JP2000503848A

JP2000503848A - 植物におけるトランスジーンの制御された発現のための植物組織／期特異的プロモーター

Info

Publication number: JP2000503848A
Application number: JP9527109A
Authority: JP
Inventors: アンケロッグ，ジル; キースベストウィック，リチャード
Original assignee: アグリトープ，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-01-29
Filing date: 1997-01-27
Publication date: 2000-04-04
Also published as: AU712460B2; CA2243969A1; KR19990082128A; EP0877813A1; WO1997027308A1; KR19990082127A; US5783393A; AU1846697A; US5783394A; US5929302A

Abstract

(57)【要約】本発明は、（i）目的の産物をコードするDNA配列、および（ii）dru1プロモーターを有するキメラ遺伝子であって、ここで該DNA配列が、プロモーターに対して異種であり、そして該DNA配列が、該産物の発現が可能になるように該プロモーターに作動可能に連結されている、キメラ遺伝子に関する。本発明は、キメラ遺伝子を有するベクター、細胞、植物、および果実、ならびにそれらに関連した方法を記載する。

Description

【発明の詳細な説明】植物におけるトランスジーンの制御された発現のための植物組織／期特異的プロモーター発明の分野本発明は、組織および／または期特異的な植物プロモーターおよび組成物の同定および特徴付けならびにこのようなプロモーターを使用する方法に関する。参照文献 Ausubel,F.M.,et al.,in CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John W iley andSons,Inc.,MediaPA(1992). Becker,D.,et al.,Plant Mol.Biol.20:1195-1197(1992). Bellini,C.,et al.,Bio/Technol 7(5):503-508(1989). Benfey,P.N.,et al.,Science 250:pages 959-966(1990). Bestwick,R.K.,et al.,PCT International Publication No.WO 95/35387,pu blished 28December 1995. Chang,S.,et al.,Plant Mol.Biol.Reporter 11(2):113-116(1993). Comai,L.and Coning,A.J.,U.S.Patent No.5,187,267,issued 16 February,1 993. Cordes,S.,et al.,The Plant Cell 1:1025-1034(1989). Dayhoff,M.O.,in ATLAS OF PROTEIN SEOUENCE AND STRUCTURE Vol.5,Nation al Biomedical Research Foundation,pp.101-110,and Supplement 2 to this vo lume,pp.1-10(1972). Doyle,J.J.and Doyle,J.L.,Focus 12:13-15(1990). Ferro,A.J.,et al.,U.S.Patent No.5,416,250,issued 16 May 1995. Hajdukiewicz,P.,et al.,Plant Mol.Bio.25:989-994(1994). Hamilton,A.J.,et al.,Nature 346:284-287(1990). Herreraestrella,L.,et al.,World Journal of Microbiology & Biotechnol ogy.11(4):383-392(1995). Holdsworth,M.J.,et al.,Nuc.Acids Res.15:731-739(1987). Houck,C.M.and Pear,J.R.,U.S.Patent No.4,943,674,issued 24 July 1990. Hughes,J.A.,et al.,J.Bact.169:3625-3632(1987). Jefferson,R.A.,et al.,EMBO J.6:3901(1987a). Jefferson,R.A.,Plant Mol.Biol.Rep.5:387(1987b). Jorgensen,R.A.,et al.,U.S.Patent No.5,034,323,issued 23 July 1991. Jorgensen,R.A.,et al.,U.S.Patent No.5,231,020,issued 27 July 1993. Kawasaki,E.S.,et al.,in PCR TECHNOLOGY: PRINCIPLES AND APPLICATIONS OF DNAAMPLIFICATION (H.A.Erlich,ed.)Stockton Press(1989). Klee,H.J.,et al.,Plant Cell 3:1187-1193(1991). Klein,T.M.,et al.,PNAS(USA)85(22):8502-8505(1988). Kyte,J.,and Doolittle,R.F.,J.Mol.Biol.157:105-132(1982). Laemelli,U.K.,Nature 227:680-685(1970). Lin,E.,et al.,Plant Mol.Biol.23:489-499(1993). Maniatis,T.,et al.,in MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL,Cold Sp ring Harbor Laboratory(1982). Mathews,H.,et al.,PCT International Publication No.WO 95/35388,publi shed 28December 1995. Melchers,L.S.,et al.,Plant Mol.Bio.21:583-593(1993). Melchers,L.S.,et al.,Plant J.5:469-480(1994). Miki,B.L.A.,et al.,in PLANT DNA INFECTIOUS AGENTS(Hohn,T.,et al.,Eds .)Springer-Verlag,Wien,Austria,pp.249-265(1987). Mullis,K.B.,et al.,U.S.Patent No.4,683,195,issued 28 July 1987. Mullis,K.B.,U.S.Patent No.4,683,202,issued 28 July 1987. Ni,M.,et al.,Plant J.7:661-676(1995). Ochman,H.,et al.,in AMPLIFICATION OF FLANKING SEQUENCES BY INVERSE P CR IN PCRPROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS (Innis,et al.,Eds .)Academic Press,pp.291-227(1990). Oeller,P.W.,et al.,Science 254:437-439(1991). Pearson,W.R.,Methods in Enzymology 183:63-98(1990). Pearson,W.R.and Lipman,D.J.,PNAS 85:2444-2448(1988). Ponstein,A.S.,et al.,Plant Physiology 104:109-118(1994). Saiki,R.K.,et al.,Science 239:487-491(1988). Sambrook,J.,et al.,in MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL,Cold Sp ring Harbor Laboratory Press,Vol.2(1989). Sato,T.,and Theologis,A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6621-6625(1989). Schuch,W.,Euphytica.79(3):287-291(1994). Sheehy,R.E.,et al.,J.Bact.173:5260-5265(1991). Toubart,P.,et al.,Plant J.3:367-373(1992). Van der Straeten,D.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:4859-4863(1990) . Van Haaren,M.J.J.,et al.,Plant Mol.Bio.21:625-640(1993). Walkerpeach,C.R.,et al.,Plant Molecular Biology Manual,B1:1-19(1994) . Wang,A.M.,et al.in PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATION S (M.A.Innis,et al.,eds.)Academic Press(1990). Woloshuk,C.P.,et al.,J Plant Cell 3:619-628(1991). Zhu,Q.,et al,Plant Cell 7:1681-1689(1995). 発明の背景近年、組換えDNA技術は、伝統的な植物育種プログラムの多くの制限を回避するのに使用されている。この技術は、実験者に（i）所望の遺伝子（例えば、疾患および昆虫耐性を与える産物を発現する遺伝子（Herreraestrellaら，1995））を同定しクローン化し、（ii）このような遺伝子を植物に移入し（Walkerpeac hら、1994）、そして（iii）選択された植物表現型をこのような遺伝子の発現により改変する（Ferroら、1995;Benfeyら、1990;Kleeら、1991）ことを可能にしてきた。植物における選択された遺伝子の発現に有用な植物プロモーターの多数の例が、現在入手可能である（Zhuら、1995；Niら、1995）。これらのプロモーターは、植物において、外来の（または、異種の）遺伝子の発現を駆動するのに使用されている。ほとんどの場合、遺伝子の５’非コード領域（すなわち、コード領域のすぐ５’側の領域）が、キメラ遺伝子を生成するのに使用されてきた。これらの領域は、しばしば、プロモーターまたは転写制御配列といわれる。植物において選択された核酸配列の発現に有用なプロモーターは、植物DNA由来であるか、または他の供給源（例えば、植物ウイルス）由来であり得る。