JP2000505079A

JP2000505079A - 肥満症タンパク質製剤

Info

Publication number: JP2000505079A
Application number: JP9526271A
Authority: JP
Inventors: ビールズ，ジョン・エム; ドッド，スティーブン・ダブリュー; ミリカン，ローン・エル・ジュニア; ペカー，アレン・エイチ
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1996-01-19
Filing date: 1997-01-17
Publication date: 2000-04-25
Also published as: EP0786256A3; CA2243505A1; EP0786256A2; AU1705197A; WO1997026013A1

Abstract

(57)【要約】本発明は可溶性非経口製剤であって、肥満症タンパク質類似体および保存剤を含み、低イオン強度を有する製剤を開示する。低イオン強度により商業的に利用可能な多用途医薬品を製造できる。

Description

【発明の詳細な説明】肥満症タンパク質製剤本出願は１９９６年１月１９日提出の米国仮出願第６０／０１０，２４４号の利益を請求する。本発明はヒト医学分野にあり、特に肥満症および肥満症に関連する障害の処置に関する。さらに詳細には、本発明は肥満症タンパク質類似体の製剤に関する。肥満症、および特に上半身肥満症は米国および世界中において一般的で非常に深刻な公衆衛生上の問題である。最近の統計によると、米国人口の２５％以上およびカナダ人口の２７％以上が太り過ぎである。Kuczmarski、Amer．J．of Clin .Nutr.55:495s-502s(1992);Reederら、Can.Med.Ass.J.,23:226-233(1992）。上半身肥満症はII型真性糖尿病に対して知られる最も強力な危険因子であり、また心臓血管障害およびがんの強力な危険因子でもある。最近の肥満症医療コストの推定額は世界中で１５０，０００，０００，０００ドルである。公衆衛生局長官が主導してアメリカ社会に蔓延し増加し続ける脂肪症との格闘を開始させるほどこの問題は深刻になってきた。この肥満症を誘発する病因の多くは異脂肪血症（dyslipidemia）、高血圧症およびインシュリン耐性に強い関連をもつ。食事療法および運動によって肥満を減じることがこれらの危険因子を劇的に減らすことが多くの研究で示された。不運なことにこれらの処置はほとんどが失敗し、失敗率は９５％に達する。この失敗は、この状態が食欲の増加、高カロリー食品への嗜好、肉体活動の減少および脂質形成代謝の増大の一因となる遺伝的に受け継がれる因子に強く関連することに由来する。このことはこのような遺伝的特質を受け継いだ人々がこの状態と格闘する彼らの努力に関係なく肥満になりがちであることを示す。それゆえ、遺伝継承にかかわらずにこの脂肪症ハンディキャップを正常にし、内科医が肥満症患者の処置を首尾よく行うことができる薬理活性物が必要とされる。ｏｂ／ｏｂマウスは肥満症および糖尿病のモデルであり、第６染色体上の突然変異にかかわる常染色体劣性特性をもつことが知られる。最近、Yiying Zhangおよび共同研究者らはこの状態にかかわるマウス遺伝子のポジショナルクローニングを公表した。Yiying Zhangら、Nature 372：425-32(1994)。この報告はマウスおよびヒトの脂肪組織において発現するタンパク質を開示する。同様に、村上らはBiochemical and Biophysical Research Communications 209(3)：944-52（19 95）においてラット肥満遺伝子（obese gene）のクロ−ニングおよび発現を報告している。このｏｂ遺伝子にコードされるタンパク質はマウスにおいて脂肪症を効果的に調節する能力を示した。Pelleymounterら、Science 269: 540-543（199 5）。不溶性タンパク質を含む非経口製剤は用量−作用における非統一性および予測不可能性に関する問題を引き起こす。この予測不可能性は懸濁製剤の薬物動態学がより大きく変動するせいであると考えられる。不溶性製剤は吸着前にまず溶解しなければならない。この過程が皮下貯蔵量を大きく変動させると仮定される。さらに、生理的条件下における非ネイティブな会合および凝集は注入部位でのタンパク質の沈澱を導き、この沈澱が炎症および他の免疫反応を導く可能性がある。これらの理由のために、不溶性のタンパク質粒子を形成するヒト肥満症タンパク質製剤はその恩恵を求める患者および管理機関に受け入れられないであろう。不運なことに、天然に存在する肥満症タンパク質は凝集する傾向を示し、可溶性の医薬的に許容される非経口製剤の調製を非常に難しくする。保存剤、緩衝液、イオン強度、ｐＨ、温度、タンパク質濃度および界面活性剤もしくは糖のような追加の賦形剤のいずれかとの間の分子相互作用は肥満症タンパク質が製剤から凝集し沈澱する傾向を考慮すると、非常に予測不可能である。肥満症タンパク質類似体が開発され、薬理活性が示された。これらの類似体のいくつかは物理的性質および安定性が大きく改善している。本発明中に含まれる類似体はBasinskiら、ＷＯ９６／２３５１５およびＷＯ９６／２３５１７に記載されている。本発明は肥満症タンパク質類似体（obesity protein analogs）が可溶性であり、多用途医薬品として商業的に利用可能な条件を供給する。最も驚くべきことに、本発明は製剤のイオン強度が１０ｍＭより高い場合に観察される特異的保存剤依存相互作用を抑える。本明細書中に開示する特定の条件下において、製剤の安定性が大きく高められる。すなわち、肥満症タンパク質類似体を精選した保存剤を伴い低イオン強度で製剤化した場合、この肥満症タンパク質はよりずっと高い濃度でも、また所望のｐＨ領域でも可溶性を保つ。それゆえ、可溶性の多用途非経口製剤を調製できる。したがって、本発明は肥満症タンパク質類似体の可溶性非経口製剤を提供する。本発明は肥満症タンパク質類似体および保存剤を含有し、約１０ｍＭより低いイオン強度を有している可溶性非経口製剤を提供する。好ましくは、本発明は肥満症タンパク質類似体およびフェノール、クレゾールまたはこれらを組み合わせたものからなる群から選択される保存剤を含み、１０ｍＭより低いイオン強度を有している可溶性非経口製剤を提供する。本発明はさらに請求項１に記載の可溶性非経口製剤の製造方法であって、肥満症タンパク質類似体および保存剤を本製剤のイオン強度が１０ｍＭより低くなるように混合することを特徴とする方法を含む。加えて、本発明は肥満症の処置を必要としている哺乳類における肥満症の処置方法であって、請求項１に記載の可溶性非経口製剤を同哺乳類に投与することを特徴とする方法を提供する。本発明の目的のため、本明細書中に開示および記載する以下の用語および略語を次のように定義する。「アルキルパラベン」は、Ｃ₁〜Ｃ₄アルキルパラベンを意味する。アルキルパラベンはメチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベンまたはブチルパラベンであるのが好ましい。「塩基対（ｂｐ）」は、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。ＤＮＡ分子において存在する略語Ａ、Ｃ、ＧおよびＴはそれぞれ５’モノリン酸形態のヌクレオチド、（デオキシ）アデニン、（デオキシ）シチジン、（デオキシ）グアニンおよび（デオキシ）チミンに対応する。ＲＮＡ分子において存在する略語Ｕ、Ｃ、ＧおよびＴは５’モノリン酸形態のヌクレオシド、ウラシル、シチジン、グアニンおよびチミンにそれぞれ対応する。二本鎖ＤＮＡでは、塩基対はＡとＵまたはＣとＧの組み合わせを意味する。ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重らせんでは、塩基対はＴとＵまたはＣとＧの組み合わせを意味する。「クレゾール」は、メタ−クレゾール、オルト−クレゾール、パラ−クレゾール、クロロ−クレゾールまたはこれらの混合物を意味する。「イオン強度」は、それぞれのイオン種の電荷の２乗によって加重した溶液中のイオン種濃度の単位であり、Physical Chemistry，Castellan，Gilbert W.，A ddison-Weslay Publishing Company,Inc.，Reading，Massachusetts（1964）p.3 35のような物理化学文献またはThe Chemist's Companion，Gordon，Arnold J．a nd Ford, Richard A.，John Wi1ey & Sons，New York（1972）p．55のような化学参考文献に記載されている。溶液中のイオン種濃度がミリモーラー（ｍＭ、ミリモル／リットル）で表される場合は、溶液のイオン強度もミリモーラー（ｍＭ）の単位を有する。