JP2000504227A

JP2000504227A - ミトコンドリアの翻訳系を用いるタンパク質製造法

Info

Publication number: JP2000504227A
Application number: JP9527666A
Authority: JP
Inventors: パイク、キー―ユング
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-01-29
Filing date: 1997-01-21
Publication date: 2000-04-11
Also published as: AU702370B2; RU2201961C2; EP0888046A4; TWI223665B; EP0888046A1; US20050089532A1; WO1997027742A1; AU1828797A; US20030099669A1; CN1162182C; CN1217632A; CA2244709A1

Abstract

(57)【要約】ミトコンドリアに富む動物器官組織をヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を含むウイルスで感染させ、感染させた組織をインビトロで培養することによってウイルス抗原を製造する方法。ミトコンドリアに富む動物組織を組み換えＨＢＶべースベクターでトランスフェクトさせ、トランスフェクトさせた組織を動的組織培養システムで培養することによってタンパク質を製造する方法。

Description

【発明の詳細な説明】ミトコンドリアの翻訳系を用いるタンパク質製造法優先権主張本出願は、特許法(35 U.S.C.)第119(e)条の下で、1996年１月29日出願の米国暫定特許出願第60/010,717号に対して優先権を主張する。発明の分野本発明は、組み換え核酸分子に基づくタンパク質の発現、特に、宿主組織にウイルスを感染させるか、宿主組織にウイルスベース発現ベクター中の組み換え核酸をトランスフェクトさせて、ミトコンドリアに富む組織での翻訳を利用することによる、インビトロ培養した動物組織におけるウイルスタンパク質を含むタンパク質の製造に関する。背景技術一般に、トランスフェクトさせた核酸からのタンパク質の翻訳は、原核または真核細胞中に存在する普遍的（universal）翻訳系を用いて達成される（Sambroo k et al.,Molecular Cloning,A Laboratory MAnual,2ndEd.,Vol.1-3,Cold Sprin g Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor,NY，1989）。真核細胞に見出されるミトコンドリアは、非普遍的（non-universal）遺伝子コードを用いる内性ミトコンドリアＤＮＡ（mtＤＮＡ）の発現のための転写および翻訳系を有する。しかし、ミトコンドリア翻訳系は、外来性核酸の翻訳に用いられたことはない。ミトコンドリアは、細胞の核の遺伝子系およびミトコンドリア内に含まれる別の遺伝子系の助けを要求する協調プロセスで生長および分裂する多層膜性細胞小器官である（Alberts et al.，Molecular Biology of The Cell，2nd Ed.，pp.3 78-401，Garland Publishing，Inc.，New York，NY)。ほとんどのミトコンドリアタンパク質は、サイトゾル（cytosol）で転写、翻訳されて、ミトコンドリア中に取り込まれる核ＤＮＡによってコードされる。これに対して、ミトコンドリアタンパク質のいくつかは、mtＤＮＡから転写されて、二つのリボゾームＲＮＡおよび２２種のｔＲＮＡを含むミトコンドリア系を用いてこの小器官それ自体の中で翻訳される。ミトコンドリア遺伝子配列とコードされたタンパク質のアミノ酸配列との比較によって、ミトコンドリア内の遺伝子コードは真核細胞の核内およびほとんどの原核細胞内で用いられる普遍的コードと較べて変化していることが明らかになった。例えば、ＵＧＡコドンは普遍的コードではタンパク質合成のための終止コドンであるが、ミトコンドリアではＵＧΛはトリプトファンをコードし、ＡＧＡおよびＡＧＧコドンは普遍的系ではアルギニンをコードするが、哺乳動物ミトコンドリアでは終止コドンである。組み換えＤＮＡは、ミトコンドリア中に輸送されるタンパク質の産生に用いることができる。一発現系では、サル腎細胞（ＣＯＳ−７細胞）にミトコンドリアのフラビン酵素（ＭＣＡＤ）遺伝子のｃＤＮＡを含む発現ベクターをトランスフェトさせた（Jensen et al.，Biochim.et Biophys.Acta 1180; 65-72,1992)。ＲＮＡ転写物およびタンパク質は、トランスフェクトされた細胞の転写および翻訳系を用いて産生された。組み換えＭＣＡＤタンパク質はプロセッシングされ、ミトコンドリア細胞画分中に濃縮され、これは、ＭＣＡＤタンパク質がミトコンドリア中に輸送されて、そこでサイトゾルで産生されたタンパク質からリーダーペプチドが除去されたことを示す。あるウイルスの複製は、細胞性ミトコンドリアまたは感染細胞に見出される多層膜性小胞と関連づけられてきた。インビトロで増殖させて、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）を感染させたサル腎細胞において、ウイルス様粒子がＨＡＶ抗原を含む膜結合小胞封入体に見出された（Asher et al.，J，Virol．Weth．15:323-328 ，1987）。Samliki Forestウイルス（ＳＦＶ）のＲＮＡ合成に要求される燐タンパク質は、燐タンパク質をコードするｃＤＮＡをトランスフェクトさせたＳＦＶ感染細胞およびＣＯＳ細胞中の大きな小胞様構造物に局在化された(Peranen，J. ，J．Gen．Virol．72: 195-199，1991) 。Ｂ型感染ウイルス（ＨＢＶ）複製を阻害するヌクレオシド類似体もまた、薬物への慢性的暴露後にミトコンドリア機能に障害を起こし、これはＨＢＶおよびｍｔＤＮＡの双方のための同様のＤＮＡ複製メカニズムを示唆する。類似体の２' 、３'−ジデオキシ−３'−チアシチジン、５−フルオロ−２'、３'−ジデオキシ −３'−チアシチジンおよび１−（２'−デオキシ−２'−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル（すなわち、フィアルリジン）はＨＢＶ複製を阻害する（Doong et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88: 8495-8499 ，1991; Colacino et al.