JP2000506396A - ホスファチジルイノシトール―３′―キナーゼ関連タンパク質をコードするヌクレオチド配列及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 PI3Kの調節サブユニット、ｐ85上の中間SH２ドメインにＣ末端側アミノ酸を介して結合し、且つブロモドメインを有するホスファチジルイノシトール−３’キナーゼ関連タンパク質をコードするヌクレオチドの同定、特性決定及び発現、並びに細胞増殖障害の診断及び処置等の医療用途のためのかかるタンパク質の利用方法を記述する。

Description

【発明の詳細な説明】 ホスファチジルイノシトール−３’−キナーゼ関連タンパク質をコードするヌク レオチド配列及びその利用 発明の分野 本発明は分子生物学の分野、そして詳しくはホスファチジルイノシトール−３ ’−キナーゼ関連タンパク質をコードするヌクレオチド配列の関与する細胞シグ ナル変換、並びに病気、好ましくは細胞増殖障害を原因とする病気の処置及び診 断におけるこれらのタンパク質の利用に関する。 発明の背景 ホスファチジルイノシトール−３’−キナーゼ(PI3Ks)は少なくとも一種類の ホスホイノシチド類を３−リン酸化できる酵素の大きなファミリーである(Whitm anら、1988，Nature332：644-646；Augerら、1989，Cell57：167-175)。３−リ ン酸化ホスホイノシチド類は全ての高等真核細胞に見い出せる。成育身体の証拠 には細胞シグナル変換の新規且つ重要な第二メッセンジャーシステムの一部とし てPI3K及びこの酵素の脂質産物であるホスファチジルイノシトール（３，４，５ ）−三リン酸（以降、「PtdIns(3,4,5)P₃」）を包括する。この新規PtdIns(3,4, 5)P₃系シグナル生成システムの成分は、ホスホイノシチダーゼＣ(PIC)がPtdIns( 4,5)P₂を加水分解して構造的に異なる第二メッセンジャー、イノシトール（１， ４，５）−三リン酸（Ins(1,4,5)P₃）及びジアシルグリセロールを放出させるが 如きイノシトールリン脂質を基礎とする既に特性決定されているシグナル生成経 路とは独立しているようである。 細胞外作動因子及び成長因子の選定は細胞内PI3K活性を刺激し、そしてPtdIns (3,4,5)P₃の迅速且つ一過性の細胞内蓄積を引き起こすであろう。驚くべきこと に、多種多様な細胞表層レセプター、例えばレセプターチロシンキナーゼ、src 科非レセプターチロシンキナーゼに関連するレセプター、サイトカイン成長因子 、及びＧタンパク質複合化レセプターの刺激はPI3K科の構成員を全て活性化する であろう。(Stephensら、1993，BiochemicaらBiophysica Acta，1179：27-75を 参照のこと）。例えば、活性化されたときにPtdIns(3,4,5)P₃の蓄積増大を供す るチロシンキナーゼレセプターはPDGFレセプター、EGFレセプター、FGFレセプタ 一科の構成員、CSF−１レセプター、インスリンレセプター、IGF−１レセプター 及びNGFレセプターである。PtdIns(3,4,5)P₃蓄積を刺激するsrc科非レセプター チロシンキナーゼに関連するレセプターはIL−２レセプター、IL−３レセプター 、mIgMレセプター、CD４レセプター、CD２レセプター及びCD３／T細胞レセプタ ーである。更に、サイトカインIL−４レセプター及びＧタンパク質連結トロンビ ンレセプター、ATPレセプター及びfMLPレセプターは全てPI3Kの活性を刺激し、 その後のPtdIns(3,4,5)P₃蓄積をもたらす。即ち、PtdIns(3,4,5)P₃は極めて多彩 なシグナル生成経路における第二メッセンジャーのようである。 PI3K活性及びPtdIns(3,4,5)P₃の生産がこのような多彩なレセプターについて のシグナル伝達の生理学的に関連する経路であるこの仮説の裏付けはとりわけ二 系列の実験的証拠に由来する：即ち、真菌代謝物によるPI3K活性の阻害及び直接 タンパク質会合の観察に由来する。真菌代謝物であるウォルトマンニン（wortma nnin）は細胞外因子に対するその後の細胞応答を排除する。例えば、好中球はケ モカインfMet-Leu-Phe（fMLP）に対し、PI3Kを刺激してPtdIns(3,4 ,5)P₃を合成することにより応答する。この合成は侵入微生物の好中球破壊に関 与する呼吸燃焼の活躍に相関する。ウォルトマンニンによる好中球の処理はfMLP 誘導化呼吸燃焼反応を阻止する。（Thelenら、1994，PNAS，USA 91：4960-4964 ）。事実、ウォルトマンニンによるこれらの実験及びその他の実験的証拠は造血 幹細胞系の細胞、特に好中球、単球及びその他のタイプの白血球におけるPI3K活 性が、急性及び慢性炎症に係る数多くの非記憶免疫反応に関与することを示す。 PI3K酵素はいくつかの活性化形態のレセプターチロシンキナーゼに直接作用し 、そして一緒に精製されうる。精製すると、レセプターチロシンキナーゼ一体化 PI3Kは触媒サブユニット及びアダプター（又は調節）サブユニットを含んで成る 170〜200kDのヘテロダイマーより成ることが見い出された（Otsuら、1991，Cell 65：91-104、Ponsら、1995，Mol．Cell．Biol．15：4453-4465、Innkaiら、199 6，J．Biol．Chem．271：5317-5320）。 触媒サブユニットの２種類の同族体はp110及びp110βが発表され、そしてクロ ーニングされている。ウォルトマンニンに不可逆的に結合する触媒サブユニット は高度に近縁する調節サブユニットの小ファミリーの一つ又はその他の構成員p5 5，p55PIKp85α及びｐ85βと強く結合して170〜200kDのヘテロダイマーを形成す る。既知の調節サブユニットは２つのSH２ドメインを含むタンパク質：タンパク 質相互作用ドメインの大集団を含む（Cantleyら、1991 Cell 04：281-302）。 SH２ドメインの存在はPI3Kヘテロダイマーの結合力及び活性化レセプターチロ シンキナーゼに至る刺激を担うものと考えられている。活性化レセプターは局所 的な共通配列内のキーとなるチロシン残基において、好ましくは55〜87kDのPI3K アダプターに見い出される SH２ドメインにおいてリン酸化される(Songyangら、1993，Cell 72：767-778)。 PI3Kヘテロダイマーが一旦結合すると、それはPI3K触媒サブユニットを直接活性 化し（ただしその効果はin vitroでは比較的小さい；Carpenterら、1993，J．Bi ol．Chem 268：9478-9483、Backerら、1992，EMBO J.11：3469-3479)、そして細 胞質ゾルPI3Kをそのリン脂質基質源へと転移させる。このような因子の組合せは PtdIns(3,4,5)P₃生産の急増大を招く。明らかに、PI3Kのこのようなアイソフォ ームはレセプター調節チロシンキナーゼの専用シグナルトランスデューサーとし て機能するように構造的になっているようである。 しかしながら、PI3Kのp110／ｐ85サブファミリーは、シグナルを変換するのに ヘテロトリマーGTPaseを利用する細胞表層レセプターの活性化の結果として起こ りうるPtdIns(3,4,5)P₃の生産に関与しないようである（例えばfMLP，PAF，ATP 及びトロンビン）。このようなタイプの細胞表層レセプターは主に、活性化が免 疫系の炎症反応に関与する造血幹起源の細胞において述べられている。最近の徴 候は約220kDの自然相対分子量を有するクロマトグラフィー的に異なる形態のウ ォルトマンニン感受性PI3KがU937細胞及び好中球に存在していることを示唆して いる(Stephensら、1994，Cell 77：83-93)。このPI3K活性はＧα−GTPサブユニ ットではなくＧβγサブユニットにより特異的に刺激される。類似のPI3K活性が 骨肉腫細胞系においても述べられている（Morrisら、1995，Mol．Pharm.48：532 -539）。血小板はＧβγ−感受性PI3Kも含むが、これがｐ85／p110 PI3K科構成 員であるかどうかは不明である（Thomasonら、1994，J．Biol．Chem．269：1652 5-16528）。このあまり特性決定されていないＧβγ感受性PI3KはATP，fMLP等の 如き作動因子に応答してPtdIns(3,4,5)P₃の生産を司りうるようである。 Ｇタンパク質結合レセプターを介してシグナルを変換する細胞作動因子により PI3K活性を活性化するメカニズムの同定が欠如している。炎症反応に関与する好 中球呼吸燃焼を活性化する大半の作動因子がレセプターチロシンキナーゼではな くＧタンパク質カップリング化レセプターに結合するであろうことに注目するこ とが重要である。即ち、このようなタイプのケモカインに応答してPI3Kを調節す るメカニズムはチロシンキナーゼを介してシグナル生成する成長因子による調節 とは異なるようである。 PI3Kの発現に影響を及ぼす一次現象及びそれに由来する産物についての一定の 情報があるが、発現から産物形成に至る経路を調節する因子についてはあまり知 られていない。かかる因子の同定は有意義な医療用途を有するであろうことが理 解される。 本発明は新規のPI3K関連タンパク質の同定、精製及びクローニングにより少な くともある程度この問題を解決することを目的とする。 発明の概要 本発明の第一の目的はPI3K関連タンパク質をコードするヌクレオチドの発表で ある。 本発明の第二の目的はPI3Kのp85の調節サブユニット上の中間SH2ドメインに結 合し、そして更にブロモドメインを司るPI3K関連タンパク質をコードするヌクレ オチドの発表である。 本発明の第三の目的はPI3K関連タンパク質であって、そのＣ末端アミノ酸によ りPI3Kのp85の調節サブユニット上の中間SH２ドメインに結合するタンパク質を コードするヌクレオチドの発表である。 本発明の第四の目的はブロモドメインを司るPI3K関連タンパク質をコードする ヌクレオチドの発現及び発現タンパク質の精製のため の方法の発表である。 本発明の第五の目的はPI3K関連タンパク質の単離核酸又はタンパク質フラグメ ントのそれぞれの発表である。 本発明の第六の目的はPI3K関連タンパク質又はそのフラグメントをコードする 単離核酸配列で形質転換された宿主細胞の発表である。 本発明の第七の目的はPI3K関連タンパク質又はそのフラグメントをコードする 単離核酸配列を含むベクターの発表である。 本発明の第八の目的はPI3K関連タンパク質の全長又はフラグメントとPI3Kとよ り成る複合体の発表である。 本発明の第九の目的はPI3K関連タンパク質又はそのフラグメントをコードする 単離核酸配列又はそのフラグメントを利用して病気を診断する方法の発表である 。 