JP2000503764A

JP2000503764A - 増殖性動脈疾患の診断および治療におけるｒｃ―９の使用

Info

Publication number: JP2000503764A
Application number: JP09522889A
Authority: JP
Inventors: オールスタイン，エリオット・ハワード; アーレス，アンソニー・ジョゼフ; オーティーリ，マイケル・ビクター
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1995-12-18
Filing date: 1996-12-13
Publication date: 2000-03-28
Also published as: ZA9610584B; WO1997022880A1; AU1413997A; EP0904543A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、アテローム性動脈硬化症の診断および治療において、ポリヌクレオチド配列、それによりコードされる組換えＲＣ−９タンパク質、およびＲＣ−９抗体を用いる方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】増殖性動脈疾患の診断および治療におけるＲＣ−９の使用発明の分野本出願は概して冠動脈疾患に関与するタンパク質に関する。発明の背景進行した多血管性冠動脈疾患の治療として経皮経管冠動脈拡張術（ＰＴＣＡ）を行うことは、過去１０年間で指数的に増加している。しかしながら、この拡張術の長期的な効果は、この拡張術を施した患者の４０％ほどに観察される、血管再狭窄が高率で発生することで有意に限定される（Ｐ.Ｌibby ら、Ｃirculation ，86（増補III） :47-52（1992））。この手術に関連して結果的に生じる新内膜形成は、幾つかの異なる細胞型と活発に関与し、幾つかの相にて生じる動的な過程である（Ａ.Ｎ.Ｃlowes ら、Ｌab.Invest.49:208-215（1983））。最初の応答は、本質は、局所的な炎症反応に発展する可能性のある、多くの異なるサイトカインおよび成長因子を分泌するＴ−リンパ球およびマクロファージが関与する１次炎症である。第２期は再狭窄病変の主要細胞成分、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）が関与し、この反応ではこれらの因子は内膜に移動し、可溶性の成長および化学走性因子を分泌し、増殖する(Ｌibbyら、前掲(1992);Ｃlowesら、前掲(1983);Ｒ .Ｒoss、Ｎature362:801-809（1993）；およびＥ.Ｒ.Ｏ'Ｂrien ら、Ｃirc.Ｒes. 73:223-231（1993））。これらの活性化ＶＳＭＣはまた細胞外マトリックスをも分泌する。第３期は損傷後の最後の数週間であり、慢性的な繊維増殖性病変形成を特徴とする（Ｒoss、前掲（1993））。バルーン血管形成に対する細胞応答はかなりよく特徴づけされているが、ＰＴＣＡに伴う新内膜形成を妨げる効果的な抗再狭窄の薬理学的な補助的手段は未だない。同種異型移植片阻害因子（ＡＩＦ）は同種異型移植片拒絶の診断および治療に有用であると記載されている。ラットおよびヒトＡＩＦの配列は１９９５年６月２９日発行のＷＯ９５／１７５０６に記されている。当該分野において必要とされるのは、かかる新内膜形成を妨げる方法、ならびにこれらを診断およびモニター観察するより好ましい方法である。発明の要旨本発明は自然に結合している他の細胞性物質から単離された、ＲＣ−９のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列の新規な用途を提供する。また、これらの配列を含有するベクター、組換え法により製造したＲＣ−９タンパク質および抗ＲＣ −９抗体の新規な用途も提供する。従って、第１の態様において、本発明は増殖性動脈疾患および血管再狭窄の診断方法を提供する。これらの方法は、本明細書に記載するＲＣ−９の核酸およびアミノ酸配列および抗ＲＣ−９抗体を利用する。さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載するＲＣ−９核酸配列、タンパク質および抗体を用いて、アゴニストおよびアンタゴニストを含む、選択されたＲＣ−９配列に特異的に結合する化合物を同定する方法を提供する。なおさらなる態様において、本発明は前記の方法を用いて製造した化合物または薬物を提供する。さらに別の態様において、本発明は増殖性動脈疾患および血管再狭窄の治療方法を提供する。これらの方法では、本明細書に記載する化合物または薬物、ＲＣ −９の核酸およびアミノ酸配列、および好ましくは抗ＲＣ−９抗体を利用する。本発明の他の態様および利点は、以下のこれらの好ましい具体例の詳細な記載においてさらに記載する。図面の簡単な説明図１は、デイフェレンシャル・ディスプレイ（differential display）により得られたクローンＲＣ９のＤＮＡ部分配列[配列番号：１]を示す。この配列はジーンバンク受入番号Ｕ１０８９４が付与されている。図２は、ＲＣ−９のゲノムＤＮＡ配列[配列番号：２]を示す。この配列はジーンバンク受入番号Ｕ３３４７１が付与されている。図３は、ラットＲＣ−９のｃＤＮＡ[配列番号：３]および推定アミノ酸配列[ 配列番号：４]を図示する。図４は、ヒトＲＣ−９のｃＤＮＡ[配列番号：５]およびアミノ酸配列[配列番号：６]を図示する。発明の詳細な記載本発明は増殖性動脈疾患および血管再狭窄の検出および治療における、ＲＣ− ９と称する遺伝子、およびコードされるタンパク質の新規な用途を提供する。本明細書で提供するヌクレオチドおよびアミノ酸配列ならびに抗体はかかる血管性疾患および損傷の診断およびモニター観察に有用である。これらの配列および抗体はさらに、アテローム性動脈硬化症および血管再狭窄に特徴づけられる他の症状の治療に有用な化合物の製造にも有用である。広範な動物種に由来するＤＮＡとのＲＣ−９ＤＮＡクロスハイブリッド形成の観察により、ＲＣ−９にコードされるタンパク質に関して、実質的な進化上の保存および重要な生物学的機能の可能性が示唆される。バルーン血管形成で損傷したラット頚動脈におけるＲＣ−９ｍＲＮＡの一時的発現は、そのタンパク質産生物が血管再狭窄の初期ないし中間の段階に役割を果たすことを示している。Ｉ．ＲＣ−９ポリヌクレオチド配列本発明の方法は本明細書に記載するＲＣ−９ポリヌクレオチド配列を利用できる。図１−４は本発明の新規な転写物のＤＮＡ配列を示す。図１は以下の実施例１に記載するように得られたクローンＲＣ−９のヌクレオチド配列[配列番号：１]示す。この部分配列は４２４塩基の長さであり、プローブとして用い、図２のより長い配列を得た。