JP2000505802A - ワクチン接種の新規な方法、ならびにそのための、第１のエピトープをコードする核酸および第２のエピトープを含有するペプチドを含むワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、哺乳動物に疾患のワクチン接種をするための方法および組成物に関する。ここで、(i)第１のエピトープをコードする核酸、および(ii)第２のエピトープ含むペプチドを含む混合物が、この核酸および第２のエピトープの両方がその哺乳動物のプロフェッショナル抗原提示細胞によって取り込まれ、そして核酸がこの細胞において発現されるように投与される。そして、第１および第２のエピトープは、その細胞において、免疫応答がその哺乳動物においてこれらエピトープに対して惹起されるようにプロセシングされる。

Description

【発明の詳細な説明】 ワクチン接種の新規な方法、ならびにそのための、第１のエピトープをコード する核酸および第２のエピトープを含有するペプチドを含むワクチン発明の分野 本発明は、細胞のトランスフェクションを含む、ワクチンおよびワクチン接種 の方法に関する。発明の背景 特定の疾患について、感染性因子への最初の曝露がその後の感染に対する生涯 の免疫を付与することが観察されて以来、ワクチン接種は、重要な医療追求行為 である。ワクチンは、特定の病原性生物(例えば、ウイルス、細菌、真菌、およ び寄生生物)による感染に対して個体に免疫を確立するために長年使用されてい る。 初期のワクチンは、それらの免疫原性を維持した生の生物または殺傷した生物 に依存していた。特定の病原体の構造および機能ならびに適応免疫の機構のより 十分な理解は、より安全でより指向性のワクチンの設計を可能にしてきた。例え ば、Ｂ型肝炎ウイルスに対する現在のワクチンは、完全な生物よりむしろ、ウイ ルス表面抗原の一部分のみを使用する接種に依存する。このような指向性ワクチ ンはより少ない副作用を導き、そして保護的でない(すなわち、長期の免疫を付 与しない)、抗原に対する望まれない免疫応答を回避する。 進歩したワクチン設計は、組換えDNA技術および遺伝子治療概念を使用し、DNA ワクチンを提供する。ここでは、哺乳動物細胞における所望の免疫原の発現用の ベクターが被験体に注射される。このベクターは、注射部位付近の細胞に取り込 まれ、次いでインサイチュで免疫原を発現するよう作動し、続いて保護的免疫応 答を導く。 DNAワクチンの使用に関連する問題は、これまでは、ベクターが代表的に注射 される組織(すなわち、筋肉)が、通常、抗原提示に関連しないということである 。 その結果、DNAワクチンは高度に効果的な免疫応答を生じない。 得られる抗原提示が、適応免疫系の実質的にすべての成分を活性化し得る(す なわち、抗体、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、ま たはマクロファージに媒介されようが、特定の病原体と戦うに必要な免疫応答を 惹起し得る)ような細胞への複合体抗原の送達に適切な方法および特定化された 遺伝子送達ビヒクルに対する必要性が存在する。発明の要旨 本発明は、第１のエピトープをコードする核酸および第２のエピトープを含む ペプチドを含有する複合体の抗原提示細胞への送達を介して、長期持続免疫を得 るための方法および組成物を提供する。 抗原提示細胞は、クラスＩまたはクラスIIMHC分子のいずれかと共に、Ｔ細胞 に対して抗原の抗原性エピトープを提示する。内因的に合成されたタンパク質は 、一般に、クラスＩと共に提示され、一方、環境から取り込まれたタンパク質( 外因性に合成されたタンパク質)は、一般に、クラスIIと共に提示される。従っ て、ワクチンが、クラスＩおよびIIMHC分子の両方に必要とされる抗原の提示を 生じることは有益である。本発明は、抗原を抗原提示細胞に対して内因性に合成 されたタンパク質(すなわち、核酸によりコードされるエピトープ)および外因性 に合成されるタンパク質の形態で提供することによって、クラスＩおよびIIの両 方の提示の刺激を提供する。 ペプチドまたはポリペプチド形態のエピトープまたは抗原と共におよび第２の 核酸によりコードされるエピトープとの抗原提示細胞への二連送達は、増強され た免疫応答を生じると考えられる。 従って、本発明は、疾患に対して哺乳動物にワクチン接種をする方法を含む。 この方法は、哺乳動物に、(i)第１のエピトープをコードする核酸と、(ii)第２ のエピトープを含むペプチドとの混合物を投与し、その結果、核酸およびペプチ ドが、その哺乳動物のプロフェッショナル抗原提示細胞によって取り込まれ、そ してこの細胞において核酸が発現される工程を包含する。ここで、免疫応答は、 その哺乳動物において両エピトープに対して惹起される。 本発明はまた、疾患に対して哺乳動物にワクチン接種をする方法を含む。ここ で、投与される混合物は、(i)第１のエピトープをコードする核酸、および(ii) 第２のエピトープを含むペプチドを含有する複合体であり、その結果、この複合 体が、その哺乳動物のプロフェッショナル抗原提示細胞によって取り込まれ、そ してこの細胞において発現される。ここで、免疫応答は、その哺物において第１ および第２のエピトープに対して惹起される。 本発明はまた、疾患に対して哺乳動物にワクチン接種をする方法を含む。この 方法は、哺乳動物に、(i)第１のエピトープをコードする組換え核酸、および(ii )その抗原提示細胞に通常は存在しない第２のエピトープを含有する、プロフェ ッショナル抗原提示細胞を投与する工程を包含する。ここで、投与の際に、免疫 応答は、その哺乳動物において、両エピトープに対して惹起される。 本発明はまた、疾患に対して哺乳動物にワクチン接種をするための組成物を含 む。この組成物は、(i)第１のエピトープをコードする核酸およびそのベクター をエピソーム形態に維持することを可能にする配列を含むベクター、および(ii) 第２のエピトープを含むペプチドを含む複合体を含む。ここで、この組成物は、 抗原提示細胞への送達またはこの細胞における選択的発現について適合されてい る。 本発明はまた、疾患に対して哺乳動物にワクチン接種するための複合体を含む 。この複合体は、(i)第１のエピトープをコードする組換え核酸、および(ii)そ の抗原提示細胞に通常は存在しない第２のエピトープを含有する、プロフェッシ ョナル抗原提示細胞を含有する。 本発明は、疾患に対して哺乳動物にワクチン接種する方法を含む。この方法は 、哺乳動物に、(i)核酸および(ii)エピトープを含むペプチドを含む複合体を投 与し、その結果、この複合体が、哺乳動物のプロフェッショナル抗原提示細胞に よって取り込まれる工程を包含する。ここで、免疫応答は、その哺乳動物におい てエピトープに対して惹起される。 本発明のこの局面において、混合物における核酸の存在が、抗原提示細胞によ る、エピトープを含むペプチドの取り込みを促進し、その結果、このエピトープ に対する免疫応答を促進すると考えられる。 好ましくは、第１のエピトープは、感染性因子または生物に由来し、そして第 １のエピトープは、疾患の間にその哺乳動物中に存在する。 複合体は第２のエピトープをさらに含むこと、および第１および第２のエピト ープは同じ抗原のエピトープであるか、または同じ感染性因子もしくは生物のエ ピトープであることが好ましい。 例えば、第１および/または第２のエピトープは、インフルエンザNPの免疫優 性エピトープを含み得る。 複合体または混合物は、上記(ii)で言及されたペプチドに含有されるエピトー プとは異なるエピトープを含む第２のペプチドをさらに含むこともまた好ましい 。 複合体は、プロフェッショナル抗原提示細胞を標的化するための細胞標的化リ ガンドをさらに含み得る。 核酸は、エピトープを含むペプチドと密接に関連し、その結果、核酸が好まし くは縮合形態であることが好ましい。従って、第１のエピトープが、核酸結合性 アミノ酸配列に融合した第１のエピトープを含む２ドメインポリペプチド中に存 在することもまた好ましい。 本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」とは、免疫原性アミノ酸配列を いう。エピトープとは、６〜８アミノ酸の最小アミノ酸配列(すなわち、ペプチ ド)をいい得る。この最小配列は、その天然状況から取り出され、そして本発明 に従う複合体においてペプチドとして保有される場合、または異種ポリペプチド に翻訳され、その結果、それが天然の免疫原性を維持し、従って本発明に従う複 合体においてポリペプチドの部分として保有される場合、免疫原性である。エピ トープはまた、このエピトープを含む天然のポリペプチドが抗原といわれる場合 、免疫原性である、その天然のポリペプチドの一部分をいい得る。もちろん、ポ リペプチドまたは抗原は、１またはそれ以上の別個のエピトープを含み得る。エ ピトープはまた、複数鎖のポリペプチドの(すなわち、別個のオープンリーディ ングフレームによってコードされる)免疫原性部分をいい得る。用語エピトープ 、ペプチド、およびポリペプチドはすべて、隣接するアミノ酸のαアミノ基およ びαカルボキシ基との間のペプチド結合により互いに結合した一連のアミノ酸を いい、そして改変(例えば、グリコシル化、側鎖酸化、またはリン酸)または改変 の ないことが免疫原性を破壊しなければ、このような改変を含んでも含まなくても よい。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチト」とは、ペプチドおよびポリ ペプチドの両方またはタンパク質をいうと意味される。 エピトープ(ペプチド、ポリペプチド、抗原)は、免疫原性をなお維持しながら 、できるだけ小さいことが所望される。免疫原性は、本明細書中に記載されるよ うに、免疫応答を惹起する能力、例えば、適切なMHC分子(すなわち、MHCクラス ＩまたはクラスII分子)と結合する能力、および、Ｔ細胞応答および抗原応答を 誘導する能力、例えば、所定のエピトープに対する細胞傷害性Ｔ細胞応答または 血清抗体応答を測定することによって示される。 本明細書中で使用される場合、用語「抗原」または「免疫原」とは、免疫原性であ り、すなわち、哺乳動物において免疫応答を惹起し得、従って少なくとも１つの エピトープを含みそして複数のエピトープを含み得る、ペプチド、タンパク質、 ポリペプチドをいう。本発明に従えば、「病原体」、「生物」、または「因子」は、本 発明に従ってワクチン接種が所望される疾患を引き起こし得る。本明細書中で使 用される場合、これらの用語は、ウイルス、細菌、真菌、または寄生物をいう。 用語「因子」はまた、腫瘍抗原または自己免疫に関連する抗原のような抗原をいい 得る。本発明は、抗原性を達成するための病原体全体またはそのゲノム全体の投 与を意図しない。従って、用語「エピトープ」は、それが病原体全体をいわない範 囲に限定される。 「免疫応答」とは、細胞性または体液性のいずれかの免疫応答、または細胞性お よび体液性の両方の免疫応答をいう。 送達ビヒクルによって標的細胞に送達される抗原性ペプチドまたはタンパク質 は、外因性に合成された抗原としてプロセシングされ、そしてエピトープは、ク ラスII拘束Ｔ細胞に対してクラスIIMHC分子とともに優勢に提示されると考えら れる。送達ビヒクルの核酸によってコードされる抗原は、内因的に合成され、そ してこの抗原のエピトープはクラスIMHC分子とともに優勢に提示される。MHCク ラスＩおよびII両分子とともに提示することにより、強力な免疫応答が確実にな る。 核酸にコードされた抗原は、プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)において のみ発現されることが、本発明に従えば好ましい。 本発明に従えば、核酸がコードする抗原が、プロフェッショナル抗原提示細胞 (APC)においてのみ発現されることが好ましい。 本明細書中で使用される場合、用語「プロフェッショナル抗原提示細胞」とは、 MHCクラスIIを有する細胞(すなわち、MHCクラスIIを発現するか、またはクラスI Iを発現するように誘導され得る細胞)をいう；このような細胞には、Ｂリンパ球 、濾胞性樹状細胞以外の樹状細胞、マクロファージ、内皮細胞、貪食白血球、単 球、または単球由来細胞、クップファー細胞、ランゲルハンス細胞、またはこれ らの幹細胞または他の前駆体細胞、およびクラスIIを発現するかまたはMHCクラ スIIを発現するよう誘導され得るかのいずれかの他の細胞が含まれる。 遺伝子のAPCまたは関連する細胞に限定された発現は、以下の２つの方法で達 成され得る。1)送達ビヒクルをAPCまたは関連する細胞にのみ標的化すること、 および/または2)抗原をコードする遺伝子の発現をAPCまたは関連する細胞に限定 すること。 本発明に従えば、複合体は、細胞表面上のレセプターを標的化するための標的 化リガンドをさらに含み得ることが意図される。例えば、遺伝子の発現がAPCに 限定されるかまたはAPCにのみに特異的に限定される場合、標的化された送達は 、非APCおよびAPCに対して非特異的に達成され得る。 従って、本発明の複合体は、哺乳動物のプロフェッショナル抗原提示細胞を特 異的に標的化するよう適合され、そして/または核酸は、プロフェッショナル抗 原提示細胞において特異的に発現されるよう適合される。 用語「プロフェッショナル抗原提示細胞を特異的に標的化する」とは、複合体が APCに標的化され、従って送達が実質的にAPCに限定される状況をいう。しかし、 当業者は、標的化が完全に生じることはたまにしかなく、いくつかの送達は標的 化されていない細胞に生じることを認識する。この用語は、APCへの送達が、他 の細胞タイプに比して、好ましくは、約２倍以上増加している場合をいう。 APC、その幹細胞または他の前駆体細胞タイプへ標的化された送達は、レセプ ター媒介遺伝子移入によって達成され得る。以下の例の標的化リガンドを含む送 達ビヒクル：(ａ)造血幹細胞用には、抗CD34モノクローナル抗体、または幹細胞 因子(c-KitまたはCD117)、あるいはflk-2リガンド(ヒトホモログSTK−1)；(ｂ) 単球/マクロファージ/樹状細胞前駆体用には、抗CD33モノクローナル抗体；(ｃ) 分化したマクロファージ/樹状細胞用には、マンノース基を有するグリコシル化D NA結合ペプチドが、特異的なレセプター(例えば、マンノースレセプター)に標的 化するために使用され得る；および(ｄ)MHCクラスIIを有する細胞用には、MHCク ラスIIタンパク質の定常領域に特異的である抗体、またはMHCクラスIIと結合す るリガンド(例えば、可溶性CD4)；例えば、MHCクラスII保有細胞の１つのサブセ ット(Ｂリンパ球）は、可溶性CD4を使用するか、あるいはCD80、CD19もしくはCD 22に対する抗体またはこれらのリガンドを使用して標的化され得る；内皮細胞用 には、γインターフェロンおよび血管内皮細胞増殖因子(VEGF)レセプター；なら びに(ｅ)APCまたはＴ細胞用には、同時剌激性分子(それぞれ、例えば、B7−1，B 7-2、またはCD28、CTLA-4)のリガンドまたはこれらに対する抗体。これらの標的 化リガンドは、標的化機能に加えて、APCへの同時刺激性シグナルを増大させる こと、および、従ってAPCの活性化を増大させることを含む二重の役割を演じ得 る。 標的付けられた複合体の使用に代えるかまたは加えて、APC、その幹細胞また は他の前駆体細胞タイプにおいて発現を導くDNA調節エレメントが利用され得る 。 用語「プロフェッショナル抗原提示細胞において特異的に発現される」とは、核 酸の発現が実質的にAPCに限定されている状況をいう。従って、この用語は、核 酸の発現がAPCに優勢に限定されている状況、例えば、核酸の発現が生じる細胞 の約50％、そして好ましくは80％〜100％がAPCである状況を含む。 本発明に従えば、核酸にコードされる抗原が、プロフェッショナル抗原提示細 胞(APC)においてのみ優勢に発現されることがさらに意図される。 好ましい調節エレメントには、MHCクラスIILCRのような遺伝子座制御領域(LCR )が含まれる。 本発明は、免疫応答を惹起し得る任意のタンパク質またはペプチドの提示を引 き起こすために使用され得る。 本発明は、それに対する免疫応答が測定され得る任意の感染性因子に適用可能 である。本発明はまた、それに対する免疫応答が有益である他の疾患標的(例え ば、腫瘍)に適用可能である。従って、本発明は、任意の感染性因子または疾患 標的のエピトープをコードする配列の使用を意図する。 好ましくは、このエピトープは、キーエピトープ(すなわち、完全なポリペプ チド配列か、または特定の感染性因子もしくは疾患に対して強力な免疫応答を生 じるエピトープかのいずれか)である。好ましいエピトープの例としては、イン フルエンザ核タンパク質(NP)遺伝子のペプチドエピトープ、HIVのtat、rev、gag 、およびnef成分、ならびにHPVのE6およびE7タンパク質由来のエピトープが挙げ られる。さらなる好ましいエピトープは、寛容を惹起することが見出されたエピ トープ(例えば、慢性関節リウマチに関与するコラーゲン)である。 １より多いエピトープが、免疫応答の可能性を増大させるために、遺伝子によ ってコードされ得る。このことは、保護的免疫応答を生じるキーエピトープが同 定されていない場合、特に重要である。従って、本発明のさらなる局面において 、核酸は、特定の感染性因子もしくは疾患に対して免疫応答を惹起し得る、１よ り多いエピトープをコードする。