JP2000504577A - 真核生物における遺伝子発現の制御 - Google Patents
真核生物における遺伝子発現の制御Info
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Abstract
(57)【要約】
細胞を真核的活性遺伝子またはその生産物を制御するモジュレータ遺伝子生産物と当該モジュレータ遺伝子またはその生産物を制御する更なる遺伝子生産物を発現する形質転換カセットで形質転換すること、および上記二つの遺伝子、すなわちモジュレータ遺伝子と更なる遺伝子のプロモータが同じまたは相補的組織に対する誘導的プロモータおよび発生的プロモータから選択されたものであることを特徴とする、真核的活性細胞遺伝子を制御する方法を提供する。Ｂ.amiloliquefaciensのリボヌクレアーゼであるバルナーゼを発現する致死的遺伝子を、Pinus radiataのＰrＭＡＤＳ１、２または３やEucalyptus grandisのＥＧＭ１、２または３から誘導される類の組織特異的プロモータの調節下に置く。同じ組織特異性プロモータをLaclq遺伝子を発現させるために使用するが、バルナーゼ（バルスター）のリプレッサーはlacオペロンを含む修飾３５sＲＮＡＣaＭＶプロモータによってプロモートされる。当該カセットは、再生用植物細胞を、改良された特異性と低下したプロモータ漏出を有する標的組織中でバルナーゼを発現する植物中に形質転換させるために使用される。
Description
【発明の詳細な説明】
真核生物における遺伝子発現の制御
この発明は真核生物における遺伝子発現の制御のための方法に関係する。
この発明は、植物の標的の器官または機能における高度に特異的な発現の制御
への独特であるが独占的でない応用性を持ち、また説明の目的でそのような応用
に言及されるであろう。しかし、この発明は、酵母や動物の標的の器官や機能に
おける特異的発現の制御といった他の真核生物遺伝子の発現制御のような、他の
応用においても使用され得よう。
植物、動物および酵母といった下等動物を含む商業的利益のある真核細胞生体
は、しばしば生育資源を非商業的な構造に転換する、すなわち経済的損失のある
違った遺伝子を発現する。別の商業種は、商業価値を増大するであろう特徴の導
入から利益を得よう。
たとえば、森林樹での生殖的な構造の発達は樹木の資源への重大な負担を意味
し、生殖の努力は木の生育を犠牲にして起こる。成熟した樹木の種子は、樹木群
との土壌資源を求める競争を防ぐために、また破壊的な山火事の危険を最小限度
にするために、定期的に除去されねばならない若木の発育不良を引き起こす。
オーストラリア特許明細書No．86224/91は、ある植物における植物性生育を増
大させる方法を開示する。この明細書は、着花制御因子ジベレリンA4/7による誘
導、遺伝子産物の初期の出現、および雄と雌両性の生殖的な芽における発現の特
異性を基礎として、生殖性構造特異的遺伝子に対する、本質的に組織特異的なプ
ロモーター（成長促進物質）が選択された方法を例示する。遺伝子とプロモータ
ーは単離され特徴づけられた、遺伝子の組織特異的プロモーターを包含する遺伝
子の一部が、あるリボヌクレアーゼの構造遺伝子に融合して遺伝子が修飾された
。
形質転換体は生殖的な構造の欠落を示すが、プロモーター漏出は非標的組織に
おける致死性リボヌクレアーゼの低レベルの蓄積に到りやすく、生育の減少を来
し、しがって商業的潜在力を減じた。
遺伝子発現プロモーターは三つの広いクラスの一つに一致すると一般に見なす
ことができる。構成的プロモーターは全ての組織で連続的に遺伝子を発現する。
発生的プロモーターは特異的な組織または特異的段階での組織において発現する
。誘導性プロモーターは代謝物の存在、外来性の化合物または光、熱や圧といっ
た他の刺激に応じて発現をオンまたはオフに切り替えることで応答する。
本質的に花組織に特異的なプロモーターの制御下でのBarnaseバルナーゼとい
った致死性遺伝子産物の発現は、遺伝子産物に対する阻害因子（B'または“Bars
tarバルスター“）の構成的同時発現によって、より組織特異的にされようこと
が知られている。標的細胞にで発現された遺伝子産物の作用は、阻害が遺伝子産
物の作用を抑制するには不十分である所で起こるであろうし、またプロモーター
のある程度の非特異性またはプロモーター漏洩から起こる非標的細胞Barnase活
性は、本質的に抑制される。
しかしながら、挿入されたプロモーターはしばしば漏洩的であり、またより好
ましい強力なプロモーターは、非標的細胞の死を防ぐに不十分な阻害を持つ他の
組織において有害に発現しようし、これは商業的に重要な非標的組織に不利に影
響しよう。プロモーター漏洩は予測され難く、また例えば樹木といった形質転換
体が最初の着花までに長い生育がある場合には、非標的細胞における遺伝子産生
物の結果の活性は着花抑制の利点を無くすか減じよう。一般により好ましい強力
なプロモーターは、プロモーターの選択を制限する。
本発明は、上の不利益の少なくとも一つを本質的に軽減し、真核生物遺伝子発
現を制御することおよび、使用時に信頼でき効率的であろう真核生物遺伝子発現
制御の方法を提供することを目指す。この発明の他の対象や利点は下文に明らか
になろう。
前述および他の目的も期待して、この発明は、真核生物の遺伝子またはその産
物を制御するモジュレーター（修飾因子）遺伝子産物および該モジュレーター遺
伝子またはその産物、該遺伝子２個のプロモーター、モジュレーター遺伝子およ
び誘導性プロモーターならびに同じまたは相補的な組織に対する発生的プロモー
ターから選ばれたさらなる遺伝子を制御するさらなる遺伝子の産物を発現する構
築物を持つ細胞を形質転換することから成り立っている、真核生物で活性な遺伝
子を制御する方法中に、ある面で広く存在する。
真核生物で活性な遺伝子は、関心の有る生体に生得の遺伝子を構成するか、ま
たは誘導された遺伝子を構成いよう。遺伝子は生来のプロモーターによって促進
されようし、あるいは遺伝子と非相同的な構造を構成する。真核生物で活性な遺
伝子は、選ばれたどのような細胞機能の発現産物に対してもコードしよう。例え
ば、遺伝子は標的組織に致死性効果を持つリボヌクレアーゼや根組織に線虫抵抗
性を付与するパーオキシダーゼといった酵素を包含する活性ポリペプチドに対し
てコードしよう。遺伝子は色素とアントシアニンといった染料、Bti毒素といっ
た殺虫化合物、あるいは芳香物の産生への経路を可能にする産物に対してコード
しよう。
誘導性プロモーターの制御下でのレポーター遺伝子の発現は、周辺の細胞への
漏洩無しに標的組織中における標的細胞の正確な位置を示そう。これは病原体お
よび昆虫と植物細胞との間の相互作用の初期段階の研究にとって非常に有用であ
ろう。GUS，Luc，アントシアニン遺伝子およびGFPは、レポーターとしての侯補
を構成しよう。比色定量または蛍光分析は、商品化される前には小規模宣伝の物
質から作製されよう。
この場で使用されるように、表現“致死性遺伝子”は、あるペプチドまたはア
ンチセンスまたはリボザイムまたは標的細胞を本質的に混乱させて標的細胞を死
に到らせる他の非ペプチドをコード化する遺伝子（や複数の遺伝子）を意味する
とされる。発明は、真核生物で効果的な致死性遺伝子を構成する具体物への参照
と共に、下文に記載されであろう。
致死性遺伝子は、いかなる遺伝子、あるいはペプチドやアンチセンスまたは、
標的細胞を本質的に混乱させてそこで標的細胞を死に到らせる、リボザイムをコ
ード化する遺伝子の組み合わせであろう。例えば、致死性遺伝子は、B.amyloliquefaciens
からのBarnase、A.aryzaeからのRNエーズT1，ウシRNエーズ
A，E ．coli からのRNエーズ ＩとＲＮエーズ Hおよび一組の植物RNエーズ （
Ｓ−蛋白質の集団）といったリボザイムをコード化する遺伝子から選択されよう
。代わりに、致死性遺伝子は、制限エンドヌクレアーゼの集団、1-4-β-グルカ
ナーゼや1-3-β-グルカナーゼといったグルカナーゼを含む酵素、ユビキチン、
酸性
ピロホスファターゼおよび植物細胞壁合成阻害因子から選択されよう。
好ましくは、致死性遺伝子は、RNエーズ である。キメラの致死性遺伝子は、
植物生殖器官の雄と雌の部分において発生の初期に発現される上流（プロモータ
ー）配列の制御下に、B.amyloliquefaciens からのBarnase のコーディング領域
を包含して構築されよう。
標的細胞での病原体−宿主植物相互作用の最初の出来事の間に、標的細胞にお
いて致死性遺伝子の発現制限が達成されよう。例えば、攻撃された細胞における
Barnaseまたはβ-グルカナーゼやキチナーゼといった他の毒素の発現は、周辺の
細胞への感染拡大を防ぐであろうこれらの細胞の壊死に到らせるであろう。人工
的過敏反応プロジェクトでの決定的段階は、周辺細胞における可能なプロモータ
ー漏洩の遮断である。
細菌性サルチレート-ヒドロキシレート遺伝子の発現は、全ての植物における
病原体誘導性プロモーターの制御下でのカセットの全身性発現の原因であるサル
チル酸のレベルを減ずるであろう。例えば、ある病原体誘導性プロモーターは、
ウドンコ病(powdery mildew)Eresfy graminis （Mouradov et al.1993）で接種
された後に強力に発現される大麦から分離されよう。この遺伝子のゲノムのクロ
ーンは分離され特徴づけられた（Mouradov et al．1994）。このプロモーター領
域は、致死性または異なる機能性の遺伝子を包含するカセットに融合されよう。
他の植物MADS-ボックス遺伝子と相同性を持ち、EGM1，３および２と名づける
ユーカリ樹遺伝子３種ががクローン化され配列決定された。系統発生の解析が、