図２は、２個のイントロンを有する、ＲＣ−９のゲノムＤＮＡ配列[配列番号：２]を示す。イントロン１は塩基対１２１−７７２にわたり、イントロン２は塩基対１０００−１２７６にわたる。ポリＣトラクトは塩基対８６４−８７３および１２５４−１２７６に位置する。分岐点コンセンサス配列は図２の塩基対８５１−８５７および１２１２−１２１８に位置する。図３はラットＲＣ−９のｃＤＮＡ配列[配列番号：３]を示す。転写開始コドンは図３の塩基対１４３−１４５に位置し、停止コドンは塩基対５８１−５８３に位置する。図４はヒトＲＣ−９の６３６塩基対のＤＮＡ配列[配列番号：５]を示す。これらの配列は４４４塩基対のオープン・リーディング・フレーム（塩基対７２−５１６）を有し、これは１４７個のアミノ酸タンパク質[配列番号：６]をコードする。これらの配列のフラグメントは種々の用途に有用であることが判明している。望ましくは、これらの機能的フラグメントは長さが少なくとも約１５個のヌクレオチドであり、所望のアミノ酸配列、例えばエピトープ、望ましくは、ＲＣ−９様生物学的活性等により特徴づけられる治療上有用なペプチドをコードする。これらのＲＣ−９ヌクレオチド配列はポリメラーゼ連鎖反応またはクローニング技術を慣用的に用いることにより単離できる。別法として、これらの配列は慣用される遺伝子操作または化学合成技術を用いることにより構築できる。本発明の方法において用いる場合、ゲノムＲＣ−９ＤＮＡ配列(図１配列番号：１および図２配列番号：２)またはコード化ＲＣ−９タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列（図３配列番号：３および図４配列番号：５）またはその機能的フラグメントを修飾してもよい。本明細書に記載する配列データを用いて、本発明に有用なＲＣ−９タンパク質をコードする他のポリヌクレオチド配列を得ることは、当業者の範囲内である。核酸レベルでのかかる修飾は、例えばサイレントなまたはアミノ酸配列を変化させる、例えば発現または分泌を改善するためのヌクレオチド配列に対する修飾を包含する。さらに別法では、本明細書において有用なポリヌクレオチド配列は、望ましいならば、容易に評価可能なタグを付加して修飾し、定量化を促進することができる。例えばインビトロ突然変異誘発およびプライマー修復を包含する既知の技術により、ヌクレオチドを置換、挿入または欠失することができる。また遺伝暗号の自然縮退により引き起こされる対立遺伝子変異も包含する。本明細書に記載するＲＣ−９タンパク質をコードする核酸配列の単離に加え、アンチセンス配列のごとき例示されているＤＮＡ配列に相補的な配列を含め、他の核酸配列もまた本発明の範囲内である。高度なまたは中程度のストリンジェントな条件下で[Ｔ.Ｍaniatis ら、Ｍolecular Ｃloning(ＡＬaboratory Ｍanual )，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory，387-389（1982）を参照のこと]、図１ −４［配列番号：１、２、３、５］に示すＤＮＡ配列にハイブリダイズするこれらの配列もまた有用なＤＮＡ配列に包含される。高度にストリンジェントな条件の例としては、６５℃、４ｘＳＳＣでハイブリダイズし、続いて６５℃で０．１ｘＳＳＣで１時間洗浄することが挙げられる。別法として、高度にストリンジェントな条件の例は５０％ホルムアミド中４２℃で４ｘＳＳＣである。また、中程度に高度なストリンジェントな条件、例えば５５℃、４ｘＳＳＣでハイブリダイズし、続いて３７℃、０．１ｘＳＳＣで１時間洗浄するのもまた有用であることが判明している。また、中程度に高度なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、５０％ホルムアミド中３０℃で４ｘＳＳＣが挙げられる。以下により詳細に記載するように、これらのタンパク質をコードするＲＣ−９核酸配列は種々の診断および治療用途に有用である。有利なことに、核酸配列は、増殖性動脈疾患および血管再狭窄、とりわけ望ましくないＲＣ−９レベルまたは発現に付随する症状の検出および診断に使用するための診断用プローブおよびアンチセンスプローブとして有用である。オリゴヌクレオチドプローブはサザン・ブロッティングおよびポリメラーゼ連鎖反応のごとき標準的な診断技術において有用である。また、ＲＣ−９核酸配列は本発明の方法に有用なＲＣ−９タンパク質を製造するのに用いることができる。一度構築または単離したこれらのＤＮＡ配列または適当なフラグメントを用いて本発明のタンパク質をインビトロまたはインビボで得ることは好ましい。ＩＩ．ＲＣ−９アミノ酸配列本発明の方法は、本明細書に示すＲＣ−９タンパク質およびその適当な機能的フラグメントを包含する、ＲＣ−９アミノ酸配列を利用してもよい。ＲＣ−９ラットタンパク質[配列番号：４]は図３に示すｃＤＮＡ配列[配列番号：３]によりコードされ、ＲＣ−９ヒトタンパク質[配列番号：６]は図４に示すｃＤＮＡ配列[ 配列番号：５]によりコードされる。ラットタンパク質[配列番号：４]は長さが１４７個のアミノ酸であり、分子量が１６８２４．９ダルトンである。ヒトタンパク質もまた長さが１４７個のアミノ酸である[配列番号：６]。ＲＣ−９の生物学的に活性なフラグメントもまた本発明の方法に有用である。これらの機能的フラグメントは長さが少なくとも５個のアミノ酸であるのが望ましく、エピトープまたは他の望ましいアミノ酸配列を有していてもよい。ＲＣ−９タンパク質のアナログまたは修飾体もまた本発明では有用である。典型的には、かかるアナログはわずか１、２、３または４個のコドンの変化だけが異なり、ＲＣ−９様の生物学的活性により特徴づけられる。例えば、ＲＣ−９の図示されたアミノ酸配列（図３および４、配列番号：４および６）から少数のアミノ酸が変化したポリペプチド；とりわけ保存的アミノ酸置換されたポリペプチドが挙げられる。保存的置換は側鎖および化学的特性において関連する一連のアミノ酸内で起こる置換である。加えて、本発明で有用なＲＣ−９タンパク質を修飾し、例えばその産生を改良するか、タンパク質の安定性もしくは他の特徴、例えば結合活性もしくは生物学的利用率を増強するか、その用途を競合化合物をスクリーニングするのに向上させるか、またはタンパク質に関する他の幾つかの望ましい特性を付与してもよい。本明細書に記載するＲＣ−９タンパク質およびＲＣ−９タンパク質フラグメントは以下により詳細に記載する治療用組成物において有用である。本発明の方法はまた、これらのタンパク質の診断への適用、および抗ＲＣ−９抗体のごとき他の治療用および診断用試薬を製造するための使用をも包含する。一般に他のタンパク質と同様に、これらのＲＣ−９タンパク質はまたスクリーニングアッセイにおいてまたは研究用手段として供することができる。