JP2000504218A - リガンド指令酵素プロドラッグ療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、腫瘍の治療に有効な、(a)細胞の表面をターゲッティングすることができるリガンドと酵素との融合タンパク質またはコンジュゲート、および(b)該酵素により活性薬剤に変換され得るプロドラッグ、を含んでなる、互いに組み合わせて用いるための二成分系を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 リガンド指令酵素プロドラッグ療法 序論および発明の背景 本発明は、リガンド指令酵素プロドラッグ療法(ligand directed enzyme prod rug therapy: LIDEPT)ならびに腫瘍を含めた疾病の治療におけるその使用に関す る。 「抗体指令酵素プロドラッグ療法」（ADEPT）と称する治療法が、プロドラッ グを用いて患者の腫瘍細胞を治療する方法として提案されている。腫瘍細胞はプ ロドラッグを活性化することができる酵素に結合された抗体によりターゲッティ ングされる。コンジュゲート中の抗体は、酵素が腫瘍細胞の外面でプロドラッグ を活性薬剤に変換できるように腫瘍細胞と結合する（例えばWO88/07378参照）。 あるいはまた、酵素をコードする遺伝子の送達法も使用されている（例えばEP-A -415731 参照）。こうした方法として、リン酸カルシウム共沈、マイクロインジ ェクション、リポソーム、指定ＤＮＡ取込み、および受容体媒介ＤＮＡ導入が挙 げられる。これらはMorgan & French Anderson，Annu．Rev．Biochem.，1993，6 2:191 に論評されている。「GDEPT」（遺伝子指令酵素プロドラッグ療法）とい う用語には、ウイルスと非ウイルスの両方のデリバリーシステムが含まれる。 本発明は、腫瘍細胞の表面上の受容体を認識するリガンドを使用する、新しい クラスの酵素デリバリーシステムに関する。腫瘍細胞はリガンド-酵素コンジュ ゲートまたはリガンド-酵素融合体によりターゲッティングされる。発明の開示 本発明は、互いと組み合わせて使用するための二成分系を提供し、この二成分 系は、 （a）リガンドと酵素との融合タンパク質またはコンジュゲート、および （b）該酵素により活性薬剤に変換され得るプロドラッグ、 を含んでなる。 上記二成分系のリガンド成分は、好ましくは、 （i）腫瘍細胞の表面上のコグネイト（cognate）受容体に結合するという生物 学的役割を担う天然に存在するポリペプチド、または （ii）そのコグネイト受容体に依然として結合する上記ポリペプチドの断片、 または （iii）改変された受容体特異性を有する上記（i）および（ii）の誘導体、 からなるリガンドである。 さらに、本発明は、受容体に結合することができる有効なリガンド-酵素およ び該酵素により活性薬剤に変換され得るプロドラッグを患者に投与することを含 んでなる患者の治療方法ならびに治療を必要としている患者の腫瘍の治療方法に おいて使用するための本発明の二成分系を提供する。本発明はさらに、リガンド （またはその断片もしくは誘導体）と酵素との新規なコンジュゲートを提供する 。図面の簡単な説明 図１は、リガンド、酵素、およびそれらを含むいくつかの融合タンパク質の模 式図である。発明の詳細な説朋 Ａ．リガンド コグネイト受容体に結合するという生物学的役割を有する天然に存在するポリ ペプチドからなるリガンドは、天然の哺乳動物ポリペプチドであることが好まし い。望ましくは、このようなポリペプチドは本発明により治療される予定の哺乳 動物種から選択される。したがって、本発明の系がヒトへの使用を目的としてい る場合、そのポリペプチドはヒト由来のものであることが好ましい。動物に適用 する場合は、そのポリペプチドは例えばウシ、ヒツジ、ブタ、イヌまたはネコの ポリペプチドであり得る。研究用には、そのポリペプチドは上記または他の動物 、例えば霊長類や（マウス、ラット、ウサギなどの）げっ歯類に由来するもので あってもよい。 リガンドの例として、上皮増殖因子EGF（上皮増殖因子受容体に結合する）、 ヒレグリン（heregulin）およびc-erbB2リガンドが挙げられる。EGFRおよびc- ErbB2は多くの腫瘍型において発現されている。 一般的に、適当なリガンドの例には、腫瘍細胞上または腫瘍の周辺にある血管 系上にもっぱら発現されるか数多く発現される受容体を認識するものが含まれる 。 後者のこのような例は血管内皮増殖因子（VEGF）受容体である。VEGFは悪性細 胞により生じる腫瘍血管形成の調節物質であり、高親和性VEGF受容体を発現する 腫瘍内皮細胞上で作用する。公知のVEGF受容体はflt-１およびflk-１と呼ばれる チロシンキナーゼであり、これらは腫瘍の内皮細胞および腫瘍と正常組織の境界 域で特異的に発現される(Science 253，989，1992; Cell 72，835，1993)。flk- １は胚発生中の内皮細胞で特異的に発現されるが、血管形成が停止する成体では ダウンレギュレートされる。腫瘍は更なる増殖のために腫瘍血管系からの栄養素 と酸素の絶え間ない供給を必要とするので、腫瘍は血管形成に依存している。そ れゆえ、flt-１および／またはflk-１に結合するVEGFは、腫瘍環境に酵素を選択 的にターゲッティングさせるために使用できる可能性がある。腫瘍内皮をターゲ ッティングすることの利点は、それが接近可能性の欠如による大きい分子（例： 抗体）の低い透過性の問題を克服する点である。また、リガンドのin vivoクリ アランス時間は非常に短く、それゆえ、プロドラッグ注射前の正常組織および血 液からのクリアランスのために、抗体-酵素コンジュゲートの場合に必要とされ る時間よりも少ない時間がリガンド-酵素の投与の場合には必要とされる。 VEGFはLIDEPTにおいてプロドラッグを選択的に触媒して毒薬とすることができ る非内因性酵素に結合させたり、または該酵素との融合タンパク質として調製す ることができる。このLIDEPT系では、flt-１および／またはflk-１がプロドラッ グを毒薬に変換する非内因性酵素により効率的にターゲッティングされるだろう 。使用可能な酵素およびプロドラッグには、WO88/07378、WO89/10140、WO90/027 29、EP-A-415731 、WO91/03460、WO93/08288、WO94/25429、WO95/02420、WO95/0 3830、PCT/GB95/01783およびPCT/GB95/01782に記載されているものが含まれる（ 前記文献の開示内容を参考としてここに組み入れる）。 この抗血管形成法を用いることは、毒薬が腫瘍の血管系から拡散することがで きる小さい分子であるので、三重の目的にかなうだろう。第一に、それは腫瘍血 管系の内皮細胞を死滅させるだろう。第二に、それは第三者効果（bystander effect）を発揮することにより腫瘍細胞を殺すだろう。第三に、それは腫瘍細胞 を栄養素と酸素に飢えさせることによっても腫瘍細胞を殺すだろう。 リガンドの断片も使用できるが、それらがコグネイト受容体（リガンドが結合 する受容体）に依然として結合するという条件付きである。望ましくは、その結 合は実質的に類似した親和性、例えば約１０倍低い親和性から約１０倍高い親和 性、またはより高い親和性、例えば約２０〜１００倍高い親和性をもつだろう。 この結合はまたコグネイト受容体に対して実質的に類似した選択性をもつだろう 。かくして、この断片はリガンド自体よりも実質的に高度に他の細胞表面受容体 と交差反応したり結合したりしない。 断片の結合親和性は標準的な方法、例えばＩ¹²⁵リガンド競合アッセイにより 測定し得る。結合特異性は例えばin vitroでのＩ¹²⁵リガンド-酵素生体分布によ り測定し得る。 リガンドの断片は所望の方法で作製し得る。例えば、リガンドを化学的に、例 えばトリプシンまたは臭化シアンのような他のタンパク質断片化化合物、または 他のタンパク質分解酵素を用いて、切断する。クロマトグラフィーでリガンドの 断片を分離し、回収する。タンパク質の切断、クロマトグラフィーおよび回収の 条件は当業界で公知である。より一般的には、断片は組換えＤＮＡ法により作製 されるだろう。リガンドをコードするＤＮＡを制限部位でスプライスし、該リガ ンドをコードするＤＮＡの領域を欠失させる。リガンドの断片がＣ末端切断型断 片である場合は、所望の切断位置に停止コドンを導入すべく位置指定突然変異誘 発法によりそのＤＮＡを改変する。その他のＤＮＡ操作法は一般的な参考書、例 えばSambrookら，Molecular Cloning，CSH，1987に見いだせる。 次いで、切断ＤＮＡを組換え発現系で発現させてリガンド断片を産生させ、こ の断片を回収する。本明細書中に記載するように、断片をコードするＤＮＡは融 合タンパク質を与えるようにLIDEPT系の酵素をコードするＤＮＡに連結させても よい。 リガンドおよびそれらの断片の誘導体も組換えＤＮＡ法により作製し得る。位 置指定突然変異誘発法を用いて、リガンドにアミノ酸の置換、欠失または挿入を 導入することができる。導入可能な１つのクラスの置換は同類アミノ酸置換であ る。 同類置換は次の表にしたがって行われ、ここでは第２欄の同じブロックにある アミノ酸、好ましくは第３欄の同じラインにあるアミノ酸が互いに置換可能であ る。 リガンド断片と同様に、誘導体はリガンド自体と実質的に類似したまたはより 高い親和性および選択性でもってそれらのコグネイト受容体に結合することが好 ましい。好適な選択性および親和性の程度はリガンド断片について先に規定した とおりである。Ｂ．酵素 酵素は、細胞、特に哺乳動物（中でもヒト）細胞、の表面に通常発現されない し、循環系にも放出されない、プロドラッグを活性薬剤に変換する能力がある酵 素である。この酵素は天然にはヒトに存在しない哺乳動物酵素またはプロドラッ グに通常接近できないヒト酵素であり得る。これにはプロドラッグに関して選択 性のある様式で改変された哺乳動物酵素および他の種からの酵素が含まれる。言 い換えれば、この改変は、天然酵素によるプロドラッグの活性薬剤への変換が、 改変酵素が働く速度より一桁以上遅い速度であることを意味する。改変酵素は標 準的な組換えＤＮＡ法により、例えば、酵素をクローニングし、その遺伝子配列 を決定し、そして位置指定突然変異誘発法のような方法でその遺伝子配列を改変 することにより作製し得る。 通常、酵素はプロドラッグから保護基を除去することによりプロドラッグを活 性薬剤に変換するだろう。たいていの場合、保護基はプロドラッグから全体とし て開裂される。しかし、酵素が保護基の一部を開裂または単に改変して、部分的 に開裂または改変された不安定な保護基（保護基の残部は自然に除去される）を 生成することも可能である。この種のプロドラッグは特に後述するニトロレダク ターゼ酵素と共に用いられる。 好ましくは、酵素は非哺乳動物酵素である。適当な非哺乳動物酵素には細菌の 酵素が含まれる。細菌の酵素としては、WO88/07378に記載されるようなカルボキ シペプチダーゼG2（CPG2）などのカルボキシペプチダーゼ、シュードモナス（Ps eudomonas）のγ-グルタミルヒドロラーゼ EC3.4.22.12 (Levy CC & Goldstein P J．Biol．Chem．242 p2933(1967))、およびWO93/08288に記載されるような大 腸菌のニトロレダクターゼなどのニトロレダクターゼが挙げられる。その他の適 当な酵素の例はチミジンキナーゼ（ｔｋ）、特にウイルスｔｋ、例えばＶＺＶま たはＨＳＶのｔｋ、およびβ-ラクタマーゼとβ-グルクロニダーゼである。他の 酵素にはペニシリンＶアミダーゼ、ペニシリンＧアミダーゼ、およびシトシンデ アミナーゼが含まれる。 融合タンパク質は各リガンドに必要とされるような真核細胞（例えば昆虫細胞 、哺乳動物細胞）および非真核細胞（例えば細菌）の両方において発現される。 多くのリガンドはゴルジ装置と小胞体（ＥＲ）を通ってプロセシングされ、そこ でグリコシル化されるが、このことは結合活性にとって重要でありうる。こうし た場合には真核細胞に基づいた発現系が用いられる。融合タンパク質、特に非真 核生物酵素とリガンドの融合体の場合に、該リガンドがゴルジを通過する必要が あるときは該酵素もゴルジ／ＥＲを通過し、その結果同様にグリコシル化され得 る。これは酵素の非グリコシル化形態と比べて酵素活性の低下に至らせる。 本発明の好ましい態様では、酵素が１以上の（例えば２、３または４の）グリ コシル化部位で置換、欠失または挿入により改変されている。例えば、CPG2の一 次アミノ酸配列内には、このような共通モチーフが残基 Asn 222、Asn 264 およ びAsn 272 に３ヵ所存在する。CPG2を本発明で用いる場合はこれらの部位の１ヵ 所以上を改変することが好ましい。望ましくは、この改変はロイシンまたはグル タミンへの置換である。 一般に、例えば１、２、３、４、５またはそれ以上のアミノ酸の欠失または挿 入も可能ではあるが、少なくとも１〜11のグリコシル化部位でのアミノ酸置換か らなる酵素の改変が特に好ましいものである。あらゆる場合に、この改変は、酵 素が未改変の非グリコシル化酵素と実質的に同じ速度でプロドラッグを活性薬剤 に変換する能力を保持するようなものである。これに関して、「実質的に未変化 」とは、望ましくは１桁以内であり、好ましくは約１／２倍から２、５または１ ０倍までである。 特定の変化に加えて、酵素は、酵素活性が上で定義したように実質的に未変化 であるかぎり、末端切断、置換、欠失または挿入により改変され得る。例えば、 Ｎ末端および／またはＣ末端での小さな切断が、酵素をコードする核酸配列が本 明細書に記載する種々の他のシグナル配列に連結されているベクターを作製する のに必要とされる操作の結果として起こりうる。改変酵素の活性は、当技術分野 で知られた常法により作製できる適当なモデル系を用いる測定しうる。 本発明の別の態様では、リガンドまたはその断片もしくは誘導体をコードする 遺伝子に同じ読み枠で融合された、１以上のグリコシル化部位が置換、欠失また は挿入により改変された細菌性カルボキシペプチダーゼ遺伝子を含有するベクタ ーが提供される。リガンド遺伝子はカルボキシペプチダーゼ遺伝子の5'末端また は3'末端のいずれかに融合され、これら２つは直接融合されていても、１個以上 （例えば１０、２０または１００個まで）のアミノ酸をコードするリンカー配列 によって隔てられて融合されていてもよい。