JP2000506145A

JP2000506145A - 硫化塩によるタンパク質の結晶化

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Publication number: JP2000506145A
Application number: JP9531365A
Authority: JP
Inventors: ニエルソン，スティーグ; アーゲラウストセン，マーズ
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1996-03-08
Filing date: 1997-03-03
Publication date: 2000-05-23
Also published as: WO1997032894A1; DE69734708D1; US6066481A; DE69734708T2; EP0892810A1; CN1213375A; DK0892810T3; ATE310745T1; EP0892810B1; AU2021797A

Abstract

(57)【要約】本発明はタンパク質溶液から得られるタンパク質の結晶化のための方法であって、（ａ）６未満の酸化状態で有する硫黄原子を含む塩による当該タンパク質溶液の処理；（ｂ）結晶状態での当該タンパク質の回収；を含んで成る方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】硫化塩によるタンパク質の結晶化技術分野本発明は塩によるタンパク質の結晶化のための簡単、安価且つ非常に効率的な方法に関する。背景技術酵素は通常工業用目的のために液体又は非晶質材料として供与される。液体として供与されないときは、それらは通常非晶質材料として供与され、なぜなら酵素の結晶化のための公知の方法は工業スクールで利用されるには高価すぎると通常考えられているからである。酵素の結晶化に関する幾多の論文がある。特異的な結晶化手順の結果について一般化することは難しく、なぜなら酵素の結晶化技術は非常に経験的なものだからである。今日に至るほとんどの公知のタンパク質結晶化プロセスの特徴は、純粋且つ濃厚な初期溶液、非常に長い結晶化時間、塩類の如き化学品の多量の消費にある。参考のため、例えばBiotechnology and Bioengineering 48，1995，p 316-323を参照のこと。ポリエチレングリコールを利用する工業的酵素結晶化プロセスも発表されている。参考のため、例えばWO 95／01989を参照のこと。溶液から塩類を抽出し、次いで溶液のpHを酵素のpI付近に調整することにより酵素を結晶化させることも可能であることが発表されている。参考のため、WO 9 4／22903を参照のこと。発明の概要本発明において、驚くべきことに酸化性の硫化塩類が結晶化塩類として非常に有効であることが見い出された。これらは非純粋溶液で低量で用いられ、簡単、安価且つ環境に優しい工程に短い結晶化時間及び高収量を供する。従って、本発明はタンパク質溶液から得られるタンパク質の結晶化のための方法であって、（ａ）６未満の酸化状態を有する硫黄原子を含む塩による当該タンパク質溶液の処理；（ｂ）結晶状態でのタンパク質の回収；を含んで成る方法を提供する。図面の簡単な説明本発明を添付図面を参照しながら更に説明する。図１は温度坂路、即ち、実施例１に記載の通りにして一次核形成速度を管理するために利用した温度と時間との関係を示す。発明の詳細な開示本発明はタンパク質溶液、特に発酵（培養）液からのタンパク質又はポリペプチドの結晶化のための方法を提供する。発酵液は注目のタンパク質の他に多種多様のその他のタンパク質、例えば基質化合物、例えば炭水化物及び塩類、細胞、並びにその他の代謝物、例えば核酸及び注目のタンパク質以外のタンパク質を含む。好ましくは、本発明の方法は、例えば凝集、遠心、濾過、ミクロ濾過、限外濾過、透析濾過(diafiltration)、電気透析、吸着、沈殿、蒸発又は任意のそれらの組合せにより予め精製しておいた発酵液に適用する。本発明の方法は比較的不純な溶液に対して非常に良く働くため（実施例１参照のこと）、結晶化前にクロマトグラフィー方法を利用することにより発酵液から得られるタンパク質溶液を精製することは通常必要とされないであろう。より特異的な態様において、本発明の方法は周知の方法によるタンパク質含有溶液の濃縮を含んで成る。かかる方法には限外濾過による、透析濾過による、透析による、又は蒸発による濃縮が含まれる。タンパク質含有溶液の濃縮は結晶化の実施にあたって必須ではないが、取扱い及び収量の観点から好都合である。実用的な理由のため、タンパク質含有溶液は 0.1〜25重量％、好ましくは0.5〜20重量％、より好ましくは１〜15重量％、更により好ましくは５〜12重量％のタンパク質含有量へと濃縮してよい。