JP2000504575A

JP2000504575A - 微生物のチップベースの種分化および表現型特徴付け

Info

Publication number: JP2000504575A
Application number: JP9528727A
Authority: JP
Inventors: エイ．ジンゲラス，トーマス; マック，デイビッド; エス．チー，マーク; ジェイ．ベルノ，アンソニー; ストライヤー，ルバート; ガンドール，ガッサン; ワン，チン
Original assignee: アフィメトリックス，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-02-08
Filing date: 1997-02-07
Publication date: 2000-04-18
Also published as: US6228575B1; WO1997029212A1; EP0937159A4; EP0937159A1; AU2189397A

Abstract

(57)【要約】本発明は、生物を、例えばMycobacterium tuberculosis rpoB遺伝子に基づくオリゴヌクレオチド配列を用いて、種分化および表現型分類するためのオリゴヌクレオチドに基づくアッセイおよび方法を提供する。生物が属する群または種は、生物由来の標的核酸のハイブリダイゼーションパターンを、データベース中のハイブリダイゼーションパターンと比較することによって決定され得る。

Description

【発明の詳細な説明】微生物のチップベースの種分化および表現型特徴付け本出願は、米国特許出願第60/011,339号（1996年２月８日出願）；同第60/012 ,631号（1996年３月１日出願）；同第08/629,031号（1996年４月８日出願）；および同第60/017,765号（1996年５月15日出願）（これらの開示は、その全体が、全ての目的のために、具体的に参考として援用される）の一部継続出願であり、そしてそれらの優先日の恩恵を請求する。発明の背景著作権の告知本特許書類の開示の一部は、著作権保護を受ける事項を含む。著作権所有者は、特許書類または特許開示の、正確に特許商標庁特許ファイルまたは記録において出現する形態での、何人による静電写真法的複写にも異議を唱えないが、それ以外にはいかにしても全ての著作権を保有する。発明の分野本発明は、微生物の同定および特徴付けに関する。発明の背景多剤耐性およびヒト免疫不全ウイルス（HIV-1）感染は、結核の問題に対する深遠な衝撃を有している因子である。１つ以上の抗マイコバクテリア剤に対して耐性のMycobacterium tuberculosis株の頻度の増加が報告されている。Blockら、（1994）JAMA 271:665-671．M．tuberculosisに感染していない免疫無防備状態のHIV-1感染患者は、M．avium複合体（MAC）またはM．avium−M．intracellul are（MAI）複合体に頻繁に感染する。これらのマイコバクテリア種は、M．tuber cul osisを処置するために使用される薬物にしばしば耐性である。これらの因子は、薬物感受性およびマイコバクテリア種同定の正確な決定の重要性を再び強調した。 HIV-1感染患者において、マイコバクテリア疾患の正確な診断は重要である。なぜなら、M．tuberculosis感染の処置は、他のマイコバクテリア感染により必要とされる処置とは異なるからである。Hoffner，S.E．(1994) Eur ．J．Clin．M icrobiol．Inf．Dis. 13:937-941。HIV-1感染に一般に関連する非結核マイコバクテリアとしては、M．kansasii．M．xenopi，M．fortuitum、M．aviumおよびM. intracellularが挙げられる。Wolinsky，E.，(1992) Clin ．Infect．Dis. 15:1- 12、Shafer，R.W.およびSierra，M.F．1992 Clin ．Infect．Dis. 15:161-162。さらに、M．tuberculosisの新たな症例（HIV-1感染および非感染）の13％は、主な抗結核剤（イソニアジド[INH]、リファンピン[RIF]、ストレプトマイシン[STR ]、エタンブトール[EMB]、およびピラジンアミド[PZA]）の１つに耐性であり、そして3.2％は、RIFおよびINHの両方に耐性である。Blockら、JAMA 271:665-671 (1994)。その結果、マイコバクテリア種同定および薬物耐性の決定は、マイコバクテリア疾患の診断の間の中心的な関心事となっている。 Mycobacterium種を検出および同定するために使用される方法はかなり変動する。Mycobacterium tuberculosisの検出については、抗酸性染色スミアおよび培養物の顕微鏡検査がなお、大部分の微生物学臨床研究室において選択される方法である。しかし、臨床サンプルの培養は、マイコバクテリアの遅い増殖により制限される。４週間の平均時間が、検出および可能な同定を可能にするために十分な増殖が得られる前に必要とされる。近年、培養のための２つのさらなる迅速な方法が開発されている。それらは、放射測定系（Stager，C.E.ら、(1991) J ．Cl in．Microbiol. 29:154-157）、および二相（ブロス／寒天）系（Sewellら、(19 93) J ．Clin．Microbiol. 29:2689-2472）を含む。一旦増殖すると、培養されたマイコバクテリアは、脂質組成、種特異的抗体の使用、種特異的DNAまたはRNAプローブ、ならびにPCRベースの16S rRNA遺伝子の配列分析（Schirmら、(1995) J. Clin ．Microbiol. 33:3221-3224；Koxら、(1995) J ．Clin．Microbiol. 33:322 5-3233）およびIS6110特異的反復配列分析（総説については、例えば、Smallら、P.M.およびvan Embden，J.D.A．(1994) Am ．Society for Microbiology，569- 582頁を参照のこと）により分析され得る。16S rRNA配列（RNAおよびDNA）の分析は、Mycobacteria種を同定するための最も情報を与える分子的アプローチであった（Jonasら、J ．Clin．Microbiol. 31:2410-2416 (1993)）。しかし、同一の単離物について薬物感受性情報を得るためには、さらなるプロトコル（培養物）または別の遺伝子分析が必要である。薬物感受性情報を決定するためには、培養方法がなお選択されるプロトコルである。Mycobacteriaは、標準的な比例平板法（proportional plate method）または最小阻止濃度（MIC）法のいずれかの使用により、特定の薬物に耐性であると判定される。しかし、培養方法により必要とされる固有の長時間の仮定のもと、分子遺伝学に基づいて薬物感受性を決定するアプローチが、近年開発されている。表１は、変異された場合に、薬物耐性を与えることが示されているM．tubercu losis遺伝子を列挙する（他の遺伝子が公知である。例えば、pncA遺伝子）。表１に列挙される薬物の中で、RIFおよびINHは、結核処置の骨格を形成する。M．t uberculosisにおけるRIF耐性の検出は、その臨床的および疫学的意義のためだけでなく、それが高度に脅威である多剤耐性表現型についてのマーカーであるので、重要である（Telentiら、(1993) The Lancet 341:647-650）。表１に列挙される薬物耐性の中で、RIFに対する感受性の減少が、遺伝的基礎で最も良く理解されている。表１薬物耐性を与える変異を有するM．tuberculosis遺伝子薬物遺伝子大きさ（bp）遣伝子産物 RIF rpoB 3,534 RNAポリメラーゼのβサブユニット INH katG 2,205 カタラーゼ-ペルオキシダーゼ INH-ETH inhA 810 脂肪酸生合成 STR rpsL 372 リボゾームタンパク質S12 rrs 1,464 16S rRNA FQ gyrA 2,517 DNAジャイレースＡサブユニット E．coli株におけるRIFに対する耐性は、rpoB遺伝子における変異の結果として生じることが観察されたので、Telentiら（前出）は、M．tuberculosis rpoB遺伝子の69塩基対（bp）領域を、RIF耐性変異が集中した遺伝子座として同定した。Kapurら、(1995) Arch ．Pathol．Lab．Med. 119:131-138は、M．tuberculosis rpoB遺伝子におけるさらなる新規な変異を同定し、これはこのコア領域を81 bp まで延長した。マイコバクテリアにおける抗菌剤耐性についての詳細な総説において、Musser（Clin ．Microbiol．Rev.，8:496-514(1995)）は、全ての特徴付けされた変異およびそれらの、rpoBのこの81 bp領域における発生の相対的頻度を要約した。ミスセンス変異は全ての既知の変異の88％を含み、一方、挿入（３または６bp）および欠失（３、６、および９bp）は、それぞれ残りの変異の４％および８％を説明する。全てのRIF耐性結核単離物の約90％が、この81 bp領域に変異を有することが示されている。残りの10％には、おそらくrpoB以外の遺伝子が関与すると考えられている。上記の理由で、表現型レベルおよび遺伝子型レベルの両方で、Mycobacteriaのような微生物を同定および特徴付けする、より簡便な方法を有することが所望される。本発明は、その必要性および関連する必要性を満たす。発明の要旨本発明は、生物を特徴付けし、そして同定するための系、方法、およびデバイスを提供する。本発明の１つの局面において、第一の生物の遺伝子型を同定するための方法は、以下の工程を包含する： (a) 基板上の既知の位置でオリゴヌクレオチドのアレイ（array）を提供する工程であって、このアレイは第二の生物由来の参照DNAまたはRNA配列に相補的であるプローブを含む、工程； (b) 第一の生物由来の標的核酸配列をアレイにハイブリダイズさせる工程；および (c) 標的のアレイへの全体的なハイブリダイゼーションパターンに基づいて、第一の生物の遺伝子型を同定し、そして必要に応じて第一の生物の表現型を同定する工程。本発明の別の局面は、遺伝子をコードする第一の生物由来の標的核酸配列（またはその相補物）を第二の生物由来の同一の遺伝子をコードする参照配列（またはその相補物）と比較することによって、生物の遺伝子型および/または表現型を同定するための方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する： (a) 標的核酸またはそのサブ配列（subsequence）を含むサンプルを、固体支持体に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイにハイブリダイズさせる工程、このアレイは以下を含む：複数のプローブを含む第一のプローブセットであって、各プローブは参照配列のサブ配列に正確に相補的なヌクレオチドのセグメントを含み、このセグメントは参照配列における対応するヌクレオチドに相補的な少なくとも１つの質問（in terrogation）位置を含む； (b) 第一のプローブセットのどのプローブが、参照配列へのそれらの結合に比較して標的核酸またはそのサブ配列に結合するかを決定する工程であって、このような相対的結合は、標的配列中のヌクレオチドが参照配列中の対応するヌクレオチドと同一であるかまたは異なるかを示す、工程； (c) 標的配列のヌクレオチドと参照配列のヌクレオチドとの間の差異に基づいて、第一の生物の表現型を同定する工程； (d) 参照配列と第一の生物との間の差異の１つ以上のセットを誘導する工程；および (e) 差異のセットを生物の種分化（speciation）に相関する差異のセットを含むデータベースと比較して、第一の生物の遺伝子型を同定する工程。本発明の別の局面は、遺伝子（またはその相補物）をコードする第一の生物由来の標的核酸配列を第二の生物由来の同一の遺伝子（またはその相補物）をコードする参照配列と比較することにより、生物の遺伝子型および/または表現型を同定するための方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する： (a) 標的核酸またはそのサブ配列を含むサンプルを、固体支持体に固定されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイにハイブリダイズさせる工程、このアレイは以下を含む：複数のプローブを含む第一のプローブセットであって、各プローブは参照配列のサブ配列に正確に相補的なヌクレオチドのセグメントを含み、このセグメントは参照配列における対応するヌクレオチドに相補的な少なくとも１つの質問位置を含み、ここで、各質問位置は参照配列または標的配列のヌクレオチド位置に対応する； (b) 各プローブ由来のハイブリダイゼーション強度を決定する工程； (c) ハイブリダイゼーション強度を、それからハイブリダイゼーション強度が決定されたプローブに対応するヌクレオチド位置に対してプロットして、ハイブリダイゼーション強度の標的プロットを誘導する工程； (d) 標的配列を参照配列で置換して工程(a)〜(c)を繰り返して、参照配列の基線プロットを誘導する工程；および (e) 標的プロットを基線プロットと比較して、生物の遺伝子型および／または表現型を決定する工程。本発明の別の局面は、固体支持体に固定されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイを提供する。このアレイは以下を含む：複数のプローブを含む第一のプローブセットであって、各プローブは参照配列のサブ配列に正確に相補的なヌクレオチドのセグメントを含み、このセグメントは参照配列中の対応するヌクレオチドに相補的な少なくとも１つの質問位置を含む；ここで、参照配列は、Mycobacterium tuberculosis由来の遺伝子である。本発明の別の局面は、患者サンプルにおける核酸多型性の存在を同定するための方法を提供する。この方法は以下の工程を包含する： (a) 患者サンプル由来の核酸配列と野生型サンプル由来の対応する核酸配列との間の参照核酸プローブのアレイへのハイブリダイゼーション強度の差異を決定する工程； (b) 各参照核酸プローブに対応する各々の塩基位置について、野生型サンプルのハイブリダイゼーション強度に対する(a)の差異の比を誘導する工程；および (c) 参照プローブに対応する塩基位置についての(b)の比が、割り当てられた値より大きいかまたはそれに等しい場合、参照プローブに対応する塩基位置における多型性の存在を同定する工程。本発明の別の局面は、患者サンプル中の核酸多型性の存在を同定するコンピュータープログラム産物を提供する。このコンピューター産物は、以下を包含する：該患者サンプル由来の核酸配列と野生型サンプル由来の対応する核酸配列プローブとの間の参照核酸プローブのアレイへのハイブリダイゼーション強度の差異を決定するコンピューターコード；各参照核酸プローブに対応する各塩基位置についての、該野生型サンプルのハイブリダイゼーション強度に対する差異の比を導く、コンピューターコード；参照プローブに対応する塩基位置についての比が、割り当てられた値よりも大きいかまたはそれに等しい場合に、参照プローブに対応する塩基位置での多型性の存在を同定するコンピューターコード；およびコンピューターコードを保存するコンピューター読み取り可能媒体。本発明の別の局面は、コンピューターシステムにおいて、生物を群に割り当てる方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：複数の公知の核酸配列の群を入力する工程であって、複数の公知の核酸配列が公知の生物由来である、工程；複数の公知の核酸配列についてのハイブリダイゼーションパターンを入力する工程であって、各ハイブリダイゼーションパターンが、参照核酸配列のサブ配列への該公知の核酸配列のサブ配列のハイブリダイゼーションを示す、工程；参照核酸配列のサブ配列への、サンプル核酸配列のサブ配列のハイブリダイゼーションを示す生物由来のサンプル核酸配列についてのハイブリダイゼーションパターンを入力する工程；サンプル核酸配列についてのハイブリダイゼーションパターンを、複数の公知の核酸配列についてのハイブリダイゼーションパターンと比較する工程；および特定の位置においてサンプル核酸配列のハイブリダイゼーションパターンに最も密接にマッチするハイブリダイゼーションパターンを有する少なくとも１つの公知の核酸配列の群に従って、生物を属する特定の群に割り当てる工程。本発明の別の局面は、生物を群に割り当てるコンピュータープログラム産物を提供する。このコンピュータープログラム産物は、以下を包含する：複数の公知の核酸配列の群を入力として受けるコンピューターコードであって、複数の公知の核酸配列が公知の生物由来である、コンピューターコード；複数の公知の核酸配列をハイブリダイゼーションパターンを入力として受けるコンピューターコードであって、各ハイブリダイゼーションパターンが参照核酸配列の公知の核酸配列のサブ配列へのハイブリダイゼーションを示す、コンピューターコード；参照核酸配列のサブ配列へのサンプル核酸配列のサブ配列のハイブリダイゼーションを示す生物由来のサンプル核酸配列を、ハイブリダイゼーションパターンを入力として受けるコンピューターコード；サンプル核酸配列についてのハイブリダイゼーションパターンを、複数の公知の核酸配列についてのハイブリダイゼーションパターンと比較するコンピューターコード；サンプル核酸配列のハイブリダイゼーションパターンに、特定の位置で最も密接にマッチするハイブリダイゼーションパターンを有する公知の核酸配列の少なくとも１つの群に従って、生物を属する特定の群に割り当てるコンピューターコード；およびコンピューターコードを保存するコンピューター読み取り可能媒体。本発明の別の局面は、コンピューターシステム中に、ジェネリックプローブアレイを利用して、生物を属する群に割り当てる方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：複数の単離体についてのハイブリダイゼーション強度を入力する工程であって、ハイブリダイゼーション強度が単離体とジェネリックプローブアレイとの間のハイブリダイゼーション親和性を示す、工程；複数の単離体間で最も大きい分散を有するハイブリダイゼーション強度を選択する工程；および選択されたハイブリダイゼーション強度に従う群に複数の単離体のそれぞれを割り当てる工程。本発明の別の局面は、ジェネリックプローブアレイを利用して、生物を属する群に割り当てるコンピュータープログラム産物を提供する。このコンピュータープログラム産物は、以下の工程を包含する：複数の単離体を入カハイブリダイゼーション強度として受けるコンピューターコードであって、ハイブリダイゼーション強度が単離体とジェネリックプローブアレイとの間のハイブリダイゼーション親和性を示す、コンピューターコード；複数の公知の核酸配列を入力ハイブリダイゼーションパターンとして受けるコンピューターコードであって、各ハイブリダイゼーションパターンが参照核酸配列の公知の核酸配列のサブ配列のハイブリダイゼーションを示す、コンピューターコード；複数の単離体間で最も大きい分散を有するハイブリダイゼーション強度を選択するコンピューターコード；選択されたハイブリダイゼーション強度に従う複数の単離体のそれぞれを群に割り当てるコンピューターコード；およびコンピューターコードを保存するコンピューター読み取り可能媒体。図面の簡単な説明図１：基本的なタイル化ストラテジー。図は、参照配列中の質問位置 (I) と対応するヌクレオチド (n) との間の関係、および第一のプローブセット由来のプローブと第二、第三、および第四のプローブセット由来の対応するプローブとの間の関係を示す。図２：第一のプローブセット由来のプローブにおける相補性のセグメント。図３：基本的なタイル化ストラテジーにおけるプローブの漸増的連続。図は、４つのプローブセットを示し、それぞれは３つのプローブを有する。各プローブは、5'ヌクレオチドの獲得および3'ヌクレオチド欠失によって、ならびに質問位置を占有するヌクレオチドにおいて同一のセット内のその祖先とは異なることに留意のこと。図４：チップ上のレーンの代表的配置。チップは４つのプローブセットを示し、それぞれは５つのプローブを有し、そしてそれぞれは１つのプローブあたり合計５つの質問位置を (I1-15) 有する。図５：欠失および挿入変異を検出するためのストラテジー。括弧内の塩基は存在してもしなくてもよい。図６：基板上のオリゴヌクレオチドプローブの光指向性合成を示す。図７：チップ上の全ての可能なテトラヌクレオチドオリゴマーの組合せアレイの合成を示す。図８：標的調製の模式図。図９：配列決定のためのタイル化ストラテジー。図10：オクタマーに基づくチップについてのミスマッチプロフィール。図11：仮定的６クラスツリーに基づく分類システム。末端の節の下の番号は、この分類によって決定されたクラス割り当てである。図12：M．tuberculosis単離体由来のrpoB遺伝子の700bp領域のMtb rpoBチップ分析の像。図13：７つのMycobacterium種の共通の単一ヌクレオチド多型性。図14：７つのMycobacterium種の独特の（種特異的）単一ヌクレオチド多型性。図15Aおよび15B：７つのMycobacterium種のハイブリダイゼーションパターンおよびバーコードフィンガープリント表示。図16：７つのM．gordonae臨床的単離体およびそれ由来のコアフィンガープリントのバーコードフィンガープリント表示。図17：Mycobacterium tuberculosis rpoBチツプ上のM．gordonaeを標的として用いるハイブリダイゼーション強度対ヌクレオチド位置のプロット。下部パネルは、M．tuberculosisおよびM．gordonaeのrpoB遺伝子の配列を、差異の位置に黒で輪郭を記して示す。図18：Mycobacterium tuberculosis rpoBチツプ上の他のMycobacterium種を標的として用いる、ハイブリダイゼーション強度対ヌクレオチド位置のプロット。図19：Mycobacterium tuberculosisについての対応するプロット上に重ねあわせたMycobacterium tuberculosis rpoBチツプ上のMycobacterium種を標的として用いる、ハイブリダイゼーション強度対ヌクレオチド位置のプロット。図20A〜20D、および21：Mycobacterium tuberculosis rpoBチップ上の標的としての公知のMycobacterium種のプロットと比較した、ハイブリダイゼーション強度対未知の患者サンプルのヌクレオチド位置のプロット。