この融合体は宿主細胞内で融合構築 物を発現し得るプロモーターに機能的に連結される。カルボキシペプチダーゼは 望ましくは、前記１以上の置換、欠失または挿入を別にして、配列番号２のアミ ノ酸配列をもつCPG2である。さらなる置換、欠失または挿入を含むが実質的に未 変化のカルボキシペプチダーゼ活性を保持するカルボキシペプチダーゼ変異体も 本発明のこの態様の一部を構成する。このような変異体には、例えば上で述べた 末端切断された酵素が含まれる。 また、リガンドをコードする配列に改変を導入することもできる。融合タンパ ク質を安定化し、それをインターナリゼーションから防ぐために末端切断、挿入 、欠失および特異的点突然変異が必要になるかもしれない。また、リガンドと酵 素の二成分間に柔軟性を与えてそれぞれを活性にするため、リガンドと酵素の間 に 追加の「リンカー領域」が必要になるかもしれない。 本発明はまた、このような融合タンパク質をコードするＲＮＡまたはＤＮＡで ありうる核酸ならびに該核酸を含有するベクターを提供する。好ましくは核酸融 合体はカルボキシペプチダーゼの上記変異体をコードする該酵素に関する配列番 号２の配列（ただし、配列番号４におけるように１以上のグリコシル化部位を除 くように改変された場合を除く）と、該リガンドまたはその断片に関する配列番 号６の間である。ベクターは発現ベクターであってよく、そこでは前記核酸が融 合タンパク質発現用の宿主細胞と適合性のプロモーターに機能的に連結される。 かくして、本発明はまた、本発明の発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する 。 この宿主細胞は細菌（例：大腸菌）、昆虫、酵母または哺乳動物（例：ハムスタ ーまたはヒト）の細胞であり得る。 本発明の宿主細胞は上で定義したような融合タンパク質またはその断片の生産 方法において用いられ、この方法は、該酵素またはその断片が発現される条件下 で該宿主細胞を培養し、そして実質的に単離された形で該酵素またはその断片を 回収することを含んでなる。この目的のために、ニッケル親和性に基づく系と共 にポリヒスチジン残基を使用することができる。Ｃ．他のベクター成分 本発明による系では、融合体が該融合体を細胞から分泌させるシグナル配列に 連結され得る。これは通常、酵素を細胞表面の方に導く能力を保持する哺乳動物 のシグナル配列またはその誘導体である。いくつかのリガンドは天然のシグナル 配列をもっていて、それを使用してもよい。例えば、この目的にVEGFシグナル配 列を使用できる。融合体がこのようなシグナル配列をもつ場合、それを望ましい 適切な他のシグナル配列と置き換えることができる。適当なシグナル配列として は、膜貫通受容体チロシンキナーゼに見いだせるもの、例えばc-erbB2 (HER2/neu)シグナル配列または細胞表面に酵素を発現させる能力を保持するその 変異体が挙げられる。c-erbB2シグナル配列は、Coussensら（1985）Science230: 1132-1139を参照することにより得られる。 本明細書中の実施例に記載した実験を用いて、細胞表面に酵素を発現させる能 力について上記の変異体または他のシグナル配列を調べることができる。こうし た変異体は分子生物学の分野でそれ自体知られている標準的な技術、例えばシグ ナル配列を含有するベクターの位置指定突然変異誘発法を用いて作製できる。 さらに適当なシグナル配列としては、von Heijne（1985）J．Mol．Biol．184: 99-105 による論評中に見いだせるものが含まれる。 リガンドおよび酵素を、必要であれば、シグナル配列と共にコードするベクタ ーは当技術分野でそれ自体知られた組換えＤＮＡ技術を用いて作製できる。リガ ンド、酵素およびシグナル配列をコードする配列は、合成または組換え核酸配列 を一緒にスプライシングするか、または位置指定突然変異誘発法のような技術に より既存の配列を修飾することにより構築できる。標準的な組換えＤＮＡ技術に ついては、SambrookらによるMolecular Cloning (1989，Cold Spring Harbor)を 参照されたい。Ｄ．プロモーター 酵素は、ベクターが発現される予定の細胞内で発現され得るプロモーターを用 いてベクターにおいて発現されるだろう。プロモーターは酵素をコードする配列 およびその関連配列に機能的に連結される。適当な宿主細胞には上記のものが含 まれるが、このような宿主細胞からのプロモーターを用いることができる。かか る宿主細胞において機能しうるウイルスプロモーターも使用できる。Ｅ．プロドラッグ 本発明の系で用いるプロドラッグは酵素と適合するように、すなわち該酵素が プロドラッグを活性薬剤に変換できるように選択される。望ましくは、治療を受 ける患者に対するプロドラッグの毒性は、活性薬剤より少なくとも１桁低い毒性 であるだろう。好ましくは、活性薬剤は数桁、例えば２、３、４桁またはそれ以 上高い毒性であるだろう。適当なプロドラッグとしては、WO88/07378， WO89/10140，WO90/02729，WO91/03460，EP-A-540 263，WO94/02450，WO95/02420 またはWO95/03830（これらを参考としてここに組み入れる）に記載されるような ナイトロジェンマスタードプロドラッグおよび他の化合物が含まれる。Ｅ（i）- ナイトロジェンマスタードプロドラッグ ナイトロジェンマスタードプロドラッグは次式の化合物を含む。 M-Ar-CONH-R 式中、Arは置換されていてもよい芳香環系を表し、R-NHはα-アミノ酸 R-NH₂ま たはオリゴペプチドR-NH₂ の残基であって、少なくとも１個のカルボン酸基を含 み、そしてM はナイトロジェンマスタード基を表す。 アミノ酸残基 R-NH は好ましくはグルタミン酸の残基である。WO88/07378には、 酵素カルボキシペプチダーゼG2が上に示したタイプの化合物からグルタミン酸部 分を除去する能力があり、グルタミン酸部分の除去により活性ナイトロジェンマ スタード薬剤が生成されると記載されている。 かくして、本発明で用いるナイトロジェンマスタードプロドラッグは WO94/02450に記載の一般式Ｉのプロドラッグおよびその塩を含み、特に式（Ｉ） の化合物およびその生理的に許容される誘導体（塩を含む）を含む。 式中、R¹およびR²はそれぞれが独立して塩素、臭素、ヨウ素、OSO₂Me、OSO₂フェ ニル（ここでフェニルはC_1-4アルキル、ハロゲン、-CN またはNO₂から独立に選 択される１、２、３、４または５個の置換基で置換されていてもよい）であり、 R^1aおよびR^2aはそれぞれが独立して水素、C_1-4アルキルまたはC_1-4ハロアルキ ルを表し、 R³およびR⁴はそれぞれが独立して水素、C_1-4アルキルまたはC_1-4ハロアルキル を表し、 n は０〜４の整数であり、 各R⁵は独立して水素、１個の二重結合または１個の三重結合を含んでいてもよ いC_1-4アルキル、C_1-4アルコキシ、ハロゲン、シアノ、-NH₂、-CONR⁷R⁸（ここで R⁷およびR⁸は独立して水素、C_1-6アルキルまたはC_3-6シクロアルキルである）を 表し、または２個の隣接R⁵基が一緒になって次の基を表し、 a）１個の二重結合を含んでいてもよいC4アルキレン、 b）C3アルキレン、または c）-CH=CH-CH=CH-、-CH=CH-CH₂- もしくは -CH₂-CH=CH-（それぞれは１、２、 ３または４個の置換基で置換されていてもよく、前記置換基はそれぞれが独立し てC_1-4アルキル、C_1-4アルコキシ、ハロゲン、シアノおよびニトロよりなる群か ら選択される）、 X は基-C(O)-、-O-C(O)-、-NH-C(O)- または-CH₂-C(O)-であり、そして Z は基-CH₂-T-C(O)-OR⁶であり、ここで Tは-CH₂-、-O-、-S-、-(SO)-または-( SO₂)-であり、R⁶は水素、C_1-6アルキル、C_3-6シクロアルキル、アミノ、モノ- またはジ-C_1-6アルキルアミノ、モノ- またはジ-C_3-6シクロアルキルアミノであ る、ただしR⁶が水素であるときT は-CH₂- である。 ハロゲンにはフッ素、塩素、臭素およびヨウ素が含まれる。基R^1aおよびR^2aの 好適なものはメチルと水素であり、特に水素である。基R³およびR⁴の好適なもの は水素、メチルおよびトリフルオロメチルで、特に水素である。基R¹およびR²の 好適なものはＩ、Br、Cl、OSO₂MeおよびOSO₂フェニル（ここでフェニルは２位お よび／または４位が１または２個の置換基で置換されている）である。Ｉ、Clお よびOSO₂Meが特に好ましい。 n が１〜４の整数であるときの好適な基R⁵はフッ素、塩素、メチル-CONH₂およ びシアノである。好ましくは、n は０、１または２である。n が１または２であ るとき、R⁵は環の３位および／または５位にあって、フッ素であることが好まし い。基X は好ましくは-C(O)-、-O-C(O)-または-NH-C(O)- である。Z は好ましく は基-CH₂CH₂-COOHである。 好ましい特定の化合物として次のものが挙げられる。 N-4-[(2-クロロエチル)(2-メシロキシエチル)アミノ]ベンゾイル-L-グルタミ ン酸（以下「ＣＭＤＡ」という）およびその塩、 N-(4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]-3-フルオロフェニルカルバモイル)-L-グ ルタミン酸およびその塩、 N-(4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェニルカルバモイル)-L-グルタミン酸 およびその塩、 N-(4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェノキシカルボニル)-L-グルタミン酸 およびその塩、および N-(4-[ビス(2-ヨードエチル)アミノ]フェノキシカルボニル)-L-グルタミン酸 （以下「プロドラッグ２」という）およびその塩。 関心のある本発明化合物のうちの特定のサブグループは、R¹〜R⁴、R⁵、X また はW の上記特定のまたは包括的な定義のいずれか一つを単独で、またはR¹〜R⁴、 R⁵、X またはW の他のいずれかの特定のまたは包括的な定義と組み合わせて用い ることにより得ることができる。 その他のプロドラッグには式（II）の化合物およびその生理的に許容される誘 導体が含まれる。 式中、R¹、R²、R⁵、n およびZ は上記式（Ｉ）の化合物において定義したとおり であり、 m は０〜４の整数であり、 Z¹およびZ²はそれぞれが独立して-O- または-NH-であり、そして R⁹は水素、t-ブチルまたはアリルである。 R¹、R²、R⁵、n およびZ の好適なものは式（Ｉ）の化合物に関して先に定義し たとおりである。m の好ましい数は上記 nに関して定義したように０、１または ２である。R⁹は好ましくは水素であるが、特に合成中はアリルやt-ブチルのよう な基で保護される。 これらのプロドラッグはカルボキシペプチダーゼ酵素、例えばWO88/07378また はWO94/02450に記載されるようなCPG2により腫瘍部位で活性化され得る。 式（III）のナイトロジェンマスタードプロドラッグおよびその生理的に許容 される誘導体も本発明において使用することができる。 式中、R¹、R²、R⁵、Z¹、n およびm は式（II）の化合物において定義したとおり である。 これらのプロドラッグは例えばWO93/08288に記載されるようなニトロレダクタ ーゼ酵素により腫瘍部位で活性化され得る。 通常、酵素活性を確実なものとするため、ニコチン酸もしくはニコチンアミド のリボチドまたはリボシドのようなコファクター（補助因子）が必要とされ、プ ロドラッグと一緒に投与してもよい。 式（II）および（III）の化合物は、化学分野でそれ自体公知の反応および方 法を用いて製造することができ、また、英国特許出願第9501052.6 号およびその 優先権を主張して1996年１月19日に出願されたPCT/GB96/ を参考にするこ とで製造することができる。特に、次の方法が使用される。Ａ： Z¹が-O-である式（II）の化合物 （i）Z¹が-O-である式（II）の化合物を製造するには、式（IV）のナイトロジ ェンマスタード： 〔式中、R¹、R²、R⁵およびn は先に定義したとおりであり、Z⁴は-O-である〕を 式（Ｖ）のリンカー： 〔式中、R⁵、m、Z²、R⁹およびZ³は先に定義したとおりであり、Q は水素または 離脱基である〕と反応させる。この反応は塩基（例えばＤＭＦおよびトリエチル アミン）の存在下に非プロトン性溶媒中で行うことができる。 好ましい離脱基 Qとしては、スクシンイミジル基、4-ニトロフェニルカーボネ ート基、ペンタフルオロフェニルカーボネート基、およびテトラクロロエチル基 CH(Cl)CCl₃などがある。 （ii）式（IV）の化合物は基R⁵ _(n)（上記定義どおり）で置換されていてもよ い4-ニトロフェノールから出発して製造される。フェノール基を（出発物質をア ダマンタニル-フルオロホルメートおよびトリエチルアミンとＴＨＦ中室温で反 応させることにより）アダマンタニルオキシカルボニル誘導体として保護する。 保護した4-ニトロフェニルカーボネートを、室温でギ酸アンモニウムと10% Pd/C 触媒を用いてエタノール中で水素転移により対応するアミンに還元する。次に、 こ のアミンをAcOH中20℃でエチレンオキシドによりヒドロキシエチル化した後、所 望のナイトロジェンマスタードへと反応させる。適当な条件はEP-A-433360 また はEP-A-490970 に記載されている。化合物をカラムクロマトグラフィーで精製す る。アダマンチル基を除去するための脱保護はトリフルオロ酢酸中で行う。 （iii）別法として、式（IV）のナイトロジェンマスタードをトリエチルアミ ンおよび非プロトン性溶媒中のホスゲンまたはトリホスゲンで処理してクロロホ ルメートとして活性化し、続いて式（VI）の化合物： 〔式中、R⁵、ｍ、Z²、R⁹およびZ¹は先に定義したとおりである〕とカップリング させることができる。これはＴＨＦまたは他の非プロトン性溶媒中で塩基（例え ばトリエチルアミンまたはピリジン）の存在下に行われる。 （iv）Z₁が-0-である式（II）の化合物のさらに別の合成経路は、基R⁵ _(n)（上 記定義どおり）で置換されていてもよい4-ニトロフェノールと式（Ｖ）の化合物 とを直接カップリングさせるか、または前記の置換されていてもよい4-ニトロフ ェノール化合物クロロホルメートと式（Ｖ）の化合物とを反応させ、続いてそれ ぞれの場合に、ニトロ基を、アミンを経て、マスタード基に変換するための上記 反応を行うことを含む。Ｂ： Z¹が-NH-である式（II）の化合物 （i）Z¹が-NH-である式（II）の化合物を製造するには、非プロトン性溶媒中 で塩基の存在下にZ⁴が-NH-である式（IV）の化合物を式（Ｖ）のリンカーと反応 させる。Z⁴が-NH-である式（IV）の化合物は、基R⁵ _(n)（上記定義どおり）で置 換されていてもよい1-ハロ-4-ニトロベンジル化合物から製造できる。これを加 熱 しながらジエタノールアミンと反応させることで対応する1-ビスーヒドロキシエ チルアミノ-4-ニトロ−ベンジル化合物に変換する。得られた生成物をカラムク ロマトグラフィーで精製する。対応する4-ニトロナイトロジェンマスタードは、 例えばピリジン中の塩化メシルを用いてメシル化することにより製造でき、その 後、必要ならば、他のハロマスタード（例：ブロモまたはヨードマスタード）へ と反応させることができる。4-ニトロ基は20℃でギ酸アンモニウムと10% Pd/C触 媒を用いてエタノール中で水素転移により還元することができる。 （ii）別法として、上記の1-ビスーヒドロキシエチルアミノ-4-ニトロベンジ ル化合物を20℃でギ酸アンモニウムと10% Pd/C触媒を用いてエタノール中で還元 して、対応するフェニレンージアミノ誘導体を得ることができる。この誘導体は 上の段落で記載したように、例えば最初に塩化メシルと反応させることにより、 対応する4-アミノナイトロジェンマスタードに変換し得る。Ｃ： 式（III）の化合物 （i）式（III）の化合物は、上記セクションＡ（i）で記載したナイトロジェ ンマスタードフェノール化合物を、基R⁵ _(n)（上記定義どおり）で置換されてい てもよい4-ニトロベンジルクロロホルメートと、トリエチルアミンの存在下また は不在下に20℃でカップリングさせることにより得られる。 （ii）別法として、上記セクションＢ（ii）で記載したようなアニリンナイト ロジェンマスタードを、上記セクションＣ（i）で記載したようなクロロホルメ ートと共に用いることができる。Ｄ： Z²が-NH-である式（Ｖ）の化合物 （i）Z²が-NH-である式（Ｖ）の化合物は、基R_5(n)（上記定義どおり）で置換さ れていてもよい4-ニトロベンジルアルコールから製造することができる。ヒドロ キシル官能基はピラニル- またはt-ブチル-ジメチルシリル（TBDMSi）-エーテル として保護されるが、それぞれ非プロトン性溶媒中で3,4-2H-ジヒドロピランお よびピリジニウム-p-トルエンスルホネート（PPTS）により、またはジメチルホ ルムアミド（DMAC）中で塩化TBDMSiおよびイミダゾールにより20℃で処理して保 護する。このようにして得られた中間体を、20℃でギ酸アンモニウムと10% Pd/C 触媒を用いてエタノール中で水素転移により対応するアミンに還元する。このア ミ ンを式（VII）のグルタミルエステル中間体： 〔式中、R⁵、m 、R⁹およびZ¹は先に定義したとおりであり、Z²は-NH-であり、Pr はピラニル- またはt-ブチル-ジメチルシリル（TBDMSi）-エーテル保護基である 〕に変換する。これを行うには、トルエン中60℃で該アミンをトリホスゲンとト リエチルアミンで処理して対応するイソシアネートを得、これを式R⁹-C(0)-CH(N H₂)-Z¹（R⁹およびZ は上記定義どおり）のグルタメート誘導体で処理する。別法 として、トルエン中-78℃でトリホスゲンとトリエチルアミンで処理することに より対応グルタメートから得られた対応グルタミル-イソシアネートを、ワンポ ット法で該アミンと反応させてもよい。 （ii）式（VII）の化合物を脱保護するには、温和な酸性媒体（AcOH、THF お よびH₂OまたはPPTS、EtOH、55℃）で処理してTBDMSiまたはピラニル基を除去す る。これによりPrが水素である式（VII）の化合物が得られる。Qが離脱基である 式（Ｖ）の化合物は、当技術分野で公知の一般的反応を用いて製造することがで きる。 （iii）例えばQ がスクシンイミジル基である場合は、Prが水素である式（VII ）の化合物を、アセトニトリル中でジスクシンイミジル-カーボネートとトリエ チルアミンで処理する。4-ニトロフェニルカーボネート基が所望であれば、THF 中での4-ニトロフェニルクロロホルメートとトリエチルアミンによる処理が用い られる。ペンタフルオロフェニルカーボネートは、ペンタフルオロフェノールの in situ ホスゲン化と、その後のPrが水素である式（VII）のリンカーへのカッ プリングにより付加される。Ｅ： Z²が-O-である式（Ｖ）の化合物 （i）カルバミル結合をもつリンカーの出発物質は、非置換のまたは（上記定 義どおりの基R⁵ _(n)で）置換された4-ヒドロキシ-ベンジルアルコールである。こ れらのタイプのリンカーは1,4-脱離を受けるために芳香核上に特別の電子求引性 基を必要とするかもしれない。4-ヒドロキシ基は、THF中20℃で出発物質をアセ チル-v-トリアゾロ-[4,5-b]ピリジン，1N NaOHで処理してアセテートとして保護 する。アセテートのアルコール官能基は上記セクションＤに記載した手法により ピラニル- またはTBDMSi-エーテルとしてさらに保護する。その後、アセテート 官能基をNaHCO₃水性MeOH中20℃で脱保護して4-ヒドロキシ基を復帰させる。得ら れたフェノール化合物を、ワンポット法で上記セクションＤ（i）に記載したよ うに保護グルタミル-イソシアネートと反応させる。こうして、Z²が-O-で、Prが ピラニル- またはt-ブチル-ジメチルシリル（TBDMSi）-エーテル保護基である式 （VII）の化合物が得られる。 （ii）この化合物の脱保護によりPrが水素である式（VII）の化合物が得られ る。これは上記セクションＤ（ii）および（iii）に記載した方法と類似した方 法により式（Ｖ）の化合物に変換することができる。Ｆ： 式（IV）の化合物の別の合成法 Q が水素、フルオロ、クロロ、ブロモまたは-O-（N-スクシンイミド）である 式（IV）の化合物はまた、WO95/02420またはWO95/03830を参考にすることで得ら れる。Ｅ（ii）-他のプロドラッグ プロドラッグとして使用できる他の化合物には細胞毒化合物のp-ニトロベンジ ルオキシカルボニル誘導体が含まれる。この種の化合物はニトロレダクターゼ酵 素と共に使用することができる。ニトロレダクターゼ酵素はプロドラッグのニト ロ基をヒドロキシルアミノまたはアミノ基に変換し、その結果p-ニトロベンジル オキシカルボニル部分が活性化されるようになり、その後自己犠牲的となる。こ れにより活性薬剤が放出される。こうした化合物には次式の化合物が含まれる。 WO93/08288のニトロレダクターゼ酵素はNADHやNADPHのような補助因子を必要 とし、これは場合により本発明の系において追加成分として供給することができ る。 上記文献に記載された他の化合物の例として、アクチノマイシンＤ、ドキソル ビシン、ダウノマイシンおよびマイトマイシンＣのプロドラッグが挙げられる。 前記文献のプロドラッグはニトロレダクターゼまたはCPG2のいずれかで活性薬剤 に変換されるが、他の酵素、例えばβ-ラクタマーゼやグルクロニダーゼにより 開裂できる保護基を含むように修飾することも可能である。 本発明において使用するのに適した追加のプロドラッグには、一般式 FTLi-(P RT)_m'の化合物またはその塩が含まれ、ここでFTLiはファルネシルトランスフェ ラーゼ阻害剤化合物のようなras阻害剤であり、PRTは酵素作用によりras阻害剤 から開裂され得るm'個の保護基を表し、そしてm'は１〜５の整数である。この種 の化合物はWO95/03830に記載されている。 本発明の系で使用するのに適した他のプロドラッグには、糖またはβ-ラクタ ム誘導体で誘導体化されるものがある。例えば、上記のタイプの活性薬剤に結合 しうる適当なリンカーは次式のものであり、 式中、R'は水素またはアセチルであり、Y¹はフェニル、ベンジルまたはトルリル のようなアリールである。これらは上記の他のプロドラッグに類似した方法で製 造することができる。 別のグループのプロドラッグは一般式 PTKi-PRT_m'のチルホスチン （tyrphostin）化合物であり、ここでPTKiはPTK（プロテインチロシンキナーゼ ）阻害活性をもつ化合物であり、PRT は酵素作用によりPTK阻害剤から開裂され 得る保護基であり、m'は１〜５の整数である。 上記のような適当なチルホスチン類は、参考としてここに組み入れられるWO95 /02420、Gazitら 1989 および1991（同書）に記載の方法またはそれらに類似し た方法により得ることができる。Ｅ（iii）- 誘導体 プロドラッグの生理的に許容される誘導体としては、塩、アミド、エステル、 エステルの塩などがある。エステルはカルボン酸のエステルを含み、該エステル 基の非カルボニル部分は直鎖または分岐鎖C_1-6アルキル（例：メチル、n-プロピ ル、n-ブチルまたはt-ブチル）、C_3-6環状アルキル（例：シクロヘキシル）から 選択される。塩としては、例えば適当な塩基から誘導された、生理的に許容され る塩基塩、例えばアルカリ金属塩（例：ナトリウム塩）、アルカリ土類金属塩（ 例：マグネシウム塩）、アンモニウム塩およびNR"₄塩（ここでR"はC_1-4アルキル ）がある。その他の塩には、塩酸塩や酢酸塩を含めた酸付加塩がある。アミドに は非置換およびモノ- またはジ- 置換誘導体が含まれる。Ｆ．本発明の用途 本発明の系はヒトまたは動物の治療方法において使用することができる。この ような治療には、治療を必要とする患者に本発明の系を投与することを含んでな る新生物細胞の増殖を治療する方法が含まれる。また、ヒトまたは動物体への細 菌、ウイルスまたは寄生生物の感染により病気にかかった細胞を治療するために 本発明を使用することも可能である。 一つの適当な投与経路は無菌溶液中の粒子を注入することによるものである。 プロドラッグを単独で投与することが可能であるが、それを医薬組成物として投 与することが好ましい。医薬組成物はプロドラッグと１種以上の許容される担体 とを、場合により他の治療用成分と共に、含有する。１種以上の担体は、組成物 の他の成分と適合しかつその賦形剤（例えばリポソーム）に有害でないという意 味で「許容される」ものでなければならない。適当なリポソームとして、例えば 、正に荷電した脂質（N[1-(2,3-ジオレイロキシ)プロピル]-N,N,N-トリエチルア ンモニウム(DOTMA))を含むもの、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン （DOPE）を含むもの、および3β[N-(n',n'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイ ル]コレステロール（DC-Chol）を含むものがある。 非経口または筋肉内投与に適する組成物には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、殺 菌性抗生物質および該組成物をレシピエントの血液と等張にするための溶質を含 みうる水性および非水性の無菌注射溶液、懸濁剤および増粘剤を含みうる水性お よび非水性の無菌懸濁液、化合物が血液成分または１以上の器官をターゲッティ ングするようにデザインされたリポソームまたは他の微粒子系などが含まれる。 本組成物は１回量または複数回量容器（例えば密閉アンプルおよびバイアル）で 提供することができ、また、使用直前に注射用担体の無菌液体（例えば水）を添 加するだけでよい凍結乾燥状態で保存することができる。注射溶液および懸濁液 はこれまで記載された種類の無菌粉末、顆粒および錠剤からその場で調製するこ とができる。 上記の成分のほかに、本組成物はその組成物のタイプを考慮して当業界で慣用 の他の剤を含んでいてもよいことを理解すべきである。可能性のある組成物のう ち、発熱物質を含まない無菌の水性および非水性溶液が好適である。 その用量は継続的に、例えば毎日、１週もしくは１ヵ月おきに、あるいは患者 の必要に応じて、投与することができる。好ましい投与経路は経口送達および注 射、典型的には非経口もしくは筋肉内注射または腫瘍内注射である。 本発明の系を用いる場合、通常、プロドラッグはリガンド-酵素の投与後に投 与されるだろう。典型的には、タンパク質を患者に投与し、次いで該タンパク質 の取込みをモニターする。例えば、標的組織の生検サンプルの回収および分析に より、または追跡標識したタンパク質リガンド-酵素を注入することによりモニ ターする。 正確な投薬レジメは個々の患者の個々の医師によって決定することがもちろん 必要であり、続いて、これはプロドラッグおよびプロドラッグから放出される細 胞毒の性質により調整されるが、いくつかの一般的なガイドラインを提示するこ とができる。このタイプの化学療法は通常プロドラッグと修飾タンパク質の両方 の非経口投与を必要とし、多くの場合、静脈内経路による投与が最も実際的であ ることがわかる。グリア芽細胞腫の場合、その経路はしばしば腫瘍内である。プ ロドラッグの典型的な投与量範囲は一般に患者の体重１kgあたり約１〜150mg/日 の範囲であり、１回でまたは複数回に分けて投与することができる。好ましくは 、投与量範囲は患者の体重１kgあたり約10〜75mg/日、例えば約10〜40mg/日の範 囲である。患者の状態や他の要因に応じて医師の裁量で他の投与量を用いてもよ い。 本発明の系を用いて治療しうる腫瘍にはLIDEPT系で治療できるまたは治療され るあらゆる腫瘍が含まれ、したがってある特定のタイプの腫瘍に限定されない。 特に適する腫瘍のタイプとしては、乳癌、結腸直腸および卵巣の腫瘍、ならびに 膵臓癌、メラノーマ、グリア芽細胞腫、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、筋 肉および前立腺の腫瘍が挙げられる。VEGFを用いるLIDEPT系の場合、活発に増殖 している血管系を含むこれらおよび他のタイプの固形腫瘍はすべてが治療の候補 となる。 