ほとんどの場合、約500〜1500塩基までの配列が、それらの制御下の遺伝子の発現の調節を可能にすることが示されている。トランスジェニック植物における異種遺伝子または遺伝子の選択された配列の発現は、代表的に、構成的プロモーターの使用を含んだ。植物プロモーターの例は、以下を含む：35Sカリフラワーモザイクウイルス（CaMV 35S）、マンノピンシンターゼ、およびオクトピンシンターゼ（ocs）。このようなプロモーターは成功的に、形質転換した植物組織における異種の核酸配列の発現を指向するために使用されてきた。しかし、トランスジェニック植物においてDNA配列を発現することに使用された場合、これらのプロモーターは、代表的には低レベルの構成的発現（すなわち、全ての植物組織における発現）を提供する。他のプロモーターは、組織特異的発現、例えば、果実特異的発現を可能にすることが同定されている（例えば、トマト由来のE4およびE8プロモーター（Cordes ら、1989；Bestwickら,1995））。また、トマト2AII遺伝子（Van Haaren）の５ ’非コード領域の調節制御下に配置された核酸配列は、果実組織の発達において、優先的に転写されることが示されている。キーウィーアクチニジンプロモーターの果実特異的制御がトランスジェニックペチュニア植物においても保存されていることが報告された（Linら、1993）。発明の要旨本発明は、その制御下に配置した核酸配列の高レベルの組織特異的な発現を可能にするプロモーターを包含する。本発明のキメラ遺伝子は、dru1プロモーターの転写調節下に目的の産物をコードするDNA配列を有する。このDNA配列は、代表的には、プロモーターに対して異種であり、そして産物の発現を可能にするプロモーターに作動可能に連結されている。産物の例は、S-アデノシルメチオニンヒドロラーゼ、アミノシクロプロパン-1-カルボン酸（ACC）デアミナーゼ、ACCオキシダーゼアンチセンス分子、ACCシンターゼアンチセンス分子、ACCオキシダーゼ同時抑制分子、ACCシンターゼ同時抑制分子、ソーマチン、スクロースリン酸シンターゼおよびリコペンシクラーゼを含むが、これらに限定されない。１つの実施態様において、本発明のプロモーターは、果実細胞におけるエチレン産生を低減させるために使用され得る。別の実施態様において、このDNA配列は、ポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質（PGIP）、グルカナーゼおよびキチナーゼのような病原関連遺伝子に対応し得る。本発明のプロモーターは、キイチゴdru1遺伝子に相同な遺伝子から、またはdr u1キイチゴ遺伝子そのものから、得られ得る。dru1プロモーター配列の例は、配列番号２２である。このようなプロモーター領域のより小さなフラグメントは、このより小さなフラグメントがDNA配列の発現をその制御下において調節するのに有効である場合、この配列に由来し得る。本発明はまた、植物形質転換ベクターを生成するための上述のキメラ遺伝子のいずれかの使用を包含する。このようなベクターは、Agrobacteriumに基づく方法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およびマイクロプロジェクタイルボンバードメント（microprojectile bombardment）を含む任意の植物細胞形質転換方法において使用され得る。これらのベクターは、植物形質転換キットの一部分を形成し得る。このキットの他の構成要素は、植物細胞形質転換に有用な試薬を含み得るが、これらに限定されない。別の実施態様において、本発明は、上述のキメラ遺伝子のいずれかを含む植物細胞、植物組織、トランスジェニック植物、果実細胞、全果実、種子、またはカルスを包含する。本発明の別の局面において、本明細書中に記載のプロモーターは、果実含有植物の果実の成熟を改変する方法において使用される。この方法において、本発明のキメラ遺伝子を含むトランスジェニック植物は、果実を有するトランスジェニック植物を産生するように生育される。この実施態様において、キメラ遺伝子は、植物細胞において発現した場合、エチレン生合成を低減させ得る産物をコードする（例えば、S-アデノシルメチオニンヒドロラーゼ、アミノシクロプロパン-1 -カルボン酸（ACC）デアミナーゼ、ACCオキシダーゼアンチセンス分子、ACCシンターゼアンチセンス分子、ACCオキシダーゼ同時抑制分子、ACCシンターゼ同時抑制分子）。これらのトランスジェニック植物によって産生された果実は、改変された成熟表現型を有する。改変された成熟表現型は、代表的には、対応する（すなわち、非トランスジェニックの）野生型果実に対するトランスジェニック果実の成熟速度の変化をいう。さらに、本発明は、トランスジェニックな果実含有植物を産生する方法を包含する。本方法において、代表的には、植物細胞において選択を可能にする発現ベクターに有される本発明のキメラ遺伝子が、選択された植物の前駆細胞中に導入される。次いで、これらの前駆細胞が生育されて、果実を有するトランスジェニック植物を産生する。本方法は、以下に述べる工程による、dru1プロモーターの単離をさらに包含し得る：（i）キイチゴdru1遺伝子DNAの領域に相同な配列を含むプローブDNA分子を選択する工程、（ii）プローブと選択された果実含有植物のゲノムに由来する複数の標的DNA 分子とを、プローブ分子とプローブ分子に相同な標的分子との間の特異的なハイブリダイゼーションを好む条件下で接触させる工程、（iii）キイチゴdru1遺伝子に相同なDNA配列を有する標的分子を同定する工程、および（iv）標的分子と関連するプロモーター配列を単離する工程さらに、本発明は、先ほど記述した工程によるdru1プロモーターの単離も包含する。本発明のキメラ遺伝子、ベクター、産物および方法はまた、dru1について本明細書中で記載したようにして本質的に同定したdru2プロモーター配列を用いて産生され得る。本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の本発明の詳細な説明が添付の図面とともに読まれた場合に、より十分に理解される。図面の簡単な説明図１は、キイチゴ小核果タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の代表的な結果を示す。図2Aおよび2Bは、キイチゴdru1遺伝子の逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT -PCR；Kawasakiら、1989；Wangら、1990）クローン化を模式的に表す。図3Aおよび3Bは、dru1遺伝子のゲノムDNA配列を表す。図に示されるのは、CAA Tボックス、TATAボックス、ATG開始コドン、２つのエキソン、１つのイントロン、スプイライシング部位、終止コドン、およびポリアデニル化部位である。図４は、dru1の遺伝子構成およびタンパク質構造の模式図を示す。図５は、dru1のコード配列のKyte-Doolittle親水性(hydrophilicity)プロットを表す。図において、親水性ウインドウサイズは７である。図６は、キイチゴ葉および花托におけるdru1 RNA発現のRNAドットブロット分析の結果を表す。RNAは、緑(green)、成熟緑(mature green)、変色(breaker)およびオレンジ(orange)／完熟(ripe)キイチゴ（それぞれ、I、II、III、IV期に対応する）から単離した。図７は、キイチゴ葉および果実におけるdru1 RNAの発現を評価するRNAハイブリダイゼーション研究の結果を示す。図８は、種々の成熟期における小核果から得られたキイチゴ小核果タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の結果を示す。図9Aおよび図9Bは、pAG-4032のベクター構築の詳細の模式的な説明を示し、そして、図10は、pAG-4033のベクター構築の詳細の模式的な説明を示す。発明の詳細な説明Ｉ．定義本発明の文脈における「キメラ遺伝子」は、代表的には、「異種」DNA配列（すなわち、プロモーターと通常は連続あるいは関連しない遺伝子産物をコードするDNA配列）に作動可能に連結されたプロモーター配列（例えば、S-アデノシルメチオニン切断酵素をコードするDNA配列に隣接したdru1プロモーター）を含む。「dru1相同遺伝子」は、本明細書中で示されるキイチゴdru1ポリヌクレオチド配列（例えば配列番号１０）に対するポリヌクレオチド配列の長さにわたり、少なくとも約55％または好ましくは80％の全体の配列相同性、すなわち、配列同一性を有する遺伝子として定義される。「配列相同性」は、本質的に以下のように決定される。同じ長さの（好ましくは、遺伝子のコード配列に対応する）２つのポリヌクレオチド配列は、もし、AL IGNプログラムを用いてそれらを整列させたとき、最高のスコアのアラインメントにおいて核酸の55％以上か、または好ましくは80％以上が、１のktup、デフォルトのパラメーターおよびデフォルトのPAM行列（Dayhoff，1972）を用いて同一に整列された場合、互いに相同であるとみなされる。 ALIGNプログラムは、FASTAバージョン1.7配列比較プログラムのスイート（Pea rsonおよびLipman，1988; Pearson 1990;プログラムは、William R．Pearson，D epartment of Biological Chemistry，Box 440，Jordan Hall，Charlottesville ,VAから入手可能）において見い出される。２つの核酸フラグメントは、それらがキイチゴdru1遺伝子またはその変異体のコード配列に対して特異的にハイブリダイズし得るか、あるいはポリメラーゼ連鎖増幅反応を特異的にプライムし得る場合、dru1遺伝子に由来するポリヌクレオチドに対して「選択的にハイブリダイズ可能」であるとみなされる：（i）例えばManiatisら、1982、320頁〜328頁および382頁〜389頁に記載される代表的なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下。このようなハイブリダイゼーション条件の例をまた、実施例８および９に示す；（ii）せいぜい約25〜30％の塩基対のミスマッチを許容するような低減したストリンジェンシーの洗浄条件を使用すること、例えば：２×SSC、0.1 ％SDS、室温で30分ずつ２回；次いで、２×SSC、0 .1％SDS、37℃、30分１回；次いで、２×SSC、室温で２回、各10分間、または（ iii）標準的な条件下の代表的なポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（例えば、Saiki ら、1988）における使用のためのプライマーを選択すること、このプライマーは、dru1配列またはその変異体の配列の特異的な増幅を生じる。好ましくは、高度に相同な核酸鎖は、20〜40％未満の塩基対のミスマッチを含み、さらにより好ましくは、５〜20％未満の塩基対のミスマッチを含む。これらの相同性の程度は、当該分野で周知なように、遺伝子ライブラリー（または、遺伝物質の他の供給源）からクローンを同定するための適切なストリンジェンシーの洗浄条件を使用することにより選択され得る。「dru1コード化ポリペプチド」は、dru1コード化ポリペプチドに相同な任意のポリペプチドとして本明細書中で定義される。