「肥満症タンパク質類似体」は、式（Ｉ）［ここに、第２８位のＸａａはＧｌｎまたは不存在であり；同タンパク質は少なくとも１つの以下の置換分を有する：第４位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第７位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第２２位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；第２７位のＴｈｒがＡｌａに置換している；第２８位のＸａａがＧｌｕに置換している；第３４位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第５４位のＭｅｔがメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、ＩｌｅNＶａｌ、ＡｌａまたはＧｌｙに置換している；第５６位のＧｌｎがＧ１ｕに置換している；第６２位のＧ１ｎがＧ１ｕに置換している；第６３位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第６８位のＭｅｔがメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＡｌａまたはＧｌｙに置換している；第７２位のＡｓｎがＧｌｎ、ＧｌｕまたはＡｓｐに置換している；第７５位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第７７位のＳｅｒがＡｌａに置換している；第７８位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；第８２位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；第９７位のＨｉｓがＧｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＰｒｏに置換している；第１００位のＴｒｐがＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換している；第１０１位のＡｌａがＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＴｈｒまたはＶａｌに置換している；第１０２位のＳｅｒがＡｒｇに置換している；第１０３位のＧｌｙがＡｌａに置換している；第１０５位のＧｌｕがＧｌｎに置換している；第１０６位のＴｈｒがＬｙｓまたはＳｅｒに置換している；第１０７位のＬｅｕがＰｒｏに置換している；第１０８位のＡｓｐがＧｌｕに置換している；第１１１位のＧｌｙがＡｓｐに置換している；第１１８位のＧｌｙがＬｅｕに置換している；第１３０位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第１３４位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第１３６位のＭｅｔがメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＡｌａまたはＧｌｙに置換している；第１３８位のＴｒｐがＡｌａ、Ｇｌｕ、ＡｓＰ、ＡＳｎ、Ｍｅｔ、Ｉ１ｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇ１ｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換している；あるいは第１３９位のＧｌｎがＧｌｕに置換している］で示されるタンパク質または医薬的に許容されるその塩を意味する。肥満症タンパク質類似体にはリーダー配列をもつタンパク質が含まれる。リーダー配列はタンパク質の産生または精製を助けるための１つまたはそれ以上のＮ末アミノ酸である。好ましいリーダー配列はＭｅｔ−Ｒ１−（ここにＲ１は不存在またはＰｒｏを除くアミノ酸のいずれかである）である。「プラスミド」は、染色体外の自己複製遺伝子成分である。「読み取り枠」は、翻訳開始点からｔＲＮＡ、リボソームおよび関連する因子の翻訳装置によってトリプレットで「読みとられる」ヌクレオチド配列であり、それぞれのトリプレットは特定のアミノ酸に対応する。それぞれのトリプレットは別個で同じ長さであるため、コーディング配列は３の倍数でなければならない。１塩基対挿入または欠失（フレームシフト突然変異という）は結果として同じＤＮＡセグメントによってコードされる２つの異なったタンパク質となる。これを防ぐには、所望のポリペプチドに対応するトリプレットコドンは開始コドンから３の倍数でならんでいなければならず、すなわち正しい「読み取り枠」が維持されなければならない。キレーティングペプチドを含有する融合タンパク質を作成する際、構造タンパク質をコードするＤＮＡ配列の読み取り枠はそのキレーティングペプチドをコードするＤＮＡ配列において維持されなければならない。「組換えＤＮＡクローニングベクター」は、１つまたはそれ以上の追加ＤＮＡセグメントを加えることができる、あるいは既に加えられたＤＮＡ分子を含有する自律複製因子であり、これにはプラスミドおよびファージがあるが、これらに限定されない。「組換えＤＮＡ発現ベクター」は、プロモーターが導入されている組換えＤＮＡクローニングベクターである。「レプリコン」は、プラスミドおよび他のベクターの自律複製を制御し、可能にするＤＮＡ配列である。「転写」は、ＤＮＡのヌクレオチド配列に含まれる情報を相補的なＲＮＡ配列に移す過程である。「翻訳」は、メッセンジャーＲＮＡの遺伝情報を用いてポリペプチド鎖の合成を特定化し、指揮する過程である。「ベクター」は、適当な制御配列と組み合わせた場合に形質転換される宿主細胞に特別な性質を与える適当なタンパク質分子に対応するポリヌクレオチド配列を保有する、遺伝子操作の際に細胞の形質転換に用いられるレプリコンである。プラスミド、ウイルスおよびバクテリオファージは本来レプリコンであるので、適切なベクターである。人工ベクターは異なる起源からのＤＮＡ分子を制限酵素およびリガーゼを用いて切断および連結することによって作成される。ベクターは組換えＤＮＡクローニングベクターおよび組換えＤＮＡ発現べクターを含む。「処置」とは、本明細書では、疾患、状態または障害と格闘することを目的とする患者の管理および介護を指し、これには兆候または併発症の発症を予防し、それらを緩和し、あるいは疾患、状態または障害を除去するために本発明のタンパク質を投与することが含まれる。本明細書中に用いている処置は美容目的のために本タンパク質を投与することを含む。美容目的は哺乳類の体重をコントロールして体の見た目を改善することを求める。「等張性試薬」は、細胞膜を透過する正味の水流出を防ぐために製剤に適当な張性を付与する生理的に寛容な試薬を意味する。一般にグリセリンのような化合物が既知の濃度でそのような目的に用いられる。他の可能な等張性試薬は塩、例えば塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトールおよびラクトースなどである。「生理的に寛容な緩衝液」は当分野において既知である。生理的に寛容な緩衝液は好ましくはリン酸ナトリウムのようなリン酸緩衝液である。他の生理的に寛容な緩衝液はトリス、酢酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムなどである。緩衝液の選択および濃度は当分野において既知である。ヌクレオチドおよびアミノ酸の略語は米国特許および商標庁によって３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２（ｂ）（２）（１９９３）の記載として許容される。特に明記しなければ、アミノ酸はＬ体である。上記のように本発明は肥満症タンパク質類似体および保存剤を含み、１０ｍＭより低いイオン強度を有している可溶性非経口製剤を提供する。イオン強度が５ｍＭより低いのが好ましく、イオン強度が１ｍＭより低いのが最も好ましい。低イオン強度下において、肥満症タンパク質類似体は溶液中に溶解したままであり、可溶性非経口製剤となり得る。非経口製剤は保存効力のガイドラインに沿って商業的に利用可能な多用途製品にしなければならない。非経口製剤において許容される当分野に既知の保存剤は：フェノール、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、クロロブタノール、ｐ−クレゾール、硝酸フェニル水銀、チメローザル（thimerosal）およびこれらの種々の混合物などである。例えばWALLHAUSER，K.-H.，DEVEL0P.B I0L．STANDARD．24，PP．9-28（Basel，S．Krager，1974）参照。アルキルパラベンおよびクロロブタノールは製剤のイオン強度に対し低感受性であるが・これらは低い効力の保存剤物質である。最も有効な保存剤、フェノールおよびクレゾール、またはこれらの混合物は肥満症タンパク質類似体と共に製剤化した場合にタンパク質の不安定性を引き起こす傾向を示す。本明細書に記載した条件下では、フェノール、クレゾールまたはこれらを組み合わせたものを用いて本タンパク質を製剤化することが可能となる。これゆえ、本発明の好ましい保存剤はフェノール、クレゾールまたはこれらを組み合わせたものからなる群から選択される。製剤中の肥満症タンパク質類似体の濃度は約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約５０．