JP2000504590A

JP2000504590A - タンパク質の製造、同タンパク質をコードするプラスミド及びこのようなプラスミドを含有する生物

Info

Publication number: JP2000504590A
Application number: JP09529890A
Authority: JP
Inventors: ダチャーズ，マシュー・ガイ; トッピング，アンドリュー・ウィリアム
Original assignee: ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1996-02-22
Filing date: 1997-02-20
Publication date: 2000-04-18
Also published as: AU1884997A; US6136567A; GB9603803D0; WO1997031118A1; DE69739263D1; ATE423211T1; EP0889965B1; ZA971477B; DK0889965T3; EP0889965A1; CA2247162A1

Abstract

(57)【要約】（１）複製起点と；（２）プラスミド複製のために必要な付加的な配列及び／又は好ましくは、選択有利性を与える遺伝子と；（３）それぞれが（１）と（２）の間に配置されるが、（１）と（２）によって相互から分離されている２つの発現カセットとを含み、逆方向反復配列を含まない（（３）における以外には）プラスミドは、それらを含む微生物の継代発生を通して高度に耐久性である。

Description

【発明の詳細な説明】タンパク質の製造、同タンパク質をコードするプラスミド及びこのようなプラスミドを含有する生物本発明は、タンパク質の製造、同タンパク質をコードするプラスミド及びこのようなプラスミドを含有する生物(organism)に関する。所望のタンパク質をコードするプラスミドを微生物に組み入れることによって、さもなくば所望のタンパク質を産生しないか又は充分な量で産生しない微生物を、所望のタンパク質、例えば酵素を産生するように修飾することは知られている。しかし、生物の長期間の培養時にプラスミドが失われる傾向がある。このことの少なくとも一部の原因は、微生物の各分裂時に、前記プラスミドを含まず、その結果として所望のプラスミドを含む娘細胞よりも選択有利性にある少数の娘細胞が生成されることによると考えられる。時が経つうちに、所望のプラスミドを含まない細胞が、存在する細胞全体の割合として増加する。この効果を克服するために、微生物に選択有利性を与える１種以上の遺伝子をプラスミド中に組み入れることが知られており、例えば、微生物が抗生物質の存在下で培養される場合には、抗生物質に対する耐性を与える遺伝子が適切であり、或いは、宿主生物における欠損(deficiency)を補う遺伝子を組み入れることができる。また、例えば、遺伝子中に停止コドンの導入又はタンパク質コーディング配列の部分的若しくは完全な欠失を生じる変異によって、所望のタンパク質を産生しないプラスミドの変異体が生成される傾向もある。このような変異プラスミドを含有する微生物は最初のプラスミドを有する微生物に比べて選択有利性を有する傾向があり、微生物の所望のタンパク質産生能力は長期間の培養時に低下するか又は失われる可能性がある。ＤＤＲ特許第２３３，８５１Ａ１号では、配列が反対のセンスで二重に存在して（逆方向反復配列）、それらの各々の配列に重複遺伝子がクローン化又は再クローン化されるベクタープラスミドが開示されている。これは遺伝子量効果のために微生物における遺伝子産物の合成増加を生じるといわれる。逆方向反復配列はそれぞれ少なくとも１つの相同な切断部位を有さなければならず、そこに重複遺伝子が挿入されると考えられる。安定なプラスミドが作製可能であると開示されている。意外にも、逆方向反復配列を有さないベクターから、ある一定の場合に、安定なプラスミドを作製することができることを、今回我々は発見した。これは重要な利点を有する。第一に、これは相同な切断部位の数を減ずるか又は排除するので、プラスミドを切断して所望の遺伝子を挿入するためにプラスミドを切断するプロセスにおいてプラスミドを無効なフラグメントに切断する傾向を減ずるか又は排除する。ＤＤＲ第２３３，８５１Ａ１号の各逆方向配列が少なくとも１つの切断部位を有さなければならず、これらの切断部位が相同であることは明らかである。通常、ベクタープラスミドは両方のこのような部位で切断される。このことは逆方向配列の両方に正確に挿入された所望の遺伝子を有するプラスミドを構築することの困難さを高める。例えば、自由末端が単一の添加遺伝子と結合して、このような遺伝子の１個のみを有するプラスミドを残す。さらに、無機能核酸フラグメントが形成される。逆方向配列における切断部位の数が多ければ多いほど、この問題は大きくなる。第二に、これは、プラスミドの切断を生じる可能性があるプラスミド間及びプラスミド内組換えの危険性を減ずる。所望の遺伝子に隣接する不必要なＤＮＡの存在はその遺伝子の一部又は全ての欠損を生じる組換えが生ずる可能性を高める。さらに、異なるプラスミド分子（コピー）中の逆方向反復配列の間の組換えが不安定な多量体プラスミドの形成を生じる可能性がある。 “発現カセット”、プロモーター配列とリボソーム結合部位、タンパク質をコードする遺伝子及び通常は終止配列を含む、タンパク質の産生に有効なＤＮＡ配列を意味する。この遺伝子は融合タンパク質をコードすることができ、シグナル配列を有することができる。第三に、これは小さいプラスミドの作製を可能にする。本発明によると１０ｋＢ以下、例えば６ｋＢ以下、さらに例えば５ｋＢ以下のプラスミド（所望の発現カセットを除いて）を用いることができることを、我々は発見している。このような各プラスミドは、大きいプラスミドに比べて、宿主生物に負わせる負担が小さい。これらはまた通常、大きいプラスミドよりも高いコピー数、例えば、５０〜３００プラスミド／宿主細胞又は３００を越えるプラスミド／宿主細胞さえも有し、一般に、所望のタンパク質の生産量(output)を改良する。第四に、逆方向反復配列自体がタンパク質をコードするので、宿主に付加的な負担を負わせて、所望の産物の分離を複雑にする。本発明は、プラスミド又はこのようなプラスミドの遺伝子によって発現されるポリペプチドを含有する生物であって、プラスミドが複製起点と、プラスミド複製のために必要な付加的な配列及び／又は好ましくは、微生物に選択有利性を与える遺伝子と、２つの発現カセットとを含み、各発現カセットは開始配列 (originating sequence)と選択有利性を与える遺伝子又はプラスミド複製のために必要な付加的な配列との間に配置されたＤＮＡ配列中に存在するが、片側では複製起点を含むＤＮＡによって、他の側では選択有利性を与える遺伝子若しくはプラスミド複製のために必要な配列を含むＤＮＡによって相互から分離されており、このプラスミドは発現カセットによって表される配列以外には逆方向反復配列を実質的に含まない生物を生成するための連続方法を含む。