１つの実施態様において、ポリペプチドは、dru1またはその変異体の配列に対して選択的にハイブリダイズする核酸によってコードされる場合、dru1コード化ポリペプチドに相同である。別の実施態様において、ポリペプチドは、上記のように、dru1またはその変異体によりコードされる場合、dru1コード化ポリペプチドに相同であり、この群のポリペプチドは、代表的には、15、好ましくは25、またはより好ましくは35より大きい連続したアミノ酸である。さらに、約60アミノ酸より長いポリペプチドについては、「ポリペプチド相同性」を決定するための配列比較が、局所アラインメントプログラムLALIGNを用いて実施される。ポリペプチド配列は、上記のように、１のktup、デフォルトのパラメーターおよびデフォルトのPAMを用いるLALIG Nプログラムを使用してdru1アミノ酸配列またはその変異体のいずれかに対して比較される。 60アミノ酸より長い最適化アラインメント、および55％または好ましくは80％より多くの同一に整列されたアミノ酸を有する任意のポリペプチドは、「相同なポリペプチド」であるとみなされる。LALIGNプログラムは、FASTAバージョン1.7 配列比較プログラムのスイート（PearsonおよびLipman，1988; Pearson 1990;プログラムは、William R．Pearson，Department of Biological Chemistry，Box4 40，Jordan Hall，Charlottesville，VAから入手可能）において見い出される。ポリヌクレオチドは、それが、dru1タンパク質コード配列、dru1のcDNAまたはその相補配列の領域と同一の配列または実質的に同一の塩基対配列を有する場合、あるいは上述の相同性を有する場合、dru1「由来」である。ポリペプチドまたはポリペプチド「フラグメント」は、それが(i)dru1遺伝子によりコードされるか、または(ii)上記のようにdru1コード化ポリペプチドと相同性を示す場合、dru1「由来」である。本発明の文脈において、表現「核酸配列」は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードする配列をいう場合、相同なタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド配列、ならびに開示される配列をコードする縮重核酸配列を含むことが意味される。「改変された成熟」表現型は、代表的には、例えば、遅滞型果実成熟（すなわち、成熟が対応する野生型果実よりも長くかかる）または果実が成熟プロセスを完了する能力の停止のような、対応する野生型果実に対するトランスジェニック果実の成熟速度の改変をいう。 DNA分子によってコードされる「産物」は、例えば、RNA分子またはポリペプチドを含む。 II．DRU1タンパク質同定、精製、および配列決定。本発明は、キイチゴ由来のdru1遺伝子により例示される、果実成熟において非常に高レベルで発現される遺伝子のクローン化に関する。本明細書中に記載されるdru1プロモーターにより指向される発現は、果実特異的であり、かつ果実成熟の間活性である。キイチゴにより産生されるタンパク質のようなタンパク質（単数または複数）は、代表的にはゲル電気泳動で分析される。可溶性小核果タンパク質のクマシーブルー染色SDSポリアクリルアミドゲルを、図１（実施例１）に示す。キイチゴから単離可能な２つの非常に豊富なタンパク質が、約17および15kDに観察され、そして、本明細書中においては、それぞれdrupe１およびdrupe２と称する。可溶性タンパク質の全量に対するdrupe１およびdrupe２の量は、例えば、走査型デンシトメトリーにより、決定され得る。図１において示されたゲルの走査型デンシトメトリー分析は、drupe１およびdrupe２がそれぞれ、キイチゴ小核果の全可溶性タンパク質の約23％および約37％を構成することを示す。本決定の結果（すなわち、drupe１およびdrupe２の高レベル）として、drupe１およびdrupe２の精製および配列決定は、例えば、直接ウェスタンブロットアプローチを用いることにより、実施され得る。ウェスタンブロット分析を実施することにおいて、全小核果タンパク質をPDVF 膜にウェスタンブロットし（実施例１）、そしてdrupe１およびdrupe２に対応する領域をN末端アミノ酸配列分析に供する。drupe１サンプルは30アミノ酸N末端配列を生じる（実施例１）。アミノ末端drupe１配列を、本明細書中で配列番号１として示す。 III．dru1コード配列のクローン化 A．dru1 cDNAクローンのRT-PCRおよびクローン化。遺伝子のゲノムコピーのcDNA合成から逆PCRまでの、dru1クローン化のための全手順を、図2Aおよび2Bに模式的に示す。クローン化手順を実施することにおいて、成熟緑キイチゴ小核果mRNAを、実施例２に記載のように調製し、そしてcDNA合成反応においてテンプレートとして使用する。反応を、図2Aおよび2Bにおいて示されるようにdTRANDOMプライマーを使用してプライムする。得られたcDNA（実施例２）を、dTRANDOMプライマーの一部およびdrupe1アミノ末端配列に基づいた512倍縮重プライマー（Drupe20）に対応するプライマーを用いて標準PCR反応に供する（実施例３）。次いで、PCR増幅産物を分析する。上記のPCR反応からの産物は、710bp産物を含み、これは、アガロースゲル精製され、そしてpCRIIにサブクローン化される（実施例３）。続くこれらのクローンのいくつかの配列解析により、drupe1のアミノ末端配列に合致するタンパク質をコードする配列を有するそれらのクローンの同定が可能になる。Ｂ．DRU1遺伝子のゲノムコピーの逆PCRクローン化。 dru1遺伝子をクローン化するこのアプローチにおいて、ゲノムキイチゴDNAが、上記のように得られたcDNA配列に対して内部にあるプライマーを用いて、PCR 反応において使用される（実施例４）。この反応は、タンパク質コード領域のほとんどを含むdru1遺伝子のゲノムクローンを生じる。１つのイントロンが、このクローンの続く配列分析から同定された（図3B）。逆PCR戦略は、dru1プロモーターを含む遺伝子の５’領域を特徴付けそして配列決定するのに使用され得る（実施例５）。図2Aおよび図2Bは、これがどのようにして達成され得るかを模式的に示す。逆PCR技術を用いるdru1ゲノムDNAの５’隣接領域の特徴づけにおいて、キイチゴゲノムDNAをNsiIで消化し、そして希釈条件下で連結させ、制限フラグメントの環化を行う。次いで、連結DNAを、dru1コード配列に対して内部であり、かつお互いに反対方向を向いたプライマーを使用したPCR増幅に供する。これは、第一エキソンの一部およびこのプロモーターの1.35kbを含むPCR反応産物を産生する。前述のクローンからの配列情報と組み合わせた本クローンの続く配列分析は、完全dru1配列（配列番号１２）を生じる。Ｃ．遺伝子発現パターンの配列決定および評価。 dru1遺伝子（配列番号１２）は、配列番号１３に示された推定アミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。このタンパク質の推定分子量は17,088であり、これは、全小核果タンパク質のゲル電気泳動により決定される17kDの分子量（図１を参照のこと）と密に合致する。dru1タンパク質は、比較的酸性で、推定pIは 4.8である。現在の配列データベースの核酸およびタンパク質相同性サーチが、有意な合致を検索するために実行され得る。dru1については、現在の配列データベースの核酸およびタンパク質相同性サーチは、有意な合致を生じなかった。この結果は、タンパク質のアミノ末端配列によって得られた、drupe1が新規なタンパク質であるという元の観察を支持する。 dru1の遺伝子発現パターンはまた、プロモーターの組織特異性を確認するために、RNAおよびタンパク質レベルで評価され得る。異なる成熟期におけるキイチゴ葉および花托由来の全RNAのノーザンドットブロット（図６および図７）は、組織および期特異的な遺伝子発現パターンを示す。これは、種々の他の植物組織に由来する全RNAのノーザンブロットの比較により確認され得る。dru1の組織および期特異的遺伝子発現パターンは、葉、花托、および小核果由来の全RNAのノーザンブロットにおいて確認された（図６および７を参照のこと）。両場合とも、葉RNAではdru1発現は観察されない。花托におけるRNA発現パターンは時間的に調節されており、一方小核果においては、それは分析された２つの期（すなわち、緑および完熟）において完全に発現される。異なる成熟期由来の小核果溶解物のタンパク質ゲルもまた実施され、dru1の期特異的発現をさらに支持し得る。図８に示されるように、成熟の種々の期（すなわち、緑、成熟緑、変色、オレンジ、および完熟）の小核果から得られたキイチゴ小核果タンパク質の電気泳動分析は、小核果における期特異的発現パターンをさらに支持する（図８）。 dru1のタンパク質およびmRNA発現のレベルは非常に高い。本発明書中に記載の観察について任意の特定の機構によりしばられることをのぞまないが、このような高レベルのタンパク質およびmRNA発現に寄与し得るいくつかの可能性のある機構がある。１つの機構的可能性は、dru1プロモーターが強力なプロモーターであるということである。タンパク質およびmRNA発現についてこの機構を支持するデータを、以下に説明する。Ｄ．プロモーター単離およびキメラ遺伝子の構築。 dru1ゲノムクローンの特徴付けは、dru1プロモーターの単離を可能にする。次いで、このプロモーターは異種遺伝子の発現を調節するために使用され得る。例示的なdru1プロモーターは、配列番号22として示される配列を有する。本発明の支持において、異種DNA配列に作動可能に連結されたdru1プロモーター配列を含むキメラ遺伝子の２つの例である、dru1pro:SAMaseおよびdru1pro:PG IP（実施例７）が構築された。S-アデノシルメチオニンヒドラーゼ（SAMase）およびポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質（PGIP）は、それぞれ、エチレン制御および真菌耐性を、トランスジェニック植物において与える。両方のタンパク質が、（i）高レベルおよび（ii）組織特異的様式で発現された場合、より効率的に機能すると推測されている。したがって、dru1プロモーターはこの目的を満たすのに理想的なプロモーターを代表する。上記の２つの代表的なキメラ遺伝子を含むAgrobacteriumバイナリーベクターp AG-4032およびpAG-4033の構築は、実施例７に記載のように実施され得る（図９および１０に模式的に示される。それぞれ、dru1pro:SAMaseおよびdru1pro:PGIP ）。 IV．植物DRU1プロモーターの同定本発明は、キイチゴ以外の種由来のdru1プロモーターの使用のために提供される。このようなプロモーターは、異種遺伝子を含むベクター構築物の作製に有用である。サザンブロット実験は、例えば、イチゴ、モモ、またはスモモにおいて、キイチゴdru1遺伝子と相当な配列同一性を有する（すなわち、代表的には、標準的な配列比較プログラムを用いて、55％より高く、より好ましくは80％同一性より高い）DNA分子の存在を実証するのに使用される。