好適な態様において、本発明の方法は酵素や、特にプロテアーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、イソメラーゼ及びオキシドリダクターゼより成る群から選ばれる酵素の結晶化に適用される。プロテアーゼ本発明に従って結晶化させるのに適当なプロテアーゼには微生物の如き細胞に由来する発酵産物でありうる任意のプロテアーゼが含まれる。細菌又は真菌起源が好ましい。化学又は遺伝子的に修飾した突然変異体が含まれる。このプロテアーゼはセリンプロテアーゼ、好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼであってよい。アルカリ性プロテアーゼの例はスブチリシン、特にバチルス（Bacillus）由来のもの、例えばスブチリシンNovo、スブチリシン・カールスバーグ、スブチリシン309、スブチリシン147及びスブチリシン168である（WO 89／06279に記載）。トリプシン様プロテアーゼの例はトリプシン（例えばブタ又はウシ起源のもの）及びWO 89／06270 に記載のフサリウム（Fusarium）プロテアーゼである。好適な市販のプロテアーゼ酵素にはNovo Nordisk A/S（デンマーク）により商標名Alcanase，Savinase，Primase，Durazym及びEsperaseで販売されているもの、Gist-Brocadesにより商標名Maxatase，Maxacal，Maxapem及びProperaseで販売されているもの、Genecor Internationalにより商標名Purafect及びPurafect OX Pで販売されているもの、並びにSolvay Enzymesにより商標名Opticlean及びOpti maseで販売されているものが含まれる。リパーゼ本発明に従って結晶化するのに適当なリパーゼには微生物の如き細胞由来の発酵産物でありうる任意のリパーゼが含まれる。細菌又は真菌起源が好ましい。化学又は遺伝子的に修飾したと突然変異体が含まれる。有用なリパーゼの例には、フミコラ・ラヌギノーザ(Humicola lanuginosa)リパーゼ、例えばEP 258,068及びEP 305,216に記載のもの、リゾムコール・ミーヘイ (Rhizomucor miehei)リパーゼ、例えばEP 238,023に記載のもの、カンジダ(Ca ndida )リパーゼ、例えばＣ．アンタルクチカ(C ．antarctica)リパーゼ、例えばＣ．アンタルクチカリパーゼＡ又はＣ（EP 214,761に記載）、シュードモナス(P seudomonas )リパーゼ、例えばＰ．アルカリゲンス（P ．alcaligenes）及びＰ．シュードアルカリゲンス（P ．pseudoalcaligenes）リパーゼ、例えばEP 218,272 に記載のもの、Ｐ．セパシア（P ．cepacia）リパーゼ、例えばEP 331,376に記載のもの、Ｐ．スタッツェリ(P ．stutzeri)リパーゼ、例えばBP 1,372,034に記載のもの、Ｐ．フルオレセンス（P ．fluorescens）リパーゼ、バチルスリパーゼ、例えばＢ．スブチリス (B ．subtilis)リパーゼ(Darroisら（1993）Biochemica et Biophysic a acta 1131，253-260)、Ｂ．ステアロサーモフィルス(B ．stearothermophilus) リパーゼ(JP 64／744992)及びＢ．プミルス（B ．pumilus）リパーゼ(WO 91／164 22)が含まれる。更に、数多くのクローニング済みリパーゼ、例えばYamaguchiら（1991）Gene 103，61-67に記載のペニシリウム・カメンベルチイ(Penicillium camembertii) リパーゼ、ジェオトリカム・カンジドウム（Geotricum candidum）リパーゼ(Sch imada Yら（1989）J．Biochem.，106，383-388)、並びに様々なリゾプス（Rhizo pus ）リパーゼ、例えばＲ．デレマー（R．delemar）リパーゼ（Hass，M．J．ら( 1991)，Gene 109，117-113）、Ｒ．ニベウス(R ．niveus)リパーゼ(Kugiyamaら（ 1992）Biosci．Biotech．Biochem．56，716-719)及びＲ．オリザ(R ．oryzae)リパーゼ等が有用でありうる。その他のタイプの脂質分解酵素、例えばクチナーゼ、例えばWO 88／09367記載のシュードモナス・メンドシナ（P ．mendocina）由来のクチナーゼ及びフサリウム・ソラニ・ピシ (F．solani pisi)(例えばWO 90／09446記載)由来のクチナーゼも結晶化し得る。