より望ましくは、ＲＣ−９タンパク質はまた例えば再狭窄において、ＲＣ−９の作用を妨げるのに有用な化学的な治療薬のスクリーニングおよび開発にも有用である。ＩＩＩ．ＲＣ−９の組換え発現本明細書に記載するＤＮＡ配列を用いて組換えＲＣ−９タンパク質を産生することができる。得られたタンパク質を本発明の方法において用いてもよく、あるいは本発明の方法がタンパク質のインビボ発現に関与していてもよい。ＲＣ−９タンパク質を製造するために、ＲＣ−９ＤＮＡ配列を適当な発現系に挿入してもよい。望ましくは、ＲＣ−９をコードするｃＤＮＡがＲＣ−９タンパク質の発現を可能とする異種発現調節配列に作動可能に連結している組換え分子またはベクターを構築する。標準的な分子生物学技術による、哺乳動物（ヒトを包含する）発現、昆虫例えばバキュロウイルス発現、酵母、真菌、および細菌発現のための多くの型の適当な発現ベクターおよび宿主細胞系が当業界で公知である。これらのベクターを適当な宿主細胞に形質転換することにより、選択されたＲＣ −９タンパク質の発現を得ることができる。多くの型が当業界で公知である他の適当な発現ベクターもまたこの目的で使用できる。この方法によってトランスフェクトするのに適当な宿主細胞またはセルラインは、スポドプテラ・フルギペデラ[Ｓpodoptera frugipedera（Ｓｆ９）]細胞のごとき昆虫細胞を包含する。かかる宿主細胞の構築および形質転換方法は周知である。[例えばＭillerら、Ｇenetic Ｅngineering，8:277-298（Ｐlenum Ｐress 1986）およびそこに引用される参考文献を参照のこと]。同様に、ヒト２９３細胞、ラット大動脈セルライン[Ｅ.Ｈ.Ｏhlstein ら、Ｅu r.Ｊ.Ｐharmacol.-Ｍol.Ｐharmacol.Ｓection.225:347-350(1992)]、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、サルＣＯＳ−１セルラインまたはスイス（Ｓwiss）、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウスに由来するネズミ３Ｔ３細胞のごとき哺乳動物細胞を用いてもよい。適当な哺乳動物宿主細胞および形質転換、培養、増幅、スクリーニング、製造および精製の方法は当業界で周知である。[例えばＧething およびＳambrook、Ｎature,293:620-625(1981)または別法として、Ｋa ufinan ら、Ｍol.Ｃell Biol.5(7):1750-1759（1985）もしくはＨowley ら、米国特許第4419446 号を参照のこと]。別の適当な哺乳動物セルラインはＣＶ−１セルラインである。細菌細胞も同様に宿主細胞として有用である。例えばイー・コリ（Ｅ.coli）の種々の株（例えばＨＢ１０１、ＭＣ１０６１、および以下の実施例で使用する株）はバイオテクノロジーの分野で宿主細胞として周知である。ビー・サブチリス(Ｂ.subtilis)、シュードモナス（Ｐseudomonas）、他の杆菌等の種々の株もまたこの方法において使用できる。当業者に周知の酵母細胞の多くの株もまた本発明の方法に有用なポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用できる。他の真菌細胞もまた発現系として用いることができる。かくして、本発明は、組み換えＲＣ−９タンパク質の製造方法であって、例えばトランスフェクションまたはエレクトロポレーションのごとき慣用される手段により、転写制御配列の調節下でＲＣ−９タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを含有する少なくとも１個の発現ベクターで宿主細胞を形質転換することからなる方法を提供する。次いで形質転換した宿主細胞をＲＣ−９タンパク質の発現を可能にする適当な条件下で培養する。例えば、宿主細胞例えばラット大動脈平滑筋細胞を、該細胞がＲＣ−９タンパク質の過剰発現能を有するのに十分なベクターでトランスフェクトし、その細胞をＲＣ−９発現を阻害する化合物をスクリーニングするのに有用なものとすることができる。別の具体例では、当業者に周知の適当な手段により、培養培地から（または細胞内に発現した場合、細胞から）発現したタンパク質を回収し、単離し、精製する。例えば、タンパク質は細胞溶解した後に可溶性形態で単離してもよく、または塩化グアニジンで抽出できる。望む場合、本発明のＲＣ−９タンパク質は融合タンパク質として製造できる。例えば、選択した宿主細胞においてタンパク質の発現を増強するか、または精製を改善するために、かかるＲＣ−９融合タンパク質を製造するのが望ましい。本明細書に記載するＲＣ−９タンパク質に適当な融合パートナーは当業者に周知であり、とりわけｂ−ガラクトシダーゼおよびポリヒスチジンを包含する。ＩＶ．抗ＲＣ−９抗体の製造ＲＣ−９タンパク質、ならびにその修飾体もしくはアナログ、またはそれらを発現する細胞は、ＲＣ−９に対する抗体を生成するための抗原として有用である。本発明の方法に有用な抗体はモノクローナル、ポリクローナル、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、およびＦａｂフラグメントを包含する。これらの抗体は、ＫohlerおよびＭilsteinのハイブリドーマ技術、Ｈuseら、Ｓcience,246:1275-1 281(1988)に記載されるごとき組み換え技術、または当該分野で公知の任意の他の変法を含め、常法により製造できる。一本鎖抗体の製造について記載した技術（米国特許第４９４６７７８号）を適用し、本明細書に記載するＲＣ−９タンパク質に対する一本鎖抗体を製造することができる。また、トランスジェニックマウス、または哺乳動物のごとき他の生物を用いて、ＲＣ−９タンパク質またはＲＣ−９誘導タンパク質に対するヒト化抗体を発現することができる。本発明の抗体その物を用いて抗イデオタイプ抗体を生成することができる。かかる抗体を産生する技術は当業界で周知である。本発明の抗体はタンパク質の形態で利用できる。また別に、本発明の抗体はインビボで抗体またはその機能的フラグメント（例えば一本鎖またはＦａｂフラグメント）を発現するポリヌクレオチドの形態で利用できる。Ｖ．診断用試薬本明細書に記載するＲＣ−９タンパク質、抗体、およびポリヌクレオチド配列（アンチセンスポリヌクレオチド配列を包含する）をＲＣ−９の産生または過剰産生に伴う特定の血管性疾患、例えばアテローム性動脈硬化症を診断するための診断用試薬として用いることができる。例えば、ＲＣ−９タンパク質、抗体、またはポリヌクレオチドはかかる症状に特徴的な血管損傷を診断するのに使用できる。これらの試薬を、診断または治療法に慣用される放射活性標識、比色酵素標識系等のごとき診断用標識を用いて標識することもできる。