同様のサザンブロット分析が、他の果実含有植物においてさらなるdru1遺伝子を同定するのに実施され得る。本明細書中で使用されるサザンブロット分析は、実施例８に詳細に説明される。dru1ホモログは、キイチゴdru1遺伝子のコード配列を含む標識DNAフラグメントを用いてプローブされる上記に列挙された植物のゲノムDNAのサザンブロットにおいて同定される。プローブは、プロモーター配列よりはむしろdru1のコード配列を含むように選択される。なぜなら、コード配列は、代表的には、プロモーター配列よりも種から種でより保存されているからである。実施例８および９に詳細に説明される実験において、プローブ分子は、プライマー特異的増幅（Mullis、1987；Mullisら、 1987）を用いてキイチゴゲノムDNAから生成される。オリゴヌクレオチドプライマーは、増幅領域がキイチゴdru1遺伝子の全コード配列を含むように選択される。プライマーはまた、キイチゴdru1遺伝子の選択された領域のみを増幅するように選択され得る。あるいは、プローブは、プラスミドDNA由来の目的の配列を含む制限消化フラグメントを単離することにより作製され得る。このプローブは、相同標的分子の続きの同定を可能にするために、検出可能な部分で標識される。標識部分の例は、商業的供給源から入手可能な放射性ヌクレオチド（例えば³²P標識ヌクレオチド、ジゴキシゲニン標識ヌクレオチド、ビオチン化ヌクレオチドなど）を含む。プライマー増幅プローブの場合、標識ヌクレオチドは、増幅プロセスの間に直接プローブに取り込まれ得る。プラスミドDNA由来の制限消化フラグメントのような、すでに単離されたDNA由来のプローブ分子は、代表的には末端標識される（Ausubelら、1992）。上記の植物のゲノム由来のHindIII DNAフラグメントのような標識分子は、ゲル上で電気泳動され、ブロットされ、そしてナイロンまたはニトロセルロースフィルター上に固定化する。次いで、標識プローブ分子は、プローブ分子とプローブ分子に相同な標的分子との間の特異的ハイブリダイゼーションに好ましい条件下で、標的分子と接触される（Maniatisら、1982；Sambrookら、1989;Ausubelら、1992）。特異的ハイブリダイゼーションに好ましい条件は、中程度から高度にストリンジェントをいい、主に、洗浄緩衝液の塩濃度および温度により影響される（Ausu belら、1992；Sambrookら、1989）。実施例９における最終洗浄において使用される条件のような条件は、代表的には、低塩濃度であるため中程度のストリンジェントと分類され、そして特異的ハイブリダイゼーションだけを保存すると推測され、異なる植物種における相同な遺伝子の同定および単離を可能にする。接触、ハイブリダイゼーション、および洗浄に続いて、プローブと相同な配列を有する標的分子がプローブ上の標識を検出することにより同定される。標識は、例えば、オートラジオグラム上で検出される放射性標識におけるように直接検出され得るか、またはこれは、例えば、ビオチン化プローブに結合した蛍光標識ストレプトアビジンのような第二の部分で検出され得る。 dru1遺伝子を含む植物の同定に続いて、プロモーター領域を含む、所望の遺伝子を含むDNAは、例えば、キイチゴdru1遺伝子の単離のために本明細書中に記載された方法により、各々の種から単離され得る。代表的には、目的のライブラリー（例えば、ゲノムまたはcDNA）は、公知のdr u1遺伝子（例えば、キイチゴdru1遺伝子）（実施例９）のコード配列に対応する配列を含むプローブを用いてスクリーニングされる。スクリーニングは、本質的には上記の公知の方法（Ausubelら、1992；Sambrookら、1989）を用いて行われる。ポジティブなプラークまたはコロニーが単離され、そして挿入DNAが配列決定され、そして公知のdru1配列と比較される。キイチゴdru1に相同な遺伝子に対応する配列を有するインサートを含むクローンが同定され、必要な場合、目的のプロモーター領域が単離されるまで、さらなるクローンを得るために使用される。 dru1プロモーターの変異体は、上述の方法により異なるキイチゴ品種および他の植物から単離され得る。GUS（β-グルクロニダーゼ）のようなレポーター遺伝子が、このようなプロモーターからの組織および／または期特異的（例えば、果実の成熟期）な調節可能発現を試験するのに使用され得る。GUSタンパク質の発現は、蛍光計的、吸光度計的、または組織化学的アッセイ（Jefferson，1987a,1 987b）により容易に測定され得る。さらに、レポーター遺伝子配列に作動可能に連結されたdru1プロモーター配列を含むキメラ遺伝子を使用して、例えば、欠失アッセイ（Benfeyら、1990）を用いて、調節ドメインに対応するDNA配列が同定され得る。例えば、配列番号22に示されるdru1プロモーター配列は、機能的にGUSレポーター遺伝子に連結され得る。次いで、欠失アッセイが、標準方法（Ausubelら、1992；Maniatisら、1982; Sambrookら）により実行され得る。あるいは、dru1プロモーター配列の領域は、配列特異的プライマーをPCR中で用いて増幅され得る。次いで、これらの増幅されたフラグメントは、GUSコード配列の５’に挿入され、そして生じる発現パターンが評価され得る。Ｖ．植物形質転換およびトランスジェニック植物の作製。Ａ．本発明のベクター。 dru1プロモーター／転写調節配列を含む植物形質転換ベクターは、当該分野で公知の方法に従って構築される（例えば、HouckおよびPear、1990、ならびにBec kerら、1992を参照のこと）。本発明は、植物の形質転換に適切なベクターを提供する。本発明のベクター、キメラ遺伝子およびDNA構築物はまた、異種遺伝子の発現に有用である。本発明のキメラ遺伝子を有するトランスジェニック植物およびその果実産物は、組換え的に発現した物質の有用な供給源であり得る。１つの実施態様において、本発明のキメラ遺伝子は、以下の２つの成分を有する：（i）dru1遺伝子から由来するプロモーター、および（ii）所望の産物をコードする異種DNA配列。本発明のベクターは、目的のDNAコード配列のための挿入部位を含む発現カセットを有するように構築され得る。次いで、そのような挿入DNAの転写は、適切なdru1プロモーター（すなわち、キイチゴdru1遺伝子プロモーターまたはそのホモログ）の制御下にある。そのような発現カセットは、単一または複数の転写終末シグナルを、発現されるべきDNA配列のコード３’末端に有し得る。このような３’配列は、dru1遺伝子コードmRNAの３’非コード領域由来の転写終末配列を含み得る。発現カセットはまた、例えば、（i）リーダー配列（例えば、分泌または液胞の標的化を可能にする）および（ii）翻訳終末シグナルをコードするDNA配列を含み得る。さらに、本発明のベクターは、植物細胞における使用のための選択可能なマーカー（例えば、nptIIカナマイシン耐性遺伝子）を含み得る。ベクターはまた、複製起点および選択可能マーカーを含む配列のような、二次宿主における選択および増殖を可能にする配列を含み得る。代表的な２次宿主は、細菌および酵母を含む。１つの実施態様において、二次宿主は、Escherichia coliであり、複製起点は、colE1型であり、そして選択可能マーカーは、アンピシリン耐性をコードする遺伝子である。このような配列は当該分野で周知であり、市販もされている（例えば、Clontech、Palo Alto，CA；Stratagene，La Jolla，CA）。本発明のベクターはまた、改変されて、Agrobacterium tumefaciensベクターの相同な領域、Agrobacterium tumefaciens 由来のT-DNAボーダー領域、およびキメラ遺伝子または発現カセット（上記）を含む植物形質転換プラスミドを媒介し得る。さらに、本発明のベクターは、Agrobacterium tumefaciensの無毒化した植物腫瘍誘導プラスミドを含み得る。他の適切なベクターは、本発明のプロモーターならびに、市販（Clontech，Palo Alto，CA）および大学供給源（Waksman Institute，Rutgers，The State University of New Jersey，Picataway，NJ）の両方から入手可能な標準植物形質転換ベクターを用いて構築され得る。本発明のベクターは、植物細胞における核酸コード配列の組織および／または期特異的な発現に有用である。例えば、選択されたペプチドまたはポリペプチドコード配列は、本発明のベクターの発現カセットに挿入され得る。次いで、ベクターは、宿主細胞に形質転換され、宿主細胞は、タンパク質コード配列の発現を可能にする条件下で培養され、そして発現されたペプチドまたはポリペプチドが細胞から単離される。形質転換された前駆細胞はまた、果実を有するトランスジェニック植物を作製するのに使用され得る。本発明の１つの局面において、このようなトランスジェニック植物により産生された果実は、果実による低減されたレベルのエチレン合成を有する。次いで、果実は、改変された成熟表現型を示す。本発明のベクター、キメラ遺伝子、およびDNA構築物は、植物細胞形質転換における使用およびそれに続くトランスジェニック植物の作製のために、個々に、またはキット中において販売され得る。Ｂ．異種遺伝子。本明細書中で記載される方法および結果は、トランスジェニック植物における遺伝子発現の組織および／または期特異的調節を提供する能力を示す。本発明の組織および／または期特異的プロモーターは、特異的植物組織にすぐ隣接した（下流の）遺伝子の転写を調節するDNAの領域を含む。本発明の方法に従って、異種遺伝子は、本発明のプロモーターに連結される。植物の形質転換のための異種遺伝子の例は、それらの植物の特異的組織（例えば、果実）において、その産物がエチレン生合成を低減させるのに有効である遺伝子を含む。AdoMetaseを含む、これらの遺伝子のいくつかは、以上に議論される。 dru1プロモーターとともに使用され得る他の目的の遺伝子は、以下を含むが、それらに限定されない：他の成熟改変遺伝子、AdoMetaseに加えて、例えば、エチレン生合成の前駆体を分解するアミノシクロプロパン-1-カルボン酸（ACC）デアミナーセ（Kleeら、1991；Sheehyら、1991）；ACCシンターゼ（SatoおよびThe ologis、1989）またはACCオキシダーゼ（Hamiltonら、1990）をコードする遺伝子のようなエチレン生合成経路の遺伝子に影響するアンチセンスまたはコサプレッションを含む遺伝子不活性化方法の使用を通じた成熟改変。さらに、真菌耐性を与えるのに関与する遺伝子（例えば、Phaseolus vulgaris由来のポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質（PGIP）（Toubartら、1992））、ならびに植物グルカナーゼ、キチナーゼ、および他の病原関連（PR）遺伝子（Melchersら、1993、19 94；Ponsteinら、1994；Woloshukら、1991）の改変形態）の有用性は、dru1のような高レベルの果実特異的プロモーターとともに使用された場合に改善される。さらに、果実における分解プロセスを担うタンパク質をコードするアンチセンスまたはコサプレッション遺伝子はまた、本発明のプロモーターとともに使用され得る。