，Antimicrobial Agents and Chemother．38(9): 1997-2002，1 994）。これらのうち、２'、３'−ジデオキシ-３'−チアシチジンの（＋）鏡像異性体は、単離したミトコンドリアでのインビトロでのｍｔＤＮＡ合成を有意に阻害することが示されてきた（Chang et al.，J．Biol．Chem．267(31): 22414- 22420，1992）。ＨＢＶは、肝臓、膵臓および唾液腺を含むミトコンドリアを多量に含む器官中に容易に見出されるが、ミトコンドリアをほとんど含まないＨＢＶをトランスフェクトさせた細胞系では、ＨＢＶウイルス粒子および抗原を検出することは難しい。さらに、ＨＢＶｅタンパク質（ＨＢｅ）を作らない細胞系はまたデーン粒子（Dane particles）も産生しないことから、いくらかのＨＢＶ抗原がウイルス複製に要求されることも考えられる。これは、従来の組織または細胞培養中においてミトコンドリアがしばしば損傷を受け、その結果、培養細胞中のＨＢＶの増殖が制限されるからとも考えられる。ミトコンドリアに富む細胞の従来の細胞培養中でのミトコンドリア損傷の一因は低酸素であるようである。ある細胞系（例えば、修飾した成人肝細胞、肝芽球腫細胞および胎児肝細胞など）は、従来の組織培養システムにおいてＨＢｅ抗原を産生することが見出された（Gripon et al. ，Virol．192: 534-540，1993; Ochiya et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 8 6:1875-1879，1989）。そのような細胞系は、従来の組織培養法を用いてＨＢｅ産生ができるに充分なミトコンドリアを含む可能性がある。最近、ＨＢＶ遺伝子を導入した（トランスジェニック）マウスがつくられて、ＨＢＶタンパク質のアセンブリー、輸送、分泌および他の機能的性質を調べるのに用いられてきた（Guidotti et al.，J．Viroｌ．69: 6158-6169，1995; Araki et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86: 207-211，1989）。そのようなトランスジェニックマウスにおいて産生されるＨＢｅ抗原は、トランスジェニックをつくるために使用されたプラスミドまたはミトコンドリアに入るこれらプラスミドから産生されたＲＮＡの結果である可能性がある。プラスミドがミトコンドリアに入るという可能性は、ミトコンドリア膜構造がある条件下で核酸を通過させる他の膜の構造と類似しているという事実に基づく。高レベルＨＢＶ複製は、末端重複ゲノムより大きな長さのＨＢＶ構築物を含むいくつかのＨＢＶトランスジェニックマウスの肝臓および腎臓組織に見出された（Guidotti et al.，J，Virol．69: 6158-6169，1995）。ヒト、細胞系、またはウイルス粒子を産生するトランスジェニック動物において、活発に複製しているＨＢＶはまた、常にＨＢｅも産生する（Chisari，F.V. ，Hepatology 22: 1316-1325，1996）。普遍的およびミトコンドリア翻訳系の双方ともに、完全に機能するＨＢＶの複製に必要であるという可能性がある。肝細胞では、ほとんどの可溶性ＨＢＶ抗原が培養肝組織のミトコンドリア画分に見出されることから、より多くのＨＢＶ抗原が普遍的翻訳系よりもミトコンドリア翻訳系を用いて産生されるようである（Paik et al.，Abstract，Am.Assoc．for t he Study of Liver Diseases，1995）。しかし、ミトコンドリアは従来の組織培養システムでしばしば損傷を受けることから、インビボでのウイルスのアセンブリーおよび／または免疫反応へのミトコンドリア翻訳系の寄与についての判定を下すのは困難だった。従来の組織培養法に伴うミトコンドリアの損傷はまた、細胞培養を用いてインビトロでＨＢＶを増殖させるのがなぜ難しかったかを説明するかも知れない。肝臓組織の生存力が制御された条件下で約２４〜４８時間維持できる動的器官培養システムが明らかにされた（Smith，P.F.，et al.，Ljfe Sci．36: 1367,1 985;S.S．Park，Inje Med.J.14(3): 363-369，1993）。インビトロ胸腺器官培養の使用は、可能な抗ウイルス剤の確認法と関連して記述された（公開ＰＣＴ出願 WO9505453）。本発明は、真核細胞ミトコンドリア翻訳系を用いてウイルス抗原を製造するために、ヒトＨＢＶまたはＨＣＶ等のウイルスで効率よく感染される動物組織をインビトロ培養するために生理的培養システム（韓国ソウルのLeema Pharmedから入手可能）を使用する。このシステムはまた、組み換えＤＮＡを含むヒト肝炎ウイルスベースベクターを培養細胞にトランスフェクトさせることによって、ミトコンドリアで翻訳され得る他の非ミトコンドリア性タンパク質の製造にも使用できる。好ましいベクターには、ＨＢＶおよび/またはＨＣＶ配列に相補的なＤＮＡに由来するＤＮＡが含まれる。発明の概要本発明は、培養動物組織におけるウイルス抗原の製造法であって、インビトロ培養において宿主組織として供される動物からの器官組織を供給する工程（ここで宿主組織はミトコンドリアに富む）；宿主組織にウイルスをインビトロ感染させる工程；感染宿主組織をインビトロ培養して、宿主組織中のミトコンドリア翻訳系を用いてウイルスタンパク質を製造する工程；および感染及び培養後の宿主組織からウイルスタンパク質を分離する工程を含む製造法を提供する。本製造法の一実施態様において、宿主組織は、肝臓、腎臓、膵臓および唾液腺からなる群から選択される器官組織から分離される。別の実施態様においては、動物は、ヒト、ラット、マウス、イヌ、ニワトリおよびカエルからなる群から選択される。好ましい実施態様では、ウイルスは、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよび脳炎ウイルスからなる群から選択されるヒトウイルスである。一実施態様において、ウイルス抗原は、宿主組織のミトコンドリア中で産生される。好ましい実施態様では、製造法はさらに、分離したウイルス抗原を動物に導入して免疫応答を誘発する工程を含む。別の好ましい実施態様では、ワクチンへの使用に適するウイルス抗原が本製造法によって製造される。本発明はさらに、培養動物組織におけるタンパク質の製造法であって、インビトロ培養において宿主組織として供される動物からの器官組織を供給する工程（ここで宿主組織はミトコンドリアに富む）；宿主組織にウイルスＤＮＡおよび組み換えＤＮＡを含むＤＮＡベクターをインビトロでトランスフェクトさせる工程 ; トランスフェクトされた宿主組織をインビトロ培養して、該宿主組織中のミトコンドリア翻訳系を用いてトランスフェクトされたＤＮＡベクターによってコードされたタンパク質を製造する工程；および培養してトランスフェクトされた宿主組織からトランスフェクトされたＤＮＡベクターによってコードされたタンパク質を分離する工程を含む製造法を提供する。