このことは、保護的免疫応答を生じるキーエピ トープが同定されていない場合、特に重要である。好ましくは、エピトープはポ リペプチドに存在し(すなわち、ポリペプチド抗原)、従ってポリペプチドは構築 物中にコードされる。好ましくは、構築物は、複数の抗原が協調して発現される 多遺伝子構築物である。 本発明のさらなる実施態様において、感染性因子に対する免疫応答が所望され る場合、送達ビヒクルのコード領域を形成するために、病原体のゲノムのすべて のオープンリーディングフレームが構築物中にともに配置される。このことは、 すべての抗原が存在し、従って免疫応答の可能性が増大するという利点を有する 。 基本的に、発現ライブラリーは病原体DNAから作製され、そしてこの発現ライ ブラリーは、免疫応答を惹起するために、送達ビヒクル中で、細胞へ送達される 。 本発明のさらなる実施態様において、異なる疾患もしくは感染性因子に特異的 な抗原をコードするDNA配列が、本発明の送達ビヒクルにおける発現のために、 構築物中にともに配置され得る。抗原は、単一遺伝子構築物もしくは複数遺伝子 構築物として配置される、タンパク質全体またはその複数もしくは単一のエピト ープであり得る。従って、送達手段は、DNA構築物内にコードされる抗原によっ て特定される多くの疾患に対して免疫保護を提供する。 本発明のさらなる実施態様において、送達ビヒクルは、抗原性ペプチド/タン パク質成分の混合物を含み得る。これらは同じ抗原に由来し得るか、同じ感染性 因子もしくは疾患に由来する異なる抗原であり得るか、または異なる感染性因子 もしくは疾患に由来し得る。従って、複合体もしくは混合物は、多くの抗原およ び、おそらく、送達系の抗原性ペプチド/タンパク質成分によって特定される多 くの感染性因子もしくは疾患に対して免疫応答を惹起する。 本発明のさらなる実施態様において、複合体もしくは混合物の抗原性成分は、 エピトープもしくは抗原に対する適切な免疫応答の発生のため、グリコシル化の 必要に応じてグリコシル化されてもよいし、またはされなくてもよい。 本発明のさらなる実施態様において、複合体または混合物の抗原もしくは抗原 性成分をコードするDNAは、その抗原の最も免疫優性なエピトープを必ずしもコ ードしなくともよい。これらは、感染性因子もしくは疾患の異なる株間でより高 度に保存されているエピトープであり得るか、または制限された変異改変を有す るかもしくは変異改変をまったく有さないエピトープであり得る。抗原はまた、 抗原全体をカバーする一連のサブ遺伝子としてコードされ得るが、その抗原全体 は、必ずしも単一の遺伝子中にコードされなくてもよい。 本発明のさらなる実施態様において、DNAは、コードされた抗原、または送達 系のタンパク質/ペプチド成分に対する免疫応答をアップレギュレートする効果 を有するさらなる因子をコードし得る。さらなる因子は、免疫応答の特異的成分 の一般的なアップレギュレーションのためのサイトカイン(例えば、インターフ ェロンγ、IL-2、IL-4、IL-10、IL−12、およびGM-CSF；リンホカイン；または 同時刺激性分子(例えば、B7-1、B7-2、ICAM-1およびICAM-3))を含み得る。ある いは、各因子は、本発明に従う核酸および抗原と同時投与され得るか、または送 達複合体の一部分を形成するように抗原もしくは核酸結合ペプチドと結合され得 るので、本発明に従う複合体の混合物中にポリペプチド形態で含まれ得る。 本発明は、細胞へのベクターまたは核酸の送達(すなわち、送達ビヒクルの使 用)を包含する。本明細書中で使用される場合、句「細胞へベクターを送達するた めの手段」または「細胞への送達のために適合された手段」とは、核酸および核酸 に結合した抗原性ペプチドもしくはタンパク質を哺乳動物細胞へ送達することが 可能になる任意の手段(ウイルス性および非ウイルス性送達手段を含む)をいい、 これには、DNA/ポリカチオン複合体、自己凝集ウイルス様粒子、哺乳動物細胞へ 核酸を送達し得るウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、レトロウイルス 、およびアデノ随伴ウイルス)、細胞へのDNAもしくはタンパク質の送達に使用さ れるミクロスフェア(例えば、ポリラクチドグリコリドポリマー(polylactide gl ycolide polymer))、およびリポソームが含まれる。本発明に従う有用な送達手 段は、当業者に周知であり、そして本明細書中でさらに記載される。 特に好ましい送達ビヒクルは、細胞を特異的または非特異的に標的化するため のリガンドとさらにカップリングされ得るポリカチオン縮合核酸を含む送達ビヒ クルである。 従って、送達ビヒクルには、DNAと結合する核酸縮合化ペプチド(すなわち、DN A結合ペプチド)、例えば、ポリカチオン性ヘテロペプチドが含まれ得る。 本発明の別の実施態様において、複合体もしくは混合物は、必ずしも細胞への ベクターもしくは核酸の送達に関与しないが、抗原性であり、従って細胞への送 達ビヒクルの侵入の際に、哺乳動物において免疫応答を誘導するように働くペプ チドを含み得る。抗原性ペプチドは、DNA結合アミノ酸配列およびこの抗原性ペ プチドを含有する２ドメインペプチドの一部分であり得る。２つのドメインは、 ペプチド結合を介して融合されて融合ポリペプチドを形成し得る。ここで、抗原 性ドメインはアミノ末端であり、そしてDNA結合ドメインはカルボキシ末端であ るか、またはDNAドメインがアミノ末端であり、そしてDNA結合ドメインがカルボ キシ末端である。タンパク質がDNA結合ドメインおよびエピトープ(これに対する 免疫応答が所望される)もまた含む場合、このタンパク質は、本明細書中に記載 の２ドメインペプチドと本質的に等価であると考えられ得る。 あるいは、２つのドメインは、切断可能なリンカー(例えば、酸不安定結合)ま たはエンドソームプロテアーゼ(カテプシン)によって切断可能なペプチド配列に よって分離されていてもよい。別の実施態様において、エピトープは融合タンパ ク質の一部分ではなく、静電気的相互作用、疎水性相互作用、共有相互作用、ま たは他の相互作用によって、エピトープをコードする核酸を含む複合体にDNA結 合ドメインと共に、直接吸収されていることもまた意図され得る。 DNA結合ペプチドが、本発明の複合体もしくは混合物において使用される場合 、それが、２ドメイン融合ポリペプチドの一部分であるか、またはエピトープと 非共有結合しているかにかかわらず、このDNA結合ペプチドは、縮合反応におい て複合体もしくは混合物の核酸に結合し、従って複合体もしくは混合物のエピト ープ部分とこの核酸との密接な結合を可能にすると意図される。 本発明のさらなる実施態様において、抗原をコードする核酸配列は、細胞外へ 抗原を分泌するためのシグナル配列を含み得る。本発明において有用なシグナル 配列は、当業者に周知であり、そして例えばBlobelおよびDobberstein(1975)、J .Cell Biol.，67，852-862に記載される。分泌抗原は、分泌する細胞および他の 近辺の細胞によって取り込まれ、外因性抗原としてプロセシングされ、そしてク ラスIIMHCとともに提示される。本発明の送達ビヒクルは、あるものは分泌シグ ナル配列とともに、そしてあるものは分泌シグナル配列を含まずに、抗原をコー ドする核酸の混合物を含み得る。従って、分泌抗原および非分泌抗原は、同じ細 胞において産生され得、そしてクラスＩおよびクラスIIの両方のMHC提示は、一 回のトランスフェクション事象後に産生され得る。 送達ビヒクルの抗原成分としてまたは２ドメインペプチドにおいて有用な抗原 性ペプチドは、同じ生物または異なる生物(これに対して、DNAベースの免疫応答 が所望される)に由来し得る。この目的に好ましい抗原性ペプチドの例は、イン フルエンザ核タンパク質(NP)の免疫優性ペプチドエピトープである。 細胞へのこの送達ビヒクルの侵入に際して、免疫応答は、抗原性ペプチドに対 して惹起される。続いて、免疫応答は持続し、そして送達ビヒクル中にまた存在 する抗原性タンパク質コード配列の発現によって拡大される。 抗原をコードする核酸を含むベクターは、患者の分裂細胞および非分裂細胞に おいて、高コピー数で維持されることがさらに好ましい。 従って、本発明によって有用な、特に好ましいベクターは、エピソーム形態で ベクターの維持を可能にする配列を含む。このようなベクターは、パピローマウ イルスの最小複製起点、パピローマウイルスのミニ染色体維持エレメント、およ び１つ以上の抗原をコードする核酸を挿入するためのクローニング部位を含み得 る。これは、BPV-1複製起点を有するプラスミド、または最小起点およびミニ染 色体維持エレメント(本明細書において以下に開示のような)、および随意にBPV- 1 E1およびE2遺伝子を含むBPV-Iベクターシステムを用いることによって達成さ れ得る。 所望であれば、選択したタンパク質(例えば、標的化リガンド)もしくは送達ビ ヒクルのペプチド、またはベクターによってコードされる他のタンパク質(例え ば、BPV-1 E1およびE2タンパク質)の抗原性は、そのオープンリーディングフレ ームに、エプスタイン・バーウイルスEBNA-1タンパク質由来のGly-Ala反復をコ ードする配列を導入することによって排除され得る。Gly-Ala反復は、シスで連 結されたアミノ酸配列の抗原提示を抑制する。 本発明の組成物は、種々の感染性因子および疾患に対する免疫保護を提供する ために、エクスビボでの遺伝子治療またはインビボでの遺伝子治療に使用され得 る。 図面の簡単な説明 本発明は、以下の図を参考にして、添付の実施例において説明される。 図１は、プロフェッショナル抗原提示細胞(樹状細胞)における抗原性タンパク 質の持続性の標的化された発現を示す概略図である。 図２は、感染性因子に対するインビボでのワクチン接種を示す概略図である。 遺伝子はプロフェッショナル抗原を提示した細胞において発現する。 図３は、APCにおける、MHCクラスIILCRの制御下のヒトグルコセレブロシダー ゼ(glucocerebrosidase)遺伝子の細胞特異的発現を示す。 図４は、pEGFP-N1でトランスフェクトされたインビトロ成熟樹状細胞の顕微鏡 写真である。トランスフェクトされた細胞は蛍光性である。 図５は、緩衝液(Ａ)、ペプチド単独(Ｂ)、または複合体(Ｃ)のいずれかととも にインキュベートされたCOS細胞のFACScan分析を表す。Ｄは、プロットの重ね書 きを表す(細い線、緩衝液；幅広の実線、ペプチド；斜線入りの線、複合体)。 図６は、プラスミドpCMVluc(CMV即時型プロモーターから駆動されるルシフェ ラーゼ遺伝子を有するルシフェラーゼ発現ベクター)の概略図である。このプラ スミドはルシフェラーゼ遺伝子(SV40イントロンおよびポリＡ配列を含む)、細菌 性複製起点、および細菌における選択のためのβラクタマーゼ遺伝子を含む。プ ラスミドはまた、真核生物細胞における選択のためのピューロマイシン遺伝子を 含む。 図7Aは、裸のDNA、またはK6ClIIおよびDNA複合体でのCOS細胞の３つのトラン スフェクタントのデータを表す。示された値は、ルミノメータから読みとられた 発光単位(1μm単位)；サンプル中に見出されたタンパク質の量(mg)；1mgのタン パク質あたりの発光単位(1μm/mg)；各条件についての、１mgのタンパク質あた りの平均発光単位(Av)；標準誤差(St.Error)。 図7Bは、図7Aに示されたデータの棒グラフである。説明 本発明は、ペプチドまたはポリペプチド形態の抗原および抗原をコードする核 酸を含む複合体を、抗原提示細胞に送達することにより、抗原への免疫応答が高 度に特異的かつ効果的になり得るという観察に基づく。 本発明はまた、ペプチドまたはポリペプチド形態の抗原および抗原をコードす る核酸を含む複合体を、抗原提示細胞に送達することにより、抗原への免疫応答 が高度に効果的になり得るという観察に基づく。 本発明はまた、ペプチドまたはポリペプチド形態の抗原および核酸を含む複合 体を、抗原提示細胞に送達することにより、抗原への免疫応答が高度に効果的に なり得るという観察に基づく。本発明のこの局面において、核酸は抗原をコード する必要はないが、抗原提示細胞による抗原の取り込みを促進するに有用である 。 最も単純な形態において、本明細書中に記載されるペプチド抗原および核酸に コードされる抗原は同じである。しかし、より効果的な免疫応答は、第１のペプ チド抗原を、第２の異なる核酸にコードされる抗原と組合せて用いることにより 得られ得ると考えられる。またはここで、いくつかの異なるペプチド抗原は、１ つまたは複数の異なる核酸にコードされる抗原と組合わせて投与される。「より 効果的な」免疫応答は、ワクチン接種手順および組成物の先行技術に関して、２ 倍および好ましくは５倍〜10倍高い免疫応答として、または本発明の複合体また は混合物により細胞性および体液性免疫応答の両方が惹起されたことを見出すこ とにより、明らかである。本発明を作製および実施するための方法および組成物 は、以下に詳細に記載される。本発明による、抗原提示細胞に制限された遺伝子発現を介するワクチン接種 本発明は、本発明により記載された混合物または複合体の哺乳動物への投与を 介する疾患または病原体に対するワクチン接種および、いくつかの場合において 、疾患または病原体に関連する抗原をコードする核酸の抗原提示細胞（すなわち 、組織）に制限された発現を提供する。それに対する免疫応答が所望される抗原 をコードする遺伝子の組織に制限された発現が所望され、ここで、発現が制限さ れる組織は、本明細書中で定義されるように、抗原提示細胞を含み、またはそれ らのサブセットは以下のように得られる。 効果的な抗原提示細胞に制限される遺伝子発現の２つの態様が、本発明により 意図される：1)抗原性ペプチドおよび遺伝子（好ましくは、それに対する免疫応 答が所望される抗原をコードする）を含む混合物または複合体の抗原提示細胞へ の標的化された送達を介する、および2)標的化されたまたは標的化されない遺伝 子送達のいずれかを介する（従って、異なる細胞型への遺伝子の送達が可能であ る）、ここで、遺伝子の発現の制御は、所望の抗原提示細胞または細胞のサブセ ットに遺伝子発現を制限する遺伝子制御エレメントを用いて効果的にされる。宿主細胞への核酸の送達 本発明による混合物または複合体は抗原提示宿主細胞に、非特異的または特異 的に（すなわち、指定された宿主細胞のサブセットに）送達され得ることが本発 明により意図される。送達の３つの態様が意図される。第１は、標的化リガンド は使用されない。第２および第３は、標的化リガンドが使用される；細胞への非 特異的な送達の場合、標的細胞集団ならびに他の細胞に存在する細胞表面レセプ ターを標的化する非特異的なリガンドが使用される；特異的な送達の場合、特異 的な細胞のサブセットを標的化するリガンドが使用される。従って、複合体また は混合物は、一般に任意の細胞に送達され得るか、または抗原提示細胞に送達さ れ得るか、または抗原提示細胞のサブセットに送達され得る。これらのサブセッ トおよび標的化リガンドならびにコグネートレセプターは本明細書中に記載され る。１．APCへの非ウイルス性送達 APCへの非ウイルス性送達は、標的化リガンドを用いてもよく、または用いな くてもよい。APC、それらの幹細胞、または他の前駆細胞型への標的化送達は、 細胞表面上のコグネートレセプターに標的化されているリガンドを含む複合体を 用いる、レセプター媒介性遺伝子移入により達成され得る。本発明による有用な 標的化リガンドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：(a)造 血幹細胞について：抗CD34モノクローナル抗体、または幹細胞因子(c-kitまたは CD117)、あるいはflk-2リガンド（STK-1ヒトホモログ）；(b)単核球／マクロフ ァージ／樹状細胞前駆体について：抗CD33モノクローナル抗体；(c)分化したマ クロフアージ／樹状細胞について：マンノース基を有するグリコシル化DNA結合 ペプチドが特定のレセプター（例えば、マンノースレセプター）を標的化するた めに使用され得る；および(d)MHCクラスII含有細胞について：MHCクラスIIタン パク質の定常領域またはMHCクラスIIに結合するリガンド（例えば可溶性CD4）に 特異的な抗体；例えば、MHCクラスII含有細胞の１つのサブセット（Bリンパ球） は、可溶性CD4を用いて、またはCD80、CD19、もしくはCD22に対する抗体または リガンドを用いて標的化され得る；内皮細胞について、γインターフェロン；お よび(e)APCまたはＴ細胞について、それぞれ、B7-1、B7-2もしくはCD28、CTLA-4 のような同時刺激分子。 DNA構築物の細胞への送達のための標的化送達ビヒクルは、当該分野において 公知であり、そして細胞表面レセプターに特異的なDNA／ポリカチオン複合体を 含む（例えば、WuおよびWu(1988)J．Biol．Chem263:14621；Wilsonら、(1992)J ．Biol．Chem．267:963-967；および米国特許第5,166,320号、ならびに、例えば 、USSN60/011,531（同じ譲渡人に譲渡され、そして本明細書中に参考として援用 される）に記載される）。この同時係属中の出願において、自己アセンブリする ウイルス様粒子が記載され、そして目的のDNAおよび縮重ペプチドを含む。