必要な場合には、付加的な発現カセットを含めることができる。発現カセットは異なるものでもよいが、同じものであることが好ましい。せいぜい１個の抗生物質耐性遺伝子が存在することが好ましい。好ましくは、これらの発現カセットは同じタンパク質をコードするか又は触媒目的のために共に用いられる酵素であるタンパク質をコードし、それによって生物若しくはそれに由来する物質が、このような酵素の両方を含む、触媒として若しくは触媒の成分として有用である。 “連続プロセス”とは、新鮮な栄養素が加えられ、産物が発酵を中断することなく連続的に又は間欠的に取り出されるプロセスを意味する。連続プロセスを操作する前に、培養培地の単位量あたりの生物の適当な濃度に達することが必要である。発酵器に所望の生物を接種し、それを所望の濃度に達するまで増殖させることによって、この状態に達することが通常であり、このときまでサンプリングのため以外には産物は通常取り出されない。これが達成された後に、少なくとも５世代、好ましくは少なくとも１０世代、より好ましくは少なくとも５０世代の生物が生成されることが望ましい。適切には、生物の総タンパク質含量に基づいて５重量％、好ましくは１０重量％、より好ましくは少なくとも１５重量％の所望のタンパク質の生産量が産生される。本発明はまた、複製起点と、プラスミド複製のために必要な付加的な配列及び／又は好ましくは、微生物に選択有利性を与える遺伝子と、２つの発現カセットとを含むプラスミドであって、発現カセットが、触媒目的のために用いられる酵素でありかつ好ましくは同じである、同じポリペプチド若しくは異なるポリペプチドを発現し、各々が複製起点と選択有利性を与える遺伝子又はプラスミド複製のために必要な付加的な配列との間に配置されたＤＮＡ配列中に存在するが、片側では複製起点を含むＤＮＡによって、他の側では選択有利性を与える遺伝子若しくはプラスミド複製のために必要な配列を含むＤＮＡによって相互から分離されでいるプラスミドを含み、このプラスミドは発現カセットによって表される配列以外には逆方向反復配列を実質的に含まない。選択有利性を与える第２遺伝子を所望の場合には存在させることができ、付加的な発現カセット（単数又は複数）としても存在することができる。２つの発現カセットからのＤＮＡの相同な配列の間で組換えが生じて、介在配列の欠失を招来する場合に、必然的にその配列は複製起点若しくは、プラスミド複製のために必要な配列を含むか（この場合には、プラスミドはもはや複製しない）、又は選択有利性を与える遺伝子を含むことになり、この場合にはプラスミドは選択によって失われる傾向があることは明らかであろう。しかし、このような損失は、遺伝子の他に逆方向反復配列を有するプラスミドにおいて生じる損失よりも少ないであろう。意外にも、発現カセットが共に密接しており、例えば５ｋＢ以下、好ましくは２ｋＢ以下だけ分離されている（それらの最も接近した点の分離によって判定して）プラスミドの場合には、カセットの一方が欠失したとしても、得られるプラスミドは選択不利性の状態であるので、両方の活性カセットを有するプラスミドを含有する微生物は、両方のカセットの同時不活化が生じるまで優勢であり続けることを、我々は発見している。本発明の他の態様では、所望のタンパク質を産生するための遺伝子がプラスミド中に反対のセンスで読まれるように配置されている、即ち、一方が時計回りと見なされるならば、他方は反時計回りである。このことは、“ヘッド対ヘッド（ head-to-head）”又は“テール対テール(tail-to-tail)”関係でそれらの間にできるだけＤＮＡを含まずに、特に遣伝子が共に接近する場合に、相同な配列が接触することを困難にする。本発明はまた、本発明によるプラスミドを含有する微生物と、このようなプラスミド及び／又は微生物を用いて所望のタンパク質を産生する方法をも含む。例えば、タンパク質は必要な場合には精製された形でそれらから分離することができる。本発明はまた、プラスミドを第１制限部位で切断して、所望の発現カセットを第１制限部位に挿入して、修飾プラスミドを形成し、この修飾プラスミドを第１制限部位と相同でない第２制限部位で切断して、所望の発現カセットを第２制限部位に挿入する方法であって、第１制限部位と第２制限部位とが片側では複製起点を含む配列によって分離され、第１制限部位と第２制限部位とが他方の側で宿主生物に選択有利性を与える遺伝子を含む配列又はプラスミド複製のために必要な配列によって分離されないならば、このような遺伝子がその側に挿入され、プラスミドは発現カセットによって表される配列以外には逆方向反復配列を実質的に含まない上記方法を含む。宿主は組換え欠損(recombinational deficiency)を有することが好ましい。この欠損は組換え遺伝子、例えばｒｅｃＡ又は好ましくはｒｅｃＪ遺伝子の無機能性又は欠失の結果であると考えられる。連続培養におけるキシラナーゼ発現プラスミドの安定性増強プラスミドｐＳＰＲ６（図１参照）（ブタペスト条約下で１９９６年２月８日に、ＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅｒｉａＬｉｍｉｔｅｄ（２３ＳｔＭａｃｈａｒＤｒｉｖｅ、ＡｂｅｒｄｅｅｎＡＢ２１ＲＹＳｃｏｔｌａｎｄＵＫ）に寄託された、大腸菌ＮＭ５５４宿主ＮＣＩＭＢ４０７８６中）は、プラスミド複製起点（ｏｒｉ）のいずれかの側及びテトラサイクリン耐性マーカーｔｅｔＡ／Ｒのいずれかの側に位置している特有のＮｏｔＩとＳｐｅＩ制限部位を含有する。このプラスミドは発酵中のプラスミドの遺伝的安定性を改良するために発現カセットの２つの独立したコピーを挿入することを可能にする。この例では、発現カセットは、構成プロモーター（バクテリオファージＴ７からの遺伝子Ａ３プロモーター）と、リボソーム結合部位（大腸菌のｌａｃｚから）と、酵素のコーディング配列（ＷＯ９３／２５６９３に述べられているプラスミドｐＮＸ１０からの切頭キシラナーゼ遺伝子）と、バクテリオファージＴ４からの転写ターミネーターとを含む真菌キシラナーゼの発現をコードするＤＮＡであった。この発現カセットはＮｏｔＩ又はＳｐｅＩ制限部位のいずれかと隣接していた。この発現カセットは、高塩制限バッファー(high salt restriction b uffer)中で制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩ又はＳｐｅＩを用いて、大腸菌ＮＭ５５４（ブタペスト条約下で１９９６年２月８日に、ＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅｒｉａＬｉｍｉｔｅｄ（２３ＳｔＭａｃｈａｒＤｒｉｖｅ、ＡｂｅｒｄｅｅｎＡB２１ＲｙＳｃｏｔｌａｎｄＵＫ）に寄託されたＮＣＩＭＢ４０７８７）におけるプラスミドｐＳＰＲ８の完全な消化によって得ることができる。