０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約５．０ｍｇ／ｍｌ〜約１０．０ｍｇ／ｍｌである。必要とされる保存剤の濃度は保存効力を維持するために必要な濃度である。保存効力を維持するために必要な保存剤の相対量は用いる保存剤によって変化する。一般に必要量は、例えば引用によって本明細書に包含されるWALLHAUSER，K.-H.，DEVEL0P．BI0L．STANDA RD.24，PP．9-28（Basel，S．Krager，1974）中にみることができる。保存剤の最適濃度はその保存剤、その溶解度および製剤のｐＨに依存する。等張性試薬、好ましくはグリセリンをさらに製剤に加えることができる。等張性試薬の濃度は非経口製剤に対して当分野に既知の範囲内であり、好ましくは約１〜２０、より好ましくは８〜１６ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは約１６ｍｇ／ｍｌである。製剤のｐＨはまた生理的に寛容な緩衝液、好ましくはリン酸ナトリウムのようなリン酸緩衝液で緩衝することができる（イオン強度が１０ｍＭより低くなるような濃度、好ましくは約１ｍＭ〜約５ｍＭで用いる）。他の許容される生理的に寛容な緩衝液はトリス、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムなどである。緩衝液の選択および濃度は当分野において既知である。他の添加剤、例えばトゥウィーン（Tween）２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、トゥウィーン４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、トゥウィーン８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、プルロニック（Pluronic）Ｆ６８（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー）、ブリッジ（BRIJ）３５（ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル）およびぺグ（ポリエチレングリコール）のような医薬的に許容される可溶化剤は凝集を減らすために製剤に加えられることもある。このような添加剤はポンプおよびプラスチック容器を用いて製剤を投与する場合に特に有用である。医薬的に許容される界面活性剤が存在することにより、本タンパク質が凝集する傾向が緩和される。本発明の非経口的製剤は通常の溶解および混合手順を用いて調製することができる。適当な製剤を調剤するために、例えば水中の肥満症タンパク質類似体の測定量と水中の所望の保存剤をこのタンパク質および保存剤を所望の濃度とするのに充分な量混合する。一般に製剤は投与前に滅菌濾過する。この方法のバリエーションは当業者によって認識されるところであろう。例えば、成分を加える順番、用いる界面活性剤、製剤を調製する温度およびｐＨは濃度および用いる投与手段に最適とすることができる。種々のイオン強度の製剤を調製し、４℃および３７℃において３日後に溶液中に残留するタンパク質量を比較することによって、予期しなかった製剤安定性に対するイオン強度効果が示された。表１および２のデータ作成に用いた製剤は実施例１および２に類似の方法で調製した。表１．イオン強度および各種条件の相関による配列番号６のタンパク質の回収量（ｐＨ７．８）。値はイオン強度効果、各種条件効果、およびイオン強度・各種条件相互作用効果を含む第２級ファクトリーモデルに生データを合わせることにより求めた最小二乗法の計算値および標準誤差である。(Ｒ²＝０．９５、（Ｐｒｏｂ＞Ｆ）＝８．６２ｅ^-13、全観測数＝６０)。溶液中のタンパク質パーセントは理論上標的の１．６ｍｇタンパク質／ｍｌを用いて計算する。すべての標品は０．３％ｍ−クレゾールを含む。表２．種々の保存剤存在下での配列番号６のタンパク質の溶解度に対するイオン強度の効果。値は保存効果、酸可動域効果、緩衝液効果、各種条件効果、およびすべての２因子相互作用効果を含む第２級ファクトリーモデルに生データを合わせることにより求めた最小二乗法の値および標準誤差である。（Ｒ²＝０．９４５、（Ｐｒｏｂ＞Ｆ）＝２．８８ｅ^-38、観測数＝１２５）。溶液中のタンパク質パーセントは理論上標的の１．６ｍｇタンパク質／ｍｌを基準とする。 ¹リン酸一水素ナトリウムを加えなかった。² ６５．２ｍＭリン酸一水素ナトリウムを加えた。例外としてメチルパラベンの実験の場合は３２．５ｍＭリン酸一水素ナトリウムを加えた。低イオン強度下にて調製された製剤の安定性が高まることは当分野を考慮すると最も予期せず、また予測不可能なことである。表１のデータは、１０ｍＭより高いイオン強度下では両温度で肥満症タンパク質類似体の溶解度が急激に下がることを示している。表２のデータは保存効果を示す。好ましくは本製剤のｐＨは約ｐＨ７．０〜約８．０、最も好ましくは７．６〜８．０である。本製剤は好ましくは肥満症タンパク質類似体および保存剤をｐＨ７．０より高いｐＨで混合することによって塩基性条件下で調製する。好ましくは、ｐＨは約７．６〜８．０、最も好ましくは約ｐＨ７．８である。理想的には、保存剤および水の溶液をｐＨ７．６〜８．０で混合する。この溶液に肥満症タンパク質類似体水溶液を加える。必要にあわせてｐＨを約７．６〜８．０に調整する。次いで成分が溶解するまで約２０〜４０分、好ましくは約３０分溶液を保つ。製剤のｐＨ調整に用いる塩基は水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムのような医薬的に許容される１つまたはそれ以上の塩基とすることができる。好ましい塩基は水酸化ナトリウムである。好ましくは、本発明の製剤に用いられる肥満症タンパク質類似体は式Ｉ［ここに；第４位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第７位のＧｌｎがＧ１ｕに置換している；第２２位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；第２７位のＴｈｒがＡｌａに置換している；第２８位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第３４位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第５４位のＭｅｔがメチオニンスルホキシド、ＬｅｕまたはＡｌａに置換している；第５６位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第６２位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第６３位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第６８位のＭｅｔがメチオニンスルホキシドまたはＬｅｕに置換している；第７２位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；第７５位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第７８位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；第８２位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；第１３０位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第１３４位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第１３６位のＭｅｔがメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅに置換している；あるいは第１３９位のＧｌｎがＧｌｕに置換している］で示されるものである。本発明の製剤に用いる他の好ましい肥満症タンパク質類似体は式Ｉ［ここに：第２２位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；第２７位のＴｈｒがＡｌａに置換している；第５４位のＭｅｔがメチオニンスルホキシド、ＬｅｕまたはＡｌａに置換している；第６８位のＭｅｔがメチオニンスルホキシドまたはＬｅｕに置換している；第７２位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；第７８位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；第８２位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；あるいは第１３６位のＭｅｔがメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、またはＩｌｅに置換している］で示されるものである。