本発明の系はまた、感染症および、例えば、細胞集団の根絶を必要とする他の 症状を治療するためにも用いられる。 腫瘍の治療が関係している場合、その治療には腫瘍が患者に及ぼす影響を緩和 するためのあらゆる方策が医師によってとられることが理解されよう。したがっ て、腫瘍の完全な寛解が望ましいゴールであるが、有効な治療には腫瘍の部分的 寛解および転移を含む腫瘍の増殖速度のスローダウンを達成しうるあらゆる方策 も含まれる。このような方策は生命を長引かせかつ／また生活の質を向上させ、 そして該疾病の症状を軽減するうえで有効でありうる。 以下の実施例は本発明を例示するものである。実施例１ 本発明を実証するために、CPG2とVEGFとの融合タンパク質を調製した。この融 合タンパク質は、哺乳動物細胞の外側での発現を指令するために、c-ErbB2（シ グナルペプチド）の部分と、グリコシル化をブロックする特定の変異を含む CPG2（N222，264および272>Q，PCT/GB95/01782に記載）と、VEGFの間で形成され る。この融合タンパク質の構造は、c-ErbB2（アミノ酸1-27）: Gly Ser: CPG2（ アミノ酸23-415）: Glu Phe Gly Gly Gly Gly Gly Thr Ala: VEGF 165（アミノ 酸28-191）である。 CPG2のＤＮＡおよびタンパク質配列をそれぞれ配列番号１および２に示す。上 に示したような変更のあるグリコシル化部位を除いてこの配列が使用された。 VEGFの配列はConnら，Proc．Natl．Acad．Sci．（1990）87: 2628に見いだせる 。 この融合体を哺乳動物発現ベクターpEF Plink2（Maraisら，（1995）EMBOJ14 ，3136-3145）にクローニングし、COS-7細胞にトランスフェクトした。融合タン パク質の発現を評価するために、トランスフェクト細胞からの培地を免疫沈降、 CPG2酵素活性およびヘパリン結合活性により分析した。 （1）免疫沈降 組織培養培地１mlをCPG2特異的抗血清で免疫沈降させ、該タンパク質をビーズ から溶出した。溶出されたタンパク質を免疫タンパク質ブロットで分析したとこ ろ、対照のトランスフェクト細胞には存在しない見かけ分子量60〜64,000の融合 タンパク質を含むことが示された。 （2）CPG2酵素活性についても基質としてメトトレキセートを用いて上清を分 析したところ、対照のトランスフェクションには含まれないCPG2活性を含むこと がわかった。 （3）ヘパリン結合 組織培養培地１mlをヘパリン-アガロースと混合し、ヘパリン-アガロースビ ーズを回収および洗浄し、結合されたタンパク質を溶出し、CPG2抗血清を用いて 免疫タンパク質ブロットで分析した。結果は、融合遺伝子でトランスフェクトし た細胞から得られた上清がCPG2-VEGF融合タンパク質を含み、これはヘパリンへ の結合能をもつが、CPG2とVEGFアミノ酸28-136との融合体はヘパリンに結合しな いことを示す。 これらのデータは以下のことを実証する。 （1）この融合タンパク質は哺乳動物細胞により合成され、分泌される。 （2）この融合タンパク質はCPG2活性を含む。 （3）この融合タンパク質は組織培養培地中で安定である。 （4）この融合タンパク質は可溶性である。 （5）この融合タンパク質はVEGFを介してヘパリンに結合する能力がある。実施例２ １．序 VEGFタンパク質は小胞体（ＥＲ）とゴルジ装置を経て細胞から分泌されるが、 その間にそれらはタンパク質分解的にプロセシングされ、グリコシル化されて成 熟タンパク質となる(Eur J．Biochem，211，19，1993)。この遺伝子には異なる イソ型のタンパク質をコードする少なくとも４つのスプライス変異型が存在する 。これらの遺伝子がコードするタンパク質は、成熟タンパク質の最初のアミノ酸 をアミノ酸番号１と記して、成熟タンパク質中に存在するアミノ酸の数によって 命名される。VEGF 165はVEGFのイソ型の一つであり、成熟タンパク質中の165個 のアミノ酸からなり、特異的受容体相互作用ドメインとヘパリン結合ドメインを 含む。これに対して、VEGF 121は121個のアミノ酸からなるタンパク質のイソ型 で、特異的受容体相互作用ドメインを含むがヘパリン結合ドメインは含まない (Science，253，989，1992; Cell，72，835，1993)。目標は、腫瘍部位で細胞毒 を生成するプロドラッグ（後で投与される）を活性化するためのVEGF-酵素融合 タンパク質を製造することである。 細菌の酵素であるカルボキシペプチダーゼG2（CPG2）は細菌細胞から分泌され るが、通常は周辺腔に存在している。CPG2はメトトレキセート（MTX）の分解を 触媒し、また、マスタードプロドラッグを開裂することによりそれを活性化する ためにも使用される(J．Med．Chem.，33，677，1990)。比較的無毒であるこうし たプロドラッグは活性な２官能性アルキル化剤へとCPG2により開裂され、かかる アルキル化剤は哺乳動物細胞にとってきわめて有毒である。CPG2からのシグナル ペプチドが哺乳動物のシグナルペプチドで置き換えられると、CPG2は哺乳動物細 胞で発現されて、該タンパク質は分泌経路に入る。しかし、CPG2のこの形態は３ ヵ所で不適切にグリコシル化されてしまい、不活性な酵素をもたらす。この哺乳 動物発現形態のCPG2の活性は、グリコシル化モチーフのコアにある３個のAsn残 基をGln残基に突然変異させると、一部回復させることができる。これは細菌酵 素の活性の約10％を保持するタンパク質をもたらす。 本発明の目的は、CPG2を用いてプロドラッグ（マスタードプロドラッグを含む ）を開裂し活性化する腫瘍部位にCPG2をターゲッティングすることである。 CPG2が腫瘍にターゲッティングされると、プロドラッグの活性化がその場所での み起こるだろう。 ２．用いるCPG2およびVEGF遺伝子ならびにタンパク質の説明 タンパク質コンジュゲートの可能なタイプを考慮するにあたって、本発明は、 産生される組換えタンパク質が既製の融合タンパク質として産生されるように連 結された遺伝子から産生されるタンパク質を使用する。VEGFは通常小胞体とゴル ジ装置を経て細胞から分泌されるので、その目標は、VEGF成分がその成熟体で発 現されるように、融合タンパク質がこの分泌経路を通過すべきであるということ であった。しかしながら、CPG2が真核細胞内でこの分泌経路を通ってプロセシン グされると、それは不適切な不活性化グリコシル化を受けやすい。それゆえ、VE GFとグリコシル化され得ないCPG2の形態との融合体の構築が行われた。VEGF成分 がCPG2のアミノ末端（Ｎ末端）またはカルボキシ末端（Ｃ末端）に連結された融 合体の実施可能性が試験された。さらに、VEGFのヘパリン結合ドメインの有無が 融合タンパク質の活性に影響を及ぼすその能力について検討された。したがって 、これらのパラメーターの試験を可能にする一連の融合タンパク質が、真核細胞 において発現させるために構築された。 2.1 CPG2 遺伝子およびタンパク質 用いるCPG2遺伝子は哺乳動物細胞発現用に修飾した。CPG2シグナルペプチドの コドンをヒトc-erbB2タンパク質由来のシグナルペプチドと置き換えてCPG2タン パク質が効率よく分泌されるようにした。c-erbB2シグナル配列に関しては、Cou ssensら（1985）Science 230: 1132-1139を参照のこと。さらに、グリコシル化 モチーフのコアにある３個のAsn残基をGln残基に突然変異させてグリコシル化を 防止し、また、この遺伝子の3'末端にポリヒスチジン・タグを付加して、融合タ ンパク質をニッケル-NTAアフィニティークロマトグラフィーで精製できるように した。この構築物をCPH₆と命名し、図１Ａに模式図で示す。哺乳動物細胞での発 現のために、この構築物の遺伝子を哺乳動物発現べクタ−pEFPlink 2にクローニ ングした。このべクターを選択した理由は、それが哺乳動物細胞内で外来遺 伝子の発現を指令するために延長因子１α遺伝子由来のプロモーターを使用して おり、さまざまな細胞型において非常に活性であることがわかっているからであ る。CPH₆遺伝子により発現されると予想されるタンパク質の構造を図１Ａに模式 図で示してあり、完全なＤＮＡ配列およびタンパク質配列を配列番号３および４ に示す。 2.2 VEGF 遺伝子およびタンパク質 プラスミドpVEGF165中のVEGF遺伝子（Bluescript中）はVEGFシグナルペプチド および成熟タンパク質が165個のアミノ酸からなるスプライス変異体をコードし ている。これは成熟タンパク質の残基１−121内に含まれるVEGFの特異的受容体 結合ドメインをコードしている。VEGF165はまたヘパリン結合ドメインもコード しており、該ドメインは成熟タンパク質の122−165までのアミノ酸の領域を必要 とする。この遺伝子には、成熟タンパク質（VEGF165）の残基75に１つのグリコ シル化モチーフが存在する(JBC，266，11947，1991)。VEGF遺伝子が発現すると 予想されるタンパク質の構造を図１Ｂに模式図で示してあり、完全なＤＮＡ配列 およびタンパク質配列を配列番号５および６に示す。 ３．融合タンパク質の生成 LIDEPT法で試験すべき種々の遺伝子を形成するために、CPH₆遺伝子とVEGF165 遺伝子を使用した。融合体を作製するための突然変異はＰＣＲ指令突然変異誘発 法（規定の融合体を正確な位置で形成させるという精確性に利点がある）により 生起させた。用いるＰＣＲ技術は標準的なもので、基本的な書物に記載されてい るが、このようなプロトコールの一例を以下に示す。 突然変異誘発プライマー、ヌクレオチドおよび適当な緩衝液の存在下で、専売 特許の熱循環装置内でサーマルサイクルを通してＤＮＡサンプルを加熱して、適 当な受容ベクターにクローニングし得るＤＮＡサンプルを生成させた。典型的な 加熱サイクルは下記のとおりであり、酵素Taqポリメラーゼを用いてＤＮＡを生 成させた。 95℃で60秒 55℃で30秒 72℃で30秒 一般的には25サイクルを行った。 これらの反応から得られた生成物を受容ベクターにクローニングし、ジデオキ シ配列決定法により分析して生成した断片の完全性を確認した。 VEGFタンパク質とCPG2タンパク質を両方向で互いに融合させた融合タンパク質 およびVEGF成分がヘパリン結合ドメインを含むまたは含まない融合タンパク質を 試験した。４種類の融合体、すなわち、CPG2がヘパリン結合ドメインを含むまた は含まないVEGFのＮ末端またはＣ末端に融合されたものを作製した。これらの構 築物は図１に模式図で示してあり、以下に詳細に説明する。 3.1 V₁₆₁-CPH₆ このクローンにおいて、推定上のタンパク質産物は、CPG2成分が成熟VEGFのア ミノ酸１−161のＣ末端に融合された融合タンパク質であるだろう。VEGF成分は この融合体のＮ末端に位置づけられるので、それ自体のシグナルペプチドが該タ ンパク質を細胞の分泌経路に導くだろう。c-erbB2シグナルペプチドはCPG2遺伝 子から除去された。したがって、この融合体はVEGFの受容体結合ドメインとヘパ リン結合ドメインの両方を含む。また、これは精製目的のためのＣ末端ポリヒス チジン・タグをも含有する。 この融合体のクロ−ニングは次のように行った。ＰＣＲをオリゴヌクレオチド プライマ−１および２（表１）およびプラスミドpVEGF165と共に用いて、VEGFオ ープンリーディングフレーム内に、この遺伝子内の内部Nco1部位を破壊するサイ レント変異を導入した。これを行ったのは、その後の段階でのクローニングを容 易にするためであった。次に、改変VEGF遺伝子と共にプライマー３および４（表 １）を用いてＰＣＲ断片を作製し、制限エンドヌクレアーゼNco1およびBamHIで 消化し、得られた断片をプラスミドpEFCPH₆中のこれらの部位にクローニングし た。この戦略により、VEGFシグナルペプチドと、VEGFアミノ酸１−161と、これ に融合されたCPG2アミノ酸23−415をコードし、さらに精製目的のためにＣ末端 にポリヒスチジン・タグを含有する遺伝子が得られる。この構築物はV₁₆₁CPH₆と 命名され、このタンパク質を図１Ｃに模式図で示す。V₁₆₁CPH₆遺伝子の配列およ びそれがコードすると予想されるタンパク質の配列を配列番号７および８に示す 。 3.2 V₁₁₅-CPH₆ このクローンでは、CPG2がVEGFのＣ末端に融合される。このクローンのために 用いたVEGFの部分は成熟タンパク質の最初の115アミノ酸であり、したがってヘ パリン結合ドメインを含まない。V₁₆₁CPH₆と同様に、VEGFのシグナルペプチドが この融合タンパク質の分泌を指令し、それゆえc-erbB2シグナルペプチドは除去 された。 この融合タンパク質をクローニングするにあたって、その後の段階でのクロー ニングを容易にするために、VEGF内の内部Nco1部位を、第3.1節に記載したよう にＰＣＲおよびオリゴヌクレオチドプライマー１および２（表１）を用いて破壊 した。ＰＣＲをオリゴヌクレオチド３および５（表１）および改変VEGF遺伝子を 用いて行い、生成物を制限エンドヌクレアーゼNcolおよびBamHIで消化した。得 られた断片をプラスミドpEFCPH₆中のこれらの部位にクローニングした。この戦 略により、VEGF由来のシグナルペプチドと、CPG2のアミノ酸22−415 に融合され た成熟タンパク質の最初の115アミノ酸と、ポリヒスチジン・タグをコードする 遺伝子が得られる。この構築物はV₁₆₁CPH₆と命名され、このタンパク質を図１Ｄ に模式図で示す。V₁₆₁CPH₆遺伝子の配列およびそれがコードすると予想されるタ ンパク質の配列を配列番号９および10に示す。 3.3 CPV₁₆₅ このクローンでは、CPG2がVEGFのＮ末端に融合される。この配置においては、 哺乳動物細胞からタンパク質を分泌させるためにc-erbB2シグナルペプチドが用 いられ、こうしてVEGFシグナルペプチドが除去された。この融合体はVEGF受容体 結合ドメインとヘパリン結合ドメインの両方を含む。しかし、この遺伝子のクロ ーニングでは、ポリヒスチジン・タグがCPG2のＣ末端から失われた。 この融合体のクローニングは次のように行った。オリゴヌクレオチド６および ７（表１）を用いる標準的なクローニング技術により、CPH₆遺伝子の3'末端のポ リヒスチジン・タグを６アミノ酸のペプチドスペーサーと置き換え、また、その 位置にユニークなKpnI部位を作製した。