大腸菌ＮＭ５５４（ｐＳＰＲ８）菌株は次のように構築された：“ＲａｐｉｄＰｕｒｅＭｉｎｉｐｒｅｐ”（ＲＰＭ）（ＳｔｒａｔｅｃｈＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＬｔｄ．，Ｌｕｔｏｎ，ＵＫ）を用いて、製造者のプロトコールに従って、Ｌブロス（１％トリプトン、０．５％酵母抽出物、０．５％ＮａＣｌ）中で３７℃において一晩増殖させた大腸菌ＮＭ５５４（ｐＳＰＲ６）菌株からプラスミドＤＮＡを作製した。プラスミドＤＮＡは例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等¹が述べているような標準方法を用いて単離することもできる。５０μｌのプラスミドｐＳＰＲ６ＤＮＡを、６μｌの製造者Ｈバッファー（高塩制限バッファー）と２０単位の制限酵素の添加により制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｌｅｗｅｓ，ＵＫ）によって消化させた。消化は３７℃において１６時間おこなった。キシラナーゼ発現カセットをＮｏｔＩによって消化させ、同様にＮｏｔＩによって消化させたプラスミドｐＳＳＲ６に、次のようにライゲートさせた。２つの種のＤＮＡを混合し、制限酵素と他の汚染物とをＲＰＭミニプレップを用いて取り出した（製造者のプロトコールに従って、但し、下記修正を加えて：清澄ライセート (cleared lysate)の代わりにＤＮＡ混合物を使用し、ＤＮＡは４０μｌ中に溶出した）。０．５μｌの１００ｍＭアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を４μ ｌのＭバッファー（中塩制限バッファー）と共に加えた。１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を加え、反応を１８℃において１６時間インキュベートした。５μｌのライゲーション反応に、本質的にＭａｎａｈａｎ²が述べているような塩化カルシウム処理によって製造した、１０μｌの大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３３２３）コンピテント細胞懸濁液を混合して、氷上で４５分間インキュベートした。次に、細胞を４２℃において９０秒間熱ショックさせ、氷に２分間戻した。１ｍｌのＬブロスを加えて、細胞を振動させながら３７℃において１時間インキュベートしてから、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンと１％レマゾールブリリアントブルー−キシラン（ＲＢＢ−Ｘｙｌａｎ，Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）とを含有するＬ寒天プレート（Ｌブロス＋１％細菌学的寒天）上に希釈物(dilutions)をプレートアウト(plate out)した。プレートを３７℃において２４時間インキュベートした。ミニプレップＤＮＡをＮｏｔＩによって消化させたときに清澄帯(zone of clearing)を生じ、予想されたプラスミドを含有した１つのコロニーをＪＭＩ０９（ｐＳＰＲ７）と名付けた。図２に概略的に示すｐＳＰＲ７からのプラスミドＤＮＡは、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを補充したＬブロス中でのＪＭ１０９（ｐＳＰＲ７）の一晩培養から上述のように作製した。５０μｌのプラスミドＤＮＡを、５μｌの製造者Ｈバッファーと２０単位のＳｐｅＩ酵素の添加により制限エンドヌクレアーゼＳｐｅＩ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）による消化によって線状化させた (linearized)。この反応を３７℃において１６時間インキュベートした。プラスミド複製起点（ｏｒｉ）と選択可能なマーカー（ｔｅｔＡ／Ｒ）とに対するＮｏｔＩ隣接キシラナーゼ発現カセット（ＸＹＬ）の位置を示す。ＮｏｔＩではなくＳｐｅＩ制限部位に隣接する以外には第１キシラナーゼ発現カセットに同じである第２キシラナーゼ発現カセットを上述したようにＳｐｅＩによって消化させた。この発現カセットは、制限酵素ＳｐｅＩによるプラスミドｐＳＰＲ８の完全な消化によって得ることができる。このＤＮＡをＳｐｅＩ消化プラスミドｐＳＰＲ７に正確に上述したように、但し１０μｇ／ｍｌテトラサイクリン含有Ｌ寒天上で形質転換体を選択して、ライゲートさせた。テトラサイクリン耐性コロニーを迅速溶菌法（ＴｗｉｇｇとＳｈｅｒｒｅｔｔ³ ）を用いてスクリーニングして、保持されるプラスミドのサイズを推定した。プラスミドｐＳＰＲ７より大きいプラスミドを含有し、ＮｏｔＩ及びＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼによる、単離プラスミドＤＮＡのその後の消化物(digest) がキシラナーゼ発現カセットの２コピーを含有することを示した１コロニーをＪＭ１０９（ｐＳＰＲ８）と名付けた。プラスミド複製起点（ｏｒｉ）と選択可能なマーカー（ｔｅｔＡ／Ｒ）とに対する両方の挿入キシラナーゼ発現カセット（ＸＹＬ）の位置を示すプラスミドｐＳＰＲ８を示す図３を参照。ＪＭ１０９（ｐＳＰＲ８）とＪＭ１０９（ｐＳＰＲ７）とからプラスミドＤＮＡを作製して、１μｌを用いて、大腸菌ＮＭ５５４菌株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を形質転換させた。ＤＮＡ及びコンピテント細胞の作製と、ＤＮＡの形質転換とは上述したようにおこなった。形質転換体を１０ μｇ／ｍｌテトラサイクリン含有Ｌ寒天上で選択した。ＮＭ５５４（ｐＳＰＲ７）とＮＭ５５４（ｐＳＰＲ８）とのストックを、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンと２５％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有するＬ寒天中で−７０℃において貯蔵した。発酵接種原を作製するために、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する５０ｍｌのＬブロスにフリーザーストックからの５００μｌを接種し、３７℃において約４時間、迅速に通気しながら、増殖させてから、発酵器に移した。発酵はＢｒａｕｎＥＤ／ＥＲ５発酵器（Ｂ．ＢｒａｕｎＢｉｏｔｅｃｈ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＵＫ）を用いておこなった。発酵器はｉｎｓｉｔｕで滅菌して、底部を２ｘ７０ｍｍ直径Ｒｕｓｈｔｏｎインペラーを用いて撹拌した。発酵器の有効容積(working volume)は約２リットルであった。実験を通して用いた培地はＪＶ１であった（付録を参照のこと）。