JP2000503672A

JP2000503672A - 二重特異性抗体断片の簡易化した製造

Info

Publication number: JP2000503672A
Application number: JP10-508402A
Authority: JP
Inventors: ユング，グントラム
Filing date: 1996-07-25
Publication date: 2000-03-28
Anticipated expiration: 2016-07-25

Abstract

(57)【要約】本発明は、これまでは必要と考えられていた精製工程を省略することができ、それによって、実質的に方法全体が簡易化され、費用に対して最も効率よくされ得る点で特徴付けられる二重特異性タンパク質、好ましくは抗体断片の製造方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】二重特異性抗体断片の簡易化した製造本発明はヒトおよび動物における腫瘍の免疫療法のための二重特異性抗体断片の製造に関する。悪性疾患に対する身体固有の免疫系の活性化は、古くからの治療目標であったが、現在のところまだ実現していない。最近の２、３年間で、科学者たちは実質的にこの目的の達成に要求される必要条件の改善に成功した。Ｔ細胞表面上で免疫系を活性化する基本的な構造を同定および特徴付けた。本質において、これらの基本的な構造は、抗原−検出Ｔ細胞受容体／ＣＤ３複合体および潜在的に最も重要な共刺激受容体としてのＣＤ２８分子である。特異的にその半分は腫瘍細胞に結合し、残りの半分は免疫系の中枢「分子トリガー（molecular trigger）」を活性化するような二重特異性抗体を構築することは可能である。活性化された細胞は、効果的に腫瘍細胞を殺傷することができる（ユング（Jung）およびミューラー−エバーハルド（Muller-Eberhard）、Imm unol．Today 9（１９８８）、２５７）。同時に、二重特異性抗体の抗−腫瘍効果を多大なイン・ビトロ試験セットアップおよびいくつかのマウス腫瘍モデルにおいても示した（ベウン（Beun）ら、Im munol．Today ２１（１９９４）、２４１３）。ヒトの最初の局所的適用で、卵巣癌および神経膠芽腫の腹膜増殖は好ましく影響を及ぼされることができた（ニッタ（Nitta）ら、Lancet ３３５（１９９０）、３６８；カネバリ（Canevari）ら、JNCl ８７（１９９５）、１４６３）。それゆえ、二重特異性抗体がある臨床的状況において、少なくともヒトの腫瘍の有効な免疫療法を可能にするであろうというもっともな期待が存在する。使用した抗体のFc部位を介して免疫細胞の非特異的な活性化を避けるため、Fc 部位を欠如した二重特異性抗体断片を使用する必要がある。先行技術において、ブレンナン（Brennan）ら（Science 229（１９８５）、８１−８３）は二重特異性抗体断片を製造する方法を報告しており、そこでは完全状態の抗体をペプチド消化よって断片化してF(ab')₂断片とし、ついで得たF(ab')₂断片をカラムクロマトグラフィーによって精製する。ついで、精製したF(ab')₂分子のヒンジ領域のジスルフィド結合を亜砒酸塩の存在下で還元することによって消化し、得たF(ab ')−SH断片を再度カラムクロマトグラフィーにかけて精製し、エルマン試薬(DTN B)を含む還元したSH基をF(ab')−TNBに修飾する。さらにカラムクロマトグラフィーによって精製した後、２つの抗体断片のうちの１つをF(ab')−SHに還元し、カラムクロマトグラフィーによって精製し、ついで他のF(ab')−TNB断片とハイブリダイズさせて二重特異性F(ab')₂断片を得る。最終的にこのようにして得た、二重特異性抗体断片をゲルクロマトグラフィーにより精製した。先行技術において、ユングら（Eur．J．Immunol．２１（１９９１）、２４３３１−２４３５）は、上記方法の修飾をF(ab')₂分子のヒンジ領域におけるジスルフィド結合の消化および得たSH基の保護基での阻害を同時に行うことによって、ブレンナンらにより記載された方法の精製の１工程を省略することができることを報告した。いずれにせよ、二重特異性抗体の製造に関するこの方法により必要とされる時間と費用の支出は非常に多大であるので、これまでのところは、ヒトまたは動物における全身適用に必要とされる内容量を製造することができなかった。これらの見込みある試薬の臨床試験は、この事実によってひどく妨害される。二重特異性抗体断片の製造を簡易化する方法の開発は、それゆえ、さらにそのような二重特異性抗体断片の主要量を提供し、腫瘍の免疫療法において使用可能であろう。