特に適当なリパーゼはM1 Lipase(商標)、Luma fast(商標)及びLipomax(商標)( Gist-Brocades)、Lipolase（商標）及びLipolase Ultra(商標)(Novo Nordisk A/ S)、並びにLipase P「Amano」(Amano Pharmaceutical Co．Ltd.)の如きリパーゼである。アミラーゼ本発明に従って結晶化するのに適切なアミラーゼ（α又はβ）には微生物の如き細胞由来の発酵産物でありうる任意のアミラーゼが含まれる。細菌又は真菌起源のものが好ましい。化学又は遺伝子的に修飾したものが含まれる。アミラーゼには、バチルス、特に英国特許明細書第1,296,839号に詳細のＢ．リシェニホルミス（B ．licheniformis）の特別な株から得られるα−アミラーゼが含まれる。市販のアミラーゼはDuramyl(商標)、Termamyl（商標）、Fungamyl （商標）及びBAN(商標)(Novo Nordisk A/S由来)並びにRapidase（商標）及びMex amyl(商標)(Gist-Brocades由来)である。その他の有用な酵素は例えばバチルス・サーモアネロバクター（Thermoanaero bactor ）又はサーモアナエロバクテリウム(Thermoanaerobacterium)から得られるCGT ase(シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼEC 2.4.1.19)である。セルラーゼ本明細書において、「セルラーゼ」なる語はセルロースのグルコース、セロビオース、トリオース及びその他のセロ−オリゴ糖に至る分解を触媒する酵素を意味する。本発明の好適な態様において、結晶化すべきセルラーゼはエンドグルカナーゼ（EC 3.2.1.4)、好ましくは単一成分（組換）エンドグルカナーゼである。好ましくは、セルラーゼは微生物セルラーゼ、より好ましくは細菌又は真菌セルラーゼである。細菌セルラーゼの有用な例はシュードモナス、バチルス、セルロモナス（Cell ulomonas ）、クロストリジウム(Clostridium)、ミクロスポラ（Microspora）、サモトガ（Thermotoga）、カルドセルム(Caldocellum)及びアクチノマイセス(Ac tinomyces )、例えばストレプトマイセス（Streptomyces）、サーモモノスポラ(T hermomonospora )及びアシドセムス(Acidothemus)より成る群、特にシュードモナス・セルロリチカス (P ．cellulolyticus)、バチルス・ロータス (B ．lautus)、セルロモナス・フィミ(C ．fimi)、ミクロスポラ・ビスポラ（M ．bispora ）、サーモモノスポラ・フスカ（T ．fusca）、サーモモノスポラ・セルロリチカム (T ．cellulolyticum)及びアシドセムス・セルロリチカス(A ．cellu lolyticus )より成る群から選ばれる細菌に由来する又はそれらより産生可能なセルラーゼである。結晶化するのに有用なセルラーゼは酸性セルラーゼであってトリコデルマ(Tri choderma )、ミロセシウム(Myrothecium)、アスペルギルス(Aspergillus)、ファネロシェテ (Phanaerochaete)、ニューロスポラ（Neurospora）、ネオカリマスティックス（Neocallimastix）及びボツリチス（Botrytis）より成る属の群、特にトリコデルマ・ビリデ (T ．viride)、トリコデルマ・リーセイ（T ．reesei）、トリコデルマ・ロンジブラチアトウム（T ．longibrachiatum）、ミロセシウム・ベルカリア (M ．verrucaria)、アスペルギルス・ニガー（A ．niger）、アスペルギルス・オリザ (A ．orizae)、ファネロシェテ・クリソスポリウム（P ．chrysospor ium ）、ニューロスポラ・クラッサ(N ．crassa)、ネオカリマスティックス・パートリシアルム (N ．partriciarum)及びボツリチス・シネレア（B ．cinerea）より成る群から選ばれる真菌に由来する又はそれらにより産生可能な酸性セルラーゼである。結晶化すべきその他の有用なセルラーゼは中性又はアルカリ性セルラーゼ、好ましくはアスペルギルス、ペニシリウム、ミセリオフソラ（Myceliophthora）、フミコラ、アーペックス(Irpex)、フサリウム、スタキボツリス（Stachybotrys ）、スコピュラリオプシス（Scopulariopsis）、シェトミウム（Chaetomium）、マイコジーン（Mycogene）、バーチシリウム（Verticillium）、ミロセシウム、パプロスポラ (Papulospora)、グリオクラジウム(Gliocladium)、セファロスポリウム（Cephalosporium）及びアクレモニウム（Acremonium）より成る属の群、特にフミコラ・インソレンス(H ．