このリンカーの構造は（Gly）5Thrであ り、２つのタンパク質成分間の領域に柔軟性を与えるようにデザインされた。 pVEGF165と共にオリゴヌクレオチド８および９（表１）を用いてＰＣＲを行い、 改変されたVEGF遺伝子を作製した。このＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼKp nIおよびXbaIで消化し、pEFCPH₆の新たに作製したKpnI部位とXbaI部位にクロー ニングした。この配置は、遺伝子の構造が成熟VEGFのコドン1−165にスペーサー を介して融合されたCPG2(Q)3(アミノ酸22−415)に融合されたc-erbB2由来のシグ ナルペプチド(アミノ酸１-27-CHECK)からなる遺伝子をもたらす。この構築物はC PV₁₆₅と命名され、このタンパク質を図１Ｅに模式図で示す。CPV₁₆₅遺伝子の配 列およびそれがコードすると予想されるタンパク質の配列を配列番号11および12 に示す。 3.4 CPV₁₀₉ CPV₁₆₅のクローニングの間に、生成されたクローンの一つが成熟VEGF配列のコ ドン110に突然変異を含んでいたことに気づいた。これはAGA（Arg）コドンをTGA （停止）コドンに変換し、その結果その位置でのVEGFのトランケーション（末端 切断）をもたらす。この突然変異は偶然にもVEGFのヘパリン結合ドメインを除去 するので、我々は、CPG2のＣ末端にVEGFを融合させた（ただし、VEGFのヘパリン 結合ドメインを欠く）結果をさらに評価できるように、この融合タンパク質を特 徴づけることを選択した。この構築物はCPV₁₀₉と命名され、このタンパク質を図 １Ｆに模式図で示す。CPV₁₀₉遺伝子の配列およびそれがコードすると予想される タンパク質の配列を配列番号13および14に示す。図１：CPG2、VEGFおよび融合タンパク質の模式図 それぞれのタンパク質は、融合タンパク質の異なる部分を表すために様々な陰 影をつけた棒線として表される。タンパク質は全て、左側にアミノ末端が、右側 にカルボキシ末端が示される（それぞれＮおよびＣ）。タンパク質同士の融合部 はオープンボックスで表される。CPV₁₆₅、CPV₁₀₉、CPV₁₆₅H₆およびCPV₁₀₉H₆の場 合、CPG2成分とVEGF成分の間のペプチドリンカーは点描ボックス（Ｌ）で表され る。２つの形態のシグナルペプチドがタンパク質を分泌経路に導くために使用さ れた。一方は哺乳動物チロシンキナーゼ受容体c-erbB2由来のシグナルペプチド （SP_erb）であり、他方はVEGF遺伝子由来のシグナルペプチド（SP_v）である。か っこ内の数字は各融合体のCPG2またはVEGFモチーフ中に存在するアミノ酸を示す 。VEGFがヘパリン結合のために必要とするアミノ酸の位置は斜線ボックスで示さ れる。VEGF断片のグリコシル化位置は●で示される。グリコシル化を防止するた めに突然変異させねばならないCPG2の３つの部位は○で示される。融合体がポリ ヒスチジン・タグを発現する場合、それは（H₆）で示される。表示したクローン は、Ａ．CPH₆；Ｂ．VEGF₁₆₅ ；Ｃ．V₁₆₁CPH₆；Ｄ．V₁₁₅CPH₆；Ｅ．CPV₁₆₅；Ｆ． CPV₁₀₉；Ｇ．CPV₁₆₁H₆；Ｈ．CPV₁₀₉H₆である。図２：CPH₆および融合タンパク質の発現およびヘパリン結合性 表２に記載したようなトランスフェクトCOS細胞から得られた組織培養上清を ウエスタンブロット分析およびヘパリン結合能分析にかけた。 Ａ．免疫沈降および免疫タンパク質ブロット分析 各サンプルにつき、関連発現ベクターでトランスフェクトした細胞から得られ た馴らし培地 500μLをトリトン X-100で0.1% v/vに調製し、次にプロテインG- セファロースビーズ（Pharmacia）に固定した、CPG2に特異的なウサギポリクロ ーナル抗血清(Maraisら，1996)約５μLと共にインキュベートした。室温で６時 間複合体を形成させ、その後ビーズを0.1% トリトン X-100を含有するPBS 500μ Lで３回洗った。結合したタンパク質をビーズから溶出し、8% SDSゲル上で分離 し、標準的な手法によりCPG2特異的抗血清を用いて免疫タンパク質ブロッティン グにより分析した。各サンプルにおいて発現されたタンパク質は該当するレーン の上に示され、レーン１、pEFCPH₆ ；レーン２、pEFVEGF₁₆₅；レーン３、pEFV_{16 1} CPH₆ ；レーン４、pEFV₁₁₅CPH₆ ；レーン５、pEFCPV₁₀₉ ；レーン６、pEFCPV_{16 5} ；レーン７、対照（pEFPlink.2）である。タンパク質マーカー（×10^-3）の泳 動位置は図面の右側に示され、各遺伝子の主要産物の泳動位置は図面の左側に矢 印で示される。Ｂ．融合タンパク質のヘパリン結合性 各サンプルにつき、馴らし培地 500μLをトリトンX-100で0.1% v/vに調製し、 次にヘパリン-セファロースビーズ約35μLと共に４℃で約16時間インキュベート した。ビーズを0.1% トリトン X-100を含有するPBS 500μLで３回洗い、結合し たタンパク質をビーズから溶出し、8% SDSゲル上で分離し、標準的な手法により CPG2特異的抗血清（Maraisら，1996）を用いて免疫タンパク質ブロッティングに より分析した。各サンプルにおいて発現されたタンパク質は該当するレーンの上 に示され、レーン８、pEFCPH₆ ；レーン９、pEFVEGF₁₆₅；レーン10、pEFV₁₆₁CPH₆ ；レーン11、PEFV₁₁₅CPH₆ ；レーン12、pEFCPV₁₀₉ ；レーン13、PEFCPV₁₆₅ ； レーン14、対照（pEFPlink.2）である。タンパク質マーカー（×10^-3）の泳動位 置は図面の右側に示され、各遺伝子の主要産物の泳動位置は図面の左側に矢印で 示される。図３：ヘパリン-セファロースクロマトグラフィーによるCPV₁₆₅の精製 pEFCPV₁₆₅でトランスフェクトした哺乳動物細胞から得られた馴らし培地をヘ パリン-セファロースクロマトグラフィーによる精製プロトコールにかけた。こ のプロトコールでは、トランスフェクションの72時間後にCOS細胞から回収した 馴らし培地17mlを700μLのヘパリン-セファロースCL 4Bカラムを通過させ、その 後カラム緩衝液(100mM Tris.HCl，260μM ZnCl₂，pH7.3)７mlで洗った。このカ ラムを順次、400mM NaClを含有するカラム緩衝液 2.8mL、800mMNaCl を含有する カラム緩衝液 2.8mL、1.2M NaCl を含有するカラム緩衝液 2.8mL、1.6MNaCl を 含有するカラム緩衝液 2.8mL、および2.0M NaCl を含有するカラム緩衝液 2.8mL を矢印で示した位置で用いて溶出した。0.7ml画分を集めた。混合タンパク質の 溶出が示され（黒丸）、これはBio-Radタンパク質測定キットを用いて595nmでの ＯＤ測定により測定した。CPG2活性の溶出は表２に記載したように基質としてMT Xを用いて測定し、白丸で示される。図４：Ni⁺⁺-NTAアガロースアフィニティークロマトグラフィーによる 融合タンパク質の精製 Sf9細胞にCPH₆およびV₁₁₅CPH₆をコードするバキュロウイルスを感染させ、表 ５に記載したようにNi⁺⁺-NTAアガロースアフィニティークロマトグラフィーによ りタンパク質を精製した。負荷画分（LOAD、レーン１、３）および精製タンパク 質（ELUATE、レーン２、４）からのサンプルをSDS-PAGEで分析し、続いて銀染色 を行ってそれらの純度を測定した。CPH₆のサンプルはレーン１および２に、V₁₁₅ CPH₆のサンプルはレーン３および４に示される。精製タンパク質の泳動位置は図 面の左側に、標準タンパク質（×10^-3）の泳動位置は図面の右側に示される。図５：融合タンパク質のダイマー分析 Sf9細胞において発現され、表５に記載したようにNi⁺⁺-NTAアガロースアフィ ニティークロマトグラフィーで精製されたV₁₁₅CPH₆（レーン１、３）およびCPH₆ （レーン２、４）をこの分析で使用した。各サンプルにつき、約50ngのタンパク 質を2-メルカプトエタノール(5% v/v)の不在下（非還元；レーン１、２）または 存在下（還元；レーン３、４）に65℃で５分加熱した。このサンプルを12% SDS ゲルで分離し、CPG2特異的抗血清を用いる免疫タンパク質ブロッティングにより 確認した。CPH₆の位置が示され、ダイマー（ダイマー-V₁₁₅CPH₆）またはモノマ ー（モノマー-V₁₁₅CPH₆）のV₁₁₅CPH₆の泳動位置が示される。標準タンパク質（ ×10^-3）の位置を図面の右側に示してある。図６：KDR(BD)のＤＮＡおよびタンパク質配列の模式図 Ａ．KDR(BD)の模式図 KDRおよびKDR(BD)のタンパク質構造が模式的に示される。これらのタンパク質 は示されるように通常のＮ末端からＣ末端の方向（それぞれＮおよびＣ）にある 。上の図面は完全なKDRタンパク質を表し、個々の領域に異なる陰影を付けてあ る。表示された領域はシグナルペプチド(SP)、細胞外ドメイン(ECD)、膜貫通領 域(TM)およびキナーゼドメイン(KD)である。また、コドン809 および810 も示さ れ、この箇所にはこの遺伝子のEcoRI部位が存在し、これを用いて該タンパク質 を末端切断して下の図面に示すようなKDR(BD)を作製した。末端切断型タンパ ク質のＣ末端に負荷された9E10エピトープは斜線ボックスとして表してある。図７：Sf9細胞におけるKDR(BD)の発現 Sf9細胞にKDR(BD)を発現するウイルス、または対照として、いかなる既知タン パク質もコードしない欠陥ポリヘドロン遺伝子をもつウイルス(empty)を感染さ せた。各サンプルにつき、溶解緩衝液(20mM Tris.HCl，0.5mM EDTA，10% v/vグ リセロール，0.3M KCl，1% v/vトリトンX-100，５μg/mlロイペプチン，５μg/m lペプスタチンA，50μg/ml フッ化フェニルメチルスルホニル，1mMベンズアミジ ン，pH8)中で感染の60時間後に10⁷個の細胞を抽出した。抽出物のタンパク質含 量はBio-Radタンパク質測定キットを用いて測定した。各抽出物 （KDR(BD),レーン１；empty,レーン２）につき、4.5μgのタンパク質を７% SDS ゲル上に載せ、9E10マウスモノクローナル抗体を用いる免疫タンパク質ブロッテ ィングによりタンパク質を検出した。KDR(BD)の泳動位置は矢印で示され、標準 タンパク質（×10^-3）の位置は図面の右側に示される。図８：KDR(BD)への融合タンパク質の結合 KDR(BD)に結合する融合タンパク質の能力をin vitroで試験した。Sf9細胞にお いて発現されたKDR(BD)を9E10モノクローナル抗体で免疫沈降させ、 9E10/KDR(BD)免疫複合体に結合する精製融合タンパク質サンプルの能力を、CPG2 酵素活性を測定することにより調べた。各サンプルにつき、図７で調製したよう な昆虫細胞抽出物750ftgから得られたKDR(BD)を、プロテインG-セファロースビ ーズ上に固定した9E10モノクローナル抗体約50μgを用いて免疫沈降させた（+KD R(BD)；レーン６〜10）。対照として、対照ウイルスを感染させた細胞から得ら れた抽出物（-KDR(BD)；レーン１〜５）をKDR(BD)発現ウイルスの代わりに用い た。VEGF/CPG2融合タンパク質もSf9細胞において発現させ、表５に記載したよう にNi⁺⁺-NTAアガロース精製タンパク質として調製した。融合タンパク質はCPG2酵 素活性により互いに対して平衡化され、各融合体につき、4.8mUのCPG2活性に相 当するタンパク質を9E10/KDR(BD)免疫複合体に添加した。サンプルを４℃で２時 間インキュベートし、洗浄緩衝液500 (50mM Tris.HCI，500mM NaCl，pH8) 中で２回洗い、次に洗浄緩衝液100 (50mM Tris.HCl，500mM NaCl，pH8)中で１回 洗った。免疫複合体により保持されたCPG2活性の量は表４に記載したように測定 した。図９：融合タンパク質により指令される非特異的細胞毒性 Ａ．CMDAプロドラッグに対するNIH3T3細胞の感受性 1mM CMDAプロドラッグの不在下（対照、レーン１）または存在下（+CMDA、レ ーン２）で集密的NIH3T3細胞を18時間培養した。インキュベーション後、細胞を 新しい皿に（100倍の希釈率で）希釈し、さらに６日間増殖させ、その後細胞の 生存率を[³H]チミジン取込みにより測定した。結果は対照（100％の細胞増殖を 表すと見なされる）に対する増殖％として表される。 Ｂ．融合タンパク質の存在下でのCMDAプロドラッグに対するNIH3T3細胞の感受性 あらゆる添加物の不在下（対照、レーン３）または示した融合タンパク質の存 在下（レーン４〜８）に1mM CMDAプロドラッグの存在下で集密的NIH3T3細胞を培 養した。添加物は次のとおりであった。レーン４、CPH₆；レーン５、CPV₁₆₁H₆； レーン６、V₁₆₁CPH₆；レーン７、V₁₁₅CPH₆；レーン８、pEFCPV₁₀₉H₆ 。各融合体 につき、定量免疫タンパク質ブロッティングにより測定して、0.3〜0.9mMの融合 体を添加した。細胞をインキュベートし、細胞増殖のために上記セクションＡの ように処理した。結果は対照レーン（100％の細胞増殖を表すと見なされる）に 対する増殖％として表される。図１０：融合タンパク質V₁₁₅CPH₆により指令されたVEGF依存性細胞毒性 Ａ．CMDAプロドラッグに対するHu-V-ec細胞の感受性 1mM CMDAプロドラッグの不在下（対照、レーン１）または存在下（+CMDA、 レーン２）で集密的Hu-V-ec細胞を18時間培養した。インキュベーション後、細 胞を新しい皿に（３倍の希釈率で）希釈し、さらに６日間増殖させ、その後細胞 の生存率を[³H]チミジン取込みにより測定した。結果は対照（100％の細胞増殖 を 表すと見なされる）に対する増殖％として表される。 Ｂ．融合タンパク質の存在下でのCMDAプロドラッグに対するHu-V-ec細胞の感受 性 あらゆる添加物の不在下（対照、レーン３）、またはCPH₆（27nM,レーン４） もしくはV₁₁₅CPH₆（11nM,レーン５）の存在下で集密的Hu-V-ec細胞を30分間培養 した。その後細胞を新しい培地で６回洗い、1mM CMDAの存在下で一晩インキュベ ートした。