JP2000504230A

JP2000504230A - 殺腫瘍性ｔリンパ球の製造法

Info

Publication number: JP2000504230A
Application number: JP10520046A
Authority: JP
Inventors: ハルベルトユングフェル; ハインリヒバルチェット
Original assignee: ロシュディアゴノスティックゲーエムベーハー
Priority date: 1996-10-30
Filing date: 1997-10-29
Publication date: 2000-04-11
Also published as: WO1998018907A1; CA2270117A1; EP0942961A1; AU6908898A

Abstract

(57)【要約】抗CD43抗体の存在下におけるインキュベーションを含む、リンパ球にリソソームによる前処理を施すことからなる、殺腫瘍性Tリンパ球の製造を可能にする方法について開示する。

Description

【発明の詳細な説明】殺腫瘍性Tリンパ球の製造法本発明は、殺腫瘍性Tリンパ球（tumoricidal T lymphocyte）の活性化、生産および増殖のための方法、ならびに殺腫瘍性Tリンパ球の活性化、生産および増殖のための培地として適した組成物に関する。細胞性免疫による防御は、例えばウイルス感染細胞または腫瘍細胞などの病理学的に変化した内因性細胞の排除に重要な役割を果たしている。この場合には、細胞傷害性Tリンパ球が表面抗原を利用してこれらの変化した内因性細胞を認識する。これらの表面抗原は通常、細胞によって形成され、いわゆる主要組織適合性複合体（MHC）の表面受容体と結合して細胞表面に存在する蛋白質断片である（Zinkernagelら、Nature 248（1974）、701〜702およびBabbitら、Nature317（ 1985）、359〜361）。しかし、腫瘍細胞のこれらの表面抗原と健常細胞の対応抗原との差が極めてわずかである場合には、免疫系は腫瘍細胞を排除しうる殺腫瘍性Tリンパ球を形成しないと考えられる。このため、このような腫瘍細胞に対して細胞性免疫による防御を誘発させようとの試みもすでになされている。最初にカルメット-ゲラン菌（bacillus Calmette-Guerin）（BCG）、コリネバクテリウムパルブム（Corynebacterium parvum）または腫瘍細胞抽出物に由来するワクチンなどの非特異的免疫賦活因子による能動免疫を達成させる試みがなされた（Te rryおよびRosenberg編、ヒト癌の免疫療法（Imunotherapy of Human Cancer）（ 1982）、Elsevier North Holland）。いわゆる養子免疫療法の概念により、さらに優れた結果が得られた。この場合には、患者のリンパ球をインビトロで活性化し、次いで再移植する。ほとんどの場合には、リンパ球はインターロイキン2の添加によってインビトロで活性化されて乱交雑キラー細胞（promiscous killer cell）となる（D．Thieleら、Immunology Today 10（1989）、375〜381）。得られた細胞傷害性リンパ球は以来、リンホカイン活性化キラー細胞（LAK細胞）と呼ばれている（Rosenberg、Immunology Today 9（1988）58〜62）。細胞傷害性T リンパ球と異なり、LAK細胞およびそれらの腫瘍細胞に対する作用は腫瘍抗原の認識に関してMHC遺伝子が正確に発現されることに依存しない上、免疫系のナチュラルキラー細胞と異なり、LAK細胞は生じたばかりの腫瘍細胞にも効果がある。すでにLAK細胞を用いて初めての臨床的成果が達成されている。しかし、この形式の養子免疫療法には、長期にわたり比較的高い用量が必要とされるインターロイキン2による副作用という短所がある。これは特に、臓器機能不全をもたらす毛細血管の透過性上昇につながる（Rosenberg、Immunology Today 9（1988）、58〜62、Rosenst einら、Journal lmnunology 137（1986）、1735〜1742およびEttinghausenら、S urg.Forum37（1987）、388〜389）。さらに、健常な内因性細胞を指向するインターロイキン2による刺激時にもLAK細胞が得られる（B．Chenら、Cell．Immunol .118（1989）、458〜469）。