この 縮重ペプチドは、そのアミノ酸組成物に関してヘテロペプチドであり（すな わち、好ましくは塩基性であり、従って良好なDNA結合およびDNA縮重ペプチドで ある、少なくとも２つの異なるアミノ酸を含む）、そして低度の多分散を有する （すなわち、低度の多分散を有するヘテロペプチドの所定の調製物は、同一長で はなくても非常に類似のペプチドを含み、調製物は本質的に単分散である）。 従って、本発明はまた、核酸を哺乳動物細胞中にトランスフェクトするための 合成ウイルス様粒子を用いて細胞に送達される核酸構築物に関する。合成ウイル ス様粒子は、組換え核酸、複数の核酸縮重ペプチドを含み、このペプチドは核酸 が縮重形態にあるように組換え核酸と非共有結合的に会合し（ここで、各核酸縮 重ペプチドはヘテロペプチドである）、および複数の核酸縮重ペプチドは低度の 多分散を有する。 複数の核酸縮重ペプチドは、第１の核酸縮重ペプチドおよび第２の核酸縮重ペ プチドを含み得、ここで、第１の核酸縮重ペプチドはそれに共有結合した第１の 官能基を含む。第１の核酸縮重ペプチドはさらに、ペプチドに直接結合し得るか 、または第１の官能基に共有結合し得る第２の官能基を含み得、ここで、第１の 官能基はペプチドに結合する。あるいは、第２の核酸縮重ペプチドはまた、それ に共有結合した第２の官能基を含み得、第２の官能基は第１の官能基とは異なる 。第１および第２の核酸縮重ペプチドは、同一または異なるアミノ酸配列を有し 得る。 本発明により有用であるペプチドに結合する官能基は、インフルエンザ核タン パク質(NP)のような抗原性ペプチドもしくはタンパク質、または特定の細胞型を 標的化するリガンド（例えば、モノクローナル抗体、インスリン、トランスフェ リン、アシアロ糖タンパク質、または糖）を含む。従って、リガンドは、非特異 的な様式においてまたは細胞型に関して制限される特異的な様式において、細胞 を標的化し得る。 第１の核酸縮重ペプチドは、８〜24の正に荷電したアミノ酸側基を含み得る； 例えば、正に荷電したアミノ酸側基の数は、12〜18の範囲であり得る。 特定の哺乳動物細胞型を標的化し得る合成ウイルス様粒子における正／負電荷 の割合は、核酸中のリン酸残基当たり0.5〜3の範囲内である；従って、この割合 はまた0.8〜1.2の範囲内であり得る。 それが標的化する細胞の型に関して制限されない合成ウイルス様粒子における 正／負電荷の割合は、核酸中のリン酸残基当たり0.5〜５の範囲内であり、従っ て、また1.2〜2の範囲内であり得る。 核酸構築物の縮重に、従って核酸の細胞への送達に特に有用である核酸縮重ペ プチドは、以下の一般式のペプチドを含む： ここで、Ｘ_{1 〜8}のそれぞれは、独立して、側鎖上に正荷電基を有するアミノ酸で あり；Ｙ_{1 〜4}のそれぞれは、独立して、αヘリックス形成を促進する天然に存在 するアミノ酸であり；Ｚ_{1 〜4}のそれぞれは、独立して、少なくとも３つのアミノ 酸が安定したターン構造を形成するのに高い性向を有する、天然に存在するアミ ノ酸であり；Ａはアミノ末端セリンまたはスレオニン残基であり；Ｂは任意のア ミノ酸であり；そしてｎ＝２〜４であり、ｍ＝２である。 他のぺプチドは、Ｘ_{1 〜8}のそれぞれは、独立して、リジン、アルギニン、2.4- ジアミノ-酪酸またはオルニチンであり；Ｙ_{1 〜4}のそれぞれは、独立して、グル タミン酸、アラニン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、トリプトファンまた はヒスチジンであり；Ｚ_{1 〜4}のそれぞれは、独立して、アスパラギン、グリシン 、プロリン、セリン、およびアスパラギン酸であり；Ｂはアラニン、グルタミン 酸またはシステインのうちの任意の１つであるペプチドである。 本発明のこの実施態様において有用である、本発明による複合体の細胞への、 エクスビボまたはインビボのいずれかにおける送達に関与するペプチドは、好ま しくは配列中の選択されたリガンドに結合させるために曝露され、従ってα-ヘ リックスの正に荷電した面ではない（核酸配向性の）位置で、１つ以上の内因性 セリン、スレオニン、またはシステイン残基を含む。ペプチド中の選択された反 応性アミノ酸残基のこの配置は、選択されかつ定義された安定性の結合によりペ プチドと他の官能性ペプチドとを結合させる核酸に接触するペプチドの面に、こ れらが接触しないように配向される。システインは、他の反応性チオール基（ジ スルフィドを介して）、アルキル化官能基（チオエーテル結合を形成する）、ま たは他のマレイミド誘導体のようなチオール反応性基を含む化合物との、チオー ル側鎖を介する特異的な結合を可能にする。 この一般的配列にあるペプチドは以下を含む： 従って、核酸の送達に有用な核酸縮重ペプチドは以下を含み得る：1)ヘリック ス形成アミノ酸、2)核酸の大きな溝に接触する反復性の３次元構造、3)定量のた めに適切な発色団、および4)補助機能性ドメインを形成するリガンドの領域(reg io)特異的な結合のための多数の「ハンドル」（すなわち、反応性部位）。 核酸縮重ペプチドはまた、本明細書中で核酸を縮重する能力を有する配列とし て同定されるH1の部分（以下の配列Ｉ、II、またはIII）を含み得る。従って、 核酸縮重ペプチドは、全配列長が17残基を超える以下の３つのコンセンサス配列 の直線状の組合せを含み得る： 配列Ｉ：-K-K-X-P-K-K-Y-Z-B-P-A-J- ここで：Ｋはリジンであり、Ｐはプロリンであり；Ａはアラニンであり；Ｘはセ リン、スレオニン、またはプロリンであり；Ｙはアラニンまたはバリンであり； Ｚはアラニン、スレオニン、またはプロリンであり；Ｂはリジン、アラニン、ス レオニンまたはバリンであり；およびＪはアラニンまたはバリンである。 配列II：-X-K-S-P-A-K-A-K-A- ここで：Ｘはアラニンまたはバリンであり；Ｋはリジンであり；Ｓはセリンであ り；Ｐはプロリンであり；およびＡはアラニンである。 配列III：-X-Y-V-K-P-K-A-A-K-Z-K-B- ここで：Ｘはリジンまたはアルギニンであり；Ｙはアラニンまたはスレオニンで あり；Ｚはプロリン、アラニンまたはセリンであり；Ｂはリジン、スレオニンま たはバリンであり；Ｋはリジンであり；Ｐはプロリンであり；Ａはアラニンであ る。 そのようなペプチドの１つはNBClであり、これは以下の構造を有する： NH₂-[SV40 NLS]-[Seq I]-[Seq II]-[Seq III]-[SV40 NLS]-[Seq I]-C-COOH ここで-C-はシステインであり；SV40NLSは配列Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Gl n；および配列 を有する。 本発明の別のこのような核酸縮重ペプチドは、以下の一般的配列にあるペプチ ドを有する： NH₂-X-(Y)_n-C-COOH、ここでＸは存在しないかまたはセリンもしくはスレオニン であるかのいずれかであり；Ｙは上記で定義された配列Ｉ、II、またはIIIであ り；ｎは２〜６であり；およびＣはシステインである。 他のこのようなペプチドは以下の構造および配列を有する：NBC2は構造：NH₂- [Seq III]-[SV40 NLSl]-[Seq I]-C-COOH、を有し、ここで-C-はシステインであ る。 NBC8は構造：NH₂-[Seq I]-[Seq I]-C-COOH、を有し、ここで-C-はシステイン である。 NBC9は構造：NH₂-[Seq I]-[Seq I]-[Seq I]-C-COOH、を有し、ここで-C-はシ ステインである。 NBC10は構造：NH₂-[Seq I]-[Seq I]-[Seq I]-[Seq I]-C-COOH、を有し、ここ で-C-はシステインであり；このアミノ酸配列は以下の通りである： 上記のように、低多分散指数（PDI）を有する核酸縮重ペプチドは、本発明に よる抗原をコードする核酸の細胞への送達に有用である。このようなペプチドに ついてのPDIは、エレクトロスプレー質量分光測定によるペプチドの分析から、 計算され得る。この方法は、各成分の0.001%以内まで正確な質量を与える。本発 明において有用なペプチド調製物のPDI値は、1.0〜1.100の範囲である。本発明 において特に有用であるペプチド調製物は、PDI＜1.01、そしてPDI＜1.001すら 有する。 好ましい送達ビヒクルは、以下のように調製される。合成ウイルス様粒子は、 抗原をコードする核酸およびペプチド調製物が、同じ緩衝液の等容量で調製され るように、処方される。核酸を、縮重ペプチド調製物を１分あたり0.1容量の速 度で添加する間、振盪または撹拌する。複合体は、標的細胞への添加前または被 検体への投与前に、少なくとも30分間室温に放置し、4℃で貯蔵し得る。粒子を 遠心分離して、凝集物質を除去する。 上記の細胞標的のためのDNA/ポリカチオン複合体に加えて、核酸を含有する細 胞標的リポソームを調製するための方法は、先行技術において公知である。標的 リポソームの例は、免疫リポソームであり、例えば、それは、リポソーム表面で のタンパク質（例えば、免疫グロブリン）吸着；リポソーム形成中のリポソーム 膜への天然のタンパク質の取り込み（例えば、超音波処理、界面活性剤透析また は逆相エバポレーション）；タンパク質のリポソーム膜内へ取り込まれる反応化 合物との（直接またはスペーサー基を介する）共有結合；リポソーム形成中また は予め形成されたリポソームとのインキュベーションによる、修飾タンパク質の 非共有疎水結合；および、免疫グロブリンタンパク質のポリマーを介してのリポ ソームへの共有結合を含む、間接結合（Therapeutic Drug Carrier Systems、第 ２巻(1)中のTorchilin，V.P．CRC Critical reviewsを参照のこと）によって調 整される。核酸-リガンド複合体のレセプターへの結合は、レセプター媒介エン ドサイトーシスによる核酸の取り込みを促進する。 自然にエンドソームを崩壊し、そのことによって細胞質へ物質を放出する、ア デノウイルスキャプシドに連結された核酸-リガンド複合体は、細胞内リソソー ムによる複合体の分解を妨ぐために使用され得る（例えば、Curielら、(1991)Pr oc．Natl．Acad．Sci．USA 88:8850;Cristianoら、(1993)Proc．Natl．Acad．Sc i．USA 90:2122-2126を参照のこと）。 レセプター媒介核酸取り込みは、インビトロまたはインビボのいずれかでの細 胞へ核酸を導入するために使用され得、さらに、核酸が目的の標的細胞上で選択 的に発現されるレセプターに結合するリガンドの使用によって、特定の細胞型へ 選択的に標的化され得るか、または標的細胞型に関しては非選択的であり得る付 加された特性を有する。 本発明による複合体または混合物の種々の成分の正確な化学量論比は、初期免 疫応答の強度、送達の効果、およびAPCまたは関連細胞への特異標的化の程度を 制御するために変化され得る。一般的に、第１のエピトープをコードする核酸の 第２のエピトープをコードするアミノ酸配列に対する比は、1:10,000〜1,000:1 の範囲であり、好ましくは1:1,000〜100:1、そして最も好ましくは1:200〜10:1 の範囲である。A ）非ウイルス送達に有用な核酸ベクター 本発明は、目的の遺伝子（すなわち、免疫応答が望まれる抗原をコードする遺 伝子）を含有するベクターの使用を意図する。そのベクターは、上記のように、 細胞送達用のために標的化されるか、または標的化されない送達ビヒクル中で運 ばれ得る。本発明による有用なベクターは、宿主細胞核DNAへ組み込まれるベク ターまたは安定なエピソームベクターを含む。エピソームベクター 染色体外レプリケーターは、一般的に、その複製起点機能に加えて、細胞分裂 で娘細胞間での複製した分子の等しい分布を確実にする機能をコードする。より 高等な生物では、染色体外レプリケーターの分割のために種々の機構が存在する 。例えば、酵母における人工（ARS含有）プラスミドは、染色体レプリケーター として染色体セントロメアを利用する（Struhlら、1979，Proc．Natl．Acad．Sc i．USA，76:1035-1039）。後生動物細胞では、安定な染色体外レプリケーターの よく研究された例が存在し、それはエプスタインバーウイルス（EBV）由来の潜 在的複製起点oriPである。EBVの維持機能は、ウイルス複製因子EBNA-lおよび繰 り返しファミリー（FR）と呼ばれるEBNA-1についての一連の結合部位を必要とす る。oriPからの複製は、cis作用エレメント（繰り返しファミリー−FRおよび二 分子対称エレメント）およびウイルス複製起点結合タンパク質、EBNA-1を必要と する(Yatesら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，81，3806-3810(1984)；Yatesら、 Nature 313:812-815(1985))。FRは、有糸分裂におけるFR含有プラスミドの核保 持によって、oriPの安定な染色体外複製に効果を有する。この活性は、細胞分裂 の終期における新たに形成する核に、プラスミドを指向する（Krysanら、Mol．C ell．Biol．9:1026−1033(1989)）。 本発明による有用な特に好ましいベクターは、患者の分裂細胞または非分裂細 胞において、高コピー数で維持される。これは、WO 94/12629およびPiirsooら、 1996，EMBO Jour．15:1に記載されているBPV-Iベクター系のようなエピソームベ クターを用いて達成され得る。これは、BPV-l複製起点（最小複製起点およびミ ニ染色体維持エレメント）および必要に応じてElおよびE2遺伝子を有するプラス ミドを含む。BPV-PlE1およびE2遺伝子はBPVエピゾームベクターの安定な維持に 必要とされる。これらの因子は、プラスミドが、細胞周期状態に非依存的に、１ 細胞あたり30コピーまでの安定なコピー数に複製されることを確実にする。従っ て、遺伝子構築物は、分裂細胞または非分裂細胞の両方において安定に残る。こ れは、造血幹細胞のような細胞およびより拘束された前駆細胞における遺伝子構 築物の維持を可能にする。 複製の「最小複製起点」（MO）とは、DNA合成の開始に必要であるパピローマ ウイルス内の最小cis-配列をいう。BPV−1のMOは、ATリッチ領域、全パピローマ ウイルスE2タンパク質が結合する共通配列、およびE1タンパク質結合部位に広が るヌクレオチド１を含む60塩基対DNAフラグメント（7914〜7927）内の上流調節 領域の3'末端に位置する。HPVのMOは、URRフラグメント（nt 7072-7933/1-99)に 位置する（Chiangら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 1992)。 「E1」とは、BPVサブタイプ１のnt 849-2663によってコードされるタンパク質 ；もしくはHPVサブタイプ11のnt 832-2779；またはその他のパピローマウイルス の相当するE1タンパク質；またはパピローマウイルスE1タンパク質の機能的フラ グメントまたは変異体、すなわち、E1の複製特性を有するフラグメントまたは変 異体をいう。 「E2」とは、BPVサブタイプ１のnt 2594〜3837によってコードされるタンパク 質；もしくはHPVサブタイプ11のnt 2723〜3823；またはその他のパピローマウイ ルスの相当するE2タンパク質；またはパピローマウイルスE2タンパク質の機能的 フラグメントまたは変異体（すなわち、E2の複製特性を有するフラグメントまた は変異体）をいう。 「ミニ染色体維持エレメント」（MME）とは、パピローマウイルス複製に必要 なウイルスタンパク質またはヒトタンパク質が結合する、パピローマウイルスゲ ノムの領域をいい、その領域は、Piirsooらに記載されているように、宿主細胞 でのパピローマウイルスMOの安定なエピソームの維持に必要である。好ましくは 、MMEは、転写アクチベーターE2に対する複数の結合部位を含む配列である。BPV 中のMMEは、最少で約６連続E2結合部位を含む上流調節領域内に位置し、そして 約10連続E2結合部位によって最適な安定維持を与えるBPVの領域として、本明細 書中において定義される。E2結合部位９は、この部位について好ましい配列であ り、本明細書の下記に記載されているように、連続部位は、約４〜10ヌクレオチ ドのスペーサーによって分離され、そして最適には６クレオチドのスペーサーに よって分離される。WO 94/12629およびPirsooらにおいてもまた記載されている ように、E1およE2は、cisまたはtransのいずれかでプラスミドに提供され得る。 「E2結合部位」とは、E2タンパク質が結合する、パピローマウイルス二本鎖DN Aの最小配列をいう。E2結合部位は、配列5'ACCGTTGCCGGT3'を含み得、これは、B PV-1URRの高親和性E2結合部位９であり；あるいは、E2結合部位は結合部位９の 置換を含み得、置換はURR内に見出され、そして本質的に共通配列5'ACCN6GGT3' からなり、ここで、Ｎはその位置に依存せず、任意のヌクレオチドであり、そし て６は６つの独立したヌクレオチド（Ｎ）をいう。１つ以上の転写アクチベータ ーE2結合部位は、ほとんどのパピローマウイルスにおいて、BPVおよびHPVにおけ るように、上流調節領域に位置する。 