さらに加えて本発明の製剤に用いる好ましい肥満症タンパク質類似体は式Ｉ［ここに：第２２位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；第２７位のＴｈｒがＡｌａに置換している；第５４位のＭｅｔがＬｅｕまたはＡｌａに置換している；第６８位のＭｅｔがＬｅｕに置換している；第７２位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；第７８位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；第８２位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；あるいは第１３６位のＭｅｔがＬｅｕ、またはＩｌｅに置換している］で示されるものである。本発明の製剤に用いる好ましい種類は配列番号２および配列番号３：のものである。最も重要なことに、本発明製剤の他の好ましいタンパク質は配列番号１のタンパク質のアミノ酸残基９７〜１１１および／または１３８の特異的置換体である。これらの置換体は結果として付加的な安定性をもち、より優れた治療物質である。これらの特定のタンパク質はより容易に製剤化され、医薬的により優れており、より優れた治療服用量運搬体となる。したがって、好ましい態様は式II：［ここに、第２８位のＸａａはＧｌｎまたは不在であり；同タンパク質は：第９７位のＨｉｓがＧｌｎ、Ａｓｎ。Ａｌａ、Ｇ１ｙ、ＳｅｒまたはＰｒｏに置換している；第１００位のＴｒｐがＡｌａ、ＧＩＵ、ＡＳＰ、ＡＳｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇ１ｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換している；第１０１位のＡｌａがＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＴｈｒまたはＶａ１に置換している；第１０２位のＳｅｒがＡｒｇに置換している；第１０３位のＧｌｙがＡｌａに置換している；第１０５位のＧｌｕがＧｌｎに置換している；第１０６位のＴｈｒがＬｙｓまたはＳｅｒに置換している；第１０７位のＬｅｕがＰｒｏに置換している；第１０８位のＡｓｐがＧｌｕに置換している；第１１１位のＧｌｙがＡｓｐに置換している；あるいは第１３８位のＴｒｐがＡｌａ、ＧＩＵ、ＡＳＰ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙr、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換している；からなる群から選択される少なくとも１つの置換分を有する］で示される肥満症タンパク質類似体またはその医薬的に許容される塩を含む製剤である。他の好ましい態様は式III：［同タンパク質は：第９７位のＨｉｓがＧｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇ１ｙ、ＳｅｒまたはＰｒｏに置換している；第１００位のＴｒｐがＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換している；第１０１位のＡｌａがＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇ１ｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＴｈｒまたはＶａｌに置換している；第１０２位のＳｅｒがＡｒｇに置換している；第１０３位のＧｌｙがＡｌａに置換している；第１０５位のＧｌｕがＧｌｎに置換している；第１０６位のＴｈｒがＬｙｓまたはＳｅｒに置換している；第１０７位のＬｅｕがＰｒｏに置換している；第１０８位のＡｓｐがＧｌｕに置換している；第１１１位のＧｌｙがＡｓｐに置換している；あるいは第１３８位のＴｒｐがＡｌａ、ＧＩＵ、ＡＳＰ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇ１ｙ、Ｇ１ｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換している；からなる群から選択される少なくとも１つの置換分を有する］で示される肥満症タンパク質類似体またはその医薬的に許容される塩を含む製剤である。より好ましい態様は式III ［ここに：第９７位のＨｉｓがＧｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＰｒｏに置換している；第１００位のＴｒｐがＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、ＧｌｎまたはＬｅｕに置換している；第１０１位のＡｌａがＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＴｈｒまたはＶａｌに置換している；第１０５位のＧｌｕがＧｌｎに置換している；第１０６位のＴｈｒがＬｙｓまたはＳｅｒに置換している；第１０７位のＬｅｕがＰｒｏに置換している；第１０８位のＡｓｐがＧｌｕに置換している；第１１１位のＧｌｙがＡｓｐに置換している；あるいは第１３８位のＴｒｐがＡｌａ、Ｇｌｕ、ＡＳＰ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇ１ｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換している］で示される肥満症タンパク質類似体を含む製剤である。他の好ましい態様は式III ［ここに：第９７位のＨｉｓがＳｅｒまたはＰｒｏに置換している；第１００位のＴｒｐがＡ１ａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕに置換している；第１０１位のＡｌａがＴｈｒに置換している；あるいは第１３８位のＴｒｐがＡｌａ、Ｉ１ｅ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換している］で示される肥満症タンパク質類似体を含む製剤である。加えて好ましい態様は式III ［ここに：第９７位のＨｉｓがＳｅｒまたはＰｒｏに置換している；第１００位のＴｒｐがＡｌａ、ＧｌｎまたはＬｅｕに置換している；第１０１位のＡｌａがＴｈｒに置換している；あるいは第１３８位のＴｒｐがＧ１ｎに置換している］で示される肥満症タンパク質類似体を含む製剤である。最も好ましい態様は第９６位のＣｙｓおよび第１４６位のＣｙｓの間にジスルフィド結合を有する肥満症タンパク質類似体を含む製剤である。最も好ましい態様の例は第９６位のｃｙｓおよび第１４６位のＣｙｓの間にジスルフィド結合を有する配列番号６〜１３の肥満症タンパク質類似体またはその医薬的に許容される塩を含む。本発明に用いられる肥満症タンパク質類似体は古典（溶液）法、固相法、半合成法およびより最近の組換えＤＮＡ法を含め、認識されるいかなる種類のぺプチド合成技術によっても調製することができる。高い収量を望む場合には組換え法が好ましい。タンパク質の組換え製造における基本工程は次の通りである：ａ）肥満症タンパク質類似体をコードする合成または半合成ＤＮＡの構築（または天然起源からの単離）、ｂ）単独または融合タンパク質のいずれかのタンパク質発現に適した手法によるコーディング配列の発現ベクターへの組み込み、ｃ）この発現ベクターを用いた適当な真核生物または原核生物宿主細胞の形質転換、およびｄ）組換え的に生産したタンパク質の回収および精製。インビトロまたはインビボにおいて転写および翻訳された結果、本タンパク質を与える合成遺伝子は当分野に周知の技術によって構築することができる。遺伝コードの天然の縮重のせいで、所望のタンパク質をコードする、相当な数ではあるが限られた数のＤＮＡ配列を構築することができることは当業者であれば認識するところであろう。本発明の好ましい実施態様において、合成は組換えＤＮＡ技術によって行う。合成遺伝子構築の方法論は当分野に周知である。例えば、Brownら、（1979）M ethods in Enzymology，Academic Press，N．Y.，Vol．68，pgs．109-151参照。本請求タンパク質合成遺伝子に相当するＤＮＡ配列はアプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）モデル380Aまたは380B合成機（Applied Biosystems， Inc.，850 Lincoln Center Drive，Foster City，CA 94404から商業的に入手可能）のような通常のＤＮＡ合成装置を用いて製造できる。いくつかの適用において、例えば融合タンパク質構築物からシグナルペプチドを切除することを制御するために、シグナルペプチドおよび構造タンパク質間に都合のよいプロテアーゼ感受性切断部位を包含するように肥満症タンパク質類似体をコードする配列を修飾することが望ましいことがある。また肥満症タンパク質類似体をコードする遺伝子はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることによって作成することもできる。鋳型はｃＤＮＡライブラリー（CL0NETECHまたはSTRATAGENEより商業的に入手可能）または所望のアライバル脂肪組織から単離したｍＲＮＡとすることができる。