ユーカリ樹遺伝子と他のMADS-ボックス遺伝子との関連性を検査するため遂行さ
れた。これから、EGM2は花弁と雄ずいの発生に関係させられたGLOBOSA MADS-ボ
ックス遺伝子群と相同であるらしく、EGM3およびEGM1両者はMADS-ボックス遺伝
子のAGL2群に一致することが示された。これらの遺伝子は極普通には花の内部の
３つの輪生体（花弁、雄ずいと雌ずい）中に発現される。
３種全てEMG遺伝子の発現様式が特徴づけられた。３種の遺伝子の発現はどの
植物性組織でも見出せなかった。EGM１遺伝子はユーカリ樹の花の花弁、雄ずい
および雌ずいで発現される。EGM3は花の成長点およびがく片で発現される。EGM2
は花弁と雄ずいで発現される。EGM3とEGM2遺伝子は、サザンブロット法により単
一
の遺伝子であることが示された。EGM1もまた単一の遺伝子らしい。
不稔性遺伝子構成物中で使用されようこれら３種全ての遺伝子のプロモーター
領域はユーカリ樹遺伝子ライブラリーから単離されて致死性的遺伝子構成物に操
作されよう。
この真核生物で活性な遺伝子、モジュレーター遺伝子とさらなる遺伝子および
それら各々のプロモーターは、それでもって標的生体が既知のいかなる方法によ
ってでも形質変換されるような形質変換カセットを構成しよう。真核細胞で活性
な遺伝子、モジュレーター遺伝子とさらなる遺伝子（や複数の遺伝子）のプロモ
ーターは、真核細胞で活性な遺伝子の発現の特異性が増強されるような組み合わ
せで選択される。例えば、この真核細胞で活性な遺伝子は、モジュレーター遺伝
子は構成的であらうが、誘導的あるいは発生的であるプロモーターにより促進さ
せられよう。弱いプロモーターでさえその特異性と有用性は、真核生物で活性な
遺伝子を促進するのに使用されるのと同じ特異性を持つプロモーターでもってさ
らなる遺伝子（や複数の遺伝子）を促進する事によって、増強されよう。
かわりに、真核生物で活性な遺伝子に対する組織特異的プロモーターは、構成
的に促進される阻害因子遺伝子産物により阻害されようし、これは次いで誘導性
に促進されるさらなる遺伝子産物により制御される。
その上さらにかわって、真核生物で活性な遺伝子産物は、ある組織特異的プロ
モーター、モジュレーター遺伝子または、異なるかまたは相補的な組織に対して
特異的なあるプロモーターの制御のもとにさらなる遺伝子の発現により自身が制
御される産物の制御のもとに発現しているモジュレーター遺伝子のモジュレータ
ー効果を受けて、構成的に発現されよう。この方法で例えば、昆虫抵抗性を付与
している構成的に促進された遺伝子は、種子特異的プロモーターの制御下に遺伝
子阻害因子を発現して種子を排除する効果に集中され、また遺伝子阻害因子自体
は非種子組織に特異的なプロモーターの制御下に発現されるさらなるある遺伝子
産物により制御されよう。
さらなる局面では、この発明は、当該の真核生物で活性な遺伝子、真核生物の
遺伝子またはその産物を制御する産物を発現するあるモジュレーター遺伝子およ
び該モジュレーター遺伝子やその産物、該遺伝子２種のプロモーター、モジュレ
ーター遺伝子と誘導性プロモーターおよび同じか相補的な組織に対する発生性プ
ロモーターから選択されたさらなる遺伝子を制御するある産物を発現するさらな
る遺伝子を構成する形質変換カセットでもってある細胞を形質変換することを構
成する、真核生物で活性な遺伝子の発現を制御する方法に広く存在する。
さらなる局面において、この発明は、真核生物で活性な遺伝子、この真核生物
の遺伝子またはその産物を制御する産物を発現するモジュレーター遺伝子および
該モジュレーター遺伝子やその産物、該遺伝子２種のプロモーター、モジュレー
ター遺伝子と誘導性のプロモーターおよび同じか相補的な組織に対する発生性プ
ロモーターから選択されたさらなる遺伝子を制御するある産物を発現するさらな
る遺伝子を構成する形質転換カセット中に広く存在する。
その上さらなる局面において、この発明は、増殖できる真核生物の細胞を下記
の遺伝子を包含する発現カセットでの形質転換の一方法中に広く存在する：
該標的組織に本質的に特異的なプロモーターの制御下に、標的細胞中に細胞毒
性的ペプチドを発現している致死性遺伝子；
該細胞毒性的ペプチドの産生と作用の阻害因子を構成的に発現しているあるモ
ジュレーター遺伝子、および
当該の本質的に特異的なプロモーターの制御下にあり該阻害因子またはモジュ
レーター遺伝子を遮断するように機能しているさらなる遺伝子。
さらなる局面において、この発明は、下記の遺伝子を包含する発現カセットに
広く存在する：
該標的組織に本質的に特異的なある誘導性プロモーターの制御下に、標的組織
に細胞毒性的ペプチドを発現している遺伝子；
該細胞毒性的ペプチドの産生と作用の阻害因子を発現している阻害因子遺伝子
、および該誘導性プロモーターの制御下に有り、該阻害因子または阻害因子遺伝
子を遮断するように機能しているリプレッサー遺伝子。
さらなる局面で、この発明は、B.amyloliquefaciensの抽出物からのP1およびP
2(Barstarに対して)およびP3とP4（Barnaseに対して）と称され、かつ下記を構
成するBarnaseおよびBarstar遺伝子のPCR分離用プライマーと関連する：
致死性遺伝子発現産物の細胞毒性的効果は、この構成物に局在化シグナル配列
を共役させる事により増加させられよう。例えば、より好ましいRNエーズの細胞
毒性的効果は、大抵の前駆RNAと成熟RNAが非保護形で存在する、核の中に標的す
る事により増加させられよう。この目的のために、例えば、Barnase遺伝子のコ
ーディング領域は、核の局在化シグナル（NLS）配列をRNエーズ遺伝子に融合す
る事により修飾されよう。
従って、以下の局面では、この発明は、A.tumefaciensのVirD2遺伝子からのNL
S配列をBarstar遺伝子に融合するための、下記を構成する、一組のPCRプライマ
ーを提供する： 組織特異的または発生的プロモーターは、植物生殖器官において花発生の初期
段階の間に遺伝子を制御している、これらの組織特異的プロモーターから選択さ
れよう。これらの遺伝子は、非開花期に間全ての植物器官において抑制された状
態で保持され、また開花期の間生殖器官において十分に誘導される。
発生的プロモーターは既知のいかなる方法ででも分離され得よう。例えば、標
的組織の発生の間にのみ存在するｍRNAが、同定され分離され、これらの特異的
ｍRNAからのｃDNAが作製され、ゲノムのライブラリーを探索するのに使用されよ
うし、次いでこれらの遺伝子のプロモーター領域を含む植物ゲノムの部分が同定
されよう。組織特異的プロモーターは本来的に相同的（未変の）か、または非相
同的（外来の）であろう。植物生殖器官組織に対して、プロモーターは雄と雌の
両器官における種々の花組織の細胞において、即ち、がく片、花弁、子房、花柱
、柱頭、胚珠、花冠その他といった特異的組織においてのみ発現されるプロモー
ターから選択されよう。不実の植物の産出には雄と雌の両器官発生の初期段階で
組織中に発現するプロモーターがより好ましい。
例えば、花発生において重要な役割を演ずるホメオチック（相同異型形成の）
MADSボックス遺伝子をコード化する遺伝子群は、花の原基発生の初期段階で発現
する。我々は、AGAMOUS AGL-2およびAGL-4遺伝子として知られるArabidopsisホ
メオチックMADSボックス遺伝子に強い相同性を示すMADS遺伝子をP.radiataから
分離した。これらの遺伝子は若い花原基で発現されて花序の成長点では発現され
ない。
致死性遺伝子産物の阻害因子をコード化する遺伝子は、致死性遺伝子の発現を
抑制している遺伝子、アンチセンスRNAを転写する遺伝子を構成するであろうし
、あるいは致死性タンパク質を不活性化できるタンパク質を発現している遺伝子
を構成するであろう。一まとめにされたオペレーター−リプレッサー系が使用さ
れると想像されるが、この阻害因子遺伝子は普通は、非標的組織で阻害因子を発
現する構成的プロモーターの発現制御下にあるだろう。
例えば、Barnase遺伝子／生殖器官組織特異的プロモーター系は、抗Barnase（
B*またはBarstar）遺伝子／プロモーター系に関連させられよう。
代わりに、バクテリオファージ ラムダN遺伝子およびE.coliでのSOS系の発現
における負制御が、発現カセットで使用され得よう。バクテリオファージラムダ
N遺伝子の発現は、PLプロモーターによってきっちりと制御されており、またこ
のプロモーターからの発現レベルを制御する。この系は、標的組織における阻害
因子遺伝子の発現に必要な負制御を提供するのに使用されよう。
SOS系は、２種のタンパク質の相互作業により制御される。転写抑制因子
（LexA）は転写の開始をそのオペレーター標的への特異的結合を通して阻害する
。RecAタンパク質はLexAタンパク質を遮断し、従ってその特異的部位での阻害を
防ぐ。これは一成分の致死性遺伝子系であろうし、また毒素遮断遺伝子を必要と
しないであろう。
誘導性プロモーターの制御下にあるリプレッサー遺伝子は、阻害因子遺伝子の
転写、RNA転写物の翻訳、またはそのもののペプチド産物の作用を抑制するため
に選択されよう。より好ましくは、リプレッサー遺伝子は、阻害因子遺伝子の発
現を直接抑制するペプチド産物をコードする。従って、リプレッサー遺伝子と阻
害因子遺伝子は、特異的なリプレッサー／オペレーター共役対を形成するため適
合されている事がより好ましい。例えば、致死性構成物と同じ組織特異性のプロ
モータの制御下にあるE.coli laclq遺伝子が、lac オペレーター配列の挿入によ
り修飾されたリプレッサー遺伝子プロモーターの作用を抑制するために使用され
よう。
リプレッサー遺伝子プロモーターは、プロモーターとリプレッサーのコーディ
ング領域との間に少なくとも一つのlac オペレーターを持っている修飾された35