本発明による有用なベクターは、BPV遺伝子マップ（WO 94/12629を参照のこと ）上の6959〜7945/1〜470の間のBPV領域（この領域は複製起点を含む）、抗原ま たはそのエピトープをコードする遺伝子に作動可能に連結された第１のプロモー ター、E1遺伝子の転写を駆動するために第２のプロモーターに作動可能に連結さ れたBPV E1遺伝子；およびE2遺伝子の転写を駆動するために第３のプロモーター に連結されたBPV E2遺伝子を含み得る。 E1およびE2遺伝子の発現を駆動するプロモーターは、同一かまたは異なり得、 そしてＢ細胞についての免疫グロブリン重鎖プロモーター／エンハンサーおよび 血球発現についてのIg重鎖もしくは軽鎖のような組織特異プロモーター、または 例えば、ホスフォグリセロールキナーゼ、IE-CMV、RSV-LTR、もしくはDHFR遺伝 子からのような遍在的に発現される遺伝子由来であり得る。BPV複製起点に関す るE1およびE2遺伝子の配置は、BPVゲノム中の天然の配列の方向を模倣し得るか 、またはそれは種々の他の方向をとり得、その選択は当業者に明らかである。 当業者は、種々のベクターが、本発明によって機能することを認識する。 ２．ウイルスベクターに媒介されるAPCへの送達 抗原提示細胞へ核酸および抗原を導入するための別の好ましいアプローチにお いて、核酸を含むウイルスベクターが移入のために使用される。ウイルスベクタ ーでの細胞の感染は、大きな割合の細胞が核酸を受容する利点を有する。さらに 、ウイルスベクター内にコードされる分子は、ベクター核酸を取り込んだ細胞で 効率的に発現される。 １．レトロウイルス：欠損レトロウイルスは、遺伝子治療目的のための遺伝子 移入における使用のためによく特徴づけられている（総説にはMiller，A.D．(19 90)Blood 76:271を参照のこと）。レトロウイルスゲノムに挿入される目的の抗 原をコードする核酸を有する組換えレトロウイルスが、構築され得る。さらに、 レトロウイルスゲノムの一部は、レトロウイルス複製欠損になるように除去され 得る。次いで、複製欠損レトロウイルスは、標準的な方法によって、ヘルパーウ イルスの使用を介して標的細胞を感染するために使用され得るビリオンへパッケ ージングされる。組換えレトロウイルスの産生およびこのようなウイルスでのイ ンビトロまたはインビボでの細胞感染のためのプロトコールは、CurrentProtoco ls in Molecular Biology、Ausubel，F.M.ら（編）Greene Publishing Associat es，(1989)，9.10-9.14章、および他の標準的実験マニュアルに見出され得る。 適切なレトロウイルスの例は、当業者に周知である、pLJ、pZIP、pWE、およびpE Mを含む。適切なパッケージングウイルス株の例は、ψCrip、ψCre、ψ2、およ びψAmを含む。レトロウイルスは、インビトロおよび／またはインビボで、上皮 細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含む多くの異なる細 胞型へ、種々の遺伝子を導入するために使用されてきた（例えば、Eglitisら、 (1985)Science 230:1395-1398;DanosおよびMulligan(1988)Proc．Natl．Acad．S ci．USA 85:6460-6464;Wilsonら、(1988)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:3014- 3018;Armentanoら、(1990)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:6141-6145;Huberら 、(1991)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:8039-8043;Ferryら、(1991)Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 88:8377-8381;Chowdhuryら、(1991)Science 254:1802-1805; van Beusechemら、(1992)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:7640-7644;Kayら、(1 992)Human Gene Therapy 3:641-647;Daiら、(1992)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:10892-10895;Hwuら、(1993)J．Immunol．150:4:104-115;米国特許第4,868,1 16号;米国特許第4,980,286号;PCT出願WO 89/07136;PCT出願WO 89/02468;PCT出願 WO 89/05345;および、PCT出願WO 92/07573を参照のこと）。 ２．アデノウイルス：アデノウイルスのゲノムは、目的の遺伝子産物をコード し、そして発現するが、通常の溶解性ウイルスライフサイクルにおける複製する 能力に関して不活性化されるように操作され得る。例えば、Berknerら、（1988 ）BioTechniques 6:616;Rosenfeldら、(1991)Science 252:431-434;および、Ros enfeldら、(1992)Cell 68:143-155を参照のこと。アデノウイルス株Ad ５型d132 4または他のアデノウイルス株（例えば、Adz、Ad3、Ad7など）由来の適切なアデ ノウイルスベクターは、当業者に周知である。組換えアデノウイルスは、効果的 な遺伝子送達ビヒクルであるために分裂細胞を必要としない点に利点があり、そ して気道上皮（Rosenfeldら、(1992)前出）、内皮細胞（Lemarchandら、(1992)P roc．Natl．Acad．Sci．USA 9:6482-6486）、肝細胞（HerzおよびGerard(1993)P roc．Natl．Acad．Sci．USA 90:2812-2816）、および筋細胞(Quantinら、(1992) Proc．Natl．Acad．Sci．USA89:2581-2584)を含む、種々広範囲の細胞型に感染 するために使用され得る。多くの複製欠損アデノウイウルスベクターは、ウイル スE1およびE3遺伝子の全部または一部分が削除されているが、80%もアデノウイ ルス遺伝子物質を残す。 ３．アデノ随伴ウイルス：アデノ随伴ウイルス（AAV）は、アデノウイルスま たはヘルペスウイルスのような別のウイルスを、効率的な複製および増殖性ライ フサイクルのためにヘルパーウイルスとして必要とする、天然に存在する欠損ウ イルスである。（総説には、Muzyczkaら、Curr．Topics in Micro．and Immunol .(1992)158:97-129を参照のこと）。それは、高頻度の安定な組み込みを示す（ 例えば、Flotteら、(1992)Am．J．Respir．Cell．Mol．Biol．7:349-356;Samuls kiら、(1989)J．Virol．63:3822-3828;および、McLaughlinら、(1989)J．Virol 62:1963-1973を参照のこと）。AAVの300塩基対しか含まないベクターが、パッケ ージングされ得、組み込まれ得る。外来性核酸のためのスペースは、約4.5kbま でに制限される。Tratschinら、(1985)Mol．Cell．Biol．5:3251-3260に記載さ れるようなAAVベクターは、細胞に核酸を導入するために使用され得る。種々の 核酸が、AAVベクターを使用して、種々の細胞型へ導入されてきた（例えば、Her monatら、(1984)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:6466-6470;Tratschinら、(198 5)Mol．Cell．Biol．4:2072−2081;Wondisfordら、(1988)Mol．Endocrinol．2:3 2-39;Tratschinら、(1984)J．Virol．51:611-619;および、Flotteら、(1993)J． Biol．Chem．268:3781-3790)。 送達ビヒクルはまた、上記のものの任意のようなウイルス抗原を含み得、ここ で、１つ以上のウイルスタンパク質が、免疫応答が望まれるエピトープを含むよ うに、修飾されてきた。 ３．組織限定遺伝子発現 標的化送達ビヒクルの使用の代わりにまたは付加的に、APC、それらの幹細胞 、または他の前駆細胞型における発現を導くDNA調節エレメントが、本発明によ って使用され得る。 エレメントが特異的である組織に関連する遺伝子の発現を制限する遺伝子制御 エレメントを使用する本発明によって組織特異的発現が提供される。このような 遺伝子制御エレメントの例は、遺伝子座調節領域ならびに組織特異プロモーター およびエンハンサーを含む。 優性活性化配列、遺伝子座活性化領域、または優性調節領域としても知られる 、遺伝子座調節領域（LCR）（Grosveldら、Cell 51:975-985，1987）は、宿主細 胞においてクロマチンへ組み込まれたトランスジーンに対して組織特異的、組み 込み部位非依存的、コピー数依存的発現を与えることを担う。ヒトグロビン遺伝 子 系で最初に発見され、トランスジェニックマウスまたはマウス赤白血病（MEL） 細胞のクロマチンへ組み込まれた場合、強い位置効果を有する傾向にあった(Mag ramら、Nature 315:338-340，1985;Townesら、EMBO J．4:1715-1723，1985;Koll iasら、Cell 46:89-94，1986;Antoniouら、EMBO J．7:377-384，1988）、LCRは 、導入遺伝子に直接連結された場合、このような位置効果に打ち勝つ能力を有す る（Grosveldら、前出）。多くのLCRが、当該分野で明らかにされ、これは、β- グロビンおよびCD2 LCR（Greavesら、1989）、マクロファージ特異的リゾチーム LCR（Boniferら、1985，1990）、およびクラスII MHC LCR（Carsonら、Nucleic Acids Res．21，9:2065-2072，1993）を含むが、これらに限定されない。 好ましい調節エレメントは、MHCクラスII LCRのような遺伝子座調節領域（LCR ）を含む。他の制御領域、例えば、Ｂ細胞に対するIg LCRもまた、他の制御領域 がAPC、それらの幹細胞、または他の前駆細胞型での発現を導く条件で、使用さ れ得る。免疫系回避を可能にするエレメントをコードするベクター 本発明による有用なベクターはまた、宿主免疫系に対する生存度から、ベクタ ーによってコードされる特定の抗原決定基を保護するように役立つ配列を、コー ドし得る。従って、宿主が、ベクターによってコードされるか、または抗原提示 細胞への核酸を送達するに使用されるビヒクルで運ばれる抗原決定基に対して、 免疫応答を増大させる場合、次いで、この抗原性は、グリシン含有反復をコード するエプスタインバーウイルスEBNA-1タンパク質由来の抗原性タンパク質配列の オープンリーディングフレームへ導入することによって、除かれ得るかまたは減 少され得、それは、cisに連結されたアミノ酸配列の抗原提示を抑制する。例え ば、Levitskayaら、1995，Nature 375:685を参照のこと。 グリシン含有反復配列をコードするDNA配列（例えば、エプスタインバーウイ ルス核抗原-1の残基93-325：EBNA1(株B95.8)のNcol-Apalフラグメントで運ばれ る）は、免疫原性であると考えられているかまたは知られているが、本発明によ る核酸の投与に際して、免疫応答が望まれないタンパク質をコードする遺伝子内 の、選択された部位に挿入される。グリシンコードDNA配列は、例えば、非免疫 原性であることが望まれるタンパク質の下流、または免疫原性であることが知ら れているタンパク質のエピトープの下流に挿入され得；例えば、それは、タンパ ク質のカルボキシ末端またはアミノ末端でのインフレーム融合を介して、タンパ ク質に結合され得るか、またはそのタンパク質を非免疫原性にするように、タン パク質内の任意の場所に挿入され得る。グリシン含有配列が、グリシン含有配列 のいずれかの末端残基が、タンパク質の免疫原性エピトープから約１と300残基 の間の距離である距離で、タンパク質内に挿入されることが、好ましい。複数の エピトープを含むタンパク質の場合には、抗原性タンパク質の全エピトープが、 本発明のこの実施態様によって非免疫原性になると考えられる。好ましくは、グ リシン含有配列のタンパク質中の挿入部位とタンパク質エピトープの１つのアミ ノ酸間の距離は、約１と200残基との間、より好ましくは約10〜100残基、そして 最も好ましくは約20と50残基との間である。本明細書で使用される「エピトープ 」とは、外来物として免疫学的に認識されるタンパク質内の、約６〜20アミノ酸 の抗原領域をいう。 例えば、本発明による抗原提示細胞へ抗原をコードする核酸を送達するために 使用されるベクターが、BPV E1およびE2タンパク質を含有する場合、E1およびE2 タンパク質が、望ましくない免疫応答を引き起こし得る可能性がある。従って、 グリシン含有配列のこれらのタンパク質の各リーディングフレームへの挿入が、 ワクチン接種核酸によってコードされる抗原に対する所望の免疫応答にかなりの 影響を与えることなく、E1およびE2タンパク質に対する免疫応答を減少または除 くために、達成され得る。 本発明による有用なベクター内に有されるタンパク質のような、選択された外 来タンパク質または免疫原性エピトープのマスキングを得るのに有用なグリシン 含有配列は、式：[(Gly_a)X(Gly_b)Y(Gly_c)Z]nを有する組換えグリシン含有アミノ 酸配列を有し、ここで各Gly_a、Gly_b，Gly_cは独立して、１、２、または３の連続 的なグリシン残基であり；各Ｘ、Ｙ、およびＺは独立して、環状構造を有さない 疎水性または極性アミノ酸であり、そして３原子未満の側鎖を有し、ここで、各 Ｘ、Ｙ、およびＺはそれぞれに、ｎ反復からｎ反復まで同じである必要はなく； そして、nは1〜66であり得る。 各Ｘ、Ｙ、およびＺは独立して、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、およびThrからな る群より選択されことが好ましく；より好ましくは、各Ｘ、Ｙ、およびＺは独立 して、AlaおよびSerの一方であり；最も好ましくは、各Ｘ、Ｙ、およびＺは独立 して、Alaであり；より好ましくは、各XおよびYはMetまたはCysでない。 グリシン含有配列は、(GlyGlyXGlyYGlyZ)およびn=7反復を含むか；または、n= 9反復で(GlyGlyXGlyGlyYGlyZ)を含み、ここで残りのｎ反復が、反復数66および 好ましくは28総反復までの(Gly_a)X(Gly_b)Y(Gly_c)Zを含むか；または、グリシン 含有配列が、n=7反復で(GlyGlyXGlyYGlyGlyGlyZ)を含み、ここで残りのn反復が 、反復数66および好ましくは28総反復までの(Gly_a)X(Gly_b)Y(Gly_c)Zを含むか； グリシン含有配列が、n=9反復で(GlyGlyAlaGlyAlaGlyGlyAla)を含み、ここで残 りのn反復が、総反復数66、および好ましくは28総反復までの(Gly_a)X(Gly_b)Y(Gl y_c)Zを含むこともまた好ましい。 グリシン含有配列が、n=7反復で(GlyGlyAlaGlyAlaGlyGlyGlyAla)を含み、ここ で残りのｎ反復が、総反復数66、および好ましくは28総反復までの(Gly_a)X(Gly_b )Y(Gly_c)Zを含むか；または、グリシン含有配列が、n=9反復で(GlyGlyXGlyYGlyG lyZ)、およびn=7反復で、(GlyGlyXGlyYGlyGlyGlyZ)を含み、ここで残りのn反復 が、総反復数66までの(Gly_a)X(Gly_b)Y(Gly_c)Zを含むこともまた好ましい。 グリシン含有配列、n=9反復の(GlyGlyAlaGlyAlaGlyGlyAla)およびn=7反復の(G lyGlyAlaGlyAlaGlyGlyGlyAla)もまた好ましく、ここで残りのn反復は、総反復数 66までの(Gly_a)X(Gly_b)Y(Gly_c)Zを含む。本発明による有用な抗原および抗原をコードする遺伝子 免疫応答が、このような応答を惹起し得る任意のタンパク質またはペプチドの 提示を介して惹起され得ることが、本発明により意図される。抗原が、感染性疾 患の特定の因子に対して強い免疫応答を引き起こす重要なエピトープであること が、好ましい。所望ならば、１つより多い抗原またはエピトープが、免疫応答の 可能性を増大するために、核酸によってコードされ得る。従って、ベクターは、 遺伝子によってコードされる抗原が同時に発現される複数遺伝子構築物を含み得 る。所望ならば、病原体ゲノムの全オープンリーディングフレームが発現され、 抗原提示細胞によって発現されそして提示されるコード配列の領域を形成するた めに、ベクター内に（発現ライブラリーとして）共に調整され得る。発現ライブ ラリーの使用は、Barryら、1995，Nature 377:632に記載される。 