 度は３方法で測定した（表Ｉ）：１）Ｄ３抗体によるｈＴＦＡＡの検出、２）ト リプシンの滴定によるクニッツドメインの測定、および３）全蛋白質濃度を測定 するための吸光度測定。３法全て同様な濃度を与えた。質量スペクトルのデータ とともに考慮して、これらの結果はこれら融合蛋白質は無変化体であって、融合 蛋白質内にあってもクニッツドメインおよびＴＦドメインの両方とも機能がある ことを証明する。 試験した融合蛋白質は短縮記号ＫＤＴＦｎまたはＴＦＫＤｎを用いて表Ｉに列 挙する。ここにｎはＧ₄Ｓリンカー単位の数を示す整数である。この記号では、 ＴＦはｈＴＦＡＡを示す。ＫＤはＴＦ７Ｉ−ｃクニッツドメインを示す。ＴＦに 続くＫＤ（ＴＦＫＤ１）はＫＤドメインがそのＮ−末端でぺプチドリンカーを経 てｈＴＦＡＡのＣ−末端に結合する融合蛋白質を示す。ＫＤに続くＴＦ（ＫＤＴ Ｆ１）はＫＤのＣ末端がぺプチドリンカーを経てｈＴＦＡＡのＮ-末端に結合し た融合蛋白質を示す。 表Ｉ 精製融合蛋白質の特徴付け。 在来のジスルフィド結合した立体配座にある融合蛋白質から予測した質量を第 ２列に示す。質量スペクトル分析の結果を第３列に示す。第４〜６列は各融合蛋 白質の代表的製造物についてＢＩＡｃｏｒｅ^TMフローセルに固定化したＤ３モノ クローナル抗体への結合を基に決定した濃度（ＴＦドメインの構造的／機能的完 全さに関する検定法）、トリプシン阻害（クニッツドメインの構造的／機能的完 全さに関する検定法）、および２８０ｎｍにおける吸光度（全蛋白質）である。 ＮＤ＝未測定。実施例３ 融合蛋白質はＴＦ−ＦＶＩＩａ依存性第Ｘ因子の活性化を阻害する 融合蛋白質の膜組織因子（ｍＴＦ）−第ＶＩＩａ因子（ｍＴＦ−ＦＶＩＩａ） 複合体の触媒機能を阻害する相対的力価をＦＸ活性化検定法を用いて評価した。 この検定法ではＦＸをｍＴＦ−ＦＶＩＩａの溶液に加え、ＦＸａ形成速度を測定 する。適量を様々な時間に採取し、ＥＤＴＡ添加によってカルシウムをキレート 化して反応を停止し、次に形成されたＦＸａの量をＦＸａ特異的基質ＳＰＥＣＴ ＲＯＺＹＭＥ^TM ＦＸａを用いて測定する。ＳＰＥＣＴＲＯＺＹＭＥ^TM ＦＸａの ＦＸａ分解はカルシウムを必要としない。ＳＰＥＣＴＲＯＺＹＭＥ^TM ＦＸａの 加水分解は４０５ｎＭにおける吸光度測定によって監視する。この速度を用いて ＦＸａ濃度を精製ＦＸａで構築した標準曲線を参照して算出してもよい。ＦＸ活 性化検定法はマイクロタイター形式で行い、吸光度の変化をＤｅｌｔａＳｏｆｔ ＩＩソフトウエア（Ｂｉｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ社）を搭載したマキントッシュＩ Ｉｃｉ型コンピュータに制御されたＳＬＴＥＡＲ３４０ＡＴプレートリーダーで 監視した。ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ第３版（Ｓｙｎｅｒｇｙ・Ｓｏｆｔｗａｒ ｅ社）を用いて非線形回帰分析を行った。 活性化の検定には２００μＬ容積中、ｍＴＦ、ＦＶＩＩａおよびＦＸを最終濃 度各５００ｐＭ、１００ｐＭおよび１９０ｎＭで使用した。添加するなら阻害剤 は最終濃度１ｎＭで存在させた。この溶液は５０ｍＭ−トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８ 、１５０ｍＭ−ＮａＣｌおよび５ｍＭ−ＣａＣｌ₂も含有した。