この型の遺伝子の例は、ポリガラクツロナーゼ、セルラーゼ、およびペクチンメチルエステラーゼ（Schuch、1994）を含む。本発明のプロモーターの使用は、成熟果実のみに対して特異的な分解プロセスの阻害を標的にする。本発明のプロモーターを用いた発現のために有用であり得る他の遺伝子産物は、（i）香料（例えば、タウマチン；GENBANK）または色改変（例えば、リコペン合成を改変する産物、例えば、アラビドプシスリコペンシクラーゼ；GENBANK）、（ii）植物細胞プロセスを改変する酵素または他の触媒産物（例えば、リボザイム、または触媒的抗体）、（ｉiｉ）アンチセンス分子、エチレン生合成の前駆体を分解する酵素、触媒産物またはコサプレッションのようなエチレン産生に影響する遺伝子産物、（iv）代替真菌制御遺伝子、および（v）トウモロコシ由来スクロースリン酸シンターゼ遺伝子（GENBANK）のようなスクロース蓄積遺伝子をコードする遺伝子を含む。さらに、果実のような特異的な組織に対していくつかの遺伝子（例えば、構成的に発現した場合、植物に対して有害である任意の遺伝子）の発現を抑制することは有用である。このような遺伝子は、必須な代謝物を枯渇させる分解酵素をコードする遺伝子を含む。dru1プロモーター領域の誘導体は、それらの発現が制御下におかれる組織および／または期特異的な遺伝子の発現のオン／オフスイッチとして使用され得る。Ｃ．植物の形質転換方法 Agrobacteriumに基づく方法に加えて、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およびマイクロプロジェクタイルボンバードメントのような多数の方法が、植物前駆細胞の形質転換を誘発するのに使用され得る。これらの方法は、当該分野で周知であり（ComaiおよびConing,1993; Kleinら、1998; Miki ら、1987; Belliniら、1989）、そして植物ゲノム中に選択されたDNAを導入する手段を提供する：このようなDNAは、所望の産物をコードする異種配列に機能的に隣接したdru1遺伝子プロモーター（例えば、AdoMetaseコード配列）からなるD NAカセットを含み得る。形質転換体ならびに得られたトランスジェニック細胞およびトランスジェニック植物は、標準的方法（Mathewsら、1995）により同定されそして評価される。Ｄ．異種植物系における発現。本発明の支持により実施された実験は、本発明のキメラ遺伝子構築物の汎用性を示す。本発明のベクター構築物は、プロモーター配列の元の植物供給源から非依存的なトランスジェニック植物における異種の配列の形質転換および発現のために使用され得る。さらに、プロモーターにより媒介された発現は、異種植物においてさえも組織および／または期特異的であるらしい。したがって、本発明のベクター、キメラ遺伝子、およびDNA構築物は、このような植物がプロモーター配列の植物供給源とは異なる種であった場合、果実を有する植物の種の形質転換に有用である。 VI．利用本発明は、成熟果実（例えば、キイチゴ）において非常に高レベルに発現される遺伝子のクローニングに関する。キイチゴから単離された遺伝子は、dru1と命名され、そして17kdの分子量を有するタンパク質をコードする。キイチゴ小核果におけるタンパク質発現分析は、dru1が、全タンパク質の少なくとも23％を含むことを示す。dru2（さらに高レベルに発現される明らかに類似の15kdのタンパク質）と組み合わせれば、これらの２つのタンパク質が、キイチゴ小核果におけるタンパク質の少なくとも65％を含む。これは、種子貯蔵タンパク質以外の任意の植物組織について異常に高レベルの遺伝子発現である。本発明の支持により実施された実験は、dru1によりコードされるmRNAおよび成熟タンパク質の遺伝子発現パターンが、成熟キイチゴの花托および小核果に厳密に調節されていることを示す。したがって、dru1プロモーターの使用は、果実組織における外来遺伝子発現の標的化を可能にする（すなわち、このような外来遺伝子がdru1プロモーターの制御下に配置される場合）。dru2遺伝子および対応するプロモーター領域は、dru1について本明細書中で記載されるように本質的に特徴づけられ得る。 dru1は、N-末端アミノ酸配列情報、およびcDNAクローンを得るためにRT-PCR反応において使用される対応する縮重PCRプライマーを用いて上記のようにクローン化され得る。逆PCRは、dru1プロモーターを含む遺伝子のゲノムクローンを得るために使用され得る。 dru1遺伝子は、いくつかの観点から農学生物工学の分野における重要な発見を示す。第一に、dru1プロモーターは、その機能が、高レベルの組織特異的なプロモーターにより増強されるかまたは可能にされる、任意の異種遺伝子を発現するために使用され得る。このような遺伝子の２つの例は、本明細書中に記載されている：SAMase遺伝子（エチレン合成の制御およびそれゆえ、成熟制御のために）、およびPGIP遺伝子（真菌制御、および特に灰色カビ病、またはBotrytis ciner eaのために）。他の例示的な遺伝子は上述される。第二に、このプロモーターの使用は、キイチゴに限定されるとはみなされ得ない。キイチゴは、本質的に小型の核果果実（drupe fruit）であり、それゆえ、d ru1プロモーターは、おそらく他の核果果実でも機能する。本発明の構築物および方法は、全ての高等植物（以下：液果様果実、例えばVitis（ブドウ）、Fraga ria（イチゴ）、Rubus（キイチゴ、セイヨウヤブイチゴ、ローガンベリー）、Ri bes（スグリおよびセイヨウスグリ）、Vaccinuium（コケモモ(blueberry)、コケモモ(bilberry)、欧州コケモモ、ツルコケモモ）、Actinida（キーウィーフルーツおよびシナスグリ）を含むが、それらに限定されない）に適用可能である。さらに、他の核果果実は、Malus（リンゴ）、Pyrus（セイヨウナシ）、Prunus属のほとんどの一員、アカテツ科の実、マンゴ、アボカド、アンズ、モモ、サクランボ、スモモ、およびネクタリンを含むが、これらに限定されない。エチレン産生（例えば、dru1pro-:SAMaseキメラを介した）の制御は、収穫後の流通系において過熟の害を被るクライマクテリック果実（例えば、モモおよびスモモ）において価値がある。さらに、dru1遺伝子が、花托において発現されるという本明細書中に記載される結果は、このプロモーターがイチゴでも機能することを示唆する。イチゴの果実は、腫大した花托であり、植物学的な観点からはキイチゴの花托とは区別不可能である。全ての核果果実（例えば、キイチゴ）およびイチゴは、Rosacea属の一員であり、それゆえ、dru1プロモーターをこの属の異種において果実特異的プロモーターとしておそらく機能的にする。本発明は、組織および／または期特異的な様式で任意の遺伝子の植物細胞発現を調節する組成物および方法を提供する。１つの実施態様において、本発明は、その発現が、果実成熟中に誘導される、dru1組織および期特異的プロモーターの使用を教示する。１つの実施態様において、本発明のプロモーターは、エチレンの細胞産生を調節するのに使用され得る。この実施態様において、その産物がエチレン合成の低減を生じる遺伝子は、dru1プロモーターに作動可能に連結される（キメラ遺伝子を作製する）。キメラ遺伝子が果実細胞に存在する場合、結果は、野生型（非トランスジェニック）果実に比較して改変された成熟表現型を有する果実である。エチレン合成の低減を生じる遺伝子産物の例は、以下を含むがこれらに限定されない：S-アデノシルメチオニンヒドロラーゼ；1-アミノシクロプロパン-1-カルボキシレートデアミナーゼ（Kleeら、1991；Sheehyら、1991）；アンチセンスまたはコサプレッション配置のACCシンターゼ遺伝子（Oellerら、1991；Van der S traetenら、1990）；およびアンチセンスまたはコサプレッション配置のいずれかのACCオキシダーゼ遺伝子（Hamiltonら、1990；Holdsworthら、1987）。コサプレッションは、Jorgensenら（1991、1993）により記載されている。エチレン生合成の低減に有用であり得る他の遺伝子産物は、触媒抗体およびリボザイム分子を含む。本発明は、１つの局面において、dru1プロモーターの制御下の異種遺伝子による植物の形質転換に適切な核酸構築物を提供する。１つの実施態様では、植物は、果実を有する植物であり、そして、異種遺伝子は、植物からの果実におけるエチレン生合成を低減させるのに効率的な遺伝子である。本発明の支持により実施される実験は、バクテリオファージT3から単離された Adometase（Ferroら（1995）；Hughesら、1987）（またはSAMase）遺伝子を含む、キメラ遺伝子構築物の構築を記載する。 dru1プロモーターは、トランスジェニックキイチゴのようなトランスジェニック植物を作製するために使用されるベクター構築物中で使用され得る。例えば、 AdoMetase遺伝子に連結されたdru1プロモーターを含む本発明の方法により操作されたベクター（例えば、ベクターpAG-4032）は、トランスジェニックキイチゴ、イチゴ、モモ、スモモなどを作製するために使用され得る。AdoMetase遺伝子は、これらのトランスジェニック植物の果実において発現され、そして成熟を遅らせる。他の成熟阻害アプローチ、つまり、ACCオキシダーゼおよびACCシンターゼのアンチセンスおよび／またはコサプレッションと比較した、本発明の方法の利点は、ベクター構築に関連した時間および資源の節約である。なぜなら、同じベクターが多くの、異なる植物型を形質転換するのに使用され得るからである。あるいは、dru1プロモーター配列は、形質転換される植物の同じ型から単離され得、そして形質転換を実施するために使用されるベクター構築物に取り込まれ得る。例えばイチゴdru1プロモーターは、AdoMetase遺伝子のような異種遺伝子に連結され得、イチゴを形質転換するのに使用され得る。以下の実施例は、本発明を例示するが、これは本発明を限定することを決して意図されない。材料と方法オリゴヌクレオチドは、Operon Technologies，Inc.，Alameda,CAにより合成された。一般的に、標準組換えDNA技術に関した命名法および研究室手順は、Sambrook ら、（1989）；Wangら、（1989）；Kawasakiら（1989）、ならびにGelvinおよび Sch ilperoot（1988）に見い出され得る。他の一般的な参照は、本明細書の全てにわたって提供される。本明細書中の手順は当該分野で公知であり、そして簡便な参照としてのみ提供される。実施例実施例１キイチゴ小核果タンパク質の特徴付けおよび精製Ａ．タンパク質溶解物の調製およびゲル電気泳動液体窒素を含む乳鉢と乳棒を使用して、１つの全ベリーの凍結した核果を微細な粉末にすりつぶすことによって、キイチゴタンパク質サンプルを調製した。サンプル緩衝液（0.05M Tris、pH6.8、１％ SDS、５％ β-メルカプトエタノール、10％グリセロール；Laemelli、1970）を組織に添加（900μl）し、そしてこのサンプルをボルテックスすることによって混合した。サンプルを、10分間90〜 95℃で加熱し、そして４℃で10分間、14K rpmで遠心分離した。上清を、不溶性の細片のペレットから取り出し、そして−20℃で保存した。