あるいは、異なる疾患または感染因子に特異的な抗原をコードするDNA配列が 、抗原提示細胞への送達および発現用のベクターに、共に調整され得る。従って 、免疫防御が、構築物内でコードされる抗原によって特定される多数の疾患に対 して、惹起され得る。 本発明のさらなる実施態様では、抗原コード核酸配列は、細胞外への抗原の分 泌のためのシグナル配列を含み得る。本発明に有用なシグナル配列は、当業者に 周知であり、例えば、BlobelおよびDobberstein(1975)，J．Cell Biol.,67，852 -862に記載される。分泌された抗原は、分泌細胞および他の近隣する細胞によっ て取り込まれ、外因性抗原としてプロセシングされ、クラスIIMHCと結合して提 示される。本発明の送達ビヒクルは、あるものは分泌シグナル配列を伴って、あ るものは分泌シグナルを伴わずに、抗原をコードする核酸混合物を含み得る。従 って、分泌される抗原および分泌されない抗原が、同じ細胞内で産生され得、そ して、クラスＩおよびクラスIIの両方のMHC提示が、シングルトランスフェクシ ョン事象後になされ得る。 本発明に従って有用な抗原は、以下のとおりである。 １．ウイルス抗原 ウイルス抗原の例は、限定されないが、gag、pol、およびenv遺伝子の遺伝子 産物のようなヒト免疫不全ウイルス（HIV）抗原からのレトロウイルス抗原、Nef タンパク質、逆転写酵素、ならびに他のHIV成分のような、レトロウイルス抗原 、；Ｂ型肝炎ウイルスのＳ、Ｍ、およびＬタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスのpre- S抗原、および他の肝炎（例えば、Ａ型、Ｂ型、およびＣ型肝炎）のＣ型肝炎ウ イルスRNAのようなウイルス成分；赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ、およ び他のインフルエンザウイルス成分のような、インフルエンザウイルス抗原；麻 疹ウイルス融合タンパク質および他の麻疹ウイルス成分のような麻疹ウイルス抗 原；タンパク質E1およびE2ならびに他の風疹ウイルス成分のような、風疹ウイル ス抗原；VP7scおよび他のロタウイルス成分のような、ロタウイルス抗原；エ ンベロープ糖タンパク質Ｂ、および他のサントメガロウイルス抗原成分のような 、サイトメガロウイルスウイルス抗原；RSV融合タンパク質、M2タンパク質、お よび他の呼吸性シンシチア(respiratory syncytial)ウイルス抗原成分のような 、呼吸性シンシチアウイルス抗原；前初期タンパク質、糖タンパク質Ｄ、および 他の単純ヘルペスウイルス抗原成分のような、単純ヘルペスウイルス抗原；gpI 、gpII，および他の水痘帯状庖疹ヘルペスウイルス抗原成分のような、水痘帯状 庖疹ヘルペスウイルス抗原；タンパク質Ｅ、M-E、M-E-NS 1、NS 1，NS 1-NS2A、 80%E、および他の日本脳炎ウイルス抗原成分のような、日本脳炎ウイルス抗原； 狂犬病糖タンパク質、狂犬病核タンパク質、および他の狂犬病ウイスル抗原成分 のような、狂犬病ウイルス抗原を含む。ウイルス抗原についてのさらなる例につ いては、Fundamental Virology，Second Edition，e's．Fields，B.N．およびKn ipe，D.M.（RavenPress，New York，1991）を参照のこと。 ２．細菌抗原 本発明の組成物および方法において使用され得る細菌抗原は、百日咳毒素、フ ィラメント赤血球凝集素、pertactin，FIM2、FIM3、アデニル酸シクラーゼ、お よいその他の百日咳細菌抗原成分のような、百日咳細菌抗原；ジフテリア毒素ま たはトキソイド、および他のジフテリア細菌抗原成分のような、ジフテリア細菌 抗原；破傷風トキシンまたはトキソイド、および破傷風細菌抗原成分のような、 破傷風細菌抗原；Ｍタンパク質および他の連鎖球菌抗原成分のような、連鎖球菌 抗原；リポ多糖および他のグラム陰性細菌抗原成分のような、グラム（grarn-） 陰性細菌抗原；ミコール酸、熱ショックタンパク質65（HSP65）、30kDa主要分泌 タンパク質、抗原85A、および他の結核菌抗原成分；Helicobacter pylori細菌抗 原成分;pneumolysin、肺炎球菌被膜多糖、および他の肺炎球菌抗原成分のような 、肺炎球菌抗原；被膜多糖および他のヘモフィルスインフルエンザ菌抗原成分の ような、ヘモフィルスインフルエンザ菌抗原；炭疽防御抗原およびその他の炭疽 菌抗原成分のような炭疽菌抗原；rompsおよび他のリケッチア細菌抗原成分のよ うな、リケッチア細菌抗原を含むが、これらに限定されない。本明細書に記載さ れている細菌抗原は、任意のその他の細菌、放線菌、マイコプラズマ、リケッ チア、またはクラミジア抗原もまた含む。 ３．真菌抗原 本発明の組成物および方法に使用され得る真菌抗原は、カンジダカビ抗原成分 ；熱ショックタンパク質60（HSP60）およびその他のヒストプラスマカビ抗原成 分のような、ヒストプラスマカビ抗原；被膜多糖、および他のクロプトコッカス 抗原成分のような、クリプトコッカスカビ抗原；小球抗原(spherule antigen)、 および他のコクシジオイデスカビ抗原成分のような、コクシジオイデスカビ抗原 ；ならびに、トリコフィチンおよび他のコクシジオイデスカビ抗原成分のような 、白癬カビ抗原を含むが、これらに限定されない。 ４．寄生生物抗原 原生動物および他の寄生生物抗原の例は、分裂小体表面抗原、スポロゾイト表 面抗原、circumsporozoite抗原、生殖母細胞／生殖細胞(gamatocyte/gamete)表 面抗原、血液期抗原pf1 55/RESA、およびその他のプラズモディウム抗原成分の ような、熱帯熱マラリア原虫抗原；SAG-1、p30、および他のトキソプラズマ抗原 成分のような、トキソプラズマ抗原；グルタチオン-S−トランスフェラーゼ、パ ラミオシン、および他の住血球虫抗原成分のような、住血球虫抗原；gp63、リポ ホスフォグリカンおよびその関連タンパク質ならびに他のリーシュマニア抗原成 分のような、リーシュマニア主要抗原および他のリーシュマニア抗原；ならびに 、75〜77kDa抗原、56kDa抗原、および他のトリパノソーマ抗原成分のような、ト リパノソーマクルーズ抗原を含むが、これらに限定されない。 ５．腫瘍抗原 本発明の組成物および方法に使用され得る腫瘍抗原は、前立腺特異的抗原（PS A）、テロメラーゼ；P-糖タンパク質のような多剤耐性タンパク質；MAGE−1、α フェトプロテイン、ガン胎児性抗原、変異p53、パピローマウイルス抗原、ガン グリオシド、またはメラノーマもしくは他の腫瘍細胞の他の炭水化物含有成分を 含むが、これらに限定されない。任意の腫瘍細胞型からの抗原が、本明細書に記 載される組成物および方法に使用され得ることが、本発明によって意図され得る 。 ６．自己免疫に関与する抗原 自己免疫に関与されることが示され、寛容を誘導するための本発明の送達ビヒ クル中で使用され得る抗原は、ミエリン塩基性タンパク質、多発性硬化症のミエ リン稀突起神経膠細胞糖タンパク質およびプロテオリピドタンパク質、および慢 性関節リウマチのCIIコラーゲンタンパク質を含むが、これらに限定されない。 細菌DNAが免疫剌激特性を有し得ることは、公知である（Tokunagaら、J．Nat ．Cancer Insti.，1984，72:955;Togunagaら、Microbiol．Immunol.，1992，36: 55）。従って、上記記載の任意の１つ以上の抗原をコードする核酸については、 核酸は免疫剌激特性を有し、そして免疫刺激を与えることが実証された、詳細に 同定されたCpGモチーフを含み得ることが、望ましい（Kriegら、Nature，1995， 374:546;Yiら、Jour．Immunol.，1996，156:558）。 投与量、投与経路、および薬学的処方物 １つ以上の抗原またはそのエピトープをコードする核酸は、種々の感染因子お よび疾患に対する免疫防御を提供するための遺伝子治療において、本発明に従っ て使用され得る。核酸は、ある細胞型を特異的に標的化し得るか、またはレシピ エント細胞に関しては標的化され得ない、細胞への核酸を送達するためのビヒク ルの一部として、抗原提示細胞に送達され得る。本発明によるAPCへの核酸の送 達は、エキソビボ遺伝子治療またはインビボ遺伝子治療を介して、達成され得る 。予防および治療のワクチンについては、インビポ遺伝子治療が好ましく、そし て治療ワクチンには、エキソビボ遺伝子治療もまた適している。遺伝子は、トラ ンスフェクトされた細胞の患者への再注入前に、エキソビボで培養された細胞へ 送達され得るか、あるいは遺伝子は、患者の血管系または標的細胞に富む身体領 域に、直接インビボ注入によって、遺伝子送達ビヒクル複合体中で、送達され得 る。インビボ注入は、皮下、静脈内、筋肉内、または腹腔内になされ得る。送達 ビヒクルはまた、経口、鼻腔、腟、または尿道経路で送達され得、そしてマイク ロスフェア、遺伝子ガン、またはBioject^TMのような、他の送達ビヒクルと組み 合わ せて送達され得る。エキソビボおよびインビボ遺伝子治療のための技術は、当業 者に公知である。一般的に、組成物は、投与処方物に適合した様式、ならびに、 予防的および／または治療的に有効な量で、投与される。投与されるべき量は、 治療される被験体、例えば、被験体の抗体を合成する免疫系の能力、および所望 の防御の程度に依存する。適切な投与量範囲は、エキソビボでトランスフェクト された細胞が、患者に投与される場合、10⁵〜10⁸細胞のオーダーであり、そして 必要に応じて10⁶〜10⁷細胞が、単回投与で投与され；遺伝子／送達ビヒクル複合 体が投与される場合、複合体または混合物の100ng〜10mg、または1mg〜1mg、ま たは必要に応じて1μg〜10μgが、単回投与で投与される。初回投与および追加 免疫投与(booster shot)に対する適切な投薬計画もまた変えられるが、初回投与 に引き続く接種または他の投与によって類型化される。投与されるに必要な活性 成分の正確な量は、医療従事者の判断に依存し、そして各被験体に対して特有で あり得る。本発明の組成物の治療に有効な量は、とりわけ投与計画、投与される 抗原の単位投与量、または投与されるコードする核酸によって発現される抗原の 単位投与量、組成物が他の治療因子と組み合せて投与されるかどうか、レシピエ ントの免疫状態および健康、ならびに特定の核酸分子、送達複合体、またはエキ ソビボトランスフェクト細胞の治療活性に依存することは、当業者に明らかであ る。 本発明による複合体および混合物はまた、水、リン酸緩衝化生理食塩水、また は生理食塩水のような、生理学的に受容可能な希釈剤中に混合され得、そしてさ らに、アジュバントを含み得る。不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミ ニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンのようなアジュバントは、当該 分野で周知である物質である。注入、経口、経皮、または他の経路を介する、本 明細書に記載される組成物を用いる投与に際しては、宿主免疫系は、本明細書に 記載されているように、ポリペプチド抗原または核酸にコードされる抗原および ポリペプチド抗原に対して、抗原に対する有効な細胞性もしくは体液性免疫応答 のいずれか、または有効な細胞性および体液性免疫応答の両方を引き起こすこと によって応答する。 本発明の組成物は、単回投与計画、または複数回投与計画で与えられ得る。複 数回投与計画は、ワクチンの一次コースが、１〜10回の分離投与、引き続いて、 免疫応答の維持および／または強化に必要とされる後続時間間隔（例えば、第二 の投与量のために１〜４ヶ月）で投与される他の投与、そして必要な場合数ヶ月 後の後続投与を含み得る計画である。１〜５年、通常３年の間隔での周期的追加 免疫は、保護的免疫の所望のレベルを維持するために望まれ得る。免疫化のコー スは、ESAT6またはST-CFと同時培養される末梢血リンパ球（PBL）のインビトロ 増殖アッセイおよび感作リンパ球から放出されたIFN-γレベルを測定することに よって続けられ得る。アッセイは、放射ヌクレオチド、酵素、蛍光標識などのよ うな、従来の標識を使用して実施され得る。これらの技術は、当業者に公知であ り、そして米国特許第3,791,932号、第4,174,384号、および第3,949,064号に見 出され得、これらは本明細書によって参考として援用されている。 免疫応答の最大化を可能にすることに加えて、APCへのDNAおよび抗原を共送達 する能力は、誘導される免疫応答の型を調節し得る利点を有する。DNA免疫が、T ヘルパー１型（Thl）応答を引き起こす傾向にあり、一方、タンパク質免疫が、T ヘルパー２型（Th2）応答を誘導することは公知である（Razら、1996，PNAS 93: 5141）。従って、本発明の複合体または混合物のDNAおよびタンパク質／ペプチ ド成分の操作によって、免疫応答型は、各成分の相対量を変えることによって、 操作され得る。 本発明の複合体および混合物はまた、診断薬としての使用を見出し得る。例え ば、それらは、複合体または混合物を使用する治療レジメンに対する、特定個体 の感受性を決定するために使用され得、従って、既存の処置プロトコールの改変 、または罹患個体に対する予後の決定に、有用であり得る。さらに、個体が、ワ クチン接種が望まれる、微生物、病原体、または因子による感染を進行する重大 な危険にあることを予測するために、それらは使用され得る。 本発明は、予防的および治療的免疫応答の両方を生成するために使用され得る 。必要に応じて、免疫系は、同じ複合体もしくは混合物を使用すること、あるい は、本明細書に記載される種々の複合体もしくは混合物の組み合わせを使用する こと、または当該分野で公知の従来ワクチン（例えば、組換えタンパク質ワクチ ンまたは殺滅されたウイルスワクチン）と本明細書に記載されている複合体もし くは混 合物の組み合わせとを使用することのいずれかによって、感作または追加免疫さ れ得る。 実施例 １．以下の実施例は、動物モデルにおける、抗原提示細胞における細胞型特異的 発現を示す。トランスジェニックマウスのいくつかの株における単核細胞−マクロファージ系 統細胞におけるヒトグルコセレブロシダーゼ遺伝子の細胞型特異的発現 マウスMHCクラスII Ea遺伝子の遺伝子座制御領域（LCR．CarsonおよびWiles、 Nucl．AcidsRes.、21、（2065-2072(1993)））がグルコセレブロシダーゼ（GC） をコードするヒト遺伝子に結合した構築物を作製した。この構築物の線状化DNA でいくつかのトランスジェニック株を作製した。ヒトGCの発現および機能的活性 は、ほとんどのトランスジェニック株の脾臓細胞において検出可能であった。非 トランスジェニックマウス（ntg）は、検出可能なヒトGC活性を有さなかった。 脾臓は、B-リンパ球およびマクロファージ／樹状細胞の両方を有し、それゆえマ クロファージ／樹状細胞における発現を明確に証明し、活性化したトランスジェ ニックマクロファージの富化集団を、トランスジェニックマウスの腹膜へのチオ グリコレート注入によって産生させた。ヒトGCの発現のための得られたマクロフ ァージ集団の分析は、ヒトGC（モノクローナル抗体8E4によって検出される）を 豊富に発現するF4/80陽性マクロファージ（Gordonら、Curr．Topics．Microbiol Immunol.,（1992）181、-37）を示した。これは、MHCLCRを用いる異種遺伝子の APC特異的発現を示す。インビボワクチン接種：MHC LCR制御下でインフルエンザNPを発現するトランス ジェニックマウスの産生、およびトランスジェニック脾臓および骨髄細胞の移植 によるシンジェニック非トランスジェニック同腹仔における抗NP免疫の生成 APCにおける外来タンパク質の発現が保護的細胞性および／または体液性免疫 応答を生じさせ得ることを示すために、上記のように、インフルエンザNP遺伝子 がMHCクラスII Ea LCRの制御下で発現されるトランスジェニック株を作製した。 これらのマウス由来の脾臓細胞または骨髄細胞を単離し、そして非トランスジ ェニックのシンジェニックマウスに注入する。次いで、マウスを、NP遺伝子（こ れはドナー細胞およびそれらの分化した子孫に存在すると予想される）の発現に ついて分析した。移植レシピエントの分析は、いくつかがNP特異的細胞傷害性Ｔ 細胞および抗NP抗体応答を首尾良く産生していることが明らかであると予想され る。ウイルスキャプシドの血球凝集素成分に対して指向される免疫を生じさせるため の抗インフルエンザワクチン インフルエンザ血球凝集素（HA）遺伝子が上記のMHCクラスII Ea LCRの制御下 で発現されるトランスジェニック株を作製する。これらのマウス由来の脾臓細胞 または骨髄細胞を単離し、そして非トランスジェニックシンジェニックマウスに 注入する。次いで、マウスをHA遺伝子（ドナー細胞およびそれらの分化した子孫 に存在することが示される）の発現について分析する。移植レシピエントの分析 は、いくつかがHA特異的細胞傷害性Ｔ細胞および抗HA抗体応答を首尾良く産生し ていることを明らかにすることが予想される。抗HIVワクチン 上記のMHCクラスII Ea LCRの制御下で、HIV-1 tat、rev、nef、またはgag遺伝 子およびその組合わせを発現するトランスジェニックマウスを作製する。