図22：参照ATCC単離体と比較した、Mycobacterium tuberculosis rpoBチップ上の標的としての、ハイブリダイゼーション強度対Mycobacterium gordonae単離体のヌクレオチド位置のプロット。図23(A，B)：タイル化アレイの設計。図24：MT1 DNAチップを用いるハイブリッド安定性に対する単一の塩基ミスマッチの効果および位置依存性。完全マッチプローブおよび各A:A単一塩基ミスマッチプローブの配列を示す。５つの独立した実験の結果をプロットする。図25(A，B，C) ：ヒトミトコンドリアDNAの2.5kb領域におけるサンプルと参照標的との間のスケールされたp⁰ハイブリダイゼーション強度パターンの比較による、塩基差異の検出。図26(A，B) ：ヒトミトコンドリアDNAの欠失配列の検出。図27(A，B，C) ：全ミトコンドリアゲノムを有するチップへのミトコンドリア標的の16.3kbのハイブリダイゼーション。図28(A，B) ： (A) 患者サンプル由来および野生型サンプル由来のMSH2遺伝子のエキソン12のハイブリダイゼーション強度の重ねあわせ。(B) 塩基位置の関数としての患者サンプルと野生型サンプルとの間での、0.25よりも大きいハイブリダイゼーション強度差異のプロット。図29：患者サンプルと野生型サンプルとの間での0.25よりも大きいハイブリダイゼーション強度差異の、MLH1遺伝子のExon13およびExon16についての塩基位置の関数としてのプロット。図30：患者サンプルと野生型サンプルとの間での0.25よりも大きいハイブリダイゼーション強度差異の、MSH2遺伝子のExon12についての塩基位置の関数としてのプロット。図31：患者サンプルと野生型サンプルとの間での0.25よりも大きいハイブリダイゼーション強度差異の、p53遺伝子のExon５についての塩基位置の関数としてのプロット。図32：本発明のソフトウェア実施態様を実行するために利用し得るコンピューター。図33：本発明のソフトウェア実施態様を実行するために利用し得る代表的なコンピューターシステムのシステムブロックダイアグラム。図34：患者サンプル由来の核酸配列における多型性の存在の同定の高レベルフローチャート。図35：生物が属する属内の種の同定方法の高レベルフローチャート。図36：生物が属する属内の種の同定方法の高レベルフローチャート。図37：Mycobacteriumの単離体の階層的なクラスター分析。好ましい実施態様の説明本発明は、生物の１つ以上のゲノム領域の遺伝子型分析に基づいて、生物の群または種を同定するため、および生物についての機能的な表現型の情報を得るための方法、組成物および装置を提供する。１つの実施態様において、本方法は、生物由来のある遺伝子をコードする標的核酸配列（またはその相補物）と、同じ遺伝子をコードする参照配列（またはその相補物）とを比較する。原則的に、生物の任意のゲノム領域由来の参照配列が使用され得る。表現型が同定される場合、その領域内の変異が特徴付けられる表現型の特徴に影響することが当業者に理解される。対照的に、遺伝子型決定は、多型性（変異をコードしてもしなくても良い）が存在することのみを必要とする。参照配列は、高度に多型性の領域、中程度に複雑な多型性の領域、またはいくつかの場合において、高度に保存された領域由来であり得る。高度に多型性の領域は、種分化分析を行う場合、典型的にはより情報を有する。本明細書中に開示される方法は、高度に多型性の領域由来の参照配列を用いて、容易に適合され得る。しかし特定の場合において、生物中の高度に保存された領域由来の参照配列を使用することが好ましい。なぜなら、これは分析の間に観察される全てのハイブリダイゼーションパターンに必要な解析(deconvolution)の数学的な複雑性を減少させるからである。この状況において、生物の「高度に保存された領域」は、遺伝子型レベルでの50 ％より大きい、好ましくは75％より大きい、そしてより好ましくは90％より大きい保存の程度をいう。特に有用な参照配列は、Mycobacterium tuberculosis (Mt )由来の700 bprpoB遺伝子である。なぜなら、これは良く定義されているからである。他の有用な参照配列は、16SrRNA、rpoB遺伝子、katG遺伝子、inhA遺伝子、gyrA遺伝子、23SnRNA遺伝子、rrs遺伝子、pncA遺伝子、およびrpsL遺伝子が挙げられる。さらに、この遺伝内の81bpセグメントは、M．tuberculosisにおけるリファンピシン(rifampacin)耐性をコードする全ての公知の変異を含む。本発明は、微生物の表現型的および遺伝型的特徴付けをするに特に有用である。この状況において、用語「微生物」は、細菌、真菌、原生動物またはウイルスをいう。本発明は、生物学的サンプルをアッセイする際の特定の有用性を見出す。本明細書中で使用される用語「生物学的サンプル」は、生物からまたは生物の成分（例えば、細胞）から得られたサンプルをいう。サンプルは、任意の生物学的組織または液体であり得る。頻繁に、サンプルは患者由来のサンプルである「臨床サンプル」である。このようなサンプルは、痰、血液、血球（例えば、白血球）、組織または細針生検サンプル、尿、腹膜水、および胸水、またはそれらからの細胞が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的サンプルはまた、組織学的目的のために採取された凍結切片のような組織の切片を含み得る。頻繁に、ハイブリダイゼーションの前に核酸サンプルを増幅することが所望であり得る。適切な増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) (Innisら、PCR Prot ocols．A guide to Methods and Application．Academic Press，Inc．San Dieg o，(1990))、リガーゼ連鎖反応(LCR) (WuおよびWallace，Genomics，4:560 (198 9)、Landegrenら、Science，241:1077 (1988)、ならびにBarringerら、Gene，89 :117 (1990)を参照のこと）、転写増幅(Kwohら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA,8 6:1173 (1989))、および自己持続性(self-sustained)配列複製(Guatelliら、Pro c．Nat．Acad．Sci．USA，87: 1874 (1990))が挙げられるが、これらに制限されない。好ましい実施態様において、サンプル核酸に結合した１つ以上の標識を検出することにより、ハイブリダイズされた核酸が検出される。標識は、当業者に周知の多数の任意の手段により取り込まれ得る。しかし、好ましい実施態様において、標識は、サンプル核酸の調製における増幅工程の間に同時に取り込まれる。従って、例えば、標識されたプライマーまたは標識されたヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、標識された増幅産物を提供する。好ましい実施態様において、上記のように、標識されたヌクレオチド（例えば、フルオレセイン標識UTPおよび／またはCTP）を用いる転写増幅は、標識を転写された核酸に取り込む。あるいは、標識は、もとの核酸サンプル（例えば、mRNA、ポリＡmRNA，cDNAなど）に、または増幅が完了した後に増幅産物に直接添加され得る。標識を核酸に結合させる手段は当業者に周知であり、そして例えば、ニックトランスレーションまたは核酸のキナーゼ処理、次いで核酸リンカー結合サンプル核酸を標識（例えば、蛍光団）に結合（連結）させることによる末端標識（例えば、標識された RNAを用いる）が挙げられる。本発明における使用に適切な検出可能な標識は、分光光度的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能な任意の組成物が挙げられる。本発明において有用な標識は、標識されたストレプトアビジン結合体を染色するためのビオチン、磁性ビーズ（例えば、DynabeadsTM）、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射性標識（例えば、³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C、または³²P）、酵素（例えば、西洋ワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびELISA において通常使用される他のもの）、および比色標識（例えば、金コロイドまたは着色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズ）が挙げられる。このような標識の使用を教示する特許は、米国特許第3,817,837号；同第3,850,752号；同第3,939,350号；同第3,996,3 45号；同第4,277,437号；同第4,275,149号；および同第4,366,241号が挙げられる。参照配列またはそのサブ配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブアレイは、以下に記載されるディスプレイストラテジーの１つを用いて、固体支持体上に固定化される。明確にするために、本発明の以下の記載の多くは、例としてMyco bacterium rpoB遺伝子由来のプローブアレイを使用する；しかし、以前に記載されたように、モニターされる表現型の特徴、適切なプライマーの有効性などに依存して、他の遺伝子由来のプローブアレイもまた使用され得ることが理解されるべきである。最初に、rpoB遺伝子の公知配列および公知の薬剤耐性変異を有するMycobacter ium種由来の標的核酸が、Mycobacterium tuberculosis rpoB遺伝子に相補的な配列由来の固相プローブアレイ（Mtb rpoBチップ）に対してスクリーニングされる。公知の配列は、文献から入手可能であるか、または別の方法（例えば、ジデオキシヌクレオチド配列決定）により個々に確立され得るかのいずれかである。これらの各種で観察された全てのハイブリダイゼーションパターンは、Mycobacteriu m tuberculosisで観察された全てのハイブリダイゼーションパターンと比較され、２つのハイブリダイゼーションパターンの間の差異が得られる。参照配列として使用されるMycobacterium tuberculosis(Mt)由来のサンプルは、固相支持体上のプローブセット（単数または複数）と正確に相補的であり、全てのプローブに結合する。他の生物由来のサンプルは、遺伝子型レベルで１つ以上の多型性を含み、同様の結合を示さない。観察されたパターンは、個々の種のrpoB遺伝子の配列における変化の関数として変動する。Mtと同一のサブ配列は、Mtについてその対応するサブ配列についてMtで観察されたサブパターンと同一のハイブリダイゼーションサブパターンを生じる。Mtと異なるサブ配列は、その対応するサブ配列についてMtのサブパターンとディファレンシャルハイブリダイゼーションサブパターンを生じる。従って、特定の種で観察される全てのハイブリダイゼーションパターンにより、Mtの領域とは異なるその種のrpoB遺伝子の領域を同定し得る。基板の特定された領域におけるディファレンシャルハイブリダイゼーションパターンの存在は、標的核酸が特定の種由来である確率と相関され得る。理想的な場合においては、単一の領域におけるディファレンシャルハイブリダイゼーションパターンは種を同定させ得る。これは、その領域における１つ以上の多型性が、特定の種に独特に関連している場合に生じ得る。しかし、より頻繁には、このような独特な１対１対応は存在しない。それよりも、ディファレンシャルハイブリダイゼーションパターン（すなわち、参照配列に関して）は複数の領域において観察され、特定種に独特な対応をいずれも有さない。しかし各ディファレンシャルハイブリダイゼーションパターンは、スクリーニングされる生物が特定の種に属する（または属さない）、または特定の表現型の特徴を有する（または有さない）確率に関連する。結果として、増大した数のこれらのセットの差異の検出により、増大したレベルの信頼性を有する生物を分類し得る。他のアルゴリズムは、複数のセットの差異の検出からこのような複合の確率を得るために使用され得る。従って、基板の全ての領域で観察された全てのディファレンシャルハイブリダイゼーションの集合である、全てのハイブリダイゼーションパターンにより、高い信頼性で、生物の種分化および／または表現型を指定し得る。１つのプローブセットが基板上で使用される場合、普通、標的配列と参照配列との間の配列における差異は、標的についてのさらなる知識がなければ定義され得ない。本明細書中に開示される、そしてPCT公開WO95/11995においてより詳細に記載されるタイル化ストラテジーで複数のプローブセットが使用され得る。いくつかの場合において、差異が定義され得る。すなわち、ディファレンシャルハイブリダイゼーションパターンを担う異なるヌクレオチドが明らかになる。他の場合において、差異は定義され得ない。すなわち、その領域に多型性が存在することのみが明らかになる。しかし、これは主にチップ上で使用されるプローブアレイの機能である。必要な場合、サンプルは異なるプローブアレイに対してスクリーニングされ、その領域に存在する多型性を指定し得る。Mtに抗生物質耐性（例えば、リファンピシンに対する）を付与する点変異は頻繁に知られているので、点変異の生じる領域におけるハイブリダイゼーションパターンの変化の存在は、リファンピシン耐性種の存在を知らせる。この技術は、薬剤耐性を同定するに制限されないことが明らかである。表現型特徴の変化が特定のゲノム領域である変異にマッピングされている任意の表現型特徴は、この方法により同定され得る。例示的および制限されない例には、トキシンおよび病原性マーカーの存在が挙げられる。この方法は遺伝子型変化を同定する能力だけでなく、従ってハイブリダイゼーションによる表現型を同定する能力を提供することを認識することが重要である。Mt rpoBチップを用いる微生物の１つのゲノム領域のハイブリダイゼーションパターンの分析はまた、以下に説明するように、微生物の種を同定する方法を提供する。このチップベースのスクリーニング方法は、異なる種に対応するハイブリダイゼーションパターンのデータベースを構築し得る。ハイブリダイゼーションパターンのいくつかの領域は、それらのハイブリダイゼーションに対応する領域におけるそれらの配列が同一なので、種のサブセットに共通である。ハイブリダイゼーションパターンの他の領域は、それらのハイブリダイゼーションに対応する配列が異なるので、２つの種の間で異なる。全ての場合において、未知の種のrpoB 遺伝子の配列がMtの対応する配列に比較される。特定の種のハイブリダイゼーションパターンとサンプルとしてのMtで観察されるパターンにおける差異は、その種の配列の特定の点での多型性の存在に相関し得る。いくつかの多型性は定義され得る。すなわち、その位置でのヌクレオチドがMtのヌクレオチドと異なることが明らかになるのみならず、そのヌクレオチドの同一性もまた明らかになる。いくつかの多型性は特定の種に独特である（すなわち、種特異的）；これらはその特定の種に存在し、他のいかなる種にも存在しない。他の多型性は共有されている。すなわち、これらは特定の種に独特ではない。種の特定のサブセットが多型性を有し、そして他は有さない。しかし、これらの多型性の各々が、種のその特定のサブセットに指定され得る。従って、共有の多型性の存在は、スクリーニングされたサンプルが特定の種を含むことを確実には示さないが、種のその特定のサブセットの１種が存在する確率を増大する。特定のサンプルのハイブリダイゼーションパターンは、「バーコード」として表され得る。ここで、バーコードの個々の線は、Mtに関連する多型性の存在を示す。本発明は、多くの個々の種をスクリーニングし、それによってこれらの種に存在する多型性の情報を得る方法を提供する。それぞれの個々の線は、異なる種に関連する確率を与え得る。この様式でデータベースは構築され得る。ここで、増加する数の多型性は、異なる種に関連し得る。認識されるように、独特の種特異的な多型性の存在は、サンプルを特定の種として即時的に同定する。しかし、いくつかの種間で共有される多型性の存在は、種の同定を可能にする。簡潔には、各種は、共有の多型性の「フィンガープリント」が割り当てられ得る、すなわち、その種およびその種の単離体が共有の多型性の特定のコレクションを有する。しかし、その種を同定し得るために、共有の多型性の独特の「フィンガープリント」パターンを種に割り当て得る必要はない。特定の多型性の存在または多型性のサブセットを特定の種であるサンプルの確率と相関させ得る限り、増加する数のこのような多型性の検出は、サンプルの種分化を増加する確率で予測し得る。すなわち、特定の種に関連するより多くのこのような多型性の観察に従い、サンプルがその特定の種であり得るという信頼水準が増加する。標準的な数学アルゴリズムが使用されてこの予測がなされ得る。従って、一旦データベースが十分に拡大されると、種についての「独特」のフィンガープリントの欠失は関係なくなる。代表的には、数学アルゴリズムが種の同一性を判定し、そして信頼水準をその判定に与える。所望の信頼水準（＞90％、＞95％など）が決定され得、そしてアルゴリズムはハイブリダイゼーションパターンを分析しそして同定を提供するかまたはしないのいずれかである。場合により、判定は、サンプルが２、３、またはそれ以上の種のうちの１つであり得る。この場合、特異的な同定は不可能である。しかし、この技術の強さの１つは、チップベースのハイブリダイゼーションにより可能とされる迅速なスクリーニングにより、パターンおよび多型性のデータベースを連続的に拡大して、十分な情報の欠如により以前は同定不能であった種の同定を最終的に可能にすることである。公知の種の増加する数の単離体の分析は、その種に特徴的なフィンガープリントの構築を可能にする。しかし、各種について分析された単離体の総数が増大されるにつれ、単一で独特のコアフィンガープリントがMycobacterium種を規定することにはなりそうもないことに留意することが重要である。むしろ、Mycobact erium種の任意の特定の単離体は、全ての可能なフィンガープリントのサブセットを有することが予想される。フィンガープリントパターンに基づくMycobacter ium種の同定は、種特異的および共有の単一ヌクレオチド多型性 (SNP) ならびにフィンガープリントから構成される集められたデータベースで構築された、以下に記載するツリー（tree）に基づく分類アルゴリズムを使用することによるような、分類分析を必要とする。従って、本明細書に開示されるハイブリダイゼーションパターンを決定するチップベースの方法は、特定の種に関連する多型性のデータベースを構築すること、ならびに１回のハイブリダイゼーション実験から未知のサンプルの種分化および表現型特性を同定するためにそのデータベースを使用することの両方を可能にする。この技術はハイブリダイゼーションパターンの差異に基づいているため、種分化のこの方法は多型性の実際の同一性を知見に依存しないこともまた認識されるべきである。Mtに関連するハイブリダイゼーションパターンは、配列中の特定の点におけるヌクレオチドがMtのそれと異なる限り、異なる。置換、挿入、または欠失（例えば、AからT、C、またはG）の正確な性質は、ヌクレオチドがAではないという事実よりも重要でない（Mtがその位置にAを保有することを例示の目的で仮定する）。サンプルはその種分化を同定するために配列決定される必要はない。信頼の第２層（second layer of confidence）が、ハイブリダイゼーションパターンの差異が共有されるかまたは独特であるかを分析することによって最初の決定に加えられ得る。同定された種が、特定の部位において共有または独特のいずれかの多型性を有し、そしてチップが実際にこのような多型を検出すると仮定する場合、最初の決定における信頼性はより大きいものであり得る。同定および表現型決定の両方は、２つのゲノム領域（rpoBおよび16S rRNA遺伝子）の分析に代わって、マイコバクテリアゲノムの１つの領域の表現型決定に基づいて達成され得る。２つの属の包含は、マイコバクテリアの同定および抗生物質薬物感受性のための高密度オリゴヌクレオチドアレイの使用の首尾よい実証から得られ得る。最初に、薬物感受性に影響する他の遺伝子は、高密度オリゴヌクレオチドアレイ上にコードされ得（表１を参照のこと）、そしてこれらのさらなる遺伝子のそれぞれについてのハイブリダイゼーションパターンは、rpoB遺伝子から得られるフィンガープリントについての信頼測定を確認および提供するために使用され得る。２番目に、同一のチップベースのストラテジーが他のユーバクテリア種について用いられ得る。これは同時に、重要な臨床的表現型に関する遺伝子型の情報（例えば、毒素および病原マーカー遺伝子）ならびに同定情報を提供し得る。先の議論はMt rpoB遺伝子を一例として使用した。この方法が、一般に、他の微生物および他のゲノム領域から得た参照配列（例えば、ヒトミトコンドリアDN A配列およびMt DNA配列）に対して適用可能であることことが認識されるべきである。参照配列の長さは、完全長ゲノムから、個々の染色体、エピソーム、遺伝子、遺伝子の成分（例えば、エキソンまたは調節配列）まで、いくつかのヌクレオチドまで、広範に変化し得る。約２、５、10、20、50、100、5000、1000、5,0 00、または10,000、20,000、または100,000ヌクレオチドの間の参照配列が一般的である。時々、配列の特定の領域のみが目的である。このような場合、特定の領域は別々の参照配列として考えられ得るか、または１つの参照配列（すなわち、微生物ゲノム）の成分として考えられ得る。参照配列は、ヌクレオチド、RNA、またはDNAの、任意の天然に存在するか、変異体の、コンセンサス配列であり得る。例えば、配列はコンピューターデータベース、刊行物から得られ得るか、またはデノボで決定もしくは認識される。通常、参照配列は、予想される標的配列と高度の配列同一性を示すために選択される。しばしば、特に、有意な程度の相違（divergence）が標的配列間で予測される場合、１つより多い参照配列が選択される。野生型および変異体参照配列の組合わせが、タイル化ストラテジーのいくつかの適用において用いられる。図32は、本発明のソフトウェアー実施態様を実行するために使用され得るコンピューターシステムの例を示す。図32は、コンピューターシステム100を示す。これはモニター102、スクリーン104、キャビネット106、キーボード108、およびマウス110を含む。マウス110は、マウスボタン112のような１つ以上のボタンを有し得る。キャビネット106は、CD-ROMドライブ114、システムメモリー、およびハードドライブ（図33を参照のこと）を備える。これらは、本発明を実行するためのコードを組み込んだソフトウェアープログラム、本発明とともに使用するためのデータなどの保存および検索のために利用され得る。