JP2000504205A - 妨害の無いバイオセンサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ペルオキシダーゼと共有結合した、炭素、炭素触媒、及び炭素含有導電性物質の微粒子形態を提供する。炭素：ペルオキシダーゼ結合体は、通常の電極の基礎として使用するために適している。驚くべきことに、結合体は、公知の妨害物質に殆ど感度を有せず、妨害の無い電極として使用するのに適している。

Description

【発明の詳細な説明】 妨害の無いバイオセンサー 発明の分野 本発明は、体液の分析用のバイオセンサーの分野に関する。発明の背景 血液中のグルコース濃度の測定の一方法は、グルコースと酵素グルコースオキ シダーゼの反応を起こさせることである。反応により、過酸化水素が産生され、 それは正電位で電気化学的に酸化されることができる。ペルオキシドの酸化によ り産生される電流を測定するが、その電流は血液中のグルコース濃度に比例する 。同様のスキームを用いて、問題の他の被検物質の濃度に比例して過酸化水素を 産生する適当な酵素を選択することによって該被検物質を測定できる。例えば、 乳酸は、酵素である乳酸オキシダーゼを用いて、同様に測定できる。 これらの測定技術に関する長く懸案の問題は、他の物質の妨害（または干渉、 interference）である。血液は、過酸化水素と同じ電位で酸化されることができ る他の成分を含みうる。これらの中では、尿酸とアセトアミノフェンが一般的で ある。こ れらの、又は他の妨害物質が酸化されると、それらの酸化から生じる電流は、過 酸化水素の酸化から生じる電流に加えられ、その電流と区別できない。それ故、 ペルオキシド、結果的に血液の被検物質の定量に誤差がでる。 これらの妨害を減少又は排除するために、多数の方法が試された。アセトアミ ノフェンは除去するのが特に難しかった。尿酸とは異なり、アセトアミノフェン は電荷を持たないからである。当業界で開示された一つの方法（Sittampalam，G .，and Wilson,G.S.，Analytical Chemistry，55，1608-1610，1983；Geise,R.J ．ら、Biosensors and Bioelectronics，6，151-160，1991）は、妨害物質が電 極と接触することを妨げるために、１個以上の選択的透過性膜を使用することで あった。しかし、この方法は、妨害を十分に防止するのに有効ではない。 妨害を防止する別の方法が米国特許第５，２２５，０６４号、第５，３３４， ２９６号に開示されている。この方法では、反応の電位を、尿酸とアセトアミノ フェンが酸化されない状態に減少させる。このことは、電極で、ペルオキシダー ゼの形態のような、過酸化水素を還元する酵素を用いることによって、達成され うる。この型の系において、過酸化水素はペルオキシダ ーゼと反応し、その反応では、過酸化水素は還元され、ペルオキシダーゼは酸化 される。ペルオキシダーゼが電極表面と密着するならば、ペルオキシダーゼは、 電位を賦課することによって、電極で還元されることができる。ペルオキシダー ゼを還元するのに必要な電流の大きさは、過酸化水素濃度に比例し、そのためグ ルコース又は問題の他の被検物質の濃度に比例する。更に、反応は、尿酸とアセ トアミノフェンは酸化せず、そのため妨害しない電位で起る。 当業界では、妨害を防止する試みにおいて、金表面又は炭素表面に物理的に吸 着した西洋ワサビペロオキシダーゼ又は真菌ペルオキシダーゼの使用が認識され ている（例えば、米国特許第５，２２５，０６４号及び第５，３３４，２９６号 ；Ho,W.O.ら、J．Electroanal．Chem.，351,187-197，1993;Wollenberger,U．