本発明の第十の目的は病気の処置のための予防的又は治療的用途を有するであ ろう化合物、好ましくは小分子を含むPI3K調節の作動因子及び拮抗因子、PI3Kの 調節サブユニットに対する結合について天然PI3K関連タンパク質と競合する突然 変異PI3K関連タンパク質、抗体、並びにPI3K関連タンパク質遺伝子発現を阻害す るのに利用できるヌクレオチド配列（例えばアンチセンス及びリボザイム分子、 並びに遺伝子又は調節配列置換構築体）又はPI3K関連タンパク質遺伝子の発現を 高めるのに利用できるヌクレオチド配列（例えばPI3K関連タンパク質遺伝子を強 力なプロモーターシステムのコントロール下に置いている発現構築体）を同定す るためのアッセイ、並びにPI3K関連タンパク質導入遺伝子を発現する遺伝子導入 細胞及び動物又はPI3K関連タンパク質を発現しない「ノックアウト体」の発表で ある。 本発明のこれら及びその他の目的は下記の説明の中の本発明の様 々な観点の説明を読むことにより当業者に明らかとなるであろう。本発明の上記 及びその他の観点は図面、詳細な説明及び実施例で更に詳しく説明する。定義 本明細書の中で用いる下記の用語は、単数形であろうと複数形であろうとも、 下記の意味を有するであろう。 Ｇタンパク質調節PI3K：Ｇβγサブユニット及び／又はＧα−GTＰサブユニッ トの如き活性化トリマーＧタンパク質により活性が刺激されるPI3K酵素を意味す る。 ｐ85：アダプターサブユニットとしても知られるPI3Kの調節サブユニット。ｐ 85には、ｐ85に相同性な分子、又はpll0、チロシンキナーゼレセプター調節PI3K にインターSH２ドメイン（２本のSH２ドメインの間にあり、且つKlippelら、Mol ．Cell．Biol.，vol.13：5560(1993)のアミノ酸位置番号付けに従いアミノ酸434 〜599より成る領域）において結合し、そしてPI3K触媒活性を刺激する分子を含 む。 ｐ85ヌクレオチドのコード配列：p85調節サブユニットタンパク質、ｐ85のポ リペプチドもしくはペプチドフラグメント、又はｐ85融合タンパク質をコードす るヌクレオチド配列を意味する。ｐ85ヌクレオチド配列はDNA、例えばゲノムDNA （例えばｐ85遺伝子）もしくはcDNA、又はRNAを包括する。ヒトｐ85はSkolnikら 、Cell,vol.65:頁83-90(1991)に記載の通りにクローニングされている。 p110 ：PI3Kの触媒サブユニットを意味する：ｐ110の機能均等物はin vivo又 はin vitroで強い親和力によりｐ85調節サブユニットに結合するPI3K触媒サブユ ニットタンパク質を意味する。 p110ヌクレオチド又はコード配列：ｐ110触媒サブユニットタンパク質、p110 タンパク質のポリペプチド又はペプチドフラグメ ント、又はp110融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を意味する。p110 ヌクレオチド配列はDNA、例えばゲノムDNA(例えばp110遺伝子）もしくはcDNA、 又はRNAを包括する。ヒトp110はHuら、Mol．Cell．Biol．vol.13(12)頁7677-768 8に記載の通りにクローニングされている。表の説明 表１は２系列ハイブリドアッセイを実施するために用いるPIKAP及びｐ85の所 定の領域を含むプラスミド構築体を示す。 表２はPIKAP及びｐ85の特異的な構築体による２系列ハイブリドスクリーニン グ結果を示し、これはPIKAPのｐ85に対する結合がｐ85のインターSH２ドメイン に対するものであり、そしてPIKAPのC末端を介するものであることを確立してい る。 発明の詳細な説明 本明細書の中で挙げる全ての公開物及び特許出願は引用することで本明細書に 組入れる。 本発明はPI3K関連タンパク質の同定、精製及びクローニングに関連し、このタ ンパク質はPI3Kのp85の調節サブユニット上のインターSH２ドメイン（２本のSH ２ドメインの間の領域）にこの関連タンパク質のＣ末端アミノ酸を介して、そし て好ましくは最後の74個のＣ末端アミノ酸を介して結合している。かかるタンパ ク質はブロモドメインも司る。 PI3Kはホスファチジルイノシトールを３ｄ位においてリン酸化し、細胞内シグ ナル生成分子PtdIns(3,4,5)P₃を構築する。PI3Kはチロシンキナーゼレセプター の刺激により様々な細胞タイプにおいて誘導されることが示された。 ここでの報告は所定のタンパク質がPI3Kに結合し、そしてその活 性に影響するとの発見である。即ち、本発明はPI3K関連タンパク質(PIKAP)と称 するかかるタンパク質又はペプチド、PIKAPヌクレオチドの利用、並びに例えばP IKAP作動因子又は拮抗因子として働きうるPIKAPに対する抗体、PI3K活性もしく は発現を阻害する拮抗因子、又はPI3K細胞活性化障害例えば限定することなく、 無秩序細胞増殖（細胞増殖障害）、好ましくは再狭窄及び癌の処置においてPI3K 活性を活性化する作動因子を包括する。 更に、本発明はPI3K関連タンパク質(PIKAP)ヌクレオチド、タンパク質及びペ プチド、並びにPIKAPに対する抗体のPI3K細胞活性化障害の診断における利用を 包括する。異常PI3K関連タンパク質(PIKAP)ヌクレオチド、タンパク質又はペプ チドの患者における診断又は活性化PI3Kシグナル変換経路における異常の診断は 適正な処置又は治療法を考案するうえでも役立つであろう。 詳しくは、下記の章に記載の本発明はPIKAP、ポリペプチド又はペプチドであ ってPI3Kの調節サブユニット、好ましくはｐ85と相互作用する機能性ドメインを 司るもの、突然変異、トランケーション又は欠失したもの（例えば、PI3Kの調節 サブユニット又は無関係なタンパク質もしくはペプチド、例えばエピトープタグ 、即ち、mycエピトープに融合した調節サブユニットの機能性ドメイン）、かか る産物をコードするヌクレオチド配列、並びにかかる調節サブユニット産物を生 産できる宿主細胞発現系を包括する。 本発明は更に抗体及び抗イディオタイプ抗体（例えばFabフラグメント）、PIK APの拮抗因子及び作動因子、並びに化合物又はヌクレオチド構築体であってPIKA Pをコードするヌクレオチド配列の発現を阻害するもの（転写因子インヒビター 、アンチセンス及びリボザイム分子、又は遺伝子もしくは調節配列置換構築体） 、又はPIKAPの発現を促進するもの（例えばPIKAPコード配列が発現コントロ ール因子、例えばプロモーター、プロモーター／エンハンサー等に作動可能式に 一体化している発現構築体）も包括する。本発明は更にヒトPIKAP(又はその突然 変異体)を発現する、又は動物の内性PIKAPの発現を阻害もしくは「ノックアウト 」するように遺伝子操作された宿主細胞及び動物にも関連する。 PIKAP、ペプチド、融合タンパク質、ヌクレオチド配列、抗体、拮抗因子及び 作動因子は病気、好ましくは免疫障害の診断のための突然変異PIKAP又は不適切 に発現したPIKAPの検出のために有用でありうる。上記の組成物は単独で、又は 宿主細胞発現系、抗体、拮抗因子、作動因子、並びに遺伝子操作された細胞及び 動物と組合せてかかる病気の処置において有効な薬剤のためのスクリーニングに 利用できる。遺伝子操作した宿主細胞及び／又は動物の利用はかかる系がPIKAP に結合する化合物の同定を可能にするのみならず、PI3Kにより変換されるシグナ ル、詳しくは細胞内シグナル生成分子PtdIns(3,4,5)P₃の生産に影響を及ぼす化 合物も同定できるという利点を供しうる。 最後に、PIKAP、融合タンパク質産物、抗体及び抗イディオタイプ抗体（例え ばFabフラグメント）、拮抗因子又は作動因子（シグナル変換を調節する化合物 を含む）であってPI3Kシグナル変換経路における下流標的に対して作用しうるも のがかかる病気の治療のために利用できうる。例えば、機能性PIKAP、突然変異P IKAPをコードするヌクレオチド構築体、並びにアンチセンス及びリボザイム分子 は病気の処置におけるPIKAP発現及び／又は活性の調節のための「遺伝子治療」 手法において利用できる。 多数の方法がPIKAPをコードするヌクレオチド配列、そして好ましくはcDNA配 列を単離するために有用である。一の方法はPIKAPとPI3Kとの結合の利点を利用 し、そして一般にタンパク質間相互作用 を同定するために用いられる。これは二系列ハイブリド方式であり、そして本明 細書においては限定ではなく例示のために詳細してある。この方式は米国特許第 5,283,173号及びChienら、1991 Proc.Natl．Acad．Sci．USA．88：9578-9582に 記載されており、そしてClontect(Palo Alto，CA)より市販されている。簡単に は、かかる方式を利用し、２つのハイブリドタンパク質をコードするプラスミド を構築する。一方のプラスミドはｐ85又はｐ85ぺプチドもしくは融合タンパク質 をコードするPI3K ｐ85ヌクレオチド配列に融合した転写アクチベータータンパ ク質のDNA結合性ドメインをコードするヌクレオチドより成り、そして他方のプ ラスミドはcDNAの一部としてこのプラスミドに組換えられた未知のタンパク質又 は本件においてはPIKAPをコードするcDNAに融合した転写活性化タンパク質のア クチベータードメインをコードするヌクレオチドより成る。DNＡ結合性ドメイン 融合プラスミド及びcDNAライブラリーを、転写するアクチベーターの結合性部位 を含む調節領域を有するリポーター遺伝子（例えばHIS3又はlacZ）を含む酵母サ ッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）の株の中に形質転換 せしめる。いづれのハイブリドタンパク質も単独ではリポーター遺伝子の転写を 活性化できない。このDNA結合性ドメインハイブリドができない理由はそれが活 性化機能を司らないからであり、そして活性化ドメインハイブリドができないの はそれがアクチベーターの結合部位に局在化できないからである。２つのハイブ リドタンパク質の相互作用は機能性アクチベータータンパク質を再構築し、そし てリポーター遺伝子の転写活性化を供する。この活性化はリポーター遺伝子産物 についてのアッセイにより検出される。 二系列ハイブリド方式又は関連の方法論を「おとり（bait）」遺伝子産物と相 互作用するタンパク質についての活性化ドメインライ ブラリーのスクリーニングに利用し得る。限定することなく、例えば、好ましく はｐ85をおとり遺伝子産物として利用する。全ゲノム又はDNA配列を活性化ドメ インをコードするDNAに融合させる。このライブラリー及びDNA結合性ドメインに 融合したおとりｐ85遺伝子産物のハイブリドをコードするプラスミドを酵母リポ ーター株に同時形質転換し、そして得られる形質転換体を転写活性化したリポー ター遺伝子を有するものについてのスクリーニングにかける。例えば、限定する ことなく、おとりｐ85遺伝子配列をベクターの中に、それがGAL４タンパク質のD NA結合性ドメインをコードするDNAに転写式に融合されるようにクローニングす ることができる。