小核果タンパク質を、標準的な手順を用いて、クマシーブルー染色と組み合わせたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS PAGE）によって分析した。可溶性小核果タンパク質のクマシーブルー染色したSDSポリアクリルアミドゲルを、図１に示す。この図において：レーン１は分子量マーカー（ BioRad，Richmond，CA）であり、レーン２、３、および５は、それぞれ個々の果実から別々に調製した９μgのキイチゴ小核果タンパク質溶解物を含む。レーン４は、さらに多い量の溶解物を含んだ。２つの非常に豊富なタンパク質が、約17kdおよび15kdに観察され、それぞれdr upe1およびdrupe2と名付けた。図１において、これらの２つのタンパク質を矢印で示した。このゲルの走査型デンシトメトリー分析は、drupe1およびdrupe2が、キイチゴの小核果中の全可溶性タンパク質のそれぞれ約23％および37％を構成することを示した。結果として、タンパク質の精製および配列決定のための直接的なウェスタンブロットアプローチが続いた。Ｂ．配列決定のためのタンパク質ブロットタンパク質ブロット（Applied Biosystems，Inc．User Bulletin Number 58; Ausubelら、1992）を、上記のキイチゴタンパク質溶解物を使用して調製した。種々の量のキイチゴタンパク質溶解物（12〜36μg／ウェル）を、4.5％のスタッカーを有する10ウェルの18％ SDS-PAGEミニゲル（1.5mm厚）上にロードし、そして25mM Tris、192mM グリシン、0.1％ SDS緩衝液中で２〜2.5時間、100ボルトで電気泳動した。タンパク質を、25mM Tris、192mM グリシン、10％メタノール緩衝液中で90ボルトで２時間、４℃にて、Applied BioSystemの「PROBLOTT」ポリビニリデンジフルオライド（PVDF）メンブレンにトランスブロットした。タンパク質の転移後、ブロットをクマシーブルー染色し、15および17キロダルトン（kd）のタンパク質バンドがブロット上に存在し、そしてこれらを切り出した。タンパク質のＮ末端配列決定を、New Haven，CTのW.M．Keck Foundation，Biotechnology Resourc e Laboratoryで行った。 drupe1サンプルは、30アミノ酸のＮ末端配列を生じた。drupe2サンプルは、おそらくブロックされたアミノ末端のために、有用な配列情報を産生しなかった。アミノ末端のdrupe1配列を、配列番号１として示す。この30アミノ酸のdrupe1配列を、BLAST検索を使用してタンパク質データベースと比較した；有意な適合は見られず、このことはdrupe1が新規のタンパク質であることを示す。実施例２ Drupe1 タンパク質に対応するcDNAクローンの回収Ａ．小核果全RNAの調製 RNAを、成熟緑キイチゴ小核果から抽出した。４つの成熟緑キイチゴの果実（食べ頃に摘み取り、そして−80℃で保存した）を使用してRNAを抽出した。小核果の推定の重量は12グラムである。液体窒素を含む冷乳鉢中で、全ベリーを乳棒でそれらを軽くたたくことによって破砕した。小核果を花托から分離した。花托を、乳鉢から取り出し、そして破棄した。小核果を、組織を凍結状態に維持するために必要である場合は液体窒素を添加しながら、乳鉢の中で粉末にすりつぶした。種子を、意図的に完全なままにした。ホモジナイズ緩衝液、２ml／グラムの組織を使用してRNAを抽出した。［ホモジナイズ緩衝液：200mM Tris-HCl pH8. 5、300mM LiCl、10mM Na₂EDTA、１％（w/v）デオキシコール酸ナトリウム、1.5 ％（w/v）ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、8.5％（w/v）不溶性ポリビニルポリピロリドン（PVPP）、１％（v/v）NP-40、１mM アウリントリカルボン酸（ATA）、５mM チオ尿素、および10mM ジチオトレイトール（DTT）；最後の３つの成分は、オートクレーブ後に添加した。］凍結粉末小核果組織を、添加と添加のの間にボルテックスしながら、全ての組織が湿るまで３〜５部分で緩衝液に添加した。組織および緩衝液の溶液（本明細書中でパルプという）を、滅菌水で１：１に希釈し、そして0.75容量のホモジナイズ緩衝液を希釈したパルプに添加した。サンプルを、65℃で10〜15分間インキュベートし、続いてスウィングバケットローター中で9000ｇで15分間、４℃にて遠心分離した。上清を、清潔なチューブに移した。塩化セシウム（CsCl）を、0. 2g/mlで上清に添加した。サンプルを、CsClが溶解するまで混合した。４mlのクッションを、Beckman １×3.5インチポリアロマー超遠心チューブに分配した（クッション：5.7M CsCl、10mM Tris-HCl，pH8.0、１mM Na₂EDTA，pH8 ）。サンプルをクッションの上に穏やかに上層した。サンプルを、SW 28ローターを用いてBeckman L8-80M超遠心分離器中で、23,000rpmで20℃にて20時間回転させた。超遠心分離器からサンプルを取り出した後、上清を、吸引機に取り付けた吸引（drawn）パスツールピペットを使用することによってサンプルから吸引除去した。透明なレンズ様のペレットを、チューブの底に見ることが可能であった。ペレットを、500μlのSSTEに溶解し、そしてミクロ遠心チューブに移した（SS TE：0.8M NaCl、0.4％ SDS、10mM Tris-HCL，pH8.0および１mM Na₂EDTA，pH8）。サンプルを、等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（24：１）で２回抽出した。RNAを沈澱させるために、2.5容量のエタノールを、水相に添加した。サンプルを遠心分離によって回収し、75％エタノールで２回洗浄し、そして100μl のTEに再懸濁した。収量は、1.6mgであった。RNAを、−20℃での保存のために、 1/9容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび３容量のエタノールを用いて再び沈澱させた。Ｂ．小核果mRNAの調製成熟緑色キイチゴ小核果の全RNAからのmRNAの単離を、「STRAIGHT A'S」mRNA 単離システム（Novagen，Madison，WI）を用いて、製造業者の説明書に従って行った。mRNAを、上記の成熟緑色キイチゴ小核果から抽出した1.6mgの全RNAから単離した。この手順によるmRNAの収量は、6.6μgであった。Ｃ．緑キイチゴ小核果mRNAからのcDNAの作製成熟緑キイチゴ小核果RNA由来のmRNAを、cDNA合成のためのテンプレートとして使用した。cDNA反応のためのプライマーは、dTRANDOM（配列番号２；Operon T echnologies，Inc.，Alameda，CAにより合成された）であった。oligo(dT)領域が、mRNAプールのpoly(Ａ)領域にハイブリダイズした。他の15ヌクレオチドは5' オーバーハングを作製し、これは、クローニングプロセスの後の工程でPCR増幅を容易にするために使用された。以下の反応混合物を、cDNA合成反応のために組み立てた：H₂O，10.2μl；250n g mRNA，0.8μl；５×BRL RT緩衝液（BRL，Bethesda，MD）、4.0μl；100mM DTT (シ゛チオトレイトール−BRL，Bethesda，MD)、0.2μl；「RNAguard」(23.4U/μ ｌ；Pharmacia，Piscataway，NJによるRNaseインヒビター)、0.5μl；dNTP(各2. 5mM)、2.0μl；50μM プライマー、1.0μl；[³²P]dCTP(3000Ci/mmol；DuPont/NE N，Boston，MA)、1.0μl；およびAMV-逆転写酵素(38U/μl；Life Sciences，Inc .，St．Petersburg，Florida)、0.3μl。cDNA反応を、65℃で３分間の反応および加熱のために、mRNAと水とを組み合わせることによって行った。混合物を氷上で冷却し、そしてミクロ遠心分離した（縮合物を回収するために）。次いで、残りの反応成分を添加した。 42℃で１時間のインキュベーション後、cDNA反応物を氷上に移動して、PCR反応で使用するまで４℃で保存した。実施例３ cDNADru1 フラグメントのPCR増幅およびクローニング縮重PCRプライマーDrupe20を、dru1タンパク質配列の逆翻訳に基づいてcDNAの 5'末端について設計した。dru1の既知のアミノ酸配列（配列番号３）の切片を、アミノ末端に対するその近接、およびその逆翻訳した配列（配列番号４；Drupe2 0）における相対的に低いレベルの縮重について選択した。Drupe20プライマー（i）は、配列番号３として示されるアミノ酸配列に対応する512倍の縮重ヌクレオチド配列であり、そして（ii）を3'プライマーとして使用した。 5'PCRプライマー（DrupeRAN18、配列番号５、cDNAプライマーdTRANDOMに対応）を、3'末端について設計した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR；Perkin-Elmer Ce tus，Norwalk，CT; Mullis，1987; Mullisら、1987）を、「AMPLITAQ」（Perkin Elmer Cetus）、PCR緩衝液II（50.0mM KCl、10mM Tris-HCl，pH8.3）、２mM Mg Cl₂、0.2mMの各dNTP、成熟緑小核果cDNA、ならびにDrupe20およびDrupeRAN18プライマーを使用して、製造業者の手順に従って以下の条件下で行った：１サイクル：95℃１分 35サイクル：95℃１分、42℃１分、および72℃１分１サイクル：72℃５分、そして５℃まで冷却。増幅反応の２つの主要な生成物：約700bpの優勢な生成物および約500bpのより少ない生成物が存在した。700bpのバンドを、供給者の説明書に従って、βアガロース（agarase）（NEB，Beverly，MA）を使用する１％「SEAPLAQUE」アガロースゲルから単離した。次いで、このフラグメントを、製造業者の説明書に従って、Invitrogen（San Diego，CA）によるTAクローニングベクターであるベクターp CRIIに連結した。 dru1遺伝子のcDNAクローンを、アルカリ溶解法（Ausubelら、1992）を使用して、1.6mlの培養物から調製したプラスミドミニプレップDNAをスクリーニングすることによって同定した。２本鎖DNAを、「SEQUENASE」ver.2酵素およびキット組成物（United States Biochemical，Cleveland，Ohio）および[α-³⁵S]-dATP （DuPont/NEN）を使用して、ジデオキシ鎖終結法によって配列決定した。反応を、M13ユニバーサル正方向プライマーおよび逆方向プライマー（NEB，Beverly，M A）を使用してプライムした。配列決定反応を、アクリルアミドゲル（「LONG RA NGER GEL」、FMC，Rockland，Maine）上で行い、そしてオートラジオグラフィーでバンドを検出した。