S-RNA-CaMVプロモーターであろう。下文に例示される修飾された35S-RNA-CaMVプ
ロモーターの選択において、本発明者等は、修飾された35S-RNA-CaMV配列の増幅
に対するプライマーを開発した。
従って、更なる局面において、この発明は、35S1および35S2と称され下記を構
成する、修飾された35S-RNA-CaMV配列のPCR増幅のためのプライマーを提供する
：
修飾された35S-RNA-CaMVプロモーターの３’および５’の両領域へのlacオぺ
レーターの導入に対しては、配列は下記PCRプライマーにより増幅されよう：
ラクトーズオペロン、DNA結合タンパク質（リプレッサー、laclq）間の相互作
用および標的プロモーター配列（オペレーター）の分子機構は大変詳細に理解さ
れている。Lacオペロンの発現はlaclqリプレッサーからの強力なまた厳密に負の
制御下にある。精製されたリプレッサーは４量体であり、各々360アミノ酸
（MW 38,350 kDa）を持つ同一のサブユニット４個から形成される。オペレータ
ー配列は、28塩基対の対称的な配列を含む35塩基対を構成する。
阻害因子遺伝子の発現の最大の抑制には、リプレッサータンパク質は標的細胞
の核中により好ましく標的される。これは、リプレッサーのC末端へ核局在シグ
ナル配列の融合により達成されよう。
さらなる局面において、この発明は、laclq遺伝子の単離に適合しかつ植物ベ
クターにクローン化するため適当な制限酵素開裂部位を持つ一組のプライマー、
遺伝子の５’および３’末端に対応しAM１ならびにAM２と称される下記プライマ
ー2種、に関係する：
本発明のその上さらなる局面において、laclq遺伝子の３’末端にNLS配列を融
合する時に使用するための、また下記を構成する一組のPCRプライマーが提供さ
れる：
欲するなら、本発明の方法は、逆にも出来る方法であろう。例えば、遺伝子カ
スケードは、生殖力に操作された不毛性の裏返しを許容するだろうし、従って種
子の産生を可能にする分子要素を使用しよう。逆の機構は、抗リプレッサー遺伝
子を、化学的にスイッチできるプロモーターの制御下に置く事により成り立とう
。例えば、生殖力の回復が必要とされる時は、植物は、修飾された阻害因子遺伝
子の発現の阻害を遮断するであろう抗リプレッサーRNAの発現を誘導する化学物
質を散布されるか別に投与されよう。花の器官における阻害因子産物の蓄積は、
致死性遺伝子機能を阻害し、従って正常な花の形成を可能とするだろう。
例えば、記述のlac/laclq系に対して、修飾されたBarstar遺伝子の発現の阻害
を遮断するであろう抗laclq RNAの発現を誘導する化学物質が植物に散布されよ
う。花の器官でのBarstar産物の蓄積は致死性遺伝子の機能を阻害するであろう
し、従って、正常な花の形成を可能とする。トウモロコシ グルタチオン-ｓ-ト
ランスフェラーゼ（GTS II）遺伝子のプロモーター領域は化学的に誘導された発
現に使用され得よう。GST IIプロモーターの発現はジクロラミン（N,N-ジアリル
-2,2-ジクロロアセタミド）やフルオラゾール（ベンジル-2-クロロ-4-トリフル
オロメチル-5-チアゾール-カルボキシレート）といった化学物質でオンにスイッ
チされ得よう。
ユーカリ樹の場合、EGM3遺伝子の上流配列を構成するEGM3プロモーターは、致
死性遺伝子をユーカリ樹の花の組織中に特異的に発現するのに使用されよう。こ
のプロモーターを用いて、細胞毒性的なBarnase遺伝子は発生の極初期において
花の成長点で特異的に発現されよう。阻害因子Barstarはlacオペレーター配列を
持っている35S-RNA-CaMVプロモータの制御下に発現されよう。
EGM3プロモーターの制御下にあるE.coli laclq遺伝子は、開花の開始の間に花
の成長点組織におけるBarstarの発現を防ぐためのリプレッサー遺伝子として使
用されるであろう。開花の間、EGM3プロモーターは花の生長点においてBarnase
とlaclqを発現するであろう、一方、修飾された35S-RNA-CaMVプロモーターは花
の成長点を除いた全組織においてBarstarを発現し、プロモーター漏洩を保護す
るであろう。非開花期の間は、35S-RNA-CaMVプロモーターは、万遍なくBarstar
を発現し、漏洩を保護するであろう。
線虫は世界農業に1000億US$超の年間損失を引き起こす。明らかに最も重要な
病原体は、広範囲の植物を攻撃する線虫Meloidogvne incognitaおよびMeloidogv ne javanica
である。制御法は、危険な化学物質の使用、輪作といった耕作上の
習慣や限定された範囲の作物における抵抗性変種の使用を含む。線虫への抵抗性
を操作する事の利点は、特別な耕作上の習慣を必要の無い事および環境の危険を
減じる事である。
致死性遺伝子／阻害因子／リプレッサー接近法は線虫への抵抗性を操作するの
に使用され得る。線虫に対する植物防御を活性化する理想的な部位は、植物根の
維管束領域における給養細胞中にある。いくつかの植物−線虫相互作用において
、遺伝子プロモーターは、線虫の給養の部位で特異的にBarnase遺伝子を発現す
るために使用され得る鑑別スクリーニングにより同定されようとしている。最近
、Meloidogvne incognitaで感染されたトマトの根での巨大細胞給養部位におい
て高レベルで発現される遺伝子２種（Lemmi9およびLemmi10）が同定された（Van
der Eycken et al.,(1996)Plant Jounal 9, 45-54）。
給養細胞における致死性遺伝子の発現は、速やかに細胞を殺し、また殊に雌の
発生にとって非常に決定的である給養過程を混乱させるであろう。非標的組織に
おける阻害因子遺伝子の発現が、プロモーター漏洩による根の他の部分への損傷
を防ぐのに必要とされるであろう。巨大給養細胞中で高レベルの発現を示すプロ
モーターは、非標的細胞ででも低いレベルで発現されるから、このことは殊に重
要である。給養部位プロモーター下のリプレッサー遺伝子の発現は、致死性遺伝
子が細胞を破壊することを許容するために、標的組織中で、阻害因子遺伝子の発
現を十分に遮断せねばならない。
この発明がより容易に理解されて実用的効果を持つようするために、下記の実
施例と発明のより好ましい具体例を説明する付随の図を参照するがそこでは：
図１はBarnase/NLS遺伝子で局在化された致死性遺伝子系の構築を表す；
図２はlacオペロン修飾された35S-RNA-CaMVオペレーター／Barstar阻害因子遺
伝子系を表す；
図３はlaclq/NLSで局在化されたリプレッサー遺伝子系の構築を表す；
図４は本発明に一致してBarnase/Barstar:lac/laclqカスケードの作用機作を
表す；
図５は本発明に一致して異なるカスケードBarnase:op/LexA/RecAを表す；
図６は本発明に一致して逆のBarnase/Barstar:lac/laclq/アンチセンスlaclq
カスケードの作用機作を表す；
図７は制御カセットならびに図１の致死性的遺伝子／NLS系の作用様式の図解
的説明をを表す；
図８はP.radiataの生殖組織および植物組織におけるPrMADS1,PrMADS2,PrMADS3
,PrFL1およびPrC0N1遺伝子の発現を表す；
図９は雄および雌の毬果でのPrMADS3の発現である；
図10はPrMADS1，PrMADS2とPrMADS3のゲル移動度シフト試験である；
図11はEGM1プロモーターのヌクレオチド配列である；
図12はEGM2プロモーターのヌクレオチド配列である；
図13はユーカリ樹花特異的MADS遺伝子のプロモーターEGM3の推定配列である；
図14はEGM1ｃDNAで探索された(6時間露出)ユーカリ樹組織から抽出された全RN
Aのノーザンブロットの図式表示である；
図15はEGM3ｃDNAで探索されたユーカリ樹組織からの抽出された全RNAのノーザ
ンブロットの図式表示である；
図16はEGM2ｃDNAで探索された(6時間露出)ユーカリ樹組織から）抽出された全
RNAのノーザンブロットの図式表示である；
図17はいくらかの植物MADSボックス遺伝子のMADSボックス領域の予測されるタ
ンパク質配列の整列である；
図18はいくらかの植物MADSボックス遺伝子の関連性を示している系統樹である
；
図１９はEcoR1およびHinDIIIで消化し、EGM3およびEGM2遺伝子で探索したEucalvotus grandis
DNAのサザンブロットである；
図２０はユーカリ樹から抽出しEGM3 cDNA（6時間露出）で探索したユーカリ樹
組織の全RNAのノーザンブロットである；
図21はプラスミド７prom Barstarの図解的説明である；
図22はV1プロモーターを含むプラスミドp BR Barnase prom Barstarの図解的
説明である；
図23はV2プロモーターを含むプラスミドの図解的説明である；
図24はEGM3 double binのPst1消化物のアガローズ分離の図解的表現である。E
coR1 クローニング部位がEGM3 binにおける塩基6772であるとすると、この消化
に対するマップから予測される断片サイズは4.9、4.4、3.3、1.9、1.1、および0
.6 kbである。
図25は、クローン化された挿入の可能な異なる配向を示すEGM3 bin のPst1消
化物の２種のゲル露出の図解的説明である。消化物から期待される断片サイズは
7.4、4.9、4.4、1.1、0.7、および0.6 kb である。
図26はEGM3 double binのプラスミド図表である。
図27はEGM3 V1 センスのプラスミド図表である。
図28はプラスミドV1(Barnase-Barstar)のプラスミド図表である。