慣用される診断アッセイ例えばサザン・ブロッティング、ノーザンおよびウェスタン・ブロティング、ポリメラーゼ連鎖反応等で、選択した哺乳動物組織におけるＲＣ−９レベルを試薬により測定できる。例えば、ポリヌクレオチド配列を診断用物質として用いて正常なＲＣ−９ｍＲＮＡを検出もしくは定量してもよく、または患者のサンプル中の標的遺伝子ＲＮＡの突然変異を検出できる。かかる方法では図１−４[配列番号：１、２、３、５]の核酸配列に相補的なＰＣＲプライマーを利用できる。また別にハイブリダイゼーション、ＲＮase 保護、化学的開裂、直接的ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用、例えば制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）およびゲノムＤＮＡのサザン・ブロッテイングのごとき方法により、特異的ＤＮＡ配列（すなわちＲＣ−９）を検出できる。他の適当なアッセイではＲＣ−９タンパク質、タンパク質フラグメント、または抗ＲＣ−９抗体を試薬として利用する。これらのアッセイはラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタン・ブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイを包含する。適当なアッセイ様式および標識系の選択は当業者の範囲内であり、診断薬の分野における多大な技術に依るさらなる説明がなくても、容易に選択できる。従って、本発明はアテローム性動脈硬化症のごとき血管再狭窄により特徴づけられる障害の診断におけるこれらのＲＣ−９タンパク質、抗体またはポリヌクレオチド試薬の使用方法を提供する。この方法は選択したサンプル例えば血液、血漿、血清または他の適当な細胞を選択した試薬、タンパク質、抗体またはＤＮＡ配列と接触させ、サンプルに対する結合性またはハイブリダイゼーションまたは試薬に基づいて選択したアッセイ様式でサンプル中に存在するＲＣ−９量を測定し、検出することからなる。ＶＩ．治療用薬物本発明はさらに血管再狭窄の治療方法を提供する。さらにとりわけ、この方法は哺乳動物組織におけるＲＣ−９活性を遮断するための抗ＲＣ−９抗体を投与することからなる。ＲＣ−９がその対応する受容体に結合することを遮断するために使用できる抗イデオタイプ抗体もまた本発明の治療用薬物として有用である。望ましいわけではないが、治療用薬物はＲＣ−９核酸配列、該核酸配列を含有するベクターまたはＲＣ−９タンパク質であってもよい。また別に、以下に記載する方法を用いて得られた薬物は治療用薬物にできる。一例としては、治療用薬物は医薬用組成物中適当な経路で投与できる。通常、組成物は活性物質（例えば抗ＲＣ−９抗体、または本明細書に記載するベクターもしくはポリヌクレオチド）を体重ｋｇあたり約１０ｍｇから約１０ｍｇ含有する。当業者であれば、最適量を適応症、重篤度、投与経路等を考慮して調整できることは理解されよう。適当な医薬用担体は当業者に周知であり、とりわけセイライン、緩衝セイライン、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらを組み合わせたものから容易に選択できる。本発明の医薬用組成物は他の活性成分、または他の望ましい成分、例えばｐＨ調整物質、保存剤等を含有してもよい。適当な経路は当業者であれば容易に決定でき、例えば静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、皮内、経口、経膣、経肛門、鼻腔内、および局所経路を包含する。現在、好ましい投与方法は静脈内投与である。しかしながら、当業者は別の適当な投与経路を容易に選択できる。必要または望ましいならば投与を繰り返すことができる。ＶＩＩ．薬物スクリーニングおよび開発本発明はまたアテローム性動脈硬化症および他の血管性障害を治療するための治療用薬としての有用性を有する化合物またはタンパク質のスクリーニングおよび開発において、本明細書に記載するＲＣ−９タンパク質、抗体およびポリヌクレオチド配列を使用する方法をも提供する。一例としては、かかる化合物は、ＲＣ−９に結合し、その生物学的活性を亢進する（アゴニストとして作用）か、または遮断する（アンタゴニストとして作用）能力を有する。かかる化合物は前記する血管障害の治療または予防のための薬物成分として有用であると考えられる。現在、ＲＣ−９の選択された領域と競合的に結合する能力を有する薬物をスクリーニングおよび開発するための、慣用的なアッセイおよび技術がある。これらアッセイおよび技術はＲＣ−９タンパク質またはその一部を発現するためのファージ・ディスプレイ系を使用し、結合可能な化合物の結合を研究するためのタンパク質を製造するためにトランスフェクトしたイー・コリ(Ｅ.coli)または他の微生物の培養物を用いることからなる。例えばＧ.Ｃesarini、ＦＥＢＳＬetters ，307(1):66-70 （ 1992 年６月）；Ｈ.Ｇram ら、Ｊ.Ｉmmunol.Ｍeth.161:169-176（1993）;Ｃ.Ｓummerら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,89:3756-3760（1992年５月）を参照されたく、これは出典明示により本明細書の一部とする。本発明のこの態様で有用なタンパク質、抗体またはポリヌクレオチド配列を用いて、他の慣用される薬物スクリーニング技術を実施できる。一例として、ＲＣ −９ＤＮＡ配列に特異的に結合する化合物の同定方法は、簡単には、選択したＲＣ−９ＤＮＡフラグメントを試験化合物と接触させて、試験化合物をＤＮＡグラグメントに結合させ;ＤＮＡフラグメントに結合する試験化合物があればその量を測定する工程からなる。かかる方法は試験化合物および固体支持体に固定化したＲＣ−９ＤＮＡフラグメントをインキュベートすることを包含する。ＲＣ−９配列に特異的に結合する化合物を同定する別の方法は、固体支持体に固定化したＲＣ−９ＤＮＡフラグメントを、試験化合物およびＲＣ−９の受容体であり、該受容体をＲＣ−９ＤＮＡフラグメントに結合させるタンパク質配列の両方と接触させ；ＤＮＡフラグメントに結合する受容体の量を測定する工程からなっていてもよい。その試験化合物による正常なタンパク質の結合阻害は、ＲＣ−９に対する試験化合物の結合性を示す。潜在的アゴニストのＲＣ−９様効果、または潜在的アンタゴニストの効果は、例えば候補分子の細胞または適当な細胞調製物との相互作用の後のリポーター系の活性を測定し、ＲＣ−９またはＲＣ−９と同一の効果を惹起させることがわかっている分子の効果と比較することにより決定できる。この点において有用なリポーター系は製品に変換した比色標識基質、ＲＣ−９活性の変化に反応するリポーター遺伝子、および当業界で周知の結合アッセイを包含するがこれらに限定するものではない。