温度は３７℃±０．２℃に維持した。ｐＨはＩｎｇｏｌｄｐＨプローブを用いて測定して、フィルター滅菌した１０ＭＮＨ₄ＯＨと２ＭＨ₃ＰＯ₄との制御添加によって６．７±０．１に維持した。空気又は３５％Ｏ₂通気しながら、６００ｒｐｍの撹拌速度を用いて、％ｐＯ₂(溶解酸素圧(dissolved oxygen tension)）を、Ｉｎｇｏｌｄ酸素プローブによって測定される飽和の２０％〜８０％に維持した。滅菌ＤｉａｍｏｎｄＳｈａｍｒｏｃｋＰＰＧＦｏａｍａｓｔｅｒＥＥＡ１４２を０．１ｍｌ／時の速度で添加することによって、発泡を制御した。３０ｇ／ｌのグリセロールと１０ｐｐｍのＦｅ²⁺（ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏとして）とを加えた２リットルのＪＶ１培地を含有する発酵器に５０ｍｌの接種原を移した。培養物を回分式で、ＣＯ₂発生速度が１０〜４０ｍＭ／ｌ／時（典型的には、２０ｍＭＣＯ₂／ｌ／時）になる時点まで増殖させ、この時点において発酵器を０．１／時の希釈率での連続操作に切り換えた。ＪＶ１培地に滅菌グリセロール（供給速度３０ｇ／ｌ）とＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（供給速度１０ｍｇＦｅ²⁺ ／ｌ）との別々の供給量を供給した。１ｍｌのサンプルを規則的に取り出して、プラスミド含量を後で分析するために２５％グリセロール中に−２０℃で貯蔵した。酵素活性と細胞乾量(dry cell weight)も、１０ｍｌサンプル中で定期的に測定した。本質的にＫｅｌｌｅｔｔ等⁴が述べているように、溶解性オート麦スペルト(oat spelt)キシラン基質（１％）から放出される還元糖の量を測定することによって、キシラナーゼ酵素活性を判定した。キシラナーゼの産生と分子量とは、Ｐｈａｓｔ電気泳動系（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，ＳｔＡｌｂａｎｓ，ＵＫ）を用いた、クーマシーブルータンパク質染色による８〜２５％勾配ゲル上でのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって、確認した。細胞乾量はＢｅｃｋｍａｎＴＪ−６遠心機において５７００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって、取り出したサンプル中の細胞をペレット化し、２〜３ｍｌのＴｒｉｓバッファー（１００ｍＭ，ｐＨ７．２）中に細胞を再懸濁させることによって測定した。次に、細胞を再ペレット化し、予め秤量したチューブに入れてオーブン中で１０５℃ において１６時間乾燥させ、乾燥した細胞の質量を測定した。１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンと１％ＲＢＢ−Ｘｙｌａｎとを含有するＬ寒天上で貯蔵発酵サンプルをプレートすること(plating)によって、発酵中のプラスミドサイズの変化を検出した。次に、コロニーを取り出して(pick)、Ｔｗｉｇｇとｓｈｅｒｒｅｔｔ³が述べている方法を用いて、溶菌させた。プラスミドサイズの変化は、対照プラスミドと比べた、１％アガロースゲル上でのプラスミドのバンドの移動度(mobility)のシフトとして認められた（アガロースゲル電気泳動はＳａｍｂｒｏｏｋ等¹が述べているようにおこなった）。図４は、ＪＶ１培地中で増殖する大腸菌の菌株ＮＭ５５４（ｐＳＰＲ７）◇とＮＭ５５４（ｐＳＰＲ８）◆の発酵に対するキシラナーゼ活性（ＫＵ／ｍｌ）を示す。培養は回分式から希釈率０．１／時の連続培養に約１０時間目に切り換えた。これらの結果は、キシラナーゼ発現カセットの単一コピーを有するＮＭ５５４（ｐＳＰＲ７）菌株が連続培養中に非常に迅速に酵素活性を失うことを実証した。サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、酵素活性の喪失が異種(hetero- logous)タンパク質のバンドの形成の喪失に対応することを立証した。迅速溶菌法を用いたプラスミドの検査は、１９時間までに採取したサンプル中のｐＳＰＲ７対照に比べて、プラスミドサイズに差異がないことを示したが、５０時間と７２時間のサンプル点では、幾つかの異なるサイズのプラスミドを示して、このプラスミドでは再編成と欠失が生じて、酵素活性の喪失を生じたことを実証した。キシラナーゼ発現カセットの２コピーを含有するＮＭ５５４（ｐＳＰＲ８）菌株は４８０時間の連続培養中に高レベルのキシラナーゼ活性を産生した。ＳＤＳ −ＰＡＧＥは、この期間にわたる異種タンパク質の産生を立証した。発酵サンプルからのプラスミドの分析はこの実験の過程中にプラスミドサイズの検出可能な変化を示さず、再編成も欠失も生じなかったことを実証した。連続発酵を０．１／時の希釈率で操作したときに、ＮＭ５５４（ｐＳＰＲ７）のピークキシラナーゼ活性がＮＭ５５４（ｐＳＰＲ８）のピークキシラナーゼ活性よりも高いことが認められた。菌株安定性の観察された増強が酵素発現のこの初期減少によるものであるかどうかを調べるために、ＮＭ５５４（ｐＳＰＲ７）菌株を前記と同様に、但し０．２／時の希釈率で発酵させた。これはピークキシラナーゼ活性を、０．１／時の希釈率で操作したＮＭ５５４（ｐＳＰＲ８）菌株によって認められたレベルに匹敵するレベルにまで低下させる効果を有した。結果は、発現レベルの低下にも拘わらず、同じ不安定性を示した。プラスミド含量の分析は、前記で認められたものと同様なプラスミドサイズの変化を示した。連続培養におけるデハロゲナーゼ発現プラスミドの安定性増強本発明を第２タンパク質、ハロアルカン酸デハロゲナーゼの産生によってさらに例証した。この例では、宿主菌株、プロモーター、リボソーム結合部位、構造遺伝子及び発酵培地は全て、キシラナーゼ例に用いたものとは異なり、本発明の広範囲な適用性を実証した。プラスミドｐＳＰＲ６を、特有のＮｏｔＩ制限部位を除去して、同位置に特有のＰｓｔＩ制限部位を導入するように、修飾した。プラスミドｐＳＰＲ６ＤＮＡを単離して、ＮｏｔＩ制限酵素によって上述のように消化させた。約２μｇの配列ＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧを有する合成オリゴヌクレオチドを高塩制限バッファー中で９４℃に加熱し、室温に徐々に冷却することによって、自己アニーリングさせた(self-annealed)。アリーリングしたオリゴヌクレオチドと消化させたｐＳＰＲ６ＤＮＡとを混合し、ＡＴＰを１ｍＭの最終濃度まで加え、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加えた。反応を１８℃において一晩インキュベートした。ライゲーションミックスをＪＭ１０９コンピテント細胞に、上述したように、形質転換して、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬ寒天プレート上にプレートした。