細胞を1/3の希釈率で再プレーティングしてさらに４日間増殖させ、 その後細胞増殖を[³H]チミジン取込みにより概算した。結果は対照レーン（100% の細胞増殖を表すと見なされる）に対する増殖％として表される。表１ 突然変異誘発で用いたオリゴヌクレオチド これらの使用したオリゴヌクレオチドは、通常の5'→3'方向で示してある。表２： トランスフェクトCOS細胞由来の馴らし培地におけるCPG2活性の分析 示したベクターでトランスフェクトしたCOS細胞由来の組織培養培地を回収し 、 CPG2活性を調べた。トランスフェクションは、lipfectAMINE 試薬を用いる標準 的な方法で行った（Maralsら、1995年）。CPG2 酵素アッセイについては、培養 培地100μLを CPG2緩衝液（100mM トリス HCl、260μM ZnCl₂、50μM MTX、pH7. 3）中で 25℃でインキュベートし、吸光度の変化速度を 320nm でモニターした 。これから、CPG2 活性を培養培地１ml 当たりの CPG2 の単位数（U/ml）として 計算した。表３： 発現されたタンパク質の予測サイズ及び測定サイズ N.D．測定せず * 測定サイズは、図 7A におけるそれぞれの場合について見られる主要なバン ドから計算した。 この表は、各成熟融合タンパク質について予測されたアミノ酸の数を示したも のであり、それから予測分子量を計算した。従ってこれらの分子量は、シグナル ペプチドの喪失を考慮に入れた数値である。測定分子量は、図 2A に示す SDS-P AGE分析から求めた数値である。表４： Sf9 細胞における融合タンパク質の発現 示したタンパク質をコードするウイルスを感染させたSf9細胞由来の組織培養 培地を回収し、CPG2 活性を測定した。この実験では 10⁷個の昆虫細胞を約 4-10 の感染多重度で感染させた。この細胞を組織培養培地の 10mL とともに60時間イ ンキュベートした。培地を回収し、遠心分離によって細胞を除去した。MTX アッ セイのため、培地のサンプルをCPG2緩衝液（100mM トリス HCl、260μMZnCl₂、5 0μM MTX、pH7.3）中で25℃でインキュベートした。吸光度の変化速度を320nm でモニターした。これからCPG2活性を培地 1ml当たりのCPG2の単位数（U/ml）と して計算した。表５： Ni⁺⁺-NTA アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質の精製 *CPG2活性は、表４の場合と同様に MTX を基質として用いる酵素アッセイで測定 した。 この表は、NI⁺⁺NTA-アフィニティークロマトグラフィーによる CPH₆及びV₁₁₅C PH₆の精製を示す。それぞれのタンパク質について 10⁷個の昆虫細胞に 4-10の感 染多重度で感染させた。細胞は 10mL の組織培養培地とともに60時間インキュベ ートし、培地を回収し、遠心分離により細胞を取り除いた。馴らし培地は、透析 緩衝液（50mM トリス HCl、500mM NaCl、pH8）に対して充分に透析し、次いで0. 5mlのカラム緩衝液（50mM トリス HCl、500mM NaCl、10% グリセリン、0.5%v/v NP40、10mM イミダゾール、５Mg/ml ロイペプチン、５Mg/ml ペプスタチンA、50 Mg/ml フッ化フェニルメチルスルホニル、１mM ベンズアミジ ン、pH8）に注入した。20mM イミダゾールを含むカラム緩衝液５ml でカラムを 洗浄し、結合したタンパク質を90mMイミダゾールを含むカラム緩衝液に溶出させ た。表には、それぞれのカラム画分に存在する全タンパク質の割合と、CPG2活性 とを示す。表６： 精製タンパク質の動態学的分析 Sf9昆虫細胞に、CPH₆、V₁₅₁CPH₆、V₁₁₅CPH₆、及びCPV₁₀₉H₆を発現するウイル スを感染させた。培養培地を回収し、表５の場合と同様にNi⁺⁺-NTAアガロースア フィニティークロマトグラフィーによって融合タンパク質を精製した。精製タン パク質を、表４の場合と同様に、MTXを開裂する能力について試験した。それぞ れの融合タンパク質の基質に対する親和性（Km）は標準的な回帰分析を使用して 求めた。４．融合タンパク質の特性づけ 第１の実験の目的は、我々が生成した融合タンパク質が真核細胞で発現され得 るかどうかを判定することである。このため、我々はCOS細胞をベースとした一 時的なトランスフェクション系を用いた。これらの細胞が、培養や、 LipofectAMINE試薬を用いてトランスフェクションを行うのに便利だからである 。 V₁₆₁CPH₆、V₁₁₅CPH₆、CPV₁₆₅、CPV₁₀₉、及びVEGF₁₆₅の遺伝子を哺乳動物発現ベ クターpEFPlink.2にクローン化した。これらのべクターはそれぞれ、pEFV₁₆₁CPH₆ 、 pEFV₁₁₅CPH₆、pEFCPV₁₆₅、pEFCPV₁₀₉、及びpEFVEGF₁₆₅と称する。これらのプラ スミド、あるいはpEFPlink.2でCOS細胞をトランスフェクトした。これらのクロ ーンにより発現されるタンパク質はいずれも分泌されることが予想されるため、 トランスフェクションの72時間後に馴らし培地をトランスフェクトした細胞から 回収 し、以下に概説するように融合タンパク質の存在について調べた。4.1. 融合タンパク質のCPG2活性 最初に、トランスフェクト細胞由来の馴らし培地をCPG2酵素活性の存在につい て調べた。培養培地のサンプルを、CPG2 基質 MTX を分解するその能力について 分析した。分析の結果から、pEFPlink.2 でトランスフェクトした細胞において は検出可能な CPG2 活性は存在せず、これに対して pEFCPH₆ をトランスフェク トした細胞由来の培地は CPG2 活性を培地１ml 当たり CPG2 の0.096 単位（U/m l）のレベルまで蓄積したことがわかる（表２）。また、それぞれの融合タンパ ク質でトランスフェクトした細胞に由来する培地も CPG2 活性を 0.004〜0.14U/ mL 培養培地の範囲まで蓄積することがわかった。従って、４種の融合タンパク 質でいずれも活性な形態で、CPG2 を発現する能力を有し、この CPG2 は細胞か ら分泌され培地に蓄積することがわかる。この CPG2 の蓄積がこれらの細胞にお ける VEGF の発現によるものではないことは度外視できる。というのは、pEFVEG F₁₆₅をトランスフェクトした細胞由来の培地では、CPG2 活性を蓄積しないから である（表２）。4.2. 融合タンパク質の有無についてのSDS分析 4.1節に示した結果から、CPG2活性が組織培養培地に蓄積することがわかった が、無傷の融合タンパク質が存在するかどうかは確認されていない。分泌された 融合タンパク質がタンパク分解を受けたかどうかを判定するために、これらのタ ンパク質をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PA GE）及び免疫ブロットにより調べた。それぞれのCOSトランスフェクト細胞由来 の馴らし培地のサンプルを、CPG2 特異的抗血清を用いて免疫沈降させた。免疫 沈降したタンパク質をSDS-PAGEにより分離し、CPG2 特異的抗血清を用いた免疫 ブロットによりCPG2タンパク質を検出した。 pEFPlink.2 でトランスフェクトした細胞由来の馴らし培地においてはCPG2 特 異的抗血清により認識されるタンパク質は存在しなかった（図２、レーン７）。 pEFCPH₆でトランスフェクトした細胞の培地においては分子量約45,000のタンパ ク質がCPG2抗血清により認識された（図２、レーン１）。このタンパク質のサイ ズはCPH₆の推定分子量に近いものであった（表３）。pEFV₁₆₁CPH₆、pEFV₁₁₅CPH₆ 、pEFCPV₁₆₅、pEFCPV₁₀₉でトランスフェクトした細胞由来の培地はすべてCPG2特 異的抗体により認識されるタンパク質を蓄積しており、そのタンパク質の分子量 はすべてCPH₆の分子量より大きいものであった（図２、レーン1、3、4、5、6） 。それぞれの融合タンパク質は、SDS-PAGE において複数のバンドとして存在す るが、これは VEGF 部分における種々の程度のグリコシル化のためである。主要 なバンドの見かけ分子量をSDS ゲルから計算すると、シグナルペプチドのサイズ を考慮に入れた場合、その分子量はそれぞれの融合タンパク質に対して予測され た推定分子量に近いことがわかった（表３）。これらのデータから、融合遺伝子 が予測された正しいタンパク質を生成することがわかる。これらのタンパク質は 正しいサイズを有し、融合タンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェ クトした細胞に由来する培地においては遊離 CPG2 の有意な蓄積は生じない。こ のことから、融合タンパク質が安定で組織培養培地においてタンパク分解を受け ないことがわかる。4.3. 融合タンパク質のヘパリン結合性 融合タンパク質を、ヘパリンに結合する能力についてヘパリン-セファロースC L-6B（Pharmacia）を用いて試験した。CL-6B はヘパリンが共有結合したセファ ロースビーズからなるカラムマトリックスである。トランスフェクト細胞由来の 馴らし培地をヘパリンセファロースCL-6B とともにインキュベートし、このマト リックスに結合することがわかったタンパク質を免疫タンパク質ブロットにより 同定した。 この分析により CPH₆はヘパリンと結合できないことがわかった（図 2B、レー ン9）。VEGF のヘパリン結合ドメインを含む２種の融合タンパク質（V₁₆₁CPH₆及 びCPV₁₆₅）は高い効率でヘパリンに結合した（図 2B、レーン10及び13）。実際 に、この結果を定量すると、このような粗生成物の条件でも60%を越えるV₁₆₁CPH₆ 及び CPV₁₆₅がヘパリンマトリックスに結合できたことがわかった。 V₁₁₅CPH₆のヘパリンマトリックスに対する弱い結合が存在するが（図 7B、レー ン 11）、これを定量するとマトリックスに結合する融合タンパク質は7％未満であ ることがわかった。さらに、この分析で使用した V₁₁₅CPH₆の量は、V₁₆₁CPH₆やC PV₁₆₅の量よりかなり多く、7%結合という数字はおそらくV₁₆₁CPH₆やCPV₁₆₅で見 られた数値に対して真の結合量を過大に評価したことを表していると考えられる 。 CPV₁₀₉もヘパリンマトリックスと結合することがわかったが（図2B、レーン12） 、これを定量すると約1.3%の結合しかなく、これは有意であるとはみなせないも のであった。これらの結果から、予測通り、VEGF ヘパリン結合ドメインが融合 タンパク質上に存在する場合、それらをヘパリンマトリックスに結合させること ができ、Ｎ末端またはＣ末端へのCPG2融合のいずれの状況においても、VEGF の ヘパリン結合ドメインが自律的に機能することを示している。この領域が融合タ ンパク質から排除された場合、得られるタンパク質のヘパリン結合活性は非常に 弱くなる。4.4. へパリンーセファロースアフィニティークロマトグラフィーによる融合タ ンパク質の精製 少なくとも２種の融合タンパク質が高い効率でヘパリン-セファロースビーズ に結合することが示されているが、この技術を用いて融合タンパク質の精製を行 った。プラスミドpEFCPV₁₆₅でトランスフェクトした COS 細胞由来の馴らし培地 をヘパリン-セファロースカラムに通した。このカラムを洗浄し、増加する濃度 の NaCl を含有する緩衝液を用いて結合したタンパク質を溶出した。その画分の CPG2活性をアッセイすることにより融合タンパク質の溶出を検出した。 CPV₁₆₅を含有するCOSで馴らし培地をヘパリン-セファロースカラム上で処理す ると、負荷されたタンパク質の>96%が結合しない。しかし、CPG2 酵素アッセイ で測定されたように、全ての融合タンパク質はカラムに結合した。400mM NaClを 含む緩衝液でカラムを洗浄すると、カラムに結合したものの50%（負荷サンプル 中のタンパク質の 2%）が溶出し、この画分には CPG2 活性が存在しなかった（ 図３）。800mM NaCl を含む緩衝液をカラムに加えると、残りのタンパク質の大 半（負荷タンパク質の約2%）がカラムから溶出した。この分画にはCPG2活性が存 在し、より高濃度のNaClを用いてもそれ以上のCPG2活性が溶出しないこと がわかった（図３）。 カラムから溶出したCPG2酵素活性の見かけの収率は約140%である。このこと、 精製タンパク質の活性が未精製のタンパク質の活性より高いことを意味しており 、これはおそらく馴らし培養培地に阻害活性が存在するためであると考えられる 。このためサンプルの精製倍率を評価することが不可能となっているが、この 8 00mM NaCl 画分は負荷されカラムから溶出されたCPG2の全てを含んでおり、一方 その量は負荷されたタンパク質の約2%に過ぎない。従って、ヘパリン-セファロ ースカラムにより>50の精製倍率が得られることになり、この方法の実施可能性 を示している。4.5. Sf9 昆虫細胞における融合タンパク質の発現 融合タンパク質をさらに特性づけることを可能とするため、融合タンパク質を 大量に製造することを試みた。この分析のために昆虫細胞系を選択したが、これ はこれらの細胞に組換えバキュロウイルスを感染させるとこの系が高レベルの外 来タンパク質を産生できるからである。昆虫細胞は通常ジスルフィド結合のよう な構造を正しく形成することができ、タンパク分解性開裂やグリコシル化のよう な翻訳後修飾を行うことが多い。これらは哺乳動物細胞でも起こるが、細菌の発 現系では見られない。但し、昆虫細胞ウイルスを作る工程の前に、CPV₁₆₅及びCP V₁₀₉のＣ末端にポリヒスチジンタグを組み込んで、Ni⁺⁺-NTA-アガロースアフィ ニティーカラムクロマトグラフィーによりこれらのタンパク質を精製できるよう にした。4.5.1 バキュロウイルスベクターのクローニング ポリヒスチジンタグをCPV₁₆₅及びCPV₁₀₉の遺伝子の3'末端に挿入した。4.5.1.1 CPV₁₆₅H₆ CPV₁₆₅H₆のクローニングを、pVEGF₁₆₅を用いたPCR反応においてオリゴヌクレ オチド４及び８を用いて行った。このPCR産物を制限エンドヌクレアーゼKpnI及 び BamHI で消化し、次いでこの断片を pEFCPV₁₆₅にクローン化して戻したが、 こ のときオリゴヌクレオチド10及び11をともに組み込み、遺伝子の3'末端にポリヒ スチジンタグを生成した。