他の適当な方法は当業者に周知である。このように、かかる方法を用いることにより、本発明はＲＣ−９またはそれの一部と相互作用し、望む場合その生物学的活性を増強または低減できる化合物を提供する。かかる化合物は本発明の範囲内である。ＲＣ−９のクローニングおよび発現を開示する以下の実施例は単なる例示であり、何ら本発明を限定することを意図するものではない。実施例１−ＲＣ−９の単離Ａ．ラット左総動脈バルーン血管形成以前に記載されるように[Ｅ.Ｈ.Ｏhlsteinら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ，90:6189-6193（1993）]、オスＳprague-Ｄawleyラット[３５０ｇ;Ｃharles Ｒiver ＢreedingＬaboratory Ｉnc.，Ｗilmington,ＭＡ]をペントバルビタール・ナトリウム麻酔[６５ｍｇ／ｋｇ、i.p.−Ｓteris Ｌaboratories,Ｐhoenix,ＡＺ]して、無菌条件下で左総頚動脈バルーン血管形成術を行った。簡単には、左外部の頚動脈を同定し、付着する組織を取り除き、２−ＦＦogarty動脈塞栓切除用カテーテル[１２−０６０−２Ｆモデル；Ｂaxter Ｈealthcare，Ｓanta Ａna ，ＣＡ]を挿入した。カテーテルを総頚動脈下方向に大動脈弓まで一定の距離誘導し、一定容量の流体で膨張させ、挿入部位まで引き戻す。この操作を合計３回行った。完了後、すぐにカテーテルを除去し、傷を閉じ（９−ｍｍＡutoclips; Ｃlay Ａdams，Ｆranklin Ｌakes，ＮＪ）、Ｐovadyne外科用スクラブ（７．５％ポビドン・ヨード−Ｃhaston Ｄayville，ＣＴ）を綿棒で塗る。動物を組織回収に必要になるまで標準的な実験用飼料および水を自由に摂取できるようにして、１２時間の明／暗サイクル下でプレキシガラスのケージに収容した。頚動脈を単離するために、ラットをバルビツレート（１００ｍｇ／ｋｇ、i.p. ）で麻酔し，大静脈を介して瀉血した。その場で左総頚動脈の付着組織を速やかに除去し、単離し、グアニジン・チオシアネート（Ｐromega Ｃompany,Ｍadison，ＷＩ）中に直接置いた。これらの容器を次いで即座に液体窒素中急速冷凍し、ＲＮＡ単離に必要となるまで−８０℃で保存した。その後のノーザン分析について、末処理動物からの組織（対照）、および転写物のディファレンシャル発現を、より詳細には一時的様式で実験するために、６時間、３日、および１４日前に血管形成を施した動物からの組織を試験した。ノーザン分析をシャム・ベッセル（ sham vessel）でも実施した。Ｂ．ＲＮＡ単離およびノーザン分析各時点での実験のために、４または５個の左頚動脈をプールさせるか、または培養物からＶＳＭＣをを単離し、全ＲＮＡを記載されるように入手した[Ｐ.Ｃhom czynskiおよびＮ.Ｓacchi、Ａnn.Ｂiochem.162:156-159（1987）]。等量のＲＮＡを装填し、１．３％アガロース／ホルムアルデヒド・ゲルで分離し、ニトロセルロースに移し、指示したプローブでハイブリダイゼーションした(０．２５ＭＮａＣｌ、１％ドデシル硫酸ナトリウム、５０％ホルムアミド、２Ｘデンハート溶液、２５ｍｇ変性サケ精子ＤＮＡ、５％硫酸デキストラン、４２℃で一晩) 。ブロットを高度にストリンジェントな条件下で洗浄し（０．１％クエン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、６５℃）、フィルムに−８０℃で６−４８時間曝露した。全プローブをランダム・プライミング法により[ａ³²Ｐ] −標識した（Ｂoehringer Ｍannheim，Ｉndianapolis In.）（全アイソトープはＡmersham Inc.，Ａrhngton Ｈeights ＩＬ.より入手）。同一のフィルターを取り除き、続いて種々のＤＮＡプローブでハイブリダイゼーションした。グリセロアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）プローブをＰＣＲ増幅物から生じた（Ｃlontech,Ｐalo Ａlto,ＣＡ.）。ハイブリダイゼーション・シグナルの相対的強度は、フィルムの直線的変動内で曝露したオートラジオグラムのデンシオメトリック・スキャニング（ＲＦＬＰ-Ｓcan Ｓoftware，Ｓ canalytics,Ｉnc.)により得た。ヒトおよび多組織ノーザンブロットをＣlontech ,Ｉnc．(Ｐalo Ａlto,ＣＡ.)より購入した。Ｃ．ｍＲＮＡのディフェレンシャル・ディスプレイ対照左総頚動脈および先にバルーン血管形成を３および１４日前に行った左総頚動脈の全ＲＮＡを単離し、ディフェレンシャル・ディスプレイ技術を用いて遺伝子発現の変化を試験した。製造者プロトコルに準じて、ＤＮＡ消化、（１ＵＤＮase；Ｇibo-ＢＲＬ，Ｇaithersberg,ＭＤ)，フェノール／クロロホルム抽出、およびエタノール沈殿の一連の方法を用いて全ＲＮＡからＤＮＡを除去した。精製した全ＲＮＡ（０２ｍｇ）を修飾したオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写した（逆転写酵素はＧenＨunter Ｃorporation,Ｂrooklin,ＭＡより入手）[Ｐ.Ｌi angら、Ｓcience,257:967-971（1992）]。ｃＤＮＡを増幅し、適当な３’オリゴｄＴプライマー、ｄＮＴＰ、[³⁵Ｓ]ｄＡＴＰ、および任意の１０量体５’プライマー（ＧenＨunter）との１０％逆転写反応物を包含することにより標識した。以下のパラメーターでＰＣＲサイクルを４０回実施した：９４℃で３０秒；４０ ℃で１２０秒；７２℃で４５秒で最後のサイクルの後、７２℃で７分浸す。反応物から得た標識ｃＤＮＡを６％アクリルアミド・配列決定用ゲルで分離し、乾燥し、オートラジオグラフ用フイルムに１２−４８時間曝露した。３日目の容器中の遺伝子発現は損傷形成の病因の初期の分子学的様相を示しており（すなわち、これらは新内膜損傷の物理学的形成の前に起こる）、一方１４日目の容器は後期の様相を示している(すなわち、最終損傷容量の約８０％は新内膜内で形成される)[Ｓ.Ａ.Ｄouglasら、Ｅur.Ｊ.Ｐharmacol.255:81-89（1994 ）]。この実験では、これらのサンプルからのＲＮＡは４個のオリゴｄＴアンカープライマー全てを用いて逆転写し、得られたｃＤＮＡを２個の異なる５’十量体を用いて増幅した。最初配列決定用ゲルの上部の３個のバンドに注意を払う、というのはこれらのサンプルは長く、従ってＤＮＡ配列の同定を容易にするからである。配列決定用ゲルの上部の３個に注目して、バンドの１０％以下は分別的に発現していると思われた（８２個中８個）。