ら 、Bioelectrochemistry and Bioenergetics，26，287-296，1991；Csoregi,E． ら，Anal．Chem．66，3604-3610，1994）。しかし、これらの報告によると、こ れらの適用においてシグナルを生成する電流の大きさは非常に小さく、直線性は ペルオキシダーゼの高濃度では乏しいので、このような使用では満足のいく結果 が得られなかった。 それ故、過酸化水素が測定可能なように反応し、利用できる大きさのシグナル 電流を産生し、高濃度まで直線性を有し、尿酸やアセトアミノフェンなどの妨害 物質の酸化によって生じる妨害をうけない電極システムの開発に大きな有用性が ある。図面の簡単な説明 図１は、本発明の妨害の無いバイオセンサーを用いる分析用電極を示す。発明の概要 本発明は、ペルオキシダーゼと共有結合した微粒子炭素を提供する。好ましく は、微粒子炭素は、二官能試薬を介し、ミクロペルオキシダーゼと結合した天然 の微粒子炭素である。 本発明はまた、サンプル中の被検物質の測定用電極として有用な微粒子炭素： ペルオキシダーゼ結合体も提供する。好適な電極は、樹脂マトリックス中に、ミ クロペルオキシダーゼと共有結合した天然の微粒子炭素を含む。発明の詳細な説明 本発明の実施態様は一般的に、溶液中の問題の被検物質の濃度を電気化学的に 測定するために使用される電極を含む。バイオセンサー又は電極は、微粒子炭素 と共有結合し、電極と密着 しているマトリックス中に保持されるペルオキシダーゼ酵素を含む。 本明細書で用いる“微粒子炭素”という用語は、炭素、炭素触媒（例えば、白 金で被覆した炭素、ルテニウム含有炭素など）及び炭素含有導電化合物（例えば 、ポリピロール、ポリアニリンなど）の細かい粒子を指す。種々の形態の微粒子 炭素は当業界公知であり、市販業者から容易に得ることができる。使用と取扱い のしやすさから、微粒子炭素は、直径１０００ｎｍ（１ミクロン）未満、好まし くは範囲５−５０ｎｍであることが好ましい。下記の実験では、微細な（３０ｎ ｍ）粒子炭素（Vulcan XC72R；E-Tek，Natick MA）を用いる。 微粒子炭素は、その天然状態（“天然”）で使用できるし、又は当業界公知の 技術により、種々の官能基を炭素に結合できる（“誘導体化”）。誘導体化炭素 の場合、炭素微粒子を二官能試薬、好ましくはアミン含有官能基を有する二官能 剤と反応させる。２個の官能末端間で異なる長さの種々のリンカーを有する二官 能試薬を利用できるので、種々の酵素での使用及び種々の適用のために適切な試 薬を容易に素早く決定できる。得られた誘導体化炭素粒子は酵素と直ちに結合さ せることができ るし、又は酵素との結合前に保存できる。 再び当業界公知の、及び下記詳細の技術により、誘導体化粒子又は天然粒子は 酵素と共有結合される。 任意の起源のペルオキシダーゼが、本発明の妨害の無いバイオセンサーで有用 である。ペルオキシダーゼは、当業界公知の技術により容易に得られるし、又は 市販業者から購入できる。一好適実施態様では、ペルオキシダーゼは、欧州特許 出願公開第０,１９５，３２０号で記載のようなミクロペルオキシダーゼである 。 酵素が結合した微粒子炭素はそれだけでは、問題の被検物質の検出のために容 易に使用できなく、被検物質が炭素：酵素結合体と接触できるように、炭素は物 理的に閉じ込められるべきである。当業界公知の、いずれの閉じ込め方法（例え ば金：ペルオキシダーゼ結合体の閉じ込め方法）も本発明での使用に適している 。例えば、半−、又は選択的−透過性膜の使用によって、炭素は物理的に閉じ込 められることができ、問題の被検物質をペルオキシダーゼ酵素と密着させること が可能となる。一好適実施態様では、微粒子炭素：酵素結合体は、電極の構築の ために使用される。