insolens)、フサリウム・オキシスポルム（F ．oxysporum）、ミセリオフソラ・サーモフィラ（M ．thermophila）、ペニシリウム・ジャンシネルム(P ．janthinellum)及びセファロスポリウム種より成る群、好ましくはフミコラ・インソレンスDSM 1800、フサリウム・オキシスポルム DSM 2672、ミセリオフソラ・サーモフィラCBS 117.65及びセフォロスポリウム種RYM-202より成る群から選ばれる真菌に由来する又はそれらにより産生可能な真菌中性又はアルカリ性セルラーゼである。結晶化するのに有用なその他のセルラーゼの例は、親セルラーゼとして、真菌又は細菌起源のセルラーゼをもつもの、例えばフミコラ、トリコデルマ又はフサリウム属の真菌の株より誘導されるセルラーゼである。オキシドリダクターゼ本発明に従って結晶化されうるオキシドリダクターゼにはペルオキシダーゼ、及びオキシダーゼ、例えばラッカーゼが含まれうる。ペルオキシダーゼペルオキシダーゼ活性を発揮する酵素は酵素分類EC 1.11.1.7を構成する任意のペルオキシダーゼ酵素又はペルオキシダーゼ活性を発揮する任意のそれらに由来するフラグメントであってよい。好ましくは、本発明の方法において利用されるペルオキシダーゼは真菌又は細菌の如き微生物により産生可能である。いくつかの好適な真菌には、副分類不完全菌類(Deuteromyctonia)に属する株、ヒフォマイセテス（Hyphomycetes）網、例えばフサリウム、フミコラ、トリコデルマ（Tricoderma）、ミロセシウム(Myr othecium )、バーチシルム(Verticillum)、アルスロマイセス(Arthromyces)、カルダリオマイセス (Caldariomyces)、ウロクラジウム（Ulocladium）、エンベリッシア（Embellisia）、クラスドスポリウム(Clasdosporium)又はドレシュレア（Dreschlera）、特にフサリウム・オキシスポルム（DSM 2672）、フミコラ・インソレンス、トリコデルマ・レシイ（T ．resii）、ミロセシウム・ベルカナ(M ．verrucana )(IFO 6113)、バーチシルム・アルボアトウルム(Verticillum alboa trum )、バーチシルム・ダーリー(V ．dahlie)、アルスロマイセス・ラモスス(Art hromyces ramosus )(FERM P.7754)、カルダリオマイセス・フマゴ（Caldariomyce s fumago ）、ウロクラジウム・チャータルム（Ulocladium chartarum）、エンベリシア・アリ (E ．alli)又はドレシュレラ・ハロデス（D ．halodes）が含まれる。その他の好適な真菌には、副分類担子菌類(Basidiomycotina)、バシジオマイセテス（Basidiomycetes）網に属する株、例えばコプリヌス（Coprinus）、ファネロシェテ (Phanerochaete)、コリオルス（Coriolus）又はトラメテス（Tramete s ）、特にコプリヌス・シネレウス（C ．cinereus）f．ミクロスポルス(microspo rus )(IFO 8371)、コプリヌス・マクロリズス（C ．macrorhizus）、ファネロシェテ・クリソスポリウム (P ．chrysosporium)(例えばNA-12)又はトラメテス（以前はポリポルス(Polyporus)と称されていた）、例えばＴ．バーシカラー（T ．vers icolor ）（例えばPR4 28-A）が含まれる。更に好適な真菌には副分類接合菌類（Zygomycotina）、ミコラセア（Mycorace ae ）網に属する株、例えばリゾプス（Rhizopus）又はムコール(Mucor)、特にムコール・ヒエマリス（Mucor hiemalis）が含まれる。いくつかの好適な細菌にはアクチノマイセタレス(Actinomycetales)目の株、例えばストレプトマイセス・スフェロイデス(S ．sph eroides )(ATCC 23965)、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス(S ．thermovi olaceus )(IFO 12382)又はストレプトバーチシルム・バーチシリウム(Streptover ticillum verticillium )種バーチシリウム（Verticillium）が含まれる。その他の好適な細菌にはバチルス・プミルス(B ．pumilus)(ATCC 12905)、バチルス・ステアロサーモフィルス (B ．