ＦＶＩＩａ貯蔵 溶液の濃度は定量したＴＦ７Ｉ−Ｃ試料での活性部位滴定およびＦＶＩＩａの基 質としてＣＨＲＯＭＯＺＹＭ^TMｔ−ＰＡを使用することによって決定した。ＴＦ ７Ｉ−Ｃの濃度は４−メチルウンベリフェリル・ｐ−グアニジノベンゾエートを 用いて活性部位滴定しておいたトリプシンを用いる滴定で正確に決定した（Ｊａ ｍｅｓｏｎ，Ｇ．Ｗ．ほか、（１９７３年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１３１巻 ：１０７〜１１７頁）。８０ｎＭ−トリプシンプラス適量の希釈した阻害剤を５ ０ｍＭ−トリス、ｐＨ８．０、１００ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＣａＣｌ₂、 および０．０５％ＴＲＩＴＯＮ^TMＸ−１００中で室温で１時間インキュベーショ ンした後、５ｍＭ−Ｎ−ベンゾイル-Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド２０ μＬを加えて全容１５０μＬとした。次に４０５ｎｍで吸光度変化を監視した。 阻害剤とトリプシンまたはＦＶＩＩａとの１：１化学量論を仮定して濃度を決定 した。次にｍＴＦ濃度を活性部位定量したＦＶＩＩａの溶液を添加した後のＣＨ ＲＯＭＯＺＹＭ^TMｔ−ＰＡ加水分解速度の増加から決定した。ＦＸおよびＦＸａ 濃度は製造社が提供したものである。 融合蛋白質の阻害活性試験ではＦＶＩＩａを融合蛋白質と３７℃で１時間イン キュベーションした後、ｍＴＦを添加した。ｍＴＦ添加後、３７℃でのインキュ ベーションをさらに１時間継続した後、基質ＦＸを添加した。反応時間は基質添 加時に開始し、様々な時間に２５μＬ容を採取して等容の５０ｍＭ−ＥＤＴＡと 混合した。形成したＦＸａを第Ｘａ因子緩衝液（１０Ｘ＝０．２Ｍ−ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１．５Ｍ−ＮａＣｌ、０．２５Ｍ−ＥＤＴＡ、１％ＰＥＧ−８００ ０）を最終濃度１Ｘまで加え、続いて０．５ｍＭ−ＳＰＥＣＴＲＯＺＹＭＥ^TMＦ Ｘａを添加することによって測定した。各時点の最終容積は２００μＬであり、 ＳＰＥＣＴＲＯＺＹＭＥ^TMＦＸａ加水分解速度は４０５ｎｍの吸光度変化で監視 したものをｍＯＤ／分で報告する。 ｍＴＦ−ＦＶＩＩａが触媒するＦＸ活性化に及ぼす１ｎＭ−阻害剤の効果を図 ５に示す。１ｎＭ−濃度でＴＦ７Ｉ−ＣまたはｈＴＦＡＡ単独のＦＸａ生成速度 は非阻害対照と同等である。融合蛋白質ＫＤＴＦ１およびＴＦＫＤ１もＦＸ活性 化速度には殆ど影響しなかった。対照的にＫＤＴＦ２はＦＸ活性化を僅かに阻害 した。リンカーがさらに長い融合蛋白質では阻害の程度が増大して、ＫＤＴＦ５ 融合蛋白質では完全な阻害が観察された。ＫＤＴＦ４はＫＤＴＦ５と等価と思わ れるが、ＫＤＴＦ６およびＫＤＴＦ７は僅かに弱い阻害剤であった。これらのデ ータはクニッツドメインとｈＴＦＡＡドメインを適当な長さのリンカーで結合す ることによって強力な阻害剤が得られることを示す。このシリーズで最善のリン カーは伸展された立体配座におけるポリペプチド鎖の長さが４５〜６０Åに対応 するＧ₄Ｓモジュール４個または５個を持つ。実施例４ 平衡解離定数の測定 ＦＸ活性化の見掛けの平衡解離定数（Ｋ_i*）をｈＴＦＡＡ、ＴＦ７−Ｃおよび ＫＤＴＦ５について測定した。