養子免疫療法に対するさらに効果的な方法が探索される中で、活性化させようとするリンパ球を自家腫瘍細胞の存在下で培養することも行われた（リンパ球腫瘍混合培養、G.Fossatiら、International Journal of Cancer 42（1988）、239 〜245；G．Degiovanniら、Eur．J．Immunol．18（1988）、671〜676；Wolfelら、J．Exp．Med．170（1989）、797〜819；Darrowら、J．Immunnol．142（1989）、3329〜3335およびNotterら、Int．J．Cancer 45（1990）、834〜841）。さらに、腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）をインビトロで増殖させるための方法も記載されている（Yronら、J．Immunol．125（1980）、238〜245）。末梢血液細胞から入手しうるLAK細胞とは異なり、腫瘍浸潤性リンパ球を入手するためには患者から腫瘍組織を採取する必要がある。これにより、それらの治療的応用はかなり制限される。殺腫瘍性Tリンパ球およびそれらの製造方法は国際公開公報第94／23014号に記載されている。これによれば、殺腫瘍性Tリンパ球はリンパ球と特定の性質をもつ哺乳動物細胞系との共培養によって生産される。 Tリンパ球の増殖において細胞表面のシアロ糖蛋白質（後にCD43と命名された）が一定の役割を果たすことは、メンツァー（Mentzer）ら、J．Exp．Medicine 165（1987）1383〜1392によって知られている。しかし、メンツァーによって記載された抗体がTリンパ球を刺激するのは単球の存在下のみである。ヴァーガス-コルテス（Vargas-Cortes）らは、Scand．J．Immunol．27（1988 ）661〜671に、抗CD43抗体による末梢血リンパ球（PBL）の剌激に関して記している。記載された方法ではヒトPBLの自発的細胞傷害性が増強され、その効果は主にN K細胞を指向し、腫瘍細胞系K562に対する細胞の細胞傷害性は増大する。本発明の目的は、他のTリンパ球および特にNK細胞の刺激および増殖が回避されるような、特異的な殺腫瘍性Tリンパ球を特異的に生産するための改善および単純化された方法を提供することであった。この目的は、向リソソーム性前処理を受けた（lysosomotropically pretreate d）リンパ球を抗CD43抗体とともに培養して殺腫瘍性Tリンパ球を単離することによる、慢性骨髄性白血病細胞系（K-562、ATCC CTL 243）の細胞を細胞傷害的に破壊せず、それらの増殖を限られた期間にわたり抑制するのみである殺腫瘍性T リンパ球を特異的に生産するための方法によって達成される。驚くべきことに、国際公開公報第94／23014号に記載された通り、白血球（リンパ球）を哺乳動物細胞系と共培養する必要はなく、むしろ向リソソーム性前処理を受けたリンパ球を培養して抗CD43抗体とともにインキュベートした場合には驚くほど特異性の高い殺腫瘍性Tリンパ球を入手できることが明らかになった。本発明の意味する範囲内での殺腫瘍性Tリンパ球は、国際公開公報第94／23014 号に記載された通りの、抗原非特異的な様式で腫瘍細胞を認識してアポトーシス誘導および／または細胞溶解を介してそれらを死滅させるT細胞である。殺腫瘍性Tリンパ球は、 a）腫瘍細胞系M0LT-4、ジャーカット、THP-1、HL-60、ヒーラ、K-562、Malme3 Mおよび／またはY79に対する殺腫瘍性効果を有する、ならびに b）細胞系HB654またはHB617の存在下におけるこれらの細胞の増殖中に、これらの殺腫瘍性Tリンパ球の培養上清からはインターロイキン2を検出限界0.5IU／m lで検出しえない、という点を特徴とする。殺腫瘍性キラーT細胞はナチュラルキラー（NK）細胞ではない。腫瘍浸潤性リンパ球と比べて、それらは広範な殺腫瘍活性をもつため、治療的応用により適している。ナチュラルキラー細胞と異なり、本発明に係る方法によって生産される殺腫瘍性細胞はT細胞である。NK細胞と殺腫瘍性細胞とを区別するさらなる基準は、NK細胞は腫瘍細胞系K-562を認識して細胞傷害的に破壊するが、殺腫瘍性T細胞は細胞系K-562の増殖を限られた期間にわたり抑制するのみであるという点である。本発明の意味する範囲内での限られた期間にわたる抑制とは、細胞培養物中の細胞が死滅せずにそれらの増殖のみが抑制されること、好ましくはそれらの増殖が完全に抑制されることを意味する。増殖抑制は可逆的であり、殺腫瘍性Tリンパ球と細胞系K-562の細胞とを分離することによって消失する。