本製造法の一実施態様において、宿主組織は、肝臓、腎臓、膵臓および唾液腺からなる群から選択される器官組織から分離される。別の実施態様においては、動物は、ヒト、ラット、マウス、イヌ、ニワトリおよびカエルからなる群から選択される。好ましい実施態様では、ウイルスＤＮＡは、ヒトＢ型肝炎ウイルスＤＮＡである。本製造法はさらに、宿主組織をヘルパーウイルスで感染またはトランスフェクトさせる工程を含んでもよい。好ましい一実施態様では、タンパク質は宿主組織のミトコンドリア中で産生される。別の実施態様は、本製造法によって製造されるワクチンへの使用に適するタンパク質である。好ましい実施態様には、ウイルスＤＮＡがヒト型肝炎ウイルスＤＮＡであって、ＤＮＡベクターが非構造ウイルスタンパク質をコードするヒトウイルスＤＮＡ配列中に挿入された組み換えＤＮＡを含むことを特徴とする本発明の方法によって製造されるタンパク質を含む。図面の簡単な説明図１は、組織サンプルのインビトロ自動化培養のための装置を示す。図２は、ＨＢＶベース発現ベクターを図式的に示す。発明の具体的説明本発明は、従来の組み換えＤＮＡ技術では容易に製造できない天然タンパク質およびウイルスからのタンパク質を製造する方法であって、自動化動的培養システムに保持された多量のミトコンドリアを含む細胞中でウイルス核酸をインビトロ翻訳させる製造法である。本発明は、インビトロ保持された組織を種間ウイルス感染させて、感染しているウイルスからのタンパク質製造を可能にする。これは、動物細胞におけるヒトウイルスの翻訳に特に重要であるが、ヒトまたは非ヒトウイルスとヒトまたは非ヒト組織を宿主組織として用いる細胞の種間感染にもまた有用である。例えば、ラット肝臓の薄片をヒトＨＢＶで感染させ、その肝臓組織を自動化動的培養システムに保持することができ、それによってウイルス抗原のインビトロ発現が可能になる。器官組織は、標準的外科的手法を用いてラットなどの動物から分離された。一般に、肝臓、腎臓、膵臓または唾液腺などの器官は、ミトコンドリアに富むことが知られているものであった。組織を約２ｃｍ²で２６０μｍの厚さの薄片に切り、その組織薄片を培養培地中でウイルスと培養することによってＨＢＶなどのウイルスに感染させた。ＨＢＶは、感染したヒト患者から得られた生検肝臓組織から得た。Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、脳炎ウイルスおよび同様の動物ウイルスなどの他のウイルスをＨＢＶの代わりに用い得ることは、当業者には理解できよう。対照として、ウイルスに暴露されなかった同タイプの動物組織の薄片を培地中で培養した。感染した器官薄片を、自動化器官培養システムで培養した。図１に示すように、この培養システムでは、培養管１２の内側に入れた多孔性容器１１中で組織薄片１０を培養し、ここではこの培養管１２が回転したときに組織が組織培養培地１５中に周期的に浸漬するようになっている（矢印）。培養管１２内のガス交換は、培養管１２の末端に位置する開口１３、１６を通して培養管中にガス混合物が導入されるように一定間隔で行った。分析のためのサンプル採取や培地や他の試薬の導入は、培養管１２の壁に位置するサンプル採取口１４を介して行った。培養システムは、インキュベーターに入れて、３７℃の恒温に保った。組織薄片の培養は、３７℃で、修飾Waymouth MB 752/1培養培地中で、ｐＨ７．０で、５％ＣＯ₂と９５％Ｏ₂のガス混合物の１．６〜２気圧下で行ったが、他の培地およびガス混合物が同様に使用できることは当業者には明らかであろう。ウイルス感染した組織の培養は、一般に約１〜４８時間、好ましくは約２４時間行った。培養完了後、組織を集めて、当業者に公知の標準的方法を用いて分析またはタンパク質調製に使用した。例えば、標準的免疫化学的方法を用いて、組織を切片にして抗ＨＢｓＡｇ抗体で染色することによって感染組織のＨＢＶタンパク質をモニターした。一般に、培養２４時間以内に、ウイルスタンパク質が動物細胞中に検出された。感染組織は抗ＨＢｓＡｇ抗体で不均一に、すなわち、組織のミトコンドリアに富む領域は組織の他の部分よりも濃く染色された。対照組織は、バックグラウンド染色のみが見られた。ウイルス感染動物組織の切片を電子顕微鏡を用いて調べたところ、ウイルスタンパク質を含む多層膜性ミトコンドリア様小器官が検出され、これは、ウイルス感染効率が動物組織中のミトコンドリアの濃度と関連していたことを示した。このように、抗ＨＢｓＡｇ抗体による組織の強い免疫染色は、ウイルス複製ができるに充分なミトコンドリアを有する動物器官においてＨＢＶが感染および複製できることを示すことから、ヒトウイルスの動物組織への種間ウイルス感染がＨＢＶを用いて明らかにされた。ＨＢＶで感染させて６〜２４時間後に電子顕微鏡によって調べた感染ラット肝臓組織は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）およびコア抗原を特異的に認識する免疫化学を用いて確認されたＨＢｓＡｇを大量に含む二重膜を有する小器官を含んでいた。免疫染色構造物のいくつかは、ミトコンドリアの破れたクリスタ区分と似ていた。ミトコンドリアは細胞質翻訳系とは別に翻訳系を有することが知られていることから、ミトコンドリア様小器官中のＨＢｓＡｇの存在は、タンパク質がミトコンドリア翻訳系によって翻訳されたことを示唆した。そのような翻訳では、細胞性細胞質における普遍的コドン使用系を用いての同じＲＮＡの翻訳と比較して、異なる分泌抗原がＨＢＶから産生されることが考えられる。感染ラット組織から分離したＨＢＶタンパク質は、標準的ポリアクリルアミドゲル電気泳動でのウイルスタンパク質のプロフィールを示し、これは標準的組み換えＤＮＡ技術によって産生されたＨＢＶタンパク質よりもより複雑である。免疫染色の結果は、本方法によって製造されたＨＢＶタンパク質は標準的細胞性リボゾーム翻訳系よりもむしろミトコンドリア翻訳系を用いて翻訳されたことを示唆する。このように、本方法を用いて製造されるタンパク質は、普通の感染中に産生されるウイルスタンパク質により近く、したがって、感染中に起きると同じような抗原的性質を有する。本方法を用いて製造されるそのようなタンパク質は哺乳動物中での免疫応答を起こすのに使用することができ、その抗原決定基は、細胞性リボゾーム翻訳に依存する標準的組み換えＤＮＡ技術を用いて産生したタンパク質上の決定基よりも感染中に産生されたものにより近似している可能性がある。