この最初の実験では、分別発現を表示する２個のバンドを選別した。Ｄ．ｃＤＮＡの回収再増幅およびクローニング選別したｃＤＮＡを配列決定用ゲルから削り取り、溶出し、前記したのと同一のプライマーを用いて再増幅した[Ｌiang ら、前記で引用]。再増幅したＰＣＲ産生物を２．０％アガロース・ゲル上で、臭化エチジウムで染色して可視化し、ガラス抽出（Ｂio 101，Ｌa Ｊona,ＣＡ）により回収した。再増幅したＰＣＲ産生物を前記したプローブのように標識し、Ｉnvitorogen ＴＡクローニング系（Ｓan Ｄ iego,ＣＡ)を用いてｐＣＲＩＩベクターにクローニングし、応用バイオシステムモデル３７３Ａ自動配列決定装置で配列決定した。ＤＮＡセグメントをアクリルアミド配列決定用ゲルから削り取って回収し、溶出し、同一のプライマーおよび反応条件を用いてＰＣＲ増幅した。再増幅により単一の産生物を得、その大きさはアクリルアミド配列決定用ゲルに表示される見かけの大きさと合致する（データは示していない）。これらの再増幅物を次いでゲルからガラス精製し、ノーザン分析用のプローブとして使用した。試験したラット組織のうち２個だけがＲＣ９転写物を発現した。精巣ＲＮＡは約１．３５ｋｂの強いシグナルを示し、頚動脈で観察された１．１ｋｂよりわずかに大きかった。２番目に、約１．１ｋｂのより弱いシグナルが脾臓で観察された。どのｃＤＮＡを選別すべきかという情報に加えて、このデータはこの転写物の発現が組織特異的であり、精巣から脾臓までの大きさの差異は、このｍＲＮＡ転写物のプロセッシングまたは異なる組織の類似するメッセージの存在を示唆することを示している。未処理ラット頚動脈およびバルーン血管形成後３時点で単離した頚動脈からの全ＲＮＡを、ノーザン分析においてこれらのＤＮＡフラグメントでプロービングし、分別発現を確認した。これらのＤＮＡの各々は別個の遺伝子転写を示すことが見出された。ノーザン分析によりその発現パターンが立証された。ＲＣ−発現は未処理の容器中では検出されず、手術後６時間では低レベルで検出され、３日で最高レベルに達し、１４日の容器では低減し、ディフェレンシャル・ディスプレイ・ゲルで観察されたパターンを確認した。偽の対照容器ではＲＣ９ｍＲＮＡの発現は検出されなかった。これらのｃＤＮＡの各々をｐＣＲＩＩベクターにサブクローニングし、両方向でジデオキシ配列決定を行った。ＲＣ９クローンは４２４塩基（図１、配列番号：１）であり、ジーンバンクに以前に寄託された特徴的な遺伝子に著明な配列相同性を示すものはなかった。実施例２−ＲＣ−９の単離ＲＣ９は、バルーン血管形成後のラット頚動脈のディフェレンシャル・ディスプレイ分析から単離した４２４ｂｐのゲノムＤＮＡフラグメントの一部であり、前記の実施例１に記載するとおり、約１．１ｋｂのｍＲＮＡを同定した。この転写物を十分に同定し、特徴づけるために、遺伝子全長を得ることが必須である。再狭窄ラット頚動脈から調製したｃＤＮＡライブラリーは利用できないので、このメッセージを発現するラット組織を同定し、次いでこの組織由来のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする必要があった。Ａ．ｃＤＮＡライブラリー・スクリーングラット精巣ｃＤＮＡライブラリー（Ｓtratagene，Ｉnc．）を高度にストリンジェントな条件下（０．１ＸＳＳＰＥ、６５℃）、４２４ｂｐＲＣ９[配列番号：１]でスクリーニングした。このプローブを用いて約７２０００個のプラークをスクリーニングし、３ラウンドのスクリーニングの後、このうち３個が陽性であった。各々がベクター・ポリリンカーの一部としてＥｃｏＲＩ部位でフランキングされた約１．６８ｋｂのインサートを含有するこれらの３個のクローンを得、制限分析により同一であることが示された。１個のクローンを選別し、ＲＣ９特異的プライマーを用いるジデオキシヌクレオチド配列決定により、ＲＣ−９に対する相同性が９８％であることが示され、またバルーン血管形成に供したラット頚動脈をも用いてプロービングし、ｍＲＮＡ発現によるこのクローンの同一性を確認した。末処置ラット頚動脈由来およびバルーン血管形成後３時点（１、３および７日）で単離した頚動脈由来の全ＲＮＡを大きさで分別し、ＲＣ−９のインサートを示す放射性標識ＰＣＲ産生物でハイブリダイゼーションした。より具体的には、全ＲＮＡ（１０ｍｇ）を１．２％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで分離し、ニトロセルロースに移し、ハイブリダイゼーションし、前記するように洗浄した。グリセロアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ(Ｇ３ＰＤＨ)プローブをローディング対照として使用した。グリセロアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）に標準化したこのブロットのスキャニング・デンシオメトリック分析により、このメッセージの発現においてバルーン血管形成後１日で基底レベルの９倍、３日後で４倍、および術後７日で２倍に増加するのが確認された。この発現パターンは、未処置容器中で検出される基底レベルは例外として、ＲＣ９ディフェレンシャル・ディスプレイで観察されたものと合致し、バルーン血管形成に反応してラット頚動脈においてこの遺伝子発現に類似したものが誘導されることが示されら。偽の対照容器からのＲＣ−９−１ｍＲＮＡのノーザン分析では基底発現における変化が認められなかった（データは示していない）。Ｂ.配列分析前記するように、クローンを両方の鎖で全長にわたって配列決定した（Ｓeque nase,Ｕnited Ｓtates Ｂiochemical Ｃorporation）。Ｍac Ｖectorソフトウェア・パッケージ（Internatinal Ｂiotechnologies，Ｉnc.）を用いてＤＮＡおよびタンパク質配列を分析した。配列類似性の調査をＧenＢank Ｎudeic Ａcid Ｄ atabaseおよびＧenetics Ｃomputer Ｇroupプログラムを用いて実施した。このクローンに由来する１．６８ｋｂのインサートの３’領域のディフェレンシャル・ディスプレイにより得られた４２４ｂｐのフラグメントとの相同性は９８％と同定し、さらにこのクローンとＲＣ９の配列との同一性を確認した。核酸クローンＲＣ−９−１を図２、配列番号：２に示す。図２[配列番号：２]の配列を続いて分析し、塩基対８６４−８７３、および１２５４−１２７６でポリＣトラクトが存在し、塩基対８５１−８５７、および１２１２−１２１８で分枝点コンセンサス配列が存在することが示された。このことは配列がイントロン配列を包含することを示している。さらなる分析により２個のイントロンが同定された。