これらの実験はＦＶＩＩａとｍＴＦの濃度を各々 ２００ｐＭおよび１ｎＭとし、阻害剤濃度を変化させたこと以外は実施例３に記 載のとおりに行った。標準曲線は精製ＦＸａ（Ｈｅｍａｔｅｃｈ社）でＳＰＥＣ ＴＲＯＺＹＭＥ^TMＦＸａを加水分解し、各測定時点で観測される加水分解速度を 生成したＦＸａの濃度に変換して構築した。次にこれらのデータを分析して最小 自乗回帰によって阻害剤の各濃度についてＦＸａ生成の初速を算出した。各初速 を非阻害速度と比較して各阻害剤濃度におけるＦＸ活性化速度の変化率を得た。 これらの値を図６にプロットする。非線形回帰分析には等式１を使用してｈＴＦ ＡＡ、ＴＦ７Ｉ−ＣおよびＫＤＴＦ５について、各々１６０±１９ｎＭ、３．８ ±０．５ｎＭおよび２±６ｐＭのＫ_i*値を得た。長さ約６０Åと推定されるリン カーへのｈＴＦＡＡおよびＴＦ７−Ｃの融合が阻害剤力価を少なくとも１００倍 増加させたことは明らかである。等式１ ： ［等式中、［Ｅ₀］は酵素濃度である。［Ｉ₀］は阻害剤濃度である。Ｖ_iは［ Ｉ₀］の存在下におけるＦＸａ生成の初速である。Ｖ₀は阻害剤の不在下における 初速である］実施例５ 血液凝固の検定 凝固時間はＡＣＬ３００Ｒｅｓｅａｒｃｈ・Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ分析機を 使用して測定した。プロトロンビン時間（ＰＴ）検定では、インキュベーション 時間を１２０秒および獲得時間を６００秒に設定した。全長ＴＦを発現する２９ ３細胞から得た膜（Ｐａｂｏｒｓｋｙ，Ｌ．Ｒ．ほか、（１９８９年）、Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８巻：８０７２〜８０７７頁）を２５ｍＭ−ＣａＣｌ₂ と混合しておいた。クエン酸添加正常ヒト血漿および阻害剤を合わせて少なくと も５分間インキュベーションした後に検定した。３７℃で２分間インキュベーシ ョンした後に、試料（血漿および阻害剤）および試薬（ＣａＣｌ₂／ＴＦ）を自 動的に混合した。凝固時間は光学的評価によって決定した。全容積１６０μＬ中 の最終濃度は阻害剤が０．０２８から５．６μＭ、ｍＴＦが０．５ｎＭ、ＣａＣ ｌ₂が１２．５ｍＭ、および血漿が５０％であった。 活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）検定では、活性化時間を７０ 秒および獲得時間を３６０秒に設定した。クエン酸添加正常ヒト血漿および阻害 剤を合わせて少なくとも５分間インキュベーションした後に検定した。試料（血 漿および阻害剤）および活性化剤（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ・Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｃｅｐｈａｌｉｎ＋Ａｃｔｉｖａｔｏｒ・ＡＰＴＴ試薬） を自動的にピペットで添加し、３７℃で７０秒間インキュベーションして、次に ＣａＣｌ₂を添加し、凝固時間を光学的評価で決定した。全容積２００μＬ中の 最終濃度は阻害剤が０．０２８から５．６μＭ、活性化剤が１０％、ＣａＣｌ₂ が１０．０ｍＭ、および血漿が５０．０％であった。 結果−融合蛋白質ＫＤＴＦ５は図７に示す通りＰＴ検定では非常に強い凝固阻害 を示した。ＫＤＴＦ５はＴＦ７Ｉ−ＣまたはｈＴＦＡＡ単独よりも強力で、ＴＦ ７Ｉ−ＣとｈＴＦＡＡの混合物で観測される用量よりも低用量で阻害した。