このクローニング法により、融合遺伝子のVEGF部分の 3'末端、即ちタンパク質のＣ末端にポリヒスチジンタグが付加したものが得られ た。この遺伝子の構築において、VGEF 遺伝子の末端の４つのコドンは除去した 。この構築物を CPV₁₆₁H₆と称し、タンパク質を図 1G に模式図で示す。 CPV₁₆₁H₆共遺伝子の配列、及びそれがコードする予測タンパク質の配列を配列番 号16に示す。4.5.1.2 CPV₁₀₉H₆ CPV₁₀₉H₆のクローニングを、pVEGF₁₆₅を用いたPCR反応においてオリゴヌクレ オチド８及び12を用いて行った。このPCR産物を制限エンドヌクレアーゼKpnI及 び BamHI で消化し、次いで断片を pEFCPV₁₆₅にクローン化して戻したが、この ときオリゴヌクレオチド10及び11をともに組み込み、遺伝子の3'末端にポリヒス チジンタグを生成した。このクローニング法により、VEGF 遺伝子をコドン110で 切断してその位置にポリヒスチジンタグを付加したものが得られた。従ってヘパ リンとの結合に必要な残基は除去されている。この構築物を CPV₁₀₉H₆と称し、 タンパク質は図1Hに模式図で示す。CPV₁₀₉H₆遺伝子、及びそれがコードする予測 タンパク質の配列を配列番号18に示す。 CPH₆、V₁₆₁CPH₆、V₁₁₅CPH₆、CPV₁₆₅H₆、及びCPV₁₀₉H₆の遺伝子を昆虫細胞シャ トルベクターpVLPlink.2にクローン化した。標準的なプロトコールに従って、こ れらのべクターを用いて組換えバキュロウイルス粒子を生成した。4.5.2 SF9 細胞におけるCPH₆及び融合タンパク質の発現 Sf9昆虫細胞にCPHf₆、V₁₆₁CPH₆、V₁₁₅CPH₆、CPV₁₆₅H₆及びCPV₁₀₉H₆の発現を指 令する組換えウイルスを感染させた。対照とするための感染は、空のポリヘドロ ン部位を有するウイルス（「エンプティー(empty)」ウイルス）を用いて行った 。これらの細胞は真核細胞であることから、タンパク質はいずれも細胞が増殖す る培地に分泌されることが予測された。そこで感染細胞由来の馴らし培地をCPG2 酵素活性の存在についてMTXを基質として用いて調べた。 エンプティウイルスを感染させた細胞に由来する馴らし培地は、MTX を分解す ることができない（表 4）。このエンプティウイルスを感染させた細胞に由来す る馴らし培地が MTX を分解できなかったことは、感染昆虫細胞において CPG2 活性が欠如していることを表している。これに対し、CPH₆を発現するウイルスを 感染させた細胞に由来する馴らし培地は、組織培養培地１mL 当たり約 0.4 単位 （U/mL）のCPG2のレベルまでCPG2タンパク質を蓄積した（表 4）。他の融合タン パク質のそれぞれを有するウイルスを感染させた細胞に由来する培地も 0.01〜0 .2 U/mLまでCPG2活性を蓄積し、融合タンパク質が分泌されたことを示している 。4.6 融合タンパク質のNi⁺⁺-アガロースアフィニティークロマトグラフィー 昆虫細胞が産生する物質を利用して、発現されたタンパク質の精製にポリヒス チジンタグを利用できるかどうかを判定した。この分析のため、CPH₆及びV₁₁₅CP H₆を用いた。Sf9細胞に適当なウイルスを感染させ、馴らし組織培養培地に分泌 されたタンパク質を、Ni⁺⁺-NTA-アガロース（Quiagen、製造者の説明書に従って 用いた）を用いた精製プロトコールにかけた。馴らし培地を透析して培地中に存 在するヒスチジンを取り除き（ヒスチジンはイミダゾール環を有するためH6-タ ンパク質の結合を妨げることがある）、次いでカラムを通過させた。カラムを洗 浄し、結合したタンパク質をイミダゾールで溶出させた。Ni⁺⁺-NTA カラムに結 合するのは馴らし培地中のタンパク質の 6%に過ぎず、洗浄サイクルでカラムか ら溶離されるタンパク質は約 33%である（表 5）。通り抜け及び洗浄画分の CPG 2 活性を調べたが、これらの画分では活性を検出できなかった。CPH₆及びV₁₁₅CP H₆のいずれの場合にも、90mMイミダゾール洗液で溶出されたタンパク質の量は、 カラムに負荷したタンパク質の約4%であった（表 5）。これをアッセイすると、 CPH₆の場合にはカラムに負荷された CPG2 活性の約 99%、V₁₁₅CPH₆の場合にはカ ラムに負荷された CPG2 活性の約 100%が含まれていることがわかった。従って 、これらのカラムからの回収率は優れたものであるといえる。 溶出したタンパク質の純度を求めるため、サンプルを SDS-PAGE にかけ、銀染 色を行った。この結果、CPH₆及びV₁₁₅CPH₆の調製物の純度は極めて高く、精製サ ンプルにおいては>95%のタンパク質が含まれていた（表 4）。これによりポリヒ スチジンタグ付加タンパク質の精製のためにこの方法を用いることの実施可能性 が示され、また昆虫細胞が大量の融合タンパク質を産生し得、これは培地に分泌 ・蒸積されて培地中に存在するタンパク質の約 4%に相当し、従って純粋なサン プルの調製に必要な精製倍率は約25で済むという事実が強調される。 このプロトコールを用いて、上述のようにCPH₆、V₁₆₁CPH₆、V₁₁₅CPH₆、及びCP V₁₀₉H₆を全てSf9 細胞からNi⁺⁺-NTA-アガロースアフィニティクロマトグラフィ ーにより精製した。これらのサンプルを用いて、基質MTXに対する CPG2 部分の アフィニティを測定した。この結果、これら全ての融合タンパク質の km はCPH₆ について見られたものに近いもので（表 6）、これは約 10μM の細菌産生CPG2 について測定された km と同様のものであることがわかった。このことはCPG2 の VEGF に対する融合が CPG2 のその基質に対する親和性を損なうものではない ということを示している。4.7 融合タンパク質のダイマー分析 哺乳動物細胞で産生された VEGF は、分子間及び分子内のシステイン架橋によ り安定化されるダイマータンパク質である。CPG2 もダイマータンパク質である が、このダイマーは非共有結合の相互作用により安定化される。Sf9 細胞で産生 されたVFGF/CPG2融合タンパク質がシステイン架橋により安定化されるダイマー であるかどうかを判定するためにダイマー分析を行った。ともに昆虫細胞から産 生されたCPH₆及びV₁₁₅CPH₆を、還元剤2-メルカプトエタノールの存在下で、また は非存在下で加熱した。得られたタンパク質をSDS-PAGEで分離し、CPG2 特異的 抗血清を用いた免疫タンパク質ブロット分析にかけた。この結果、加熱の後、還 元剤の存在下、非存在下いずれの場合でも、CPH₆は分子量が約 45 kDa のタンパ ク質として泳動することがわかった（図５、レーン２及び４）。このことは、こ のタンパク質がシステイン架橋で安定化されるダイマーの形態で存在していない ことを表している。これに対しV₁₁₅CPH₆は、還元剤の非存在下では分子量約 120 kDa のタンパク質とみられるが、還元剤の存在下では分子量約 60 kDa のタン パク質とみられる（図５、レーン１、３）。これらのデータから、Sf9 細胞で産 生さ れるV₁₁₅CPH₆は、哺乳動物細胞中のものと同様にシステイン架橋により安定化さ れるダイマータンパク質であることがわかる。4.8 融合タンパク質のVEGF受容体への結合 昆虫細胞で発現されたタンパク質を用いて、生化学的方法により融合タンパク 質がVEGF 受容体に結合し得るかどうかを判定した。我々はこの分析のためのin vitro アッセイを開発した。このアッセイでは融合タンパク質の VEGF 受容体の 外部ドメイン、KDR に結合する能力を調べる。その KDR がメンバーである受容 体チロシンキナーゼは原形質膜にかかっており、３つのドメインからなる。通常 高度にグリコシル化される外部ドメインは増殖因子結合ドメインを含んでおり、 従ってそのリガンドと特異的に相互作用する部位である。次いで１本のアミノ酸 鎖からなる短い膜貫通ドメインが存在し、さらにチロシンキナーゼドメインから なる細胞質に存在するＣ末端が存在する。我々が開発したアッセイでは、VEGF 結合に対する特異的プローブとして細胞外ドメイン (ECD) を使用したいと考え ていた。これを達成するために、SF9 細胞における発現のための KDR 外部ドメ イン及び膜貫通ドメインをクローン化した。このクローニングによって内部ドメ インは除去され、モノクローナル抗体 9E10 に対するタグがクローン化された断 片の3'末端に付加された。この構築物を KDR 結合ドメイン (BD) と称する（図6 A参照）。この方法における合理的な手段は、Sf9 細胞において KDR (BD) を発 現させ、感染細胞から抽出物を調製することである。次いで KDR (BD) を 9E10 モノクローナル抗体で免疫沈降させ、これをプローブとして用いてVEGF/CPG2融 合タンパク質のVEGF受容体への結合を検出することができた。4.8.1. KDR BD のクローニング この方法のために、プラスミドpBK-CMVAE/KDR sense中のKDR遺伝子を使用した 。オリゴヌクレオチド13及び14をKDR遺伝子とともに使用するPCRを用いて、遺伝 子の5'末端に Ncol 制限エンドヌクレアーゼ部位を生成した。次いで KDR (BD) をNcoI/EcoRI断片としてバキュロウイルスベクターpVLPlink.2にクローン化した 。KDR における EcoRI 部位は、KDR のコドン809及び810に位置してお り、この位置は膜貫通ドメインをコードする配列のちょうど3'末端に存在してい る（図6A参照）。9E10モノクローナル抗体に対するタグは、オリゴヌクレオチド 15及び16を使用して標準的なクローニング技術を用いてEcoRI部位にクローン化 した。KDR (BD) ど称するこのKDR断片の配列は配列番号20に示し、図6Aに模式図 で示す。4.8.2. Sf9 細胞におけるKDR BDの発現 昆虫細胞における KDR (BD) の発現は、9E10モノクローナル抗体を用いた感染 昆虫細胞の免疫タンパク質ブロットにより確認した。その結果、KDR (BD) ウイ ルスを感染させた細胞では、9E10モノクローナル抗体により認識される約 120kD aの分子量のバンドが存在し、このバンドはエンプティウイルスを感染させた細 胞からの抽出物には存在しなかった（図７参照）。このバンドのサイズはクロー ン化断片に予想されたサイズ（予想サイズ=92,769 Da）より大きいが、これはお そらくKDR (BD) のグリコシル化のためであると思われる。このデータからKDR ( BD) がSf9細胞において発現され得ることがわかる。4.8.3. 融合タンパク質のKDR (BD) への結合 ４種の VEGF/CPG2 融合タンパク質の KDR (BD) に結合する能力を試験した。 このアッセイのため、KDR (BD) 発現ウイルス、または対照（エンプティ）ウイ ルスのいずれかを感染させた昆虫細胞からの抽出物を、プロテインG-セファロー スビーズ上に固定した9E10モノクローナル抗体とインキュベートし、KDR (BD) を沈降させた。免疫複合体を洗浄し、昆虫細胞で発現され、Ni⁺⁺-NTAアフィニテ ィークロマトグラフィーにより精製されたCPH₆、V₁₆₁CPH₆、V₁₁₅CPH₆、CPV₁₆₁H₆ 、及びCPV₁₀₉H₆タンパク質とインキュベートした。複合体を再度洗浄し、免疫複 合体におけるCPG2活性を測定して融合タンパク質の存在を判定した。 KDR (BD) /9E10免疫複合体ではCPG2活性が見出されず（図８、レーン６）、CP H₆はKDR (BD) と相互作用しないことがわかった。しかし、V₁₆₁CPH₆、V₁₁₅CPH₆ 、CPV₁₆₁H₆及びCPV₁₀₉H₆は、それぞれの融合体で KDR (BD) /9E10 免疫複合体に 関連してCPG2活性が検出され得る（図８、レーン７〜10）という事実からわかる よう に、いずれも KDR (BD) と結合できる。この相互作用が特異的であるということ は、9E10 免疫複合体を、KDR (BD) を発現するウイルスの代わりにエンプティウ イルスを感染させたSf9細胞からの抽出物とともに処理した場合、融合タンパク 質の結合が検出され得ないという事実によって示すことができた（図 15、レー ン2〜5）。これらのデータにより４種の融合タンパク質はいずれも KDR のリガ ンド結合ドメインと特異的に相互作用できるが、CPH₆はできないということが証 明されている。５. 細胞毒性アッセイ 上述のデータを合わせると、上記の融合タンパク質が、CPG2 と VEGF との間 に２つの方向で、VEGFのヘパリン結合ドメインを含んでいるか、または含んでい ないVEGF部分を用いて構築できるということが示される。これらのタンパク質は 真核細胞により分泌され、VEGF 機能（受容体結合、及び場合によってはヘパリ ン結合）及びCPG2の酵素活性の点で安定である。CPG2部分のグリコシル化を防ぐ ために、CPG2 上の不適当なグリコシル化部位を突然変異させた。この結果、野 生型のタンパク質と比較して約 10%の酵素活性しか有していないが、その基質へ の親和性が細菌で発現された野生型CPG2 と区別がつかないタンパク質が得られ る（WO96/03515 参照）。融合タンパク質のＣ末端におけるポリヒスチジンタグ の存在により、Ni⁺⁺-NTAアガロースクロマトグラフィーによる融合タンパク質の 精製が可能となり、VEGF 部分のヘパリン結合ドメインを含む融合タンパク質を ヘパリンセファロースカラム上で精製することができる。そこで、これらの融合 タンパク質が哺乳動物細胞のプロドラッグ依存性細胞毒性を導く能力の分析に進 んだ。5.1 非特異的細胞毒性アッセイ 最初のアッセイについては、標的を定めない形態で、CPH₆及び融合タンパク質 が NIH3T3 細胞のプロドラッグ依存性細胞毒性を誘導することを示すことを目的 とした。この実験のために、CPH₆、V₁₆₁CPH₆、V₁₁₅CPH₆、CPV₁₆₅H₆、及びCPV₁₀₉ H₆をいずれもNi⁺⁺-NTAアガロースによって精製した。精製タンパク質のサンプル を CMDAプロドラッグの存在下でNIH3T3細胞に添加し、その細胞の生存性への作用を 、[3H]-チミジン取込みにより細胞増殖を測定することによって判定した。 CMDA のみでこれらの細胞で処理すると、これらの細胞の増殖に有意な影響は 現れなかった（図９、レーン１及び２）。