この点に関して殺腫瘍効果とは、検討する腫瘍細胞系の死滅（特に溶解）のみでなく、増殖に対する抑制効果も意味する。この殺腫瘍効果は、例えば殺腫瘍性 Tリンパ球とともに長期間にわたり培養した際に殺腫瘍性Tリンパ球と形態的に区別しうる腫瘍細胞系が培養物から消失する、または少なくともそれらの増殖が遅延するとの事実により、例えば当業者が精通している細胞傷害試験によって検出することができる。殺腫瘍性Tリンパ球は好ましくはCD3陽性（CD3⁺）および／またはCD4陽性（CD4⁺）である。本発明の意味する範囲内でのリンパ球は、例えば全血から入手しうる白血球の調製物（preparation）であると理解される。このような方法は当業者に公知である。例えば、勾配遠心処理（フィコール勾配）によって血液リンパ球を含む単核細胞の画分（PBMNC）が入手できる。特異的な殺腫瘍性Tリンパ球を形成させるためには、この様式で入手したPBMNCを前処理する必要がある。細胞をL-ロイシル-ロイシンメチルエステルまたは類似のエステルなどの向リソソーム性物質によって前処理する。このような物質は、例えばP.L．Triozziら、Immunopharmaco logy 28（1994）39〜45；C.S.Rosenfeld、Stemcells、Dayt 12（1994）198〜204 ；N．Seo、Cancer lnmunol．Immunother．38（1994）277〜280に記載されている。向リソソーム性前処理により、殺腫瘍性Tリンパ球の前駆細胞を豊富に含む生存リンパ球の画分を得ることができる。抗CD43抗体とは、細胞表面分子CD43（DeSmet，W.ら、Schlossman，S.F.ら（編）白血球タイピングV（Leukocyte Typing V）、pp.1706〜1707、Oxford United Kingdom：Oxford University Press、1995中）に対する抗体であると理解される。CD43は造血系の細胞上に生じるシアロ糖蛋白質であり―樹状細胞およびBリンパ球のあるサブポピュレーションを除き―免疫系のすべての細胞上に発現される（Fukuda，M.、Glycobiology 1［1991］、347〜356）。このような抗体は、好ましくは、CD43のMHCクラスI分子との結合に関与するCD43分子の一部を指向する。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよく、免疫化、合成または組換え法によって生産可能である。完全な抗体または特徴的な結合を媒介する抗体誘導体のいずれを用いることもできる。しかし、完全なCD43抗体と同様な様式で細胞表面のCD43分子と架橋する能力をもつ抗体または抗体誘導体を用いることが好ましい。前駆細胞（CD3陽性であってロイシルロイシンメチルエステル耐性のリンパ球）の殺腫瘍性Tリンパ球への分化には、表面マーカーCD43（刺激細胞上のMHC-Iとの結合）およびCD2（刺激細胞上のCD58との結合）を介した同時刺激が関与することが示されている。リンパ球と共培養した際に殺腫瘍性Tリンパ球を生じるに至る国際公開公報第94／23014号に記載された哺乳動物細胞系は、明らかに前記の表面マーカーを介して前駆細胞の分化を引き起こすことが示された。驚くべきことに、抗CD43抗体単独でも類似した効果が得られることが判明した。一つの好ましい態様において、殺腫瘍性Tリンパ球、および好ましくはT細胞によって剌激された1対の抗CD2抗体（CD2上の2つの異なるエピトープを指向する）の収量を改善するために1つまたはいくつかの抗CD2抗体を添加する（Schwartz,M .ら、J．Immunol．154（1995）、5813〜5820；Moingeon，P.ら、Immunol．Rev.1 11（1989）、111〜140）。リンパ球を数日間（好ましくは5〜30日）にわたり従来の培地中で抗CD43抗体とともに培養するのが好都合である。培地は好ましくは無血清である。自家性の殺腫瘍性Tリンパ球を調製しようとする際には、自家血清を培養に用いるのが特に好ましい。この様式で入手した殺腫瘍性Tリンパ球は、選択的には精製後に、治療的薬剤として患者に投与することができる。驚くべきことに、抗CD43抗体との培養により、リンパ球からHLAに拘束されず広範な殺腫瘍活性をもつ特異的な殺腫瘍性Tリンパ球が得られることが明らかになった。この点に関して殺腫瘍活性とは、対応する腫瘍細胞に対する死滅作用、特にアポトーシス誘導性および／または溶解作用のほか、これらの腫瘍細胞の増殖に対する抑制作用であると理解される。