ＫＤ ＴＦ５は凝固時間２倍延長を阻害剤濃度約８００ｎＭで示した。ＴＦ７Ｉ−Ｃと ｈＴＦＡＡの等モル混合物では２倍延長は１．９μＭで示した。ｈＴＦＡＡ単独 は凝固時間２倍増加を４μＭ−濃度で示したが、ＴＦ７Ｉ−Ｃでは試験した最高 濃度でも２倍延長を示さなかった。このデータはＫＤＴＦ５はＴＦ依存性血液凝 固の強力な阻害剤であって、これらの阻害剤２種の非共有結合混合物より強力な 力価を有することを示す。 図８に示す通り、ＫＤＴＦ５は以前に観測されたＴＦ７Ｉ−Ｃ単独のＡＰＴＴ 検定による血液凝固時間に及ぼす効果（Ｄｅｎｎｉｓ，Ｍ．Ｓ．とＬａｚａｒｕ ｓ，Ｒ．Ａ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻：２２１２９〜２２１３６ 頁［１９９４年］）を保持していた。ＫＤＴＦ５およびＴＦ７Ｉ−ＣとｈＴＦＡ Ａとの非共有結合混合物は共に血液凝固内因性経路の阻害についてはＴＦ７Ｉ− Ｃ単独よりも僅かに強力であった。阻害剤濃度約２００ｎＭのＫＤＴＦ５または ＴＦ７Ｉ−Ｃ／ｈＴＦＡＡ混合物はいずれも凝固時間２倍延長を示した。濃度４ ００ｎＭのＴＦ７Ｉ−Ｃが凝固時間２倍延長に必要であった。試験した濃度では ｈＴＦＡＡ単独はＡＰＴＴ検定で測定する血液凝固時間に効果を示さなかった。実施例６ ウサギの深部内側創傷モデルによる抗血栓力価の測定 雄性ニュージーランド白色ウサギ（〜４ｋｇ）をケタミン／キシラジンのＩＭ 注射で麻酔して外科的麻酔相とする。ウサギを拘束ボードに仰臥位に固定し、３ ７℃に加温し、頚部と大腿内側を剃毛する。テフロンカテーテルを耳辺縁静脈お よび大腿動脈に各々薬剤送達および試料採取のために装着する。処置前に血液試 料を採取して凝固試験（ＡＰＴＴおよびＰＴ）を行う。出血時間を後肢爪の小皮 に作った切創から評価する。頚部領域を切開し、左総頚動脈とその分枝を外科的 に露出する。超音波流動プローブ（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃｓ（商標））を総頚動脈 −内頚動脈分岐から約５ｃｍ尾側の総頚動脈に装着する。血流が安定なベースラ インに到達した後、薬剤（食塩水または被験化合物）を耳辺縁静脈に注入する。 次に収縮した塞栓切除カテーテル（Ｆｏｇａｒｔｙ（商標）、３Ｆ社）を舌枝の 切開部を経て総頚動脈内腔に挿入する。動脈を通る血流を一次的に止め、その間 にカテーテルを挿入して２−０シルクタイで切開部に緩く固定する。カテーテル を装着して固定した後に血流を再開する。収縮バルーンを血流プローブの２ｍｍ 以内まで進め、血管壁の抵抗が感じられるまで食塩水で膨張させる。カテーテル を定速で第一分岐点まで後退し、次に収縮させる。 この操作を各実験動物で数回反復し、その後カテーテルを除去する。カテーテ ル初回挿入から除去までのバルーン操作は約３分から５分を要し、長さ１．５か ら２ｃｍの傷害領域を与える。血液試料を４０分間に採取してＰＴ測定を行い、 爪小皮出血時間を評価し、頚動脈を流れる血流を監視する。開存の時間は測定可 能な血流が動脈に検出される全時間長（最大値＝４０分間）として定義する。開 存率は頚動脈血流≧５分間を示す被験動物の百分率を示す。 実験終了後、ウサギを安楽死させ、頚動脈を摘出して切開する。