stearothermophilus)、ロドバクター・スファエロイデス (Rhodobacter sphaeroides)、ロドモナス・パルストリ(Rhodomonas palustri )、ストレプトコッカス・ラクチス（Streptococcus lactis）、シュードモナス・プロシニア (P ．purrocinia)(ATCC 15958)又はシュードモナス・フルオレセンス (P ．fluorescens)(NRRL B-11)が含まれる。更に好適な細菌にはミキソコッカス（Myxococcus）、例えばＭ．ビレセンス（M ．virescens ）に属する株が含まれる。特に組換製造ペルオキシダーゼ、例えばコプリヌス種、特にWO 92／16634に従うＣ．マクロリズス（C ．macrorhizus）もしくはＣ．シネレウス(C ．cinereus) に由来するペルオキシダーゼ、又はそれらの変異体、例えばWO 93／24618及びWO 95／10602に記載の変異体が好ましい。ラッカーゼ及びラッカーゼ近縁酵素本明細書において、ラッカーゼ及びラッカーゼ近縁酵素は酵素分類EC 1.10.3. 2を構成する任意のラッカーゼ酵素、酵素分類EC 1.10.3.1を構成する任意のカテコールオキシダーゼ酵素、酵素分類EC 1.3.3.5を構成する任意のビリルビン酵素、又は酵素分類EC 1.14.18.1を構成する任意のモノフェノールモノオキシゲナーゼ酵素を包括する。微生物ラッカーゼ酵素は細菌又は真菌（糸状菌及び酵母を含む）に由来し得、そして適当な例にはアスペルギルス、ニューロスポラ、例えばＮ．クラッサ、ポドスポラ(Podospora)、ボツリチス、コリビア（Colly bia ）、ホメス(Fomes)、レンチヌス（Lentinus）、プレウロトゥス(Pleurotus) 、トラメテス（Trametes）、例えばＴ．ビロッサ（T ．villosa）及びＴ．バーシカラー（T ．versicolor）、リゾクトニア(Rhizoctonia)、例えばＲ．ソラニ(R ． solani )、コプリヌス（Coprinus）、例えばＣ．プリカチリス(C ．plicatilis)及びＣ．シネレウス、サチレラ（Psatyrella）、ミセリオフソラ、例えばＭ．サーモフィラ（M ．thermophila）、シタリジウム（Schytalidium）、ポリポルス(Pol yporus )、例えばＰ．ピンシトゥス(P ．pinsitus)、フレビア(Phlebia)、例えばＰ．ラジタ (P ．radita)(WO 92／01046)又はコリオルス（Coriolus）、例えばＣ．ハーストゥス (C ．hirsutus)(JP 2-238885)株由来のラッカーゼ、特にトラメテス、ミセリオフソラ、シタリジウム及びポリポルスより得られるラッカーゼが含まれる。塩類我々は驚くべきことに、底濃度の酸化性硫化塩、即ち、６未満の酸化状態を有する少なくとも１個の硫黄原子を含む塩、特に２〜４の酸化状態を有する少なくとも１個の硫黄原子を含む塩が、不純な溶液から酵素結晶を供しうることを見い出し、ここでこの結晶の純度及び結晶の収量は極めて優れる。更に、結晶の形態はその他の塩による結晶化と比べ、結晶が比較的大きい点で優れていることがある（実施例１参照）。本発明に係る結晶化工程はタンパク質溶液に安定化剤又は阻害剤を通常加える必要がないほどにすばやく経過する。本発明に係る好適な硫化塩類はアルカリ又はアンモニウムの塩類であり、なぜならこれらの塩類は通常水に容易に溶解するからである。それらは例えば： Na₂S₂O₃，Na₂SO₃，NaHSO₃，Na₂S₂O₄，Na₂S₂O₆x2H₂O，Na₂S₃O₆，Na₂S₄O₆，Na₂S₂O₅ ，HSCH₂COONa，K₂S₂O₃x1/3H₂O，K₂SO₃x2H₂O，KHSO₂,K₂S₂O₆，K₂S₃O₆，K₂S₃O₆， K₂S₄O₆，K₂S₂O₄，Li₂SO₃xH₂O，Li₂S₂O₆x2H₂O，(NH₄)₂SO₃，LiHSO₃，KHSO₃，(NH₄ )HSO₃，NaSCN又はKSCNである。特に亜硫酸塩又はチオ硫酸塩が好ましい。本発明に係る硫化塩は唯一の添加塩であるか、又は混合物の一部であってよく、当該混合物はこの硫化塩の他に、その他の塩類を含んで成ってよく、かかる混合物の例は下記の通りである：１）本発明に係る硫化塩と硫酸塩との混合物；２）本発明に係る硫化塩と酢酸塩との混合物；３）本発明に係る硫化塩と炭酸塩との混合物；４）亜硫酸塩と亜硫酸水素塩との混合物；５）亜硫酸塩、亜硫酸水素塩及び酢酸塩の混合物；又は６）亜硫酸塩、亜硫酸水素塩及び炭酸塩の混合物。ハロゲンを含む塩、例えば塩化物も上記の塩混合物の中に含ませてよい。本発明の特定の態様において、本発明に係る塩は当該タンパク質溶液にリッター当り0.02〜1.2モルの濃度、好ましくはリッター当り0.04〜1.0モルの濃度、より好ましくはリッター当り0.04〜0.7モルの濃度、最も好ましくはリッター当り0 .04〜0.5モルの濃度で加える。