リンパ球としては血液リンパ球を用いるのが好ましい。しかし、腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）のほか、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球を用いることも可能である。リンパ球調製物は好ましくは使用前に精製する。血液リンパ球を用いる場合には、赤血球を除去するのが好都合である。抗CD43抗体との培養の前に殺腫瘍性Tリンパ球の前駆細胞の画分を濃縮する。このために、好ましくはシーレ（T hiele）およびリプスキー（Lipsky）（The Journal of lmunology、Vol.136、No .3（1986）、p.1038〜1048）に従ったL-ロイシル-L-ロイシンメチルエステルとのインキュベーションによる向リソソーム性処理により、単球、マクロファージ、NK細胞、サプレッサーT細胞ならびに同種抗原反応性の細胞傷害性T細胞およびその前駆細胞を除去する。本発明に係る方法を実施するためには、フィコール密度勾配遠心処理など既知の方法によって、好ましくはドナーの血液または腫瘍からリンパ球をまず単離する。続いて、向リソソーム性処理後に残ったリンパ球を抗CD43抗体とともに従来のリンパ球培地中で培養する。培地中の抗体濃度は1ng／mlから100μg／mlの間、好ましくは10μg／mlである。培養は殺腫瘍性Tリンパ球の活性化が検出可能になるまで続ける。これには通常、約8日間の培養を要する。本発明に係る培養は、リンホカインもしくは特にインターロイキン2などの増殖因子または分化因子の添加を必要とせずに殺腫瘍性Tリンパ球を活性化する。このような因子は治療的応用において副作用を惹起する恐れがあるため、この点は得られた殺腫瘍性T リンパ球の治療的応用のためには特に有益である。本発明に係る方法を用いて、治療において副作用につながる恐れのある例えばリンホカインまたはインターロイキン2などの分化因子の添加を必要とせずに、上記のヒト殺腫瘍性Tリンパ球を入手することができる。このため、本発明のさらなる主題は、腫瘍療法に用いうる治療的薬剤を製造するために本発明に係る方法を用いることである。このような治療的用途のためには、本発明に従って生産された殺腫瘍性Tリンパ球を、当業者が精通している方法（例えば、遠心および生理食塩水へのペレットの再懸濁を数回、例えば3回繰り返すなど）によって洗い、選択的には単離して、投与のために適した媒質（例えば生理食塩水）中に溶解させる。このリンパ球の殺腫瘍性Tリンパ球へのエクスビボ活性化に加えて、殺腫瘍性T リンパ球に対して抗CD43抗体を適用することによってリンパ球をインビボで活性化することもできる。このような治療的応用のためには、抗体を生理的食塩水などの投与に適した媒質中に溶解させて投与する。この殺腫瘍性Tリンパ球を用いてエクスビボで細胞調製物中の腫瘍細胞を排除することもできる。これは好ましくは、殺腫瘍性Tリンパ球との培養により、幹細胞単離物（例えば骨髄幹細胞）から腫瘍細胞を排除（一掃）するために用いることができる。この様式で精製された幹細胞は、例えば放射線療法または化学療法後の患者に再移植することができる（自家骨髄移植）。ヒトCD43分子に対する抗体はDeSmet，W.ら（SchlossmanS.F.ら［編］、白血球タイピングV（Leukocyte Typing V）、pp.1706〜1707、Oxford United Kingdom ：Oxford University Press、1995中）によって記載されている。例えば「6F5」と命名された抗CD43抗体は、本発明に係る方法に適している。一つの好ましい態様において、抗CD43抗体とともに培養した後に得られる殺腫痛性Tリンパ球を増殖させる。この増殖は、好ましくは、国際出願PCT／EP97／01 924号に記載されている方法によって実施する。細胞系HB 654は、1993年3月24日に「（有限会社）ドイツ細胞培養・微生物保存機関（Deutsche Sammlung fur Zellkulturen und Mikroorganismen GmbH）」、Mascheroder Weg 1b、D-38124 Braunschweigに、DSM ACC第2122号として寄託されている。細胞系HB 617は、94年1月3日に「（有限会社）ドイツ細胞培養・微生物保存機関」、Mascheroder Weg 1b，D-38124 BraurlschweigにDSM ACC第2166号として寄託されている。