血栓が存在す れば取り出してブロットし、重量を測定する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｋ 14/745 Ｃ０７Ｋ 14/81 14/81 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 リー，ジョフリー・エフ アメリカ合衆国94044カリフォルニア州パ シフィカ、メイソン・ドライブ1170番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ）第ＶＩＩａ因子（「ＦＶＩＩａ」）活性部位阻害ドメイン； ｂ）リンカードメイン；および ｃ）組織因子（「ＴＦ」）ドメイン を含む融合蛋白質。 ２．そのＦＶＩＩａ活性部位阻害ドメインが可逆的セリンプロテアーゼ阻害 剤である請求項１の融合蛋白質。 ３．そのＦＶＩＩａ活性部位阻害ドメインが不可逆的セリンプロテアーゼ阻 害剤である請求項１の融合蛋白質。 ４．その可逆的セリンプロテアーゼ阻害剤がクニッツドメイン（「ＫＤ」） を含む請求項２の融合蛋白質。 ５．そのリンカードメインが−（Ｇｌｙ）₄−Ｓｅｒ−リンカーモジュール を含む請求項４の融合蛋白質。 ６．そのリンカードメインが−（Ｇｌｙ）₄−Ｓｅｒ−リンカーモジュール を４個含む請求項５の融合蛋白質。 ７．そのリンカードメインが−（Ｇｌｙ）₄−Ｓｅｒ−リンカーモジュール を５個含む請求項５の融合蛋白質。 ８．式: ＫＤ−［（Ｇｌy）₄−Ｓｅｒ］_X−ＴＦ ［式中、ＫＤは第ＶＩＩａ因子のクニッツ型活性部位阻害剤である； Ｘは１と１０との間の整数である；および ＴＦは組織因子ドメインである］ で示される請求項３の融合蛋白質。 ９．その組織因子変異体がｈＴＦＡＡである請求項８の融合蛋白質。 １０．そのＫＤがＴＦ７Ｉ−Ｃである請求項９の融合蛋白質。 １１．そのＸが４である請求項１０の融合蛋白質。 １２．そのＸが５である請求項１０の融合蛋白質。 １３．医薬的に許容される添加剤および請求項１の融合蛋白質を包含する医薬 的組成物。 １４．ＴＦ−第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）の凝固促進作用を阻害するために 十分な量の請求項１の融合蛋白質にＦＶＩＩａを接触させることを包含するこの ヒトＦＶＩＩａの凝固促進作用を阻害する方法。 １５．哺乳類に請求項１３の組成物を治療的有効量投与することを含む、ヒト 組織因子−第ＶＩＩａ因子（ＴＦ−ＦＶＩＩａ）の血液凝固促進作用を哺乳類の 体内で阻害する方法。 １６．さらにその組成物を血栓溶解剤と組合せて投与することを含む請求項１ ５の方法。 １７．さらにその組成物を抗凝固剤と組合せて投与することを含む請求項１５ の方法。 １８．哺乳類に請求項１３の組成物を医薬的有効量投与することを含む第ＶＩ Ｉａ因子の阻害が指示されている哺乳類を処置する方法。 １９．請求項８の融合蛋白質をコードする分離されたＤＮＡ分子。 ２０．さらにそのＤＮＡ分子に作動可能に結合する発現制御配列を含む請求項 １９のＤＮＡ分子。 ２１．そのベクターで形質転換された宿主細胞がその制御配列を認識する請求 項２０のＤＮＡ分子を含む発現ベクター。 ２２．プラスミドである請求項２１のベクター。 ２３．請求項２２のプラスミドで形質転換された宿主細胞。 ２４．その阻害剤の発現に適する条件下に請求項２３の宿主細胞を培養するこ とを含む宿主細胞中でセリンプロテアーゼ阻害剤をコードするＤＮＡ分子を発現 する方法。 ２５．さらに培養培地から阻害剤を回収することを含む請求項２４の方法。