これらのコロニーを精製し、そしてリポーター遺伝子転写を司 るライブラリープラスミドを単離する。次いでDNA配列決定をクローンのヌクレ オチド配列を決定するために利用し、それはライブラリープラスミドによりコー ドされるタンパク質配列の同一性を示す。 おとりｐ85遺伝子産物と相互作用するタンパク質の検出される細胞系のcDNAラ イブラリーは当業界に慣用の方法を用して構築できうる。本明細書に記載の特定 の系に従うと、例えばcDNAフラグメントはベクターの中に、それらがGAL４の転 写活性化ドメインに翻訳的に融合されないように挿入できうる。このライブラリ ーはおとりｐ85遺伝子−GAL４融合タンパク質と一緒に、GAL４活性化配列を含む プロモーターにより駆動させるlacZ遺伝子を含む酵母株の中に同時形質転換させ ることができる。おとりｐ85遺伝子産物と相互作用するGAL４転写活性化ドメイ ンに融合したcDNAコード化タンパク質は活性GALタンパク質を再構築し、それ故H IS3遺伝子の発現解除を駆動する。HIS3を発現するコロニーはヒスチジンを欠く 半固体寒天培地を含むペトリ皿の上でのその増殖により検出されうる。次いでcD NAをこれらの株から精製し、そして当業界に慣用の技術を利 用してｐ85遺伝子相互作用性タンパク質を産生及び単離するのに利用できうる。 上記の二系列ハイブリド技術を利用し、PI3キナーゼ関連タンパク質(PIKAP)を 同定し、そしてブロモドメインを含む一定の固有特性を有することが示された。 簡単には、ヒトPI3K ｐ85をコードするcDNA(Skolnikら、Cell 65：83-90)をAsp 718及びPstＩで消化し、そして全長ｐ85配列をpGBT８プラスミドのSmaＩ−PstＩ 部位の中のGAL４結合性ドメインに融合した。このプラスミドはEcoRＩ及びSalＩ 固有部位の間での配列５’-CCGGGGATCCCCATGGCTAGCCATATG-３’の挿入により修 飾されたProc．Natl．Acad．Sci．vol.88：頁9578-9582(1991)に記載のChienら のpMA424プラスミドである。これを酵母株YGH１に導入し、そしてプラスミドGAL ４−ｐ85を担持するYGH−１株を無ヒスチジン培地の中で２リポーター増殖及び β−ガラクトシダーゼ活性を活性化するその固有能力について評価した。プラス ミドGAL４−ｐ85を担持するYGH１株を次にpGADプラスミド中のGAL４活性化ドメ インに融合してHeLa細胞cDNAライブラリーで形質転換させた（Chienら、Proc．N atl．Acad．Sci．vol.88：頁9578-9582(1991)。cDNAがｐ85と相互作用するPIKAP をコードする場合、YGH１株はヒスチジンの非存在下で増殖し、そしてβ−ガラ クトシダーゼを生成するものと予測される。 −のスクリーニングをGAL４ DNA結合性ドメインに融合した全長ｐ85で実施し た(Asp718−PstＩ、ｐ85の末端までの６個のアミノ酸)。２×10⁵個の形質転換体 をスクリーニングした。14個のクローンがヒスチジンの非存在下での増殖及びβ −ガラクトシダーゼを生産する能力を授けた。これらの酵母株から回収したプラ スミドをオリジナルのYGH１ GAL4−p85株を再形質転換するために利用した。こ こでも、全てのプラスミドがヒスチジンの非存在下で増殖す る能力及びβ−ガラクトシダーゼを産生する能力を授けた。その後のスクリーニ ングにより、14個のうちの12個がｐ85に明確に結合するPIKAPをコードするcDNA を有することが見い出された。cDNAは様々なNH２末端トランケーション体をコー ドする。最大のものは1232塩基対を有し、そして943bpのオープンリーディング フレームを示した。全長配列のbp1493−1683に対応する放射能ラベルしたPCRプ ローブを利用するヒト組織mRNAに基づくノーザンブロット分析は約2.4kbのmRNA を示した。 かくして、PIKAPの欠失５’配列をPIKAPの中に存在する配列を利用してヒト膵 臓cDNAライブラリー(Stratagene，Corp.)から単離し、そしてこれらはbp1160−1 460である。2307塩基対と20個のアデノシンのポリアデノシンテールとを含むク ローンを単離した。これは塩基対162での開始コドン及び1767塩基対のオープン リーディングフレームを示し、それ故589個のアミノ酸を有するタンパク質をコ ードする。 ヒトPIKAPのcDNA配列（SEQ ID No．１）及び推定アミノ酸配列（SEQ ID No．2 ）をそれぞれ配列表に示す。計算分子量は69kDaである。特に有意義なのはブロ モドメインの存在である。 PIKAPの最後の74個のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列はｐ85に結合す るのに十分であると信じられている。PIKAPのその他のドメインはブロモドメイ ンを規定するおよそ151から313に至るアミノ酸残基で記述されている（Haynesら 、Nacleic Acids Research，Vol.20，No.10，p2603）。ブロモドメインはタンパ ク質間相互作用に関与しうる。 本発明のPIKAPヌクレオチド配列は；（ａ）図１に示している、又はアメリカ ンタイプカルチャーコレクション（ATCC）に受託番号98189で寄託されているcDN AクローンPIKAPに含まれているDNA配 列；（ｂ）図２に示しているアミノ酸配列又はATCCに寄託されているcDNAクスー ンPIKAPによりコードされるPIKAPアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列； （ｃ）図１に示している又はATCCに寄託されたcDNAクローンpPIKAPに含まれてい るDNA配列の相補体に非常にストリンジェンシーな条件下でハイブリダイゼーシ ョンする、例えば0.5ＭのNaHPO₄、７％のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、１mMの EDTAの中での65％Ｃでのフィルター結合化DNAに対するハイブリダイゼーション 、及び0.1％のSSC／0.1％のSDSの中での68％Ｃでの洗浄（Ausubel F.M．ら、編1 989，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.I，Green Publishing As sociates，Inc．and John Wiley & Sons，Inc.，New York，p2.10.3）によりハ イブリダイズし、且つ機能的に均等な遺伝子産物をコードする任意のヌクレオチ ド配列；並びに（ｄ）図１に示している又はATCCに寄託されているpPIKAPのcDNA クローンに含まれているアミノ酸配列をコードするDNA配列の相補体と弱いスト リンジェンシー条件下で、例えば中程度のストリンジェンシー条件下で、例えば 0.2×SSC／0.1％のSDSの中での42％Ｃでの洗浄（Ausubelら、1989、前掲）にお いてハイブリダイズし、しかも機能的に均等なPIKAP遺伝子産物をコードする任 意のヌクレオチド配列；を含む。PIKAPの機能的均等物はその他の種の中に存在 する天然PIKAP、及びPIKAPの機能活性の少なくとも一部（即ち、ｐ85に対する結 合力）を保持する天然又は操作された突然変異PIKAPを含む。本発明は配列（ａ ）〜（ｄ）の縮重変異体も含む。 本発明は更に、前段階の（ａ）〜（ｄ）のヌクレオチド配列にハイブリダイズ する、それ故その相補体である核酸分子、好ましくはDNA分子を含む。かかるハ イブリダイゼーション条件は前述の通り高度にストリンジェンシーでもあまり高 度にストリンジェンシーで なくてもよい。核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）である状 況において、高度にストリンジェンシーな条件とは、例えば６×SSC／0.05％の ピロリン酸ナトリウムの中での37％のＣ（14塩基のオリゴ）、48％のＣ（17塩基 対のオリゴ）、55％のＣ（20塩基のオリゴ）での洗浄を意味しうる。これらの核 酸分子は例えばPIKAP遺伝子調節においてPIKAPアンチセンス分子をコードする又 はかかる分子として作用しうる(PIKAP遺伝子核酸配列の増幅反応におけるアンチ センスプライマーについて及び／又はとして)。PIKAP遺伝子調節に関し、かかる 技術は例えば炎症免疫反応を調節するのに利用できうる。更に、かかる配列は更 にPIKAP遺伝子調節のために有用なリボザイム及び／又は三重ヘリックス配列と して利用できうる。また更に、かかる分子は診断方法の成分として利用すること ができ、これにより例えば炎症反応、例えば関節炎を引き起こすのを担う特定の PIKAP遺伝子の存在が検出されうる。 上記のPIKAPヌクレオチド配列に加えて、同種に存在する全長PIKAP cDNAもし くは遺伝子配列及び／又は他の種に存在するPIKAP遺伝子の同族体が当業界公知 の分子生物技術によりめんどうな実験をすることなく同定及び容易に単離できる 。従って、PIKAPの同族体は容易に同定でき、そしてcDNAライブラリーから単離 できる。 近縁の種におけるPIKAPの同族体の同定は薬剤発見の目的のためのヒトにより 近縁な動物モデル系の開発のために有用でありうる。例えば、注目の生物に由来 する好中球mRNAから合成したcDNAの発現ライブラリーはかかる種に由来するラベ ル化触媒サブユニット、例えばp110又はp110触媒サブユニット融合タンパク質を 利用してスクリーニングできうる。他方、かかるcDNAライブラリー又は注目の生 物由来のゲノムDNAライブラリーはハイブリダイゼーション又は増幅プローブと して本明細書に記載のヌクレオチドを利用するハ イブリダイゼーションによりスクリーニングできる。更に、PIKAP遺伝子産物の １又は複数のドメインに対して強い相同性を有するタンパク質をコードするゲノ ム内のその他の遺伝子座にある遺伝子も類似の技術を介して同定できる。cDNAラ イブラリーの場合、かかるスクリーニング技術は同一又は異なる種における別の スプライシングされた転写物に由来するクローンを同定できる。 スクリーニングは二重フィルターを利用するフィルターハイブリダイゼーショ ンであってよい。ラベル化プローブは図１に示すようにPIKAPヌクレオチド配列 の少なくとも15〜30の塩基対を含みうる。利用するハイブリダイゼーション洗浄 条件はcDNAライブラリーが、ラベル化配列の由来する生物のタイプとは異なる生 物に由来する場合、低めのストリンジェンシーとすべきである。 低ストリンジェンシー条件は当業者に公知であり、そしてライブラリー及びラ ベル化配列の由来する特定の生物に依存して予測的に変えることができるであろ う。かかる条件に関する指針につては、例えばSambrookら1989，Molecular Clon ing，A Laboratoty Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y．