配列を、オートラジオグラフから読み、そしてdrupe1由来の逆翻訳したＮ末端タンパク質配列とのその相同性について分析した。タンパク質配列の逆翻訳によって得られる縮合DNA配列に対抗するものとして、実際のDNA配列を決定した。cD NAとＮ末端タンパク質配列の残りとの間の相関関係を確認した。これらの判断基準（criteria）後、さらなる特徴付けのために１つのクローン（pAG-301と名付けた）を選択した。pAG-301のdru1 cDNAインサートの核酸配列を、配列番号10に示す。遺伝子のゲノムコピーの逆PCRのためのcDNA合成による完全なdru1のクローニング手順を、図２Ａおよび２Ｂに模式的に示す。実施例４ dru1 cDNA に対応するゲノムDNAフラグメントの回収「CTAB」（ヘキサデシル-トリメチル-臭化アンモニウム）法（DoyleおよびDoy le、1990）を使用して、キイチゴの葉からDNAを抽出した。PCRプライマー（DruG en5'、配列番号６；DruGen3'、配列番号７）を、完全なdru1 cDNA配列に基づいて設計した。プライマーの設計を容易にするための、「OLIGO」（National Bios ciences，Inc．（Plymouth，MN）による複合関数プログラム）を使用した。PCR を、「AMPLITAQ」（Perkin-Elmer Cetus）、PCR緩衝液（50.0mM KCl、10mM Tris -HClpH8.3、および1.5mM MgCl₂）、0.2mMの各dNTP、キイチゴのゲノムDNA、ならびにDruGen5'およびDruGen3'プライマーを使用して、製造業者の手順に従って以下（「HOT START」）の条件下で行った：１サイクル：97℃５分、その後、「AMPLITAQ」を添加した、２サイクル：97℃１分、52℃１分、および72℃１分 25サイクル：94℃１分、52℃１分、および72℃１分、１サイクル：72℃５分、そして５℃まで冷却。この増幅反応は、３つの主要な生成物：710bpの優勢な生成物ならびに690bpおよび625bpの２つのより少ない生成物を産生した。次いで、PCR反応生成物を、製造業者の説明書に従って、Invitrogen（San Diego，CA）によるTAクローニングベクターであるベクターpCRIIに連結した。710bpのインサートを有するクローンを選択し、pAG-302と命名した。 pAG-302のプラスミドDNAを、アルカリ溶解法（Ausubelら、1992）を使用して1 .6mlの培養物から調製し、「SEQUENASE」ver.2酵素およびキット成分（USB，Cle v eland，Ohio）および[α-³⁵S]-dATP（DuPont/NEN）を使用して、ジデオキシ鎖終結法によって配列決定した。配列決定反応を、M13ユニバーサル正方向プライマーおよび逆方向プライマー（NEB，Beverly，MA）を用いてプライムした。さらなる配列決定反応を、２つのさらなる内部プライマーを用いてプライムした。配列決定反応物を、アクリルアミドゲル上で分離し、そしてオートラジオグラフィーで検出した。 pAG-302中のdru1ゲノムDNAのインサートの配列を、配列番号11として表す。クローンの配列は、dru1 cDNAに対応するゲノムDNAフラグメントを単離したことを示す。実施例５逆PCRによるdru1ゲノムDNAの5'隣接領域の回収逆PCRプライマー（DruInvUp（配列番号８）およびDruInvLow（配列番号９）と名付けた）を、ゲノムDNA配列に基づいて設計し、そしてOLIGOを使用して最適化した。キイチゴのゲノムDNAを、制限酵素NsiIで消化した。cDNA配列に基づいて、NsiIが遺伝子の3'非翻訳領域で切断することが公知であったので、NsiIを選択した。NsiI消化したDNAの小さい部分を、分析用アガロースゲル上で泳動し、そしてサザントランスファーを行った（Ausubelら、1992）。サザンブロットを、pAG-302に含まれるcDNAフラグメントでプローブした。プローブは、２〜2.3kbのNsiIフラグメントを同定した：このフラグメントは、ゲノムクローンと強力にハイブリダイズした。第２のより小さいフラグメントもまた、プローブとハイブリダイズしたが、ゲノムクローンとは弱くハイブリダイズした。残ったNsiI消化したキイチゴDNAを、１％「SEAPLAQUE」アガロースゲル（FMC, Rockland，ME）上で電気泳動した。BstEIIλサイズ標準を指針として使用して、２〜2.3kbの範囲の消化したDNAをゲルから切り出した。DNAを、製造業者の説明書に従って、β-アガロース（NEB，Beverly，MA）を用いて精製した。DNAを、環状の連結反応生成物の形成に片寄らせるために、比較的希釈した濃度（１μg/ml ）で自己連結させた（Ochmanら、1990）。続いて逆PCRを、自己連結させた、NsiI消化した、サイズ選択したキイチゴのゲノムDNAについて行った。Perkin Elmer Cetusによる「AMPLITAQ」を使用して、DNAを増幅した。製造業者の手順に従って、PCR緩衝液、0.2mMの各dNTP、キイチゴのゲノムDNA（本明細書中上記のように調製した）、ならびにDruInvUpプライマーおよびDruInvLowプライマーを使用した。以下（「HOT START」）の反応条件を使用した：１サイクル：97℃５分、その後、「AMPLITAQ」を添加した、２サイクル：97℃１分、58℃１分、および72℃１分 25サイクル：94℃１分、58℃１分、および72℃１分、１サイクル：72℃５分、そして５℃まで冷却。この反応は、２つの主要な増幅生成物：１つは1.8kbおよび１つは900bpを産生した。1.8kbのバンドを、β-アガロースを使用する１％の「SEAPLAQUE」アガロースゲルから単離した。このフラグメントをpCRIIに連結して、pAG-310を生じた。 pAG-310インサートを、その全体を配列決定し（配列番号12）、そしてdru1インサートの配列が、配列を共有している領域内のcDNAクローン（配列番号10）およびゲノムクローン（配列番号11）と同一であることを見出した。CAATボックス、TATAボックス、ATG開始コドン、２つのエキソン、イントロン、スプライシング部位、停止コドン、およびポリアデニル化部位を含む、植物遺伝子の通常のエレメントおよびそれらの調節構成要素を同定した（図３Ａおよび３Ｂ）。 dru1の遺伝子の構成およびタンパク質構造を、図４に模式的に示す。この遺伝子は、配列番号13として示される推定のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。推定のタンパク質は、17,087.64の計算された分子量および4.80の推定p Iを有する。dru1タンパク質のKyte-Doolittle疎水性(hydrophobicity)プロットを、図５に示す。実施例６ dru1 遺伝子発現の特徴付けＡ．RNAドットブロット RNAドットブロットを、５μgのキイチゴの葉の全RNA、ならびに緑キイチゴ、成熟緑キイチゴ、変色キイチゴ、およびオレンジ／完熟キイチゴ由来の全花托RN Aの各５μgを使用して、RNAドットブロットを調製した（それぞれ、図６のＩ、I I、III、IV期に対応）。ブロットを、ランダムプライム法（Boeringer Mannheim Biochemicals，Random Primed reaction kit，Indianapolis，IN）によって[32 -P]dCTP（＞3000Ci/mmole）で標識したdru1 cDNAフラグメントでプローブした。ブロットを、「HYBRISOL I」（Oncor，Gaithersburg，MD）中で45℃にて一晩、ハイブリダイズさせた。1.2×10⁷DPM/mlのプローブ濃度を使用した。ブロットを、一晩のハイブリダイゼーション後に、0.1×SSCを使用して42℃で１時間の最終洗浄を含んで洗浄した。ハイブリダイゼーションプローブを標準的なオートラジオグラフィー法によって検出した。フィルムへのブロットの露出は、−80℃で増感スクリーンを用いて４時間10分であった。この分析の結果を、図６に示す。この図において、RNAドットは、それぞれ、左から右に、葉RNA、ならびに緑キイチゴ（図６「Ｉ」）、成熟緑キイチゴ（図６「II」）、変色キイチゴ（図６「III」）、およびオレンジ／完熟キイチゴ（図６「IV」）由来の花托RNAである。Ｂ．さらなるRNAハイブリダイゼーション分析植物RNA抽出法（Changら、1993）を、花托および葉について使用した。上記のキイチゴの小核果RNA抽出方法を、小核果およびストロベリーの果実について使用した。ノーザンブロットを、５μg／レーンの各サンプルRNAを用いて調製した。RNA サンプルは以下の通りであった：キイチゴの葉（図７、レーン１）、成熟緑キイチゴの花托（図７、レーン２）、オレンジ／完熟キイチゴの花托（図７、レーン３）、成熟緑キイチゴの小核果（図７、レーン４）、およびオレンジ／完熟キイチゴの小核果（図７、レーン５）。ブロットを、ランダムプライム反応によって[³²P]dCTP（＞3000Ci/mmole）で標識したdru1 cDNAフラグメントでプローブした。ハイブリダイゼーションを、「HYBRISOL I」（Oncor，Gaithersburg，MD）中で45℃にて一晩行った。4.2×10⁶ DPM/mlのプローブ濃度を使用した。ブロットを、一晩のハイブリダイゼーション後に、0.1×SSCを使用して50℃で30分間の最終洗浄を含んで洗浄した。ハイブリダイズしたプローブを、標準的なオートラジオグラフィー法によって検出した。増感スクリーンを使用せずに、室温で１時間、ブロットをフィルムに曝した。この分析の結果を、図７に示す。そしてこれは、小核果における期特異的発現パターンを支持する。Ｃ．タンパク質発現分析タンパク質溶解物を、成熟の種々の期のキイチゴ小核果から調製した（実施例１に記載のように）。溶解物を、PAGEによってサイズ-分画し、そしてクマシーブルー（50％ MeOH、10mM Tris-HCl pH8.3、1.5mM MgCl₂）でゲルを染色した。結果を図８に示す。この図において、レーン中の溶解物は以下の通りである：レーン１、緑色の小核果；レーン２、成熟した緑色の小核果；レーン３、変色した小核果；レーン４、オレンジ色の小核果；およびレーン５、熟した小核果。この分析の結果は、小核果における期特異的発現パターンを支持する。実施例７ dru1 プロモーターを含有するキメラ遺伝子Ａ．DRU1PRO:SAMase バイナリーベクターの構築 Dru1プロモーターを含有するフラグメントを、プライマーDruPro5'RI（配列番号14）およびプライマーDruPro3'(配列番号15))を使用し、そして標準的なPCR条件下でpAG-310からPCR増幅した。増幅反応は、1.3kbフラグメント産物を産生した。このフラグメントを、EcoRIおよびNcoIで完全に消化した。消化したフラグメントを、nosターミネーターを伴うAdoMetaseコード遺伝子を有するpUCベクターであるpAG-112（Ferroら、1995）に連結した。得られたプラスミドを、pAG-11 9と称した。 pAG-119プラスミドDNAを、SmaIおよびHindIIIで完全に消化した。Dru1pro/SAM -Kozak/Nosターミネーターを含む2.1kbのフラグメントを、１％の「SEAPLAQUE」アガロースからβアガラーゼを用いて、回収した。