トラン スジェニック脾臓細胞のシンジェニック非トランスジェニックマウスへの移植は 、細胞傷害性Ｔ細胞応答（Ｔ細胞媒介細胞傷害性のためのクロム⁵¹放出アッセイ を用いてインビトロで測定され得る）を惹起することが予想される。Ｔ細胞応答 を測定するために、HIV-1 nef、rev、gag、およびtatタンパク質由来の免疫優性 ペプチドの存在下で、移植レシピエント由来のＴ細胞を、シンジェニックかつ、 非トランスジェニックな、照射され、Cr⁵¹標識された標的抗原提示細胞でチャレ ンジする。効果的なＴ細胞応答を、標的細胞溶解の結果としてCr⁵¹放出を測定す ることによって検出する。HIV-1 nef、rev、gag、およびtatに対する血清抗体応 答をまた、体液性応答の生成を確認するために移植レシピエントにおいて測定す る。抗Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）ワクチン MHCクラスII Ea LCRの制御下で、HBc、HBe、S、pre-S、およびpX遺伝子ならび にその組合せを発現するトランスジェニックマウスを作製する。トランスジェニ ック脾臓細胞のシンジェニック非トランスジェニックマウスへの移植は、細胞傷 害性Ｔ細胞応答（Ｔ細胞媒介細胞傷害性のためのクロム⁵¹放出アッセイを用いて インビトロで測定され得る）を惹起することが予想される。Ｔ細胞応答を測定す るために、HBc、HBe、S、pre-S、およびpXタンパク質由来の免疫優性ペプチドの 存在下で、移植レシピエント由来のＴ細胞を、シンジェニックかつ、非トランス ジェニックな、照射され、Cr⁵¹標識された標的抗原提示細胞でチャレンジする。 効果的なＴ細胞応答を、標的細胞溶解の結果としてCr⁵¹放出を測定することによ って検出する。HBc、HBe、S、pre-S、およびpXタンパク質に対する血清抗体応答 をまた、体液性応答の生成を確認するために移植レシピエントにおいて測定する 。抗Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）ワクチン MHCクラスII Ea LCRの制御下で、ヌクレオキャプシドタンパク質であるC22-3 、NS3およびNS4領域由来のC200およびC33cタンパク質、ならびにその組合せを発 現するトランスジェニックマウスを作製する。トランスジェニック脾臓細胞のシ ンェニック非トランスジェニックマウスへの移植は、細胞傷害性Ｔ細胞応答（Ｔ 細胞媒介細胞傷害性のためのクロム⁵¹放出アッセイを用いてインビトロで測定さ れ得る）を惹起することが予想される。Ｔ細胞応答を測定するために、ヌクレオ キャプシドタンパク質C22-3、NS3およびNS4領域由来のC200およびC33cタンパク 質由来の免疫優性ペプチドの存在下で、移植レシピエント由来のＴ細胞を、シン ジェニックかつ、非トランスジェニックな、照射され、Cr⁵¹標識された標的抗原 提示細胞でチャレンジする。効果的なＴ細胞応答を、標的細胞溶解の結果として Cr⁵¹放出を測定することによって検出する。ヌクレオキャプシドタンパク質C22- 3、NS3およびNS4領域由来のC200およびC22cタンパク質に対する血清抗体応答を また、体液性応答の生成を確認するために移植レシピエントにおいて測定する。抗ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）ワクチン MHCクラスII Ea LCRの制御下で、HPV 16タンパク質であるE1、E2、E7、E5、お よびE6ならびにその組合せを発現するトランスジェニックマウスを作製する。ト ランスジェニック脾臓細胞のシンジェニック非トランスジェニックマウスへの移 植は、細胞傷害性Ｔ細胞応答（Ｔ細胞媒介細胞傷害性のためのクロム⁵¹放出アッ セイを用いてインビトロで測定され得る）を惹起することが予想される。Ｔ細胞 応答を測定するために、E1、E2、E7、E5、およびE6タンパク質由来の免疫優性ペ プチドの存在下で、移植レシピエント由来のＴ細胞を、シンジェニックで、非ト ランスジェニックで、照射され、Cr⁵¹標識された標的抗原提示細胞でチャレンジ する。効果的なＴ細胞応答を、標的細胞溶解の結果としてCr⁵¹放出を測定するこ とによって検出する。E1、E2、E7、E5、およびE6タンパク質に対する血清抗体応 答をまた、体液性応答の生成を確認するために移植レシピエントにおいて測定す る。抗腫瘍ワクチン メラノーマ特異的抗原MAGE-1、チロシナーゼ、卵巣および乳房腫瘍において変 異されたHER2/neuプロトオンコジーンのマウスホモログ、HPV 16 E7タンパク質 、および3LL肺ガンにおいて変異されたコネキシン37タンパク質をコードする遺 伝子を発現するトランスジェニックマウス株を作製する。トランスジーンによっ てコードされるタンパク質に対する細胞傷害性Ｔ細胞媒介応答および体液性免疫 応答を惹起させるために、これらのトランスジェニックマウスの骨髄細胞および 脾臓細胞をシンジェニック非トランスジェニックマウスに移植する。引き続き、 MAGE-1/チロシナーゼ、HER2/neu、HPV-16 E7、およびコネキシン37トランスジェ ニック移植レシピエントおよび非移植コントロールを、それぞれB16マウスメラ ノーマ、マウス乳ガンT50/80、3LLマウス肺ガン、またはHPV 16ゲノムDNAでトラ ンスフェクトしたC3マウス腫瘍由来の腫瘍細胞で皮下注射し、そして腫瘍の増殖 をモニターする。移植レシピエントは、非移植コントロールよりはるかに減少し た腫瘍増殖を示すことが予想され、これは、保護的抗腫瘍免疫応答が生じている ことを確認する。 さらに、上記の型の腫瘍を既に有する非移植レシピエントは、上記の対応する 腫瘍特異的抗原をコードする遺伝子に対してトランスジェニックなシンジェニッ クマウス由来の骨髄細胞または脾臓細胞の注入によってそれらのガンが治癒する と予想される。 ２．本発明の送達ピヒクルを用いる遣伝子治療の例ウイルスキャプシドの血球凝集素成分に対して指向された免疫を産生する抗-イ ンフルエンザワクチン インフルエンザ血球凝集素（HA）遺伝子が上記のMHCクラスII Ea LCRの制御下 で発現されるプラスミドベクターを含む送達ビヒクルを、直接的な静脈内注射ま たはインビトロで培養された骨髄由来細胞のトランスフェクション（次いで患者 に静脈内に再注入される）によって被験体に投与する。患者の引き続く分析は、 数名の患者がHA特異的細胞傷害性Ｔ細胞および抗HA抗体応答を首尾良く産生して いることを明らかにすることが予想される。 残基57〜68に位置するHLA A2拘束エピトープを含むペプチドをコードするイン フルエンザマトリックスタンパク質遺伝子由来のヌクレオチド配列（Gotonら、1 987，Nature 326:331-332，Mossら、1991，PNAS 88:8987-8990）が上記のMHCク ラスII Ea LCRの制御下で発現されるプラスミドベクターを含む送達ビヒクルを 、直接的な静脈内注射またはインビトロで培養された骨髄由来細胞のトランスフ ェクション（次いで患者に静脈内に再注入される）によって被験体に投与する。 患者の引き続く分析は、数名の患者がHA特異的細胞傷害性Ｔ細胞を首尾良く産生 していることを明らかにすることが予想される。抗HIVワクチン HIV-1 tat、rev、nefまたはgag遺伝子、およびそれらの組み合わせが、MHCク ラスII Ea LCRの制御下で発現されるプラスミドベクターを含む送達ビヒクルを 、直接的な静脈内注射またはインビトロで培養された骨髄由来細胞のトランスフ ェクション（次いで患者に静脈内に再注入される）によって被験体に投与する。 患者の引き続く分析は、数名の患者がHIV-1 nef、rev、tatおよびgagタンパク質 に対するCTL応答を首尾良く産生していることを明らかにすることが予想される 。 効果的なＴ細胞応答を、標的細胞溶解の結果としてのCr⁵¹放出を測定することに よって検出する。HIV-1 nef、rev、tatおよびgagに対する血清抗体応答もまた、 移植レシピエントにおいて測定し、これは体液性応答の産生を確証する。 HIV p17 GagおよびHIV p24 Gag（Nixonら、1988，Nature 336:484-487，Nixon およびMcMichael，1991 AIDS 5:1 e049-1059）中のHLAB27およびB8拘束エピトー プを含むペプチドおよびそれらの組み合わせをコードするHIV-1 gag遺伝子由来 のヌクレオチド配列（mHCクラスII Ea LCRの制御下で発現される）を含有するプ ラスミドベクターを含む送達ビヒクルを、直接的な静脈内注射またはインビトロ で培養された骨髄由来細胞のトランスフェクション（次いで患者に静脈内に再注 入される）によって被験体に投与する。患者の引き続く分析は、数名の患者がGa gタンパク質配列に対するCTL応答を首尾良く産生していることを明らかにするこ とが予想される。効果的なＴ細胞応答を、標的細胞溶解の結果としてのCr⁵¹放出 を測定することによって検出する。抗Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）ワクチン HBV HBc、HBe、S、pre-S、およびpX遺伝子、ならびにそれらの組み合わせが、 MHCクラスII Ea LCRの制御下で発現されるプラスミドベクターを含む送達ビヒク ルを、直接的な静脈内注射またはインビトロで培養された骨髄由来細胞のトラン スフェクション（次いで患者に静脈内に再注入される）によって被験体に投与す る。患者の引き続く分析は、数名の患者がHBV HBc、HBe、S、pre-S、ならびにpX タンパク質に対するCTL応答を首尾良く産生していることを明らかにすることが 予想される。効果的なＴ細胞応答を、標的細胞溶解の結果としてのCr⁵¹放出を測 定することによって検出する。血清抗体応答もまた、移植片レシピエントにおい て測定し、これは体液性応答の産生を確証する。抗Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）ワクチン HCBヌクレオカプシドタンパク質C22-3、NS3およびNS4領域由来C200およびC33c タンパク質をコードする遺伝子、ならびにそれらの組み合わせが、MHCクラスII Ea LCRの制御下で発現されるプラスミドベクターを含む送達ビヒクルを、直接的 な静脈内注射またはインビトロで培養された骨髄由来細胞のトランスフェクショ ン（次いで患者に静脈内に再注入される）によって被験体に投与される。患者の 引き続く分析は、数名の患者がヌクレオカプシドタンパク質C22-3、NS3およびNS 4領域由来C200およびC22cタンパク質に対するCTL応答を首尾良く産生しているこ とを明らかにすることが予想される。効果的なＴ細胞応答を、標的細胞溶解の結 果としてのCr⁵¹放出を測定することによって検出する。ヌクレオカプシドタンパ ク質C22-3、NW3およびNS4領域由来C200およびC33cタンパク質に対する血清抗体 応答もまた、移植レシピエントにおいて測定し、これは体液性応答の産生を確証 する。抗ヒトパピローマウイルス（HPV）ワクチン HPV16タンパク質E1，E2、E7、E5およびE6をコードする遺伝子、ならびにそれ らの組み合わせが、MHCクラスII Ea LCRの制御下で発現されるプラスミドベクタ ーを含む送達ビヒクルを、直接的な静脈内注射またはインビトロで培養された骨 髄由来細胞のトランスフェクション（次いで患者に静脈内に再注入される）によ って被験体に投与する。患者の引き続く分析は、数名の患者がE1、E2、E7、E5お よびE6タンパク質に対するCTL応答を首尾良く産生していることを明らかにする ことが予想される。効果的なＴ細胞応答を、標的細胞溶解の結果としてのCr⁵¹放 出を測定することによって検出する。血清抗体応答もまた、移植レシピエントに おいて測定し、これは体液性応答の産生を確証する。抗腫瘍ワクチン メラノーマ特異的抗原MAGE-1、チロシナーゼ、卵巣および乳房の腫瘍において 変異するHER2/neuプロトオンコジーンのマウスホモログ、ならびにHPV 16 E7タ ンパク質をコードする遺伝子が、MHCクラスII Ea LCRの制御下で発現されるプラ スミドベクターを含む送達ビヒクルを、直接的な静脈内注射またはインビトロで 培養された骨髄由来細胞のトランスフェクション（次いで患者に静脈内に再注入 される）によって被験体に投与する。患者の引き続く分析は、数名の患者がMAGE -1、チロシナーゼ、HER2/neuまたはHPV E6またはE7タンパク質に対するCTL応答 を首尾良く産生していることを明らかにすることが予想される。効果的なＴ細胞 応答を、標的細胞溶解の結果としてのCr⁵¹放出を測定することによって検出する 。MAGE-1、チロシナーゼ、HER2/neu、あるいはHPV E6またはE7タンパク質に対す る血清抗体応答もまた、移植レシピエントにおいて測定し、これは体液性応答の 産生を確証する。さらに、腫瘍退行が観察され得る。 クラスIおよびクラスII MHCに関連する抗原の提示を（インビボで）可能にする 送達系の例 以下の例は、インビボでMHCクラスI応答とクラスII応答とを区別する方法、お よび本発明に従って調製および投与される構築物を用いて増大したMHCクラスII 媒介免疫応答を得る方法を当業者に教示する。送達ビヒクルへのペプチド/タンパク質の付加 ペプチド/タンパク質抗原を含有する送達系の投与が、抗原が単に核酸にコー ドされている送達ビヒクルの投与よりも多くのヘルパーＴ細胞応答（すなわち、 優性なクラスII拘束応答）を生じることを実証するために、抗原性ペプチドを有 するかまたは有さない送達ビヒクルでマウスをワクチン接種する。送達のために 意図された複合体を、インビボでの抗原およびDNAの両方の送達について予め試 験した。動物内で免疫応答を産生する能力について複合体処方物をスクリーニン グすることにより試験を行った。可能性がある複合体処方物としては、国際特許 出願PCT/GB96/01396に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されな い。送達ビヒクル内に含まれるDNAは、抗原性遺伝子またはインフルエンザ核タ ンパク質の遺伝子のいずれもコードしない。抗原性ペプチドは、適切な、クラス II提示する、NPのエピトープまたはNPタンパク質全体である。次いで、免疫化マ ウス由来のＴ細胞は、クラスIおよびクラスII拘束応答についてアッセイされる 。送達ビヒクルが抗原性ペプチド/タンパク質を含むが抗原遺伝子を含まない場 合、優性なクラスII拘束応答が観察され、一方、抗原性ペプチド/タンパク質お よび抗原遺伝子の両方の非存在下では、クラスII拘束応答は見られない。抗原遺 伝子の存在下では、クラスIおよびクラスII応答が観察されるが、抗原性ペプチ ド/タ ンパク質が送達ビヒクルに含まれる場合にはクラスＩI応答が増大される。従っ て、抗原性ペプチド/タンパク質の送達ビヒクルへの付加は、増大したクラスII 拘束応答を産生する。クラスI拘束CTL応答を、Cr⁵¹放出アッセイによって測定し 、そしてクラスII拘束ヘルパーＴ細胞応答を、Ｔ細胞増殖アッセイまたはサイト カイン放出アッセイによって測定する。抗原遺伝子への分泌シグナル配列の付加 哺乳動物細胞において機能的である分泌シグナル配列を有する抗原遺伝子をコ ードするDNAを含有する送達ビヒクルの投与が、非分泌型の抗原が生成される送 達ビヒクルの投与よりも大きなクラスII応答を生じることを実証するために、分 泌シグナル配列を有するかまたは有さないインフルエンザ核タンパク質遺伝子を コードするDNA分子を含有する送達ビヒクルでマウスをワクチン接種する。次い で、優性なクラスIおよびクラスII拘束応答をそれぞれ決定するために、免疫化 マウス由来のＴ細胞をCTLおよびヘルパーＴ細胞応答についてアッセイする。非 分泌抗原をコードする遺伝子での免疫化と比較した場合、分泌形態のNPで免疫化 されたマウスは、増大したヘルパーＴ細胞（すなわち、優性なクラスII拘束）応 答を示す。従って、抗原性遺伝子への分泌シグナル配列の付加は、増大したヘル パーＴ細胞応答（すなわち、優性なクラスII拘束応答）を産生する。 クラスIおよびクラスII MHCに関連する抗原の提示を（インビトロで）可能にす る送達系の例 以下の例は、MHCクラスIおよびクラスII免疫応答を区別するため、ならびに本 発明による構築物および方法を用いて増大したMHCクラスII免疫応答を得るため のインビトロアッセイを提供する。 樹状細胞（DC）が、GM-CSFおよびIL-4とともに１週間培養することによってイ ンビトロで末梢血単核細胞（PBMC）から得られ得ること（Romainら、(1994)J.Ex p.Med．180:83）、および次いでこれらの細胞が成熟し、ナイーブのアロジェニ ックＴ細胞を刺激する能力の増大および抗原をプロセスする能力の減少を生じ得 ること（Sallustoら、(1994)J.Exp.Med．179:1109）が示されている。このイ ンビトロ系は、送達ビヒクルの抗原コード遺伝子を送達する能力を評価するため 、およびクラスIまたはクラスII MHC分子による提示を評価するために利用され ている。 