そのような方法論は当分野Maniatis，ら、Molecular Cloning:ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor ，New York（1989）において周知である。構築または単離したＤＮＡ配列は肥満症タンパク質類似体を直接発現か、あるいは融合タンパク質としてかのどちらかによって発現するのに有用である。この配列を融合遺伝子として用いる場合には、その産物は酵素的または化学的切断を必要とする。ポリペプチドを特異的部位で切断する、あるいはペプチドをペプチド鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端から消化する（例えばジアミノペプチダーゼ）種々のペプチダーゼが知られる。さらに、特定の化学物質（例えば臭化シアン）はポリペプチド鎖を特異的部位で切断する。部位特異的内部切断部位を含ませるためにアミノ酸配列（および組換え法を用いるならば合成または半合成コーディング配列）に必要とされる修飾は当業者であれば認識するところであろう。米国特許第５，１２６，２４９号;Carter P.，Site Specific Proteolysis of Fusion Protein，Ch．13 in Protein Purification:From Molecular Mechanism s to Large Scale Processes，American Chemical Soc.，Washington，D.C．（1 990）参照。所望のコーディングおよび制御配列を含有する適当なベクターの構築には標準的連結技術を用いる。単離したプラスミドまたはＤＮＡ断片を切断し、仕立て、再連結して必要とされるプラスミドを生成するような形にする。所望のタンパク質を効果的に翻訳するために、設計された合成ＤＮＡ配列を適した制限エンドヌクレアーゼを利用して過剰の適当な組換ＤＮＡ発現ベクターに挿入する。合成コーディング配列はこれらの発現プラスミドおよび増幅発現プラスミドからの単離およびそれらへの組み込みを容易にするために転写体末端の一方に制限エンドヌクレアーゼ切断部位を保有するように設計することができる。単離したｃＤＮＡコーディング配列は合成リンカーを用いることによって、この配列を当分野に周知の技術によって所望のクロ−ニングベクターへ包含するように容易に修飾することができる。使用する特定の制限エンドヌクレアーゼは用いる親発現ベクターの制限エンドヌクレアーゼ切断パターンによって規定される。制限部位は制御配列に対しコーディング配列が正しい方向になるように選択し、正しい読み取り枠で本タンパク質が発現されるようする。一般に、宿主細胞と適合する種由来のプロモーターおよび制御配列を含有するプラスミドベクターをこれらの宿主と共に用いる。通常、ベクターは複製開始点および形質転換細胞において表現型選択を可能にするマーカー配列を保持する。例えば、大腸菌は典型的に、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２（Bo livar，ら、Gene 2:95(1977)）を用いて形質転換する。プラスミドｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含有するため形質転換細胞の容易な同定手段を提供する。また、このｐＢＲ３２２プラスミド、または他の微生物プラスミドは組換えＤＮＡ技術に用いられるプロモーターおよび他の制御要素を含有していなければならず、あるいは含有するように修飾されなければならない。所望のコーディング配列は、タンパク質が発現する宿主細胞において機能的であるべきプロモーターおよびリボソーム結合部位から転写が開始されるように正しい方向で発現ベクターへ挿入する。そのような発現ベクターの例としてBelaga jeら、米国特許第５，３０４，４９３号（その教示内容は引用により本明細書に包含される）に記載のプラスミドがある。米国特許第５，３０４，４９３号に記載のＡ−Ｃ−Ｂプロインシュリンをコードする遺伝子は制限酵素ＮｄｅｌおよびＢａｍＨＩを用いてプラスミドｐＲＢ１８２から取り除くことができる。単離したＤＮＡ配列はＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ制限断片カセット上にてプラスミド骨格に挿入することができる。本発明において有用なベクターを構築する際、一般に原核生物をＤＮＡのクローニングに用いる。例えば、大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣＮｏ．３１４４６）は特に有用である。用いることができる他の細菌株には大腸菌Ｂおよび大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣＮｏ．３１５３７）などがある。これらの例は制限するものではなく例示にすぎない。また原核生物は発現にも有用である。前記株および大腸菌Ｗ３１１０（原栄養株、ＡＴＣＣＮｏ．２７３２５）、枯草菌（Bacillussu btilis）のようなバチルス、およびサルモネラ・ティフィリウム（Salmonera typhimurium）またはセラチア・マルセスセンス（Serratia marcescans）のような他の腸内細菌科・および種々のシュードモナス種を用いることができる。原核生物の宿主と共に用いるのに適したプロモーターにはβ−ラクタマーゼ（ベクタ−ｐＧＸ２９０７［ＡＴＣＣ３９３４４］はレプリコンおよびβ−ラクタマーゼ遺伝子を含有する）およびラクトースプロモーター系（Changら、Nature 275:615(1978)；およびGoedd elら、Nature 281:544(1979)）、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（ベクタ−ｐＡＴＨ１［ＡＴＣＣ３７６９５］はｔｒｐプロモーターの制御下にｔｒｐＥ融合タンパク質としてのオープン読み取り枠の発現を容易にするように設計されている）およびｔａｃプロモーター（プラスミドｐＤＲ５４０ＡＴＣＣ−３７２８２から単離可能）のようなハイブリッドプロモーターなどがある。しかし、ヌクレオチド配列が一般的に既知の他の機能性細菌プロモーターであっても必要な制限部位を付与するリンカーまたはアダプターを用いてタンパク質をコードするＤＮＡに連結することが可能である。また細菌系用プロモーターはタンパク質をコードするＤＮＡに作動可能に連結したシャイン・ダルガルノ配列を含有するであろう。またＤＮＡ分子は真核生物発現系において組換え的に生産することもできる。哺乳類宿主細胞における転写を制御する好ましいプロモーターは種々の起源、例えばポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはサイトメガロウイルスのようなウイルスゲノムから、あるいは例えばβ−アクチンプロモーターのような異種哺乳類プロモーターから得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターはＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限断片として容易に得られる。Fiers，ら、Nature，273:113(1978)。ＳＶ４０全ゲノムはプラスミドｐＢＲＳＶ）ＡＴＣＣ４５０１９から得られる。ヒトサイトメガロウイルスの即時初期プロモーターはプラスミドｐＣＭＢｂ（ＡＴＣＣ７７１７７）から得ることができる。もちろん宿主細胞または関連種からのプロモーターもまたここに有用である。高等真核生物によるＤＮＡの転写はエンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加する。エンハンサーは通常約１０〜３００塩基対のＤＮＡのシス作用性要素であり、プロモーターに作用してその転写を増大させる。エンハンサーは比較的独立した方向および位置に置かれ、イントロン中（Banerji，J．L.ら、Cell 33:729(1983)）およびコーディング配列自体中（0sborne，T．F．ら、Mo l．CellBio．4:1293(1984)）、転写ユニットに対して５’側（Laimins，L.ら、P NAS 78:993(1981)）および３’側（Lusky，M．L．ら、Mol．Cell Bio．3:1108(1 983)）に見られた。現在、多くの哺乳類遺伝子（グロビン、ＲＳＶ、ＳＶ４０、ＥＭＣ、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリン）由来エンハンサー配列が知られている。しかし、典型的には真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを用いる。例としてはＳＶ４０後期エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーなどがある。また真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物由来有核細胞）にて用いられる発現ベクターはｍＲＮＡ発現に影響し得る転写終結に必要な配列を含有するであろう。これらの領域はタンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分のポリアデニル化セグメントとして転写される。