本発明はまた、ウイルスベースベクター内に含まれるクローニングされたＤＮＡからタンパク質を製造する方法を含み、ここでは、翻訳はベクターがトランスフェクトされたミトコンドリアに富む動物細胞内でインビトロで行われ、細胞は自動化動的培養システム内に保持される。効果的なＨＢＶベース発現系を用いて、ミトコンドリアに富む組織における翻訳によってタンパク質を産生する。本発明のこの実施態様では、ＨＢＶ構造遺伝子に挿入されたクローニングされたコード化されたＤＮＡ配列を含むＨＢＶベース発現ベクターを用いて、好ましい自動化培養システムを用いてインビトロ培養されたトランスフェクトされた動物器官組織中で、クローンニングされたＤＮＡの遺伝子を発現させる。二本鎖ＨＢＶＤＮＡ（「マイナス」鎖および「プラス」鎖ＤＮＡ配列を含む）は、標準的分子生物学的方法を用いて他のコード化ＤＮＡ配列が挿入できるような環状ＤＮＡベクターを構築するのに用いられる。ＨＢＶベースベクターはまた、ＤＮＡの増幅のための原核細胞におけるウイルスの複製を可能にする原核細胞プラスミドからの配列を含む。ベクターは薬剤耐性遺伝子を含んで、これによりトランスフェクトされた細胞の選択マーカーが提供される（例えば、ハイグロマイシンＢ耐性）。挿入されたコード化ＤＮＡ配列は、トランスフェクトされた動物細胞における複製が要求されないＨＢＶ構造遺伝子に挿入される。挿入されるコード化ＤＮＡ配列は他のウイルス遺伝子配列、真核細胞遺伝子、ｃＤＮＡ、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅されたＤＮＡまたは合成ＤＮＡ配列でもよく、挿入は標準的分子生物学的方法を用いて、すなわち、挿入されるＤＮＡを切り出して、ＨＢＶ配列からの発現が可能なように正しい枠および方向に配置することで達成される。ＨＢＶ複製が、末端重複ゲノム長よりも大きいＨＢＶ構築物を含むあるトランスジェニックマウスの肝臓および腎臓組織中に見出された（Guidotti et al.，J ．Virol．69: 6158-6169，1995）ことから、これらの結果は、トランスジェニック構築物は核よりもむしろミトコンドリアにトランスフェクトされていたことが示唆される。このように、ゲノム長よりも大きいＨＢＶを含む組み換え構築物はまた、本システムを用いてのインビトロ保持された組織へのトランスフェクションにも有用であり、本製造法に関してここで検討した構築物と機能的に同等であると考えられる。本発明は、好ましい実施態様を例示する以下の実施例によって一層よく理解することができる。実施例１ラット腎臓組織のインビトロＨＢＶ感染雑種白ラットを常法でエーテルで麻酔して、当業者に公知の方法を用いて腹部を外科的に開いた。次いで、大動脈を切って潅流できるようにした後に、冷却した（約４℃）ウィスコンシン溶液（Viaspan，DuPont）１０ｍｌを大動脈に注入した。無血領域から腎臓を除去して、冷却したウィスコンシン溶液（約４℃）中で保存した。腎臓組織薄片（例えば、２ｃｍ²、厚さ約２６０μｍ）を調製して、冷却した培養培地中で保存した。薄片を、感染したヒト患者から得られた生検肝臓組織から得られたＨＢＶとともにインキューベートした。ＨＢＶ接種原は、Ｂ型肝炎表面抗原血症を有する患者からのヒト肝臓生検肝臓組織を修飾 WaymouthM B 752/1培地に３７℃で３時間保持することによって調製した。生検サンプルを３時間後に除去し、次いで、ラット器官組織薄片を培地で培養する。一般に、生検組織の培地に対する割合は、５〜２ｇの組織に対して培地１０ｍｌであった。対照として、ラット腎臓組織の薄片を、ヒト肝臓生検組織に暴露しなかった培地中で培養した。感染腎臓器官薄片を、図１に示した自動化器官培養システム中で培養した。すなわち、削取した器官組織薄片１０を多孔性容器１１の内側に置いて、これをガス、培地、増殖因子などを入れるための少なくとも一つの開口１３を有する回転可能な培養管１２の内側に入れる。多孔性容器１１は、例えばプラスチックメッシュ、ナイロンメッシュまたは半透過性膜などの不活性物質で作られるがこれら物質には限られず、ステンレススチールメッシュで、四角または長方形箱形で、平均孔サイズ約１００〜５００μｍを有するものが好ましい。培養管１２には、組織培養培地１５のサンプルを取り出すための再封可能なサンプル採取口１４が含まれる。サンプル採取口１４はまた、培地１５、ウイルス粒子、増殖因子、および組織サンプルをインビトロ処理するための他の培養試薬や物質の注入にも用いることができる。培養管１２が回転したとき、器官組織１０は組織培養培地１５中に周期的に浸漬される。多孔性容器１１の箱形は、培養管１２が回転したときに、周りを回転する培養管とともに一つの位置に留まる容器よりも試料の回転を促進する。培養管１２内のガス交換は、一定間隔で、ガス混合物を開口１３に導入し、ガスを培養管１２の出口１６を通して排出することによって行われる。培養管１２は３７℃の恒温の保たれる（例えば、図面に示されていないインキュベーターなどの中で）。器官培養プロセスは、全培養期間を通して同一の条件下で細胞が維持されるように自動化されることが好ましい。組織薄片は、３７℃で、修飾Waymouth MB 752/1培養培地中で、ｐＨ７．０で、５％ＣＯ₂および９５％Ｏ₂のガス混合物の１．６〜２気圧下で培養される。培養培地は、Waymou th MB752/1粉体培地（ギブコ社製）、１０％ウシ胎児血清、２．２％重炭酸ナトリウム、２５ｍＭＤ−グルコース、１μｇ／ｍｌの結晶ウシ亜鉛インスリン、５０Ｕ／ｍｌペニシリンと５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ギブコ社製）を含む抗生物質混合物および蒸留水から調製された。ガス交換は２．５分間隔で行い、図１に示した培養管を回転させて組織を培養培地中に４．５回／分浸漬させた。ＨＢＶ感染した腎臓組織の培養は、通常、約１〜４８時間、好ましくは約２４時間行った。次いで、組織を標準的免疫化学的方法を用いて、すなわち、組織を切片にして抗ＨＢｓＡｇ抗体（Sigma，St．Louis，MOから購入）で染色処理して、感染した組織中のＨＢＶの存在を決定した。一般に、培養２４時間以内に、ＨＢｓＡｇは腎臓細胞に検出された。感染した腎組織は抗ＨＢｓＡｇ抗体で不均一に、すなわち、ミトコンドリアに富む近位尿細管は比較的ミトコンドリアに乏しい遠位尿細管に較べてより濃く染色された。ＨＢＶ感染ラット腎組織の切片を電子顕微鏡を用いて調べたところ、ＨＢｓＡｇを含む多層膜性ミトコンドリア様小器官が遠位尿細管よりも近位尿細管に有意に高濃度で検出された。すなわち、ＨＢＶ感染効率は動物組織中のミトコンドリアの濃度と関連している。これらの結果はまた、種間ウイルス感染の現在の概念に反して、ＨＢＶの複製を可能にするに充分なミトコンドリアを有する動物器官においてＨＢＶが感染および複製できることを示す。