無作為に選択したコロニーを、プラスミドＤＮＡを単離し、ＮｏｔＩとｐｓｔＩ制限酵素によって別々の反応において消化させることによって、スクリーニングした。ＮｏｔＩによって消化されることができなかったが、ＰｓｔＩによって消化された１つのクローンを単離して、ＪＭ１０９（ｐＳＰＲ６ｐｓｔ）と名付けた。プラスミドｐＳＰＲ６ｐｓｔＤＮＡを単離し、高塩制限バッファー中でＰｓｔＩ制限酵素によって消化させた。３７℃において３時間インキュベートした後に、１単位のウシ腸アルカリホスファターゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を加えて、再ライゲーションを防止した。反応を３７℃においてさらに３０分間インキュベートしてから、ＥＤＴＡを５ｍＭの最終濃度まで加えて、反応を７５℃に１０分間加熱することによって停止させた。大腸菌ｔｒｐプロモーターと、２シストロン型リボソーム結合部位（ＧｏｌｄとＳｔｏｒｍｏ⁵）と、ｈａｄＤデハロゲナーゼ構造遺伝子（Ｂａｒｔｈ等⁶）と、Ｔ４ファージ転写ターミネーターとを含むデハロゲナーゼ発現カセットは、プラスミドｐＳＰＲ１１．１（１９９７年２月１２日に寄託Ｎｏ．４０８５９としてＮＣＩＭＢに、大腸菌宿主菌株ＸＬ１ＢｌｕｅＭＲ中で寄託）を上述したように制限酵素ＰｓｔＩによって消化させることによって得ることができる。次に、このデハロゲナーゼ発現カセットの単一コピーを含有するプラスミドｐＳＰＲ１０は、このＤＮＡを上記のように作製したｐＳＰＲ６ｐｓｔＤＮＡとライゲーションさせ、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリン含有Ｌ寒天上で形質転換体を選択することによって得ることができる。プラスミドｐＳＰＲ１１．１（ＮＣＩＭＢから宿主菌株ＸＬ１ＢｌｕｅＭＲ中で入手可能、寄託Ｎｏ．４０８５９）は同じデハロゲナーゼ発現カセットの２コピーを含有する。このプラスミドはプラスミドｐＳＰＲ１０上の特有のＳｗａＩ制限部位中に発現カセットの第２コピーを添加することによって構築された。プラスミドｐＳＰＲ１０ＤＮＡを前記と同様に単離し、高塩制限バッファー中で制限酵素ＳｗａＩによって消化させてから、上述したようにウシ腸アルカリホスファターゼによって処理した。デハロゲナーゼ発現カセットはｐＳＰＲ１１．１を制限酵素ＰｓｔＩによって消化させて、得ることができる。ＳｗａＩ消化プラスミドｐＳＰＲ１０に匹敵する平滑末端ＤＮＡを作製するために、１単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）とそれぞれ最終濃度２００μＭのデオキシアデノシン５’三リン酸、デオキシ−シチジン５’ 三リン酸、デオキシグアノシン５’三リン酸及びチミジン５’三リン酸（全て、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍから）とを、３時間インキュベーション後の反応に加えて、１２℃においてさらに３０分間インキュベートさせた。この反応を７５℃に１０分間加熱することによって停止させた。平滑末端デハロゲナーゼ発現カセットとＳｗａＩ消化ｐＳＰＲ１０とをライゲートさせ、ＸＬ１ＢｌｕｅＭＲコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に上述したように形質転換させ、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＬ寒天プレートにプレートした。プラスミドｐＳＰＲ１１．１は単離プラスミドＤＮＡの制限酵素による消化物(restriction digest)によって、相互に反対方向の２コピーの発現カセットを含有するものとして、同定された。ｒｅｃＪ遺伝子の欠失による組換え的欠損であるように操作された (engineered) 大腸菌Ｗ３１１０菌株（ＡＴＣＣ２７３２５）（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ），１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２，ＵＳＡ）の誘導体において、発酵実験をおこなった。この菌株の構築を説明するが、他の組換え的欠損宿主も使用可能である。ｒｅｃＪ遺伝子に隣接する大腸菌染色体の領域から、２ＰＣＲ生成物を製造した、用いたプライマーは次の通りであった：生成物１を得るためには、ＣＴＧＧＡＴＣＣＣＧＧＣＧＴＴＴＴＣＡＧＧＣＴＴＴＧＣＴＣと、ＡＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＧＡＣＣＡＣＡＡＴＡＡＴＣＣＧＣ；生成物２を得るためには、ＡＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＡＡＣＴＧＧと、ＴＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＣＧＧＣＧＴＴＴＡＣＴＴＣＴＴＣＣＡ。ＰＣＲ反応は、３５サイクルの９４℃における１分間の変性；６０℃／分でのプライムアニーリング(prime annealing)、及び７２℃／分での生成物伸長を用いておこなった。反応は、２００μＭの各ヌクレオシド三リン酸と、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ）と、５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼとを含有する１００μｌ量でおこなった。大腸菌Ｗ３１１０細胞を鋳型ＤＮＡとして用いた。得られた２ＰＣＲ生成物をＲＰＭカラムを用いて上述のように精製し、ｐＭＯＳブルーＴベクターキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）を用いて、製造者プロトコールに従ってクローン化した。ＰＣＲ生成物１を含有するプラスミドを単離し、中塩制限バッファー中で制限酵素ＢｇｌＩＩ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）によって消化させた。ストレプトマイシンとスペクチノマイシン耐性とをコードするＤＮＡフラグメントを、中塩制限バッファー中でのプラスミドｐＵＴ：：ｍｉｎｉＴｎ５Ｓｍ／Ｓｐ（ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ⁷）のＢａｍＨＩ制限消化によって作製した。このフラグメントを消化したプラスミドにライゲートさせ、ＸＬ１ＢｌｕｅＭＲコンピテント細胞に形質転換させ、５０μｇ／ｍｌアンピシリンと２５μｇ／ｍｌストレプトマイシンとを含有するＬ寒天上で形質転換体を選択した。このプラスミドから、中塩制限バッファー中での酵素ＢａｍＨＩによる制限消化によってインサートを放出させた。