CMVV/nptII/G7ターミネーター遺伝子カセットをpPZP-200の多重クローン化部位に挿入することによって、pP ZP-200（Hajdukiewiczら、1994）からpAG-4000を得た。CMVV（Cassava mottle v einウイルス）プロモーターを、Scripps Research Institute，La Jolla，CA）から入手した。pAG-4000をSmaIおよびHindIIIで消化し、そして2.1kbのpAG-119 フラグメントに連結して、ベクターpAG-4032を形成した。この構築の詳細を、図９に模式的に記載する。 dru1プロモーター：SAMaseキメラ遺伝子の完全なヌクレオチド配列を、配列番号16に示す。推定のアミノ酸コード配列を、配列番号17に示す。Ｂ．DRU1PRO:PGIP バイナリーベクターの構築 PGIP遺伝子（Toubartら、1992）およびその3'非翻訳領域（UTR）を、プライマーPGIPNco5'（配列番号18）およびPGIPPst3'（配列番号19）を使用して、pAD-16 （Toubartら、1992）からPCR増幅した。増幅反応は、1.8kbの産物を産生した。この1.8kbのフラグメントは、クローニングベクターの一部を含んでいた。このフラグメントを、NcoIおよびPstIで完全に消化して、クローニングベクターの一部をもはや含まない1290bpのフラグメントを得た。 pAG-119（上記）を、NcoIおよびPstIで完全に消化することによって調製した。これによって、プラスミドのSamK部分を除去した。次いで、プラスミドの残りの部分を上記のPGIP含有フラグメントと連結した。この新しいプラスミドを、pA G-129と名づけた。 pAG-129を、XbaIおよびPvuII（その切断が平滑末端を生じる制限酵素）で完全に消化した。Dru1pro/PGIP/Nosターミネーターを含む2.87kbのフラグメントを、１％の「SEAPLAQUE」アガロースからβアガラーゼを使用して回収した。pAG-403 3ベクターを、XbaIおよびSmaI（その切断が平滑末端を生じる制限酵素）で完全に消化することによって調製した。この消化によって、プラスミドのDru1pro/SA M-Kozak/Nosターミネーター部分を除去した。次いで、プラスミドの残りの部分を、上記のDru1pro/PGIP/Nosターミネーターフラグメントに連結した。この新しいプラスミドを、pAG-4033と名づけ、その構築を図10に模式的に記載する。 dru1プロモーター：PGIPキメラ遺伝子の完全なヌクレオチド配列を、配列番号 20として示す。推定のアミノ酸コード配列を配列番号21として示す。実施例８数種の植物におけるdru1ホモログのサザンブロット分析他の植物種にキイチゴdru1遺伝子に相同な配列が存在するか否かを決定するために、サザンブロット分析を行った。ブロットは、サイズ標準とともに６種の植物ゲノムDNA（例えば、トマト、キイチゴ、ストロベリー、プラム、チェリー、およびモモ）のHindIII消化物からなる。プローブを、dru1コード配列特異的プライマーおよびポリメラーゼ連鎖反応（PCR；Mullis，1987：Mullisら、1987）を使用して行い得る。あるいは、pAG-301（配列番号10）由来の700塩基対のインサートを、EcoRIでの消化、続くサイズ分画によって単離する。次いで、DNAフラグメントを、Bohringer Mannheim Biochemical（Indianapolis，IN）「RANDOMPR IMED DNA LABELING」キットを使用して放射性標識する。ブロットを、標準的な方法（Maniatisら、1982）に従って、dru1特異的プローブでハイブリダイズする。例示的なハイブリダイゼーション条件は、以下の通りである：ブロットを、45 ℃で、「HYBRISOL I」ハイブリダイゼーションカクテル（Oncor，Gaithersburg ，MD）中でdru1プローブと一晩ハイブリダイズさせる。最終（もっともストリンジェントな）洗浄は、0.1％ SSC、0.1％ SDSで室温（22℃）で30分間である。ブロットのオートラジオグラフを使用して、そのゲノムDNAにdru1プローブがハイブリダイズし得る植物種を同定する。実施例９ストロベリーゲノムライブラリー由来のdru1に相同なDNAフラグメントの単離Ａ．ライブラリーのスクリーニング λGEM-11中の通常のストロベリーゲノムライブラリーを、Novagen（Madison,W I）から入手し、そして標準的な方法によって上記のdru1遺伝子プローブを用いてスクリーニングした。プローブにハイブリダイズするλクローンを同定する。クローンを、３回のプラーク精製によって精製する。ハイブリダイゼーション陽性のクローンを、さらなる分析のために選択する。Ｂ．陽性クローンの分析目的のクローンを、いくつかの酵素（例えば、ApaI、BamHI、EcoRI、HindIII 、 NcoI、SacI、およびSalI）で消化し、そしてゲル上で泳動し、そして「SUREBLOT 」ナイロンメンブレン（Oncor，Gaithersburg，MD）に転移させる。ブロットを、45℃で一晩、「HYBRISOL I」ハイブリダイゼーションカクテル（Oncor，Gaith ersburg，MD）中でdru1プローブとハイブリダイズさせる。最終（もっともストリンジェントな）洗浄は、0.1％ SSC、0.1％ SDSで室温（22℃）で30分間である。ハイブリダイゼーション陽性のフラグメントを、pGEM5Zf(+)（Promega，Madis on，WI）にサブクローン化し、そしてさらに特徴づける。インサートの核酸配列を決定し、そして核酸配列からアミノ酸配列を推定する。次いで、これらの配列を、キイチゴdru1核酸およびタンパク質配列と比較する。さらなるストロベリーdru1遺伝子配列を、ストロベリーゲノムライブラリークローンのさらなるハイブリダイゼーションスクリーニングによって得る。本発明は、特定の方法および実施態様に関して記載しているが、種々の改変および変更が本発明を逸脱することなく行われ得ることが理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．キメラ遺伝子であって：（i）目的の産物をコードするDNA配列、および（ii）植物dru1遺伝子由来のdru1プロモーターを含み、ここで該DNA配列が、該プロモーターに対して異種であり、そして該DNA配列が、該産物の発現を可能にするように該プロモーターに作動可能に連結されている、キメラ遺伝子。２．キメラ遺伝子であって：（i）目的の産物をコードするDNA配列、および（ii）（a）そのコード配列が、配列番号１２のコード領域に対して少なくとも8 0％の配列同一性を有する植物dru1遺伝子に由来し、（b）果実成熟において高レベルの発現を与える能力により特徴づけられる、プロモーター、を含み、ここで該DNA配列が、該プロモーターに対して異種であり、そして該DNA 配列が、該産物の発現を可能にするように該プロモーターに作動可能に連結されている、キメラ遺伝子。３．前記DNA配列が、S-アデノシルメチオニンヒドロラーゼ、アミノシクロプロパン-1-カルボン酸（ACC）デアミナーゼ、ACCオキシダーゼアンチセンス分子、A CCシンターゼアンチセンス分子、ACCオキシダーゼ同時抑制分子、およびACCシンターゼ同時抑制分子からなる群から選択される産物をコードする、請求項１または２に記載のキメラ遺伝子。４．前記DNA配列が病原関連遺伝子である、請求項１または２に記載のキメラ遺伝子。５．前記DNA配列が、ポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質（PGIP）、グルカナーゼおよびキチナーゼからなる群から選択される、請求項４に記載のキメラ遺伝子。６．前記DNA配列が、ソーマチン、スクロースリン酸シンターゼおよびリコペンシクラーゼからなる群から選択される産物をコードする、請求項１または２に記載のキメラ遺伝子。７．前記プロモーターが、キイチゴdru1遺伝子由来である、請求項１〜６のいずれかに記載のキメラ遺伝子。８．前記プロモーターが、配列番号22と少なくとも80％の配列同一性を有する、請求項１〜７のいずれかに記載のキメラ遺伝子。９．前記プロモーターが、配列番号22に記載のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、請求項１〜８のいずれかに記載のキメラ遺伝子。１０．請求項１〜９のいずれかに記載のキメラ遺伝子を含む植物形質転換ベクター。１１．請求項１０に記載のベクターを含む、植物形質転換を用いるためのキット。１２．請求項１〜９のいずれかに記載のキメラ遺伝子を含む植物細胞。１３．請求項１〜９のいずれかに記載のキメラ遺伝子を含む、トランスジェニック果実含有植物。１４．請求項１３に記載の植物によって産生された果実。１５．果実含有植物の果実成熟を改変する方法であって、請求項１３に記載の植物を生育させてトランスジェニック果実含有植物を産生させる工程を包含し、ここで（i）前記キメラ遺伝子が、植物細胞において発現する場合、エチレン生合成を低減し得る産物をコードし、そして（ii）該植物により産生された果実が、改変された成熟表現型を有する、方法。１６．トランスジェニック果実含有植物を産生する方法であって、請求項１〜９のいずれかに記載のキメラ遺伝子を植物の前駆細胞に導入する工程、および該形質転換前駆細胞を成長させてトランスジェニック果実含有植物を産生する工程、を包含する、方法。１７．前記導入工程が、植物の前駆細胞を前記キメラ遺伝子を含む選択可能なベクターで形質転換する工程を含む、請求項１６に記載の方法。１８．前記プロモーターが以下の工程により単離される、請求項１６に記載の方法：（i）配列番号１２により同定された植物dru1遺伝子またはそのフラグメント由来のプローブDNA分子を選択する工程、（ii）特定のハイブリダイゼーション条件下で、果実含有植物のゲノムから得られた複数の標的DNA分子と該プローブとを接触させる工程、（iii）該条件下で該プローブに特異的にハイブリダイズする標的分子を同定する工程、および（iv）該標的分子に関連したプロモーター配列を単離する工程。１９．dru1プロモーターを単離する方法であって、（i）配列番号１２により同定された植物dru1遺伝子またはそのフラグメント由来のプローブDNA分子を選択する工程、（ii）特定のハイブリダイゼーション条件下で、果実含有植物のゲノムから得られた複数の標的DNA分子と該プローブとを接触させる工程、（iii）該条件下で該プローブに特異的にハイブリダイズする標的分子を同定する工程、および（iv）該標的分子に関連したプロモーター配列を単離する工程、を包含する、方法。２０．前記プローブDNA分子が配列番号22により同定されるdru1遺伝子配列由来である、請求項１９に記載の方法。２１．前記果実含有植物が、ブドウ、イチゴ、セイヨウヤブイチゴ、スモモ、サクランボ、モモ、コケモモ、およびツルコケモモからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。２２．dru1プロモーターを含むDNA分子。２３．（i）コード配列が配列番号１２のコード領域と少なくとも80％の配列同一性を有する植物dru1遺伝子由来であって、（ii）果実成熟において高レベルな発現を与える能力により特徴づけられる、プロモーターを含む、DNA分子。