本発明の根底にある問題は、それゆえ上記の先行技術の不利点を克服し、かつ二重特異性抗体断片を製造するための簡易化された方法である。問題の解決は、請求の範囲において特徴付けられた態様によって達成される。驚くべきことに、ペプチド消化後得られた抗体断片の還元および修飾は、先行技術において、これまでのところ必要であるとみなされていた工程なしに１つの工程で実行できることがわかった。その発見は、二重特異性抗体断片の製造の工程数を少なくすることができ、さらにその方法は、所望の目的製造物の一層高い層収率によってさらに特徴付けられる。本発明による方法は、完全な抗体からの二重特異性F(ab')₂断片の製造に関して記載している。基本的に、この方法は、 TNBによって還元することができるジスルフィド結合を含む限り、異なるタンパク質のカップリングに使用することができる。従って、本発明は、これまでのところ必要であると考えられていた精製工程を省略することができ、それによって実質的に全方法を簡易化し、および費用に対して、最も効率よくすることができる点で特徴付けられる二重特異性タンパク質、好ましくは抗体断片の製造方法に関する。本発明の方法の好ましい態様において、生物学的に活性であり、二重特異性抗体断片の製造は本質的に以下の工程を含む：（a）第1および第2抗体をその抗体のFc部位を開裂するおよびF(ab')₂分子を形成するのに十分な条件下で断片化工程にかけ；（b）工程（a）のそれぞれの製造物をF(ab')₂分子のヒンジ領域におけるジスルフィド結合の消化を可能にし、同時に得られたSH基を保護基で阻害できるのに十分な条件下で精製工程にかけずに還元および修飾工程にかけ；（c）工程（b）それぞれの製造物を反応付加生成物の除去に十分な条件下での精製工程にかけ；（d）工程（c）の第１抗体の製造物を工程（b）の保護基を開裂するのに十分な条件下で還元工程にかけ、（e）工程（c）により工程（d）の製造物を精製工程にかけ；ついで（f）工程（c）の第２抗体製造物および工程（e）の第１抗体製造物を二重特異性F(ab')₂分子を形成するのに十分な条件下でハイブリダイゼーション工程（e）にかける。工程（a）で使用した完全な抗体は、先行技術において公知の方法によって入手可能である（カレント・プロトコールズ・イン・イムノロジー（Current Prot ocols in Immunology）、コディガン（J．E．Codigan）、クルビスベック（A．M ．Krbisbeck）、マルグリス（D．H．Margulies）、シェバック（E．M.Shevack）、ストロバー（W．Strober）編、ジョーン・ウィリー＋サンズ（John Wiley + S ons））。個々の反応および精製工程の実行方法は当業界からも知られており、例えば、ブレンナンら（Science２２９（１９８５）、８１−８３）およびユングら（Eur．J．Immunol．２１（１９９１）、２４９１−２４９５）に記載されている。本発明の方法の好ましい態様において工程（c）は、同時に溶液をpH８.０ヘとリバッファリング（rebuffering）し、および／または工程（e）は溶液をpH４. ０へとリバッファリングして行う。本発明による方法の同様の好ましい態様において、工程（f）の製造物をハイブリダイズしていないF(ab')分子の除去という結果となる条件下でタンパク質分離工程にかける。他の好ましい態様において、上記の方法は、得られた抗体断片が滅菌および／または無発熱素および／または本質的に無活性ウイルスであるように行う。この態様は、二重特異性抗体断片が患者における使用を意図する場合に適切である。この態様は、例えば、二重特異性抗体断片が診断目的を意図する場合には必ずしも必要とされるわけではない。特に好ましい態様において、少なくとも１つの抗体はT細胞の表面抗原を認識する抗体である。上記方法の他の特に好ましい態様において、少なくとも１つの抗体は腫瘍細胞の表面抗原を認識する抗体である。本発明の方法は、十分な量の二重特異性抗体を許容し得る費用で提供することができるので、従来の方法で満足できないとわかった腫瘍の治療を可能にする。既知の例として、リンパ性転移性悪性黒色腫が記載される。というのは免疫療法も従来の治療法のいずれもこれまで利用できなかったものをうまく治療することが可能であるからである。従って、本発明の方法の他の好ましい態様は、腫瘍細胞の表面抗原を認識する抗体が黒色腫に特異的である点で特徴付けられている。上記方法の特に好ましい態様において、腫瘍細胞の表面抗原認識抗体は、CD3 またはCD28に特異的である。他の特に好ましい態様において本発明の方法は、工程（a）における断片化が抗体溶液とペプシンを37℃で３時間インキュベーションし、トリスバッファーで pHを８.０に上昇させることにより反応を終結させることを含む点で特徴付けられる。