これらの細胞を、CMDAの存在下でCPH₆ または各融合タンパク質のナノモル未満濃度で処理すると、完全な細胞死が起こ る（図９、レーン３〜７）。従って、上記融合タンパク質のそれぞれは CMDA プ ロドラッグの存在下で哺乳動物細胞を特異的に死滅させるのに非常に効率がよい ことがわかる。5.2 VEGF 指令細胞毒性アッセイ 上記融合タンパク質を、VEGF に特異的な受容体を表面に発現する細胞の CMDA 依存性死滅を誘導する能力について評価した。この分析においてはヒト請静脈内 皮 (Hu-V-ec) 細胞を採用したが、この細胞はその増殖が VEGF に依存している (Prog Growth Factor Res，5，89，1994) 。これらの細胞は、１mM CMDA がその 増殖速度に与える影響からわかるように（図10A）、CMDAに対する有意な感受性 を有していない。この細胞を、CPH₆またはV₁₁₅CPH₆の存在下で30分間インキュベ ートして融合タンパク質を細胞表面に結合させ、次いで細胞を洗浄して非結合タ ンパク質を取り除いた。CMDA を添加し、細胞の生存を[3H]-チミジン取込みによ り判定した。CPH₆で分析を行った場合、細胞の増殖速度に対する有意な影響はな かった（図 10B、レーン１、２）。これに対し、V₁₁₅CPH₆を用いて行った分析で は、細胞増殖の>90%の阻害が見られる（図10B、レーン１及び３）。これらのデ ータから、CPH₆はHu-V-ec細胞の表面に結合しないようであり、従ってプロドラ ッグを添加する前に細胞から洗い流されるので、プロドラッグの存在下でその死 滅を誘導することはできないことがわかる。しかし、V₁₁₅CPH₆は細胞表面に結合 したままとなり、細胞から洗い流されず、プロドラッグを添加したときそれらの 死滅を誘導することができる。このことは、LIDEPT 法の実施可能性の証拠とな る。配列の情報 配列番号1〜20では、ＤＮＡ配列は通常の5'→3'方向で、タンパク質配列は通 常のＮ末端→Ｃ末端方向で示す。配列番号３及び４:CPG2のＤＮＡ配列及びタンパク質配列 ＤＮＡ配列と、その下に予測タンパク質配列を示す。ＤＮＡ配列内で、遺伝子 操作された制限エンドヌクレアーゼ部位は小文字で示す。遺伝子の5'末端にある NcoI部位の位置も示す。遺伝子上の４個所の突然変異は*で示す。*1の突然変異 は、この遺伝子のPCRクローニング時に生じた、CPG2の位置172のAsnコドンのサ イレント突然変異を示す。*2、*3及び*4の突然変異は、哺乳動物細胞においてCP G2のグリコシル化を防止するのに必要なAsn→Gln突然変異である。タンパク質配 列の下にある番号は、個々の断片が誘導される遺伝子のコドンを表している。c- erbB2 に由来する領域には下線を付したが、これはその遺伝子のコドン１〜17を 含み、このタンパク質を分泌経路に導くのに使用されるシグナルペプチドを包含 する。CPG2に由来するこの領域はコドン23〜415を含む。クローンのＣ末端のポ リヒスチジンタグは、タンパク質配列においてイタリック体で示し、停止コドン は●で示す。配列番号５及び６:VEGFのＤＮＡ配列及びタンパク質配列 ＤＮＡ配列、及びその下に予測タンパク質配列を示す。タンパク質配列内で、 成熟タンパク質配列からタンパク分解により切断されるシグナルペプチドには下 線を付す。従ってアミノ酸の番号は、残-26から開始されており、残基１が成熟 タンパク質における第１のアミノ酸である。単一のグリコシル化部位の部分は* で示す。停止コドンは●で示す。 融合タンパク質配列について、ＤＮＡ配列、その下にその予測タンパク質配列 を示す。VEGF 由来の配列は太字で示し、CPG2 に由来する配列は通常の文字で示 す。配列番号７、９、11、及び13の２つのＤＮＡは、配列番号３及び５から取ら れたものである。配列番号７及び８:V₁₆₁H₆迎のＤＮＡ配列及びタンパク質配列 成熟タンパク質のコドン２におけるVEGF配列内のサイレント突然変異（CCC→C CT）を生成し、この遺伝子に存在するNcoI 部位 (*) を破壊した。形成された制 限エンドヌクレアーゼ部位は小文字で示す。タンパク質配列の下の数字は、個々 の断片が誘導される遺伝子のコドンを表している。VEGF 配列は-26〜161 の番号 を付されており、CPG2 配列は23〜415 の番号を付されている。成熟タンパク質 からタンパク質分解により切断される、VEGF に由来するシグナルペプチドには 下線を付した。ポリヒスチジンタグはタンパク質配列内でイタリック体で示し、 停止コドンは●で示す。配列番号９及び10:V₁₁₅CPH₆のＤＮＡ配列及びタンパク質配列 成熟タンパク質のコドン２において、VEGF配列内のサイレント突然変異（CCC →CCT）を生成し、この遺伝子に存在するNcoI部位 (*) を破壊した。さらに、VE GF 遺伝子は、タンパク質配列の下に付された番号で示すコドン115 において切 断されている。形成された制限エンドヌクレアーゼ部位は小文字で示す。タンパ ク質配列の下の番号は個々の断片が誘導される遺伝子のコドンを表している。VE GF配列は、-26〜115の番号を付されており、CPG2配列は23〜415の番号を付され ている。従って、融合タンパク質はVEGF のヘパリンとの結合に関わるアミノ酸 を含んでいない。成熟タンパク質からタンパク質分解により切断されるVEGF由来 のシグナルペプチドには下線を付した。ポリヒスチジンタグはタンパク質配列内 でイタリック体で示し、停止コドンは●で示す。配列番号11及び12:CPV₁₆₅のＤＮＡ配列及びタンパク質配列 ペプチドスペーサーは二者間のEcoRI 及びKpn1 部位で囲まれた追加のＤＮＡ 配列により生成された。これらがコードするスペーサペプチドは、タンパク質配 列中でイタリック体で示し、かつ下線を付した。この構築物のクローニングによ りCPG2由来配列の3'末端からポリヒスチジンタグが失われ、VEGFシグナルペプチ ドに対する配列も除去される。この遺伝子の5'末端にはc-erbB2 の初めの27個の コドン、それに続くCPG2のアミノ酸23〜415がペプチドスペーサーを介してVEGF アミノ酸１〜165に融合されている。停止コドンは●で示す。配列番号13及び14:CPV₁₀₉のＤＮA配列及びタンパク質配列 ペプチドスペーサーは、二者間の、EcoRI及びKpn1部位で囲まれた追加のＤＮ Ａ配列により生成された。これらがコードするスペーサーペプチドは、タンパク 質配列内でイタリック体で示し、かつ下線を付した。この構築物のクローニング により、CPG2由来の配列の3'末端からボリヒスチジンタグが失われ、かつVEGF シグナルペプチドの配列も除去される。このクローンは、CPV₁₆₅の生成時にPCR で突然変異が起こったときに生成されたものである。これにより成熟 VEGFのArg コドン110が停止コドンに変換され、このクローンに由来するタンパク質配列に 示すように (*) 、コドン109においてVEGF部分が切断される。この遺伝子の5'末 端には、c-erbB2の最初の27コドン、それに続くCPG2アミノ酸23〜415がペプチド スペーサーを介してVEGFアミノ酸１〜109に融合されている。この停止コドンを 生じた突然変異は●で示す。配列番号15及び16:CPV₁₆₅H₆のＤＮＡ配列及びタンパク質配列 VEGF及びCPG2のＤＮＡ配列は配列番号11から取ったものである。ペプチドスペ ーサーは、二者間の、EcoRI及びKpn1部位で囲まれた追加のＤＮＡ配列により生 成された。これらがコードするスペーサーペプチドはタンパク質配列内でイタリ ック体で示し、かつ下線を付した。このクローンにおいては、示したように成熟 VEGFのコドン162にBamHI部位を生成することにより、ポリヒスチジンタグを成熟 VEGFのコドン161の3'位置でこの遺伝子に含めた。そしてこのポリヒスチジンタ グをこの位置にクローン化したが、これがタンパク質配列の末端にイタリック体 で示すＣ末端タンパク質タグをコードするものである。クローニングの間には、 便宜的に、示したようにEcoRI 部位をBam HI 部位の3'側に形成した。遺伝子の5 '末端には、c-erbB2 の最初の 27 個のコドンがあり、それに続くCPG2アミノ酸2 3〜415がペプチドスペーサーを介して VEGF アミノ酸１〜161及びそれに続くボ リヒスチジンタグに融合されている。停止コドンは●で示す。配列番号17及び18:CPV₁₀₉H₆のＤＮＡ配列及びタンパク質配列 VEGF 及びCPG2の二つのＤＮＡ配列は配列番号13から取られたものである。ペ プチドスペーサーは、二者間、EcoRI 及びKpn1 部位に囲まれた追加のＤＮＡ配 列により生成され。これらがコードするスペーサーペプチドは、タンパク質配列 においてイタリック体で示し、かつ下線を付した。このクローンにおいては、示 したように成熟VEGFのコドン110にBamHI部位を生成することにより、ポリヒスチ ジンタグを成熟VEGFのコドン109の3'位置でこの遺伝子に含めた。そしてこのボ リヒスチジンタグをこの位置にクローン化したが、これがタンパク質配列の末端 にイタリック体で示すＣ末端タンパク質タグをコードするものである。クローニ ングの間には、便宜的に、示したようにEcoRI部位をBamHI部位3'側に形成した。 遺伝子の5'末端には、c-erbB2 の最初の 27 個のコドンがあり、それに続くCPG2 アミノ酸23〜415がペプチドスペーサーを介してVEGFアミノ酸１〜109 及びそれ に続くポリヒスチジンタグに融合されている。停止コドンは●で示す。配列番号19及び20:KDR (BR) のＤＮＡ配列及びタンパク質配列 5'末端において形成したNco1部位の位置、及びコドン809及び810における内在 的なEcoRI部位を示す。シグナルペプチドはタンパク質配列の中の下線を付した 領域として示す。コドン 746〜770 の間に存在する膜貫通領域及びそのタンパク 質配列には下線を付し、かつイタリック体で示す。Ｃ末端 9E10 タグをコードす るために使用されているＤＮＡ配列は小文字で示し、それがコードするタンパク 質配列はイタリック体で示す。この領域は 9E10 エピトープに融合したKDRのア ミノ酸１〜810をコードする。停止コドンは●で示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 5/00 5/00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 マライス，リチャード イギリス国 エスダブリュ３ ６ジェイビ ー ロンドン，フラム ロード 237，ザ インスティテュート オブ キャンサー リサーチ，チェスター ビーティー ラ ボラトリーズ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（a）リガンドと酵素との融合タンパク質またはコンジュゲート、および （b）該酵素により活性薬剤に変換され得るプロドラッグ、 を含んでなる、互いと組み合わせて用いるための二成分系。 ２．前記酵素が細菌性カルボキシペプチダーゼである、請求項１に記載の系。 ３．前記カルボキシペプチダーゼがカルボキシペプチダーゼCPG2である、請求項 ２に記載の系。 ４．CPG2が１以上のグリコシル化部位で改変されて、該１以上の部位でのグリコ シル化が防止されている、請求項３に記載の系。 ５．前記プロドラッグがナイトロジェンマスタードプロドラッグである、請求項 ２〜４のいずれか１項に記載の系。 ６．前記リガンドが血管内皮増殖因子（VEGF）である、請求項１〜５のいずれか １項に記載の系。 ７．リガンドと、プロドラッグを毒薬に変換し得る酵素とを含んでなる融合タン パク質。 ８．実質的に配列番号８、10、12、14、16または18に記載される、または配列番 号７、９、11、13、15または17のＤＮＡによりコードされる融合タンパク質。 ９．請求項８に記載の融合タンパク質およびCPG2により活性薬剤に変換され得る プロドラッグを含んでなる、請求項１に記載の系。 10．ヒトまたは動物体の処置または治療方法において使用するための請求項１〜 ６または９のいずれか１項に記載の系。 11．腫瘍治療用医薬の製造における、腫瘍および細胞に結合することができるリ ガンドと酵素との融合タンパク質またはコンジュゲート、および該酵素により活 性薬剤に変換され得るプロドラッグの使用。 12．（a）リガンドと酵素との融合タンパク質またはコンジュゲート、および （b）該酵素により活性薬剤に変換され得るプロドラッグ、 を含んでなる、互いと組み合わせて用いるための二成分系の調製方法であって 、リガンドと酵素との融合タンパク質またはコンジュゲートを調製し、そして 該融合タンパク質またはコンジュゲートを、該酵素により活性薬剤に変換される プロドラッグと組み合わせて配置することを含んでなる方法。 13．リガンドと、プロドラッグを毒薬に変換し得る酵素とを含んでなる融合タン パク質の調製方法であって、該融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベク ターを含有する宿主細胞を、該融合タンパク質が発現される条件下で培養し、そ して該融合タンパク質を実質的に単離された形で回収することを含んでなる方法 。 14．請求項７または８に記載の融合タンパク質をコードする核酸。 15．請求項14に記載の核酸を含有するベクター。 16．リガンドまたはその断片もしくは誘導体をコードする遺伝子に同じ読み枠で 融合された、１以上のグリコシル化部位が置換、欠失または挿入により改変され ている細菌性カルボキシペプチダーゼ遺伝子を含んでなる、請求項15に記載のベ クター。 17．融合タンパク質発現用の宿主細胞に適合性のプロモーターに機能的に連結さ れた請求項15または16に記載のベクターを含んでなる発現ベクターを含有する宿 主細胞。 18．腫瘍の治療において別個にまたは順次使用するための組合せ製剤としての、 （a）リガンドと酵素との融合タンパク質またはコンジュゲート、および （b）該酵素により活性薬剤に変換され得るプロドラッグ、 を含んでなる製品。 19．腫瘍の治療を必要としている患者に、腫瘍および細胞に結合することができ るリガンドと酵素との融合タンパク質またはコンジュゲート、および該酵素によ り活性薬剤に変換され得るプロドラッグを有効量で投与することを含んでなる、 腫瘍の治療方法。