イントロン１は図２の塩基対１２１−７７２にわたり、イントロン２は塩基対１０００−１２７６にわたる。図２[配列番号：２]の配列を用いて以下の実施例３に記載するように、ＲＣ−９ｃＤＮＡクローンが得られる。Ｃ．ゲノムＤＮＡ種分析図２、配列番号：２のＲＣ−９配列の進化上の保存を決定するために、ヒト、サル、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ウサギ、ニワトリ、および酵母［サッカロミセス・セルビシア（Ｓaccaromyces cervisiae）］を包含する広範な動物種に由来する、ＥｃｏＲＩ消化したゲノムＤＮＡを用いてサザン・ブロット分析を実施した。９種の異なる動物種に由来する消化したゲノムＤＮＡ４ｍｇを含有するゲノムＤＮＡサザン・ブロットをＣlontech，Ｉnc.（Ｐalo Ａlto,ＣＡ）より購入し、製造者の指示書に準じて、高度にストリンジェントな条件下(５Ｘクエン酸ナトリウム、１０％デンハート溶液、１００ｍｇ／ｍｌのシアリングしたサケ精子ＤＮＡ、１％ドデシル硫酸ナトリウム、６５℃で、一晩）でＲＣ−９−１ｃＤＮＡクローン全長でハイブリダイゼーションした。ブロットを低(２．０Ｘ硝酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、５５℃）、または高度にストリンジェント（０．２Ｘクエン酸ナトリウム、１％ドデシル硫酸ナトリウム、６５ ℃)な条件下で洗浄し、オートラジオグラフィーに供した。図２[配列番号：２]のＲＣ−９−１ＤＮＡを、低ストリンジェント洗浄条件下(２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃）で種々の種に由来する多くの制限断片にハイブリダイゼーションし、最も顕著なものはラットおよびウシの両方の２４ｋｂフラグメント、並びにマウスの４．４ｋｂフラグメントであった。イヌ、マウス、ラットおよびウシにおいて他のバンドも検出された。ウサギ、ニワトリ、または酵母ではバンドは可視化されなかった。あまり顕著でないバンドも多くこのストリンジェント条件下で観察され、ヒト、ラット、およびウシの可視化された約２．３および１．０ｋｂの長さのバンドを包含する。マウスにおける２．５ｋｂでの強いシグナルも顕著である。高度にストリンジェントな洗浄条件下（０．２ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃）でこれらのバンドは殆ど可視下されず、ラットで２４ｋｂおよびマウスで４．４ｋｂの残りの顕著なバンドは強度の変化はない。マウスにおける２．５ｋｂのバンドはもはや認められず、これはこのバンドが図２[配列番号：２]のＲＣ−９−１配列と交差ハイブリダイゼーションする別の遺伝子を示すことを示唆している。従って、ＲＣ−９−１転写物は良く保存されると考えられる。実施例３−ＲＣ−９のｃＤＮＡクローニング試験したラットｍＲＮＡを前記するように単離し、逆転写してオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを生じた。ＲＣ−９プライマーをＲＣ−９ゲノムＤＮＡ（図２、配列番号：２）の最端から選択した。とりわけ、センスプライマー（２５量体オリゴヌクレオチド）は図２[配列番号：２]のヌクレオチド３１−ヌクレオチド５５に対応し、５’−ＡＣＴＴＣＡＧＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＣＣＣＴＡＣＧＧ−３’の配列を有し；アンチセンス・プライマーは図２[配列番号：２]のヌクレオチド１６５１−１６７８に対応し、５’ＧＣＡＴＣＡＧＧＧＡＧＣＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＧＴＴＴ−３’の配列を有する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＲＣ−９ｃＤＮＡを得た。以下のパラメーターを用いてＰＣＲサイクルを４０回実施した：９４℃で１分；５３ ℃で１分」；７２℃で３分、最後のサイクルの後４℃で浸す。ＲＣ−９ｃＤＮＡを１％アガロースゲルで分離し、標準的な技術を用いて精製した。ＲＣ−９ｃＤＮＡをベクターｐＣＲＩＩ[Ｉn Ｖitrogen]にライゲーションし、クローンを単離し、ＥｃｏＲＩで制限酵素消化し、これらが正確な大きさのインサートを含有することを確認した。陽性クローンを配列決定し、図２のゲノム配列と比較した。ｃＤＮＡ配列の一部をそれによりコードされるアミノ酸配列と共に図３[ 配列番号：３]に示す。図３の配列は６９６塩基対の長さである[配列番号：３] 。図３のヌクレオチド７２−６９６に対応するｃＤＮＡで相同性研究を実施し、これにより、ｃＤＮＡ配列[配列番号：３]は図２[配列番号：２]のＲＣ−９ゲノム配列に９８％相同であることが示された。配列番号：３および４は、以前にＷＯ９５／１７５０６に記載されるラットＡＩＦ配列と実質的に同一であることが見出されている。実施例４−ＲＣ−９の機能制限エンドヌクレアーゼＢｓｔＸ１を用いて、実施例３のＲＣ−９クローンをｐＣＲＩＩプラスミドから切断した。ＲＣ−９ＤＮＡを精製し、予めＢｓｔＸ１で切断し、イー・コリ(Ｅ.coli)中で成長させた発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ(Ｉ nvitorogen Inc.)にライゲーションした。伸長するために正しい配向でＲＣ−９を含有する単一の細菌性コロニーを選別した。ｐＲｃ／ＣＭＶ中ＲＣ−９を有する精製ＤＮＡを得た。ラット大動脈平滑筋（ＲＡＶＳＭ）細胞をｐＲｃ／ＣＭＶプラスミド単独でか、またはＲＣ−９を含有するプラスミドｐＲｃ／ＣＭＶでトランスフェクションした。トランスフェクションすべきＤＮＡ（ｐＲｃ／ＣＭＶまたはｐＲｃ／ＣＭＶＲＣ −９）と混合したＬipofect ＡＭＩＮＥ試薬（Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.)を用いてトランスフェクションした。Ｌipofect ＡＭＩＮＥ試薬によりＤＮＡが細胞膜を通過できるようになり、実際ＤＮＡを宿主の染色体に組み込むことができる。トランスフェクションの２日後、化合物Ｇ４１８（Ｇeneticin）を細胞に加えた。Ｇ４１８はｐＲｃ／ＣＭＶプラスミドを含有しない細胞を殺し、ｐＲｃ／ＣＭＶまたはｐＲｃ／ＣＭＶＲＣ−９を含有する細胞のみを残す。トランスフェクションしたＲＡＶＳＭをＧ４１８存在下、ＲＣ−９に関する機能研究のために成長させた。ｐＲｃ／ＣＭＶまたはｐＲｃ／ＣＭＶＲＣ−９のどちらかを含有するＲＡＶＳＭを同一濃度でＴ−１５０フラスコに播種し、５または７日間ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｇ４１８中成長させた。