本発明の方法の他の態様において、工程（b）における還元および修飾は、室温で２０時間DTNB-TNB混合物の等量の付加を含む。本発明の方法の他の好ましい態様において、工程（c）および（e）の精製工程はスーパーデックス（Superdex）２００（c）および／またはセファデックス（S ephadex）G２０カラム上のゲル濾過を含む。当業者は公知文献からいかにして上記カラムを用いて製造物（c）および（e）の精製条件を選択するかを知っている。また、当業者は先行技術から本発明の方法によって得た製造物の他の精製方法を見出すかもしれない（Current Protocols in Iwnunology、コディガン、クルビスベック、マルグリス、シェバック、ストロバー編、（John Wiley + Sons））。本発明の方法の他の好ましい態様において、工程（d）における還元工程は、０.１mM DTT中での工程（c）製造物のインキュベーションを含む。この態様は特に好ましく、かつ例えばブレンナンら（Science２２９（１９８５）、８１−８３）およびユングら（Eur．J．Immunol．２１（１９９１）２４９１−２４９５）参照のように公知の方法に比較して、非常にわずかな、重鎖および軽鎖間のジスルフィド結合の還元確率を最小化するTNBによって阻害されたタンパク質−SH 基に関して、ほとんど立体異性体的DTT濃度を使用する。この方法において、二重特異性抗体断片の総収量だけでなく製造物の質を本発明の方法を使用することによって高めることができる。本方法の特に好ましい他の態様において、工程（f）におけるハイブリダイゼーションは、pH８.０の０.１Mリン酸バッファー中のF(ab')−TNBおよびpH４.０の０.０２M酢酸バッファー中のF(ab')−TNBの等量反応によってもたらされる。図は：図１本発明の方法による二重特異性F(ab')₂断片の製造を示す。実施例は本発明の説明を提供する。実施例：１二重特異性F(ab')₂断片の製造本発明による方法の出発点は、先行技術文献に記載されるように入手した完全な抗体である（Current Protocols in Immunology、コディガン、クルビスベック、マルグリス、シェバック、ストロバー編、John Wiley + Sons）。本例に関して、黒色腫関結合プロテオグリカンまたは抗原特異的Ｔ細胞受容体と結合するヒトＣＤ３分子に特異的である抗体を使用した。これらの抗体をpH４.０の酢酸バッファー中、３７℃で３時間ペプシン（シグマ（Sigma））で処理し、抗体のF c部位を開裂させた（図１（１））。その反応をトリスフバッファーでpH値８まで上昇させることによって停止させ、ついで得られた溶液を５,５'−ジチオビス −２−ニトロ安息香酸（DTNB；シグマ）およびチオニトロベンゾエート（thioni trobenzoate）（TNB）（図１（２））の等量混合物で室温で２０時間イーンキュベートした。DTNB-TNB混合物のモル比は２０：３０であり、１０mM DTT溶液と共に４０mM DTNB溶液を２、３分間インキュベートすることによって調整した。０．１mM DTT（シグマ）で２５℃で１時間、２つの修飾したF(ab')断片のうちの１つを繰り返し、還元後（図１（３））、入手したF(ab')−TNBおよびF(ab')−SH 断片は、２５℃で１時間ハイブリダイズして二重特異性抗体F(ab')₂断片を生じる（図１（４））。得た二重特異性F(ab')₂断片をスーパーデックス２００カラム上でのゲル濾過により精製した。完全な抗体の量に基づく収率は約２０％であった。先行技術に記載される方法と比較して、したがって収率は５０％〜１００％増加することができた。実施例２：二重特異性F(ab')₂断片の機能性および安定性使用したすべての抗体およびその二重特異性構築物を標準的方法によりその機能性および安定性を調査した（ユングら、Eur．J．Immunol．２１（１９９１）、２４３１−２４３５））。本発明の方法により製造されたF(ab’)₂断片の機能性および安定性は従来の方法により製造された断片のそれと比較できた。これはとりわけ、ヒト腫瘍物質との結合、リンパ球増殖における活性および細胞毒性試験およびイン・ビボ条件下での安定性をいう；使用した構築物を３７℃のヒト血清中でインキュベートし、数ヶ月間５℃のリン酸バッファー中で、少なくとも６日間機能的に安定であった。実施例３：マウスのB16黒色腫細胞における二重特異性F(ab')₂断片の試験本発明の方法によって製造された二重特異性抗体断片はまた、動物試験におけるイン・ビボ活性に関して試験した。これらの試験により、上記F(ab')₂断片はマウスにおける黒色腫細胞の増殖を阻害することができ、その結果、全未処理動物が１００％死亡するのに、処理した動物の半分より多くが生き残る。