樹状細胞のトランスフェクション 本発明による複合体が、上記のインビトロで成熟した樹状細胞（DC）をトラン スフェクトし得ることを実証するために、DCをpEGFP-N1（Clonetechから市販さ れているプラスミド）を含有するペプチド複合体でトランスフェクトした。プラ スミドpEGFP-N1は、蛍光顕微鏡により可視化される場合にその自然の蛍光によっ て可視化され得る緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードする。ペプチド複合体を 、pEGF-N1の１μｇ当たり２μgのNBC9および0.6μgのLIP9を用いて作製した(Lip 9は、国際特許出願PCT/GB96/01396に記載されるようなNBC9のN-パルミチル誘導 体である）。以下の成分を以下の順番で添加し、各々の添加の後にサンプルウエ ルを混合することによって複合体を作製した： NBC 9（水中に10mg/ml） 43.75ml milli-Q濾過滅菌水 507.5ml 0.5Mリン酸緩衝液、pH7.4 43.75ml 5M NaCl 105ml pEGFP-N1（0.5mg/ml） 175ml Lip 9（1mg/ml） 52.9ml 混合物を、室温で１時間、そして４℃で一晩インキュベートした。次いで、85 0mlを3400mlのPEG希釈緩衝液中に希釈した。 PEG希釈緩衝液： 10％PEG 8000 25mMリン酸塩pH7.4 37.5mM NaCl DCを、Romaniら（J.Exp.Med．1994 180:80-93）に記載されるように生成した 。簡単には、PBMCを、当該分野で公知の標準プロトコルによってバフィーコート か ら調製した。PBMCを、RPMI-1640，10％FCS中に再懸濁し、そしてプラスチックデ ィッシュに接着させた。５％CO₂下で37℃にて２時間の後、非接着細胞を除去し 、接着細胞を穏やかに洗浄し、引き続いてGM-CSF（800U/ml）およびIL-4（500U/ ml）を用いて培養した。培養物に培養の２日毎にサイトカインを与えた。 培養の７日目に細胞を収集し、そしてRAT培地（RPMI 1640、ヒト血清アルブミ ン1mg/ml；ヒトトランスフェリン（部分的に飽和）50μg/ml）において1.26×10⁶ 細胞/mlに再懸濁した。６ウェルプレートを用いて、12μlの10mMのクロロキン および863μlのDCをウェルに添加した。次いで、ウェル当たりに125μlの複合体 を添加し、そして細胞を37℃、５％CO₂で４時間インキュベートした。細胞をウ ェルから取り出し、収集し、そしてウェル当たり1mlの完全培地（RPMI-1640，10 ％FCS）中に再懸濁し、そして37℃、５％CO₂での24時間インキュベーションのた めにプレートに戻した。次いで各ウェルを収集し、スライド上にサイトスピン（ cytospin）し、次いでトランスフェクト細胞を、LEICA蛍光顕微鏡を用いて可視 化した（ポジティブ細胞は緑に見える）。図３は典型的な視野を示す。 細胞が抗原を含有する複合体でトランスフェクトされ得、従って抗原およびDNA が同一の細胞に送達され得ることを実証する COS細胞を、K6ClIIペプチドおよびpCMVb（Clonetech）からなる複合体でトラ ンスフェクトした。一方、等価量の裸のDNAとともにインキュベートしたCOS細胞 は、トランスフェクションを示さない。 K6ClIIは、インフルエンザＡ核タンパク質（A/NT/60/68）のエピトープ、およ びDNAのリン酸骨格とのイオン性相互作用に関するリジン残基のストレッチを含 有するペプチドである。従って、このペプチドは、抗原-DNA結合融合ペプチドで ある。このペプチドの配列は：NH2-KKKKKKGGFLGFWRGENGRKTRSAYERMCNILKGK-COOH である。 DNAおよび複合体溶液を以下のように作製した：DNA溶液：100μg/ml pCMVb、2 5mMリン酸塩pH7.4、0.6MNaCl。複合体溶液：100μg/ml pCMVb、25mMリン酸塩pH7 .4、0.6M NaCl、200μg/ml K6ClII。これらの溶液を室温で１時間、次いで４℃ で一晩インキュベートした。複合体またはDNAとのインキュベーションの２ ４時間前に、COS細胞を６ウェルプレート中にウェル当たり1×10⁵細胞で播種し た（DMEM、10％ウシ胎児血清(FCS)中）。 DNAおよび複合体溶液を、20μg/mlの最終DNA濃度でPEG希釈剤（10％PEG 8000 、25mMリン酸塩pH7.4、37.5mM NaCl）に希釈した。COS細胞をトランスフェクシ ョンする直前に、COS細胞をPBSで洗浄し、そしてウェル当たりに875μlのRATQ培 地（137.14μMクロロキンを有するRAT培地）を添加した。次いで、ウェル当たり に125μlの希釈した複合体またはDNA溶液を添加し、そしてそれらの細胞を37℃ で５時間インキュベートした。次いで、製造業者の指示に従ってTropix Galacto -Light^TMキット（Tropix，カタログ番号BL300G）を用いて、細胞をb-ガラクトシ ダーゼ活性についてアッセイした。簡潔に述べると、ウェルをDMEM、10％FCSで 洗浄し、次いでウェル当たりに250μlの溶解緩衝液（キットにより提供される、 1mMで添加されたジチオスレイトールを有する）を添加した。次いで、細胞をは がし、そしてピペッティングで上下させて細胞溶解を促進した。溶解細胞をエッ ペンドルフチューブに移し、そして13Kで２分間遠心分離した。上清を、清潔な エッペンドルフチューブに移した。２〜10μlの上清をルミノメーター（luminom eter）アッセイチューブに添加し、そして溶解緩衝液で10μlになるまで満たし た。100mlの反応緩衝液を各チューブに添加し、サンプルを室温で60分間インキ ュべートし、次いでLight Emission AcceleratorおよびBarthoid lumat LB9501 ルミノメーターを用いて分析した。清澄化した細胞溶解物のタンパク質濃度を、 Bio-Rad DCタンパク質アッセイキット（Bio-Rad）を用いて測定した。次いで、 その結果を、タンパク質１mg当たりの相対光単位として表した（図７）。各トラ ンスフェクションを三つ組で行った。 明白に、裸のDNAでのCOS細胞のトランスフェクションは存在しないが、K6ClII /DNA複合体での非常に効率的なトランスフェクションが存在する。陽イオン性の ペプチド/DNA複合体がエンドサイトーシス経路によって細胞に取り込まれること が当該分野で公知であるので（Wagner，E.，Curiel，D.およびCotten，Matt（19 94）Advanced Drug Delivery Reviews 14：113−135）、K6ClIIペプチドを含有 するエピトープは、トランスフェクトされた細胞のエンドソームに送達されるは ずである。エンドソームは、それに対するクラスII抗原提示を生じるAPC送達の 区 画である。 DCが、抗原を含有する複合体でトランスフェクトされ得ることを実証する 上記の実施例に記載されたものと類似した複合体を作製する。これらの複合体 は、抗原性配列およびDNA結合配列（例えば、K6ClII）を含有するペプチド/タン パク質により縮重されるレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）をコード するDNAを含有し得る。複合体はまた、国際特許出願PCT/GB96/01396に記載され るような他のDNA縮重ペプチドまたは他の脂質化（llpidated）ペプチドを含み得 る。このような複合体は、COS細胞をトランスフェクトすることが示されており （上記を参照のこと）、そして複合体の実験的至適化は、DCのトランスフェクシ ョンを生じる。至適化は、DCをトランスフェクトする能力についてわずかに異な る複合体を経験的に試験することによって行われ得る。トランスフェクション効 率は、蛍光顕微鏡を用いた緑色蛍光タンパク質（GFP）発現細胞を可視化するこ と、あるいはルシフェラーゼまたはb-ガラクトシダーゼ活性を測定することのよ うな方法によって評価され得る。これらのレポータータンパク質を測定するため の方法論は本明細書中に記載されている。 細胞とともにインキュベートされる抗原が、送達ピヒクルに複合体化される場合 、遊離抗原よりも容易に細胞に会合することを実証する これらの実験に用いられる抗原は、上記のようなインフルエンザＡ核タンパク 質由来のエピトープ配列（K6CLII）を含有するペプチドである。このペプチドを 、フルオレセイン−マレイミドを用いて、システインを介して蛍光的に標識した 。標識は約７％の効率であった。標識のためのプロトコルは以下のとおりであっ た：4.2mgのK6CLIIを0.5mlの20mM MES，pH6.5に溶解させた。次いで、2.1mgのフ ルオレセイン-5-マレイミド（Molecular Probes，Europe）を250ulのエタノール に溶解させ、そしてペプチド溶液に添加した。エタノールを、撹拌溶液が清澄化 するまで滴加した。24℃で１時間後、サンプルを、PD−10カラム（Pierce&Warri ner，UK）で50％水性アセトニトリルを用いて脱塩した。標識ペプチドを含有す る画分を、凍結乾燥し、そして−20℃で保存した。このペプチドはK6ClII-F1と 呼ばれる。 K6ClII-f1およびpCMVluc（図６）を用いて、非ウイルス送達系を作製した。送 達ビヒクルを以下の方法で作製した。２つの別々の溶液を作製した。ペプチドお よびDNAペプチド溶液：滅菌水中に5mg/mlで19.2mlのK6ClII-Fを1180.8mlのl0mM HEPES，150mM NaCl（HBS）に添加した。DNA溶液：0.5mg/mlで56.5mlのpCMVlucを 1143.5mlのHBSに添加した。 次いで、ピペットで急速に添加し、続いて繰り返しピペッティングすることに より、ペプチド溶液をDNA溶液とフラッシュ混合（flash mixed）した。複合体溶 液を、細胞に添加する前に室温で１〜２時間放置した。 19.2mlのK6ClII-F1を5mg/mlで含むコントロールペプチド溶液を2380.8mlの10m M HEPES，150mM NaCl（HBS）に添加した。 複合体、ペプチドまたは緩衝液とのインキュベーションの24時間前に、COS細 胞を６ウェルプレートにウェル当たり1×10⁵細胞で播種した。COS細胞をPBSで１ 回洗浄し、そして800mlのRAT培地を添加した。次いで、200mlの複合体、遊離ペ プチドまたはHBSを細胞に添加した。30分間のインキュベーションの後に、細胞 をPBSで２回洗浄し、次いで2mlのPBS、1mM EDTAとともにインキュベートして、 接着細胞を放出させた。細胞を収集し、500mlのPBSに再懸濁し、そしてFACS分析 （Beckton Dickinson FACScan）によって分析した。複合体が送達される細胞は 、ペプチド単独とともにインキュベートされたものよりも蛍光と会合し、それ故 よりペプチド（すなわち、抗原）と会合することを、FACSデータは明白に示す（ 図５）。 抗原発現構築物でトランスフェクトされたDCは、自己のＴ細胞を剌激し得ること を実証する トランスフェクトされたDCが、関連するＴ細胞クローンを刺激し得ることが以 前に示されている（Alijagicら、Eur.J.Immunol．1995 25:3100-3107）。 ヒトPBMCを、当該分野で公知の方法によってバフィーコートから調製した（Cu rrent Protocols in Immunology，J.E．Coliganら編）。PBMCを、２つの部分に 分割し、一方からＴ細胞を、当該分野で公知の標準的な非Ｔ細胞枯渇（磁性ビー ズ）技術（Current Protocols in Immunology，J.E．Coliganら編）によって精 製し、そして他方の部分からDCを上記のように得た。 次いで、上記のものと類似した複合体によって、インフルエンザA核タンパク 質タンパク質をコードするプラスミドでDCをトランスフェクトした。複合体は、 PCT/GB96/01396に記載されるようなトランスフェクション効率を増大させるため の至適化を必要とする。次いで、トランスフェクトDCを、種々の割合で自己のＴ 細胞とともにインキュベートし、そしてＴ細胞の増殖性応答を、当業者に公知の 方法論による³H-チミジン取り込みによって測定した（Current Protocols in Im munology，J.E．Coliganら編）。トランスフェクトDCの存在下では、Ｔ細胞増殖 は、非トランスフェクトDCとともにインキュベートされる場合よりも実質的に大 きいことが予期される。 多数の方法により、インフルエンザ核タンパク質（NP）の提示が分析され、そ れがクラスIまたはII拘束であるかを評価し得る。Ｔ細胞集団のCD4+またはCD8+ サブセットを刺激するDCの能力を測定し得る。異なるDC:Ｔ細胞の割合で、自己 のCD4+またはCD8+細胞のいずれかとともにトランスフェクトDCをインキュベート する。次いで、Ｔ細胞の相対的な増殖は、抗原（NP）がクラスIまたはクラスII 拘束様式で提示されているかどうかの評価を可能にする。CD4+細胞の刺激はクラ スII提示を示し、一方、CD8+細胞の刺激はクラスI提示を示す。 NP発現プラスミドでのDCのトランスフェクションの後、DCは、CD4+細胞よりも 高い程度に増殖するようにCD8+を刺激し得、従って抗原提示は主にMHCクラスI拘 束であった。抗原提示のクラスIまたはII拘束をまた、トランスフェクトDCが自 己のＴ細胞とともにインキュベートされたときに産生されるサイトカインの分析 によって測定し得る。トランスフェクトDCおよび自己のＴ細胞を、異なる割合（ 通常、1:1〜1:100のDC:Ｔ細胞の範囲）でいっしょにインキュベートする。 DCに送達される抗原は自己のＴ細胞に提示されること、そして提示は主としてMH CクラスII提示によることを実証する 抗原は、送達ビヒクル中に抗原を含ませることによってDCに送達され得る。多 数の方法により、抗原は送達系中に含まれ得る。抗原は、結合化学によって、DN A結合ペプチドに結合され得る。結合化学としては、国際特許出願PCT/GB96/0139 6に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。抗原はエピト ープであり得、これは、DNA結合配列とともに、標準的なペプチド化学技術によ って合成され得る。抗原はまた組換え分子であり得、これは、抗原および単一、 または複数のDNA結合配列を含有するように設計される。上記の場合、抗原は、D NA結合官能基とDNAのリン酸骨格との間のイオン性相互作用によって複合体に結 合される。抗原-DNA結合配列結合体は、送達ビヒクル内の唯一のDNA凝縮因子で あってもよいし、なくてもよい。抗原はまた、疎水性、静電気性、共有結合性、 または他の相互作用によって送達ビヒクルに結合され得る。抗原は、免疫応答が 産生され得る任意のタンパク質またはその一部であり得る。 抗原を含有する送達ビヒクルは、以下のように試験されることによって、DCへ の抗原の送達の効率について試験され得る。試験複合体が作製され、そして抗原 が送達されたDCによる抗原の提示を測定することによって、DCに抗原を送達する 能力について試験される。抗原の提示を測定する方法は以下に記載される。送達 が、より良好な核酸/抗原送達のために至適化され得る方法は、国際特許出願PCT /GB96/01396に記載される。 次いで、複合体を用いて、抗原含有送達ビヒクルとともにインキュベートされ たDCが、Ｔ細胞に対する抗原を提示し得ることが示され得る。これらの実験に用 いられる抗原は、「リコール抗原」であるべきである。リコール抗原は、そこか らDCおよびＴ細胞が精製されたドナーが、その抗原に対してすでに免疫応答を産 生している抗原である。リコール抗原の例は、テタヌストキソイドおよびインフ ルエンザ核タンパク質（インフルエンザに以前に感染しているドナーにおける） である。リコール抗原の提示は、DCと自己のＴ細胞とのインキュベーションおよ び³H-チミジン取り込みを測定することによるＴ細胞の増殖の測定によって評価 され得る。DCおよびＴ細胞を、種々の割合（通常、1:1-1:100のDC:Ｔ細胞）でイ ンキュベートする。抗原がクラスIまたはクラスII MHC分子によって提示される かどうかを試験するために、多数のアッセイの内の１つが実行され得る。これら には、Ｔ細胞集団のCD4+またはCD8+サブセットを刺激するDCの能力の測定、また はDCが自己のＴ細胞とともにインキュベートされたときのサイトカイン産生の 測定が挙げられるがこれらに限定されない。Ｔ細胞集団のCD4+またはCD8+サブセ ットを刺激するDCの能力を測定するために、トランスフェクトDCを異なるDC:Ｔ 細胞割合で自己のCD4+またはCD8+Ｔ細胞のいずれかとともにインキュベートする 。次いで、Ｔ細胞の相対増殖は、抗原がクラスIまたはクラスII拘束様式で提示 されているかの評価を可能にする。CD4+細胞の刺激はクラスII提示を示し、一方 、CD8+細胞の剌激はクラスI提示を示す。 サイトカイン産生を測定するために類似したアッセイを設定する。DCを、自己 のＴ細胞とともにインキュベートし、そして所定の時点（通常24時間であるが、 常にそうであるとは限らない）の後、培地のサンプルを採取し、サイトカインに ついてアッセイする。