上記自動化培養システムを用いて、ラット肝臓組織に加えて、イヌ、マウス、ニワトリおよびカエルからの肝臓組織の培養に成功した。当業者には、そのような動物組織もまた、ＨＢＶ、またはミトコンドリアに富む組織に感染してこのインビトロシステムでウイルス複製ができるような他のヒトまたは非ヒトウイルス（例えば、Ａ型およびＣ型肝炎または脳炎ウイルス）で感染され得ることは理解されよう。そのような動物組織には、ヒトウイルスまたは動物ウイルスで感染されたヒト組織も含まれることは当業者には理解されよう。実施例２ラット肝臓組織のＨＢＶ感染はミトコンドリア小器官に局在する肝臓除去に関して記述した実施例１と実質的に同様にして、雑種白ラットから肝臓組織を外科的に除去した。実施例１と実質的に同様にして肝臓組織を薄片にしてＨＢＶで感染させた。次いで、感染ラット肝臓組織を自動化培養システムで約２４時間培養して、当業者に公知の手法を用いてＨＢｓＡｇおよびＨＢＶｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）を認識する酵素連結イムノソルベント法（ELISA）（すなわち、アボットラボラトリーから入手可能なＨＢＶ ELISAキット）を用いてこれら抗原の存在を調べた。感染組織には、更に標準的サザン・ブロット法を用いたＤＮＡハイブリダイゼーションによるＨＢＶＤＮＡに関する分析も行われた（本質的には、Guidotti et al.，J．Virol．69: 6158-6169，1995と同様）。感染ラット肝臓組織は、まず、標準的細胞分画法（実質的には、Jensen et al .，Biochim．et Biophys．Acta 1180: 65-72，1992と同様）を用いて、細胞質可溶性（サイトゾル）画分とミトコンドリアを含むペレットに分画した。すなわち、感染組織薄片を緩衝液（０．２５Ｍスクロース、０．１ｍＭＥＤＴＡおよび１ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．４）中で均質化して、低速（７００×ｇ）で遠心分離して、核および未崩壊細胞（核画分）を除去した。上清を高速度（12,000× ｇ）で遠心分離して、ミトコンドリア画分（ペレット）とサイトゾル画分（上清）とを分離した。次いで、核、ミトコンドリアおよびサイトゾル画分について、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇの存在を、これら二つの抗原を検出するELISA法を用いて調べた。ミトコンドリア画分には、核またはサイトゾル画分に見出されるよりも、少なくとも１０倍多くのＨＢｓＡｇが含まれていた。ＨＢｅＡｇは、ミトコンドリア画分にのみ検出され、核またはサイトゾル画分には見出されなかった。これらの結果は、ＨＢＶは、ラット肝臓組織において主にミトコンドリアまたは一緒に分画されたミトコンドリア様小器官で複製され、僅かに限られたＨＢＶ複製のみが細胞核で起きることを示す。標準的ゲル分離およびＤＮＡハイブリダイゼーション技術を用いて、２．１Ｋｂ以下のＨＢＶＤＮＡからなる複製複合体がミトコンドリア画分に見出された。サイトゾル画分にはＨＢＶＤＮＡは検出されず、少量（ミトコンドリア画分で見出された量の約１０％以下）が核画分に見出された。実施例３ヒト血漿から分離されたＨＢｓＡｇと組み換えＤＮＡから産生されたＨＢｓΛとの比較ヒト血漿に由来するワクチン（韓国ブルークロスから得られた Hepavax）中のＨＢｓＡｇと組み換えＤＮＡ技術によって製造されたＨＢｓＡｇ（韓国、ソウルのJEIL-JEDANGから入手）とをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ −ＰＡＧＥ）を用いて比較した。タンパク質を４０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．８）、１％ＳＤＳ、０．３５％β−メルカプトエタノール、５％グリセロールおよびブロモフェノールブルーを含む緩衝液に溶解して、５分間煮沸した後に、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で標準法（Laemmli，U.K.，Nature 227: 680-685，19 70）を用いて分離した。電気泳動後、タンパク質を公知の方法および抗ＨＢｓＡｇ抗体（Sigma，St．Louis，MOから入手）を用いてイムノブロットした。組み換えＤＮＡ技術によって製造されたＨＢｓＡｇは、２３Ｋｄに単一バンドのみを示したが、ヒト血漿から分離されたＨＢｓＡｇは、約２０Ｋｄから約３０Ｋｄの広いシミ状のバンドで表面抗原の広範なスペクトルを示した。これらの結果は、組み換えＤＮＡ技術によって産生される単ータンパク質に対して、天然に産生される多くのＨＢＶ抗原はミトコンドリア内でコア抗原遺伝子およびミトコンドリアに独特なコドンを使用して産生される可能性があることを示唆する。血漿由来のワクチンは組み換えＤＮＡ技術によって製造されたワクチンよりも一般により効果的であることから、これらの結果はまた、感染中に産生された複数の異なるかたちのＨＢＶ表面抗原は、個々にあるいは総合して、組み換えＤＮＡ技術によって製造された単一のＨＢＶ抗原よりも良好な免疫原となり得ることを示唆する。実施例４ミトコンドリア翻訳系を用いてのミトコンドリアにおけるＨＢｓＡｇ産生哺乳類ミトコンドリアのコドン使用系においては、コドンＡＧＡおよびＡＧＧは翻訳終結のための終止コドンとして使用される。コアＨＢｓＡｇの遺伝子は、ＡＧＡおよびＡＧＧコドンを含むが、それらはコア抗原タンパク質を成熟ＨＢｓＡｇにプロセシングするための切断部位と考えられてきた。しかし、哺乳動物ミトコンドリア中で翻訳された場合、コアＨＢｓＡｇの遺伝子はΛＧＡおよびＡＧＧコドンで自然に終結する。ミトコンドリアの遺伝子コドン法則に基づくと、ＨＢｓＡｇ遺伝子にはいくつかの他の予測される開始および終止コドンがある（表１に一覧）。同一の決定をｐｒｅ−Ｓ１およびｐｒｅ−Ｓ２と称するＨＢＶタンパク質およびコア抗原（ＨＢｃＡｇ）をコードする遺伝子に関して行い、これら開始および終止コドン座も表１に示す（ＨＢＶタンパク質の一般的検討に関しては、Lau and Wright，Lancet 342: 1335-1340，1993を参照されたい）。ラット肝臓組織を実質的には実施例２と同様にしてＨＢＶに感染させて、感染したラット組織を１２〜４８時間インビトロ培養する。培養後、感染ラット組織を集めて、４０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．８）、１％ＳＤＳ、０．３５％β−メルカプトエタノール、５％グリセロールおよびブロモフェノールブルーを含む緩衝液に溶解した。