このフラグメントを、制限酵素ＢｇｌＩＩによって消化したＰＣＲ生成物２を含有するプラスミドにライゲートさせた。ライゲーションと形質転換とは上記と同様であった。クローンは、ストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子が、大腸菌染色体上のｒｅｃＪ遺伝子に通常隣接するＤＮＡと隣接している単離プラスミドＤＮＡの制限消化によって同定された。大腸菌染色体上のｒｅｃＪ遺伝子の欠失は、大腸菌ＪＣ７６２３菌株（ＡＴＣＣ４７００２）の形質転換によって達成された。上記プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩによって消化させ、エタノール沈殿法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等¹）によってＤＮＡを濃縮させて、最終濃度約５００ｎｇ／μｌを得た。新たなエレクトロコンピテントＪＣ７６２３細胞を生成し（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等¹）、２μｌの消化したプラスミドＤＮＡをＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＨｅｍｅｌＨｅｍｐｓｔｅａｄ，ＵＫ）（１５ＫＶ／ｃｍ，２５μＦキャパシタンス，２００オーム平行抵抗）におけるエレクトロポレーションによって形質転換させた。３７℃におけるＬブロス中での２時間の回収期間振動後に、２５μｇ／ｍｌのストレプトマイシンと２５μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンとを含有するＬ寒天上で形質転換体を回収した。形質転換体を１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｌ寒天上でのプレーティングによってアンピシリンへの感受性に関してスクリーニングした。形質転換体はストレプトマイシンとスペクチノマイシンに耐性であるが、アンピシリンに感受性であり、ＪＣ７６２３菌株に比べてＵＶ光に対して増強した感受性を有すると同定された。この菌株はＪＣ７６２３△ｒｅｃＪと名付けられた。 △ｒｅｃＪ変異を菌株Ｗ３１１０にＰＩファージ形質導入によって導入した。ファージ溶菌物をＪＣ７６２３上にのせ(raised)、Ｍｉｌｌｅｒ⁸が述べている方法を用いてＷ３１１０を感染させるために用いた。形質導入体を上述したようにストレプトマイシンとスペクチノマイシンとを含有するＬ寒天上で選択した。発酵のために、菌株Ｗ３１１０△ｒｅｃＪを、上述したようなエレクトロポレーションを用いてプラスミドｐＳＰＲ１０とｐＳＰＲ１１．１とによって形質転換させた。発酵接種原と、デハロゲナーゼ産生菌株の発酵とは本質的にキシラナーゼ産生に関して述べたようにおこなったが、この場合には、培地中に酵母自己溶菌物(y east autolysate)が存在せず、グリセロールではなくグルコースを用いた。デハロゲナーゼ酵素活性をＮａＯＨによって中和した２−クロロプロピオン酸（ＦｌｕｋａＣｈｅｍｉｃａｌ，Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）の脱塩素の速度として測定した。Ｗ３１１０△ｒｅｃＪ（ｐＳＰＲ１０）とＷ３１１０△ｒｅｃＪ（ｐＳＰＲ１１．１）との連続発酵の結果を図５に示す。これらは、明細書に述べたように修正したＪＶ１培地中で増殖する大腸菌の菌株Ｗ３１１０△ｒｅｃＪ（ｐＳＰＲ１０）▲とＷ３１１０△ｒｅｃＪ（ｐＳＰＲ１１．１）●の発酵に対するデハロゲナーゼ活性（単位／ｍｌ）を示す。培養は回分式から希釈率０．１／時の連続培養に約４０時間目に切り換えた。２コピーのデハロゲナーゼ発現カセットを含有するｐＳＰＲ１１．１を含む菌株は、単一コピーの発現カセットのみを有するプラスミドｐＳＰＲ１０を含む菌株よりも非常に大きな安定性を有することが明白に分かる。ピーク酵素活性は低下するが、発酵の総生産性が非常に強化されることは明らかである。付録発酵培地（ＪＶＩ) Ｋ₂ＳＯ₄ ２ｇ／ｌＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ１．５ｇ／ｌＨ₃ＰＯ₄（８５％）０．１４ｍｌ／ｌＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ０．１１g／ｌ微量元素溶液１ｍｌ／ｌ酵母自己溶菌物（Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇｅｒ，低塩，Ｄ等級）２０ｇ／ｌチアミンＨＣｌ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＫ，３２ｇ／ｌ滅菌ストック）０．５ｍｌ／ｌテトラサイクリン塩酸塩（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＫ，６７ｍｇ／ｍｌ滅菌ストック）０．１５ｍｌ／ｌ微量元素溶液は０．２ｇ／ｌのＡｌＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏと、０．０８ｇ／ｌのＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏと、０．０２ｇ／ｌのＣｕＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏと、０．０１ｇ／ｌのＨ₃ＢＯ₄と、０．２ｇ／ｌのＫＩと、０．５ｇ／ｌのＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏと、０．０１ｇ／ｌのＮｉＳＯ₄・６Ｈ₂Ｏと、０．５ｇ／ｌのＮａ₂ＭＯ₄・２Ｈ₂Ｏと、０．５ｇ／ｌのＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏとを含有した。全ての化学薬品は“ＡＲ”等級であり、他に指定しないかぎり、Ｆｉｓｏｎｓ（Ｌｏｕｇｈｂｒｏｕｇｈ，ＵＫ）から入手した。滅菌は１２１℃において３０分間おこなった。チアミンと、微量元素と、テトラサイクリンの溶液は０．２μ ｍフィルターに通してフィルター滅菌して、無菌的に加えられた。参考文献：１．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ.,Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，とＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ．２．Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，１９８５，「大腸菌の形質転換法」，ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇｖｏｌ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（編集：Ｄ．