この特定の実施態様では、微粒子炭素：酵 素結合体は、電極を構築するために、導電性表面に閉じ込められる。当業界公知 である、炭素：酵素微粒子を表面に閉じ込める多数の方法のうちで、ＷＯ ９５ ／２２０５７に記載の方法が好ましい。そこで記載された方法は、粒子を樹脂マ トリックス（“ペイント”ともいう）に導入するものであるが、酵素活性を保持 するために水ベースであるという利点がある。それはまた、液体を提供し、分配 を容易にし、電極の製造を容易にする。そこに開示されているように、炭素粒子 を有する液体樹脂を乾燥させ、血液と適合性のある水不溶性フィルムを形成させ る。 本発明の酵素：微粒子炭素は、ペルオキシダーゼの触媒的性質が利点のあるい ずれの適用でも有用である。重要なことであるが、本発明の酵素：微粒子炭素は 、ペルオキシド測定を通常妨害する化合物が本質的に妨害しない組成物を提供す る。即ち、本発明の酵素：微粒子炭素は、装置ベースシステム（インビトロ）で 、又はインビボでの血液被検物質の直接測定用のデバイスで使用できる。実施例１−ミクロペルオキシダーゼの炭素粒子との共有結合形成 この実験では、天然炭素粒子及び２種の型の誘導体化炭素粒 子をミクロペルオキシダーゼと共有結合させる。 第１の型の誘導体化炭素は、炭素１００ｍｇと、ｐＨ５．５の５０ｍＭの２［ Ｎ−モルホリノ］−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（Sigma，St.Louis ＭＯ）緩衝 液５ｍＬ中エチレンジアミン２７ｍｇを混合することによって炭素に結合した官 能基エチレンジアミン（Aldrich，Milwaukee ＷＩ）を利用する。次に、塩酸１ −（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）（Pi erce，Rockford ＩＬ）５０ｍｇを加え、結合を開始させ、１時間反応させる。 誘導体化炭素を遠心で取得し、水で３回洗浄する。 第２の型の誘導体化炭素では、官能試薬として、ポリ（オキ ＴＸ）を用い、炭素１００ｍｇと、ｐＨ５．５の４％ピリジン／水溶液５ｍＬ中 のジアミン２４０ｍｇを混合することによって、炭素と結合させる。次に、ＥＤ Ｃ４ｍｇを加え、結合を開始させ、一晩反応させる。次に、誘導体化炭素を遠心 で取得し、水で３回洗浄する。 ペルオキシダーゼ酵素は、ＥＤＣを用いて、天然の微粒子炭素又は誘導体化微 粒子炭素と共有結合させる。炭素１００ｍｇ を、５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）５ｍＬ中ペルオキシダーゼ酵素（例 えば、Sigma Chemical，St.Louis，ＭＯからのＭＰ−１１ミクロペルオキシダー ゼ）２０ｍｇと混合する。あるいは、且つ好ましくは、緩衝液は、ｐＨ５．５の ４％ピリジン／水溶液でありうる。ＥＤＣ１０ｍｇを加え、溶液を１時間混合す る。共有結合したペルオキシダーゼ酵素を有する炭素を遠心で取得し、水で洗浄 する。結合酵素を有する炭素は湿潤状態で保存する。 共有結合と比較するために、酵素吸着は、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ塩化ナトリウム、及び０．０５％抗菌（Kathon CG；Roh m and Haas，Philadelphia ＰＡ）溶液からなる溶液（ｐＨ７．５）中で行う。 この溶液をＰＥＳＫ７．５と命名する。炭素１２５ｍｇを、ＰＥＳＫ７．５ ５ ｍＬ中酵素２５ｍｇと一晩混合する。次に、炭素を遠心で取得し、ＰＥＳＫ７． ５で３回洗浄する。実施例２−ペイントの製造 導電性表面上に炭素を保持するための、Ｆ１３３樹脂と命名した樹脂マトリッ クスを、以下の重量の各成分を混合して作製する。 