本発明に係る塩は一段階で加えてよく、又は一より多くの段階で加えてよい。通常結晶化は塩を一段階で加えたときに満足たるように起こるであろう。結晶化において、塩付加の後に撹拌力を弱める及び形成される結晶の破壊を防ぐことを確実にする任意のその他の調整が往々にして好都合であり、これはその後の結晶の回収を促進するであろう。pH の調整本発明に係る塩を添加するタンパク質溶液のpHは、結晶化を最大にし、同時にタンパク質が安定である至適pHを見つけるために調整されうる。この至適pHを見つける方法は、典型的にはpH10で始まり、次いでpH９、pH８、pH７、…pH３まで結晶化を行う試験を実施し、そして例えば至適pHがpH４と５との間にあるとわかったとき、この範囲内で試験を行って至適pHを見つけるというように行う。至適 pHは通常pH４〜９の範囲内にある。ある状況においては、結晶化工程はpHを傾斜させることにより実施する。即ち、結晶化工程を様々なpHで実施する。 pHの調整のため、本質的に任意の酸又は塩基を利用してよい。この酸は無機又は有機系であってよい。いくつかの例は塩酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、クエン酸及びギ酸である。好適な酸はリン酸、ギ酸、クエン酸及び酢酸である。好適な塩基は水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化アンモニウム、特に水酸化ナトリウムである。結晶化本発明の方法を利用することにより、結晶化の開始のために任意の種を添加することなく、結晶化を48時間未満の結晶化時間で行う、特に結晶化を36時間未満の結晶化時間で行う、好ましくは結晶化を24時間未満の結晶化時間で行う、より好ましくは結晶化を12時間未満の結晶化時間で行う、最も好ましくは結晶化を６時間未満の結晶化時間で行うことが可能でありうる。結晶化させるタンパク質溶液の温度は好ましくは５℃〜40℃、特に10℃〜30℃ であり、好ましくはこの温度は実施例に示すように段階式に高める。即ち、その坂路は例えば10℃で始まり、次いで例えば１時間かけて20℃にまで高め、次いで例えば１時間かけて23℃、次いで例えば１時間かけて25℃にまで高め、そして例えば28℃で終らせ、その温度を約24時間保ってよい。結晶化後の回収本発明の方法はタンパク質、特に酵素を結晶化させる。結晶質タンパク質の回収は慣用の方法、例えば遠心及び／又は濾過、及び任意的な乾燥により成し遂げられうる。本発明の方法を利用することにより、結晶の回収特性はKAcの如きその他の塩類の利用と比べて改善されることができ（実施例１参照）；なぜなら結晶は大きめであり、この特徴は結晶化後の遠心及び／又は濾過をはるかに簡単にするからである。もし非常に高純度な結晶製品を所望するなら、本発明の方法を繰り返してよい。即ち、本発明の方法の結晶質最終製品を再溶解し、そして１又は複数回の更なる結晶工程にかける。最終製品が結晶製品であってよく、又は結晶を再溶解して例えば液体タンパク質製品を製造してよい。本発明の更なる利点は当該最終製品が酸化性硫化塩を含む点にあり、このことはこのタンパク質、例えば酵素が酸化に対して安定化されるということを意味する。本発明を更に下記の非限定実施例で説明する。実施例１亜硫酸塩を利用するプロテアーゼの結晶化例えばUS 3,723,250号に記載の通りに発酵させたバチルス・レンタス(Bacillu s lentus)プロテアーゼを含む200kgの培養液を100kgづつの２つの画分に分け、それぞれ画分Ａ及び画分Ｂと命名した。各画分を下記表１に記載の通りに前処理した。表１．培養液画分Ａ及び画分Ｂの前処理及び凝集 Al化合物は活性単位当りのOD_440nmの値を有意に低め、従って画分Ａは画分Ｂよりも純粋となる。各画分から遠心分離により産生株を除去し、２つの上清液を得、それらをその後Seitz K900パッドを用いて濾過した。得られる濾液をAsahi(６kD)膜で濃縮した。画分Ａは２容量水を用いて更に透析濾過した。このようにして濃縮物Ｂは濃縮物Ａよりも比較的多い量の低分子量の発酵化合物（炭水化物、塩、核酸、その他のタンパク質等）を含んだ。これは下記表２に示すようにOD_280nm／活性プロテアーゼグラムの比、OD_440nm／活性酵素グラム、並びに活性プロテアーゼグラム／Mettler乾燥物質グラムの測定値により示される。表２．濃縮物Ａ及び濃縮物Ｂの純度これらの濃縮物を様々な量のNa₂SO₃又はKAcにかけ、そして20重量％のリン酸を用いてpH＝4.9に調整した。一次核形成速度を管理するために独特の濃度坂路を利用した。坂路は図１に示すように、10℃で始まり、１時間かけて20℃に、次いで１時間かけて23℃に、１時間かけて25℃、そして最後に28℃にまで高め、その温度を24時間保った。