Ｍ．Ｇ．Ｇｌｏｖｅｒ），１０９〜１３５頁，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ．３．Ｔｗｉｇｇ，Ａ．Ｔ．とＤ．Ｓｈｅｒｒａｔｔ，１９８０，「プラスミドＣｏｌＥ１のトランス相補可能なコピ一数変異体」，Ｎａｔｕｒｅ，２８３，２１６〜２１８頁．４．Ｋｅｌｌｅｔ，Ｌ．Ｅ．，Ｄ．Ｍ．Ｐｏｏｌｅ，Ｌ．Ｍ．Ａ．Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ａ．Ｊ．Ｄｕｒｒａｎｔ，Ｇ．Ｐ．Ｈａｚｅｌｗｏｏｄ及びＨ．Ｊ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，１９９０, 「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ亜種ｃｅｌｌｕｌｏｓａからのキシラナーゼＢとアラビノフラノシダーゼとは同じセルロース結合ドメインを有し、隣接遺伝子によってコードされる」，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７２，３６９〜３７６頁．５．Ｇｏｌｄ，Ｌ．とＳｔｏｒｍｏ，Ｇ．Ｄ.,１９９０，「高レベル翻訳開始」ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏ１ｏｇｙ，１８５，８９〜１０３頁．６．Ｂａｒｔｈ，Ｐ．Ｔ．，Ｂｏｌｔｏｎ，Ｌ．及びＴｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，１９９２，「反対の立体特異性を有する２個のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａハロアルカノエートデハロゲナーゼをコードするオペロンのクローニングと部分的配列決定」，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７４，２６１２〜２６１９頁．７．ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ，Ｖ．，Ｈｅｒｒｅｒｏ，Ｍ．，Ｊａｋｕｂｚｉｋ，Ｕ．及びＴｉｍｍｉｓ，Ｋ．Ｎ．，１９９０，「グラム陰性Eｕｂａｃｔｅｒｉａにおける挿入変異のためのＭｉｎｉ−Ｔ−５トランスポゾン誘導体、プロモータープロービング及びクローン化ＤＮＡの染色体挿入」，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２，６５６８〜６５７１頁．８．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．，１９７２，ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，２０１〜２０５頁，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ．

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年３月３０日（１９９８．３．３０）【補正内容】ＤＤＲ特許第２３３，８５１Ａ１号では、配列が反対のセンスで二重に存在して（逆方向反復配列）、それらの各々の配列に重複遺伝子がクローン化又は再クローン化されるベクタープラスミドが開示されている。これは遺伝子量効果のために微生物における遺伝子産物の合成増加を生じるといわれる。逆方向反復配列はそれぞれ少なくとも１つの相同な切断部位を有さなければならず、そこに重複遺伝子が挿入されると考えられる。安定なプラスミドが作製可能であると開示されている。意外にも、本発明によれば逆方向反復配列を有さないベクターから安定なプラスミドを作製することができることを、今回我々は発見した。これは重要な利点を有する。第一に、これは相同な切断部位の数を減ずるか又は排除するので、プラスミドを切断して所望の遺伝子を挿入するためにプラスミドを切断するプロセスにおいてプラスミドを無効なフラグメントに切断する傾向を減ずるか又は排除する。ＤＤＲ第２３３，８５１Ａ１号の各逆方向配列が少なくとも１つの切断部位を有さなければならず、これらの切断部位が相同であることは明らかである。通常、ベクタープラスミドは両方のこのような部位で切断される。このことは逆方向配列の両方に正確に挿入された所望の遺伝子を有するプラスミドを構築することの困難さを高める。例えば、自由末端が単一の添加遺伝子と結合して、このような遺伝子の１個のみを有するプラスミドを残す。さらに、無機能核酸フラグメントが形成される。逆方向配列における切断部位の数が多ければ多いほど、この問題は大きくなる。請求の範囲１．プラスミド又はこのようなプラスミドの遺伝子によって発現されるポリペプチドを含有する生物の連続生成方法であって、プラスミドが（１）複製起点と；（２）プラスミド複製のために必要な付加的な配列及び／又は好ましくは、微生物に選択有利性を与える遺伝子と；（３）２つの発現カセットであって、それぞれが複製起点と選択有利性を与える遺伝子又はプラスミド複製のために必要な付加的な配列との間に配置されたＤＮＡ配列中に存在するが、片側では複製起点を含むＤＮＡによって、他の側では選択有利性を与える遺伝子若しくはプラスミド複製のために必要な配列を含むＤＮＡによって相互から分離されている２つの発現カセットとを含み、このプラスミドが発現カセットによって表される配列以外には逆方向反復配列を実質的に含まない上記方法。２．発現カセットが同じポリペプチドをコードし、好ましくは同じものである、請求項１記載の方法。３．所望のタンパク質を産生するための遺伝子がプラスミドの反対のセンスに配置される、請求項２記載の方法。４．宿主が組換え欠損を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。５．プラスミドが１０ｋＢ（キロベースペア）以下である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。６．カセットがそれらの最も接近した末端の分離によって判定して５ｋＢ以下、好ましくは２ｋＢ以下だけ分離されている、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。７．ポリペプチドがキシラナーゼ又はデハロゲナーゼである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。８．