次に、樹脂（液体）７２ｍｇを、水中の０．０８５Ｍ湿潤状態トレハロース（ Sigma，St.Louis，MO）２６２ｍｇ中でコンパクトにした炭素：酵素結合体１６ ０ｍｇと混合する。３成分の激しい撹拌をamalgamator(WIG-L-BUG；Crescent De ntal Co.，Lyons IL)を用いて３分間行い、液体懸濁液を作製する。次に、この 懸濁液又はペイントを電極に適用できる。実施例３−電極の構築 ＷＯ ９５／２２０５７に記載の型の分析用電極において、炭素：酵素結合体 を用いる。 本発明の炭素：酵素結合体を試験するための分析用電極アッセンブリーを簡単 に図１に示す。電極アッセンブリー１０は、ポリエステルシート３２上の１個以 上（この図では４個）のバイオセンサー１２からなる。バイオセンサー１２は、 ポリエステルシート３２上に銀／塩化銀（Acheson SS24540）電気連結部２０を プリントすることにより構築する。装置２１との電気的接触の位置において、電 気連結部２０の末端部も同様に、導電 トレースが、電気連結部２０上の炭素インキ（Acheson 423SS）のスクリーンプ リントによって、作製される。炭素表面は、スクリーンプリント絶縁体（Acheso n ML25208）を用いてマスクし、１２でのペイントの適用のために露出されてい る炭素０．０１３ｃｍ²は残す。手動ディスペンサーを用い、炭素：酵素結合体 ペイント０．２〜１．０μＬを、炭素トレースの露出されている表面に施用する 。銀／塩化銀（Acheson SS24540）を用いて、参照電極１４をプリントする。別 のカウンター電極（図１では示さず）を、側面対向ガスケット１６上の前面プレ ート１８上に作製する。カウンター電極は上記のように炭素でプリントするが、 ペイントは施用しない。ガスケット１６は、ポリエステルシート３２と前面プレ ート１８の間に挟まれて、フローチャンネル３４を形成する。したがって、液体 は、入口２４から入って出口２６から出て、バイオセンサー１２、参照電極１４ 、及びカウンター電極（図示せず）を流れよう。背面プレート２２は、締め穴４ ２を通ってボルト３０に挿入されたナット２８のような締め手段を介して前面プ レート１８に締めつけることができる。必要によって、穴４４とピン４６により 、構成物の適切な設置を確実にするために、設置手段を提供できる。実施例４−感度の証明 ａ． 異なる酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、大豆ペルオキシダーゼ、及び ミクロペルオキシダーゼ）、異なる炭素結合方法（吸着又は共有結合）、及び異 なる炭素処理（天然、エチレンジアミン、又はJEFFAMINE ED-600）を用いて、実 施例１〜３に記載のように、幾つかの電極を作製する。３７℃の約０．１ｍＭ過 酸化水素の試験溶液を、炭素トレース、参照電極及びカウンター電極上に通す。 固定電位１００ｍＶを電極に適用し、得られた電流を、種々の電極型について、 標準的三電極回路を用いて記録する。酵素、炭素結合技術、及び炭素処理の種々 の組合せで測定した電流は以下の通りである。 上記から明らかなように、共有結合ミクロペルオキシダーゼ は、吸着という通常の方法よりもかなり大きい電流を示す。共有結合ミクロペル オキシダーゼ（ＭＰ−１１，Sigma，St.Louis MO）は、西洋ワサビペルオキシダ ーゼ（II型，Sigma）及び大豆ペルオキシダーゼ（Enzymol International，Inc. ，Bexley OH）のような他のペルオキシダーゼ酵素よりもかなり大きい電流を与 える。 ｂ． フェリシアン化カリウムも、ペルオキシダーゼと同様な可逆反応で還元さ れる。