CD-ROM116は例示的なコンピューター読み取り可能保存媒体として示されているが、フロッピーディスク、テープ、フラッシュメモリー、システムメモリー、およびハードドライブを含む他のコンピューター読み取り可能保存媒体が利用され得る。キャビネット10 6はまた、中央プロセッサー、システムメモリー、ハードデイスク、などのようなありふれたコンピューター構成部分を備える。図33は、本発明のソフトウェアー実施態様を実行するために使用され得るコンピューターシステム100のシステムの組立分解図を示す。図32に示されるように、コンピューターシステム100はモニター102およびキーボード108を含む。コンピューターシステム100はさらに、中央プロセッサー102、システムメモリー120 、Ｉ/Oコントローラー122、ディスプレイアダプター124、リムーバブルディスク 126（例えば、CD-ROMドライブ）、固定されたディスク128（例えば、ハードドライブ）、ネットワークインターフェイス130、およびスピーカー132のようなサブシステムを含む。本発明での使用に適切な他のコンピューターシステムは、さらなるまたはいくつかのサブシステムを含み得る。例えば、別のコンピューターシステムは、１つより多いプロセッサー102（すなわち、マルチプロセッサーシステム）またはキャッシュメモリーを含み得る。 134のような矢印は、コンピューターシステム100のシステムバス構造を示す。しかし、これらの矢印は、サブシステムをリンクするために作用する任意の内部接続図を例示する。例えば、ローカルバスは中央プロセッサーをシステムメモリーおよびディスプレイアダプターに接続するために利用され得る。図33に示されるコンピューターシステム100は、本発明での使用のために適切なコンピューターシステムの例でしかない。本発明での使用に適切なサブシステムの他の配置は、当業者には容易に明白である。本発明の方法は、オリゴヌクレオチドアレイを用いる。これは、その配列が公知である、１つ以上の選択された参照配列に相補性を示すプローブを含む。代表的には、これらのアレイは、米国特許第5,143,854号ならびにPCT特許公開番号WO 90/15070、WO92/10092、およびWO95/11995（これらのそれぞれは、本明細書中で参考として援用される）に記載のような固相表面上で高密度アレイで（「チップ上のDNA」）固定されている。種々のストラテジーが、チップ上でオリゴヌクレオチドプローブアレイを整列および表示するために利用可能であり、それにより標的核酸についてのハイブリダイゼーションパターンおよび得られる配列情報を最大化する。例示的な表示および整列ストラテジーはPCT特許公開番号WO94/12305（本明細書中で援用される）に記載されている。より完全な記載のために、基本的なストラテジーの簡潔な記載を以下に記載する。基本的なタイル化ストラテジーは、１つ以上の選択された参照配列に高度の配列同一性を示す標的配列の分析のための固定されたプローブのアレイを提供する。このストラテジーは、４つのプローブセットに再分されるアレイについて例示される。しかし、満足な結果が１つのプローブセット（すなわち、先に記載の参照配列に相補的なプローブセット）から得られることは明らかである。第１のプローブセットは、選択された参照配列と完全な相補性を示す複数のプローブを含む。完全な相補性は、通常、プローブの長さを通じて存在する。しかし、参照配列に対する相補性を欠如するリーディング配列またはトレイリング配列に隣接されている完全な相補性のセグメント（単数または複数）を有するプローブもまた使用され得る。相補性を有するセグメント内において、第１のプローブセット中の各プローブは、参照配列中のヌクレオチドに対応する少なくとも１つの質問位置を有する。すなわち、プローブおよび参照配列が２つの間で相補性が最大になるようにアラインされる場合、質問位置は参照配列中の対応するヌクレオチドとアラインされる。プローブが１つより多い質問位置を有する場合、それぞれは参照配列中のそれぞれのヌクレオチドに対応する。質問位置と第１のプローブセット中の特定のプローブの対応するヌクレオチドとの同一性は、第１のセット中のプローブの検査により簡単には決定され得ない。明らかなように、質問位置および対応するヌクレオチドは、第１のプローブセット中のプローブおよびさらなるプローブセットからの対応のプローブの構造比較により規定される。原則として、プローブは、参照配列に相補的なセグメント中の各位置に質問位置を有し得る。時々、質問位置は、相補性を有するセグメントの末端から離れて位置する場合、より正確なデータを提供する。従って、代表的には、長さXの相補性を有するセグメントを有するプローブは、X-2質問位置より多くを含まない。プローブは、代表的には、９〜21ヌクレオチドであり、そして通常、全てのプ口ーブは相補的であるので、プローブは、代表的には、１〜19の質問位置を有する。しばしば、プローブは、プローブの中心でまたはその近傍で、１つの質問位置を含む。本発明の説明の目的のために、第１のセットの各プローブに対して、３つのさらなるプローブセットからの３つまでの対応するプローブが存在する。図１は、本発明の塩基の「タイル化(tiling)」ストラテジーを説明する。従って、参照配列において各々の目的のヌクレオチドに対応する４つのプローブが存在する。４つの対応するプローブの各々は、目的のヌクレオチドとともに整列される質問位置を有する。通常、３つのさらなるプローブセットからのプローブは、１つの例外を除いて、第１のプローブセットからの対応するプローブと同一である。例外は、少なくとも１つの（そしてしばしば唯一の）質問位置（これは４つのプローブセットからの４つの対応するプローブの各々において同一の位置に存在する）が４つのプローブセットにおいて異なるヌクレオチドで占有されていることである。例えば、参照配列のＡヌクレオチドに対して、第１のプローブセットからの対応するプローブは、Ｔにより占有された質問位置を有し、そしてさらなる３つのプローブセットからの対応するプローブは、Ａ、Ｃ、またはＧ（各プローブにおいて異なるヌクレオチド）により占有されたそれぞれの質問位置を有する。勿論、第１のプローブセットからのプローブが、参照配列に対する相補性を欠失したトレイリングまたはフランキング配列を含む（図２参照）場合、これらの配列が、３つのさらなるセットからの対応するプローブにおいて存在する必要はない。同様に、３つのさらなるセットからの対応するプローブは、第１のプローブセットからの対応するプローブに存在しない相補性のセグメントの外側にリーディングまたはトレイリング配列を含み得る。時折、さらなる３つのプローブセットからのプローブは、第１のプローブセットからの対応するプローブの完全に相補的なセグメントの近接するサブ配列と同一である（質問位置の例外を除いて）。この場合、サブ配列は、質問位置を含み、そして通常、相補性のセグメントの末端からの１つまたは両方の末端のヌクレオチドの省略においてのみ完全長プローブとは異なる。すなわち、第１のプローブセットからのプローブが長さｎの相補性のセグメントを有する場合、他のセットからの対応するプローブは、通常、少なくとも長さｎ−2のセグメントのサブ配列を含む。従って、サブ配列は、通常、少なくとも３，４、７、９、15、21または25ヌクレオチド長、最も典型的には、9〜21ヌクレオチドの範囲である。サブ配列は十分に長いか、またはプローブが参照配列よりも質問位置で変異した参照配列の改変体に対して検出可能により強固にハイブリダイズするようなハイブリダイゼーション条件であるべきである。プローブは、相補的な塩基対形成によって標的核酸配列とハイブリダイズし得るオリゴデオキシリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチド、あるいはこれらのポリマーの任意の改変形態であり得る。相補的な塩基対形成とは、配列特異的な塩基対形成（例えば、Watson-Crick塩基対形成ならびにHoogsteen塩基対形成のような他の形態の塩基対形成を含む）を意味する。改変形態は、2'-0-メチルオリゴリボヌクレオチドおよびいわゆるPNA（オリゴデオキシリボヌクレオチドがホスホジエステル結合よりむしろペプチド結合によって結合される）を含む。プローブは、任意の結合によって支持体に付着され得る（例えば、3'、5'または塩基により）。3'付着は、この方向がオリゴヌクレオチドの固相合成に好適な化学反応と適合するので、より通常である。第１のプローブセットにおけるプローブの数（および結果としてさらなるプローブセットのプローブの数）は、参照配列の長さ、参照配列における目的のヌクレオチドの数および１プローブあたりの質問位置の数に依存する。一般に、参照配列における目的の各ヌクレオチドは、プローブの４つのセットにおいて同一の質問位置を必要とする。例として、100ヌクレオチドの参照配列（その内の50が目的である）、および各々単一の質問位置を有するプローブを考慮されたい。この状況では、第１のプローブセットは50のプローブを必要とし、各々は、参照配列における目的のヌクレオチドに対応する１つの質問位置を有する。第２、第３および第４のプローブセットは、各々、第１のプローブセットにおける各プローブに対応するプローブを有し、従って、各々もまた、合計50のプローブを含む。参照配列における目的の各ヌクレオチドの同一性は、４つのプローブセットからのヌクレオチドに対応する質問位置を有する４つのプローブで、相対的なハイブリダイゼーションシグナルを比較することによって決定される。いくつかの参照配列において、全てのヌクレオチドが目的である。他の参照配列において、改変体（変異または多型）が集中する特定の部分のみが目的である。他の参照配列において、特定の変異または多型およびすぐ近隣のヌクレオチドのみが目的である。通常、第１のプローブセットは、少なくとも１つのヌクレオチド（例えば、点変異を表す）および１つのすぐ近隣のヌクレオチドに対応するように選択される質問位置を有する。通常、第１のセットにおけるプローブは、少なくとも３、10、50、100、1000、20,000、100,000、1,000,000、10,000,000 またはそれ以上の近接するヌクレオチドに対応する質問位置を有する。プローブは、通常、少なくとも５、10、30、50、75、90、99または時には100％の参照配列におけるヌクレオチドに対応する質問位置を有する。頻繁に、第１のプローブセットプローブは参照配列に完全に亘り(span)、そして参照配列に関して互いに重複する。例えば、ある通常の配列において、第１のプローブセットにおける各プローブは、参照配列に相補的である3'塩基の省略および参照配列に相補的である5' 塩基の獲得によってそのセットの他のプローブとは異なる。図３は、塩基タイル化ストラテジーにおけるプローブの増加する遷移を説明する。チップ上のプローブの数は非常に多数であり得る（例えば、10⁵〜10⁶）。しかし、しばしば所定の長さのプローブの総数の比較的小さい部分（すなわち、約50 ％、25％、10％、５％または１％未満）のみが、特定のタイル化ストラテジーを行うために選択される。例えば、８マー(octomer)プローブの完全なセットは、6 5,536のプローブを含む；従って、本発明のアレイは、典型的には、32,768よりも少ない８マープローブを有する。10マープローブの完全なアレイは、1,048,57 6のプローブを含む；従って、本発明のアレイは、典型的には、約500,000よりも少ない10マープローブを有する。しばしば、アレイは、下限の25、50または100 のプローブ、および10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰など程の多数のプローブを有する。アレイは、プローブを支持体に付着させるリンカーのようなプローブ以外の他の成分を有し得る。所定の長さの全ての可能なプローブの部分のみの使用のいくつかの利点としては以下を含む：(i) アレイ中の各位置が、ハイブリダイゼーションが生じるか否かについて高度に有益である；(ii) 非特異的ハイブリダイゼーションが最小化される； (iii) 特に既知の標準のハイブリダイゼーションパターンを参照して、ハイブリダイゼーション差異と配列差異とを関連させるのが簡単である；および (iv) 高解像度写真製板を用いて、合成の間に独立して各々のプローブを検討する(address)能力は、任意の配列に対してアレイを設計し、そして至適化することを可能にする。例えば、任意のプローブの長さは、他のものとは独立して変化し得る。概念的な単純性のために、セットにおけるプローブは、通常、チップを横切るレーン中に配列の順番に整列されるが、この整列は必要とされない。例えば、プローブは、チップ上にランダムに分配され得る。レーンは、一連の重複するプローブを含有し、これらは、選択された参照配列を表すか、またはタイル化する(t ile across)（図３を参照のこと）。プローブの４つのセットの成分は、通常、４つの平行レーン中に配置され、水平方向に列を集合的に構成し、そして垂直方向に４メンバーカラムの系列を集合的に構成する。４つのプローブセットからの対応するプローブ（すなわち、参照配列の同じサブ配列に相補的である）は、カラムを占有する。レーン中の各プローブは、通常、図３に示されるように、一方の末端での塩基の省略および他方の末端でのさらなる塩基の含有によって、レーン中に前にあったものとは異なる。しかし、この整然としたプローブの連続は、アレイの特定のカラムにおけるコントロールプローブの含有またはプローブの省略によって中断され得る。このようなカラムは、チップを方向付けるか、またはバックグラウンド（チップに非特異的に結合した標的配列を含み得る）を測定するためのコントロールとして働く。プローブセットは、通常、Ａヌクレオチドによって占有される質問位置を有する全てのプローブがＡレーンを形成し、Ｃヌクレオチドによって占有される質問位置を有する全てのプローブがＣレーンを形成し、Ｇヌクレオチドによって占有される質問位置を有する全てのプローブがＧレーンを形成し、そしてＴ（またはＵ）によって占有される質問位置を有する全てのプローブがＴレーン（またはＵレーン）を形成するように、レーン中に配置される。この配列において、プローブセットとレーンとの間にただ一つの一致も存在しないことに留意されたい。従って、第１のプローブセットからのプローブは、図４における５つのカラムに対してＡレーン、Ｃレーン、Ａレーン、ＡレーンおよびＴレーンで配置される。プローブのカラム上の質問位置は、その同一性がそのカラム中のプローブへのハイブリダイゼーションの分析から決定される標的配列における位置に対応する。従って、I₁−I₅は、それぞれ、図４のN₁〜N₅に対応する。質問位置は、完全一致と単一塩基ミスマッチとの間のディファレンシャルハイブリダイゼーションシグナルを最大化するために、通常はプローブの中心位置またはその近辺であるが、プローブのいずれの位置でもあり得る。例えば、11マープローブについて、中心位置は６番目のヌクレオチドである。プローブのアレイは、通常、上記のように、列およびカラムに配置されるが、チップ上でのプローブのこのような物理的整列は必須ではない。アレイ中の各プローブの空間的位置が既知である場合、プローブからのデータは、チップ上のプローブの物理的整列に関係がない標的の配列を得るように収集および保有され得る。データを処理することにおいて、それぞれのプローブからのハイブリダイゼーションシグナルは、チップ上のプローブの物理的整列がどうであろうと、引き続くデータ換算のために所望される任意の概念的なアレイに再仕分け(reassort) され得る。一連の長さのプローブがチップにおいて用いられ得る。上記のように、プローブは、独占的に相補性セグメントからなり得るか、または、フランキング、トレイリングおよび/またはインターベンニングセグメントによって並列される１つ以上の相補性セグメントを有し得る。後者の状況では、相補性セグメントの全長が、プローブの長さよりも重要である。機能的な用語において、第１のプローブセットの相補性セグメントは、プローブが、プローブの質問位置に対応するヌクレオチドに単一塩基変異を含む参照の改変体と比較して、より強く検出可能に参照配列にハイブリダイズするのに十分な長さであるべきである。同様に、さらなるプローブセットからの対応するプローブにおける相補性セグメントは、プローブが、参照配列に関する質問位置に単一のヌクレオチド置換を有する参照配列の改変体により強く検出可能にハイブリダイズするのに十分な長さであるべきである。プローブは、参照配列に完全相補性（おそらくプローブセットに依存する質問位置以外）を示す、通常には少なくとも３ヌクレオチドの長さ、そしてより通常には少なくとも５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25または30塩基の長さを有する単一の相補性セグメントを有する。いくつかのチップでは、全てのプローブが同じ長さである。他のチップは、異なる群のプローブセットを使用し、この場合には、プローブは群内で同じサイズであるが、異なる群間で異なる。例えば、いくつかのチップは、全てのプローブが11マーである上記の４つのプローブのセットを含む１つの群、ならびに全てのプローブが13マーである４つのプローブのセットを含む第２の群を有する。勿論、さらなるプローブの群が付加され得る。従って、いくつかのチップは、例えば、11マー、13マー、15マーおよび17マーのサイズを有する４つのプローブの群を含む。他のチップは、４つのプローブの同じ群内において異なるサイズのプローブを有する。これらのチップにおいて、第１のセットにおけるプローブは、互いに独立して長さ変化し得る。他のセットにおけるプローブは、通常、第１のセットからの同じカラムを占有するプローブと同じ長さである。しかし、時折、異なる長さのプローブが４つのレーンにおける同じカラム位置に含まれ得る。異なる長さのプローブが、反応のpH、温度、およびイオン条件でのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション安定性に依存するプローブからのハイブリダイゼーションシグナルを同等化するために含まれる。プローブの長さは、標的配列と完全にマッチしたプローブと、この標的配列と、単一の塩基のミスマッチを示すプローブとを区別することにおいて、重要であり得る。この識別力は、短いプローブについて、通常はより大きい。より短いプローブはまた、通常は、二次構造の形成をしにくい。しかし、結合した、標的配列の絶対的な量、およびそれ故にシグナルは、より大きなプローブについて、より多い。これらの競合する考慮点の間の最適な妥協を提示するプローブの長さは、とりわけ、標的DNA配列の特定の領域のGC含量、二次構造、合成効率、および交差ハイブリダイゼーションに依存して変化し得る。標的のいくつかの領域において、ハイブリダイゼーション条件に依存して、短いプローブ（例えば、11 mer ）が、より長いプローブ（例えば、19 mer）では接近できない情報を提供し得る。その逆もまた同じ。最大の配列情報は、上記のようなチップ上に異なるサイズのプローブのいくつかの群を含むことによって、読み取られ得る。しかし、標的配列の多くの領域について、このようなストラテジーは冗長な情報を提供する。すなわち、同じ配列が、プローブの別の群によって複数回読まれるという点である。同等の情報を、異なるサイズのプローブの単一の群から得ることができる。ここで、サイズは、標的配列の特定の領域で読み取り可能な配列を最大にするように選択される。いくつかのチップは、欠失変異を分析するために特に設計されたさらなるプローブセットを提供する。さらなるプローブセットは、上記の第１のプローブセットにおける各プローブに対応するプローブを含む。しかし、さらなるプローブセットに由来するプローブは、図５に示されるように、さらなるプローブセットに由来するプローブにおいて、質問位置を占有するヌクレオチドが欠失されている点で、第１のプローブセットにおける対応するプローブとは異なる。必要に応じて、さらなるプローブセットに由来するプローブは、第１のプローブセットに由来する対応するプローブに関して、その末端の一方にさらなるヌクレオチドを有する（図５で括弧で示す）。さらなるプローブセットに由来するプローブは、質問位置に対応するヌクレオチドで、単一の塩基欠失を有する標的配列に対応する、第１のプローブセットに由来するプローブよりも、さらに強力にハイブリダイズする。質問位置だけではなく、近接したヌクレオチドもまた欠失しているさらなるプローブセットが提供される。同様に、他のチップが、挿入を分析するためのプローブセットを提供する。例えば、一つのさらなるプローブセットは、上記の第１のプローブセット中のそれぞれのプローブに対応するプローブを有する。しかし、さらなるプローブセット中のプローブは、質問位置の近隣に挿入された余分なＴヌクレオチドを有する。図５を参照のこと（余分なＴが四角で囲んで示されている）。必要に応じて、プローブは、第１のプローブセットに由来する対応するプローブに関してその末端の一方に１つ少ないヌクレオチドを有する（括弧で示す）。さらなるプローブセットに由来するプローブは、図５の参照配列のヌクレオチド「ｎ」の左側にＡの挿入を有する標的配列に対応する、第１のプローブセットに由来するプローブよりもさらに強力にハイブリダイズする。質問位置の近傍に挿入されたＣ、Ｇ、またはＡのヌクレオチドを有する同様のさらなるプローブセットが、構築され得る。通常は、４つのこのようなさらなるプローブセット（各ヌクレオチドについて１つ）が、組み合わせて使用される。第１のプローブセットに由来する対応するプローブとの、さらなるプローブセットに由来するプローブのハイブリダイゼーションシグナルの比較は、標的配列が挿入を含むかどうかを示す。例えば、さらなるプローブセットの１つに由来するプローブが、第１のプローブセットに由来する対応するプローブよりも高いハイブリダイゼーションシグナルを示す場合、標的配列は、標的配列中の対応するヌクレオチド（ｎ）の近隣に挿入を有することが推測される。標的中に挿入された塩基は、最も高いハイブリダイゼーションシグナルを示す、さらなるプローブセット由来のプローブにおいて挿入された塩基の相補物である。第１のプローブセットに由来する対応するプローブが、さらなるプローブセットに由来する対応するプローブよりも高いハイブリダイゼーションシグナルを示す場合、標的配列は、標的配列中の対応する位置（図５中の（ｎ））の左に挿入を含まない。他のチップは、複数の密接した範囲に変異を有する標的配列を分析するための、さらなるプローブ（多重変異プローブ）を提供する。多重変異プローブは、通常、質問位置を占有している塩基を除いて、そして参照配列において置換が起こり得るヌクレオチドに対応する１つ以上のさらなる位置を除いて、上記のような第１のセット由来の対応するプローブと同一である。可能な置換が起こっている場合、多重変異プローブ中の１つ以上のさらなる位置が、参照配列における対応する位置を占有しているヌクレオチドに相補的なヌクレオチドによって占有されている。