溶解物を５分間煮沸してから、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド上で標準法（Laemmli，U.K.，Nature 227: 680-685，1970）を用いる電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離した。比較のために、組み換えＤＮＡ技術によって調製したＨＢｓＡｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の隣接列に対照として含めた。電気泳動による分離の後、公知の方法でタンパク質を抗HＢｓAＡｇ体を用いてイムノブロットして検出した。インビトロ増殖させた感染ラット組織で産生されたＨＢｓＡｇは、ＨＢＶに慢性感染したヒトの血漿に検出されるものと類似する約２０Ｋｄから約３０Ｋｄのタンパク質を含む。このように、ミトコンドリアに富む組織でのＨＢＶ遺伝子のインビトロ翻訳は、感染したヒトで天然に産生されるＨＢＶ抗原によく似た多様な分泌抗原を産生する。これに対して、組み換えＤＮＡ技術によって産生されるＨＢｓＡｇは約２３Ｋｄの単一バンドとして現れる。ラット肝臓のインビトロ感染によって産生された多様なＨＢｓＡｇタンパク質は、ＨＢＶ感染に対するワクチンとしての使用のために分離される。表１ ¹ ＨＢＶのサブタイプ「ａｄｒ」に見出された。² ＨＢＶのサブタイプ「ａｄｗ」および「ａｙｗ」に見出された。³ これはＨＢｅＡｇの終末コドンを表す。以前には、血漿または細胞質のプロテアーゼの切断部位と推定された。実施例５ＨＢＶベース発現ベクターを用いてのトランスフェクトされた動物組織におけるタンパク質の製造効果的なＨＢＶベース発現系は、ミトコンドリアに富む組織中での翻訳に依存するタンパク質の製造にも同様に使用できる。すなわち、ＨＢＶベース発現ベクターは、実施例１および２と同様にして、インビトロ培養しトランスフェクトされたラット器官組織でのクローニングされたＤＮＡの遺伝子発現を行うのに使用できる。ＨＢＶは、「マイナス」鎖とそれより短い「プラス」鎖からなる３２００塩基のゲノムを有するＤＮＡベクターで、両鎖は構造タンパク質およびウイルス複製に必要なタンパク質をコードする部分二重鎖環状ＤＮＡを形成する（Lau and Wr ight，Lancet 342: 1335-1340，1993）。ＨＢＶベースベクターは、原核細胞プラスミドｐＢＲ３２２からの配列、ＨＢＶ複製開始点、末端を切ったＨＢＶポリメラーゼ遺伝子および薬剤耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシンＢへの耐性を付与するＨＳＶチミジンキナーゼ調節配列の制御下のハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子）を含む。図２に示すように、ｐＨＢＶｅｘと称するＨＢＶベースベクターは、大腸菌（ Escherichia coli）等の原核細胞でのベクターの複製を可能にするベクターｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（「ｐＢＲ」で表示）、大腸菌で発現された場合にアンピシリン耐性を示す配列（「ＡｍｐＲ」で表示）、遺伝子発現真核細胞にハイグロマイシンＢ耐性を付与するＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター（「ＨＳＶＴＲｐｒｏ」で表示）配列および終止配列（「ＨＳＶＴＫ」で表示）の制御下にあるハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（「ＨＹＧ」で表示）、末端を切ったＨＢＶポリメラーゼ遺伝子（「ＨＢＶｐ」で表示）の制御下で発現されるタンパク質をコードするゲノムまたはｃＤＮＡ配列であり得る挿入ＤＮＡ配列（「ｉｎｓＤＮＡ」で表示）からなる。ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子の末端切断および外来ＤＮＡの挿入は、複製およびパッケージングのための末端タンパク質とｐｒｅ−Ｓ１遺伝子の始まりとの間の領域で起きる。プラスミドの残りは、ＨＢＶ「マイナス」鎖ＤＮＡ（「ＨＶＢ−」で表示）と、逆転写、合成プライマーからのＤＮＡ重合およびＨＢＶ「マイナス」鎖を表す二本鎖ＤＮＡのベクターの残り部分への連結を含む標準的分子遺伝学的手法によって作出されたその標準的相補的ＤＮＡ配列とからなる（Sambrook et al.，Molecular Clonjng，A Laboratory Manual(2nd Ed.),Bol．1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989）。ｐＨＢＶｅｘベクターにおいて、ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子のコード配列の一部は、ＨＢＶ調節配列からの発現ができるように挿入ＤＮＡを正しい枠および方向に位置するための制限酵素消化および連結の標準的分子生物学的方法（Sambro ok et al.，Molecular Cloning，A Lahoratory Manual，2nd Ed.、Vol．1-3,Co ld Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989）を用いて外来性ＤＮＡ配列（ウイルスまたは真核細胞遺伝子、ポリメラーゼ連鎖によって増幅されたｃＤＮＡまたはＤＮＡのいずれか）で置き換えられる。環内側の矢印は、ＤＮＡ配列の方向（転写の方向）を示す。同等のｐＨＢＶｅｘベクター（図示なし）における他のＤＮＡ配列には、他の原核細胞ベクター由来の配列、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスまたはエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、単純庖疹ウイルス（ＨＳＶ）および脳炎ウイルスを含む他のウイルスからの配列を含むことができる。他のＨＢＶベース発現ベクターが図２に図示したベクターに相当するものとして代替できることは当業者には理解できよう。例えば、ｐＨＢＶｅｘと同様であるが、ベクター中の重複する単一ＨＢＶゲノムより大きい構築物は、重複するＨＢＶ構築物を含むトランスジェニックマウスにおいて得られた結果に類似の複製または遺伝子発現に最適であり得る（Guidotti et al.，J．Virol．69: 6158-6169，1995)。