;及びAusubelら1 989，Current Protocols in MolecularBiology，Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Yを参照のこと。 他方、ラベル化PIKAPヌクレオチドプローブはここでも適当なストリンジェン シー条件を利用し、注目の生物に由来するゲノムライブラリーをスクリーニング するのに利用できうる。ヒトゲノムクローンの同定及び特性決定は診断試験の考 案及びヒト患者における細胞増殖障害を処置するための臨床プロトコールの考案 のために有用である。例えば、ヒト遺伝子のイントロン／エクソン境界に隣接す る領域に由来する配列は、診断に利用できうるエクソン、イントロン、スプライ シング部位（例えばスプライスアクセプター及び／又 はドナー部位）内の突然変異を検出するために増幅アッセイにおいて利用するた めのプライマーを考案するために利用できうる。 更に、PIKAP遺伝子同族体を本明細書に開示のPIKAP遺伝子産物内のアミノ酸配 列に基づいて考案した２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを利用す るPCRを実施することにより注目の生物の核酸から単離し得る。反応のための鋳 型はPIKAP遺伝子アレルを発現することがわかっている又は推定されるヒトもし くは非ヒト細胞系又は好中球の如き細胞タイプから調製したmRNAの逆転写体によ り得られうる。 このPCR産物は増幅配列がPIKAP遺伝子の配列であることを確証せしめるように サブクローン及び配列決定できうる。次いでこのPCRフラグメントを様々な方法 により全長cDNAクローンを単離するために利用できうる。例えば、増幅フラグメ ントをラベルし、そしてバクテリオファージcDNAライブラリーの如きcDNAライブ ラリーをスクリーニングするのに利用できうる。他方、このラベル化フラグメン トはゲノムライブラリーのスクリーニングを介してゲノムクローンを単離するた めに利用し得る。 PCR技術は全長cDNA配列を単離するためにも利用し得る。例えばRNAは適当な細 胞源（即ち、PIKAP遺伝子を発現することのわかっている、又は推定されている もの、例えば好中球又はその他のタイプの白血球）から標準の手順を利用して単 離し得る。逆転写反応は第一鎖合成のプライミングのために増幅フラグメントの ５’最端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用してRNAに対して実施 し得る。得られるRNA/DNAハイブリドを標準末端トランスフェラーゼ反応を利用 してグアニンで「テール化」してよく、このハイブリドをRNAase Hで消化するこ とができ、そして第二鎖合成はポリ−Ｃプライマーでプライミングすることがで きうる。即ち、増幅フ ラグメントの上流のcDNA配列は簡単に単離できうる。利用できうるクローニング 戦略については、例えばSambrookら、1989前掲を参照されたい。 PIKAP遺伝子配列は更に突然変異PIKAP遺伝子アレルを単離するためにも利用し てよい。かかる突然変異アレルは炎症の如き造血幹系細胞活性化障害の症状に寄 与するゲノタイプを有することのわかっている又は推定されている個体から単離 し得る。突然変異アレル及び突然変異アレル産物は下記の治療的及び診断方法に 利用し得る。更に、かかるPIKAP遺伝子配列はPIKAP遺伝子調節（例えばプロモー ター又はプロモーター／エンハンサー）欠損を検出するのに利用できうる。 突然変異PIKAP遺伝子のcDNAは例えば当業者公知の技術、PCRにより単離し得る 。この場合、第一cDNA鎖を突然変異PIKAPアレルを担持すると推定される個体に おいて発現されることのわかっている又は推定される細胞から単離したmRNAに対 してオリゴdTオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、次いでこの新しい鎖を 逆転写酵素で伸長させることにより合成できうる。次いでcDNAの第二鎖を正常遺 伝子の５’末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを利用して合 成する。これら２種類のプライマーを用い、その産物をPCRを介して増幅させ、 適当なベクターにクローニングし、そして当業者公知の方法を介してDNA配列分 析にかける。突然変異PIKAPアレルのDNA配列を正常PIKAPアレルのそれと対比す ることにより、突然変異PIKAP遺伝子産物の機能の欠失又は改変を司る突然変異 が確認できる。 他方、ゲノムライブラリーは突然変異PIKAPアレルを担持すると推定されるも しくはそれがわかっている個体から得られるDNAを用いて構築することができる か、又はcDNAライブラリーは突然変異PI KAPアレルを発現することのわかっているもしくは推定される細胞タイプ由来のR NAを用いて構築できる。正常PIKAP遺伝子又はその任意の適当なフラグメントを ラベルし、そしてかかるライブラリーにおける対応の突然変異PIKAPアレルを同 定するためのプローブとして利用することができうる。突然変異PIKAP遺伝子配 列を含むクローンを当業者公知の方法に従って精製し、次いで配列分析にかける ことができうる。 更に、例えば突然変異PIKAPアレルを担持すると推定される又はそれがわかっ ている個体においてかかる突然変異アレルを発現することのわかっている又は推 定される細胞タイプから単離したRNAより合成したcDNAを用いて発現ライブラリ ーを構築することができる。このようにして、推定の突然変異細胞タイプにより 作られる遺伝子産物を発現させ、そして下記のように正常PIKAP遺伝子産物に対 して生起させた抗体と一緒に標準の抗体スクリーニングを利用してスクリーニン グできる（スクリーニング技術に関しては、例えばHarlow，E，and Lane,編1988 「Antibodics；A Laboratory Manual」Cold Soring Harbor Press，Cold Sprin Harborを参照のこと。）更に、スクリーニングはラベル化融合タンパク質による スクリーニングにより成し遂げることができる。PIKAP突然変異が改変された機 能を有する発現遺伝子産物を供する場合（例えば、ミスセンス又はフレームシフ ト突然変異の結果として）、PIKAPに対する抗体のポリクローナルセットは突然 変異PIKAP遺伝子産物と交差反応するようである。かかるラベル化抗体との反応 を介して検出されるライブラリークローンは当業者公知の技術に従って精製して 配列分析にかけることができる。 本発明は更に突然変異PIKAP、PIKAPのペプチドフラグメント、トランケーショ ン化PIKAP及びPIKAP融合タンパク質をコードする ヌクレオチド配列を包括する。これらには、限定することなく、下記の突然変異 PIKAPをコードするヌクレオチド配列；触媒的結合に対応するポリペプチドもし くはペプチド又はPIKAPのＧβサブユニット結合性ドメインもしくはこれらのド メインの一部；１もしくは２つのドメインが欠失しているかトランケーションPI KAP又はトランケーション非機能性PIKAPが含まれる。融合タンパク質をコードす るヌクレオチドには、限定することなく、全長PIKAP、トランケーションPIKAP、 又は無関係のタンパク質もしくはペプチド、例えば得られる融合タンパク質の精 製もしくは検出を補助するエピトープタグ、又はマーカーとして利用できうる酵 素、蛍光タンパク質、ルミネッセンスタンパク質に融合されPIKAPのペプチドフ ラグメントが含まれうる。 本発明は更に（ａ）任意の上記のPIKAPコード配列及び／もしくはその相補体 （即ち、アンチセンス）；（ｂ）コード配列の発現を指令する調節因子に作動可 能式に一体化した上記の任意のPIKAPコード配列；並びに（ｃ）宿主細胞内でコ ード配列の発現を指令する調節因子に作動可能式に一体化した上記の任意のPIKA Pコード配列を含む遺伝子操作された宿主細胞も包括する。本明細書において用 いる調節因子には、限定することなく、誘導性及び非誘導性プロモーター、エン ハンサー、オペレーター及びその他の因子であって発現を駆動及び調節すること が当業者に公知であるものが含まれる。かかる調節因子には、限定することなく 、バクロウィルスプロモーター、サイトメガロウィルスhCMV即時早期遺伝子、SV 40アデノウィイルの早期又は後期プロモーター、lac系、trp系、TAC系、TRC系、 ファージＡの主要オペレーター及びプロモーター領域、fdコートタンパク質のコ ントロール領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酸性ホスフ ァターゼのプロモーター及び酵母接 合因子のプロモーターが含まれる。 PIKAP PIKAPは様々な用途、例えば抗体の作製、診断アッセイにおける試薬、細胞増 殖障害の調節に関与するその他の細胞遺伝子産物の同定、及びかかる障害の処置 において利用できうる化合物のスクリーニングのためのアッセイにおける試薬と して利用できる。 本発明のPIKAPアミノ酸配列には図２に示すアミノ酸配列（SEQID No．２）又 はATCCに寄託されたcDNAクローンPIKAPによりコードされるアミノ酸配列が含ま れる。更に、その他の種のPIKAPが本発明に包括される。事実、上記のPIKAPヌク レオチド配列によりコードされる任意のPIKAPタンパク質が本発明の範囲に属す る。 本発明は更に任意の上記の基準、例えば限定することなく、ｐ85に結合する能 力、PI3K活性に影響する能力による判定に従い、上記のヌクレオチド配列により コードされるPIKAPに機能的に均等であるタンパク質も包括する。かかる機能的 に均等なPIKAPタンパク質には、限定することなく、上記のPIKAPヌクレオチド配 列によりコードされるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の付加又は置換であって、 カイレント変化を供し、それ故機能的に均等な遺伝子産物を産生するものを含む 。残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性特性の類似に 基づき構築されうるアミノ酸置換が関与する。例えば、非極性（疎水性）アミノ 酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニ ン、トリプロファン及びメチオニンが含まれる。極性中性アミノ酸にはグリシン 、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが 含まれる。正帯電（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リジン及びヒスチジンが 含まれる。