本発明の別の局面は、参照配列に完全に相補的な複数のプローブを含む第１のプローブセット、および必要に応じて１つ以上のさらなるプローブセット（それぞれのさらなるセットは、目的のヌクレオチドについての質問位置を有する第１のセットにおけるプローブに対応するプローブを含む）を用いるチップから、ハイブリダイゼーションパターンを誘導する。さらなるプローブセットにおけるプローブは、第１のプローブセットにおけるそれらの対応するプローブとは、質問位置に異なるヌクレオチドを有することが異なる。全体のハイブリダイゼーションは、第１のプローブセット中のプローブ、およびさらなるプローブセットにおけるその対応するプローブからなるプローブの群に対する標的のハイブリダイゼーションによって観察される最大のハイブリダイゼーション強度を、プローブのこの群によって質問される標的のヌクレオチド位置に対してプロットすることによって誘導される。従って、この方法において、プローブは、特定の群におけるすべてのプローブが、分析される配列中共通のヌクレオチド位置を質問する群に従って群化される。これらの群は、質問プローブの群と呼ばれる。例えば、図４に関して、質問位置I¹を有するプローブの第１の列は位置ｎ¹を質問しており、質問位置I²を有するプローブの第２の列は位置ｎ²を質問しており、以下同様である。図１において先に記載される場合、すなわち、第１のプローブセットに由来する対応するプローブが質問位置にＴヌクレオチドを有し、そして他の３つのプローブセットに由来する対応するプローブが、Ｃ、Ｇ、およびＡヌクレオチドをそれぞれ有する場合、分析されるサンプル配列のその位置に目的の特定のヌクレオチドを質問する全部で４つのプローブが存在する。これらのプローブのそれぞれから観察される最も高い強度が測定され、そしてサンプル配列のその位置に対応する最大のハイブリダイゼーション強度としてその測定した値が決められる。次いで、この決定は、分析されるサンプル配列の残存しているヌクレオチド位置について何度も繰り返され、ヌクレオチド位置に対するハイブリダイゼーション強度のプロットを得ることができる。特定の位置の、４つ全ての可能性のあるヌクレオチド多型性を質問する、対応するプローブのさらなるセットが必ずしも存在しないことが認識されるはずである。すぐ前に記載した方法は、特定の位置での最大のハイブリダイゼーション強度、および標的配列をスキャンまたはこれを「通じてタイル化」するにつれて、その位置から隣に近接する位置までその最大強度がどのように変化するかの両方を測定する。従って、チップは、参照配列に対して相補的である単一のプローブセットを使用し得る；それらのそれぞれが、その位置で目的の対応するヌクレオチドを変化することによって、標的中の特定の位置を質問する、複数のプローブセット；または、第１のプローブセットおよび質問プローブの群の第１のセットを含むさらなるプローブセットとは異なる長さである、なおさらなるプローブセット。例えば、参照配列を横切ってタイル化する参照に相補的である、単一のプローブセットを含むチップが使用され得る。この場合、サンプルの特定のヌクレオチド位置を質問する1つのプローブのみが存在するにもかかわらず、その特定のプローブのハイブリダイゼーション強度は、質問されるヌクレオチド位置の関数としてプロットされる。この場合、「最大の」ハイブリダイゼーション強度は存在しない。なぜなら、各位置は、ただ１つのプローブによって「質問される」からである。しかし、分析される配列のヌクレオチド位置の関数としてのハイブリダイゼーション強度の画像プロットからなお導かれ得、そして、誘導されたプロットを用いて遺伝型と相関するデータベースが構築される。１つのプローブセット（参照配列に相補的である）を使用するこの方法は、1995年10月16日に出願された米国特許出願番号第08/531,137号に記載されている。このような方法によって得られるプロットを、図17に示す。この完全なプロットは、単一のハイブリダイゼーション実験から集められた画像によって導かれる。分析されるサンプル配列が変化するにつれて、このプロットの形状もまた変化する。明確な説明のために、以下の考察は、Mycobacterium tuberculosis rpoB 遺伝子由来の参照配列に相補的なプローブを含むチップを使用する。そして参照配列（すなわち、M．tuberculosisサンプル由来）がチップにハイブリダイズする場合に観察される画像に由来する最大のハイブリダイゼーション強度のプロットは、基線、または参照プロット（もしくはパターン）と呼ばれる。tuberculos is以外のMycobacteriumの種に由来する標的配列は、異なる形状のプロットを生じる。従って、公知の種分化の標的を使用するハイブリダイゼーション実験は、これらの異なる形状のプロットのそれぞれが、種分化または他の遣伝子型の特徴と相関付けられるデータベースを提供する。次いで、これは、表現型の存在の予想を可能にする。任意の目的の遺伝子がチップを横切ってタイル化され得ること、およびその遺伝子またはその多型変異体を含むと疑われる任意の他のサンプルからのチップ上の画像に由来するハイブリダイゼーションパターンが、サンプル中のその遺伝子の特定の変異体の存在または非存在を検出するために使用され得ることが明らかであるはずである。図17は、参照配列がMycobacterium tuberculosis rpoB遺伝子由来であり（実施例に記載されるMtbチップ）、そして標的がM．gordonaeである場合について、参照配列に沿って質問される位置の関数としてハイブリダイゼーション強度のプロットを示す。図18は、他のMycobacterium種を用いて得られた同様のプロットを示す。M．tuberculosisと異なる種は、M．tuberculosisと同一である配列のセグメントに由来するハイブリダイゼーション強度においてさえも、差異を生じることがまた注目される。従って、この方法は、M．tuberculosisと同一であるサブ配列に由来する情報を誘導することもなお可能にする。明らかであるように、各種は、特徴的なパターンを生じる。参照配列（この場合、Mt rpoB）を用いて得られるパターンを基線（または参照）パターンとして取り上げ得、そして参考に由来するパターンの上に標的に由来するパターンを、参照との差異を検出するために重ねる。図19は、Mtbチップ上で観察された、Mtb由来のパターンに対する異なる標的由来のパターンのそのような重ねあわせを示す。予想されるように、標的がM．tuberculosisである場合（下段のパネル）、重ねあわせは完全であるが、標的がM．tuberculosisではない場合、差異が存在する。従って、これらのパターンのそれぞれは、その特定の種についての「フィンガープリント」である。一旦、フィンガープリントのデータベースが確立されると、未知の標的から得られた対応するパターンと比較して、特定の種であると標的を最終的に同定するか、またはデータベース中に存在する種の任意の１つである標的の可能性を排除するかのいずれかし得る。図20Ａ〜20Ｄは、４つのMycobacterium種由来のフィンガープリントとの未知の患者のサンプルのそのような比較を示し、これは、マッチを示し、従って、未知のサンプルをM．gordonaeとして同定する。図21は、２つの他のサンプル（６および７、以前に、他の技術によって、M．aviumとして間違って同定されていた）の、M.xenopiおよびM．intracellulareとしての同様の同定を示す。先の考察が示すように、サンプルのヌクレオチド位置に対するハイブリダイゼーション強度をプロットするいくつかの方法が存在する。これらの全ては、遺伝子型の差異に特徴的なパターンを提供する。このように、本発明は、本明細書中で開示される特異的なプロトコルによって誘導されるプロットを使用することに制限されない。先に説明するように、遺伝子型および遺伝子型の差異の同定はまた、表現型の予想を可能にする。標的パターンがそれに対して比較される基線パターンを作製するために使用される配列は、参照配列がチップにハイブリダイズしたサンプル由来である必要はないことが認識されるはずである。標的サンプルに関連する任意の他のサンプルが使用され得る。なぜなら、この方法が、基線パターンと未知の標的由来のパターンとの間の差異を比較するからである。高密度のオリゴヌクレオチドのアレイが、Mycobacterium属内の単離体の種を同定するために利用された遺伝子領域から集められた情報を使用して、薬物耐性を付与された変異を検出するために利用され得る。例えば、Mycobacteriumのrpo B遺伝子の700塩基対が、リファンピンに対する耐性を付与する変異を検出するため、およびMycobacterium種の同定を可能にする多型性を検出するために利用され得る。表1Bは、rpoBの700塩基対内で、M．tuberculosisと比較した９つの非結核種で観察された全多型性変化を示す。これらの任意の非結核種とともに、種特異的（観察された多型性の塩基位置がその種でのみ見出された）および共有（多型性を有する塩基位置がその種の単離体のいくつかおよび他のMycobacterium種の単離体のいくつかで見出された）の両方が存在する。実質的に、これらの多型性の全ては、以前には記載されておらず、それらの対応する種の同定について有用および重要なマーカーを構成する。表1B マイクロバクテリア多型性分析 16SrRNA配列は、一般的に、Mycobacteriumの種を同定するために利用される。しかし、rpoB遺伝子を使用するハイブリダイゼーションパターンの分析は、誤って分類されたいくつかの単離体が存在することを示している。例えば、Californ ia Public Health departmentから受け取った２つのMycobacterium単離体（96-1 761および95-1760）は、M．avium単離体として示されていた。rpoB遺伝子を利用する場合、M．intracellulare（M．aviumの近縁関係）と最も類似する一致であったことが決定された。以下には、生物が属する属内の種を同定する実施態様を記載する。しかし、このプロセスは、一般的に、生物に対して群（この群は、種、亜種、表現型、遺伝子型などであり得る）を割り当てるために適用される。従って、以下の説明が、本発明の実施態様を例示する。図35は、生物が属する属内の種を同定する方法のコンピューター実行フローチャートを示す。工程300で、公知の生物からの核酸配列の種が入力される。これらの核酸配列は、「公知の核酸配列」と称される。さらに、工程302で、公知の核酸配列に対するハイブリダイゼーションパターンが入力される。ハイブリダイゼーションパターンは、参照核酸配列のサブ配列に対する、公知の核酸配列のサブ配列のハイブリダイゼーション親和性を示す。例えば、参照核酸配列のサブ配列は、チップ上の核酸プローブの部分であり得る。工程304で、種および公知の核酸配列のハイブリダイゼーションパターンのデータベースが生成され得る。他の工程でのように、この工程は任意であるが、より効率的に種を同定し得る。このシステムは、サンプル核酸配列のハイブリダイゼーションパターンと、工程308での公知の核酸配列についてのハイブリダイゼーションパターンを比較し、これは、必要に応じてデータベースに保存され得る。工程308で、このシステムは、特異的な位置でサンプル核酸配列のハイブリダイゼーションパターンと最も近く一致する公知の核酸配列のハイブリダイゼーションパターンに従ってサンプル核酸が得られた生物の種を決定する。全体のパターン一致技術が利用され得るにもかかわらず、種特異的多型性位置および／または共有の多型性位置もまた分析し得る。さらに、これはサンプル核酸配列の種を同定するために利用される、ハイブリダイゼーションパターンの組合せであり得る。ハイブリダイゼーションパターンの比較は、公知の技術のいずれかで行われ得る。好ましい実施態様において、直線回帰が、全てまたは選択される塩基位置を横切って利用され、ハイブリダイゼーション強度を正規化する。次いで、直線回帰からの回帰係数を利用して、ハイブリダイゼーションパターンのハイブリダイゼーション強度、そしてそれ故核酸配列の近縁度を測定する。さらに、サンプル核酸のハイブリダイゼーションパターンが、公知の核酸配列のハイブリダイゼーションパターンにいかに近縁に適合するかに依存して、システムは、工程310に示されるように、サンプルについて同定された種が正しいという確率を計算し得る。再び図19を参照すると、この図は、Mycobacteria種のハイブリダイゼーション強度のプロットを示している。DNAアッセイは、チップの野生型配列としてMycob acteria tuberculosis (Mtb) に対して設計された。このチップは、Mtbチップとして参照され、チップがMtbでタイル化 (tiled) されていることを示す。言い換えれば、他のプローブに加えて、連続的な塩基位置で、Mtbに完全に相補的なプローブが存在する。これらのプローブは、野生型プローブまたは参照配列に相補的なプローブとして参照される。 Mtbは、Mtbチップにハイブリダイズされ、そして野生型プローブ対塩基位置のハイブリダイゼーション強度にこでは、光子カウントの対数関数として測定した）は、下のグラフに「Mtb 対 M．tuberculosis」として識別されて示される。グラフは、Mtbのハイブリダイゼーションパターンの例を示している。グラフの表題によって示されるように、このグラフは、それ自身に対するMtbハイブリダイゼーション強度パターンを実際に示し、その結果、実際に、互いに重ねられた２つのハイブリダイゼーションパターンが存在する。以下の段落において、Mtb配列は、参照配列（すなわち、代表的には公知の配列である）として識別される。 Mycobacteriaの多くの種が存在する。多数の種が、Mtbチップにハイブリダイズし、そして図19のグラフは、野生型プローブ対塩基位置のハイブリダイゼーション強度（ここでもまた、光子カウントの対数関数として測定した）を示す。My cobacteria種のハイブリダイゼーションパターンに加えて、各グラフはまた、参照配列Mtbのハイブリダイゼーションパターンを示す。異なるMycobacteria種の塩基の80％が同一であり得るにもかかわらず、各種は、固有のハイブリダイゼーションパターンまたはフットプリントを生じる。Myco bacteria種であることが知られているサンプル配列（例えば、先の塩基呼出アルゴリズム(base calling algorithm)またはジデオキシ配列決定由来）は、同様に、Mtbチップにハイブリダイズされ得る。得られるハイブリダイゼーションパターンは、サンプル配列の同一性を決定するために、公知の配列のハイブリダイゼーションパターンと比較され得る。 Mycobacteria種自身（または他の種）は、塩基呼出アルゴリズムまたはジデオキシ配列決定が、Mycobacteria種としてサンプルを同定し得るに十分であるという類似性を有し得る。この種はまた、この方法がハイブリダイゼーションパターンに従って種を同定し得るに十分であるという相違点を有し得る。この例では、チップ野生型配列および参照配列が、同じ配列であったにもかかわらず、異なる配列が利用され得る。検討されるハイブリダイゼーションパターンは、野生型プローブのハイブリダイゼーション強度によって生じた。しかし、ハイブリダイゼーションパターンは、各塩基位置で最も高い強度のプローブのハイブリダイゼーション強度を利用することを含む、他の方法を生じ得る。さらに、この方法は、他の種または無関係の核酸配列においてさえ、サンプル配列を同定するために利用され得る。代表的には、予想されるように、同じ種の異なる単離体の間の差異は、小さいのに対して、異なる種の間で観察されたハイブリダイゼーションの差異は大きい。従って、種分化の割り当てかまたは単離体の追跡を試みるかどうかに依存して、どんな事前に設定されたレベルが所望されても、識別パターン一致機能のカットオフを決定し得る。図22は、M．gordonaeの異なる単離体で観察されたパターンおよびそれらのM．gordonaeの１つの単離体（ATCC単離体）との比較を示す。ハイブリダイゼーション強度対ヌクレオチド位置パターンの誘導、およびそれらの公知の同一であると認めるパターンとの関連は、標的の特定の位置または標的配列で存在する塩基を同定することを必要としないことに注意するべきである。代わりに、標的中の対応する位置で参照配列のヌクレオチドに同一であるヌクレオチドの存在について質問している任意の１つ以上のプローブから観察された最大ハイブリダイゼーション強度を決定し、そして塩基位置の関数としてどのように変化するかをプロットする。このようにして、得られたパターンを、公知の種分化の生物からのパターンのデータベースと比較して、一致の存在または非存在を確立する。従って、割り当てを行うために、標的配列における任意の塩基を「呼出す」または同定する必要はない。一旦、標的配列パターンと基線の参照パターンとの間の差異が確立されると、これらの差異は、標的と参照との間のヌクレオチド配列における差異の存在として、同じ様に使用され得、特定の位置でハイブリダイゼーション強度における特定レベルの差異の存在が特定の種または遺伝子型を示すという確率を誘導する。次いで、参照から観察された相違の全ては、特定の種または遺伝子型であるサンプルの複合確率を与えるために組み合わせられ得る。従って、ハイブリダイゼーションのこれらのパターンの誘導はまた、先に記載された同定方法の「バーコード」型の使用を可能にする。図17に示されるように、ハイブリダイゼーションパターン強度由来のパターンを用いて、参照の配列とは異なる標的の配列である領域からだけではなく、全体の配列からの情報が得られ得る。このパターン一致の方法の１つの利点は、同じセットのプローブがチップ上で使用されると仮定すると、割り当てを行うために、異なる時間および異なる濃度のサンプルで異なるチップを使用し得ることである。なぜなら、異なる種の各々は、同一および不変のハイブリダイゼーションパターンを生成するからである。例えば、２つのパターン（標的配列対参照配列）を比較するために標的の分析と同時に、参照配列からコントロールパターンを引き出す必要はない。なぜなら、コントロールパターンは不変であり、そしてパターン一致は、配列に沿って後に続く塩基位置の間で最大ハイブリダイゼーション強度における相対的変化を観察するからである。従って、全ての部位でハイブリダイゼーションに影響する増幅条件およびサンプル濃度のような因子は、分析の間に等しく正規化され得る。このようなパターン一致技術とともにオリゴヌクレオチドアレイを使用する本発明の方法は、一般的にrpoB遺伝子とは異なる参照配列に適用可能であり、そして標的配列と任意の遺伝子由来の参照配列との間の任意の差異を検出するために使用され得ることを認識する。例示により、そして限定することなく、参照配列は、HIV遺伝子、乳ガン (BRCA-1) 、または嚢包性線維症をコードする遺伝子由来であり得る。ソフトウエアを用いて、ハイブリダイゼーション強度をプロットし、そしてそのように誘導したパターンを参照配列または他の配列からのパターンとを比較し、標的と参照との間の差異、パターンのデータベース中の配列に対する標的の同一性または欠除を確定する。ポリヌクレオチド配列は、重複するオリゴヌクレオチドのアセンブリとして示され得る。従って、特定の配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドのセットからなるアレイは、標的配列の同一性を決定するか、標的の量を定量するか、または標的配列と参照配列との間の差異を検出するために使用され得る。多くの異なるアレイは、これらの目的のために設計され得る。このような設計の１つ（タイル化アレイと称される）は、図23Aに模式的に示される。標的配列を読むためのプローブのタイル化アレイの使用は、図23Bに示される。p^15.7（3'末端から７位で異なる15マー）タイル化アレイは、MT1（Ｄ-ループにまたがる1,311の塩基を含むクローン化配列）またはヒトミトコンドリアDNAのコントロール領域に対して設計および合成された。図23Bの上部のイメージパネルは、アレイにハイブリダイズしたmt¹蛍光標識化RNAの蛍光イメージの部分を示す。塩基配列は、各カラム内の４つのプローブの強度を比較することによって読まれ得る。例えば、16,493と標識したカラムは、3'TGACATAGGCTGTAG（配列番号１）、3'TGACATCGGCTGTAG（配列番号２）、3'TGACATGGGCTGTAG（配列番号３）、 3'TGACATTGGCTGTAG（配列番号４）の４つのプローブからなる。最も強いシグナルを有するプローブは、Ａ置換（Ａ301、Ｃ 57、Ｇ 135、Ｔ 110 カウント）を有するプローブであり、これは、16,493位の塩基をRNA転写物におけるＵ（Ａプローブに相補的）として同定する。このプロセスを継続し、配列の残りは、ハイブリダイゼーション強度から直接読まれ得る。単一塩基多型性の検出を図23Bの下部画像パネルに示す。下部パネルにおいてハイブリダイズされる標的はMT2であり、これは、この領域において、16,493位におけるTからCへの変化によってMT1と異なる。従って、G置換を有するプローブは最も強力なシグナルを示す。タイル化アレイ(tiled array)はMT1に対して設計されたので、16,493を重複する隣接プローブもまた、変化によって影響を受ける。15マーのプローブが使用されるので、合計15のカラムすなわち60のプローブが、標的における単一塩基変化によって影響を受ける。P^15,7アレイにおいて、変異を質問するプローブセットの左側の８つの位置および右側の６つの位置におけるプローブは、標的に対してさらなるミスマッチを有する。結果は、特徴的な「フットプリント」、または変異位置に隣接するプローブにおけるシグナルの喪失であり、これは図24のU字型曲線を連想させる（図24に示すデータは８マープローブについてのものであるが、本発明者らは、20マーを使用してさえも、完全なマッチから単一塩基末端位置ミスマッチを識別し得ている）。各位置における４つの質問プローブのうち、MT1に対してミスマッチを有さないよう設計されたプローブからのシグナルの喪失が最大である。本発明者らは、これらの設計されたプローブセットを、P^015,7または単にP⁰として同定する。他の３つのプローブセット（P¹と呼ぶ）において、MT1シグナルは、質問位置における単一塩基ミスマッチの結果として既に低くなっている。比較ハイブリダイゼーションおよび多色検出図23Bに示す例のような、ミスマッチから生じるシグナル強度のパターンおよびそれらの差異を、配列分析において有利に使用し得る。P⁰からのハイブリダイゼーションシグナルの喪失は、参照と標的との間の配列差異の強力な指標である。この情報は、参照配列および標的配列の両方を、同一のアレイに同時にハイブリダイズすることにより、最良に得られる。単純タイル化アレイから最大量の有用な情報を抽出するために、本発明者らは２色標識化および検出のスキームを開発し、これによって既知の配列の参照サンプルのハイブリダイゼーションを内部標準として使用することが可能になった（図25）。参照をフィコエリトリン（赤）で標識し、そして未知の標的をフルオレセイン（緑）で標識する。