（１）複製起点と；（２）プラスミド複製のために必要な付加的な配列及び／又は好ましくは、微生物に選択有利性を与える遺伝子と；（３）好ましくは同じである、触媒目的のために共に用いられる酵素である、同じポリペプチド又は異なるポリペプチドを発現する２つの発現カセットであって、それぞれが複製起点と選択有利性を与える遺伝子又はプラスミド複製のために必要な付加的な配列との間に配置されたＤＮＡ配列中に存在するが、片側では複製起点を含むＤＮＡによって、他の側では選択有利性を与える遺伝子若しくはプラスミド複製のために必要な配列を含むＤＮＡによって相互から分離されている２つの発現カセットとを含むプラスミドであって、発現カセットによって表される配列以外には逆方向反復配列を実質的に含まない上記プラスミド。９．所望のタンパク質を産生するための遺伝子が反対のセンスにおいて読まれ、それらの最も接近した末端間に最大で５ｋｂ、好ましくは最大で２ｋｂ（７）ＤＮＡを有する、請求項８記載のプラスミド。１０．請求項１〜７のいずれかに記載の使用に適したプラスミド。１１．ブタペスト条約下で、ＮＣＩＭＢ４０７８６とＮＣＩＭＢ４０７８７に関しては１９９６年２月８Ｎ日に、ＮＣＩＭＢ４０８５９に関しては１９９７年２月１２日に、ＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅｒｉａＬｉｍｉｔｅｄに、番号ＮＣＩＭＢ４０７８６とＮＣＩＭＢ４０７８７で大腸菌中で寄託されたプラスミドｐＳＰＲ６とｐＳＰＲ８と、番号ＮＣＩＭＢ４０８５９で大腸菌中で寄託されたプラスミドｐＳＰＲ１１．１。１２．プラスミドを第１制限部位で切断して、所望の発現カセットを第１制限部位に挿入して、修飾プラスミドを形成し、この修飾プラスミドを第１制限部位と相同でない第２制限部位で切断して、所望の発現カセットを第２制限部位に挿入する方法であって、第１制限部位と第２制限部位とが片側では複製起点を含む配列によって分離され、第１制限部位と第２制限部位とが他方の側で宿主生物に選択有利性を与える遺伝子を含む配列又はプラスミド複製のために必要な配列によって分離されないならば、このような遺伝子がその側に挿入され、プラスミドは発現カセットによって表される配列以外には逆方向反復配列を実質的に含まない上記方法。１３．請求項８〜１１のいずれかに記載のプラスミドを含む生物。１４．最大で１つの抗生物質耐性遺伝子を有する、請求項８〜１１のいずれかに記載のプラスミド又は請求項１２に記載の方法によって作製されたプラスミド。１５．プラスミドが最大で１つの抗生物質耐性遺伝予を有する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．プラスミド又はこのようなプラスミドの遺伝子によって発現されるポリペプチドを含有する生物の連続生成方法であって、プラスミドが（１）複製起点と；（２）プラスミド複製のために必要な付加的な配列及び／又は好ましくは、微生物に選択有利性を与える遺伝子と；（３）２つの発現カセットであって、それぞれが開始配列と選択有利性を与える遺伝子又はプラスミド複製のために必要な付加的な配列との間に配置されたＤＮＡ配列中に存在するが、片側では複製起点を含むＤＮＡによって、他の側では選択有利性を与える遺伝子若しくはプラスミド複製のために必要な配列を含むＤＮＡによって相互から分離されている２つの発現カセットとを含み、このプラスミドが発現カセットによって表される配列以外には逆方向反復配列を実質的に含まない上記方法。２．発現カセットが同じポリペプチドをコードし、好ましくは同じものである、請求項１記載の方法。３．所望のタンパク質を産生するための遺伝子がプラスミドの反対のセンスに配置される、請求項２記載の方法。４．宿主が組換え欠損を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。５．プラスミドが１０ｋＢ（キロベースペア）以下である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。６．カセットがそれらの最も接近した末端の分離によって判定して５ｋＢ以下、好ましくは２ｋＢ以下だけ分離されている、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。７．ポリペプチドがキシラナーゼ又はデハロゲナーゼである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。８．（１）複製起点と；（２）プラスミド複製のために必要な付加的な配列及び／又は好ましくは、微生物に選択有利性を与える遺伝子と；（３）好ましくは同じである、触媒目的のために共に用いられる酵素である、同じポリペプチド又は異なるポリペプチドを発現する２つの発現カセットであって、それぞれが開始配列と選択有利性を与える遺伝子又はプラスミド複製のために必要な付加的な配列との間に配置されたＤＮＡ配列中に存在するが、片側では複製起点を含むＤＮＡによって、他の側では選択有利性を与える遺伝子若しくはプラスミド複製のために必要な配列を含むＤＮＡによって相互から分離されている２つの発現カセットとを含むプラスミドであって、発現カセットによって表される配列以外には逆方向反復配列を実質的に含まない上記プラスミド。９．所望のタンパク質を産生するための遺伝子が反対のセンスにおいて読まれ、それらの最も接近した末端間に殆どＤＮＡを有さない、請求項８記載のプラスミド。１０．請求項１〜７のいずれかに記載の使用に適したプラスミド。１１．ブタペスト条約下で、ＮＣＩＭＢ４０８７６とＮＣＩＭＢ４０８７８に関しては１９９６年２月８日に、ＮＣＩＭＢ４０８５９に関しては１９９７年２月１２日に、ＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅｒｉａＬｉｍｉｔｅｄに、番号ＮＣＩＭＢ４０７８６とＮＣＩＭＢ４０７８７で大腸菌中で寄託されたプラスミドｐＳＰＲ６とｐＳＰＲ８と、番号ＮＣＩＭＢ４０８５９で大腸菌中で寄託されたプラスミドｐＳＰＲ１１．１。１２．プラスミドを第１制限部位で切断して、所望の発現カセットを第１制限部位に挿入して、修飾プラスミドを形成し、この修飾プラスミドを第１制限部位と相同でない第２制限部位で切断して、所望の発現カセットを第２制限部位に挿入する方法であって、第１制限部位と第２制限部位とが片側では複製起点を含む配列によって分離され、第１制限部位と第２制限部位とが他方の側で宿主生物に選択有利性を与える遺伝子を含む配列又はプラスミド複製のために必要な配列によって分離されないならば、このような遺伝子がその側に挿入され、プラスミドは発現カセットによって表される配列以外には逆方向反復配列を実質的に含まない上記方法。１３．請求項８〜１１のいずれかに記載のプラスミドを含む生物。１４．最大で１つの抗生物質耐性遺伝子を有する、請求項８〜１１のいずれかに記載のプラスミド又は請求項１２に記載の方法によって作製されたプラスミド。１５．プラスミドが最大で１つの抗生物質耐性遺伝子を有する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。