そして負帯電（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸 が含まれる。 PIKAP DNAにランダム突然変異を施し（当業者公知のランダム突然変異誘発技 術を利用して）、そして得られる突然変異PIKAPを活性について試験できるが、 より高い機能、例えば触媒サブユニットに対するより強い結合親和力及び／又は より強いシグナル生成能力；又はより低い機能、例えば触媒サブユニットに対す るより弱い結合親和力及び／又はより弱いシグナル生成能力を有する突然変異PI KAPを作製するようにPIKAPコード配列の部位特異的突然変異誘発を操作すること ができる（当業者周知の部位特異的突然変異誘発技術を利用して）。 例えば、ブタPIKAPアミノ酸配列をヒトPIKAPのそれと整合させることができる 。突然変異PIKAPは種間同一性領域が維持され、一方で可変性残基が改善される ように、例えばアミノ酸残基の欠失もしくは挿入により、又は１もしくは複数個 のアミノ酸残基の置換により操作し得る。可変性位置での保存的改変は機能を保 持する突然変異PIKAPを作るように操作できる。このような可変性位置での非保 存的変化は機能を改変するように操作できうる。他方、機能の改変が所望する場 合、欠失又は保存領域の非保存性改変を操作せめしてよい。当業者は本明細書に 供する教示を利用してかかる突然変異体又は欠失PIKAPをそれらについての機能 変化に関して容易に試験できうる。 PIKAPコード配列に対するその他の突然変異誘発は、選定の宿主細胞における 発現、スケールアップ等により適するPIKAPを作製するように施すことができる 。例えば、各アミノ酸についてのトリプレットコードを宿主細胞翻訳機構の優先 コドン用法により適合するように改変してよい。 PIKAPの１もくしは複数のドメイン（もしくはドメインの一部）に対応するペ プチド（例えば、ｐ85結合性ブロモドメイン）、トラ ンケーション化もしくは欠失PIKAP(例えば１もしくは複数の上記ドメインの一部 が欠失しているPIKAP)、並びに全長PIKAP、PIKAPペプチドもしくはトランケーシ ョンPIKAPが無関係のタンパク質に融合している融合タンパク質も本発明の範囲 に属し、そして本章及び前述において開示したPIKAPヌクレオチド及びPIKAPアミ ノ酸配列に基づいて考案されうる。かかる融合タンパク質には、限定することな く、エピトープタグに対する融合体（例えば、下記実施例に例示）；又はマーカ ー機能を担う酵素、蛍光タンパク質もしくはルミネッセンスタンパク質に対する 融合体が含まれる。 PIKAPポリペプチド及びペプチドは化学合成できるが（例えばCreighton 1983 ，Proteins：Structures and Molecular Principles，W.H．Freeman & Co.，N.Y .）、PIKAPに由来する大型ポリペプチド及び全長PIKAP自体もPIKAP遺伝子配列及 び／又はコード配列を含む核酸の発現のために当業者公知の技術を利用して組換 DNA技術により好適に製造し得る。かかる方法は上記のPIKAPヌクレオチド配列並 びに適当な転写及び翻訳コントロールシグナルを含む発現ベクターを構築するの に利用できうる。これらの方法には、例えばin vitro組換DNA技術、合成技術、 及びin vivo遺伝子組換が含まれる。例えばSambrookら、1989前掲及びAusubelら 、1989前掲に記載の技術を参照のこと。他方、PIKAPヌクレオチド配列をコード できるRNAは例えばシンセサイザーを利用して化学合成できうる。例えば引用す ることで本明細書に組入れる「Oligonucleotide Synthesis」1984，Gait，M.J. 編IRL Press，Oxfordに記載の技術を参照のこと。 本発明のPIKAPヌクレオチド配列を発現させるのに様々な宿主発現ベクター系 を利用することができうる。PIKAPペプチド又はポリペプチドが可溶性誘導体で ある場合、ペプチド又はポリペプチドは 培養物から、即ち、PIKAPペプチド又はポリペプチドが分泌されないときは宿主 細胞から、そしてPIKAPペプチド又はポリペプチドが細胞により分泌されるとき は培養培地から回収できうる。しかしながら、かかる操作された宿主細胞自体、 PIKAPの構造及び機能特性を保持することのみならず、例えば薬剤スクリーニン グアッセイの如き生物活性を評価することも重要な場合、使用してよい。 本発明の目的のために利用できうる発現系には、限定されることなく、微生物 、例えばPIKAPヌクレオチド配列を含む組換バクテリオファージDNA、プラスミド DNAもしくはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．コリ (E．coli)、Ｂ．スブチリス(B．subtilis)）、PIKAP配列を含む組換ウィルス発 現ベクター（例えばバキュロウィルスで感染された昆虫細胞系；PIKAPヌクレオ チド配列を含む組換えウィルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウィ ルス、CaMV；タバコモザイクウィルス、TMV)により感染された又は組換プラスミ ド発現ベクター（例えばTiプラスミド）により形質転換された植物細胞系；又は 哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えばメタロチオネインプロモ ーター）もしくは哺乳動物ウィルス由来のプロモーター（例えばアデノウィルス 後期プロモーター；ワクシニアウィルス7.5Kプロモーター）を含む組換発現構築 体を保有する哺乳動物細胞系(例えばCOS，CHO，BHK，293，3T3，U937)が含まれ る。 細菌系において、数多くの発現ベクターがPIKAP遺伝子産物を発現させること を意図する利用に依存して好適に利用されうる。例えば、PIKAPタンパク質の薬 理組成物の作製又はPIKAPタンパク質に対する抗体を生起させるために大量のか かるタンパク質を製造する場合、例えば容易に精製できる高レベルの融合タンパ ク質産物の発現を指令するベクターが所望されうる。かかるベクターには限定す ることなく、PIKAPコード配列がlacZコード領域にインフレームでベクター内に 個別にライゲーションされた融合タンパク質が産生できるようになっているＥ． コリ発現ベクタ−pU R278(Rutherら、1983，EMBO J．２：1791)；pINベクター（ Inouye & Inouye，1985,Nucleic Acids Res．13：3101-3109；Van Heeke & Schu ster，1989，Ｊ．Biol．Chem．264：5503-5509）；等が含まれる。pGEXベクター はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として外来ポ リペプチドを発現させるのにも利用できうる。挿入配列が比較的小型のポリペプ チド（25kD未満）をコードするなら、かかる融合タンパク質は一般に可溶性であ り、そしてグルタチオン−アガロースビーズに対する吸着、それに続く遊離グル タチオンの存在下での溶出により簡単に精製できうる。pGEXベクターはクローニ ングされた標的遺伝子産物がGST成分から遊離できるようにトロンビン又はXa因 子プロテアーゼ切断部位を含むように考案されている。他方、得られる融合タン パク質が不活性であり、そして宿主細胞内で封入体を形成するなら、この封入体 は当業者に周知の技術を利用して精製、そして組換タンパク質は可溶化できうる 。 昆虫系において、オートグラファ・カリフォニカ（Autographa californica） 核ポリヒドロシスウィルス(AcNPV)が外来遺伝子を発現させるベクターとして使 用し得る（例えば、Smithら、1983，J．Virol．46：584；Smith米国特許第4,215 ,051号参照のこと）。 哺乳動物宿主において、数多くのウィルス系発現系が、好ましくはＵ937細胞 又はCos−７細胞において組換タンパク質を一過性的に発現させるためのCMVプロ モーターを用い、利用されうる。他方、当業者周知のレトロウィルスベクター系 が組換発現構築体を宿主細胞に挿入するのに利用できうる。例えば、細胞を形質 導入するためのレトロウィルスベクター系が公開PCT出願WO96/09400及びWO 94／29438に記載されている。 アデノウィルスを発現ベクターとして用いる場合、注目のPIKAPヌクレオチド 配列をアデノウィルス転写／翻訳コントロール複合体、例えば後期プロモーター 及び３分節系リーダー配列にライゲーションさせてよい。次いでこのキメラ遺伝 子をin vitro又はin vivo組換によりアデノウィルスゲノムの中に挿入してよい 。ウィルスゲノムの非本質領域（例えば領域Ｅ１又はＥ３）への挿入は、生存し 、且つ感染宿主内でPIKAP遺伝子産物を発現させることのできる組換ウィルスを もたらすであろう（例えば、Logan & Shend，1984，Proc．Natl．Acad．Sci．US A 81：3655-3659を参照のこと）。特異的な開始シグナルも挿入PIKAPヌクレオチ ド配列の効率的な翻訳のために必要でありうる。これらのシグナルにはATG開始 コドン及び隣接配列が含まれる。それ自体の開始コドン及び隣接配列を含む全PI KAP遺伝子又はcDNAの場合、追加の翻訳コントロールシグナルは必要とされない ことがある。しかしながら、PIKAPコード配列の一部しか挿入しないとき、おそ らくはATG開始コドンを含む外性翻訳コントロールシグナルを用意せねばならな い。更に、この開始コドンはインサート全体の翻訳を確実にするために所望のコ ード配列のリーディングフレームとin phaseとなっていなければならない。これ らの外性翻訳コントロールシグナル及び開始コドンは天然及び合成を含む様々な 起源のものであってよい。発現の効率は適当な転写エンハンサー因子、転写ター ミネーター等の組込みにより高めることができうる（Bittnerら、1987，Methods in Enzymol．153：516-544参照のこと）。 更に、挿入配列の発現を調節する又は遺伝子産物を特定の所望の状況で修飾及 びプロセシングする宿主細胞株を選定することができうる。タンパク質産物のか かる修飾（例えばグリコシル化）及びプ ロセシング（例えば切断）はタンパク質の機能にとって重要でありうる。様々な 宿主細胞がタンパク質及び遺伝子産物の後翻訳プロセシング及び修飾のための特 徴的且つ特異的なメカニズムを有する。適当な細胞系又は宿主系は発現される外 来タンパク質の適正な修飾及びプロセシングを確実にするために選定し得る。従 って、一次転写物の適正なプロセシングのための細胞機構を有する真核宿主細胞 を利用してよい。かかる哺乳動物宿主細胞には限定することなく、CHO，VERO，B HK，HeLa，COS，MDCK．293，3T3，W138及びU937細胞が含まれる。 