図29はプラスミドV2(LaclqNSL-35sプロモーターOp-Barstar)のプラスミド図表
である。
図30はプロモーター探索子戦略の表示である；
図31はPrMADS2プロモーターのヌクレオチド配列である；
図32はPrMADS3 cDNAプロモーターのヌクレオチド配列である；
図33はPrMADS3タンパク質のアミノ酸配列である；
図34はPrMADSプロモーターのヌクレオチド配列である；
図35はPrFL1 cDNAクローンのヌクレオチド配列である；
図36はPrFL1タンパク質のアミノ酸配列である；
図37はPrFL1プロモーターのヌクレオチド配列である；
図38はPrCon1遺伝子(部分)のヌクレオチド配列である；また
図39はEGM2 cDNA（３日露出）で探索したユーカリ樹組織から抽出した全RNAの
ノーザンブロットである。
実施例１
キメラ生殖器官特異的発現カセットを構築した。これは、生殖器官特異的プロ
モータおよびバルナーゼ阻害剤をコードする遺伝子の正のコントロールの下のバ
チルス・アミロリクエファシエンスからのバルナーゼ遺伝子、導入lacオペレー
タ配列を有する修飾構成的プロモータ(３５ＳＲＮＡ ＣａＮＶ)の下のバチルス
・アミロリクエファシエンスからのバルスター(Ｂ*)、および図４に示す致死的
遺伝子を発現するために用いられたのと同じ生殖器官特異的プロモータのコント
ロールの下の大腸菌laclq遺伝子の負のコントロールを含む。
生殖器官特異的プロモータは、後記するように花の発生の初期段階において生
殖器官に発現された遺伝子の上流配列を含む。バルナーゼの細胞毒性作用は、プ
レＲＮＡおよび成熟ＲＮＡの大部分が非保護の形態で存在する核をバルナーゼが
標的とすることにより増大された。この目的のために、図１に示すように
Ａ.tumefacieus株Ｃ５８のＶirＤ２遺伝子からの核局在化シグナル(NLS)配列を
Ｂ遺伝子の３'−領域に融合することにより、Ｂ遺伝子のコード領域を修飾した
。
３５Ｓ−ＲＮＡ−ＣaＭＶプロモータ領域の５'−、３'−および５'−、３'−
領域においてlacオペレータ配列を保持する阻害剤バルスター(Ｂ*)遺伝子部分ベ
クターを図２に示すように構築した。
致死的遺伝子を発現する用いられたのと同じ生殖器官特異的プロモータのコン
トロールの下の大腸菌laclq遺伝子は、図３に示すようにlaclqタンパク質のＣ末
にＡ.tumefacieusのＶirＤ２遺伝子からのＮＬＳを融合することにより、核を標
的としたそのlaclqタンパク質を有する。
実施例２
別のキメラ生殖器官特異的発現カセットを図５のように構築した。そこでは、
生殖器官特異的プロモータおよびバルナーゼ遺伝子は、３５３−ＲＮＡ−ＣaＭ
Ｖプロモータのコントロール下でＬexＡ生産物の正の転写コントロール下、およ
びの致死的遺伝子の発現に用いられたのと同じ生殖器官特異的プロモータのコン
トロール下のＲecＡ遺伝子生産物の負のコントロール下にある。
実施例３
逆転システムを実施例１に実質的に準じて構築した。さらに、アンチセンスＬ
aclqＲＮＡ遺伝子を調節するトウモロコシ・グルタチオンＳ−トランスフェラー
ゼ(ＧＳＴII)遺伝子から化学的に切り替えできるプロモータを含めた。このこと
は図６に示すように種子の産生をもたらす。生殖力の回復は、ジクロラミン(Ｎ
，Ｎ−ジアリール−２,２−ジクロラセタミド)またはフルオラゾール(ベンジル
−２−クロロ−４−トリフルオロメチル−５−チアゾールーカルボキシレート）
などの誘導物質で噴霧することにより達成される。アンチ−laclqRNAのこの化学
的誘導発現は、修飾３５Ｓ−ＲＮＡ−ＣaＭＶ−Ｂ*遺伝子の発現阻害を阻止する
。花の器官におけるＢ*の蓄積は、致死的遺伝子の機能を阻害し、正常な花形成
をもたらすであろう。
実施例４
laclqリプレッサー遺伝子の植物発現ベクターへの修飾および挿入
pＲＴ９９ＧuＳベクターをＸbaIおよびＫpnIで消化し、ＧＵＳ遺伝子のコード
領域を放出せしめると、植物における発現に適したベクターとなる。
laclqレプレッサーはほとんどすべての市販大腸菌株で利用され得る。いくつ
かの市販プラスミドもレプレッサー遺伝子を含有している。植物においてこの遺
伝子を発現するために、原核翻訳開始コドン(ＧＴＧ)をＡＴＧ中に変更した。
laclq遺伝子を単離するために、遺伝子の５'および３'末に対応する２種のプラ
イマーを用いた(ＡＭ１およびＡＭ２)。この２種のプライマーは植物ベクター中
にクローニングするために適した制限酵素開裂部位を有する。
増幅後、ＰＣＲフラグメントをＸba1およびＫpn1で消化し、ＧＵＳ遺伝子(pＢ
Ｒ−３５Ｓlaclq)を置換するために同じ酵素で消化されたpＢＲ−３５ＳＧＵＳ)
中に連結した。
laclq遺伝子の３'末にＮＬＳ配列を融合するために、いくつかのＰＣＲを行っ
た。
プライマー
laclq遺伝子のコード領域に融合したA.tumefacieusからのＶirＤ２遺伝子から
のＮＬＳを含有する最終ＰＣＲフラグメントは、ＸbaIおよびＫpnIで消化し、同
じ酵素(pＢＲ−３５Ｓlaclq−ＮＬＳ)で消化された植物発現ベクターpＢＲ３２
２−３５５ＧＵＳ中に連結された。このベクターは、可能性のある相同組換えを
なくすために、ＸＬ１BlueからＪＣ８６９７(recＡ)大腸菌株に形質転換された
。
実施例５
バルナーゼおよびバルスター遺伝子
Ｐ１およびＢ２(バルスターについて)、およびＰ３およびＰ４(バルナーゼに
ついて)プライマーを用いてバチルス・アミロリクエファシエンスの粗抽出物か
らＰＣＲにより、これらの遺伝子を単離した。
Ｐ１−Ｐ２ＰＣＲフラグメント(バルスター)は、ＥcoＲＩおよびＨindIIIで消
化し、同じ酵素で(ＢＳ−Ｂ*)で消化したBluescript ＳＫベクター中に連結し
た。ＢＳ−Ｂ*ベクターのＢamＨＩ−ＨindIIIフラグメントをタンパク質発現
ベクターpＱＥ３２(pＱＥ３−Ｂ*)に導入した。
Ｐ３−Ｐ４ＰＣＲフラグメント(バルナーゼ)は、ＰＣＲクローニングベクター
Ｐ／ＧＥＭ−Ｔ(pＧＥＭ−Ｔ−Ｂ)中に連結した。Ｂ遺伝子の３'末にＮＬＳ配列
を融合するために、いくつかのＰＣＲを行った。
プライマー
バルナーゼ遺伝子のコード領域に融合したA.tumefacieusからのＶirＤ２遺伝
子からのＮＬＳを含有する最終ＰＣＲフラグメントをＰＣＲクローニングベクタ
ーpＧＥＭ−Ｔ(pＧＥＭ−Ｔ−Ｂ−ＮＬＳ)中に連結した。
実施例６
lacオペレータ配列の３５Ｓ−ＲＮＡ−ＣaＭＶプロモータへの導入
市販のプラスミドpＱＥ３２は２つのlacオペレータ(オペレータＩおよびII)の
理想的な組み合せを有する。第１工程でpＲＴ９９ＧＵＳベクターからのＨindII
IフラグメントをBluescript ＳＫベクター(Ａ１)中に導入した。３５Ｓ−ＲＮ
Ａ−ＣaＭＶプロモータおよびターミネータ領域中に融合されたＧＵＳ遺伝子を
保持するＡ１ベクターのＥcoＲＩ−ＳalＩフラグメントを同じ酵素で消化された
pＱＥ３２ベクター中に導入した。
得たベクターは、上流領域(Ｄp＋３５Ｓ−ＧＵＳ)に２つのlacオペロンを有す
る３５−ＲＮＡ−ＣaＭＶプロモータを含有する。
lacオペレータを３５ＳＲＮＡ−ＣaＭＶプロモータとＧＵＳ遺伝子コード領域
の間に導入するために、まず、プロモータのないＧＵＳ遺伝子を保持するＡ１ベ
クターのＢamＨＩ−ＳalＩフラグメントを同じ酵素で消化されたpＵＣ１９ベク
ター中に連結した。次の工程において、pＵＣ１９−プロモータＧＵＳベクター
は、ＥcoＲＩおよびＳalＩ酵素で消化し、同じ酵素(pＱＥ−プロモータＧＵＳ)
で消化したpＱＥ３２中に連結した。３５Ｓ−ＲＮＡ−ＣaＭＶプロモータの５'
および３'領域に対応する３５Ｓ１および３５Ｓ２プライマーを用いてＰＣＲに
より、３５Ｓ−ＲＮＡ−ＣaＭＶプロモータ領域を増幅した。
ＰＣＲフラグメントをＸhoＩおよびＳalＩで消化し、Ｘho1で消化されたpＱＥ
プロモータＧＵＳ中に導入した。正しい方向でプロモータを含有するクローンを
選択し、得たプラスミド(３５Ｓ−ＧＵＳ)をＸＬ１BlueからＶＣ８６９２(recA)
大腸菌株に、可能性ある相同組換えをなくするために、形質転換した。
３５Ｓ−ＲＮＡ−ＣaＭＶプロモータの５'および３'領域の両方にlacオペレー
タを導入するために、３５Ｓ−ＧＵＳベクターのオペレータ３５Ｓプロモータ領
域を、３５Ｓプロモータの５'および３'−領域に対応するＯＰ１および３５Ｓ２
プライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。
ＰＣＲフラグメントをＸhoIおよびＳa1Ｉで消化し、ＸhoＩで消化したpＱＥプ
ロモータＧＵＳ中に導入した。正しい方向にプロモータを含有するクローンを選
択し、得たプラスミド(３５Ｓ−プロモータＧＵＳ)をＸＬ１BlueからＪＣ８６９
７(recＡ)大腸菌株中に、可能性ある相同組換えをなくするために、形質転換し
た。
バルスター遺伝子をpＱＥプロモータＧＵＳベクター中に、ＥcoＲＩ＋Ｋpnl両
者の消化後に、クローン化した。
組織切除法の１つの難しさは、他の組織におけるプロモータの漏出および発現
の効果である。これを克服するために、コントロールシステム(遺伝子カスケー
ドを開発した。これによって致死的遺伝子の発現が非標的組織において計数され
る（図７）。バルナーゼ(Ｖ１)およびバルスターに加えてこれらのカスケードの
レセプター(laclq)(Ｖ２)部分を保有する２種のベクターを設計した。
プロモータ領域をベクターＶ１およびＶ２にクローン化するために、Ｖ１につ
いて末端のＳalＩ制限部位(ＳａｌＩプライマー)およびＶ２についてＥcoＲＩ制
限部位(ＥcoＲＩプライマー)を持つプライマーセットを用いて、増幅した。Ｖ１
およびＶ２ベクターにおけるプロモータの方向に調べるために、ＥcoＲＩ制限部
位をＳalＩ部位から下流に前進ＳalＩプロモータに設計し、ＳalＩ部位をＥcoＲ