このアプローチは、フラグメント化、ハイブリダイゼーション、洗浄、および検出工程の間の実験的変動性を最小化するか、または除去する。さらなる利点は、サンプルと参照標的とが競合してミスマッチ識別を促進することである。参照および未知を、同一の条件下で並行して２つの異なるチップにハイブリダイズすることによって実験を行うこともまた可能である。この場合は、単一の標識のみが必要とされる。いずれかのアプローチを使用して、２つの関連配列の間の差異を、P⁰プローブの、スケールされた(scaled)ハイブリダイゼーションパターンの単純な比較から同定し得る。多型性から生じるP⁰強度における差異は、多数の位置にわたって広がり、そしてプローブ長および置換位置と相関する（図25 ）。この特徴的な大規模パターンは、単一位置における強度の差異よりも強固かつ容易に認識される。各P⁰シグナルの振幅は、配列およびミスマッチに依存するので、フットプリントの実際のサイズおよび形状は変動し得る。従って、分析された配列（これは埋め込まれた解釈の誤りを含み得る）を比較するよりもむしろ、ハイブリダイゼーション振幅サインを直接比較することによって、配列を同定し得る。ハイブリダイゼーションパターン分析は、配列多様性を検出する他の方法に対する利点を提供し得るか、またはいくつかの場合はそれらとの結合において有利であり得る。シトクロムb遺伝子および制御領域の多型性スクリーニング本発明者らは、参照ハイブリダイゼーションパターンと結合してP⁰プローブセットを、どのように使用して600bpよりもずっと大きな全長にわたって配列を分析し得るか、および単一塩基多型性がタイル化アレイを使用してどのように読み取られ得るかを示している。本発明者らは、２つのアプローチを組み合わせ、そしてアレイハイブリダイゼーションパターンを使用して、複雑な標的配列からの自動化された塩基呼出(basecalling)を行った。組み合わせは、大部分の困難を克服するのに有用であった。例えば、いくつかの配列は、特に、標的が長くそして微細な規模で反復的であるか、またはGCリッチである場合（局所的な場合でさえも）、顕著に交差ハイブリダイズし得る。既知の配列の参照からの差異に関して標的を分析することにより、多くの潜在的な混乱シグナルが無視され得る。なぜなら、それらは両サンプルにおいて同一であるからである。第二の制限は、２以上の多型性が単一のプローブ長の範囲内に生じる場合、結果的な不安定化が配列解釈の正確性を減少させる傾向があることであるが、変化の存在は、シグナルの喪失から容易に推測され得る（図25）。本発明者らは、さらなる分析のために、そのような領域を直接読み取ることを試みるよりもむしろ、それらを単純に同定するアプローチを採用した。自動塩基呼出アルゴリズム（これは、各位置について４つの質問プローブの全てを使用し、そして参照とサンプルとのハイブリダイゼーション強度を比較する）を適用した後、得られた配列を２つのカテゴリーに分離した：１つは、高い正確性で直接読み取られ得る配列、２番目は、決定的な配列割り当てのために、さらなる分析を必要とする配列。第一のカテゴリーは、各P⁰プローブとの単一のミスマッチのみを有する得られた配列、および得られた配列とP⁰とのフットプリントパターン間の一致を有するとして定義された。 P⁰強度フットプリントを、以下の方法で検出した：参照およびサンプルの強度を規格化し、そしてR（目的の塩基を中心とする５つの位置のウィンドウ(window )にわたる、log₁₀(P⁰参照/P⁰サンプル)の平均) を、配列中の各位置について算出した。サンプルプローブ強度を参照強度に対して規格化するために、各プローブ対についての強度比の、底が10の対数のヒストグラムを作図した。ヒストグラムは0.01のメッシュサイズを有し、そしてこれを、各点における値をその点を中心とする５点ウインドウにわたる平均カウント数で置換することによって滑らかにした。ヒストグラムにおける最高値の位置を定め、そして得られた強度比を最もあり得る較正係数として取り上げた。フットプリントを、バックグラウンドを少なくとも50カウント超える参照またはサンプルの強度を有する少なくとも５つの隣接位置、および実験についての上位10％以内のR値を有する領域として検出した。205の多型性部位（サンプルがP⁰にミスマッチである場所）において、Rの平均値は1.01であり、標準偏差は0.57であった。35,333の非多型性部位（すなわち、参照とサンプルの両方がP⁰との完全なマッチを有する場所）では、Rの平均値は-0.05であり、標準偏差は0.25であった。第二のカテゴリーは、複数のミスマッチおよび/または得られた配列とP⁰とのパターン間のミスマッチを有する、得られた配列を有する。例えば、図25Aに示すief007の領域は、配列が正確に呼出された場合、第一のカテゴリーに該当する。偽陽性塩基呼出は、フットプリントを欠くか、または複数のミスマッチされたプローブの予測を生じ、そしていずれの場合でもフラッグされて(flagged)いる。偽陰性は、「野生型」塩基呼出にもかかわらずフットプリントが存在することにより、検出される。限定されたプローブセットの使用から生じる偽陰性塩基呼出の例を、図26Aに示す。この場合、(CA)_nの長さの多型性が存在し、ここでMT2においてn=4であり、そして参照のMT1においてn=5である。アレイは、(CA)₅を読み取るように設計されるが、MT2標的は「野生型」として読み取られるように十分に良くハイブリダイズする。しかし、フットプリントが検出され、従って、領域はさらなる分析のためにフラッグされる。ハイブリダイゼーションパターンにおけるいくつかの差異は、標的の別の場所における変化の二次的な効果である。おそらく標的二次構造における配列特異的差異に起因する１つの例を、図26Aに示す。この例は、差異のパターンの解釈が常に単純ではないことを示す。しかし、一般的に、差異のパターンは配列分析を助けるさらなる情報の相当な量を提供する。本発明者らは、tRNA^{GlU Thr}、シトクロムb、tRNA^Thr、tRNA^Pro、制御領域、およびtRNA^Phe DNA配列に広がるMT DNAの2.5kb領域を分析した。これらの配列は、タンパク質コードからtRNA構造調節まで広がる、非常に異なる機能を有し、従ってMT DNAの種々の変異率を評価するための良い比較基準を提供するはずである。 p^20,9タイル化(tiling)アッセイを使用して、MT1と比べて180 (0.59％) の塩基置換を含有する全部で12のサンプルを分析した。結果を表1Aに示す。分析された 30,582bpのうち、塩基置換は、使用者の干渉なしに、98％の配列において＞99％の正確性で読み取られた。偽陽性呼出は全く起こらなかった。残る２％の配列を、さらなる分析のためにフラッグした。これは、非常に高い割合の正確性を示し、これは一度に2.5kbの配列を分析するために得られた。従って、より成熟したゲルに基づく技術は、クラスター化多型性および長さ多型性を読み取ることが可能であるが、4Nタイル化アレイへのハイブリダイゼーションは、かなり少ない努力によって、大部分の配列にわたって同等の結果を生じる。表1A 配列分析の結果 mt1と比較して180の置換を含有する合計12のサンプルを分析した（mt3、mt4、 mt5、mt6、ha001、ha002、ha004、ha007、ief002、ief007、ief011，およびyr01 9）。結果を、全12サンプルについて合計した。180の置換の２つを除く全てを、 P0強度差異として検出した（１つの例外を、塩基呼出により正確に読み、そしてさらなる分析のために自動的にフラッグした）。全体で、649bp（分析された配列の２％）を、さらなる分析のためにフラッグした。塩基呼出の結果を、フラッグされていない領域およびフラッグされた領域について別々に分類した。フラッグされていない領域における完全自動塩基呼出は、１/127多型性または１/29,87 9全bpの誤り率を有していた。対照的に、53 (29％) の置換を含んでいたフラッグされた領域は、14の偽陰性および８つの偽陽性を含有していた。しかし、平均して、１サンプルあたり２〜３の従来の配列決定反応すなわち全計で30の反応が、フラッグされた領域を分解し、配列全体について99.9％を超える塩基呼出の正確性を与えると、本発明者らは推定した。これは、従来の方法のみ、および配列のチェックおよび編集の労働集約的な課題における類似の省力によって配列を決定するために本発明者らが使用したよりも、８倍少ない配列決定を表す。この実験において、サンプルを、図25に記載するように調製しそしてハイブリダイズした。独立して決定される参照配列を提供するために、各2.5kb PCRアンプリコンを、ABI373A DNAシークエンサーを使用するプライマー特異的な蛍光チェーンターミネーターサイクル配列決定によって両鎖について配列決定し、そして組み立て、そしてシークエンサー3.0を使用して手動で編集(edit)した。ハイブリダイゼーション分析もまた、両鎖について実行した。本明細書中に提示する分析は、ゲノムDNAから増幅された配列が本質的にクローナルであるか、または少なくとも１つの支配的な種を含有すると仮定し、そしてゲルに基づく方法によるその決定が正確であると仮定する。PCR増幅の誤りは、約10⁵倍の増幅の推定およびTaq ポリメラーゼの既知の誤り率に基づく、本質的にランダムに分布する、最大約0. 5％の配列差異を与え得る。これは、特に参照ハイブリダイゼーションパターンとの差異を分析する場合、ゲルに基づく配列分析またはハイブリダイゼーション分析の結果に有意に影響することを予期されない。塩基呼出を、変数核密度(variable kernel density)の推定に基づくBayesian 分類アルゴリズムを使用して実行した。ハイブリダイゼーション強度値のセットに伴う各塩基呼出の尤度を、未知のプローブセットを正確な塩基呼出が既知である例のセットと比較することによって計算した。次いで、得られた４つの尤度を、それらの合計が１になるように規格化した。両鎖からのデータを、値を平均化することによって組み合わせた。最も可能性のある塩基呼出が0.6より大きな平均規格化尤度を有する場合、それは呼出され、そうでない場合、塩基は両義性であると呼出された。例のセットを２つの異なるサンプル、ib013およびief005（M T1と比較して全部で35の置換を有し、そのうちの19は分析された12のサンプルと共有され、そして16は共有されない）から得た。塩基呼出の性能は、サンプルの選択に敏感ではなかった。ハイブリダイゼーション配列分析を完全に自動化し、使用者の編集を無くした。対照的に、従来の配列決定はコンティグ構築に続く編集を必要とし、そこでは＞１％の塩基呼出を手動で訂正した。高密度オリゴヌクレオチドアレイ上記のタイプの高密度オリゴヌクレオチドアレイを設計、合成、ハイブリダイズおよび解釈するためにいくつかの技術が開発された。代表的なアレイは、記載された米国特許第5,143,854号およびPCT特許公開番号WO 90/15070およびWO 92/1 0092に記載され、その各々は本明細書に参考として援用される。しばしば、アレイは、25、50または100プローブの下限、および1,000,000、100,000、10,000または1,000プローブの上限を有する。所定範囲の長さのプローブが採用され得る。好ましくは、高密度オリゴヌクレオチドアレイの各々は、10,000〜20,000オリゴヌクレオチドプローブ(長さ10〜20マー)を含み、これは、標的核酸(RNAまたは DNA)の配列を決定するために用いられる。頻繁に、異なるオリゴヌクレオチドの密度は、1cm²あたり約60の異なるオリゴヌクレオチドより大きい。標的配列の決定は、チップの表面上のすべてのプローブを含む単一のハイブリダイゼーション反応を実施することにより成し遂げられる。以下は、本発明で用いられるDNAチップの合成、アレイ設計、サンプル調製/蛍光ラベリングおよび塩基呼び出し特徴を記載する短い概説である。光特異的合成： DNAチップは、光特異的合成を用い、チップ表面上にオリゴヌクレオチドプローブを構築する(Fodorら、Science、251：767-73(1991))。この光特異的合成は、半導体を基礎にする光リソグラフィーおよび固相化学合成を組み合わせる。図６を参照して、このプロセスは、光化学的に除去可能な保護基(C)で修飾されたリンカーが固体基板、チップ表面に付着したとき開始される。光分解可能な保護基を備えたリンカーおよびホスホルアミダイトが合成され、そしてPeaseら、PNA S、91:11241-11245 (1994)に記載されている。光は、光リソグラフィーマスクを通じて合成表面の特定領域に向けられ、次の化学的カップリングのためにこれらの領域を活性化する。光分解可能な保護基を持つ一連のヌクレオチドの最初(図６中のＴ)を、チップとともにインキュベートし、そして化学的カップリングが先行する工程で照射されたこれらの部位で起こる。次いで光をマスクの異なるセクションを通じて次の合成部位および化学的工程に向け、チップ表面上で各々がそれ自身の独特のアドレスを有するオリゴヌクレオチドプローブの規定された集合が構築され得る。完全およびサブセット-連結アレイの合成：光特異的合成では、オリゴヌクレオチド産物の位置および組成は、照射のバターンおよび化学的カップリング試薬の順序に依存する。すべての可能なテトラヌクレオチドオリゴマーを含むチップの合成を考慮する(256の可能性)(図７)。サイクル１では、マスク１が基板表面の1/4を活性化する(dT)。サイクル１のラウンド２では、マスク２が基板の異なる1/4を第２のヌクレオシドとのカップリングのために活性化する(dC)。このプロセスを、モノヌクレオチドの４つの領域を構築するために継続する。サイクル２のマスクは、サイクル１のマスクに垂直であり、そして各合成ラウンドは、すべての16の可能なジヌクレオチドが作成されるまで４つの新たなジヌクレオチドを生成する(図７)。サイクル３のマスクは、合成領域をさらにサブ分割し、各カップリングラウンドは16のトリマーを生成する。基板のサブ分割は、サイクル４を通じて継続し、すべての256の可能なテトラマーを形成する(完全な組合せアレイ)。光特異的完全組合せアレイの成功した証明が最近報告された(Peaseら、PNAS、91：11241-11245(1994))。完全アレイの任意のサブセットが、合成の各サイクルおよびラウンドで用いられるマスクパターンを改変することにより合成され得ることに注目することが重要である。完全な組合せアレイは、デノボの配列決定が求められる適用のために用いられ得(Fod orら、1993)、その一方組合せアレイのサブセットは、本出願で採用されるような再配列決定適用のために用いられ得る。サンプル調製、および標的核酸の蛍光ラベリング：増幅で生成された蛍光標識されたDNAまたはRNAにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドアレイおよびこのハイブリダイゼーションは、エピ蛍光共焦点顕微鏡法(Fodorら、1993；Molecular Dynamics、Santa Clara，CA)により検出される。このプロセスは、標的核酸のサンプルからの抽出により開始される。図８を参照して、標的核酸(マイコバクテリアゲノムDNA)は、バクテリオファージRNAポリメラーゼプロモーター配列を含む標的遺伝子特異的なプライマーペアを用いる、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅される(図８)。標的核酸のPCR増幅コピーは、インビトロ転写(IVT)反応の間に、二本鎖(ds)DNAから蛍光標識された一本鎖(s s)RNAに転換される。最後に、フルオレセイン標識された標的遺伝子特異的RNA転写物は、高温および30 mM Mg⁺⁺下で、オリゴマー長の標的に断片化される。サンプル抽出、増幅、チップハイブリダイゼーションおよび分析の正確なプロトコール、プライマーおよび条件は、実施例に記載される。勿論、その他のラベリング戦略も利用され得る。再配列決定チップおよび単一塩基ミスマッチの検出：先に記載したように、標的遺伝子配列は、タイル化ストラテジーで並べられた重複する一連のオリゴヌクレオチドプローブで、チップ上に表され得る(図９)。このような戦略では、標的中の各塩基は、プローブの中心または中心近くに位置する塩基を除いて同一である４オリゴヌクレオチドプローブの集合を用いることにより質問される。４つのプローブの各々は、この質問位置に、dA、dT、dCまたはdGを含む。４つのオリゴヌクレオチドプローブのうちで、正確な相補物である１つは、ハイブリダイゼーション後のDNAチップの洗浄の後、最も安定なハイブリッド、そしてそれ故最強の蛍光シグナルを生成する。同様に、標的配列中の次のヌクレオチドは、それらが１ヌクレオチド下流にずらされることを除いて最初の４つと同じである４つの同じ長さのプロープで質問され得る。これらのプローブの中心塩基もまた、すべての４つの可能な塩基を有する。同様の様式で、標的配列の塩基のすべてが、タイル化ストラテジーで並べられた重複するプローブを用いて質問され得る。４つの可能なプローブのうち、どれが標的に対する相補物であるかの決定は、次の最も高いハイブリダイゼーションシグナルに対して最も高い比をとることによりなされる。この比が1.2より大きい場合、質問される塩基の特異的決定がなされ得る。最も高いハイブリダイゼーションシグナルがこの基準に合致しない場合、不確かな決定が、IUPAC配列コードを基礎になされる。単一塩基ミスマッチを検出するためのDNAチッププローブの感度は、16ステップの組合せ合成を用いて説明される。光分解可能なMenPoc-dAおよびMenPoc-dTは、チップ上のプローブの合成の間に用いられるただそれだけのヌクレオチドであった。リソグラフィーのマスクは、256のオクタヌクレオチドの各々が、1.28×1 .28 cmのチップ表面上で、４つの独立の位置で合成されるように選択された。これは、各々が400×400μmの合成領域を占める1024のオクタヌクレオチドのアレイを生じた。合成およびdAアミンのフェノキシアセチル脱保護の後、ガラス基板を、恒温に調節されたハイブリダイゼーションセル中にマウントした。この実験に採用された標的は、１nM濃度で存在するオリゴヌクレオチド5'-AAAAAAAA-フルオレセイン-3'であった。30分のハイブリダイゼーションおよび15℃で×1.0 SSP Eを用いた洗浄の後、チップをエピ蛍光共焦点リーダーを用いて走査した。各々のハイブリダイゼーション事象の蛍光強度は、チップの表面上のプローブのミスマッチの位置に対してプロットされた(図１０)。位置ゼロのミスマッチ(完全相補物3'-TTTTTTTT-5'を用いて)は、このアレイのバックグラウンドシグナルを約2 20カウントで有して、アレイ上で最も明るいハイブリダイゼーションである。ミスマッチ位置１(プローブの3'末端における)(3'-ATTTTTTTT-5')は、次に最も高いハイブリダイゼーションであ,る。得られる「U」形状の曲線は、プローブ/標的複合体の各位置におけるミスマッチの相対的安定性を示す。位置３、４、５および６におけるミスマッチは非常に不安定で、そしてこれらのハイブリダイゼーションの強さは、完全にマッチしたハイブリダイゼーションより約３倍低い。位置１におけるミスマッチ（オクタヌクレチオチドがチップ基板につなぎとめられる点) は、位置８における対応するミスマッチ(5'自由末端)より不安定でないこともまた注目に値する。アレイ合成および標的ハイブリダイゼーションの均一性は、４つの二重合成部位の強度の低い分散に反映される。パターン認識アルゴリズムオリゴヌクレオチドプローブアレイ由来のハイブリダイゼーションパターンは、樹状分類技法のような、数学的パターン認識アルゴリズムを用いて、薬物耐性表現型および生物の種分化と相関付けられ得る。各種について分析された単離体の総数が増加するにつれ、単一および独特のコアフィンガープリントがマイコバクテリウム種を規定することはありそうでないことに注意することが重要である。むしろ、マイコバクテリウム種の任意の特定の単離体が、すべての可能なフィンガープリントのサブセットを有することが期待される。フィンガープリントパターンに基づくマイコバクテリウム種の同定は、種特異的および共有のSNPおよびフィンガープリントからなる収集されたデータベースを基に構築された分類分析を必要とする。未知のrpoBハイブリダイゼーションパターンを、データベース中のマイコバクテリウム種の１つから来るとして同定する目的は、一般的な分類課題である。測定(配列およびフィンガープリントデータ)は、サンプルの収集を基になされる。これらの測定を基に、収集の各メンバーのクラス(種)を予見するために系統的な方法が開発される。各ハイブリダイゼーション部位における標的により生成されるシグナルは、MT rpoBにより生成されるシグナルと比較される。この比較に基づき、MT rpoBに対して標的中のその部位で質問された遺伝子型における差異が存在するか否かを決定する。分類手段構築は過去の経験に基づく。系統的な分類手段構築では、過去の経験が学習サンプルにより要約される(a.k.a設計または訓練サンプル)。これは、それらの実際の分類とともに過去において観察されたN事例に対する測定データからなる。フェーズＩで収集されたデータベースが、初期の訓練サンプルとして供されることが意図される。測定データ中に出現し得る２つの一般的タイプの変数がある。順序または数値変数およびカテゴリー変数である。変数は、その測定された値が実数である場合、順序または数値変数と呼ばれる。変数は、それが任意の自然の順序を有さない有限のセットにおける値をとる場合、カテゴリー的である。本発明者の場合では、配列における各ヌクレオチド位置が変数である。従って、すべての測定変数はカテゴリー的である。与えられた場合に対する測定変数のセットは、測定ベクトルと呼ばれる。測定空間は、すべての可能な測定ベクトルのセットとして規定される。４つの最も一般的に用いられる分類手法は、判別分析、開核密度評価(kernel density estimation)、および kth最接近隣接点(kth nearest neighbor)、および樹状構造分類である。判別分析は、すべての測定ベクトルが多変数正常分布であり、そしてそれ故カテゴリー的変数を取り扱うためにセットアップされない(G nanadesikan，R、Methods for statistical data analysis of multivariate ob servations(Wiley，New York(1977)を参照のこと)。たとえ、開核密度評価およびkth最接近隣接点法が、測定ベクトルの基礎となる分布の形態について最小限の仮定をなしたとしても、なお両方法に共通の重大な制限がある。それらは、測定ベクトルの間に距離尺度(計量用の)の定義を必要とし；これら分類手段の性能は、計量法の選択に感受性である。カテゴリー変数を取り扱う自然なまたは単純な方法はない。両方法は、分類手段としてコンピューター計算には高価である。何故なら、それらは、学習サンプルが貯蔵され、そして距離および分類規則がそれぞれの新たな未決定の場合について再計算されることを必要とするからである。