３’ 側の非翻訳領域もまた転写終結部位を含む。発現ベクターは選択マーカーと呼ばれることもある選択遺伝子を含有していてよい。哺乳類細胞に適当な選択マーカーの例にはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ、これはｐＪＯＤ−１０［ＡＴＣＣ６８８１５］のＢｇｌII／Ｈｉｎｄ III制限断片から誘導することができる）、チミジンキナーゼ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼはｖＰ−５クローン［ＡＴＣＣ２０２８］のＢａｍＨＩ断片に含まれる）またはネオマイシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子（ｐＮＮ４１４酵母人工染色体ベクター［ＡＴＣＣ３７６８２］から得られる）がある。そのような選択マーカーが哺乳類宿主細胞中に首尾よく転移すると、トランスフェクションされた哺乳類宿主細胞は選択圧下に置かれても生存することができる。広く用いられる２つの異なるカテゴリーの選択的体制が存在する。第１のカテゴリーは細胞の代謝および補足培地なしに生育する能力が欠如した突然変異細胞株の利用に基づくものである。２つの例は：ＣＨＯＤＨＦＲ^-細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ −９０９６）およびマウスＬＴＫ^-細胞（Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）ＡＴＣＣＣＣＬ− ２．３）である。これらの細胞はチミジンまたはヒポキサンチンのような栄養素を加えることなしに生育する能力を欠いている。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経路に必要な特定の遺伝子を欠いているために、欠失ヌクレオチドが補足培地中に供給されなければ生存できない。培地を補足することの代替法は完全なＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子をそれぞれの遺伝子を欠いている細胞へ導入することであり、これによりこれらの細胞の生育要求性を変える。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子によって形質転換されなかった個々の細胞は補足されていない媒地中では生存能力がない。第２のカテゴリーは優性選択であって、いかなる細胞タイプにおいても用いられる選択機構を意味し、突然変異細胞株の利用を必要としない。これらの機構では典型的に薬剤をもちいて宿主細胞の生育を阻止する。新規遺伝子を有するこれらの細胞は薬物耐性を付与するタンパク質を発現し、その選択に生き残るであろう。そのような優性選択の例では薬物ネオマイシン（Southern P．およびBerg,P ．J．Molec．Appl．Genet．1: 327(1982)）、ミコフェノール酸（Mulligan,R．C ．およびBerg，P.，Science 209:1422(1980)）、またはハイグロマイシン（Sugd en，B．ら、Mol．Cell．Biol．5:410-413(1985)）を用いる。上記の３例は真核生物性調節下に細菌遺伝子を用いてそれぞれ適当な薬剤Ｇ４１８またはネオマイシン（ジェネチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性をもたらす。真核生物性発現に好ましいベクターはｐＲｃ／ＣＭＶである。ｐＲｃ／ＣＭＶはインビトロジェン・コーポレーション、3985 Sorrento Valley Blvd.，San Di ego，CA 92121から商業的に入手可能である。構築プラスミド中の配列が正確か確認するため、連結反応混合物を用いて大腸菌Ｋ１２株ＤＨ１０Ｂ（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換し、抗生物質耐性によって上首尾の形質転換体を適切に選択する。形質転換体由来プラスミドを調製し、制限および／またはMessing,ら、Nucleic Acids Res．9:309（1981）の手法による配列によって分析する。宿主細胞は本発明の発現ベクターを用いて形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択または遺伝子の増幅に適当であるように修飾した慣用的栄養培地において培養することができる。その培養条件、例えば温度、ｐＨなどは以前に発現に対して選択した宿主細胞で用いた条件であり、これは当業者には明らかであろう。細胞を上記ベクターを用いて形質転換する技術は当分野に周知であり、Maniatis,ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor ,New York（1989）、またはCurrent Protocols in Molecular Biology（1989）および補遺のような概説参考文献に記載されている。高等真核生物において特許請求しているタンパク質をコードするベクターの発現に好ましい適当な宿主細胞は：ＳＶ４０によって形質転換されるアフリカミドリザル腎細胞株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ−１６５１）；形質転換ヒト初期胚腎細胞株２９３（Graham，F．L．ら、J．Gen Virol．36:59-72（1977）、Viro logy 77:319-329、Virology 86:10-21）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）、ＡＴＣＣＣＣＬ−１０、Virology16:147(1962））；チャイニーズハムスタ一卵巣細胞ＣＨＯ−ＤＨＦＲ-（ＡＴＣＣＣＲＬ−９０９６）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、ＡＴＣＣＣＲＬ−１７１５、Biol．Reprod．23 :243-250(1980)）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト頸部上皮がん腫細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣＣＣＬ−２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ−３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ−１４４２）、ヒト２倍体肺細胞（ＷＩ −３８、ＡＴＣＣＣＣＬ−７５）、ヒト肝細胞がん腫細胞（ＨｅｐＧ２、ＡＴＣＣＨＢ−８０６５）、およびマウス乳腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）などを含む。原核生物に加えて、酵母培養物のような単細胞真核生物もまた用いられる。たくさんの他の株も一般に利用可能であるがサッカロミセスセレビシエ（すなわち一般パン酵母）が最も一般的に用いられる真核微生物である。サッカロミセスにおける発現には、例えばプラスミドＹＲｐ７（ＡＴＣＣ−４００５３、Stinchco mb,ら、Nature 282:39（1979）；Kingsmanら、Gene 7:141(1979)；Tschemperら、Gene10:157(1980)）が一般的に用いられる。このプラスミドはトリプトファン中で生育する能力の欠如した酵母突然変異株、例えばＡＴＣＣｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１（Jones，Genetics85:12(1977)）に対する選択マーカーを供給するｔｒｐ遺伝子をすでに含有している。酵母宿主と共に用いる適当なプロモーター配列には３−ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（プラスミドｐＡＰ１２ＢＤＡＴＣＣ５３２３１上に見られ、米国特許第４，９３５，３５０号、１９９０年６月１９日に記載されている）または他の解糖系酵素、例えばエノラーゼ（プラスミドｐＡＣ１ＡＴＣＣ３９５３２上に見られる）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（プラスミドｐＨｃＧＡＰＣ１ＡＴＣＣ５７０９０、５７０９１に由来）、ジモモナスモビリス（１９９１年５月１９日発行の米国特許第５，０００，０００号）、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのプロモーターがある。生育条件によって制御されるさらに別の転写上の利点をもつ誘導性プロモーターを含有する他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン（プラスミドベクタ−ｐＣＬ２８ＸｈｏＬＨＢＰＶＡＴＣＣ３９４７５上に含まれる、米国特許第４，８４０，８９６号）、グリセルアルデヒド３− リン酸デヒドロゲナーゼおよびマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素（プラスミドｐＲＹ１２１ＡＴＣＣ３７６５８上に見られるＧＡＬ１）のプロモーター領域である。