ペルオキシドとフェリシアナイドの等濃度を用いると、ペルオキシダーゼ から産生される電流は、フェリシアナイドから産生される電流より３０〜６０倍 小さいことが、当業界で十分に認識されている。例えば Csoregi,E．ら参照。本 発明の感度を評価するために、本発明の電極でのペルオキシドの還元から生じる 電流を、フェリシアン化カリウムの還元から生じる電流と比較する。約３７℃で 、約０．０５ｍＭの実質的に等濃度の過酸化水素とフェリシアナイドを、天然の 炭素に共有結合したミクロペルオキシダーゼを有する、本明細書記載の具体例で ある電極に通す。驚くべき事に、ペルオキシド還元の電流は、フェリシアナイド 還元の電流の２倍であった（以下の表参照）。フェリシアナイドでは１個の電子が含まれるのに対し、ペルオキシド還元は２個 の電子を含むので、フェリシアナイドによって産生されるシグナルの２倍である 、本発明によって産生されるシグナルは、炭素からミクロペルオキシダーゼ酵素 への非常に速い電子移動を示す（少なくとも、可逆的フェリ／フェリシアナイド 反応の電子移動と同じだけ速い）。これは、以前には決して達成されなかったも ので、本発明の感度を示す。実施例５−直線性の証明 電極を、エチレンジアミン誘導体化炭素に共有結合した大豆及び西洋ワサビペ ルオキシダーゼ、並びに天然の炭素に共有結合したミクロペルオキシダーゼを用 いて作製する。約３７℃、電極電位１００ｍＶで、種々のレベルの過酸化水素に 対する電極の応答を測定し、以下の結果を得る。 上記からわかるように、大豆ペルオキシダーゼも西洋ワサビペルオキシダーゼ も試験した範囲で直線性を示さなかった。高濃度では、応答は顕著に減少し、情 報は有用ではないから記録をとらない。一方、ミクロペルオキシダーゼは、過酸 化水素が少なくとも０．３ｍＭまでは直線性を示す。 現在までの文献では、ペルオキシドの検出での使用では、西洋ワサビペルオキ シダーゼ又は真菌ペルオキシダーゼが、ミクロペルオキシダーゼより好まれてい た。しかし、ミクロペルオキシダーゼを使用する本発明の実施態様は、シグナル の大きさばかりか直線性という点でも他のペルオキシダーゼ酵素の適用より非常 に優れている。実施例６−グルコース濃度の測定 本実施例では、製造業者によって供給された市販の電極において本発明のペイ ントを用いて、市販の装置（Nova Biomedical Stat Profile 10）を使用して、 グルコースを測定する。 実施例１に記載のようにして、天然の炭素にミクロペルオキシダーゼを共有結 合させ、実施例２に記載のようにペイントを作製する。電極本体の白金作用電極 にペイントが設置されるように、Nova Biochemicalのグルコース酵素キャップの 内部表面の中央に、ペイントを施用する。ペイントを乾燥させ、次に、 該キャップをグルコース電極本体上に置く。対照電極は非改変グルコース電極 、即ち、製造業者によって供給されたままの電極であり、製造業者の指示通り操 作する。改変電極をフローヤルの中に入れ、種々のレベルの妨害物質を含むグル コース溶液を電極上に通し、測定のために流動を止める。適用電位約１００ｍＶ で、電位差計を用い、電流を計測する。グルコースレベルは、低血糖糖尿病サン プルをシミュレートするように、温度約３７℃で約２ｍＭの一定に保つ。アセト アミノフェンは毒性限界２ｍＭまで変化させる。アセトアミノフェンの非存在下 及び存在下の電極のシグナルの変化％を定量する。結果を下に示す。 アセトアミノフェン濃度対グルコースシグナル変化％ ２ｍＭグルコース溶液。 結果は、本明細書記載の実施態様の電極のグルコース測定に及ぼすアセトアミ ノフェンの影響は本質的にないことを示す。実施例７−乳酸濃度の測定 Nova Biomedical 乳酸酵素キャップを用いて、実施例６と同様の実験を行う。 