最も重要なのは、それらはデータ構造に対する使用可能な情報をほとんど与えない。Kanal，L.(1974) IEEE Trans．Information Theory IT-20：697-722、およびHand，D.J．Discrimination and Classification (Wiley，Chichester (198 1))は、これらの方法に関する文献の調査を与える。ツリー構造分類法は、帰納的かつ反復的手順である。それは、完全測定空間から始まり、測定空間のサブセットを２つの子孫サブセットまたは２つの子孫ノードに繰り返し分割することによって進行する。その基礎的なアプローチは、子孫ノードの各々におけるデータが親ノードのデータより「純粋」になるように、ノードの各分割を選択することである。ノードの不純度尺度は、全てのクラスがそのノードにおいて一緒に均等に混合される場合、最大であり、そしてノードがただ１つのクラスを含む場合、最少であるように、規定される。分割の並び（sequ ence）は、各候補のノードで全ての可能な分割が試験され、そして不純度の最大の減少を引き起こす分割が選択されるように、決定される。末端のノードは、測定空間の区画を形成する。各末端ノードは、その区画においてクラスの比率に基づくかまたは観察されたクラス割り当てによって指定される。（通常、割り当ては、最も高い比率を有するクラスである。）同一のクラス割り当てを有する２つ以上の末端ノードが存在し得る。そのクラスに対応する区画は、その同一クラスに対応する全ての末端ノードをよせ集めることによって得られる。ツリー分類手段は、以下の方法において所定の測定ベクトルについてのクラスを予想する：最初の分割の定義から、その測定ベクトルが右へ動くのかまたは左へ動くのかを決定する。これは、その事例が末端ノードへ移動するまで繰り返される。次いで、予測されるクラスは、その末端ノードのクラス割り当てによって与えられる。分類ツリーの最適なサイズは、以下の様式で決定される：全ての末端ノードが極めて小さくなり、大きなツリーを生じるまで分割を続ける。次いで、この大きなツリーは、選択的に上向きに剪定され、従って、サブツリーのならびの減少をもたらす。最後に、交差確証またはテストサンプル推定値を使用して、サブツリーのならびから、最も低い推定誤分類率を有するサブツリーを選択する。ツリー構造分類方法論は、Breimanら Classification and Regression Trees，（Wadsw orth International Group，Belmont，California (1984)）において詳細に網羅される。ツリー構造アプローチは、強力であり、そして柔軟性のある分類ツールである。それは、簡単かつ自然な方法で数値変数およびカテゴリー的変数の両方を扱い得る。最終的な分類は、新たなデータを分類するために効率的に使用され得る単純な形態を有する。それは、自動的に段階的に変数を選択し、そして複雑性を減少させる。それは、新たなケースについての分類および誤分類の可能性の推定値の両方を提供する。ツリー手順の出力は、データの予測的構造に関して容易に理解され、そして解釈される情報を与える。ツリー構造化分類手段の例図11は、仮定の６−クラスツリー（ボックスの下の数字）を示す。ボックスはノードを示す。ノードt1は、全測定空間を含み、そしてルートノードと呼ばれる。ノードt2およびノードt3は互いに素であり、t1は、t2およびt3の和集合である。同様に、t4およびt5は、互いに素であり、t2は、t4およびt5の和集合である。分割されないそれらのノード（この事例において、t6、t8、t10、t11，t12、t14 、t15、t16、およびt17）は、末端ノードと呼ばれる。末端ノード下の数字は、この特定の分類手段についてのクラス割り当てまたはクラスラベルである。ｘを測定ベクトルとする（本発明者らの場合において、長さＫのDNA配列）；ｘ＝ (X₁、X₂、・・・・、X_K) 。分割は、ｘの座標上の条件を設定することによって形成される。例えば、t1のt2およびt3への分割１は、以下の形態であり得る：t2はX₁₀={Ａ、Ｃ}のような測定、ベクトルの和集合であり、そしてt3は、X₁₀= {Ｇ、Ｔ}のような測定ベクトルの集合である。この分類手段は、この方法における測定ベクトルｘについてのクラスを予想する：第１の分割の定義から、ｘがt2またはt3のどちらに進むのかを決定する。例えば、分割１についての上記の定義を使用する場合、その配列における10番目のヌクレオチドがＡまたはＣのいずれかの場合、ｘはt2へ進み、そうでなければ、ｘはt3へ進む。ｘがt2へ進む場合、次いで分割２の定義から、ｘはt4またはt5のどちらへ進むのかを決定され、そしてこのように続けられる。ｘが最終的に末端ノードへ移動した場合、その予想されるクラスは、その末端ノードに付いているクラスラベルによって与えられる。実施例 Mycobacterium tuberculosis rpoBチップ高密度のオリゴヌクレオチドアレイ（Mtb rpoBチップ）を合成し、そして予備的実験において試験する。チップを、塩基９および10（センスおよびアンチセンスプローブ）ならびに塩基10および11（センスおよびアンチセンスプローブ）に位置する質問位置を有する２つの長さのオリゴヌクレオチド（18および20mer）を使用して合成する。Mtb rpoBチップを、以前にRIF感受性であると決定された1 5のM．tuberculosis臨床的単離体を遺伝子型分類するために最初に使用した。図 12は、これらの単離体の一つに由来するrpoB遺伝子の700bp領域のMtb rpoBチップ分析のイメージである。オリゴヌクレオチドプライマー配列、PCR増幅、インビトロ転写、およびチップへのハイブリダイゼーション条件は以下のとおりであった。 M．tuberculosisからの染色体DNAを、１つのコロニーを100μlのddH₂O中に懸濁し、10分間煮沸し、そしてDNA溶液を細胞砕片から分離するために手短に遠心分離することよって単離した。次いで、染色体DNAをddH₂Oで1:10に希釈した。70 5bp rpoBフラグメントを、各dNTPを200μMで、各プライマーを0.2μMで、2.5Uの Taqポリメラーゼ (BM，Indianapolis，IN) 、10mM Tris (pH8.3)、50mM KCl、1. 5mM MgCl₂を含む100μl反応容量中で増幅した。増幅を、モデル9600サーモサイクラー (Perkin Elmer Cetus) で行った。組み込まれたT3およびT7配列を有するプライマーrpoB-4(CTC GGA ATT AAC CCT CAC TAA AGG GAC CCA GGA CGT GGA GGC GAT CAC ACC GCA)（配列番号１）およびrpoB-7(TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC GTC GCC GCG TCG ATC GCC GCG C)（配列番号２）を使用して705bpフラグメントを増幅するために、95℃５分、（95℃１分、68℃30秒、および72℃２分）の 35サイクル、続いて72℃10分を使用した。次いで、PCRアンプリコンを、Amicon Microcon 100カラムを使用して精製した。約50ngアンプリコンのインビトロ転写を、1.25mM rNTP，10mM DTT，125μm F-CTP、20U RNaseインヒビター、40mM Tri s-HCl (pH7.5)、６mM MgCl₂、２mMスペルミジン、20mM NaCl、20U T3/T7 RNAポリメラーゼを含む20μlの反応容量中で37℃にて90分間行った。次いで、RNAを、 Amicon Microcon 100カラムを用いて精製し、そして分光光度計を使用して定量した。断片化を30mM MgCl₂中で95℃にて30分間行った。６×SSPE、20％ホルムアミド、0.005％ Triton、0.5nM コントロールオリゴ中の20nM RNA溶液を、68℃にて10分間加熱し、次いで氷上に５分間置き、そしてAffymetrix Fluidics Statio n中でMtb rpoBチップに22℃にて30分間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後の洗浄を、Affymetrix Fluidics Station（Affymetrix Santa Clara ， CA）中で１×SSPE、20％ホルムアミド、0.005％ TritonX100を用いて行った。これは、１サイクル当たり２回の充填および排出を有する12洗浄サイクル、続いて６×SSPE、0.005％ Tritonを用いる１回の洗浄、１サイクル当たり２回の充填および排出を有する２サイクルを使用した。次いで、チップを、Molecular Dyna mics scanner (Molecular Dynamics，Santa Clara，CA) 上で22℃にて11.25ピクセル/μmの解像度でスキャンした。上記のように、700bpアンプリコンは、73.3％G:Cリッチ (rich) である18bp領域を有する67.7％G:Cリッチであるので、20％ホルムアミドをハイブリダイゼーション工程およびハイブリダイゼーション後の洗浄工程の両方で使用した。Mtb rpoBチップによる分析からの結果は、分析した15のM．tuberculosis RIF感受性単離体のいずれについても700bpの任意の塩基で多型性が存在しないことを示した。この結果を、従来のジデオキシヌクレオチド配列決定によって確認した。従って、両方法は、10,500ヌクレオチドの全配列の分析において100％一致した。 RIF耐性を与える変異の検出４つのプレ耐性／ポスト耐性RIF単離体を、盲目的方法でスクリーニングした。それらを、この第１世代Mtb rpoBチップを使用して分析した。表２は、チップ分析の結果を要約する。４対の単離体の内、81bp領域中に変異を保有する対の一方のメンバー（他の全てのヌクレオチドは野生型であった）を有する３対を観察した。対の他方の単離体はこのような変異を示さなかった。興味深いことに、４番目の対 (001415/001417) は、単離体001417が培養アッセイによってRIF耐性として特徴づけられたが、調べられた700bpの任意のヌクレオチドで変異を含まなかった。RIF耐性M．tuberculosis単離体の10％は、rpoBの81bp領域中に変異を有さないので、この単離体は、チップによって分析されないrpoBの部分における変異のために、または摂取、代謝、または薬物結合を制御するいくつかの他の遺伝子における変異のために耐性であり得る。全ての８つの単離体についてチップを使用して得た配列を、ジデオキシヌクレオチド配列決定を使用して確認した。さらなる４つのRIF耐性単離体もまた、スクリーニングした。81bp領域内のみの変異をMtb rpoBチップによってこれらの単離体の各々について検出し、そしてジデオキシヌクレオチド配列決定によって確認した。合計25のM．tuberculosis単離体を分析した。これらの内７つはリファンピシン耐性であり、表２に示す変異を有していた。表２に示す変異以外に、25の単離体のいずれにおいても多型性は存在しなかった。表２ Mtb rpoBチップによって分析され、そしてDidによって確認されたRIF感受性かつ耐性M．tuberculosis臨床的サンプル1.アミノ酸番号付けおよびヌクレオチド番号付けシステムは、Millerら(1993)により誘導された配列決定を用いる。 2.耐性は、Smallら、「Tuberculosis: Pathogenesis, Protection，and Control 」569〜586頁（1994）（Am．Soc．Microbiol.、B.R.Bloom編）の相対的／比率法を使用して決定した。非M．Tuberculosisマイコバクテリアについての単一ヌクレオチド多型性およびハイブリダイゼーションパターン（フィンガープリント）データベースマイコバクテリア種を同定することが可能なデータベース（SNPおよびチップベースのハイブリダイゼーションフィンガープリントからなる）の構築における第一の工程は、７つの臨床的に重要なマイコバクテリア種の分析を用いて行われる：M.gordonae、M．chelonae、M.kansasii、M.scrofulaceum、M.avium、M.intr acellulare、およびM．xenopi。第１の工程として、これらの種の各々由来の一つの単離体からのrpoB遺伝子の700bp領域を、ジデオキシヌクレオチド方法論を使用して配列決定した。ヌクレオチド（60〜71）およびアミノ酸（５〜８）の差異を、これらのマイコバクテリア種の各々の700bp領域内でM．tuberculosisと比較した（表３）。２つのタイプの単一ヌクレオチド多型性（SNP）に注目した：種特異的（固有の）SNPおよび共有のSNP。少なくとも３つの他の非tuberculosis マイコバクテリアと共有されるSNPは多く、分析した700bp全体を通して散乱していた。図13は、これらの共有SNPの位置を示す。しかし、種特異的SNPは、かなり少ない。図14は、各々の種についての１つの単離体に基づいて分析された７つの種の各々についてのSNPの位置および性質を示す。表３マイコバクテリア種における多型性の比較多型性の数７つのマイコバクテリア種の各々からの蛍光標識されたRNAアンプリコンをMtb rpoBチップにハイブリダイズさせた場合、次いで、M．tuberculosisについてのアンプリコンをハイブリダイズすると、ハイブリダイゼーションの画像は、かなり異なっている（図15A）。ハイブリダイゼーションパターンにおける差異を、バーコード様フィンガープリントとして示し得る（図15B）。フインガープリント上の各線は、野生型M．tuberculosisをハイブリダイズするときと比較した場合のハイブリダイゼーション差異を示す。これらの差異は、ジデオキシヌクレオチド配列決定分析によって同定された種特異的多型性および共有の多型性に起因する（表３）。任意の個々のマイコバクテリア種について、フィンガープリントの個々の線によって示される差異のいくつかのみが、特異的な塩基対差異として同定され得る。フィンガープリントの線の残りは、M．tuberculosisサンプルをハイブリダイズした場合とは異なっているとしてのみ特徴づけられ得る。これらの未同定の差異は、通常、複数の多型性が密接に近接して生じる場合に引き起こされるか、またはそれらは、固有のまたは共有の多型性の存在により隣接するプローブのハイブリダイゼーションの脱安定化の結果である。このようなクラスター化多型性の場合において、ある領域におけるヌクレオチドを質問する個々のプローブ内に複数のミスマッチが存在する。このようなプローブを含むハイブリダイゼーション結果は、不安定であり、あいまいに呼び出し、間違っている呼び出し、または呼び出しなしに導く。従って、完全なフィンガープリントパターンは、同定された差異（固有または共有の多型性）および未同定の差異（塩基呼び出し決定なしに導くクラスター化多型性）から構成される。質問した700bpの平均2 7.7％が、M．tuberculosis標的がチップにハイブリダイズした場合と、異なっているとみなされた（表４）。言い換えれば、多型性であるとABI配列決定によって同定されたすべての塩基について、チップは、３つの塩基をMtbとは異なるとみなす。さらに、これは、多型性が、チップによって異なっているとみなす場合、多型性としてABIによって同定された塩基に隣接する２つの塩基の各々が、これらの部位でのハイブリダイゼーションの脱安定化のために、チップによって異なっているともみなされたことに起因する。表４ M.tuberculosisと比較した、Mycobacteria種間のフィンガープリントパターンの差異 1. ヌクレオチドの差異は、M.tuberculosis配列と比較して同定された差異(種特異的な多型性および共有する多型性)および同定されてない差異 (クラスター化した多型性により引き起こされる)から構成される。 2. ％差異は、チップ上のMtb rpoB遺伝予によって分析された合計700bpに基づく。各非tuberculosisマイコバクテリアに関するデータベースは、各Mycobacteria 種についてただ１つの単離株の分析結果であったので、１つのMycobactera種の複数の単離株間で観察されるフィンガープリントパターンの変動を研究した。その結果、M.gordonaeの10の単離株由来のrpoB遺伝子をMtb rpoBチップによって分析した。図16は、センス鎖ハイブリダイゼーションのイメージを示す。各チップ下、イメージは、両鎖の分析後にコンピュータにより計算されたハイブリダイゼーションフィンガープリントである。分析された11の単離株(10の新規な単離株および１つの元の単離株)間で共有される差異を以下に示す(表５)。この分析から、M.gordonaeのコア(コンセンサス)フィンガープリントパターンを導いた(図1 6)。同様なコアフィンガープリントは、８つの他のMycobacteria種について導かれており、したがって、これらの種の同定が可能となる。上記の技術は、種特異的多型性および共有される多型性のデータベースを構築するために使用され得ることが明らかである。このデータベースは、他の種についてのフィンガープリントを導くために使用され得る。重要なことは、各種について分析される単離株の総数が増加するにつれて、単一で独特なコアフィンガープリントがMycobacteria種を規定することはありそうにないと気づくことである。むしろ、Mycobacteria種の任意の特定の単離株は、すべての可能なフィンガープリントのサブセットを有すると考えられる。フィンガープリントパターンに基づくMycobacteria種の同定は、以前に記載されたように、種特異的なおよび共有のSNPおよびフィンガープリントからなる収集されたデータベースに基づいて構築されたツリーベースの分類アルゴリズムを使用する分類分析を必要とする。表５ Gordonae臨床株間の共有される差異％ヒトミトコンドリアDNAチップ(MT1) フルオレセイン標識標的RNAを合成し、フラグメント化し、そして転写混合物を６×SSPE、0.05％Triton X-100中に20倍希釈し、約１〜10nM RNAを得た(フラグメント化の前に推定)。ハイブリダイゼーションを室温で30分間行った。チップを、６×SSPE、0.005％Triton X-100中で、数回交換して合計５〜10分間洗浄し、そしてこれをスキャンした。図23AはMTIチップ上のタイル化アレイの設計図を示す。標的配列(大文字)における各位置は、質問塩基(interrogatlon base)(Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかである)と呼ばれる１つの位置を除いて同一である、チップ上の４プローブのセット(小文字)によって質問される。標的は、４つのプローブのうちの１つと完全に相補的であるが、他とはミスマッチである。図10に示されるように、完全な相補物は、ミスマッチ体より強いハイブリダイゼーションシグナルを与える。下方の３つのプローブのそれぞれは、４つのプローブのセットを表し、ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴである。示されるように、これらのセットを、配列にわたって塩基１個の増分でタイル化することによって、長さＮの核酸標的が、4N個のプローブを含むタイル化アレイで、変異についてスキャンされ得る。(Ｂ)タイル化アレイへのハイブリダイゼーションおよび点変異の検出。示されたアレイはMT1標的配列に対して設計された。MTIにハイブリダイズする場合(上方パネル)、１つのカラムにおいて４つのプローブからなる各セット中の１つのプロープが標的と完全にマッチする。一方、他の３つは１つの塩基ミスマッチを含む。各列のプローブにおいて使用される質問塩基を、イメージの左に示す。標的配列は、最も明るいシグナルを有する質問塩基の相補物として、左から右へ、５'から３'へ読まれ得る。MT2(Ｔ→Ｃトランジションによりこの領域においてMT1とは異なる)へのハイブリダイゼーション(下方パネル)は、このプローブセットに相違して影響する。ここでは、多型性の位置で、Ｇプローブは、MT2と完全なマッチであり、他の３つのプローブは１つの塩基ミスマッチを有する。(Ａ ^★、Ｃ ^★、Ｇ ^★、Ｔ ^★カウント)。しかし、隣接する位置では、これらプローブは１つまたは２つのいずれかの塩基ミスマッチを有する。なぜなら、ここでは、MT2置換は、質問位置から離れて生じるからである。ミスマッチの位置は、プローブ概念図において、赤丸によって示される。サンプルと参照標的との間でスケールした(scaled)P^020.9ハイブリダイゼーション強度パターンの比較による、2.5kbのサンプルと参照配列との間の塩基の差異の検出この研究では、プライマー対L14675-T3(5’aattaaccctcactaaagggATTCTCGCACG GACTACAAC)(配列番号７)および有667-T7を使用して、ゲノムDNAから直接、各2.5 kbの標的配列を、記載されるように、PCR増幅し、転写してフルオレセインもしくはビオチンで標識されたRNA標的を得、プールし、そしてフラグメント化した。示した実験において、MT1参照標的をビオチン標識し、サンプル標的をフルオレセイン標識した。標的を転写反応物から180倍希釈して、３M TMAC1、10mM Tri s.Cl(pH 8.0)、１mM EDTA、0.005％Triton X-100、および0.2nMのコントロールオリゴヌクレオチド(51フルオレセイン−CTGAACGGTAGCATCTTGAC(配列番号８))中 100〜1000pMの最終濃度とした。(本発明者らは、ＧリッチＨ鎖標的が１M NaCl中では貧弱にハイブリダイズするが、３Mテトラメチルアンモニウムクロライド中では良好にハイブリダイズし、一方、Ｌ鎖がいずれの溶液においても良好にハイブリダイズすることを見出した)。ハイブリダイゼーションをパッケージしたチップにおいて実行した。サンプルを、95℃にて５分間変性させ、氷上で５分間冷却し、そして37℃に平衡させた。次いで、容量180glのハイブリダイゼーション溶液をフローセルに添加し、そしてチップを37℃にて３時間、実験室ロティセリー(rotisserie)にて60rpmで回転させながら、インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、チップを、６×SSPE、0.005％Triton X-100で室温にて６回洗浄した。６×SSPE、0.005％Triton X-100中の２gg/mlフィコエリトリン結合ストレプトアビジンの溶液を加え、そしてインキュベーションを室温にて５分間続けた。チップを再び洗浄して、１プローブセルあたり74ピクセルの解像度でスキャンした。１つを530 DF 25nmバンドパスフィルターを使用し、２つめは560nmロングパスフィルターを使用して、２つスキャンを収集した。