次いで細胞をトリプシン処理し、増殖における差異を見出すためにヘモサイトメーターを用いて計数した。５日目にｐＲｃ／ＣＭＶの細胞数は４．５５ｘ１０⁴±８．５ｘ１０³セル／ｃｍ²（Ｔ−１５０フラスコ＠１５０ｃｍ²中）であり、ｐＲｃ／ＣＭＶＲＣ−９の細胞数は１．２２ｘ１０⁵±５ｘ１０²セル／ｃｍ²であり；変化は１６８％であった。７日目の細胞数は類似の結果であった：ｐＲｃ／ＣＭＶの細胞数は５．９３ｘ１０⁴±５．５ｘ１０³セル／ｃｍ²（Ｔ−１５０フラスコ＠１５０ｃｍ²中）であり、ｐＲｃ／ＣＭＶＲＣ−９の細胞数は１．８４ｘ１０⁵±３．７ｘ１０⁴セル／ｃｍ²であり；変化は２１０％であった。細胞数データにより、ＲＣ−９を含有するＲＡＶＳＭは対照細胞よりも速い速度で増殖することが明確に示された。実施例５−ヒトＲＣ−９の組織発現本明細書に記載するヒトＲＣ−９配列、配列番号：５および６は以前にＷＯ９５／１７５０６に記載されたヒトＡＩＦ配列と実質的に同一である。ヒトＲＣ− ９[配列番号：５]で形質転換したイー・コリ（Ｅ.coli）は元来pＢluescriptに発現するが、成長し、陽性クローンが同定された。ゲル精製ｃＤＮＡプローブ（ＰＣＲにより生じる）を用いて、前記するように、ノーザン「ドット・ブロット」分析により、ヒトＲＣ−９ｍＲＮＡ発現を評価した。発現、シクロフィリンを用いた標準化はＣＮＳ、ＧＩ／尿生殖管および驚くことに、心臓、大動脈および精巣の種々の領域からの「正常な」ヒト組織において相対的に低値であった（ｈＲＣ−９により定義：シクロフィリンの比率＜１．３）。（この最後の観察は、ラットＲＣ−９[配列番号：３]がラット精巣ｃＤＮＡライブラリーに由来するクローンであったので特に興味深い）。しかしながら、発現は炎症細胞機能に関連する器官において数倍に上昇した(骨髄＞胸腺＞脾臓＞末梢血白血球、例えばｈＲＣ−９：シクロフィリンの比率＞６．０）。胎児組織では同様の発現パターンが示された（例えば、胸腺、脾臓で発現は最大）。ヒト「疾病」組織ブロットでは、ミトゲン（ＴＧＦｂまたはアンジオテンシンＩＩ）刺激血管平滑筋細胞に存在するｍＲＮＡが増強され、これにより成長因子刺激に関連するヒトＲＣ−９[配列番号：６]のアップレギュレーションが示された。組織分析により、高血圧、うっ血性心不全および心筋梗塞に関連する（例えば心臓および腎臓における）ヒトＲＣ−９ハイブリダイゼーションの上昇は細胞性増殖／分化および繊維増殖障害の病因の対照におけるヒトＲＣ−９[配列番号：５および６]の役割に合致することが示された。平均的な発現に相対的に合致して、以前に血管形成を行った血管の新内膜に由来する血管平滑筋において、ヒトＲＣ−９ｍＲＮＡ発現もまた増加した。本明細書に引用した全ての参考文献は出典明示により本明細書の一部とする。本発明の特定の具体例を特に記載したが、多くの修飾および変更を行うことができることは当業者には明らかであろう。従って、本発明は示した特定の具体例により限定することを意味するものではなく、むしろ範囲は以下の請求の範囲によってのみ規定されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者オーティーリ，マイケル・ビクターアメリカ合衆国19442ペンシルベニア州ブルー・ベル、クリアビュー・アベニュー 1565番

Claims

【特許請求の範囲】１．ＲＣ−９の過剰産生により特徴付けられる増殖性動脈疾患の診断方法であって、（ａ）患者から由来のサンプルを、検出可能な標識と結合させた（ｉ）ＲＣ−９に対する抗体；（ii）ＲＣ−９ポリヌクレオチド配列；および（iii）ＲＣ−９タンパク質；からなる群から選択される診断用試薬と接触させること：（ｂ）該試薬と該サンプル中のＲＣ−９を結合させることにより、該サンプル中のＲＣ−９の存在を検出すること：からなる、増殖性動脈疾患の診断方法。２．抗体を、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂフラグメントおよび一本鎖抗体からなる群より選択する、請求項１記載の方法。３．抗体がモノクローナル抗体である請求項２記載の方法。４．ポリヌクレオチド配列が、（ａ）配列番号：１からなるＤＮＡ配列；（ｂ）配列番号：２からなるＤＮＡ配列；（ｃ）配列番号：３からなるＤＮＡ配列；（ｄ）配列番号：４からなるＤＮＡ配列；（ｅ）前記した（ａ）から（ｄ）のＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列；（ｆ）ストリンジェント条件下で（ａ）から（ｄ）へのハイブリダイズ能を有する配列；（ｇ）ＲＣ−９様生物学的活性を有する（ａ）から（ｄ）のフラグメントおよびアナログ；からなる群より選択される、請求項１記載の方法。５．ＲＣ−９タンパク質が、（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号：６のアミノ酸配列；（ｃ）（ａ）または（ｂ）のアナログ；および（ｄ）５個のアミノ酸を有してなり、ＲＣ−９様生物学的活性により特徴づけられる、（ａ）または（ｂ）のフラグメント；からなる群から選択される、請求項１記載の方法。６．ＲＣ−９に対する抗体を含んでなる医薬組成物を患者に投与することからなる、ＲＣ−９の過剰産生により特徴づけられる増殖性動脈疾患の処置方法。７．抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂフラグメントおよび一本鎖抗体からなる群より選択される、請求項６記載の方法。８．抗体がモノクローナル抗体である請求項７記載の方法。９．選択されたＲＣ−９ＤＮＡ配列に特異的に結合する化合物の同定方法であって、該ＲＣ−９ＤＮＡ配列を試験化合物と接触させて、該試験化合物を該ＤＮＡ配列と結合させ、該ＤＮＡ配列に結合する試験化合物の量を測定する方法。１０．ＲＣ−９ＤＮＡ配列を固体支持体に固定する請求項９記載の方法。１１．選択されたＲＣ−９アミノ酸配列に特異的に結合する化合物の同定方法であって、該ＲＣ−９アミノ酸配列を試験化合物と接触させて、該試験化合物を該アミノ酸配列と結合させ、該アミノ酸配列に結合する試験化合物の量を測定する方法。１２.ＲＣ−９アミノ酸配列を固体支持体に固定する請求項１１記載の方法。１３．選択されたＲＣ−９抗体に特異的に結合する化合物の同定方法であって、該ＲＣ−９抗体を試験化合物と接触させて、該試験化合物を該抗体と結合させ、該抗体に結合する試験化合物の量を測定する方法。１４．ＲＣ−９抗体を固体支持体に固定する請求項１３に記載の方法。１５．一群の化合物をＲＣ−９タンパク質、ＲＣ−９ＤＮＡ配列または抗ＲＣ −９抗体でスクリーニングすることにより得られる、ＲＣ−９活性の阻害能を有する化合物。１６．ＲＣ−９の過剰産生により特徴付けられる増殖性動脈疾患の治療用医薬の製造におけるＲＣ−９抗体の使用。