Ｉから下流のＥcoＲＩプライマーに設計した。
Ｓa1Ｉプライマー
ＰｒＭＡＤＳ２プロモータ： ＰｒＭＡＤＳ３プロモータ： ＰｒＦＬ１プロモータ： ＥｃｏＲＩプライマー：
ＰｒＭＡＤＳ２プロモータ： ＰｒＭＡＤＳ３プロモータ： ＰｒＦＬ１プロモータ： ＳalＩプライマーのＰＣＲフラグメントをＳa1Ｉ制限酵素で消化し、ＳalＩで
消化したＶ１ベクターに導入した。プロモータの方向をＥcoＲＩ酵素での消化を
用いて調べた。
ＥcoＲＩプライマーのＰＣＲフラグメントをＥcoＲＩ制限酵素で消化し、Ｅco
ＲＩで消化したＶ１ベクターに導入した。プロモータの方向をＳalＩ酵素での消
化を用いて調べた。得たプラスミドのマップを図２１および２２に示す。
これらのベクターをＨindIII酵素で線状化し、ＨindIIIで消化したＢin１９バ
イナリーベクター中に導入した。修飾Ｂiu１９ベクターを保有するコロニーをカ
ナマイシンおよびアンピシリン抗生物質でプレート上に選択した。次の工程とし
て、Ｂin１９−Ｖ１−プロモータおよびＢ１９Ｖ２−プロモータベクターをいく
つかのアグロバクテリウム株に形質転換した。アラビドプシス・サリアナ、ユー
カリプタス・グランディスおよびピタス・ラジアータの胚および外植体をアグロ
バクテリウム株でもって共形質転換した。
プラスミドpＲＴ９９qus(Topfer et al.Nuc1eic Acids Research(１９８
８)１６(１７)：８７２５)からのＨindIIIフラグメントをpＢＲ３２２のＨind
III部位にクローン化した。この挿入は、両方向にクローンされる挿入に対応す
る２種のプラスミドを生みだした。挿入領域は、カリフラワー・モザイク・ウイ
ルス(ＣaＭＶ)３５ＳＲＮＡプロモータ、β−グルコロニダーゼ(ＧＵＳ)遺伝子
およびＣaＭＶ３５Ｓターミネータ領域を含む。これらのプラスミドをpＢrＧus
１およびpＢrＧus２と名付け、致死的遺伝子構築体の基とした。挿入における方
向はＢamＨＩ−消化で調べた。pＢrＧus２は２．５kbと４．４kbのＢamＨＩフラ
グメントを、pＢrＧus１は６．１kbと０．８kbのフラグメントをつくりだす。
laclq核局在化シグナルタンパク質をコードするＤＮＡは、５'プライマーＬac
Ｉ(ＥcoＲＩ部位を有す)およびＫpnI部位を有する３'プライマーＤ２３を用いて
ＰＣＲによりプラスミドpＧＥＭlaclqＮＬＳから増幅される。増幅ＤＮＡフラグ
メントは、ＥcoＲＩおよびＫpnIで制限されて、同じ酵素で切断されたpＢＲＧus
２中にクローン化される。得たプラスミドをpＢＲＬacと名付けた。pＢＲＬacプ
ラスミドは、ＳphI で切断され、次いでＳphＩでアガロースゲル上で操作して、
除去したい制限部位を含む小さいＳphＩフラグメントから離れて、Ｌaclq遺伝子
、アンピシリン抵抗性遺伝子および複製源を含有するプラスミドの精製を可能と
する。得たプラスミドをpＢＲＬacＢＨ−と名付けた。
プラスミド構築の第２工程は、修飾ＣaＭＶプラスlacオペレータプロモータの
調節下でのバルスター遺伝子のクローニングのための準備である。これは、プロ
モータおよびコード配列の間のＥcoＲＩ部位を除去するように修飾されたプロモ
ータ／遺伝子配列を含有するプラスミドp３５Ｓ−op−バルスターＥcoＲＩから
増幅された。この増幅は、ＥcoＲＩでの３５Ｓ−opバルスタープラスミドの切断
、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによる平滑化反応の実施および平滑プラスミドの再連
結によってなされた。ＰＣＲを５'−プライマ−pＱＥ−Ｆおよび３'−プライマ
ーＢar−３'を用いて実施した。ＰＣＲフラグメントをＸholおよびＫpn1で切断
した。これをＸholおよびＫpnlで切断した３５Ｓ−opバルスタ−ＥcoＲＩプラス
ミド中にクローン化した。そこから、望ましくない遺伝子をゲル電気泳動で精製
除去した。これは、バルスターコード領域の３プライム末で制限部位の除去を可
能にした。このプラスミドをｐ３５Ｓ−op−バルスターＥｃｏＲＩ−２と名付け
た。
次いでp３５Ｓ−op−バルスターＥｃｏＲＩ−２からＸholおよびＳalＩでもっ
てバルスター遺伝子を切り出し、ＳalＩでpＢrＬacＢＨ−中にクローン化した。
バルスターはＳalＩ部位に両方向にはいり得るが、１方向のみ見出された。挿入
の方向はＫpnl消化により確認された。プラスミドpＢＲＬacＯpバルスター１中
にみられる挿入の方向を示すものとして１kbバンドのみが見られた。この得たプ
ラスミドをＶ２と呼ぶ。
プラスミドは、本例の場合は花特異的プロモータのlaclq遺伝子の５プライム
部位クローニングのユニークＥcoＲＩ中にクローニングする準備が整えられた。
ユーカリプタスＭＡＤＳ遺伝子ＥＧＭ３からのＥＧＭ３プロモータをこの目的に
用いた。このプロモータは両方向にクローン化され、得たプラスミドをＶ２ＥＧ
Ｍ３センスおよびＶ２ＥＧＭ３アンチセンスと名付けた。Ｖ２ＥＧＭ３センスは
、植物形質転換ベクターのためのlaclqおよびＣaＭＶopバルスター遺伝子を調節
したＥＧＭ３の源として用いた。ＥＧＭ３プロモータの方向をＸbalＰst１消化
により決定した。２.３および０.９ｋｂバンドの存在は正しい方向の指標であっ
た。
Ｒ２構築体Ｖ１は、プロモータなしのバルナーゼ遺伝子を含み、出発点として
pＢrＧus２を用いて構築された。バルナーゼ遺伝子は、プライマーバルナーゼ５
プライムＳalおよびバルナーゼ３プライムＫpnを用いて遺伝子バチルス・アミロ
リクエファシエンスから増幅された。得たＰＣＲ生産物はＫpnＩおよびＳa1Ｉで
制限しpＢrＧus１および連結反応を行った。増幅プライマーを用いて、得たコロ
ニーからのプラスミドを配列決定のための鋳型として用いた。プラスミドＳＢ４
はバチルス・アミロリクエファシエンス バルナーゼ遺伝子と同じ配列のバルナ
ーゼフラグメントを含有するのがみられ、これをpＢＲバルナーゼと名付け、更
なる構築に用いた。
植物における致死遺伝子としてバルナーゼを用いた以前の研究によると、バル
スターについてのアンチトキシン遺伝子が存在することを要し、プロモータ領域
がクローン化バルナーゼ遺伝子の５プライムであり得る前に、バルナーゼと同じ
プラスミドから発現された(Paul et al．１９９２ Plant Mo1ecu1ar Biolo
gy １９:６１１−６２２）。
これは、バルナーゼ配列を有するバチルス・アミロリクエファシエンスからの
バルスター遺伝子およびプロモータを含有するプラスミドを用いて遂行された。
この終了までにプロモータおよびバルスターＤＮＡ領域は、プライマー５プライ
ムバルスタープロモータおよびＢar３プライムを用いて、バチルス・アミロリク
エファシエンス遺伝子ＤＮＡから増幅した。ＰＣＲフラグメントをＫpnlおよびp
ＧＥＭ３fで制限し、連結反応を行った。得た白いコロニーを挿入のためにスク
ニーニングした。コロニー７からのＤＮＡを配列決定に用い、遺伝子バチルス・
アミロリクエファシエンスＤＮＡにおけるようにバルスタープロモータおよびバ
ルスター配列を含有するのが分かった。このプラスミドを図２１に示すように７
promバルスターと名付けた。
７promバルスタープラスミドをＫpnlおよびpＢＲバルナーゼで制限し、プロモ
ータバルスターフラグメントをpＢＲバルナーゼＤＮＡのＫpnl部位にクローン化
した。この結果、Ｖ１として知られるプラスミドを得た。ＥＧＭ３プロモータを
pＥＧＭ３からＥcoＲＩを用いて切除し、ＤＮＡポリメラーゼ(Ｋlenowフラグメ
ント)を用いて平滑にし、すでに制限および平滑化されているＶ１ＤＮＡのユニ
ークＳa1Ｉクローニング部位にクローン化した。正しい方向に挿入されたプロモ
ータを有するプラスミドをＥＧＭ３ＶＩセソス(図２７)と名付けた。
ＥＭ３Ｖ１センスＤＮＡをＨindIIIで直線化し、ＨindIIIでやはり直線化した
植物形質転換ベクターＢin１９にクローン化した。挿入の２方向に対応する２種
のプラスミドＥＧＭ３Ｖ１Ｂin１および２を得た。方向２において、ＥＧＭ３Ｖ
１Ｂｉｎに存在する２ＥｃｏＲＩ部位は約８０bp離れていた。ＥＧＭ３Ｖ１Ｂｉ
ｎ２をＥcoＲＩで切断し、ＤＮＡポリメリラーゼＩ(Klenowフラグメント)を用い
て平滑化した。ＥＧＭ３プロモータlaclq遺伝子およびＣaＭＶ３５Ｓopバルスタ
ー遺伝子を、ＡatIIおよびＨindIIIを用いてＥＧＭ３Ｖ２センスから切り出した
。このフラグメントを平滑化し、ＥcoＲＩカットおよび平滑ＥＧＭ３Ｖ１Ｂin２
に結合して、２つの可能な方向に対応するプラスミドＥＧＭ３Ｄouble ＢinＩ
およびII(図２６)をつくった。これらのプラスミドはA.tumefacieusでの植物形
質転換に用いた。
この方法をユーカリプタスＭＡＤプロモータについて繰り返した。ＥＧＭ２の
長いもの、短いものおよびＥＧＭ３の短いものがあった。
プライマー 実施例７
生殖器官特異的プロモータの単離
Arabidopsis thaliana および Anthirrhinum majus花分裂組織および器官
同定遺伝子に強い相同性を示す５種のコーン特異的遺伝子を非成熟雌性および雄
性コーンからつくられたピタス・ラジアータcＤＮＡライブラリーから単離した
。これらのうち３種、ＰrＭＡＤ１,２および３は、ＭＡＤＳ−ボックス遺伝子の
ファミリーに属し、Arabidopsis ＡＧＬ−２、ＡＧＬ−４およびＡＧＬ６遺伝
子、および他の非アンギオスペルス、Picece abies(ノーウェイspruce)からのd
alＩ遺伝子に夫々相同性を示す。ＰrＦ１遺伝子は、Arabidopsis Leafy(Lfy)お
よびFloricaula(Flo)からのAnthirrhinum遺伝子のパイン・オ