組換タンパク質の長期間にわたる高収率生産のため、安定な発現が好ましい。 例えば、上記のPIKAP配列を安定的に発現する細胞系を操作してよい。ウィルス 複製起点を含む発現ベクターを用いるのではなく、宿主細胞は適当な発現コント ロール因子（例えばプロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポ リアデニル化部位、等）によりコントロールされたDNA及び選択マーカーで形質 転換せしめてよい。外来DNAの導入の後、操作した細胞をリッチな培地の中で１ 〜２時間増殖させ、次いで選択培地にスイッチする。組換プラスミドにおける選 択マーカーは選択に対する耐性を授け、それ故細胞がプラスミドをその染色体の 中に安定的に組込み、そしてフォーカスを形成するに至るまで増殖し、クローニ ングでき、そして細胞系へと増幅できうるようにする。この方法はPIKAP遺伝子 産物を発現する細胞系を操作するのに好適に利用されうる。かかる操作した細胞 系はPIKAP遺伝子産物の内性活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニング及び評 価において極めて有用でありうる。 いくつかの選択系、例えば限定することなく、ヘルペス単純ウィルスチミジン キナーゼ(Wiglerら、1977，Cell11：223)、ヒポキサンチン−グアニンホスホリ ボシルトランスフェラーゼ(Szybalsk a & Szybalski，1962，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 48：2026)及びアデニンホ スホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら、1980，Ce11 22：817)遺伝子がtk^-、h gprt^-又はaprt^-細胞のそれぞれにおいて利用できうる。また、抗代謝物耐性を下 記の遺伝子についての選択に基づいて利用できうる。dhfr：これはメトトレキセ ートに対する耐性を授ける（Wiglerら、1980，Natl．Acad．Sci．USA 77：3567 ；O'Hareら、1981，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78：1527；gpr：これはミコフ ェノール酸に対する耐性を授ける（Mulligan & Berg，1981，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 78：2072)；neo：これはアミノグリコシドＧ−418に対する耐性を授 ける（Colberre-Garapinら、1981，J．Mol．Biol．150：１）；及びhyro：これ はヒグロマイシンに対する耐性を授ける(Santerreら、1984，Gene 30：147)。 PIKAP遺伝子産物は遺伝子導入マウスにおいても発現されうる。任意の種の動 物、例えば限定することなく、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ミ クロピッグ、ヤギ及び非ヒト霊長類、例えばヒヒ、サル及びチンパンジーがPIKA P遺伝子導入動物を構築するのに利用できうる。 当業界公知の技術が、遺伝子導入動物の始祖系列を作製するようPIKAP導入遺 伝子を動物に導入するのに利用できうる。かかる技術には、限定することなく、 前核マイクロインジェクション（Hoppe,P.C．and Wagner，T.E.，1989、米国特 許第4,873,191号）；生殖系へのレトロウィルス媒介遺伝子導入（Van der Putte nら、1985,Proc．Natl．Acad．Sci.，USA 82：6148-6157）；胚芽幹細胞におけ る遺伝子ターゲッティング（Thompsonら、1989，Cell 56：313-321)；胚芽のエ レクトロポレーション（Lo，1983，Mol．Cell．Biol．３：1803-1814）；及び精 子媒介遺伝子導入（Lavitranoら、19 89，Cell 57：717-723）；等が含まれる。かかる技術については、Gordon，1989 ，Transgenic Animals，Intl．Rev．Cytol．115：171-229を参照のこと。これは 引用することで本明細書に組入れる。 本発明は全細胞の中にPIKAP導入遺伝子を担持する遺伝子導入動物及び全てで はなくその一部の細胞において導入遺伝子を担持する動物、即ち、モザイク動物 を提供する。導入遺伝子は単一導入遺伝子として、又はコンカテマーで、例えば ヘッド・トゥ・ヘッドタンデム又はヘッド・トゥ・ヘッドタンデムで組込まれう る。当該導入遺伝子は例えばLaskoらの教示（Lasko，M．ら、1992，Pro．Natl． Acad．Sci．USA 89：6232-6236）に従い、特定の細胞タイプの中に選択的に導入 して活性化させることができうる。かかる細胞タイプ特異的活性化に必要な調節 配列は注目の特定の細胞タイプに依存し、そして当業者に明らかであろう。PIKA P導入遺伝子を内性PIKAP遺伝子の染色体部位の中に組込むことが所望されるとき 、遺伝子ターゲッティングが好ましい。簡単には、かかる技術を利用する場合、 内性PIKAP遺伝子に相同性であるいくつかのヌクレオチド配列を含むベクターを 、染色体配列との相同組換を介して内性PIKAP遺伝子のヌクレオチド配列の中に 組込んでその機能を破綻させることを目的に考案する。これにより、内因性PIKA P遺伝子の発現は内性遺伝子への非機能性配列の挿入により失われることもある 。この導入遺伝子は例えばGuらの教示(Guら、1994，Science 265：103-106)に従 い、特定の細胞タイプに選択的に導入することもでき、これによりその細胞タイ プのみにおいて内性PIKAP遺伝子を失活させることができる。かかる細胞タイプ 特異的分活性化のために必要とされる調節配列は注目の特定の細胞タイプに依存 し、そして当業者に明らかであろう。 遺伝子導入動物が一旦構築できたら、組換PIKAP遺伝子の発現を 標準の技術を利用してアッセイすることができうる。一次スクリーニングはサザ ンブロット分析又はPCR技術により成し遂げ、導入遺伝子の組込みが行われたか どうかを検定するために動物を分析することができうる。遺伝子導入動物の組織 中の導入遺伝子のmRNA発現のレベルは、限定することなく、動物から獲得した細 胞タイプサンプルのノーザンブロット分析、in situハイブリダイゼーション分 析及びRT-PCRの如き技術を利用して評価することもできうる。細胞増殖障害の診断 様々な方法が細胞増殖障害、例えば再狭窄及び癌の診断及び予後検出のため、 並びにかかる障害にかかる傾向をもつ対象者の同定のために採用されうる。 かかる方法は、例えば上記のPIKAPヌクレオチド配列及びPIKAP抗体の如き試薬 を利用する。詳しくは、かかる試薬は、例えば（１）PIKAP遺伝子突然変異の存 在の検出又は非細胞増殖障害状況に比して過剰もしくは低下したPIKAP mRNA発現 の検出のため；（２）非細胞増殖障害状況に比して過剰もしくは低下したPIKAP 遺伝子産物の検出のため；並びに（３）PIKAPにより媒介されるシグナル変換経 路における障害もしくは異常の検出のために利用し得る。 本明細書に記載の方法は、例えば本明細書に記載の少なくとも一種の特異的な PIKAPヌクレオチド配列又はPIKAP抗体試薬を含んで成るプリパッケージ診断キッ トにより実施することができ、これは好都合には細胞活性化障害異常を示す患者 を診断するために臨床的設備において利用されうる。 PIKAPの検出のため、任意の有核細胞がゲノム核酸の出発源として利用できう る。PIKAP発現の検出のため、PIKAPの発現される任意の細胞タイプ又は組織が利 用されうる。 核酸系検出技術を以下に記述する。ペプチド検出技術も以下に記 述する。 PIKAP 遺伝子及び転写体の検出 PIKAP遺伝子内の突然変異はいくつかの技術を利用して検出できる。任意の有 核細胞由来の核酸がかかるアッセイ技術のための出発点として利用でき、そして 当業者公知の標準核酸調製手順に従って単離され得る。 DNAは遺伝子構造に関与する異常、例えば点突然変異、挿入、欠失及び染色体 転移を検出するために生物サンプルのハイブリダイゼーション又は増幅アッセイ において利用できうる。かかるアッセイには、限定することなく、サザン分析、 一本鎖コンホメーション多形態分析（SSCP）、及びPCR分析が含まれる。 PIKAP特異的突然変異の検出のためのかかる診断方法は例えば、核酸、例えば 患者サンプル又はその他の適当な細胞源に由来するサンプルから獲得した細胞DN A分子、クローン化遺伝子又はその縮重変異体等を、組換DNA分子、クローン化遺 伝子又はその縮重変異体等の１又は複数のラベル化核酸試薬と、PIKAP内での相 補性配列に対するこれらの試薬の特異的なアニーリングに好適な条件下で接触及 びインキュベーションすることを包含しうる。好ましくは、これら核酸試薬の長 さは少なくとも15〜30個のヌクレオチドである。インキュベーション後、全ての アニールしなかった核酸を核酸分子ハイブリドから除去する。ハイブリダイズし た核酸の存在は、任意のかかる分子が存在しているなら、検出される。かかる検 出方式を利用し、注目の細胞タイプ又は組織由来の核酸を固相支持体、例えば膜 、又はプラスチック表面、例えばマイクロタイタープレートもしくはポリスチレ ンビーズのそれの上に固定化してよい。この場合、インキュベーション後、アニ ールしなかった上記のタイプのラベル化核酸試薬は容易に除去できる。残留のア ニールしたラベル化PIKA P核酸試薬の検出は当業者周知の標準技術を利用して成し遂げられる。核酸試薬 のアニールしたPIKAP遺伝子配列を、遺伝子突然変異が存在するか否かを決定す るため、正常な遺伝子配列から推定されるアニーリングパターンと比較してよい 。 患者サンプル又はその他の適当な細胞源におけるPIKAP遺伝子特異的核酸分子 の検出のための別の診断方法は例えばPCRによるその増幅（Mullis K.B．1987米 国特許第4,683,302号に記載の実験態様）、それに続く当業者周知の技術を利用 する増幅分子の検出を包括しうる。得られる増幅配列は、遺伝子突然変異が存在 するか否かを決定するため、増幅される核酸がPIKAP遺伝子の正常コピーのみを 含むであろうと予測されるものと比較してよい。 更に、PIKAP遺伝子突然変異を担持する個体を同定するために周知の遺伝子型 決定技術が実施できうる。かかる技術には、例えば制限フラグメント長多形態（ RFLP）の利用が含まれ、これは使用する特異的な制限酵素についての認識部位の １つにおける配列変異を包括する。 PIKAP遺伝子発現のレベルはPIKAP転写を検出及び測定することによってもアッ セイできうる。