酵母での発現に用いる適当なベクターおよびプロモーターはR.Hitzemanら、欧州特許公開第７３，６５７Ａ号にさらに記載されている。サッカロミセスセレビシエ由来ＵＡＳＧａｌ（プラスミドＹＥｐｓｅｃ−− ｈＩ１ｂｅｔａＡＴＣＣ６７０２４上のＣＹＣ１プロモーターと連結して見られる）のような酵母エンハンサーもまた酵母プロモーターと共に都合よく用いられる。製造例１所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドをＰｍｌＩおよびＢｓｕ３６Ｉを用いて消化する。これらの酵素の認識配列は同タンパク質のコーディング領域内のヌクレオチド第２７５位および第３６０位にそれぞれ存在する。クローニングベクターはこれらの認識配列を含まない。結果的に、ＰｍｌＩおよびＢｓｕ３６Ｉを用いた制限酵素消化後、２つの断片のみがみられ、そのうち１つはベクター断片に相当し、もう１つはタンパク質コーディング配列内から遊離した〜８５塩基対断片に相当する。この配列は本発明の第９１位および第１１６位の間のアミノ酸置換体をコードするいかなるＤＮＡ配列によっても置き換えることができる。これらのＤＮＡ配列は相補的塩基ならびに、ＰｍｌＩおよびＢｓｕ３６Ｉを用いる消化によって生成する末端と適合する末端を伴う２つのオリゴヌクレオチドとして化学的に合成する。これらの化学的に合成したオリゴヌクレオチドを当モル量（１〜１０ピコモル／μl）で混合し、９５℃にまで加熱し、２０〜２５℃にまでゆっくりと温度を下げることによってアニーリングする。このアニーリングしたオリゴヌクレオチドを標準的連結反応に用いる。実施例１に記載の通りに連結産物によって形質転換し、分析する。他の置換体は適当な制限部位を用いる類似の手法で行うのが好ましい。製造例２ＭｅｔＡｒｇリーダー配列をもつ配列番号６をコードするＤＮＡ配列は製造例１に記載のプラスミドおよび手法を用いて得た。プラスミドはＰｍｌＩおよびＢｓｕ３６Ｉで消化した。配列５”−配列番号１４：の合成ＤＮＡ断片は配列５’−配列番号１５：とアニーリングし、ＰｍｌＩおよびＢｓｕ３６Ｉ部位の間に挿入した。連結、形質転換およびプラスミドの単離に続いて、合成断片の配列をＤＮＡ配列分析によって確認した。上記ベクターを用いて細胞を形質転換する技術は当分野に周知であり、Maniat is,ら、（1988）Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NewYorkまたはCurr ent Protocol sin Molecular Biology（1989）および補遺のような概説参考文献に記載されている。本明細書に例示するような本発明の好ましい実施態様において用いる大腸菌細胞の形質転換を含む技術は当分野に周知である。形質転換した大腸菌細胞を培養する正確な条件は大腸菌宿主細胞株の性質および用いる発現ベクターもしくはクロ−ニングベクターに依存する。例えば、ｃ１８５７熱誘導性ラムダファージプロモーターオペレーター領域のような熱誘導性プロモーターオペレーター領域を包含するベクターはタンパク質合成を誘導するために培養条件の温度を約３０℃から約４０℃に変える必要がある。本発明の好ましい態様において、大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８細胞を宿主細胞として用いたが、多数の他の細胞株、例えば大腸菌Ｋ１２Ｌ２０１、Ｌ６８７、Ｌ６９３、Ｌ５０７、Ｌ６４０、Ｌ６４１、Ｌ６９５、Ｌ８１４（大腸菌Ｂ）（これに限定されないが）も利用できる。次いで形質転換した宿主細胞を発現プラスミドに存在する耐性遺伝子に対応する抗生物質の選択圧下、適当な培地のプレートにまく。次いで用いた宿主細胞株に適当な時間および温度で培養物をインキュベートした。大量細菌発現系において発現されるタンパク質は大量の過剰発現タンパク質を含有する細粒または封入体に凝集することが特徴である。Kreugerら、in Prote in Folding,GieraschandKing,eds.，pgs136-142(1990)，American Association for the Advancement of Science Publication No.89-18S,Washington,D．C．。そのようなタンパク質凝集体はさらに精製したり、所望のタンパク質産物を単離したりするために溶解しなければならない。（前掲）。タンパク質を溶解するためには、グアニジン塩酸のような強い変性溶液および／または尿素のような弱い変性溶液を用いる種々の技術が用いられる。溶液中の変性試薬を徐々に除去すること（しばしば透析によって）によって変性タンパク質に天然のコンフォメーションをとらせることができる。変性および折りたたみ状態に対する特定の条件は、特定のタンパク質発現系および／または問題のタンパク質によって決まる。製造例３ＭｅｔＡｒｇリーダー配列を伴う配列番号６のタンパク質を大腸菌内で発現させ、得られた微粒を８Ｍ尿素および５ｍＭシステイン中で単離した。このタンパク質を８Ｍ尿素中、陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製し、８Ｍ尿素（５ｍＭシステインを含む）中への希釈およびＰＢＳに対する完全透析によつて折りたたませた。どちらの手法の場合もタンパク質の凝集は全くないか、ほとんどみられなかった。サイズ排除クロマトグラフィーによる最終精製後、このタンパク質をＰＢＳ中３〜３．５ｍｇ／ｍlに濃縮した。製造例４および５配列番号２および６のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、引用によって本明細書中に包含されるBasinskiら、ＷＯ９６／２３５１５およびＷＯ９６／２３５１７に記載のようにして製造した。ＤＮＡ配列は米国特許第５，１２６，２４９号（これは引用によって本明細書に包含される）に記載のようにＭｅｔ−ＡｒｇまたはＭｅｔ−Ｔｙｒをコードするジペプチドのリーダー配列を伴って発現されるのが好ましい。このアプローチはタンパク質の効率的発現を容易にし、カテプシンＣまたは他のジペプチジルペプチダーゼを用いて敏速に活性タンパク質型に変換することができる。タンパク質の精製は当分野に既知の逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除などの技術によって行う。以下の実施例および製造例は単に本発明製剤の製造を例示するためのものである。本発明の範囲は単に以下の実施例のみからなると考えるべきではない。実施例１肥満症タンパク質類似体製剤最低イオン強度を有する配列番号６のタンパク質（今後ここでは、タンパク質番号６とする）溶液を作成するために、まず凍結乾燥した固形物質を水に溶解してストック溶液（ストック１）を作成した。ストック１中のタンパク質番号６濃度は、最大スペクトル吸光度（２７９ｎｍまたは２８０ｎｍ）でのタンパク質番号６に対する既知の吸光係数を用い、最大スペクトル吸光度（２７９ｎｍまたは２８０ｎｍ）を測定し、希釈因子を利用してＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計によって確かめた。ｍ−クレゾールを含有するストック保存剤溶液は例えばその正味の液状物を水に溶解することによって調製した（ストック２）。ストック１を必要量の水といっしょにアルカリ性ｐＨ（７．８±０．１）でストック２を含む容器に加えることによって１．６ｍｇ／ｍlタンパク質番号６溶液を調製し、絶対に必要であっても、ごく微量μlの塩酸または水酸化ナトリウムを用いてそのｐＨを調節した。室温で適当な時間（３０分間）インキュベートした後、溶液のｐＨを検査し、絶対に必要であってもごく微量μlの塩酸または水酸化ナトリウムで調節し、０．３％ｍ−クレゾールを含み、ｐＨ７．８±０．１の１．６ｍｇ／ｍlタンパク質番号６溶液を得た。次いでこの溶液を０．２２μｍシリンジフィルターのついたガラスシリンジを用いて、手でガラスバイアル中へ濾過した。標品の最低イオン強度（０ｍＭに近い）を確認するために、ストック１が不存在という点以外ではタンパク質番号６溶液に対応したブランク溶液（ブランク）を調製した。エポキシコーティングプラチナ（Ｐｔ）または金（Ａｕ）に浸した細胞を用いて電気伝導度メーターを較正し、次いで広範な塩化カリウム（ＫＣＩ）溶液のシリーズと標準化した。ブランク溶液をＫＣｌ標準溶液と同じ手法で検査し、ＫＣｌ標準データを単純１次的に合わせることから得られた方程式から数学的にその電気伝導度を求めた。実施例２肥満症タンパク質類似体製剤最低イオン強度を有する配列番号６のタンパク質（今後ここでは、タンパク質番号６とする）溶液を作成するために、まず凍結乾燥した固形物質を水に溶解してストック溶液（ストック１）を作成した。ストック１中のタンパク質番号６濃度は、最大スペクトル吸光度（２７９ｎｍまたは２８０ｎｍ）でのタンパク質番号６に対する既知の吸光係数を用い、最大スペクトル吸光度（２７９ｎｍまたは２８０ｎｍ）を測定し、希釈因子を利用してＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計によって確かめた。ｍ−クレゾールを含有するストック保存剤溶液は、例えばその正味の液状物を水に溶解することによって調製した（ストック２）。