ルソロジーである。ＰrＣon１はArabidopsis ＣＯＮＳＴＡＮＳ(co)遺伝子に強
い相同性を示す。これらの遺伝子の機能を解明するために、コーン発生の相違す
る段階における雄性および雌性コーンの発現パタンを特徴化することを行った。
有意に低いレベルの発現が生長組織:つぼみ、針葉、茎および根で見られた。
インシトウハイブリダイゼイションによると、これらの遺伝子の発現は生殖組織
細胞でのみ検出可能であった。
発現分析によると、５種すべての遺伝子が雄性および雌性コーンの発生の異な
る段階において発現の相違するパターンを示した(図８および９)。ＰrＭＡＤＳ
１,２および３遺伝子はコーン特異的である。２種の遺伝子の発現は生殖器官原
基組織に限定的であった。生長組織:つぼみ、針葉、茎、根には、これらの検出
可能な発現はみられなかった。ＰrＦＬ１およびＰrＣon１については、生長つぼ
みで低い検出可能発現がみられた。
生殖器官において両遺伝子の低レベルの発現が、コーン発生(５０mgコーン)の
間に増加されたコーン発生(５mgコーン)の初期段階において、検出された。雄性
コーンにおいて両遺伝子の発現は最初の伝播生殖細胞を含むミクロ伝播生殖に限
定された。雌性コーンにおいて両遺伝子の発現は未成熟卵子に限定された。
インビトロにおけるＤＮＡ結合タンパク質としてＭＡＤタンパク質を特性化す
めために、大腸菌で両タンパク質を発現し、そのＤＮＡ結合性質を特徴付した。
これらのＤＮＡ結合コンセンサス配列はＡＧＡＭＯＵＳタンパク質のそれに類似
している。これら３種のタンパク質は、ＰrＭＡＤＳ１およびＰrＭＡＤＳ２につ
いてＣＡrＧボックスのコンセンサス配列ＴＴ(Ａ／Ｔ)ＣＣ(Ａ／Ｔ)(Ａ／ｔ)2(
Ｔ／Ａ)ＮＮＧＧ(−Ｇ)(Ａ／Ｔ)2(oligo Ａ)をマッチするＤＮＡ配列を結合す
る(図３２)。これらのコンセンサス配列の変異(オリゴＢ)はそのＰrＭＡＤ１、
２および３タンパク質の結合を低下する。非放射活性オリゴとの競合は、ＣＡr
Ｇコンセンサスへのいかなるタンパク質の結合も低下しなかった。このことは、
特異的ＤＮＡタンパク質相互作用をとりあつかっていることを示している。
上流配列をプロモータフィンダー戦略を用いて単離した（図３０）。ＥcoＲＶ
、ＳcaＩ、ＤraＩ、ＰuuIIおよびＳspＩによってピタス・ラジアータからゲノム
ＤＮＡ消化によって個々につくったＤＮＡフラグメント末端に特殊なアダプター
を
連結した。用いた酵素は、６塩基認識部位を有し、平滑末端を生じることから、
選択した。アダプター連結反応後、第１アダプター、プライマーＡＰ１、ＡＰ２
および遺伝子特異的プライマーＧＳＰ−１,２を用いて、これらのＤＮＡフラグ
メントをＰＣＲの鋳型とした。
アダプター(第１配列)、アダプタープライマーおよびポリメリラーゼ阻止プラ
イマーの配列を以下に示す。アダプタープライマーＡＰ１がアダプターの２２塩
基の１−２２に対応し、アダプタープライマーＡＰ２が塩基１３−３１に対応し
、ポリメラーゼ阻止が塩基４１−４８に対応することに注意すべきである。
アダプター：
低ストランドの３末端上のアミノ基の存在は、連結していない遊離のアダプタ
ー分子からのポリメラーゼ触媒伸長を阻止し、もし、特定の遺伝子特異的プライ
マーがアダプターの上方ストランドに対するＤＮＡストランドを伸長しなければ
、プライマー結合部位の発生を防止する。
第１次ＰＣＲは、Avantage Ｔth Polymerase Mix(Clontech)、およびＰrＭ
ＡＤＳ２、３およびＰrＦＬ１遺伝子についてのアダプタープライマーＡＰ１お
よびＧＳＰ−１を用いて実施される。
ＧＳＰ−１配列：
ＰＣＲ２工程サイクル・パラメーター：
７サイクル: ９４℃ ２５秒
７２℃ ４分
３２サイクル: ９４℃ ２５秒
６７℃ ４分
最終サイクル後に６７℃の４分間を追加する。
同じサイクルパラメーターおよびＡＰ２アダプタープライマーを有するＧＳＰ
の第２セットを用いて、第２次ＰＣＲにおいて第１次ＰＣＲ１mlを使用した。
ＧＳＰ−２プライマー配列：
１−２kbＰＣＲフラグメントをＴＡ型クローニングベクター中にクローン化し
、配列決定した。ＰrＭＡＤＳ２、ＰrＭＡＤＳ３およびＰｒＦ１についてのcＤ
ＮＡ、タンパク質およびプロモータの配列を図３１、３４および３７に示す。
実施例８
キメラＤＮＡ配列の植物への導入
キメラＤＮＡ配列を植物組織に、A.tumefacieusを用いて共転移した。選択培
地で生育することにより形質転換体を保持した。標準分子生物学技法(サザン、
ノーザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ)を用いて、２つのプラスミドの存在
を証明した。植物プロモータのコントロール下で、プラスミドＡはバルナーゼ遺
伝子を有し、プラスミドＢはバルスター遺伝子を有す。これは、共形質転換のた
めの追加の選択を創生する。
指定したベクター系は、生殖器官特異的プロモータの正のコントロール下に、
および大腸菌ラクターゼ(lac)リプレッサーオペレータ・システムの負のコント
ロール下における配列遺伝子のカスケードを含む。非開花期間において、リプレ
ッサータンパク質の不存在で、オペレータはすべての器官内でバルスター遺伝子
またはアンチセンスＲＮＡの構成的配列を可能とする。生殖器官特異的プロモー
タの可能性ある漏出のために、低レベルの致死的遺伝子生産物が種々の植物器官
および細胞に存在する。
細胞質中のバルスタータンパク質またはこれらの細胞の核中のアンチセンスＲ
ＮＡの蓄積は、致死的遺伝子生産物の細胞毒性作用を阻止する。開花の初期段階
において、生殖器官の適当な細胞内でのＢ(または他のＲＮase)およびlaclq遺伝
子の発現は、劇的に増加する。これらの生殖器官細胞の核におけるlaclqタンパ
ク質の蓄積は、バルスター遺伝子(またはアンチセンスＲＮＡ)の発現を、標的生
殖器官細胞における致死的遺伝子生産物のレベルを増加するlacリプレッサー・
オペレータ相互作用を通じて、阻止するであろう。
実施例９
他の植物ＭＡＤＳ−ボックス遺伝子に相同性を有する３種のユーカリプト遺伝
子(ＥＧＭ１,２,３)をクローン化し、配列決定した(図１０−１３および１７)。
ユーカリプト遺伝子と他のＭＡＤＳボックス遺伝子の関係を調べるために、系統
発生学的解析を行った(図１８)。これによると、ＥＧＭ２は、花片および雄蕊の
発生に関与するＧＬＯＢＯＳＡＭＡＤＳ−ボックス遺伝子に相同的であるらしい
ことが分かる。ＥＧＭ３およびＥＧＭ１両者はＭＡＤＳボックス遺伝子のＡＧＬ
２グループに入る。これらの遺伝子は、花の内的３輪生体(花片、雄芯および心
皮)において最も普通に発現されるが、花の発生におけるその機能はまだ分かっ
ていない。
すべての３ＥＧＭ遺伝子の発現パターンを特徴付けた(図１４、１５および１
６)。これらの遺伝子の発現はいずれの生育組織においても検出されなかった。
ＥＧＭ１遺伝子はユーカリプト花の花片、雄芯および心皮で発現する。ＥＧＭ３
は花の分裂組織および蕚で発現する。ＥＧＭ２は花片および雄芯で発現する。Ｅ
ＧＭ３およびＥＧＭ２が単一遺伝子であることをサザン分析によって明らかにし
た(図１９)。ＥＧＭ１も単一遺伝子のようである。
これらすべての３遺伝子のプロモータ領域は不毛遺伝子構築体に用いられ、ユ
ーカリプトゲノム・ライブラリーから単離された。ＥＧＭ３プロモータは致死遺
伝子構築体に用いた。
３種のＥＧＭＭＡＤＳボックス遺伝子の発現組織特異性を調べるために組織範
囲にノーザンブロットを行った。根、若木茎、シュート葉および成熟花からのＲ
ＮＡ単離に用いた組織はユーカリプス・グランジス植物から得た。花床、花片、
雄芯、心皮および花柱を含む花の組織からのＲＮＡ単離のための組織は、ユーカ
リプス・グロブルス花から採取した。この種は、非常に大きい花を産生し、ＲＮ
Ａの充分量を容易に採取できることから用いた。相違する花の組織を含むブロッ
トにおいて全ＲＮＡ１０mcgを用い、生長組織を含むユーカリプス・グランディ
スのブロットにおいて２０mcgを用いた。ＭＡＤＳ−ボックスを除去するのに適
する制限酵素で消化される３種のＥＧＭ遺伝子でもってブロットをプローブした
。
ノーザン・ブロットにより、３種すべてのＥＧＭ遺伝子はユーカリプト花にお
いて高レベルで発現することが分かった。ノーザンが長時間フィルムにさらされ
たとき、生長組織においてＥＧＭ２およびＥＧ１の弱い発現がみられた。ＥＧＭ
３遺伝子は生長組織において特に発現した。花において、ＥＧＭ２遺伝子は雄芯
および花片に発現するのが観察された。ＥＧＭ３遺伝子は花床、花片、雄芯、心
皮および花柱で発現する。
実施例１０
カスケードの第１部分(因子１)は、lacオペレータ(ＬＥＡＦＹ−op)を有する
花分裂組織同定遺伝子プロモータ(すなわちArabidopsis thalianaからのＬＥＡ
ＦＹ)のコントロール下にレポータＧＵＳ遺伝子を含む。第２構成体(因子２)は
、トウモロコシＧＳＴ−２７遺伝子プロモータのコントロール下にレセプターla
clqを含む。このプロモータは、セーフナーであるジクロルミドおよびＲ−２９
１４８で植物を処理することにより上方調節される。Arabidopsis植物は２因子
で共形質転換された。
他の戦略は、交差すべき因子１および２を別個に保持するArabidopsisライン
ついてである。因子１からのみの発現がＸ−ガルで着色後に青い花を生産する。
因子２からの発現の因子１を発現する植物への化学的導入は、花に見られる青色
を消失せしめる。
実施例１１
カスケードの第１因子１は、lacオペレータを有する花分裂組織同定遺伝子プ
ロモータ(すなわち、Arabidopsis thalianaからのＬＥＡＦＹ)のコントロール
の下にバルナーゼ遺伝子を含む。第２因子はトウモロコシＧＳＴ−２７遺伝子プ
ロモータのコントロールの下にレセプターlaclq遺伝子を含む。Arabidopsis植物