本発明は、以下の実施例、刊行物および表によって明らかになるが、その保護される範囲は特許の請求の範囲に由来する。記載される方法は、たとえ改変がなされた後でも本発明の主題を記載する例として理解される必要がある。実施例において言及する抗体の特徴は、国際白血球タイピングワークショップ（international Leucocyte Typing Workshop）で明記されている。前記の抗体の代わりに、類似した結合特異性をもつ抗体を用いることも可能である。実施例1 リンパ球の抗CD43抗体との培養ヒトドナーの末梢血（PBMNC）から得た単核細胞を勾配遠心処理（リンパ球分離用培地、Boehringer Mannheim GmbH（BM））によって赤血球から分離し、リン酸緩衝生理食塩水（Boehringer Mannheim GmbH（BM））で2回洗い、シーレ（Thi ele）およびリプスキー（Lipsky）（The Journal of lmunology、Vol.136、No.3 （1986）、p.1038〜1048）に従い、250μMのロイシル-ロイシンメチルエステル（Boehringer Mannheim GmbH（BM））とともに、細胞約5×10⁶個／ml RPMI-1640 培地（Boehringer Mannheim GmbH（BM））の密度にて室温で20分間インキュベートする。RPMI-1640培地で2回洗った後、6F5抗CD43抗体を10μg／mlの濃度になるように添加したX-vivo-20培地（Bio-Whittacker）中に生存細胞を2×10⁶個／ml の密度とし、8％CO₂雰囲気下にて37℃で培養する。培養開始から5日目に培地の半分を補充し、最終濃度が10μg／mlとなるように新たな6F5抗CD43抗体を添加する。培養開始から10日目に、実施例3のために細胞を用いる。培養第10日の細胞の表現型判定では、細胞の＞95％がCD3陽性であることが示される。マーカーCD14およびCD16を有する細胞は認められない。実施例2 リンパ球の抗CD43抗体および抗CD2抗体との培養実施例1で記載した通りに、勾配遠心処理およびロイシル-ロイシンメチルエステル処理によってヒトドナーの血液からリンパ球を調製する。10％の熱失活（56 ℃／30分）自家血清を添加し、抗CD43抗体6F5ならびに抗CD2抗体TS2／18およびV IT13（Schwarz，M.ら、J．Immunol．154（1995）、5813〜5820）を各10μg／ml の濃度となるように添加したイスコーブ（Iscoves）改変DMDM（Gibco）中にリンパ球を1×10⁶個／mlの密度で懸濁した。第5日に抗体を含む培地の半分を補充した。培養開始から10日目の細胞数計測では、リンパ球の増殖が2.2倍になったことが示された。実施例3 殺腫瘍性Tリンパ球の効果実施例1によって得た殺腫瘍性Tリンパ球をヒト腫瘍系（表ＩおよびII参照）の培養物に添加する。これらの腫瘍細胞に対する殺腫瘍効果を顕微鏡で観測する。本発明に係る殺腫瘍性Tリンパ球により、これらの種々の腫瘍細胞系は死滅するか、それらの増殖が抑制される。 1）エフェクター細胞／腫瘍細胞の比 2）48時間後の顕微鏡による評価 3)培養14日後 4）増殖抑制 5）5×10⁴個のTHP-1細胞当たり約4コロニー 6）5×10⁴個のHL-60細胞当たり約15コロニー 7）2.5×10⁴個のヒーラ細胞当たり6コロニー 8）３日後に増殖抑制が消失

【手続補正書】【提出日】１９９９年５月１０日（１９９９．５．１０）【補正内容】請求の範囲 1．向リソソーム性前処理を受けたリンパ球を抗CD43抗体とともに培養すること、および殺腫瘍性Tリンパ球を単離することにより、慢性骨髄性白血病細胞系K-5 62（ATCC CCL 243）を細胞傷害的に破壊せずにそれらの増殖を限られた期間にわたり抑制するのみである殺腫瘍性Tリンパ球を特異的に製造するための方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】 1．向リソソーム性前処理を受けたリンパ球を抗CD43抗体とともに培養すること、および殺腫瘍性Tリンパ球を単離することにより、慢性骨髄性白血病細胞系K-5 62（ATCC CCL 243）を細胞傷害的に破壊せずにそれらの増殖を限られた期間にわたり抑制するのみである殺腫瘍性Tリンパ球を特異的に製造するための方法。 2．1つまたはいくつかの抗CD2抗体が添加される、請求項1記載の方法。 3．培養物に自家血清が添加される、請求項1記載の方法。 4．向リソソーム性前処理のためにL-ロイシル-ロイシンメチルエステルが用いられる、請求項1〜3記載の方法。