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）のクトック溶液（典型的には０．１Ｍまたは０．２Ｍ）をその固形物を水に溶解することによって調製した（ストック３）。ストック１を必要量の水といっしょにアルカリ性ｐＨ（７．８±０．１）でストック２を含む容器に加えることによって１．６ｍｇ／ｍlタンパク質番号６溶液を調製し、絶対に必要であっても、ごく微量μｌの塩酸または水酸化ナトリウムを用いてそのｐＨを調節した。室温で適当な時間（３０分間）インキュベートした後、ストック３を加え、溶液に低い追加のイオン強度を付与した。そのｐＨを検査し、絶対に必要であってもごく微量μlの塩酸または水酸化ナトリウムで調節し、０．３％ｍ−クレゾールを含み、ｐＨ７．８±０．１で低イオン強度、例えば約２．５ｍＭの１．６ｍｇ／ｍlタンパク質番号６溶液を得た。次いでこの溶液を０．２２μｍシリンジフィルターのついたガラスシリンジを用いて、手でガラスバイアル中へ濾過した。標品の低イオン強度（およそ２〜３ｍＭ）を確認するために、ストック１が不存在という点以外ではタンパク質番号６溶液に対応したブランク溶液（ブランク）を調製した。エポキシコーティングプラチナ（Ｐｔ）または金（Ａｕ）に浸した細胞を用いて電気伝導度メーターを較正し、次いで広範な塩化カリウム（ＫＣｌ）溶液のシリーズと標準化した。ブランク溶液をＫＣｌ標準溶液と同じ手法で検査し、ＫＣｌ標準データを単純１次的に合わせることから得られた方程式から数学的にその電気伝導度を求めた。実施例３肥満症タンパク質類似体製剤配列番号６のタンパク質（今後ここではタンパク質番号６とする）溶液を作成するために、中性水溶液から凍結乾燥した大きな固形物質を水に再溶解してストック溶液（ストック１）を作成した。ストック１中のタンパク質番号６濃度は、最大スペクトル吸光度（２７９ｎｍまたは２８０ｎｍ）にタンパク質番号６に対する最大スペクトル吸光度（２７９ｎｍまたは２８０ｎｍ）での既知の吸光係数で割った希釈因子を掛けることによってＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計によって確かめた。ｍ−クレゾールを含有するストック保存剤溶液は、例えばその正味の液状物を水に溶解することによって調製した（ストック２）。グリセリンのような等張性試薬のストックはその正味の液状物を水に溶解することによって調製した（ストック３）。ストック１をストック３および必要量の水といっしょに塩基性ｐＨ（７．８±０．１）で、ストック２を含む容器に加えることによって１．６ｍｇ／ｍlタンパク質番号６溶液を調製し、絶対に必要であっても、ごく微量μｌの塩酸または水酸化ナトリウムを用いてアルカリ性ｐＨ（７．８±０．３）に調節した。室温で適当な時間（３０分間）インキュベートした後、絶対に必要であってもごく微量μlの塩酸または水酸化ナトリウムでそのｐＨを再調節し、０．３％ｍ−クレゾールおよび１６ｍｇ／ｍlグリセリン含み、ｐＨ７．８±０．１の１．６ｍｇ／ｍlタンパク質番号６溶液を得た。次いでこの溶液を０．２２μｍシリンジフィルターのついたガラスシリンジを用いて、手でガラスバイアル中へ濾過した。標品の最低イオン強度（０ｍＭに近い）を確認するために、ストック１が不存在という点以外ではタンパク質番号６溶液に対応したブランク溶液（ブランク）を調製した。エポキシコーティングプラチナ（Ｐｔ）または金（Ａｕ）に浸した細胞を用いて電気伝導度メーターを較正し、次いで広範な塩化カリウム（ＫＣｌ）溶液のシリーズと標準化した。ブランク溶液をＫＣｌ標準溶液と同じ手法で検査し、ＫＣｌ標準データを単純１次的に合わせることから得られた方程式から数学的にその電気伝導度を求めた。実施例４肥満症タンパク質類似体製剤配列番号６のタンパク質（タンパク質番号６）溶液を作成するために、中性水溶液から凍結乾燥した大きな固形物質を水に再溶解してストック溶液（ストック１）を作成した。ストック１中のタンパク質番号６濃度は、最大スペクトル吸光度（２７９ｎｍまたは２８０ｎｍ）にタンパク質番号６に対する最大スペクトル吸光度（２７９ｎｍまたは２８０ｎｍ）での既知の吸光係数で割った希釈因子を掛けることによってＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計によって確かめた。ｍ−クレゾールを含有するストック保存剤溶液は、例えばその正味の液状物を水に溶解することによって調製した（ストック２）。グリセリンのような等張性試薬のストックはその正味の液状物を水に溶解することによって調製した（ストック３）。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）のストック溶液（典型的には０．１Ｍまたは０．２Ｍ）をその固形物を水に溶解することによって調製した（ストック４）。ストック１を必要量の水と塩基性ｐＨ（７．８±０．１）で、ストック２をストック３といっしょに含む容器に加えることによって１．６ｍｇ／ｍlタンパク質番号６溶液を調製し、絶対に必要であっても、ごく微量μlの塩酸または水酸化ナトリウムを用いてそのｐＨを調節した。室温で適当な時間（３０分間）インキュベートした後、ストック４を加え、溶液に低い追加のイオン強度を付与した。そのｐＨを検査し、絶対に必要であってもごく微量μlの塩酸または水酸化ナトリウムで再調節し、０．３％ｍ−クレゾールおよび１６ｍｇ／ｍlグリセリン含み、ｐＨ７．８±０．１で低イオン強度、およそ２．５ｍＭの１．６ｍｇ／ｍlタンパク質番号６溶液を得た。次いでこの溶液を０．２２μｍシリンジフィルターのついたガラスシリンジを用いて、手でガラスバイアル中へ濾過した。標品の低イオン強度を確認するために、ストック１が不存在という点以外ではタンパク質番号６溶液に対応したブランク溶液（ブランク）を調製した。エポキシコーティングプラチナ（Ｐｔ）または金（Ａｕ）に浸した細胞を用いて電気伝導度メーターを較正し、次いで広範な塩化カリウム（ＫＣｌ）溶液のシリーズと標準化した。ブランク溶液をＫＣｌ標準溶液と同じ手法で検査し、ＫＣｌ標準データを単純１次的に合わせることから得られた方程式から数学的にその電気伝導度を求めた。本発明の原理、好ましい態様および実施様式は前記の明細書に記載したとおりである。しかし、開示した特定の形態は制限的よりむしろ例示的とみなされるべきであり、本明細書中保護を意図する発明はこれに限定されると考えるべきではない。本発明の概念から離れることなく当業者によってバリエーションおよび変化を加えることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ )，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ (72)発明者ミリカン，ローン・エル・ジュニアアメリカ合衆国46254インディアナ州インディアナポリス、ディアクリーク・アベニュー 5319番 (72)発明者ペカー，アレン・エイチアメリカ合衆国46220インディアナ州インディアナポリス、ノース・パーク・アベニュー 5354番

Claims

【特許請求の範囲】１．肥満症タンパク質類似体および保存剤を含み、約１０ｍＭより低いイオン強度を有している可溶性非経口製剤。２．イオン強度が約５ｍＭより低い請求項１に記載の製剤。３．イオン強度が約１ｍＭより低い請求項２に記載の製剤。４．肥満症タンパク質類似体および、フェノール、クレゾールもしくはこれらを組み合わせたものからなる群から選択される保存剤を含み、１０ｍＭより低いイオン強度を有している可溶性非経口製剤。５．保存剤がフェノール、ｍ−クレゾールまたはこれらを組み合わせたものからなる群から選択される請求項４に記載の製剤。６．肥満症タンパク質類似体の濃度が約１．０ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌである請求項５に記載の製剤。７．イオン強度が５ｍＭより低い請求項６に記載の製剤。８．肥満症タンパク質類似体の濃度が約１．０ｍｇ／ｍｌから約５０．０ｍｇ／ｍｌである請求項７に記載の製剤。９．さらに等張性試薬を含む請求項８に記載の製剤。１０．さらに生理的に許容される緩衝液を含む請求項９に記載の製剤。１１．肥満症タンパク質類似体の濃度が１．０〜１０ｍｇ／ｍｌであり、保存剤がｍ−クレゾールであり、生理的に許容される緩衝液が約１．４ｍＭより低い濃度のリン酸ナトリウムである請求項１０に記載の製剤。１２．肥満症タンパク質類似体が配列：を有する肥満症タンパク質類似体または医薬的に許容されるその塩であり、あるいは肥満症タンパク質類似体が配列：を有する肥満症タンパク質類似体または医薬的に許容されるその塩であり、同肥満症タンパク質類似体が第９６位のＣｙｓおよび第１４６位のＣｙｓの間にジスルフィド結合を有している、請求項１〜１１のいずれかに記載の製剤。１３．請求項１〜１２のいずれかに記載の可溶性非経口製剤の製造方法であって、肥満症タンパク質類似体および保存剤を同製剤が約１０ｍＭより低いイオン強度を有するように混合することを特徴とする方法。１４．肥満症の処置を必要としている哺乳類における肥満症の処置方法であって、同哺乳類に請求項１〜１２のいずれかに記載の可溶性非経口製剤を投与することを特徴とする方法。１５．肥満症の処置に用いるための請求項１〜１２のいずれかに記載の製剤。