結晶懸濁物を遠心し、そしてその結晶を5.5％のCaCl₂(pH＝4.9)溶液を用いて洗浄した。その結晶を遠心を利用して回収し、そして100％のMPGで10倍量に溶解し、そして得られる製品をOD_440nm及びプロテアーゼ活性について分析した。最終製品Ａ及びＢの結晶化収率及び純度を表３及び４のそれぞれに示す。表３．Na₂SO₃及びKAcを増やすことにより結晶化させた濃縮物Ａ。我々は収率及び純度がKAcの代わりにNa₂SO₃を用いることにより増大することを見い出した。更に、我々は生成される結晶の厚みが増すことを見い出した（針状の代わりに桿状）。これは回収のために濾過設備を用いる場合、フィルター板をより細い針が侵入してしまうのを防ぐため、重要である。表４．Na₂SO₃及びKAcを増やすことにより結晶化させた濃縮物Ｂ。このはるかに不純な濃縮物に基づき、我々は収率及び純度がKAcの代わりにNa₂ SO₃を用いることで事実上増大することを見い出した。我々は結晶化のためには1 0％ほどの多さのKAcを必要としたが、Na₂SO₃では４％で足りた。また我々は結晶の厚みが増すことも見い出した。原材料１kg当りの価格に関してKAc又はNa₂SO₃の利用のコスト差はほとんどないが、Na₂SO₃の場合はKAcの場合よりも少ない塩ですむため、Na₂SO₃が好ましい。実施例２チオ硫酸塩を利用するアミラーゼの結晶化例えばGB 1,296,839号に記載の通りに発酵させたバチルス・リシェニホルミス（B．licheniformis）アミラーゼを含む100kgの培養液を下記の処理にかけた：表５．バチルス・リシェニホルミス培養液の前処理産生株をドラム濾過により除去して濾液を得、これをSeitz EK1フィルターパッドを用いて微生物濾過（germfiltration）した。得られる濾液をエバポレーションを利用して15％の乾燥物質含有量（屈折率として測定）にまで濃縮した。得られる濃縮物の純度をOD_440nm／活性アミラーゼグラムの比及び活性酵素／乾燥物質（酵素グラム／乾燥物質グラム）の比で示す。表６．結晶化を開始する前の濃縮物の純度この濃縮物を更に様々な量の酢酸カリウム、チオ硫酸ナトリウム及び硫酸ナトリウムにかけ、そして13.3重量％のNaOH溶液を用いてpH＝7.3に調整し、そして2 8℃にて24時間の結晶時間放置した。結晶懸濁物を遠心により回収した。結晶ケーキを50％のMPG溶液に溶解して10重量倍にした。得られる製剤化製品をOD_440nm及びアミラーゼ活性について分析した。アミラーゼ活性分析はα−アミラーゼによるｐ−ニトロフェニル−アルファー、Ｄ−マルトヘプタオシド（pNP-G₇）の消化に基づく。基質pNP-G₇はアミラーゼによってpNP-G₃及びpNP-G₄へと分解される。pNP-G₃は更に過剰量のα−グルコシダーゼによりグルコース及び黄色ｐ−ニトロフェノールへと分解される。反応を in situで追跡し、これにより時間単位当りの吸収変化を計算できる。この数字は反応速度及び酵素活性の尺度である。プロテアーゼによる妨害を避けるため、 PMSF（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を試験溶液に加えた。最終製品の収率及び純度は表７に示す。表７．量を増大させた３通りの塩にかけ、pH＝7.3及び28℃で結晶化させた濃縮物の収率及び純度。我々は、結晶化剤としてチオ硫酸ナトリウム(Na₂S₂O₃)を用いると収率が高まることを驚くべきことに見い出した。換言するなら、我々はチオ硫酸塩を用い、収率を実質的に高め、そして純度さえも高めることができた。原材料１kg当りの価格に関してKAc又はNa₂SO₃の利用のコスト差はほとんどないが、Na₂SO₃の場合はKAcの場合よりも少ない塩ですむため、このアミラーゼの結晶化のためにはNa₂SO₃が好ましい。実施例３チオ硫酸ナトリウムを利用するプロテアーゼの結晶化例えばUS 3,723,250号に記載の通りに発酵させたバチルス・レンタスプロテアーゼを含む100kgの培養液を下記の処理にかけた：生産株はドラム濾過により除去し、その濾液を更にSeitz K900濾過プレートを用いて濾過し、次いでSeitz EK1濾過パッドを用いて微生物濾過した。得られる濾液をAsahi(６kD)膜で濃縮した。得られる濃縮物の純度を下記の表８にOD_440nm／活性プロテアーゼの比グラム及びOD_280nm／活性プロテアーゼグラムの比で示す。表８．結晶化を始める前の濃縮物の純度濃縮物を更に様々な量の酢酸カリウム及びチオ硫酸ナトリウムにかけ、そして 20重量％のHCOOH溶液を用いてpH＝4.9に調整し、そして28℃にて24時間の結晶時間放置した。結晶懸濁物は遠心により回収した。結晶ケーキを１重量の5.5％のCaCl₂溶液を用いて洗浄した。得られる結晶ケーキを70％のMPG溶液に溶かして10重量倍に希釈した。