さらに、ｐＨＢＶｅｘベクターまたは同等のベクターを用いてのトランスフェクションにはまた、ベクターＤＮＡの複製または遺伝子発現を促進または増強するためのヘルパーウイルスによる共トランスフェクションまたは感染も含まれることは当業者には明らかであろう。動物組織は、実質的には実施例１および２と同様にして、ミトコンドリアに富む器官から分離してインビトロ培養用に調製する。挿入ＤＮＡを含むｐＨＢＶｅｘベクターをミトコンドリアに富む組織に標準的トランスフェクション法を用いてトランスフェクトさせる。この方法には、リン酸カルシウム沈澱、ｐＨＢＶｅｘ−ｉｎｓＤＮＡ構築物を含む細菌プロトプラストとの組織細胞の融合、ｐＨＢＶｅｘ−ｉｎｓＤＮＡ配列を含むリポゾームを用いた組織の処理、ＤＥＡＥデキストラン促進トランスフェクション、エレクトロポレーションおよびＤＮＡのマイクロインジェクションなどが含まれる。トランスフェクトされた組織薄片を実質的には実施例１と同様にして自動化システムでインビトロ培養して、トランスフェクトされたＤＮＡのミトコンドリアに富む組織における発現によってタンパク質を製造する。タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィーを含む種々の標準法のいずれかを用いて精製する。ＨＢＶベース発現系を用いて、ミトコンドリアに富む組織に感染するウイルス（例えば、他の肝炎ウイルスまたは脳炎ウイルス）の自然感染中に産生されるものと類似する他のウイルス抗原を製造して、これら病原体のための効果的ワクチンをつくることも可能である。実施例６ＨＢＶベース発現ベクターを用いるトランスフェクトさせた動物組織におけるヒトＨＣＶ抗原の製造動的組織培養システム中の動物組織におけるＨＣＶの直接培養は充分なＨＣＶ抗原を得るにはまだ非効率的な方法であることから（例えば、ＨＣＶは比較的緩慢に複製される）、他のウイルスをベースとしたベクターの使用はインビトロでのＨＣＶ抗原製造のための有効な選択である。ｐＨＢＶｅｘベクターは、ヒトＣ型肝炎ウイルスの抗原をコードする遺伝子をミトコンドリアに富む細胞に移し、実質的には実施例５と同様にしてミトコンドリア翻訳系を用いて天然抗原を製造するために使用される。Ｃ型肝炎ウイルスはＲＮＡウイルスであることから、Ｃ型肝炎表面抗原（ＨＣｓＡｇ）をコードするＲＮＡ配列はまず、当業者に公知の技術（Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Lahoratory Manual(2ndEd.),vo l.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989)を用いてｃＤＮＡに逆転写される。ＨＣｓＡｇｃＤＮＡは、ベクタ−ＤＮＡの制限消化およびＨＣｓＡｇをコードする二本鎖ｃＤＮＡの連結（適当な制限酵素切断部位および平滑末端連結を用いて）の標準的技術を用いてｐＨＢＶｅｘベクターの末端を切断したＨＢＶポリメラーゼ遺伝子中に挿入される。ｐＨＢＶｅｘ−ＨＣｓＡｇ構築物をラット肝臓組織の分離薄片中にトランスフェクトさせて、実質的には実施例１、２および５に記述された方法を用いて２４〜４８時間インビトロ培養する。２４〜４８時間の培養後、組織を取り出し、トランスフェクトされた組織中で産生されたＨＣｓＡｇタンパク質をＨＣｓＡｇタンパク質に結合する抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーを含む標準的タンパク質精製技術を用いて精製する。本発明は、ミトコンドリアに富む細胞で天然に産生されるタンパク質（例えば、肝臓または膵臓で産生されるタンパク質）を製造するために有用な方法を含む。本発明の翻訳方法は、ミトコンドリア中で翻訳される天然の非ミトコンドリアタンパク質の製造に使用することができる。これは、ミトコンドリア翻訳に依存するプロセシングまたはコドン認識などの免疫原性特徴を有するタンパク質の製造のためにとくに重要であり得る。すなわち、本発明は、ミトコンドリア中で複製されるウイルスの天然抗原、または従来の組織培養法で培養された場合に複製が遅すぎるウイルスの天然抗原または従来の組み換えＤＮＡ技術では製造できないウイルスの天然抗原の製造に有用である。感染病原体、特にヒト感染病原体からのタンパク質をインビトロのシステムで製造するニ−ズがある。種間感染は、同種からの望ましくない産生物によって所望の産生物が汚染される危険性を少なくすることから、好ましい。例えば、感染病原体の増殖をヒト細胞に依存しないヒト感染病原体による感染方法は、他のヒト感染病原体（例えば、ヒト組織中に存在するＨＩＶ）による汚染の危険性を少なくする。同様に、ヒト感染を効果的に真似てヒト感染中に産生されるものと類似する免疫原を製造するようなインビトロシステムのニ−ズがあり、これは組み換えＤＮＡからのタンパク質製造に用いられる従来の技術では可能と思われない。本発明は、トランスフェクトされた動物細胞のミトコンドリア中で他の非ミトコンドリアタンパク質を産生させるに有用な組み換えＨＢＶベースベクターを用いる、タンパク質製造法を提供する。本発明はまた、疾患を予防してヒトのウイルス感染によって起きる病状の現在の治療法を改善するための新治療法の発見に有用なウイルスのインビトロシステムでの増殖を可能にする。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年８月２１日（１９９７．８．２１）【補正内容】請求の範囲１．ウイルス抗原のインビトロ製造法であって、次の工程からなる。インビトロ培養において宿主組織として供される非ヒト動物から得られる約２ｃｍ×２ｃｍ×２６０μｍの器官組織の薄片を供給する工程（ここで宿主組織がミトコンドリアに富む）；該宿主組織をウイルスでインビトロ感染させる工程；該感染宿主組織の組織培養培地中への周期的な浸漬、さらにガス交換ができるようにした動的インビトロ器官培養システム中で該感染宿主組織を培養する工程；ウイルス抗原の産生のために該感染組織を該動的器官培養中に充分時間保持する工程；およびインビトロで産生された該ウイルス抗原を分離する工程。２．供給する工程が肝臓、腎臓、膵臓または唾液腺器官組織から分離された宿主組織を用いることを特徴とする、請求項１に記載の製造法。３．供給する工程が非ヒト動物であるラット、マウス、イヌ、ニワトリまたはカエルから分離された宿主組織を用いることを特徴とする、請求項１に記載の製造法。４．感染させる工程がＡ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよび脳炎ウイルスからなる群から選択されるヒトウイルスを用いることを特徴とする、請求項１に記載の製造法。５．保持する工程が約２４〜約４８時間内に該宿主組織中のミトコンドリア様小器官においてウイルス抗原を産生することを特徴とする、請求項１に記載の製造法。６．