シグナルを解析してスペクトルの重複を除去し、１セルあたりの平均カウントを決定した。以下のように、サンプルプローブ強度を参照強度にスケールした：各対のプローブについて、強度比率の常用対数のヒストグラムを作成した。ヒストグラムは0.01のメッシュサイズを有し、そして各点での値を、その点を中心とする５点ウィンドウ上でのカウントの平均数で置き換えることによってヒストグラムを滑らかにした。ヒストグラムにおける最高値の位置を決め、そして得られる強度比を最も有望な較正係数であると推定した。ミトコンドリア制御領域における超可変領域Ｉの一部分からの、Ｈ鎖プローブにハイブリダイズするＬ鎖標的についてのデータを図25に示す。番号付けは従来のものである。各プロットにおいて、参照標的強度を赤で示し、サンプルを青で示す。参照(MT1)はp⁰プローブと完全マッチである。図25A−ief007とMT1との比較。２つの標的配列の間には、16,223位に位置する１つの塩基差異(MT1 Ｃ：ief 007 Ｔ)が存在する。これは、20位置(16,223位から左に11個および右に８個)にわたる「フットプリント」を生じる。ここで、ief007のp⁰強度は、MT1の強度と比べて10倍より大きなファクターで減少している。フットプリントのサイズおよび位置は、p^20.9プローブへのハイブリダイゼーションに影響する単一塩基ミスマッチと一致する。理論的なフットプリント位置は灰色の横棒によって示され、多型性の位置は、横棒内の黒横線によって示される。フットプリントのサイズは、プローブ長とともに変化し、その相対的位置は質問位置とともに変化する(示さず)。サンプルおよび参照標的は競合するので、フットプリント領域中のMT1シグナルは、実際に、各プローブセルにおける総シグナルの比率につれて増大する。なぜなら、ミスマッチしたサンプル標的は、もはや、プローブ部位について効果的に競合しないからである。図25B−ha001とMT1との比較。ha001標的は、MT1 と比べて４つの多型性を有する。p⁰強度パターンは、標的間の差異の２つの領域を明確に示す。さらに、各領域は２以上の差異を含むことが容易に理解され得る。なぜなら、両方の場合で、フットプリントが20位置より長く、したがって単一塩基差異によって説明するには広すぎるからである。競合の効果は、ief007およびha001の実験におけるMT1強度を比較することによって理解され得る：MT1の相対強度は、ha001がpoミスマッチを含むがief007は含まないパネルＢにおいて、より強い。図25C−ha004サンプルは、MT1に対して複数の差異を有し、示した領域のほとんどにわたって広がる複雑なパターンを生じる。したがって、たとえ、ベースコーリング(basecalling)が、4Nのタイル化アレイのみを使用して弱められたとしても、差異は明確に検出される。パターンが高度に複雑である場合でさえ、サンプルは比較およびマッチングされ得る。例えば、ha004サンプルを、同じ実験において、参照としてのha004と比較する場合、たとえ複数のミスマッチの効果が直接配列読みとりを弱めるとしても、p⁰パターンはマッチを示す(示さず)。２bp欠失の検出実験の詳細は上記のとおりである。結果を図26に示す。図26Aは、4Nアレイが長さ多型性を検出するよう設計されていなかったが、MT DNA中の514〜523に位置するこの共通２bp長多型性は、po強度フットプリントの存在により、容易に検出されたことを示す。図26Bは、ハイブリダイゼーションに対する標的特異的効果を示す。MT1参照(GG)とha002標的(AA)との間の２bpの差異は、複雑なフットプリントパターンと関連する：ミスマッチしたha002ハイブリッドのpoシグナルは、1 6,381位から左方へ広がる領域において、完全に付着したmt1ハイブリッドのpoシグナルより10倍まで高い。両サンプルを同じアレイに対して同時にハイブリダイズさせた。さらに、この効果はミスマッチによって直接影響を受けるプローブを越えて広がる。したがって、本発明者らは、差異は標的の二次構造の変化に起因すると結論する。逆転した反復(概略図上で陰影を付されている)間の塩基対合の破壊の結果としての標的の接近可能性の増大が、サンプル対参照のｐ⁰シグナルの増大を説明し得る。全ゲノムチップへの16.3kbのミトコンドリア標的配列のハイブリダイゼーション図27Aは、Ｌ鎖標的サンプルとハイブリダイズしたアレイの、実際のサイズのイメージを示す。1.28×1.28cmのp^20.9タイル化アレイは、合計134,688のプローブを含み、それぞれが35×35ミクロンのセル中で合成される。プローブ数は、16 .6kbゲノムの２倍以上を示すに十分である。アレイはセンスおよびアンチセンスコードの能力を有する。ゲノムの16,569bpマップを示し、そして制御領域に位置するＨ鎖複製起点(OH)'を示す。図27B−ハイブリダイゼーションパターンの一部分を拡大して示す。スケールを左側に横棒で示す。ほとんどのアレイは直接読みとられ得る。２分以内に検流計スキャナー検出システムにより生じたイメージを、３ミクロン、16ビットピクセル解像度にて収集し、アレイ中の各プローブセルについて、100ピクセルの強度データを提供した。蛍光を、581 Df 52nm.バンドパスフィルターを通じて検出した。図27C−16.3kbサンプルにおいて単一塩基差異を検出し、読み取るアレイの能力を示す。２つの異なる標的配列を、異なるチップに、並行してハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションパターンを、配列中の４つの異なる位置について比較する。各ペアの上のパネルは、これらの位置でチップpo配列とマッチするMT3標的のハイブリダイゼーションを示す。下のパネルは、レーバー遺伝性視神経症(LHON)の患者由来のサンプルにより生じたパターンを示す。３つの病原性変異LHON3460、LHON4216、およびLHON13708を示す。３つとも明確に検出される。比較のために、このセットの第３のパネルは、両サンプルにおいて同一である領域を示す(11,778位あたり)。上記のパターンマッチング技術はまた、生物学的サンプルの核酸配列が、特定の対立遺伝子について、ホモ接合であるかヘテロ接合であるかを決定する方法、すなわち、特定の位置での核酸配列における多型性の存在を同定するための方法を提供する。この点において、多型性は、サンプル核酸のコードセクションおよび非コードセクションの両方で、すなわち、エキソンまたはイントロンで同定され得る。このことは、例えば、遺伝子的に関連する疾患が存在するかどうかを同定することにおいて、価値を有する。もちろん、遺伝子的に関連する任意の状態、すなわち、「疾患」として考えられる状態以外の状態が、このような方法によって同定され得ることが認識される。図34は、患者サンプル由来の核酸配列における多型性の存在を同定する方法のコンピュータ実行用フローチャートを示す。本明細書中に記載されるフローチャートは、例示のためであり、限定ではない。例えば、単純化のために、図34は、一度に１つの塩基位置を分析して多型性を検出することを記載する。しかし、各ステップはまた核酸配列全体について実行され得、そして/またはいくつかのステップは組合せられ得る。ステップ200にて、システムは、患者サンプル由来の核酸配列中の塩基位置を選択する。システムは、ステップ202にて、患者サンプル由来の核酸配列と野生型サンプル由来の対応する核酸配列との間で、参照核酸プローブのアレイへのハイブリダイゼーションの強度の差異を決定する。参照核酸プローブは、野生型サンプルに完全に相補的であり得るが、このことは必要とされない。本システムは、野生型サンプル由来の核酸配列のハイブリダイゼーション強度に対する、工程202で測定された差異の比を誘導または計算する。この比は、工程204で誘導され、そしてこれは、患者野生型サンプル由来の核酸配列についてのハイブリダイゼーション強度が同一になるまでどの程度まで近接しているかを示す。この比が塩基位置に多型性が存在することを示すかどうかを決定するために、設定値が用いられる。設定値はユーザーにより特定され得、工程206で、本システムは、比を設定値と比較する。比が設定値より大きい場合、本システムは、患者サンプル由来の核酸配列の塩基位置における多型性の存在を同定する。工程21 0で、本システムは、分析すべき次の塩基位置が存在するかどうかを決定する。例示のためであって限定ではないが、癌患者由来の核酸サンプルをスクリーニングして、DNA修復遺伝子MSHまたはMLHIが変異しているか否かを決定し得る。これは、適切な領域からの患者DNAのハイブリダイゼーションパターンを健常（すなわち、野生型）サンプルの同じ領域からのDNAのハイブリダイゼーションパターンと比較することにより行われる。図２８〜３１は、ヘテロ接合性MSH2、MLH1 、MSH2およびp53遺伝子からの患者DNAサンプルとそれらの対応する野生型遺伝子とのこのような比較を示す。スクリーニングは、以前に記載されるように、参照配列が野生型配列に対して相補的であるチップを用いることが有利であるが、チップ上に固定化された任意の参照配列に対して行われ得る。各塩基位置に対応するハイブリダイゼーション強度は、以前に記載されるように、各サンプルについて決定される。次いで、各塩基位置での患者サンプルの強度と野生型サンプルの強度との差異を決定し、そしてそれをその塩基位置での野生型サンプルに対する強度と比較する。この比は、１〜０の間で変動し得、野生型配列および患者配列この領域で同一の場合（ハイブリダイゼーションは両サンプルに対して同一であるため）０であり、完全に不適合である（すなわち、その領域で患者サンプルと参照配列との間で全くハイブリダイズしない）場合１に達する。この比が設定値より大きい場合、これは、その特定の塩基位置での多型性を示している。代表的には、この設定値は約0.5に設定され、好ましくは0.6に設定される。このような多型性が存在する位置は、この比を、比が約0.25より大きい全ての位置についての対応する塩基位置に対してプロットすることにより、同定され得る。比が0.25 未満である場合、これは統計学的ノイズであるとみなされる。代表的には、このようなプロットはスパイクを示し、これは、約0.5が多型性部位周辺のほぼ中心となる最大比となる。プロットは、以下のように誘導された変数を伴って作成される：Ｙ軸：ｙ＝（ＷＴ強度−ＰＳ強度）／ＷＴ強度Ｘ軸：ｘ＝塩基位置ここでＷＴ＝野生型であり、そしてＰＳ＝患者サンプルである。この技術は、DNAサンプルのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両鎖のハイブリダイゼーション強度を決定し、そしてスパイクが両鎖においてそれぞれの同じ相補位置で生じることを必要とすることにより、より高いレベルの精度を提供するようにさらに精製されている。チップ上のプローブは代表的には10〜20マーであり、従って、多型性が存在する（すなわち、この領域において患者配列のハイブリダイゼーション強度と野生型配列のハイブリダイゼーション強度との間に差異がある）位置全体においてタイル化すると、「フットプリント」を作出する。結果として、特定の塩基位置で多型性が生じるさらにより高い信頼水準が、上記で誘導されたハイブリダイゼーション強度比が、少なくとも２つの隣接塩基位置、好ましくは３つの隣接位置で、設定値（本実施例では0.5）より大きいことを必要とすることにより得られる。タイル化アレイによるミスマッチ検出本実施例では、参照標的ＴＯおよび３つの変異標的Ｔ１，Ｔ２、およびＴ３が提供される。Ｔ１は１１位に、Ｔ２は９位に、そしてＴ３は９位および１１位に置換を有する。変異配列を記載するにおいて、置換の位置をＳで記載する。これらの配列を表６に示す。表６変異配列の置換これらの各標的を、プローブのタイル化アレイを含むDNAチップとハイブリダイズさせる。簡潔には、ｐ⁷ ₄チップを本明細書中に記載する。上付の７は、チップが参照標的に完全または部分的に相補的な７マープローブのタイル化アレイを含むことを示す。下付の４は、質問位置を示し、その結果各７マーの４位のヌクレオチドが変動する（４つの異なる合成細胞中のＡ、Ｔ、ＧまたはＣ）。標的プローブミスマッチ数を以下の表７に示す。上列は、ベストマッチ例について（すなわち、４つの各セットのうち最も相補的なプローブについて）のミスマッチ数を示し、そして２番目の列は、セット中の他の３つのプローブについてのミスマッチ数を示す。表７標的プローブミスマツチ表８に示すのは、異なる分離で２つの置換を含む一連の標的とのｐ⁷ ₄のハイブリダイゼーションについての、ベストマッチ例におけるミスマッチ数である：表８ベストマッチハイブリダイゼーション標的がタイル化参照配列を含む７マーチップＰ⁷にハイブリダイズする場合、この場合におけるミスマッチ数は、各置換位置でのさらなるミスマッチを除いて上記のベストマッチ例により示されるものと同じである（表９を参照）。Ｔ３については、例えば、Ｐ⁷は、８および１１位（Ｔ３が置換を有する位置）でＰ⁷ ₄ よりも１つ多いミスマッチを有する。表９置換位置でのミスマッチ従って、Ｐⁿ _jチップ、およびａ位に置換を有する標的について一般化するために、プローブのベストマッチセットが、ａ−１かィらａ−ｋに１、ａに０、そしてａ＋１からａ＋ｍに１ミスマッチを有する。ここでｋ＝ｊ−１であり、そしてｍ＝ｎ−ｊである。Ｐ⁷ ₄、ｋ＝３およびｍ＝３では、１ミスマッチ帯は、ａ−１からａ−３、およびａ＋１からａ＋３であり、ａ（質問位置）では０ミスマッチである。複数置換の効果は相加的である。従って、例えば、ｋが９であり、かつｍが６である場合、Ｐ¹⁶ ₁₀チップおよびａ位およびｂ位に置換を有する標的を用いて、ａの置換の効果は、ａ−１〜ａ−９およびａ＋１〜ａ＋６に１ミスマッチを与えることである。ｂでの置換は、ｂ−１〜ｂ−９、およびｂ＋１〜ｂ＋６に１ミスマッチを与える。ａおよびｂが100位および108位である場合、それらの効果は、表１０に示すように、合計である。表１０複数置換の効果従って、ハイブリダイゼーションパターンが与えられると、置換変異の位置決めは、以下のようにして行われ得る。（ａ）第一工程は、Ｐⁿ _jチップを参照標的と、そして別のＰⁿ _jチップを未知標的とハイブリダイズすることである。あるいは、単一のＰⁿ _jチップを異なって標識された参照標的および未知標的（例えば、赤蛍光参照標的および緑蛍光未知標的）の混合物とハイブリダイズさせ得た。一対のチップ、または一対の適切に標識された標的を用いることにより、当業者は、ミスマッチを含み、そして０、１、２とより大きな数の間のミスマッチ数を識別するプローブを容易に同定し得る。（ｂ）位置ａでの置換は、残基ａでの０ミスマッチセルを除いてｎ残基長いミスマッチ帯の存在により同定される。ａ残基で最高強度を示すプローブが、置換を同定する。（ｃ）ｎより長い「静帯(quiet zone)」（すなわち、未知標的が１以上のミスマッチを示す）は、少なくとも２つの置換を含まなければならない（挿入および欠失の効果は以下で考察する）。Ｐⁿ _jとＰⁿとの間の差異により、置換の部位が明らかになる。また、これらの各位置で最高強度を示すＰⁿ _jのプローブが、置換を同定する。一例を以下の表１１に示す。Ｐ⁷−Ｐ⁷ ₄、タイル化参照配列とタイル化アレイの最高例適合との間の差異、は、８位および13位で１ミスマッチであり、そして他の位置で０ミスマッチであることを示す。このことにより、置換がこれらの２つの位置で生じたことが示される。それらの正体を、これらの質問位置の４つのヌクレオチドのうちどれが最高の強度を有するかを検索することにより確立する。（ｄ）さらなる情報は、ジェネリックチップ（例えば、全ての１０マーのDNA を含むチップ）を参照標的および未知標的とハイブリダイズすることにより得られ得る。ハイブリダイゼーションパターンの差異が、変異部位にわたるプローブを同定する。ジエネリックプローブアレイを用いる種の同定ジェネリック高密度DNAプローブアレイが単離体の種を同定するために用いられ得ることが決定されている。「ジェネリック」とは、プローブアレイが目的の属内の種を同定するように特異的に設計されたものではないことを意味する。例えば、長さ10ヌクレオチドの全ての核酸プローブを含むプローブアレイは、ジェネリックプローブアレイである。さらに、完全に異なる目的のためのプローブアレイが、ジェネリックプローブアレイとして用いられ得る。従って、HIVにおける変異を検出するためのプローブアレイは、Mycobacteriumにおける種を同定するために用いられ得る。各単離体の種を決定することが望まれる複数の単離体が与えられれば、単離体は、まずジェネリックプローブアレイとハイブリダイズされ、上記のようなハイブリダイゼーション強度を得る。次いで、代表的には、ハイブリダイゼーション強度は、単離体にわたって正規化される。実験からの各ハイブリダイゼーション強度の分析は、計算的に実行可能であったり、少なくとも経済的に実行可能でなくてもよいことが決定されている。従って、本発明は、分析すべき変異体の数を減少させる。１つの実施態様において、ジェネリックプローブアレイにおける各プローブについて、単離体にわたるハイブリダイゼーション強度の平均および偏差を計算する。次いで、最も多くの分散を示すプローブを選択し、そして対応するハイブリダイゼーション強度を、単離体を種にクラスター形成するために利用する。このように、本発明は、最も変動しているハイブリダイゼーション強度を有するプローブからのハイブリダイゼーション強度を用いる。まず、利用可能な装置によって処理可能であると考えられるプローブの数を特定し得る。次いで、本発明は、最も多くの識別情報を提供するプローブの数からのハイブリダイゼーション強度を選択する。このプロセスは、一般に、複数の単離体を群に割り当てるために用いられ得、ここでこの群は、種、亜種、表現型、遺伝子型などである。説明の目的のために、以下に、単離体の種を同定する実施態様を記載する。図３６は、生物が属する種を同定する方法のコンピューター実行フローチャートを示す。工程400で、複数の単離体とジェネリックプローブアレイとの間のハイブリダイゼーション親和力を示すハイブリダイゼーション強度が入力される。次いで、必要に応じて、ハイブリダイゼーション強度は、工程402で標準化または正規化されて、実験間の変動を減少させる。例えば、ハイブリダイゼーション強度は、Ｚスコア分析または正規化により一般平均および偏差に対して標準化され得る。このシステムは、工程404で、単離体にわたって最も多くの偏差を有するハイブリダイゼーション強度を選択する。どのハイブリダイゼーション強度が最も変動するかを決定することは、平均および偏差の計算を含む、いかなる方法によっても行われ得る。一例として、分析されるハイブリダイゼーション強度の数は、 10,000から20に減少し得、これにより、ハイブリダイゼーション強度の分析に必要とされる計算時間を劇的に減少させる。工程406では、複数の単離体の各々の種が、選択されたハイブリダイゼーション強度に従って決定される。アルゴリズムのクラスター形成は、単離体を種にクラスター形成するために用いられ得る。一例として、主成分分析法および可変クラスター形成分析法（Variable Clustering analysis）が用いられ得る。クラスター形成の目的は、データにより示唆されるが、演鐸的に定義されない群またはクラスターに単離体を配置決めすることである。このため、所定のクラスター中の単離体は類似する傾向にあり、そして異なるクラスター中の単離体は類似しない傾向にある。従って、事前の分類が不要である。 Mycobacteriumの単離体が分析されており、図３７は、これらの単離体の階層的クラスター形成を示す。クラスターの高さは、クラスター間の平均距離を示す。上述の発明は、明確化および理解の目的のために、説明および例示として幾分詳細に説明している。変更および改変が、添付の請求の範囲の範囲内で行われ得ることは、当業者に明らかである。従って、上述の記載は、例示であって限定ではないことが理解されるべきである。よって、発明の範囲は、上述の記載を参照することによって決定されるべきではなく、代わりに、以下の請求の範囲を参照することによって、このような請求項が権利を受けるべき等価物の全範囲と共に、決定されるべきである。本願に引用した全ての特許、特許出願および刊行物は、あらゆる目的のために、各それぞれの特許、特許出願または刊行物が個々に記載されると同程度に、その全体が本明細書中に参照として援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０６Ｆ 19/00 Ｇ０６Ｆ 15/42 Ａ (31)優先権主張番号０８／６２９，０３１ (32)優先日平成８年４月８日(1996．4．8) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／０１７，７６５ (32)優先日平成８年５月15日(1996．5．15) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者マック，デイビッドアメリカ合衆国カリフォルニア 94025, メンロパーク，モントレーアベニュー 2076 (72)発明者チー，マークエス. アメリカ合衆国カリフォルニア 94306, パロアルト，ウェイバリーストリート 3199 (72)発明者ベルノ，アンソニージェイ. アメリカ合衆国カリフォルニア 95112, サンホセ，サウス 12ティーエイチストリート 570 (72)発明者ストライヤー，ルバートアメリカ合衆国カリフォルニア 94035, スタンフォード，ソノマテラス 843 (72)発明者ガンドール，ガッサンアメリカ合衆国カリフォルニア 94027, アサートン，パルマーレーン 73 (72)発明者ワン，チンアメリカ合衆国カリフォルニア 95133, サンホセ，ケープケネディードライブ 843

Claims