一般に測定されるサイトカインの例は、IFN-γ（Th1応答 を示す）またはIL-4（Th2応答を示す）である。市販のキットは、これらのサイ トカインのレベルを測定するために入手可能である（R&D Systems）。サイトカ イン産生をまた、ELISPOT技術に基づくより感受性の高いアッセイによって測定 し得る（Current Protocols in Immunology，J.E．Coliganら編）。 DCへの抗原およびDNAの送達が、抗原またはDNA単独の送達よりも自己のＴ細胞か らより強い増殖応答を産生することを実証する 抗原単独またはDNA単独のDCへの送達は、一般に、DCの表面上での、MHC分子と 結合して、抗原のエピトープの提示を導く。抗原の送達は、MHCクラスII分子と 結合した提示を導く傾向にあり、一方、DNAの送達（すなわちDCのトランスフェ クション）は、一般にクラスI分子と結合した提示を導く。DNAおよび抗原の両方 の送達は、DNAまたは抗原単独のいずれかを送達することと比較して、DCによる 増大した提示を導く。 抗原およびDNAを含有する送達ビヒクルを、標的APC細胞への至適な送達のため に、以下のように試験し得る。試験送達ビヒクルを作製し、そして抗原が送達さ れているDCによる抗原の提示を測定することによって、抗原およびDNAをDCに送 達する能力について試験する。抗原の提示を測定する方法は、２つの上記の実施 例に記載されている。より良好な送達のために複合体が至適化され得る方法は、 国際特許出願PCT/GB96/01396に記載されている。 DNAおよび抗原の両方が送達されるDCは、DNAまたはタンパク質/ペプチド抗原 のみが送達されているDCと比較して、自己のＴ細胞の増殖を剌激する能力（³H- チミジン取り込みによって測定される）の増大を示すことが予期される。従って 、DNAおよびペプチド/タンパク質抗原の両方の送達は、いずれかの別々の送達と 比較して、免疫応答の産生に関して有意な利点を示すことが予期される。 本発明はまた、混合物としての、２つの別々の成分（(1)核酸および（ii）ペ プチド抗原）の同時投与を含む。このような同時投与は、DNAまたはタンパク質/ ペプチド抗原のみが送達されているAPCと比較して、自己のＴ細胞の増殖を剌激 する能力の増大を生じることが予期される。抗原の遺伝子への分泌シグナルの付加 哺乳動物細胞において機能性である分泌シグナル配列を有する抗原の遺伝子を コードするDNAを含有する送達ビヒクルの投与が、非分泌バージョンの抗原が産 生される送達ビヒクルの投与よりも大きなクラスII応答を生じることを実証する ために、分泌シグナル配列を有するかまたは有さないインフルエンザ核タンパク 質遺伝子をコードするDNA分子を含有する送達ビヒクルでインビトロ由来の樹状 細胞（以前インフルエンザAに感染したドナー由来）をトランスフェクトする。 次いで、トランスフェクトDC（トランスフェクトDCとして同じPBMから調製した ）とともにインキュベートした場合のシンジェニックＴ細胞をクラスIおよびク ラスII拘束応答についてアッセイする。非分泌抗原をコードする遺伝子でのトラ ンスフェクトされたＤＣと比較した場合、分泌形態のNPでトランスフェクトした 樹状細胞は、増大したクラスII拘束Ｔ細胞活性を示す。従って、抗原の遺伝子へ の分泌シグナル配列の付加は、増大したクラスII拘束応答を産生する。 本発明による複合体または混合物（エピトープおよび核酸を含有する）が、遊離 エピトープよりも強い免疫応答を誘導することの比較実証 送達複合体の一部としてのエピトープまたは抗原の送達が、「遊離」抗原（す なわち、核酸を含まないペプチドまたはポリペプチドのようなエピトープあるい は抗原）の送達よりも、免疫原性を誘導するにおいてより効果的であることを実 証するために、マウスを本発明による混合物または複合体（すなわち、核酸およ びペプチド抗原）、または核酸を含まない同一のペプチドでワクチン接種する。 ワクチン接種したマウスにおける免疫応答を、当業者に周知の標準的な免疫学的 アッセイによって測定する。このようなアッセイには、本明細書中に記載される ような、CR⁵¹放出アッセイ、Ｔ細胞増殖アッセイおよびサイトカインアッセイ（ Current Protocols in Immunology，J.E．Coliganら編）が挙げられる。 例えば、比較実証を、免疫化されているマウス株によって提示されることが知 られている抗原性タンパク質のエピトープからなる抗原（例えば、インフルエン ザ核タンパク質のペプチドエピトープ）を用いて実施し得るか、あるいはそれは インフルエンザ核タンパク質のようなタンパク質全体であり得る。マウスを、皮 下、静脈内、腹腔内または他の経路によってワクチン接種する。マウスを、初回 注射の後の１〜４週間の期間に迫加免疫注射に供し得る。マウスを、初回または 追加免疫注射の少なくとも３週間後に屠殺し、それらの脾細胞を収集し、そして 標準的な免疫学的アッセイに供して、免疫応答のレベルを決定する。本発明によ る複合体または混合物を、より効果的な免疫応答を惹起するように決定する。こ こで、本発明による複合体または混合物で免疫化したマウス由来の脾細胞の試験 抗原に対する増殖性応答は、抗原単独で免疫化された動物由来の脾細胞の増殖性 応答よりも、規模において少なくとも２倍、そして好ましくは５〜10倍大きい。 一旦、免疫応答の規模が、比較アッセイにおいて少なくとも２倍大きいと決定 されると、産生される免疫応答の型が、Cr⁵¹放出アッセイおよびサイトカインア ッセイを用いてさらに定義される。本発明による複合体または混合物は、好まし くは、細胞性および体液性免疫応答の両方を惹起し、それらのうちの少なくとも 一方が、比較アッセイにおいてコントロールまたは先行技術のワクチンよりも規 模において２倍以上大きい。あるいは、本発明の複合体または混合物は、細胞性 または体液性免疫応答のいずれかを惹起し、その応答は、比較的なアッセイにお いてコントロールまたは先行技術のワクチンよりも規模において少なくとも２倍 、そして好ましくは５〜10倍大きい。細胞性免疫応答は、Cr⁵¹放出アッセイによ って測定されるような、細胞傷害性Ｔ細胞応答によって示され、そしてクラスI 拘束応答を示す。抗マウスCD4対抗マウスCD8抗体の存在下におけるこの応答の測 定 は、応答のMHC拘束、および免疫応答が体液性免疫応答にも関与するかどうかの より正確な指標を提供し得る。すなわち、抗CD8抗体の存在下での応答はクラスI I拘束であり、一方、抗CD4抗体の存在下での応答はクラスI拘束である。抗CD4ま たは抗CD8抗体はまた、免疫応答がMHCクラスIまたはMHCクラスII拘束であるかど うかを示し得る増殖アッセイにおいて用いられ得る。 他の実施態様 他の実施態様は以下の請求の範囲内に存在する。本明細書中に引用される参考 文献の内容は、参考として本明細書中に援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 7/08 // Ｃ０７Ｋ 7/08 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (31)優先権主張番号 ９６１４５４８．７ (32)優先日 平成８年７月11日(1996．7．11) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ６０／０２４，１１６ (32)優先日 平成８年８月16日(1996．8．16) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳動物に疾患のワクチン接種をする方法であって、 該哺乳動物に、(i)第１のエピトープをコードする核酸、および(ii)第２のエ ピトープを含むペプチドの混合物を、該核酸および該ペプチドが、該哺乳動物の プロフェッショナル抗原提示細胞によって取り込まれ、そして該核酸が該細胞に おいて発現されるように投与する工程であって、該疾患に対する免疫応答が、該 哺乳動物において該両エピトープに対して惹起される、工程 を包含する、方法。 ２．前記投与される混合物が、(i)前記第１のエピトープをコードする前記核酸 、および(ii)前記第２のエピトープを含む前記ペプチドを含む複合体を含み、該 複合体が、前記哺乳動物のプロフェッショナル抗原提示細胞によって取り込まれ 、そして該核酸が該細胞において発現される、請求項１に記載の方法。 ３．哺乳動物に疾患のワクチン接種をする方法であって、 該哺乳動物のプロフェッショナル抗原提示細胞に、(i)第１のエピトープをコ ードする組換え核酸、および(ii)該抗原提示細胞に通常は存在しない第２のエピ トープを含むペプチドを含有する混合物を投与する工程であって、該投与の際に 、該疾患に対する免疫応答が、該哺乳動物において該両エピトープに対して惹起 される、工程 を包含する、方法。 ４．前記第１および第２のエピトープが同一のエピトープである、請求項１、２ 、または３に記載の方法。 ５．前記第１および第２のエピトープが異なるエピトープである、請求項１、２ 、または３に記載の方法。 ６．前記第１および第２のエピトープが単一ポリペプチドのエピトープである、 請求項５に記載の方法。 ７．前記第１のエピトープが第１のポリペプチドのエピトープであり、前記第２ のエピトープが第２のポリペプチドのエピトープである、請求項５に記載の方法 。 ８．前記第１および第２のエピトープが単一生物のエピトープである、請求項７ に記載の方法。 ９．前記核酸が１より多いエピトープをコードする、請求項１、２、または３に 記載の方法。 １０．前記第１および/または第２のエピトープが感染性因子に由来する、請求 項１、２、または３に記載の方法。 １１．前記第１および/または第２のエピトープが、疾患の過程で前記哺乳動物 に存在する、請求項１、２、または３に記載の方法。 １２．前記核酸が複数遺伝子構築物を含む、請求項１、２、または３に記載の方 法。 １３．前記複数遺伝子構築物の遺伝子が協調して発現される、請求項１２に記載 の方法。 １４．前記疾患が感染性病原体により引き起こされ、そして前記核酸が該病原体 のゲノムに由来するオープンリーディングフレームを含む、請求項１１に記載の 方法。 １５．前記核酸が前記病原体のゲノムに由来する複数のオープンリーディングフ レームを含む、請求項１４に記載の方法。 １６．前記核酸が前記第１のエピトープおよび第２のエピトープをコードし、該 第１のエピトープが第１の疾患の過程で哺乳動物に存在し、該第２のエピトープ が第２の疾患の過程で哺乳動物に存在し、そして前記投与が該第１および第２の 疾患に対して免疫応答を惹起する、請求項１、２、または３に記載の方法。 １７．前記第１の疾患が第１の病原体によって引き起こされ、前記第２の疾患が 第２の病原体によって引き起こされる、請求項１６に記載の方法。 １８．前記第２のエピトープが、核酸結合アミノ酸配列に融合した前記第２のエ ピトープを含む２ドメインポリペプチドに存在し、前記哺乳動物への該ポリペプ チドの投与の際に、免疫応答が該エピトープに対して惹起される、請求項１、２ 、または３に記載の方法。 １９．前記第２のエピトープが前記核酸にコードされるエピトープと同一の生物 に由来する、請求項１８に記載の方法。 ２０．前記第１および/または第２のエピトープがインフルエンザNPの免疫優勢 エピトープを含む、請求項１、２、または３に記載の方法。 ２１．前記核酸が、遺伝子座制御領域に作動可能に連結されたコード配列の発現 を、プロフェッショナル抗原提示細胞に限定する該遺伝子座制御領域をさらに含 む、請求項１、２、または３に記載の方法。 ２２．前記遺伝子座制御領域がMHCクラスIILCRまたはIgLCRである、請求項２１ に記載の方法。 ２３．前記複合体が、プロフェッショナル抗原提示細胞を標的化するための細胞 標的化リガンドをさらに含む、請求項２に記載の方法。 ２４．哺乳動物に疾患のワクチン接種をする方法であって、 該哺乳動物に、(i)核酸、および(ii)第１のエピトープを含むペプチドの複合 体を、該核酸および該ペプチドが、該哺乳動物のプロフェッショナル抗原提示細 胞によって取り込まれるように投与する工程であって、該疾患に対する免疫応答 が、該哺乳動物において該第１のエピトープに対して惹起される、工程 を包含する、方法。 ２５．前記第１のエピトープが感染性因子または感染性生物に由来する、請求項 ２４に記載の方法。 ２６．前記第１のエピトープが疾患の過程で該哺乳動物に存在する、請求項２４ に記載の方法。 ２７．前記複合体が第２のエピトープをさらに含む、請求項２４に記載の方法。 ２８．前記第１および第２のエピトープが同じ抗原のエピトープである、請求項 ２７に記載の方法。 ２９．前記第１および第２のエピトープが同じ感染性因子または感染性生物のエ ピトープである、請求項２７に記載の方法。 ３０．前記第１および/または第２のエピトープがインフルエンザNPの免疫優勢 エピトープを含む、請求項２７から２９のいずれかに記載の方法。 ３１．前記複合体が、プロフェッショナル抗原提示細胞を標的化するための細胞 標的化リガンドをさらに含む、請求項２４に記載の方法。 ３２．前記第１のエピトープが、核酸結合アミノ酸配列に融合した前記第１のエ ピトープを含む２ドメインポリペプチドに存在する、請求項２４に記載の方法。 ３３．哺乳動物に疾患のワクチン接種をするための組成物であって、 (i)第１のエピトープをコードする核酸およびそのべクターをエピソーム形態 に維持することを可能にする配列を含むベクター、および(ii)第２のエピトープ を含むペプチドを含む複合体を含み、 ここで、該複合体が、プロフェッショナル抗原提示細胞によって取り込まれ、 そして該核酸が該細胞において発現され、該疾患に対する免疫応答が、該哺乳動 物において該エピトープに対して惹起される、組成物。 ３４．前記複合体が抗原提示細胞における選択的発現に適合されている、請求項 ３３に記載の組成物。 ３５．哺乳動物に疾患のワクチン接種をするための組成物であって、 (i)第１のエピトープをコードする核酸、そのベクターをエピソーム形態に維 持することを可能にする配列、および抗原提示細胞におけるそのベクター配列の 選択的発現を得るための遺伝子制御エレメントを含むベクター、および(ii)第２ のエピトープを含むペプチドを含む複合体を含み、 ここで、該複合体が、プロフェッショナル抗原提示細胞によって取り込まれ、 そして該核酸が該細胞において発現され、該疾患に対する免疫応答が、該哺乳動 物において該エピトープに対して惹起される、組成物。 ３６．前記遺伝子制御エレメントが、遺伝子座制御領域に作動可能に連結された コード配列の発現を、プロフェッショナル抗原提示細胞に限定する該遺伝子座制 御領域を含む、請求項３５に記載の組成物。 ３７．前記ベクターをエピソーム形態に維持することを可能にする前記配列が、 パピローマウイルス配列を含む、請求項３３または３５に記載の組成物。 ３８．前記パピローマウイルス配列が最小複製起点および最小維持エレメントを 含む、請求項３７に記載の組成物。 ３９．前記パピローマウイルス配列がE1およびE2遺伝子をさらに含む、請求項３ ７に記載の組成物。 ４０．前記パピローマウイルス配列がウシパピローマウイルスに由来する、請求 項３７に記載の組成物。 ４１．前記複合体が、前記ベクターにおける、遺伝子座制御領域の存在によって 、抗原提示細胞における選択的発現について適合され、ここで、該遺伝子座制御 領域は、これに作動可能に連結された核酸コード配列の発現を、プロフェッショ ナル抗原提示細胞に限定する、請求項３４に記載の組成物。 ４２．前記遺伝子座制御領域は、MHCクラスIILCRまたはIgLCRの１つである、請 求項３４または４１に記載の組成物。 ４３．前記核酸が１より多いエピトープをコードする、請求項３３または３５に 記載の組成物。 ４４．前記エピトープが感染性因子のエピトープである、請求項３３または３５ に記載の組成物。 ４５．前記抗原が疾患の過程で前記哺乳動物に存在する、請求項３３または３５ に記載の組成物。 ４６．前記核酸が複数遺伝子構築物を含む、請求項３３または３５に記載の組成 物。 ４７．前記疾患が感染性病原体によって引き起こされ、そして前記核酸が該病原 体のゲノムに由来するオープンリーディングフレームを含む、請求項４４に記載 の組成物。 ４８．前記核酸が、第１の疾患の過程で哺乳動物に存在する第１のエピトープお よび第２の疾患の過程で哺乳動物に存在する第２のエピトープをコードし、それ によって該第１および第２の疾患に対する免疫応答が惹起される、請求項４６に 記載の組成物。 ４９．前記第１の疾患が第１の病原体によって引き起こされ、前記第２の疾患が 第２の病原体によって引き起こされる、請求項４８に記載の組成物。 ５０．前記複合体が、該複合体における、レセプターまたは抗原提示細胞を標的 化するための標的化リガンドの存在によって、抗原提示細胞における選択的発現 について適合されている、請求項３４に記載の組成物。 ５１．前記第２のエピトープが、DNA結合アミノ酸配列および該エピトープを含 む２ドメインペプチドの部分である、請求項３３に記載の組成物。 ５２．前記第２のエピトープが前記核酸にコードされたエピトープと同じ生物に 由来する、請求項５１に記載の組成物。 ５３．前記第２のエピトープがインフルエンザNPの免疫優勢エピトープを含む、 請求項５２に記載の組成物。 ５４．前記第１のエピトープまたは前記第２のエピトープがインフルエンザNPの 免疫優勢エピトープを含む、請求項３３または３５に記載の組成物。