は２つの因子で共形質転換された。非誘導の植物において、唯一つの因子１の発
現が不毛のArabidopsis植物を産生する。因子１を発現する植物において因子２
からの発現の導入は、ＬＥＡＦＹ−opプロモータからの発現を停止し、最初は不
毛のArabidopsis植物において生殖能力を回復した。
実施例１２
下記において、いくつかの略号を用いる。これらは植物組織培養で普通に使用
されているものである。
ＢＡ：６−ベンジルアミノプリンとしても知られるベンジルアデニン
ＩＢＡ：インドール−３−酪酸
ＮＡＡ：１−ナフタレン酢酸
ＴＤＺ：１−フェニル−３−［１，２，３−チアジアゾール−５−イル］ウレア
としても知られるチジアズロン
下記は、形質転換ユーカリプタスをシュートおよび実生外植材から産生するた
めの好ましい工程について説明したものである。シュート外植体
１．０.２ｍＭのＢＡ含有の固形ＫＧ培地に月毎にシュートを継体培養する。弱
光（１６時間照射、１００−３５０Luxまたは１−８mmolm-2ｓ-1ＰＡＲ）および
２２５℃。
２．継体培養３−４週後の全シュートを使用する。
３．上部４−６葉を残し、下部葉を除去する。
４．針（例えば２５Ｇ）で５−６回葉を傷つけ、１０−１００mＭアセトシリン
ゴン含有のアグロバクテリウム懸濁液（約１×１０8cfu−ml）に１０分−２時間
全シュートを入れる。６００nm希釈１／２０で光学濃度１.０のアグロバクテリ
ウム懸濁液は約１×１０8cfu mＬ-1である。葉の基部を傷つけたときに最もより
結果が得られる。別法として、アグロバクテリウム懸濁液中に傷つけたシュート
を１時間残す代わりに、４０−１００Ｋpaで１０−３０分間、アグロバクテリウ
ムでシュートを真空浸潤することができる。シュートは真空浸潤のために傷つけ
ることを要しない。しかし、真空浸潤よりも針で傷つけたときの方がカル
ス形成が大きくなる。
５．無菌濾紙の間でシュートを乾かし、０.２mＭ ＢＡ含有のＫＧ培地に垂直に
シュートを挿入する。暗闇で２日間共培養する。
６．０.２mＭ ＢＡおよび２００mgＬ-1セフォタキシム含有のＫＧ培地にシュー
トを（垂直のまま）移す。弱い光で５日間保つ（照射１６時間、１００−３５０
Ｌuxまたは１−８mmolm-2s-1ＰＡＲ）。
７．４−６の上部葉を採取し、２mＭ ＢＡ、２．５mＭ ＮＡＡ、２００mgＬ-1
セフォタキシムおよび５−１０ｍｇＬ-1ゲネティシン含有の固形カルス誘導培地
上に、向軸面を上にして、これらの葉を植える。
８．２mＭ ＢＡ、２.５mＭ ＮＡＡ、１.０mＭ ＴＤＺ、２００mgＬ-1セフォ
タキシムおよび１５mgＬ-1ゲネティシン含有のＧ２２培地に外植体を移す。暗闇
で毎２週間継代培養する。光中でインキュベートすると褐色のフェノール性の化
合物を産生する。
９．６週間後に、２００mgＬ-1セフォタキシムおよび１５mgＬ-1ゲネティシン含
有のシュート誘導培地ＧＢＡ（すなわち５mＭ ＢＡおよび０．５mＭ ＮＡＡ含
有Ｇ２２）に外植体を移す。暗闇で５−６日間置き、次いで光中（１６時間照射
、１００−３５０Ｌｕｘまたは１−８mmolm-2s-1ＰＡＲ）に入れる。毎２週間継
代培養を行う。
１０．２００mgＬ-1セフォタキシムおよび１５mgＬ-1ゲネティシンのＧＢＡ上に
８−１０週間置いた後、２００mgＬ-1セフォタキシムおよび３０mgＬ-1ゲネティ
シンのＧＢＡに、つぼみを有するカルス片および元の外植体上に形成したカルス
を移す。
１１．この培地上に４−６週間置いた後、０．０１mＭ ＢＡ、５０mgＬ-1セフ
ォタキシムおよび５mgＬ-1ゲネティシン含有の液体ＫＧ培地で２週間シュートを
再生し、次いで高ゲネティシン（１０mgＬ-1）の培地に２−４週間移す。液体培
養基を７０ml容器中で液体８mlと共に１００−１２０rpmで振盪する。
１２．固形培地（２００mgＬ-1セフォタキシムおよび１０mgＬ-1ゲネティシン含
有で、ホルモンのないＫＧ）および強い光環境（１６時間照射、４５０Ｌuxまた
は１０mmolm-2s-1ＰＡＲ）に生存のシュートおよびカルスを移す。毎２週間
継代培養する。
１３．マーカー遺伝子活性のために推定の形質転換シュートを検定する。
１４．確認した正のシュート材から植物を再生さす。１０mgＬ-1ゲネティシン含
有でホルモンのないＫＧ上にシュートを移すことによって根付きを誘導する。し
かし、３週間後に根付きがなければ、ＩＢＡ０.２mgＬ-1（９.８mＭ）含有の同
じ培地に移す。
以上詳記した方法は、形質転換から再生シュートまで１−８月間行う。実生外植体
１．種子を消毒し、０.２mＭ ＢＡ含有のＫＧ上に発芽させる。
２．１０−１２日経た実生を用い、根を採取し、５０mＭアセトシリンゴン含有
の一夜生育アグロバクテリウム懸濁液（約１×１０8cfu ml）に入れる。６００n
m希釈１／２０で光学濃度１.０を有するアグロバクテリウム懸濁液は約１×１０8
cfu mＬ-1である。顕微鏡下で３０ゲージシリンジ針をゆるやかに突き刺して、
子葉と胚軸を傷つける。１時間インキュベートし、懸濁液から実生を採取し、過
剰の液体を除くために実生を滅菌濾紙間で乾燥する。１時間アグロバクテリウム
懸濁液中に傷つけた子葉を放置する代わりに、２０分間９５ＫＰａ（２８mgＨg
）でアグロバクテリウムでもって子葉を真空浸潤することができる。真空浸潤法
では子葉を傷つけることを要しない。しかし、胚軸は真空浸潤するときでも傷つ
けることを要する。
３．暗闇で２日間ＫＧ培地（０.２mＭ ＢＡ含有）上で共培養する。培地で実生
が直立しているように注意する。
４．２００mgＬ-1セフォタキシム含有のＫＧ培地（０.２mＭ ＢＡ含有）に実生
を移す。５日間弱い光（１６時間照射、１００−３５０Ｌuxまたは１−８mmolm- 2
s-1ＰＡＲ）でインキュベーションを続ける。
５．子葉および胚軸を切除する。０．５mＭ ＢＡ、１．０mＭ ＮＡＡ、１．０
mＭＴＤＺ、２００mgＬ-1セフォタキシムおよび１０mgＬ-1ゲネティシン含有の
カルス誘導培地に胚軸を移す。１．０mＭ ＢＡ、１．０mＭ ＮＡＡ、０.３mＭ
ＴＤＺ、２００mgＬ-1セフォタキシムおよび１０mgＬ-1ゲネティシン含有のＧ
２２培地に子葉を移す。２週間暗闇でインキュベーションを続ける。
６．１５mgＬ-1ゲネティシンおよび２００mgＬ-1セフォタキシム含有の同じ培地
に外植体を移す。暗闇でのインキュベーションを続ける。約６週間経過まで毎２
週間継代培養する。
７．６週間後、１５mgＬ-1ゲネティシン含有のシュート誘導培地ＧＢＡ（すなわ
ち５ｍｇＭ ＢＡおよび０.５mＭ ＮＡＡ含有のＧ２２）に移す。５−７日間暗
闇で培養物を放置し、次いで光環境（１６時間照射、１００−３５０Ｌuxまたは
１−８mmolm-2s-1ＰＡＲ）に移す。
８．１５mgＬ-1ゲネティシンおよび２００mgＬ-1セフォタキシムのＧＢＡ上に約
１０週間置くと、多くの外植体がシュートを産生する。これらのシュートを採取
し、３０mgＬ-1ゲネティシンおよび２００mgＬ-1セフォタキシムのＫＧ培地（０
.２mＭ ＢＡ含有）に移す。元の外植体上に形成したカルスを１５mgＬ-1ネティ
シンおよび２００mgＬ-1セフォタキシムのＧＢＡに戻して継代培養し、１カ月置
くと、さらにシュートが発生し、３０mgＬ-1ゲネティシンおよび２００mgＬ-1セ
フォタキシムのＫＧ培地（０．２mＭ ＢＡ含有）に移す。
９．３０mgＬ-1ゲネティシンおよび２００mgＬ-1セフォタキシムの新しいＫＧ培
地（０.２mＭ ＢＡ含有）にさらに１カ月間すべてのシュートおよびカルスを移
す。
１０．この培地で４−６週間後、０．０１Ｍ ＢＡ、５０mgＬ-1セフォタキシム
および５mgＬ-1ゲネティシン含有の液体ＫＧ培地に２週間再生シュートを入れ、
高度のゲネティシン（１０mgＬ-1）の培地に２−４週間移す。
１１．固形培地（２００mgＬ-1セフォタキシムおよび１０mgＬ-1ゲネティシン含
有、しかしホルモンのないＫＧ）、高い光学環境（１６時間照射、４５０Ｌuxま
たは１０mmolm-2s-1ＰＡＲ）に生存のシュートおよびカルスを移す。毎２週間継
代培養する。
１２．マーカー遺伝子活性のために推定形質転換シュートを検定する。
１３．確認した正のシュート材から植物を再生さす。１０mgＬ-1ゲネティシン含
有でホルモンのないＫＧ上にシュートを移すことによって根付きを誘導する。し
かし、３週間後に根付きがなければ、ＩＢＡ０.２mgＬ-1（９.８mＭ）含有の同
じ培地に移す。
１２日またはそれ以下の実生が形質転換に最適であるが、２０日までの実生は
再生に用いることができる。
選択なしで非形質転換の子葉および胚軸外葉体のシュート再生率は約８０％で
ある。
培地からのセフォタキシムの除去は、３カ月後においてさえ、アグロバクテリ
ウムの急速な過生長をもたらすであろうことを経験は教える。セフォタキシムの
濃度は液体と固形培地とで変化する。
シュート材は、液体培地で急速に生長し、固形培地での生長に比して、多くの
シュートを形成した。
この液体選択工程は、選択圧を増すことにより偽のポジティブを減少し、残渣
のアグロバクテリウムを減少し、そして固形生長培地に比してシュート組織の量
を増大するという利点を有する。
再生の根付き形質転換植物は、土を基にする培地に移され、ある大きさの木に
生長し、植樹に適した形となる。
本研究で用いた培地はLaine and David（1994）に記述されているＧ２２、Ｇ
ＢＡおよびＫＧである。しかし、ＭＳ、Ｂ５およびＰ２４を含む種々の基本的培
地が試され、シュート再生を支持することが分かった。植物生長レギュレは、La
ine and David（1994）のものと一般的に相違し、葉からのカルス誘導について
は１−３mＭ ＢＡ、０.０５−２mＭ ＴＤＺおよび０．５−２.５mＭ ＮＡＡ
、子葉については１−３mＭ ＢＡ、０.０５−１mＭ ＴＤＺおよび０.５−２.