例えば、PIKAP遺伝子を発現することのわかっている又は推定さ れる細胞タイプ又は組織、例えば造血幹系細胞、特にミエロイド細胞及び血小板 を単離し、そして上述の如きハイブリダイゼーション又はPCR技術を利用して試 験することができうる。単離細胞は細胞培養物又は患者に由来しうる。培養物か ら採取した細胞の分析は細胞系遺伝子治療技術の一部として利用するべき細胞の 評価における必須工程であるか、又はPIKAP遺伝子の発現に対する化合物の作用 を試験するための必須行程でありうる。かかる分析はPIKAP遺伝子発現の活性化 又は不活性化を含むPIKAPの発現パターンの定量的及び定性的観点の双方を示し うる。PIKAP 遺伝子産物の検出 論じてきた野生型もしくは突然変異PIKAP遺伝子産物又はその保存変異体もし くはペプチドフラグメントに対して特異的な抗体も本明細書に記載の通りにして 、細胞障害診断及び予後診断として利用できうる。かかる診断方法はPIKAP遺伝 子発現のレベルの異常、又はPIKAPの構造及び／もしくは一時的な組織、細胞も しくはサブ細胞位置の異常を検出するために利用でき、そしてin vivo又はin vi troで、例えば生検組織において実施し得る。 分析すべき組織又は細胞タイプには一般にPIKAP遺伝子を発現する細胞を含む ことで知られる又は推定されるもの、例えば浸潤した炎症組織を有する好中球が 含まれるであろう。本明細書において採用するタンパク質単離方法は例えば引用 することで本明細書に組み入れるHarlow and Lane(Harlow，E．and Lane，D.，1 988「Antibodies；A Laboratory Manual」，Cold Spring Harbor Laboratory Pr ess，Cold Spring Harbor，New York)に記載のものであってよい。単離細胞は細 胞培養物又は患者に由来しうる。培養物から採取した細胞の分析は細胞系遺伝子 治療技術の一部として利用されうる細胞の評価における必須の工程でありうるか 、又はPIKAP遺伝子の発現に対する化合物の影響を試験するための必須の工程で ありうる。 例えば、抗体、又は抗体のフラグメント、例えば前述のものはPIKAP遺伝子産 物又はその保存変異体もしくはペプチドフラグメントを定量又は定性検出するた めに本発明において有用である。これは例えば光学顕微鏡、フローサイトメトリ ー又はフルオルメトリー検出と組合せた蛍光ラベル化抗体（下記参照）を採用す る免疫蛍光技術により成し遂げることができる。 本発明において有用な抗体（又はそのフラグメント）又は融合もしくは接合タ ンパク質は更に、PIKAP遺伝子産物又はその保存変異 体もしくはペプチドフラグメントのin situ検出又はｐ85結合力（ラベル化ｐ85 融合タンパク質の場合）についての免疫蛍光、免疫電子顕微鏡又は非免疫アッセ イにおいて組織学的に採用できうる。 in situ検出は組織抗体を患者から取り出し、そしてそれに対して本発明のラ ベル化抗体又は融合タンパク質を適用することにより成し遂げることができうる 。抗体（又はフラグメント）又は融合タンパク質は好ましくはラベル化抗体（又 はフラグメント）を生物サンプルの上に積層することにより適用する。かかる手 順の利用を介し、PIKAP遺伝子又はその保存変異体もしくはペプチドフラグメン トの存在のみならず、検査組織内の分布も決定することが可能である。本発明を 利用し、当業者は多種多様な組織学的方法（例えば染色手順）をかかるin situ 検出を達成するために改良できることを容易に認識するであろう。 PIKAP遺伝子産物又はその保存変異体もしくはペプチドフラグメントについて のイムノアッセイ及び非イムノアッセイは典型的にはサンプル、例えば生物流体 、組織抽出物、採取したばかりの細胞又は細胞培養物の中でインキュベーション した細胞リゼートを、PIKAP遺伝子産物又はその保存変異体もしくはペプチドフ ラグメントを同定できる検出可能式にラベル化された抗体の存在下でインキュベ ーションし、そして任意の数多くの当業界周知の技術により結合抗体を検出する ことを含んで成るであろう。 生物サンプルを固相支持体又は担体、例えばニトロセルロース、又はその他の 固相支持体であって細胞、細胞粒子もしくは可溶性タンパク質を固定化すること のできるものに接触させて固定化させてよい。この支持体を次に適当のバッファ ーで洗い、そして検出可能式にラベル化された抗体又は融合タンパク質で処理し てよい。この固相支持体を次にバッファーで２回洗浄して未結合の抗体又は融合 タンパク質を除去する。固相支持体上の結合ラベルの量を慣用の手段により検出 できうる。 「固相支持体又は担体」は抗原又は抗体を結合させることのできる任意の支持 体を包括することを意図する。周知の支持体又は担体にはガラス、ポリスチレン 、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然 及び改質セルロース、ポリアクリルアミド、ガブロス及びマグネタイトが含まれ る。担体の性質は本発明の目的のためにある程度可溶性であるか、又は不溶性の いづれでもよい。この支持材料はカップリングした分子が抗原又は抗体に結合で きる限り、本質的に任意の可能な構造形態を有してよい。即ち、この支持体の形 態はビーズの如き球状、又は試験管の内側の如き円筒形、又は棒の外面の如きで あってよい。他方、その表面はシート、テストストリップ等のように平らであっ てよい。好適な支持体にはポリスチレンビーズが含まれる。当業者は抗体もしく は抗原の結合のための数多くのその他の適当な担体を知り、又は慣用の実験の利 用によりそれを確認できるであろう。 所定のロットPIKAPサブユニット抗体又は融合タンパク質の結合活性が周知の 方法に従って決定できうる。当業者は慣用の実験を採用することにより各決定の ための作動的且つ最適なアッセイ条件を決定することができるであろう。 抗体に関し、抗体を検出可能式にラベル化することのできる抗体の一の方法は それを酵素に連結し、そして酵素イムノアッセイ(EIA)に利用できうる（Voller 「The Enzyme Linked Immunosorbent Assay（ELISA）」1978，Diagnostic Horiz ons 2：1-7，Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersvil le，MD）；Vollerら1978，J．Clin．Pathol．31：507-520；Butler，1981,Meth ．Enzymol．73：482-523；Maggio（編）、1980，Enzyme Imm unoassay，CRC Press，Boca Raton，FL，；Ishikawaら（編）、1981，Enzyme Im munoassay，Kgaku Shoin，Tokyo）。この抗体に結合した酵素は適当な基質、好 ましくは発色原基質に、例えば光度計、蛍光計又は目視手段より検出できうる化 学成分を生成する状況で反応するであろう。抗体を検出可能式にラベルするのに 利用できる酵素には、限定することなく、マレエートデヒドロゲナーゼ、スタフ ィルコッカルヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコ ールデヒドロゲナーゼ、アルファーグリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、 トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベーターガラク トシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リ ン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンステアラーゼが含 まれる。この検出は酵素にとっての発色原基質を利用する比色法により成し遂げ ることができうる。検出は、類似に調製した標準品と比較して基質の酵素反応の 程度の目視比較により成し遂げることもできうる。 検出は任意の様々なその他のイムノアッセイを利用して成し遂げることもでき うる。例えば、抗体または抗体フラグメントの放射能ラベリングにより、PIKAP をラジオイムノアッセイ(RIA)の利用を通じて検出可能である（例えば、Weintra nb，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course on Radi oligand Assay Techniques，Thc Endocrine Societh，March，1986を参照のこと ：引用することで本明細書に組入れる）。放射性アイソトープはガンマ−カウン ターもしくはシンチレーションカウンターの如きの利用又はオートラジオグラフ ィーにより検出できる。 抗体を蛍光化合物でラベルすることも可能である。蛍光式にラベ ルした抗体を適当な波長の光に曝露させると、その存在は蛍光により検出できる 。最も一般的に利用されている蛍光ラベル化合物はフルオレセインイソチオシア ネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン 及びフルオレスカミンである。 この抗体は蛍光放射金属、例えば¹⁵²Eu又はランタニド系のその他のものを利 用して検出可能式にラベル化することもできる。これらの金属は金属錯形式基、 例えばジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）又はエチレンジアミン四酢酸（EDTA ）を利用して抗体に付加させることができる。 この抗体はケミルミネッセンス化合物にカップリングすることによっても検出 可能式にラベル化することができる。ケミルミネッセンス標識化抗体の存在は化 学反応の際に生ずるルミネッセンスの存在を検出することにより決定できる。特 に有用なケミルミネッセンスラベル化合物の例はルミノール、イソルミノール、 セロマチックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシ ュウ酸エステルである。 同様に、本発明の抗体をラベル化するのにバイオルミネッセンス化合物を使用 することができる。バイオルミネッセンスは触媒タンパク質がケミルミネッセン ス反応の効率を高める生物系において見い出させるタイプのケミルミネッセンス である。バイオルミネッセンスタンパク質の存在はルミネッセンスの存在を検出 することにより決定する。ラベル化の目的のために重要なバイオルミネッセンス 化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンである。 PI3K 発現又は活性を調節する化合物についてのスクリーニングアッセイ 下記のアッセイはPIKAP又はｐ85と相互作用し（例えば結合し） 、ｐ85に対するPIKAPの結合に影響する化合物、PIKAP及び／もしくはｐ85と相互 作用する細胞内タンパク質と相互作用（例えば結合する）する化合物、PIKAPと ｐ85とのもしくはPI3K媒介シグナル変換に関与するその他の細胞内タンパク質と の相互作用を妨害する化合物、並びにPIKAP遺伝子の活性を調節する（即ち、PIK AP遺伝子発現のレベルを調節する）もしくはPIKAPのレベルを調節する化合物を 同定するために考案する。