得られる製剤化製品をプロテアーゼ活性について分析した。プロテアーゼ活性はジメチルカゼイン反応速度アッセイを利用して測定した。最終製品の収率を表９に示す。表９．量を増大させた２通りの塩にかけ、28℃でpH＝4.9において結晶化させた濃縮物の収率及び形態。我々は驚くべきことに、結晶化剤とはチオ硫酸ナトリウム(Na₂S₂O₃)を低塩濃度で用いることにより収率が著しく高まることを見い出した。更に、我々は表９からわかる通り結晶形態を改善することができた。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年３月２４日（１９９８．３．２４）【補正内容】請求の範囲 1. タンパク質溶液から得られるタンパク質の結晶化のための方法であって：（ａ）６未満の酸化状態を有する硫黄原子を含む塩による当該タンパク質溶液の処理；（ｂ）結晶状態での当該タンパク質の回収；を含んで成る方法。 2. 前記硫黄原子が２〜４の酸化状態を有する、請求項１記載の方法。 3. 前記塩が亜硫酸塩又はチオ硫酸塩である、請求項１記載の方法。 4. 前記塩が Na₂S₂O₃，Na₂SO₃，NaHSO₃，Na₂S₂O₄，Na₂S₂O₆x2H₂O，Na₂S₃O₆，Na₂S₄O₆，Na₂S₂ O₅，HSCH₂COONa，K₂S₂O₃x1/3H₂O，K₂SO₃x2H₂O，KHSO₂，K₂S₂O₆，K₂S₃O₆，K₂S₄O₆ ，K₂S₂O₄，Li₂SO₃xH₂O，Li₂S₂O₆x2H₂O，(NH₄)₂SO₃，LiHSO₃，KHSO₃及び(NH₄)HS O₃より成る群から選ばれる、請求項１記載の方法。 5. 前記タンパク質溶液が複数種のタンパク質を含んで成る、請求項１記載の方法。 6. 前記タンパク質溶液が発酵液から得られるものである、請求項１記載の方法。 7. 前記発酵液を前記塩処理する前に遠心、濾過、マイクロ濾過、限外濾過、透析濾過、電気透析、沈殿、蒸発又はそれらの組合せにより精製する、請求項６記載の方法。 8. 前記塩処理の前に前記発酵液に１又は複数種の凝集剤を添加する、請求項６記載の方法。 9. 前記塩を１リッターのタンパク質溶液当り0.02〜1.2モルの濃度で前記タンパク質溶液に添加する、請求項１記載の方法。 10．前記タンパク質溶液を0.1〜25重量％のタンパク質含有量に濃縮する、請求項１記載の方法。 11．前記タンパク質が酵素である、請求項１記載の方法。 12．前記酵素がプロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ又はオキシドリダクターゼである、請求項11記載の方法。 13．前記タンパク質溶液のpHが４〜９である、請求項１記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】 1. タンパク質溶液から得られるタンパク質の結晶化のための方法であって：（ａ）６未満の酸化状態を有する硫黄原子を含む塩による当該タンパク質溶液の処理；（ｂ）結晶状態での当該タンパク質の回収；を含んで成る方法。 2. 前記硫黄原子が２〜４の酸化状態を有する、請求項１記載の方法。 3. 前記塩が亜硫酸塩又はチオ硫酸塩である、請求項１記載の方法。 4. 前記塩が Na₂S₂O₃，Na₂SO₃，NaHSO₃，Na₂S₂O₄，Na₂S₂O₆x2H₂O，Na₂S₃O₆，Na₂S₄O₆，Na₂S₂ O₅，HSCH₂COONa，K₂S₂O₃x1/3H₂O，K₂SO₃x2H₂O，KHSO₂，K₂S₂O₆，K₂S₃O₆，K₂S₄O₆ ，K₂S₂O₄，Li₂SO₃xH₂O，Li₂S₂O₆x2H₂O，(NH₄)₂SO₃，LiHSO₃，KHSO₃及び(NH₄)HS O₃より成る群から選ばれる、請求項１記載の方法。 5. 前記タンパク質溶液が複数種のタンパク質を含んで成る、請求項１記載の方法。 6. 前記タンパク質溶液が発酵液から得られるものである、請求項１記載の方法。 7. 前記発酵液を前記塩処理する前に遠心、濾過、マイクロ濾過、限外濾過、透析濾過、電気透析、沈殿、蒸発又はそれらの組合せにより精製する、請求項６記載の方法。 8. 前記塩処理の前に前記発酵液に１又は複数種の凝集剤を添加する、請求項６記載の方法。 9. 前記塩を１リッターのタンパク質溶液当り0.02〜1.2モルの濃度で前記タンパク質溶液に添加する、請求項１記載の方法。 10．前記タンパク質溶液を0.1〜25重量％のタンパク質含有量に濃縮する、請求項１記載の方法。 11．前記タンパク質が酵素である、請求項１記載の方法。 12．前記酵素がプロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ又はオキシドリダクターゼである、請求項11記載の方法。 13．前記タンパク質溶液のpHが４〜９である、請求項１記載の方法。 14．請求項１記載の方法より得られるタンパク質製品。