分離したウイルス抗原を動物に導入して免疫応答を誘発する工程からさらになることを特徴とする、請求項１に記載の製造法。７．請求項１の製造法によって製造されて、ワクチンにおける使用に適するウイルス抗原。８．請求項１の製造法によって製造されたウイルス抗原のワクチン調製のための使用。９．インビトロのウイルス抗原の製造法であって、次の工程からなる。インビトロ培養において宿主組織として供される非ヒト動物から得られる約２ｃｍ×２ｃｍ×２６０μｍの器官組織の薄片を供給する工程（ここで宿主組織がミトコンドリアに富む）；該宿主組織を、組み換えウイルスＤＮＡ、および組み換えウイルスＤＮＡの発現を可能にするＤＮＡ配列からなるＤＮＡベクターでインビトロトランスフェクトさせる工程；該トランスフェクトさせた宿主組織の組織培養培地中への周期的な浸漬、さらにガス交換ができるようにした動的インビトロ器官培養システム中で該トランスフェクトさせた宿主組織を培養する工程；ウイルス抗原の産生のために該トランスフェクトさせた組織を該動的器官培養中に充分時間保持する工程；およびインビトロで産生された該ウイルス抗原を分離する工程。１０．供給する工程が肝臓、腎臓、膵臓または唾液腺器官組織から分離された宿主組織を用いることを特徴とする、請求項９に記載の製造法。１１．供給する工程が非ヒト動物であるラット、マウス、イヌ、ニワトリまたはカエルから分離された宿主組織を用いることを特徴とする、請求項９に記載の製造法。１２．トランスフェクトさせる工程がＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスまたはその組み合わせ中の核酸に由来する組み換えウイルスＤＮＡを用いることを特徴とする、請求項９に記載の製造法。１３．トランスフェクトさせる工程がＢ型肝炎中の核酸に由来し、非構造ウイルスタンパク質をコードするヒトウイルスＤＮＡ配列中に挿入された組み換えウイルスＤＮＡを用いることを特徴とする、請求項９に記載の製造法。１４．保持する工程が約２４〜約４８時間内に該宿主組織中のミトコンドリア様小器官においてウイルス抗原を産生することを特徴とする、請求項９に記載の製造法。１５．該宿主組織をヘルパーウイルスで感染またはインフェクトさせる工程からさらになることを特徴とする、請求項９に記載の製造法。１６．請求項９の製造法によって製造され、ワクチンにおける使用に適するウイルス抗原。１７．請求項９の製造法によって製造されたウイルス抗原のワクチン調製のための使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 7/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ｅ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ウイルス抗原のインビトロ製造法であって、次の工程からなる。インビトロ培養において宿主組織として供される非ヒト動物から得られる約２ｃｍ×２ｃｍ×２６０μｍの器官組織の薄片を供給する工程で、ここで宿主組織がミトコンドリアに富むことを特徴とする工程；該宿主組織をウイルスでインビトロ感染させる工程；該感染宿主組織の組織培養培地中への周期的な浸漬、さらにガス交換ができるようにした動的インビトロ器官培養システム中で該感染宿主組織を培養する工程；ウイルス抗原の産生のために該感染組織を該動的器官培養中に充分時間保持する工程；;およびインビトロで産生された該ウイルス抗原を分離する工程。２．供給する工程が肝臓、腎臓、膵臓または唾液腺器官組織から分離された宿主組織を用いることを特徴とする、請求項１に記載の製造法。３．供給する工程が非ヒト動物であるラット、マウス、イヌ、ニワトリまたはカエルから分離された宿主組織を用いることを特徴とする、請求項１に記載の製造法。４．感染させる工程がＡ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよび脳炎ウイルスからなる群から選択されるヒトウイルスを用いることを特徴とする、請求項１に記載の製造法。５．保持する工程が約２４〜約４８時間内に該宿主組織中のミトコンドリア様小器官においてウイルス抗原を産生することを特徴とする、請求項１に記載の製造法。６．分離したウイルス抗原を動物に導入して免疫応答を誘発する工程からさらになることを特徴とする、請求項１に記載の製造法。７．請求項１の製造法によって製造されて、ワクチンにおける使用に適するウイルス抗原。８．請求項１の製造法によって製造されたウイルス抗原のワクチン調製のための使用。９．インビトロのウイルス抗原の製造法であって、次の工程からなる。インビトロ培養において宿主組織として供される非ヒト動物から得られる約２ｃｍ×２ｃｍ×２６０μｍの器官組織の薄片を供給する工程で、ここで宿主組織がミトコンドリアに富むことを特徴とする工程；該宿主組織を、組み換えウイルスＤＮＡ、および組み換えウイルスＤＮＡの発現を可能にするＤＮＡ配列からなるＤＮＡベクターでインビトロトランスフェクトさせる工程；該トランスフェクトさせた宿主組織の組織培養培地中への周期的な浸漬、さらにガス交換ができるようにした動的インビトロ器官培養システム中で該トランスフェクトさせた宿主組織を培養する工程；ウイルス抗原の産生のために該トランスフェクトさせた組織を該動的器官培養中に充分時間保持する工程；およびインビトロで産生された該ウイルス抗原を分離する工程。１０．供給する工程が肝臓、腎臓、膵臓または唾液腺器官組織から分離された宿主組織を用いることを特徴とする、請求項９に記載の製造法。１１．供給する工程が非ヒト動物であるラット、マウス、イヌ、ニワトリまたはカエルから分離された宿主組織を用いることを特徴とする、請求項９に記載の製造法。１２．トランスフェクトさせる工程がＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスまたはその組み合わせ中の核酸に由来する組み換えウイルスＤＮＡを用いることを特徴とする、請求項９に記載の製造法。１３．トランスフェクトさせる工程がＢ型肝炎中の核酸に由来し、非構造ウイルスタンパク質をコードするヒトウイルスＤＮＡ配列中に挿入された組み換えウイルスＤＮＡを用いることを特徴とする、請求項９に記載の製造法。１４．保持する工程が約２４〜約４８時間内に該宿主組織中のミトコンドリア様小器官においてウイルス抗原を産生することを特徴とする、請求項９に記載の製造法。１５．該宿主組織をヘルパーウイルスで感染またはインフェクトさせる工程からさらになることを特徴とする、請求項９に記載の製造法。１６．請求項９の製造法によって製造され、ワクチンにおける使用に適するウイルス抗原。１７．請求項９の製造法によって製造されたウイルス抗原のワクチン調製のための使用。