【手続補正書】【提出日】１９９９年４月１６日（１９９９．４．１６）【補正内容】（１）明細書第１頁最終行および同第２頁24行にある「ペプチド」を『ペプシン』と補正する。（２）同第２頁下から２行目にある「層収率」を『総収率』と補正する。

Claims

【特許請求の範囲】１．（a）第１および第２抗体を、抗体のFc部位を開裂し、F(ab')₂断片を形成するのに十分な条件下で断片化工程にかけ；（b）工程（a）のそれぞれの製造物を中間精製工程なしにF(ab')₂分子のヒンジ領域におけるジスルフィド結合の消化および同時に得られたSH基の保護基による阻害が十分可能である条件下で、還元および修飾工程にかけ；（c）工程（b）のそれぞれの製造物を反応付加物を除去するのに十分な条件下で精製工程にかけ；（d）工程（c）の第１抗体の製造物を工程（b）の保護基の開裂に十分な条件下で還元工程にかけ；（e）工程（d）の製造物を工程（c）による精製工程にかけ；ついで（f）工程（c）の第２抗体の製造物および工程（e）の第１抗体の製造物を特異的なF(ab')₂分子を形成するのに十分な条件下でのハイブリダイゼーション工程にかける工程を含む生物学的に活性な二重特異性抗体断片の製造方法。２．工程（c）がpH８.０に該溶液を同時にリバッファリングするおよび／または工程（e）がpH４.０に同時にリバッファリングする間に起こることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．工程（f）の製造物をハイブリダイズしていないF(ab')₂分子を除去する結果となる条件の下でタンパク質分離工程にかける工程を実行することによって特徴付けられる請求項１または２に記載の方法。４．該得られた抗体断片が滅菌、無発熱素および本質的に無活性ウイルスであることを特徴とする請求項１から３のいずれか１つに記載の方法。５．少なくとも１つの抗体がT細胞の表面抗原を認識することを特徴とする請求項１から４のいずれか１つに記載の方法。６．少なくとも１つの抗体が腫瘍細胞の表面抗原を認識することを特徴とする請求項１から５のいずれか１つに記載の方法。７．該腫瘍細胞の表面抗原を認識する抗体が黒色腫に特異的であることを特徴とする請求項６に記載の方法。８．腫瘍細胞の表面抗原を認識する抗体がCD3またはCD28に特異的であることを特徴とする請求項５から７のいずれか１つに記載の方法。９．工程（a）における断片化が、ペプシンと抗体溶液を３７℃で３時間インキュベートし、ついでトリスバッファーでpHを８.０まで上昇させることによって反応を終結させることを含むことを特徴とする請求項１から８のいずれか１つに記載の方法。１０．工程（b）における還元および修飾がDTNB／TNB等量混合物を室温で２０時間添加することを特徴とする請求項１から９のいずれか１つに記載の方法。１１．工程（c）および（e）における精製工程がスーパーデックス２００上（c ）および／またはセファデックスG20カラム上でのゲル濾過を含むことを特徴とする請求項１から１０のいずれか１つに記載の方法。１２．工程（d）における還元工程が０．１mM DTT中で製造物をインキュベートすることを含むことを特徴とする請求項１から１１のいずれか１つに記載の方法。１３．工程（f）におけるハイブリダイゼーションが、pH８.０の０.１Mリン酸バッファー中のFab-TNBおよびpH４.０の０.０２M酢酸バッファー中のFab-SHの等量の反応液によってもたらされることを特徴とする請求項１から１２のいずれか１つに記載の方法。