乳酸は、グルコースよりも血液濃度が低いので、０．３ｍＭ乳酸溶液を用いる。 再度下記のように、本発明のミクロペルオキシダーゼを用いると、乳酸測定に対 するアセトアミノフェンによる妨害が無くなる。 アセトアミノフェン濃度対乳酸シグナル変化％ ０．３ｍＭ乳酸溶液。 実施例８−ミクロペルオキシダーゼのポルフィリンとの比 ポルフィリンは触媒として作用できることが知られている。ミクロペルオキシ ダーゼは基本的に、ポルフィリン環に共有結合した、１１個のアミノ酸からなる 短ペプチド鎖であり、ポルフィリンとミクロペルオキシダーゼの間で化学構造に 多くの類似性があるので、以下の実験で、ペルオキシドの触媒的還元におけるペ プチド鎖の必要性を評価する。 以下の方法で、コバルトをプロトポルフィリン IX ジメチルエステル（Sigma ）に挿入する。ポルフィリン５０ｍｇを、１００ｍＬ丸底フラスコ中ＤＭＦ２５ ｍＬに溶解する。塩化コバルト（sigma）５０ｍｇを加え、蛍光が消失するまで 還流する。次に、溶液を冷却し、冷水を加え、コバルトポルフィリンを再結晶化 させる。洗浄と乾燥後、コバルトポルフィリンを湿潤炭素２５０ｍｇに吸着させ る。乾燥ポルフィリン１０ｍｇを、クロロホルム５ｍＬ中炭素と混合して、吸着 を行わせる。クロロホルム除去、アセトンと水による洗浄後、炭素：吸着ポルフ ィリン約１６０ｍｇ、Ｆ１３３樹脂７２ｍｇ、水中の０．０８５Ｍトレハロース ２６２ｍｇを混合することによって、コバルトポルフィリンをペイント中に作製 する。実施例３に記載のスク リーンプリント電極上に、ペイントを塗布する。０．１ｍＭ過酸化水素の還元を 、異なる電位で、コバルトポルフィリン電極とミクロペルオキシダーゼ（天然の 炭素に共有結合した）電極について記録する。 電位の関数としての０．１ｍＭ過酸化水素の還元。 これらの結果は、ミクロペルオキシダーゼ含有の本発明のペイントは、コバル トポルフィリンよりも容易に、電位約４００ｍＶでペルオキシドを還元すること ができることを示す。このことは、ミクロペルオキシダーゼは、ペルオキシドの 触媒的還 元で、ポルフィリンよりも顕著に良く作用することを示す。実施例９−別のミクロペルオキシダーゼ酵素の合成 ミクロペルオキシダーゼの触媒的性質への鉄の必要性を調ペる為に、以下の実 験を設計する。結果は、金属部分は触媒活性に必要であり、驚くべきことに、天 然の鉄が除去され、他の金属で置き換えられたときでも、活性は保持されること を示す。 ａ． 氷酢酸１４ｍＬ中に溶解した酵素２０００ｍｇに、濃ＨＣｌ ４ｍＬ中硫 酸鉄８００ｍｇを添加することによって、ミクロペルオキシダーゼから鉄を除去 する。この反応混合液は窒素下１０分間攪拌され、その間に溶液の色はエビ茶色 から紫に変る。ミクロペルオキシダーゼが沈殿するまで、アセトンを溶液に加え る。次に、この固体を集め、アセトンを用いて遠心で洗浄し、乾燥させる。 ｂ． 種々の金属を挿入するために、実施例９ａからのミクロペルオキシダーゼ （以後、“脱鉄化”ペルオキシダーゼという）２０ｍｇを、１：３ピリジン：酢 酸溶液４ｍＬに溶解する。溶液を窒素下８０℃に加熱し、硫酸塩又は塩酸塩の形 態の金属（例えば、鉄、亜鉛、銅、ニッケル）２０ｍｇを水１ｍＬ中に加える。 混合液を、窒素下８０℃で１０分間反応させ、つぎに空気 中で１０分間冷却する。ミクロペルオキシダーゼを沈殿させるために、アセトン を加え、固体をアセトンで洗浄する。 異なる金属を含む各ミクロペルオキシダーゼ活性を、炭素との共有結合の前に 、試験する。４−アミノアンチピリンと２−ヒドロキシ−３，５−ジクロロベン ゼンスルホン酸からのキノンイミン色素の生成速度を、過剰の過酸化水素存在下 、５５０ｎｍで観察することによって、活性を測定する。