５ｍＭ ＮＡＡ、胚軸について１−３mＭ ＢＡ、０.０５−２mＭ ＴＤＺおよ
び０.５−２.５mＭ ＮＡＡの併用であった。分化培地は一般的にＧＢＡ培地で
あり、これはＧ２２であるが、２.５−５mＭ ＢＡおよび０.５ｍＭ ＮＡＡ（L
aine and David，1994）が補充されていた。０.２ｍＭ ＢＡ含有のＫＧ培地は
一般的にクローン材のサブ培養培地として用いられる。すべての培地０.２５％G
e1rite または Phytage1で固形化された。１５分間１２１Ｃでオートクレーブに
かける前に、ｐＨは水酸化カリウムを用いて５.７−５.８に調製された。アグロ
バクテリウム接種物の好ましい製法について下記する。
１．選択して構成体含有のアグロバクテリウム株を植物上に線状に置く、例えば
pＢin ＧＵＳＩＮＴ構造体を含むＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０５およびＡＧＬ
１についてＹＥＰ＋リファンピシン（５０mg／Ｌ）＋カナマイシン（１００mg／
Ｌ）。
２．２８０Ｃで２日間プレートをインキュベートする。
３．選択して単一コロニーをＹＥＰブロスにとりあげ、２８ＯＣで一夜シェーカ
上で生長さす。
４．一夜培養物を用い、選択して新鮮な培地に接種し（１％接種物）２８０Ｃで
一夜シェーカで生長さす。この追加の工程は植物形質転換により持続的な接種を
産生する。
５．アグロバクテリウムを採取し、水洗し、組織培養培地に再懸濁する。形質転
換に適した濃度にまで希釈する。
６．再懸濁アグロバクテリウムをラクトース酵母培地プレート上に線状に植え付
け、２８０Ｃで２日間プレートをインキュベートする。コロニーについてＢened
ict試験（Bernaerts and Deley，1963）を行い、アグロバクテリウムであること
を確認する。
この方法は、形質転換の日にアグロバクテリウムの優れた濃い培養物をもたら
すであろう。
プレートまたはグリセロール・ストックからインキュベートした一夜生長培養
物は種々の結果をもたらすであろう。
上記のように生長させ、かつ光学濃度（６００nm）０.９８まで希釈したＡＧ
Ｌ１培養物は、変化値２.３７×１０9cfu／mlを有する。
上記は本発明の説明のためになされたものであって、それについてのすべての
他の修飾および変更が当業者にとって、請求の範囲による本発明の範囲および域
内にあるべきことは、申すまでもなく理解されるであろう。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ
Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ
，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ
，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，
ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ
Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ
，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，
ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ
Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ
，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，
ＶＮ，ＹＵ
(72)発明者 サザートン，サイモン・ジョージ
オーストラリア4520クイーンズランド州
サムフォード、キャッスルウッド・コート
１番
(72)発明者 ソーブリッジ，ティモシー・アイバー
オーストラリア4067クイーンズランド州
セント・ルシア、カーモディ・ロード142
番、ユニット１
【要約の続き】
させるために使用される。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．細胞を、真核的活性遺伝子またはその生産物を調節するモジュレータ遺伝 子生産物および当該モジュレータ遺伝子またはその生産物を調節する更なる遺伝 子生産物を発現する構築体で形質転換すること、および上記二つの遺伝子である モジュレータ遺伝子および更なる遺伝子のプロモータが同じまたは相補的組織に 対する誘導プロモータおよび発生プロモータから選択されたものであることを特 徴とする、真核活性遺伝子を調節する方法。 ２．真核的活性遺伝子が、天然遺伝子ないし関連有機体または誘導遺伝子から 選択されたものである、請求項１記載の真核活性遺伝子を調節する方法。 ３．真核的活性遺伝子が、合成経路に対する活性ポリペプチド、酵素または可 能な遺伝子生産物から選択された発現生産物をコードするものである、請求項１ 記載の真核活性遺伝子を調節する方法。 ４．合成経路が、色素および染料の生産のために選択されたものである、請求 項３記載の真核活性遺伝子を調節する方法。 ５．当該染料がアントシアニンのようなものである、請求項４記載の真核活性 遺伝子を調節する方法。 ６．合成経路が、殺虫性化合物の生産のために選択されたものである、請求項 ４記載の真核活性遺伝子を調節する方法。 ７．殺虫性化合物が、ブチトキシン（Bti toxin）である、請求項６記載の真 核活性遺伝子を調節する方法。 ８．酵素が、標的組織に対して致死的効果を有するリボヌクレアーゼおよび根 組織に対してネマトード抵抗を与えるパーオキシダーゼから選択されたものであ る、請求項３記載の真核活性遺伝子を調節する方法。 ９．リボヌクレアーゼ遺伝子が、バチルス・アミロリクエファシエンス （B.amyloliquefaciens）からのバルナーゼ（Barnase）のそれである、請求項８ 記載の真核活性遺伝子を調節する方法。 １０．遺伝子が、発生の初期段階で植物生殖器官の雄部および雌部で発現され る遺伝子のプロモータ配列のコントロール下、バチルス・アミロリクエファシエ ンスからのバルナーゼのコード領域を含むように構成されている、請求項９記載 の真核活性遺伝子を調節する方法。 １１．真核的活性遺伝子が、ユーカリプタス・グランデイス（Eucalyptus grandis）におけるＥＧＭＬ１、および２のユーカリプト遺伝子に対するプロモ ータから選択されたプロモータと共に構成されている、上記請求項のいずれかに 記載の真核活性遺伝子を調節する方法。 １２．真核的活性遺伝子が、ピヌス・ラヂアータ（Pinus radiata）における ＰｒＭＡＤＳＬ１、２および３のパイン遺伝子に対するプロモータから選択され たプロモータと共に構成されている、請求項１〜１０のいずれかに記載の真核活 性遺伝子を調節する方法。 １３．真核的活性な遺伝子、モジュレータ遺伝子および更なる遺伝子ならびに それらのプロモータが標的有機体を形質転換させる形質転換カセットを含み得る ものである、上記請求項のいずれかに記載の真核活性遺伝子を調節する方法。 １４．真核的活性遺伝子が、発生プロモータによってプロモートされ、当該モ ジュレータ遺伝子のプロモータが構成的なものである、請求項１３記載の真核活 性遺伝子を調節する方法。 １５．真核的活性遺伝子に対するプロモータが組織特異性であり、構成的にプ ロモートされたインヒビター遺伝子生産物によって阻害され、従って誘導的にプ ロモートされた更なる遺伝子生産物によってコントロールされる、請求項１３記 載の真核活性遺伝子を調節する方法。 １６．真核的活性遺伝子生産物が組織特異性プロモータのコントロール下に発 現されるモジュレータ遺伝子のモジュレータ効果により構成的に発現され、当該 モジュレータ遺伝子または生産物はそれ自体異なったまたは相補的組織に対して 特異的なプロモータのコントロール下に更なる遺伝子の発現によってコントロー ルされる、請求項１３記載の真核活性遺伝子を調節する方法。 １７．細胞を、真核的活性遺伝子、当該真核的活性遺伝子またはその生産物を 調節する物質を発現するモジュレータ遺伝子および当該モジュレータ遺伝子また はその生産物を調節する物質を発現する更なる遺伝子を含む形質転換カセットで 形質転換すること、および上記二つの遺伝子であるモジュレータ遺伝子および更 なる遺伝子のプロモータが同じまたは相補的組織に対する誘導プロモータおよび 発生プロモータから選択されたものであることを特徴とする、真核活性遺伝子の 発現を調節する方法。 １８．増殖性真核細胞を、次のものを含む発現カセットで形質転換する方法： 標的組織に対して本質的に特異的なプロモータのコントロール下に、当該標的 組織中の細胞毒性ペプチドを発現する、致死的遺伝子； 上記細胞毒性ペプチドの産生または活性の阻害剤を構成的に発現する、モジュ レータ遺伝子；および 上記本質的に特異的なプロモータのコントロール下にあり、上記阻害剤または モジュレータ遺伝子を阻止するように機能する、更なる遺伝子。 １９．真核活性遺伝子が、バチルス・アミロリクエファシエンス抽出物からの バルナーゼ遺伝子およびバルスター遺伝子から選択されるものであり、Ｐ１およ びＰ２（バルスターに対して）並びにＢ３およびＢ４（バルナーゼに対して）と して定義され、次の配列を含むプライマーにより、ＰＣＲによって単離される、 請求項１〜１６のいずれかに記載の真核活性遺伝子を調節する方法： ２０．真核活性遺伝子が、致死的遺伝子発現生産物の細胞毒効果が構成体に局 在化シグナル配列をカップリングさせることにより増強されている致死的遺伝子 である、請求項１〜１６のいずれかに記載の真核活性遺伝子を調節する方法。 ２１．真核活性遺伝子が、リボヌクレアーゼ（Rnase）遺伝子に核局在化シグ ナル（ＮＬＳ）配列を融合させることにより核を標的としたリボヌクレアーゼを コードするものである、請求項２０記載の真核活性遺伝子を調節する方法。 ２２．遺伝子がバルナーゼ遺伝子であり、融合がＰＣＲによって行われ、 A.tumefaciensのVirD2遺伝子からのＮＬＳ配列をＢ遺伝子に融合させるためのＰ ＣＲプライマーのセットが使用され、かつ次の配列を含むものである、請求項２ １記載の真核活性遺伝子を調節する方法： ２３．リプレッサー遺伝子およびインヒビター遺伝子が特異的なリプレッサー ／インヒビターカップルを形成するのに適したものである、請求項１〜２２のい ずれかに記載の真核活性遺伝子を調節する方法。 ２４．リプレッサー／インヒビターカップルが、真核活性遺伝子構成体と同じ プロモータのコントロール下に大腸菌laclq遺伝子を含み、lacオペレータ配列の 挿入によって修飾したリプレッサー遺伝子プロモータの作用を抑制するために使 用される、請求項１〜２２のいずれかに記載の真核活性遺伝子を調節する方法。 ２５．リプレッサー遺伝子プロモータが、プロモータとリプレッサーのコード 領域の間に少なくとも１個のlacオペレータを有する修飾３５Ｓ−ＲＮＡ−Ｃａ ＭＶプロモータである、請求項２４に記載の真核活性遺伝子を調節する方法。 ２６．修飾３５Ｓ−ＲＮＡ−ＣａＭＶ配列が、次の配列を有するプライマー３ ５Ｓ１および３５Ｓ２を使用するＰＣＲによって増幅される、請求項２５記載の 真核活性遺伝子を調節する方法： ２７．修飾３５Ｓ−ＲＮＡ−ＣａＭＶ配列が、修飾３５Ｓプロモータの３’と ５’領域の間にlacオペレータを導入するために次の配列を有するプライマーＯ Ｐ１および３５Ｓ２を使用するＰＣＲによって増幅される、請求項２５記載の真 核活性遺伝子を調節する方法： ２８．laclq遺伝子が、当該遺伝子の５’と３’末端に対応する、次の配列を 有する二つのプライマーＡＭ１およびＡＭ２を使用して、植物ベクター中にクロ ーニングするための酵素開裂部位をもって単離される、請求項２４記載の真核活 性遺伝子を調節する方法： ２９．laclq遺伝子の３’末端が、次のＰＣＲプライマーのセットにより、Ｎ ＬＳ配列に融合される、請求項２８記載の真核活性遺伝子を調節する方法： ３０．真核活性遺伝子、当該真核活性遺伝子またはその生産物を調節する物質 を発現するモジュレータ遺伝子および当該モジュレータ遺伝子またはその生産物 を調節する物質を発現する更なる遺伝子を有し、上記二つの遺伝子であるモジュ レータ遺伝子および更なる遺伝子のプロモータが同じまたは相補的組織に対する 誘導プロモータおよび発生プロモータから選択されるものである、形質転換カセ ット。 ３１．標的組織に対して本質的に特異的な誘導プロモータのコントロール下に 当該標的組織に対して細胞毒性を示すペプチドを発現する遺伝子、上記細胞毒性 ペプチドの生産または活性の阻害剤を発現する阻害剤遺伝子および上記誘導プロ モータのコントロール下にあり、上記阻害剤または阻害剤遺伝子を阻止するよう に機能するリプレッサー遺伝子を含む、発現カセット。
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