【特許請求の範囲】１．第一の生物の遺伝子型を同定するための方法であって： (a) 基板上の既知の位置でオリゴヌクレオチドのアレイを提供する工程であって、該アレイは第二の生物由来の参照DNAまたはRNA配列に相補的であるプローブを含む、工程； (b) 該第一の生物由来の標的核酸配列を該アレイにハイブリダイズする、工程；および (c) 該標的の該アレイへの全体的なハイブリダイゼーションパターンに基づいて、該第一の生物の遺伝子型を同定する工程、および必要に応じて該第一の生物の表現型を同定する工程、を包含する、方法。２．前記第二の生物がMycobacterium tuberculosisである、請求項１に記載の方法。３．前記参照DNAまたはRNA配列が、16SrRNA、rpoB遺伝子、katG遺伝子、inhA遺伝子、gyrA遺伝子、23SnRNA遺伝子、rrs遺伝子、pncA遺伝子、およびrpsL遺伝子からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。４．前記表現型が抗生物質薬物に耐性である、請求項３に記載の方法。５．前記薬物がリファンピシン (rifampacin)、リファブチン、イソニアジド、ストレプトマイシン、ピラチナミド、エタンブトールからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。６．前記全体的なハイブリダイゼーションパターンが、前記標的核酸配列のハイブリダイゼーションパターンと前記参照配列のハイブリダイゼーションパターンとを比較することによって導かれる、請求項１に記載の方法。７．前記比較が、標的核酸中の残基が前記参照配列中の対応する残基と異なる１つ以上の位置を同定する、請求項６に記載の方法。８．前記比較が、前記標的核酸と前記参照配列との間の差異の１つ以上のセットを導くために用いられ、各セットは該標的が前記第一の生物の特定の種に属する確率と関連する、請求項７に記載の方法。９．差異の各セットと関連する前記確率が、前記標的が特定の種に属するという所望の信頼水準よりも大きい組合せ確率を導くために用いられる、請求項８に記載の方法。１０．前記比較が、前記標的核酸と前記参照配列との間の差異の１つ以上のセットを導くために用いられ、各セットは該標的が特定の表現型を有する確率に関連する、請求項８に記載の方法。１１．差異の各セットと関連する前記確率が、前記標的が特定の表現型を有するという所望の信頼水準よりも大きい組合せ確率を導くために用いられる、請求項１０に記載の方法。１２．前記比較が、１つ以上の種特異的多型性を同定し、そしてこれらの種特異的多型性が該同定を確認するために用いられる、請求項７に記載の方法。１３．前記比較が、１つ以上の共有の多型性を同定し、そしてこれらの共有の多型性が該同定を確認するために用いられる、請求項７に記載の方法。１４．前記アレイの第一領域への前記標的のハイブリダイゼーションパターンが、該標的が特定の種に属する確率を誘導するために用いられ；全ての領域から導かれる前記生物が特定の種に属することを示す確率の組合せが所望の信頼水準を超えるまで、該アレイの他の領域についてこれを反復する、請求項６に記載の方法。１５．各領域が、標的核酸内の３と15との間の連続する残基の存在または非存在を検出するオリゴヌクレオチドプローブに対応する、請求項１４に記載の方法。１６．前記参照DNAまたはRNA配列が高度に保存された遺伝子由来である、請求項１に記載の方法。１７．前記標的核酸が生物学的サンプルから増幅される、請求項１に記載の方法。１８．前記標的ヌクレオチドが蛍光的に標識されている、請求項１７に記載の方法。１９．前記オリゴヌクレオチドが約５〜25ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。２０．前記ハイブリダイゼーションが250μl以下の液体容量において行われる、請求項１に記載の方法。２１．前記アレイが100と1,000,000との間のプローブを有する、請求項１に記載の方法。２２．前記アレイが約2,800プローブを有する、請求項２１に記載の方法。２３．前記プローブがスペーサーを介して支持体に連結している、請求項１に記載の方法。２４．前記全体的ハイブリダイゼーションパターンが、以下： (a) 選択されたプローブのセットのそれぞれへの標的核酸配列のハイブリダイゼーション強度を決定する工程；および (b) 該ハイブリダイゼーション強度を、該選択されたプローブのセットへの前記参照配列の対応するハイブリダイゼーション強度と比較する工程、によって導かれる、請求項１に記載の方法。２５．前記選択されたプローブのセットが前記参照配列の連続するセグメントを質問する、請求項２４に記載の方法。２６．前記全体的ハイブリダイゼーションパターンが、前記標的配列の共通のヌクレオチド位置を質問するプローブの群から生成される最大ハイブリダイゼーション強度を決定し、これを該標的中の他のヌクレオチド位置について反復し、そして決定された最大ハイブリダイゼーション強度を質問されるべき対応するヌクレオチド位置の関数としてプロットして、ハイブリダイゼーション強度対ヌクレオチド位置の標的配列プロットを提供することによって導かれる、請求項１に記載の方法。２７．請求項３７に記載の工程を前記参照配列によって置換される前記標的配列を用いて反復して前記参照配列の基線プロットを誘導し、そして該標的プロットを該基線プロットと比較する工程をさらに包含する、請求項２６に記載の方法。２８．前記共通のヌクレオチド位置が連続するセグメントを形成する、請求項２７に記載の方法。２９．遺伝子（またはその相補物）をコードする第一の生物由来の標的核酸配列を第二の生物由来の同一の遺伝子（またはその相補物）をコードする参照配列と比較することによって、生物の遺伝子型および/または表現型を同定するための方法であって、該方法は以下： (a) 該標的核酸またはそのサブ配列を含むサンプルを、固体支持体に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイにハイブリダイズする工程であって、該アレイは：複数のプローブを含む第一のプローブセットであって、各プローブは該参照配列のサブ配列に全く相補的なヌクレオチドのセグメントを含み、該セグメントは該参照配列中の対応するヌクレオチドに相補的な少なくとも１つの質問位置を含む、第一のプローブセットを含む、工程； (b) 該標的核酸またはそのサブ配列に該参照配列へのそれらの結合に比較して第一のプローブセットのどのプローブが結合するかを決定する工程であって、このような相対的結合は、該標的配列中のヌクレオチドが該参照配列中の対応するヌクレオチドと同一かまたは異なるかどうかを示す、工程； (c) 該標的配列の該ヌクレオチドと該参照配列との差異に基づいて、該第一の生物の該表現型を同定する工程； (d) 該参照配列と該第一の生物との間の差異の１つ以上のセットを導く工程；および (e) 該差異のセットを生物の種分化と相関する差異のセットを含むデータベースと比較して該第一の生物の遺伝予型を同定する工程、を包含する、方法。３０．前記第二の生物が、Mycobacterium tuberculosisである、請求項２９に記載の方法。３１．前記遺伝子が、16SrRNA，rpoB遺伝子、katG遺伝子、inhA遺伝子、gyrA遺伝子、23SnRNA遺伝子、rrs遺伝子、pncA遺伝子、およびrpsL遺伝子からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。３２．前記表現型が抗生物質薬物に耐性である、請求項２９に記載の方法。３３．前記薬物がリファンピシン、リファブチン、イソニアジド、ストレプトマイシン、ピラチナミド、エタンブトールからなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。３４．前記参照DNAまたはRNA配列が高度に保存された遺伝子由来である、請求項２９に記載の方法。３５．差異の各セットが、前記標的が前記第一の生物の特定の種に属する確率に関連する、請求項２９に記載の方法。３６．前記差異の各セットに関連する確率が、前記標的が特定の種に属する所望の信頼水準よりも大きい組み合わせ確率を導くために用いられる、請求項３５に記載の方法。３７．前記比較が、１つ以上の種特異的多型性を同定し、そしてこれらの種特異的多型性が該同定を確認するために用いられる、請求項２９に記載の方法。３８．前記比較が、１つ以上の共有の多型性を同定し、そしてこれらの共有の多型性が該同定を確認するために用いられる、請求項２９に記載の方法。３９．前記標的核酸が生物学的サンプルから増幅される、請求項２９に記載の方法。４０．前記標的核酸が蛍光的に標識される、請求項３９に記載の方法。４１．前記オリゴヌクレオチドが約５〜25ヌクレオチド長である、請求項２９に記載の方法。４２．前記ハイブリダイゼーションが、250μL以下の液体容量中で行われる、請求項２９に記載の方法。４３．前記アレイが100と1,000,000との間のプローブを有する、請求項２９に記載の方法。４４．前記アレイが約2,800プローブを有する、請求項４２に記載の方法。４５．前記プローブがスペーサーを介して前記支持体に連結している、請求項２９に記載の方法。４６．前記アレイが第二、第三、および第四のプローブセットをさらに含み、それぞれは該第一のプローブセット中の各プローブについて対応するプローブを含み、該第二、第三、第四プローブセット中の対応するプローブは、該第一プローブセット中の対応するプローブまたは前記少なくとも１つの質問位置を含むそのヌクレオチドのサブ配列に、４つのプローブセットからの４つの対応するプローブのそれぞれにおける異なるヌクレオチドによって該少なくとも１つの質問位置が占有されていることを除いて、配列が同一であり、そして互いに相対的に、該４つのプローブセット中のどのプローブが該標的核酸またはそのサブ配列に特異的に結合するかを決定し、該４つのプローブセット中の該対応するプローブの該相対的特異的結合が、該標的配列中のヌクレオチドが前記参照配列中の対応するヌクレオチドと同一であるか異なるかどうかを示す、請求項２９に記載の方法。４７．前記アレイが、前記第一プローブセットにおける各プローブについて対応するプローブを含む第五のプローブセットをさらに含み、該第五プローブセツトからの該対応するプローブは該第一プローブセットまたは前記少なくとも１つの質問位置を含むそのヌクレオチドのサブ配列からの該対応するプローブを含む配列に、該少なくとも１つの質問位置が該第五のプローブセットからの対応するプローブ中で欠失している以外は同一である、請求項４６に記載の方法。４８．前記アレイが、前記第一のプローブセットにおける各プローブについて対応するプローブを含む第六のプローブセットをさらに含み、該第六のプローブセットからの対応するプローブは該第一のプローブセットまたは前記少なくとも１つの質問位置を含むそのヌクレオチドのサブ配列からの対応するプローブを含む配列に、さらなるヌクレオチドが該第一のプローブセットからの対応するプローブ中の該少なくとも１つの質問位置に隣接して挿入されている以外は同一である、請求項４６に記載の方法。４９．前記第一のプローブセットが、参照配列中の３つの連続するヌクレオチドのそれぞれにそれぞれ対応する少なくとも３つの質問位置を有する、請求項４６に記載の方法。５０．前記第一のプローブセットが、前記参照配列中の50の連続するヌクレオチドのそれぞれにそれぞれ対応する少なくとも50の質問位置を有する、請求項４６に記載の方法。５１．前記参照配列のサブ配列に全く相補的である前記第一プローブセットの各プローブ中のセグメントが９〜12ヌクレオチドである、請求項４６に記載の方法。５２．遺伝子（またはその相補物）をコードする第一の生物由来の標的核酸配列を第二の生物由来の同一の遺伝子（またはその相補物）をコードする参照配列と比較することによって、生物の遺伝子型および/または表現型を同定するための方法であって、該方法は以下の工程： (a) 該標的核酸またはそのサブ配列を含むサンプルを、固体支持体に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイにハイブリダイズする工程であって、該アレイは：複数のプローブを含む第一のプローブセットであって、各プローブは該参照配列のサブ配列に全く相補的なヌクレオチドのセグメントを含み、該セグメントは該参照配列中の対応するヌクレオチドに相補的な少なくとも１つの質問位置を含み、ここで各質問位置は該参照または標的配列中のヌクレオチド位置に対応する、第一のプローブセットを含む、工程； (b) 各プローブからのハイブリダイゼーション強度を決定する工程； (c) 該ハイブリダイゼーション強度対該ハイブリダイゼーション強度が決定されたプローブに対応するヌクレオチド位置をプロットして、ハイブリダイゼーション強度の標的プロットを導く工程； (d) 工程 (a) 〜 (c) を該参照配列によって置換された該標的配列を用いて反復し、該参照配列の基線プロットを導く工程；および (e) 該標的プロットを該基線プロットと比較し、該生物の遺伝子および/または表現型を同定する工程、を包含する、方法。５３．前記第二の生物がMycobacterium tuberculosisである、請求項５２に記載の方法。５４．前記遺伝子が、16SrRNA、rpoB遺伝子、katG遺伝子、inhA遺伝子、gyrA遺伝子、23SnRNA遺伝子、rrs遺伝子、pncA遺伝子、およびrpsL遺伝子からなる群より選択される、請求項５３に記載の方法。５５．前記表現型が抗生物質薬物に対して耐性である、請求項５４に記載の方法。５６．前記薬物が、リファンピシン、リファブチン、イソニアジド、ストレプトマイシン、ピラチナミド、エタンブトールからなる群より選択される、請求項５５に記載の方法。５７．前記参照DNAおよびRNA配列が高度に保存された遺伝子由来である、請求項５２に記載の方法。５８．前記アレイが、第二、第三、および第四のプローブセットをさらに含み、それぞれは該第一のプローブセット中の各プローブについて対応するプローブを含み、該第二、第三、第四プローブセット中の該対応するプローブは、該第一プローブセット中の対応するプローブまたは前記少なくとも１つの質問位置を含むそのヌクレオチドのサブ配列に、４つのプローブセットからの４つの対応するプローブのそれぞれにおける異なるヌクレオチドによって該少なくとも１つの質問位置が占有されていることを除いて、配列が同一であり、そして (b) において決定されたハイブリダイゼーション強度が、該４つのプローブセットにおける該対応するプローブのそれぞれからの最大ハイブリダイゼーション強度である、請求項５２に記載の方法。５９．固体支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイであって、該アレイは、以下：複数のプローブを含む第一のプローブセットであって、各プローブは該参照配列のサブ配列に全く相補的なヌクレオチドのセグメントを含み、該セグメントは該参照配列中の対応するヌクレオチドに相補的な少なくとも１つの質問位置を含み、ここで該参照配列はMycobacterium tuberculosis由来の遺伝子である、第一のプローブセット、を含む、アレイ。６０．前記遺伝子が、16SrRNA、rpoB遺伝子、katG遺伝子、inhA遺伝子、gyrA遺伝子、23SnRNA遺伝子、rrs遺伝子、pncA遺伝子、およびrpsL遺伝子からなる群より選択される、請求項５９に記載のアレイ。６１．以下をさらに含む、請求項６０に記載のアレイ：それぞれが前記第一のプローブセットにおける各プローブについて対応するプローブを含む、第二、第三、および第四のプローブセットであって、該第二、第三、および第四のプローブセット中の対応するプローブが、該第一のプローブセット中の対応するプローブまたは少なくとも１つの質問位置を含むそのヌクレオチドのサブ配列に、少なくとも１つの質問位置が前記４つのプローブセットからの前記４つの対応するプローブのそれぞれにおける異なるヌクレオチドによって占有されていることを除いて、配列において同一である、第二、第三、および第四のプローブセット。６２．患者サンプルにおける核酸多型性の存在を同定する方法であって、以下の工程： (a) 患者サンプル由来の核酸配列と、野生型サンプル由来の対応する核酸配列との間の参照核酸プローブのアレイへのハイブリダイゼーション強度の差異を決定する工程； (b) (a) における差異の、該野生型サンプルのハイブリダイゼーション強度に対する比を、各参照核酸プローブに対応する各塩基位置について誘導する工程；および (c) (b) における参照プローブに対応する塩基位置についての比が、割り当てられた値よりも大きいかまたはそれに等しい場合に、該参照プローブに対応する塩基位置での多型性の存在を同定する工程、を包含する、方法。６３．前記核酸配列が、ミトコンドリアDNA、p53、MSH、MLH1またはBRCA-1からなる群より選訳される、請求項６２に記載の方法。６４．前記核酸配列がHIV遺伝子を含む、請求項６２に記載の方法。６５．前記核酸配列が遺伝性疾患に関連する遺伝子を含む核酸配列である、請求項６２に記載の方法。６６．前記遺伝子性疾患が嚢胞性線維症である、請求項６５に記載の方法。６７．患者サンプル中に核酸多型性の存在を同定するコンピュータープログラム産物であって、以下の産物：該患者サンプル由来の核酸配列と、野生型サンプル由来の対応する核酸配列との間の参照核酸プローブアレイへのハイブリダイゼーション強度の差異を決定するコンピューターコード；各参照核酸プローブに対応する各塩基位置についての該野生型サンプルのハイブリダイゼーション強度に対する該差異の比を導くコンピューターコード；参照プローブに対応する塩基位置についての比が割り当てられた値よりも大きいかまたはそれに等しい場合に、該参照プローブに対応する塩基位置での多型性の存在を同定するコンピューターコード；およびコンピューターコードを保存するコンピューター読み取り可能媒体を包含する、コンピュータープログラム産物。６８．コンピューターシステムにおいて、生物を群に割り当てる方法であって、以下の工程：複数の公知の核酸配列の群を入力する工程であって、該複数の公知の核酸配列が公知の生物由来である、工程；複数の公知の核酸配列についてのハイブリダイゼーションパターンを入力する工程であって、各ハイブリダイゼーションパターンが参照核酸配列のサブ配列への該公知の核酸配列のサブ配列のハイブリダイゼーションを示す、工程；該生物由来のサンプル核酸配列についてのハイブリダイゼーションパターンを入力する工程であって、該参照核酸配列のサブ配列への該サンプル核酸配列のサブ配列のハイブリダイゼーションを示す、工程；該サンプル核酸配列についてのハイブリダイゼーションパターンを、複数の公知の核酸配列についてのハイブリダイゼーションパターンと比較する工程；および該生物が属する特定の群を、特定の位置で該サンプル核酸配列のハイブリダイゼーションパターンに最も密接にマッチするハイブリダイゼーションパターンを有する少なくとも１つの公知の核酸配列の群に従って割り当てる工程、を包含する、方法。６９．前記群が種、亜種、遺伝子型、および表現型からなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。７０．サンプル核酸配列が割り当てられる群が、該サンプル核酸配列の実際の核酸配列の知識を必要とせずに決定される、請求項６８に記載の方法。７１．前記サンプルおよび公知の核酸配列のハイブリダイゼーションパターンのハイブリダイゼーション強度を直線回帰を用いて正規化する工程をさらに包含する、請求項６８に記載の方法。７２．前記比較工程が、比較のための線形回帰からの回帰係数を利用する工程を包含する、請求項７１に記載の方法。７３．前記複数の公知の核酸配列のハイブリダイゼーションパターンについてのデータベースを作製する工程をさらに包含する、請求項６８に記載の方法。７４．前記参照核酸配列がMycobacterium tuberculosis由来である、請求項６８に記載の方法。７５．前記位置が種特異的多型性の位置を含む、請求項６８に記載の方法。７６．前記位置が複数の種間で共有の多型性の位置を含む、請求項６８に記載の方法。７７．前記サンプル核酸配列が前記特定の群に属する確率を計算する工程をさらに含む、請求項６８に記載の方法。７８．前記群がMycobacteriumの種である、請求項６８に記載の方法。７９．前記公知の核酸配列およびサンプル核酸配列が高度に保存された遺伝子を含む、請求項６８に記載の方法。８０．前記公知の核酸配列およびサンプル核酸配列が、16SrRNA、rpoB遺伝子、k atG遺伝子、inhA遺伝子、gyrA遺伝子、23SnRNA遺伝子、rrs遺伝子、pncA遺伝子、およびrpsL遺伝子からなる群より選択される遺伝子を含む、請求項６８に記載の方法。８１．生物を群に割り当てるコンピュータープログラム産物であって、以下の産物：複数の公知の核酸配列の群を入力として受けるコンピューターコードであって、該複数の公知の核酸配列が公知の生物由来である、コンピューターコード；該複数の公知の核酸配列についてのハイブリダイゼーションパターンを入力として受けるコンピューターコードであって、各ハイブリダイゼーションパターンが参照核酸配列のサブ配列への該公知の核酸配列のサブ配列のハイブリダイゼーションを示す、コンピューターコード；該生物由来のサンプル核酸配列についてのハイブリダイゼーションパターンを入力として受けるコンピューターコードであって、該参照核酸配列のサブ配列への該サンプル核酸配列のサブ配列のハイブリダイゼーションを示す、コンピューターコード；該サンプル核酸配列についてのハイブリダイゼーションパターンを該複数の公知の核酸配列のハイブリダイゼーションパターンと比較するコンピューターコード；該生物が属する特定の群を、特定の位置で該サンプル核酸配列の該ハイブリダイゼーションパターンに最も密接にマッチするハイブリダイゼーションパターンを有する該公知の核酸配列の少なくとも１つの群に従って割り当てるコンピューターコード；および該コンピューターコードを保存するコンピューター読み取り可能媒体、を包含する、コンピュータープログラム産物。８２．コンピューターシステムにおいて、生物が属する群をジェネリックプローブアレイを利用して割り当てる方法であって、以下の工程：複数の単離体についてのハイブリダイゼーション強度を入力する工程であって、該ハイブリダイゼーション強度が該単離体と該ジェネリックプローブアレイとの間のハイブリダイゼーション親和性を示す、工程；複数の単離体間で最も大きい分散を有するハイブリダイゼーション強度を選択する工程；および該複数の単離体のそれぞれを該選択されたハイブリダイゼーション強度に従う群に割り当てる工程、を包含する、方法。８３．前記群が、種、亜種、遺伝子型、および表現型からなる群より選択される、請求項８２に記載の方法。８４．前記割り当てる工程が、前記複数の単離体を前記選択されたハイブリダイゼーション強度に従う群にクラスター分析する工程を包含する、請求項８２に記載の方法。８５．前記クラスター分析する工程が、主要成分分析および可変クラスター分析からなる群より選択される、請求項８４に記載の方法。８６．複数の単離体の間で前記ハイブリダイゼーション強度を標準化する工程をさらに包含する、請求項８２に記載の方法。８７．前記標準化工程が、複数の単離体間に共通の平均値および分散が存在するように、各単離体の前記ハイブリダイゼーション強度を調節する工程を包含する、請求項８６に記載の方法。８８．前記ジェネリックプローブアレイが、特定の長さの全ての核酸プローブを含む、請求項８２に記載の方法。８９．ジェネリックプローブアレイを利用して生物が属する群に割り当てるコンピュータープログラム産物であって、以下の工程：複数の単離体の入力としてハイブリダイゼーション強度を受けるコンピューターコードであって、該ハイブリダイゼーション強度が該単離体と該ジェネリックプローブアレイとの間のハイブリダイゼーション親和性を示す、コンピューターコード；該複数の単離体間の最も大きい分散を有するハイブリダイゼーション強度を選択するコンピューターコード；該選択されたハイブリダイゼーション強度に従う複数の単離体のそれぞれに群を割り当てるコンピューターコード；および該コンピューターコードを保存するコンピューター読み取り可能媒体、を包含する、コンピュータープログラム産物。