以下の相対的活性結果 を測定する。 結果は、鉄の除去と置換により、活性の約２５％損失を示す。亜鉛とニッケル ミクロペルオキシダーゼは、活性の約５０％損失を示す。銅ミクロペルオキシダ ーゼはあまり活性がない。 異なる金属イオンを含むミクロペルオキシダーゼ酵素を、実施例１に記載の方 法を用い、天然の炭素に共有結合させる。炭素：酵素結合体約１６０ｍｇ、Ｆ１ ３３樹脂、及び水中０．０８５Ｍトレハロース２６２ｍｇを用い、ペイントを製 造し、その後、 試験のために、実施例３に記載のように炭素トレースに塗布する。電極を、１０ ０ｍＶで過酸化水素還元について試験する。 これらの結果は、ミクロペルオキシダーゼは、異なる金属イオンの挿入で改変 でき、ペルオキシドを検出するセンサーで使用できることを示す。 本出願で引用した参考文献の全ては引用により本明細書に含まれるものとする 。 本発明を、好適実施態様に関し記載した。本発明の真の範囲と思想から離れる ことなくして、変化、変更又は改変を、これらの実施態様に関し為すことができ ることを当業者は容易に理解しよう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ペルオキシダーゼと共有結合した微粒子炭素。 ２． 微粒子炭素が天然の微粒子炭素であることを特徴とする請求項１に記載の 組成物。 ３． 微粒子炭素が二官能試薬で誘導体化されていることを特徴とする請求項１ に記載の組成物。 ４． 二官能試薬がジアミンであることを特徴とする請求項３に記載の組成物。 ５． ジアミンがポリ（オキシアルキレン）ジアミンであることを特徴とする請 求項４に記載の組成物。 ６． 微粒子炭素が炭素又は炭素触媒であることを特徴とする請求項１に記載の 組成物。 ７． 微粒子炭素が炭素含有導電性化合物であることを特徴とする請求項１に記 載の化合物。 ８． 微粒子炭素は炭素であり、ペルオキシダーゼはミクロペルオキシダーゼで あることを特徴とする請求項６に記載の組成物。 ９． 微粒子炭素が天然の微粒子炭素であることを特徴とする 請求項８に記載の組成物。 １０． ペルオキシダーゼの金属部分が、鉄、ニッケル又は亜鉛を含むように改 変されていることを特徴とする請求項１に記載の組成物。 １１． 樹脂マトリックスを更に含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物 。 １２． サンプル中の被検物質の測定用電極であって、導電性表面に閉じ込めら れた、ペルオキシダーゼと結合した微粒子炭素を含むことを特徴とする該電極。 １３． 微粒子炭素が天然の微粒子炭素であることを特徴とする請求項１２に記 載の電極。 １４． ペルオキシダーゼがミクロペルオキシダーゼであることを特徴とする請 求項１３に記載の電極。 １５． ペルオキシダーゼと結合した微粒子炭素が樹脂マトリックスに閉じ込め られていることを特徴とする請求項１４に記載の電極。 １６． 試験サンプル中の、問題の被検物質の測定方法であって、サンプルを、 ペルオキシダーゼと結合した微粒子炭素と接触させ、サンプル中の被検物質量の 定量的又は定性的測定法と して電位の変化を検出することを特徴とする該方法。 １７． 微粒子炭素が天然の炭素であることを特徴とする請求項１６に記載の方 法。 １８． ペルオキシダーゼがミクロペルオキシダーゼであることを特徴とする請 求項１７に記載の方法。 １９． ペルオキシダーゼと結合した微粒子炭素が導電性表面に閉じ込められて いることを特徴とする請求項１６に記載の方法。 ２０． ペルオキシダーゼと結合した微粒子炭素が樹脂マトリックスに閉じ込め られていることを特徴とする請求項１９に記載の方法。 ２１． 被検物質がグルコース又はラクトースであることを特徴とする請求項１ ６に記載の方法。