PIKAP遺伝子調節配列（例えばプロモーター配列）に 結合し、且つPIKAP遺伝子発現を調製しうる化合物を同定するアッセイを更に利 用してよい。例えば引用することで本明細書に組入れるPlatt，K.A.，1994，J． Biol．Chem．269：28558-28562を参照のこと。 本発明に従ってスクリーニングできうる化合物には、限定するこなく、PIKAP 又はｐ85に結合し、そして天然リガンドにより誘引される活性を擬帯する（即ち 、作動因子）又は天然リガンドにより誘引される活性を阻害する（即ち、拮抗因 子）ペプチド、抗体及びそのフラグメント、プロスタグランジン、脂質、及びそ の他の有機化合物；並びにPIKAPもしくはp85（又はその一部）を擬態し、そして 天然ガンドに結合して「中和する」ペプチド、抗体又はそのフラグメント、及び その他の有機化合物が含まれる。 かかる化合物には、限定することなく、ペプチド、例えば可溶性ペプチド、例 えば限定することなくランダムペプチドライブラリーの構成員（例えば、Lam，K .S．ら、1991，Nature 354：82-84；Houghten，R．ら、1991，Nature 354：84-8 6）、並びにＤ−及び／又はＬ−形態アミノ酸より成る組合せ化学誘導分子ライ ブラリーペプチド、ホスホペプチド（例えば、限定することなく、ランダム又は 部分的に縮重である直接ホスホペプチドライブラリーの構成員；例えばSongyang ，Z．ら、1993，Cell 72：767-778を参照のこと） ；抗体（例えば、限定することなく、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化 、アンチイディオタイプ、キメラ又は一本鎖抗体、並びにFAb，F(ab)₂及びFab発 現ライブラリーフラグメント、並びにそのエピトープ結合性フラグメント）；並 びに小型の有株又は無株分子が含まれうる。 本発明に従ってスクリーニングできるその他の化合物には、限定することなく 、適当な細胞（例えば好中球）への侵入を増大させることができ、且つPIKAP遺 伝子又はPIKAPシグナル変換経路に関与する一定のその他の遺伝子の発現に影響 を及ぼす（例えば、遺伝子発現に関与する調節領域又は転写因子と相互作用する ことにより小有株分子；又はPIKAPの活性に、例えばPI3Kのp85に対するPIKAPの 結合又はPIKAPシグナル変換経路に関与する一定のその他の細胞内因子に対するP IKAPの結合を阻害もしくは高めることにより影響を及ぼす化合物が含まれる。 コンピューターモデリング及び探索技術は、PIKAPもしくはｐ85の発現又は活 性を調節できうる化合物の同定又は既に同定された化合物の改良を可能にする。 かかる化合物又は組成物が同定できたら、活性部位又は領域を同定する。かかる 活性部位は典型的には結合パートナー部位、例えばｐ85とPIKAP自体との相互作 用ドメインでありうる。本特許出願においてPIKAP及びｐ85はp110に同じ領域に おいて結合することを念頭に置かれたい。この活性部位は当業界公知の方法、例 えばペプチドのアミノ酸配列から、核酸のヌクレオチド配列から、関連の化合物 又は組成物とその天然リガンドとの複合体の研究から同定できうる。後者の場合 、化学又はＸ−線結晶グラフ方法が、当該因子のどの部分に複合したリガンドが 見い出せるかを発見することにより活性部位を見い出すのに利用できうる。 次に、活性部位の三次元幾何学的構造を決定する。これは公知の 方法、例えばコンピューター分子構造を決定できるＸ線結晶グラフにより実施で きる。他方、固相又は液相NMRを利用して一定の分子間距離を決定することがで きる。構造決定の任意のその他の実験方法が部分又は完全幾何学構造を得るため に利用できうる。幾何学構造は天然又は人工の複合化リガンドであって決定すべ き活性部位構造の精度を高めうるものにより測定できうる。 不完全又は不十分な精度で構造が決定できたら、コンピューター式数値化モデ リング方法が構造を完成させるため又はその精度を高めるために利用できうる。 任意の認識されたモデリング方法、例えばタンパク質又は核酸の如き特定の生体 高分子に特異的なパラメーター式モデル、計算分子運動に基づく分子動力学モデ ル、熱アンサンブルに基づく統計学的機械モデル又は合成モデルが利用されうる 。ほとんどのタイプのモデルに関し、構成原子及び基の間の力である標準分子力 場が必要であり、そして物理化学おいて公知の力場から選定されうる。不完全又 は精度の低い実験構造はこのようなモデリング方法により計算した完全且つより 高精度な構造に対する制約に担いうる。 最後に、実験、モデリング又は組合せにより活性部位の構造が決定できたら、 候補の調節化合物はその分子構造に基づく情報と共に化合物に関与するデーター ベースを探索することにより同定できうる。かかる探索は決定された活性部位構 造に合致し、且つ活性部位を規定する基と相互作用する化合物を探索する。かか る探索は入手であってよいが、好ましくはコンピューターのアシストを伴う。こ のような探索から見つけられる化合物は潜在的なPIKAP調節化合物である。 他方、これらの方法は既知の調節化合物又はリガンドから改良型調節化合物を 同定するのに利用できる。既知の化合物の組成は改変 させ、そしてその改変の構造的効果は上記の実験及びコンピューターモデリング 方法をこの新規の組成物に適用することにより決定できる。改変構造をこの化合 物の活性部位構造と比較し、改善されたフィット性又は相互結果があるかどうか を決定する。このようにして、例えば側基を変えることによる組成物のシステム 式バリエーションが迅速に評価できる向上した特異性又は活性の改良型調節化合 物又はリガンドが得られる。 ｐ85と相互作用するPIKAPの活性部位、並びに関連の変換及び転写因子の同定 に基づき調節化合物を同定するのに有用な更なる実験及びコンピューターモデリ ング方法は当業者に自明であろう。 分子モデリング系の例はCHARMm及びQUANTAプログラムである（Polygen Corpor ation，Waltham，MA）。CHARMmプログラムは分子構造の構築、グラフィックモデ リング及び分析を実行する。QUANTAは相互作用構築、修飾、目視化及び分子同志 の挙動の分析を可能にする。 いくつかの論文、例えばRotivinenら1988，Acta Pharmaceutical Fennica 97 ：159-166；Ripka，New Scientist 54-57(June 16，1988)；McKinaly and Rossm ann，1989，Annu．Rev．Pharmacol.Toxiciol．29：111-122；Perry and Davies ，OSAR：Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design pp. 189-193(Alan R．Liss，Inc．1989)；Lewis and Dean，1989，Proc．R.Soc．Lon d．236：125-140 and 141-162には特異的なタンパク質と相互作用性である薬剤 のコンピューターモデリングが記載され、そしてAskewら1989，J．Am．Chem．So c．111：1082-1090には核酸成分についてのモデルレセプターについて記載され ている。化学物質をスクリーニングし、且つグラフィカル的に描写するその他の コンピューターはBio Design，Inc．(Pasadena，CA.)，Allelix，Inc ．(Mississauga，Ontario，Canada)及びHypercube，Inc．(Cambridge，Ontario) の如き会社から入手できる。これらは主に特定のタンパク質に対して特異的な薬 剤への適用のために考案されているが、これらは領域が同定できたら、DNA又はR NAのその領域に特異的な薬剤の考案のために適用できうる。 以上は結合性を改変せしめうる化合物の考案及び作製について記載してきたが 、天然産物又は合成化学物質を含む既知の化合物、並びにインヒビター又はアク チベーターである化合物についてのタンパク質を含む生物活性物質のライブラリ ーをスクリーニングすることもできる。 本明細書に記載の如きアッセイを介して同定した化合物は例えばPIKAP遺伝子 産物の生物機能を高める及び細胞増殖障害を緩和するのに有用でありうる。本明 細書に記載の技術により同定した化合物の有効性を試験するためのアッセイを以 下に説明する。 PIKAP に結合する化合物についてのin vitroスクリーニングアッセイ in vitro系はPIKAP及びｐ85と相互作用し（例えば結合）できる化合物を同定 するために考案できうる。同定する化合物は例えば野生型及び／又は突然変異PI KAP遺伝子産物の活性の調節において利用し得；正常PIKAP／ｐ85相互作用を破綻 する化合物を同定するためのスクリーニングにおいて利用し得；又はそれ自体か かる相互作用を破綻しうる。 PIKAPに結合する化合物を同定するのに利用されるアッセイの原理はPIKAPと試 験化合物とをこれら２つの成分が相互作用して結合し、その反応混合物から取り 出せる及び／又は検出されることのできる複合体を形成するような条件下及び十 分な時間をかけて反応混合物を調製することを包括する。利用するPIKAPの種は スクリーニ ングアッセイの目的に依存して変えてよい。例えば、天然リガンドの作動因子を 望むなら、全長PIKAP、又はアッセイ系において利点（例えばラベリング、得ら れる複合体の単離、等）を供するタンパク質又はポリペプチドに融合したPIKAP を含む融合タンパク質を使用してよい。 スクリーニングアッセイは様々な方式で実施してよい。例えば、かかるアッセ イを実施する一の方法はPIKAPタンパク質、ポリペプチド、ペプチドもしくは融 合タンパク質又は試験物質を固相支持体に定着させ、そして反応の終了時にこの 固相に定着したPIKAP／試験化合物複合体を検出することを包括するであろう。 かかる方法の一の態様において、PIKAP反応体を固相表面の上に定着させ、そし て定着していない試験化合物は直接又は間接的にラベルしてよい。この方法の別 の態様においては、固相に定着したPIKAPタンパク質をラベル化ｐ85と複合させ る。次いで、試験化合物はPIKAP／ｐ85複合体の結合を破綻する能力についてア ッセイすることができる。 実際、マイクロタイタープレートが固相として好適に利用されうる。定着成分 は非共有又は共有結合により固定化できうる。非共有結合は単に固相表面をタン パク質の溶液で被覆し、そして乾燥させることにより成し遂げることができうる 。他方、固定化するタンパク質に対して特異的な固定化抗体、好ましくはモノク ローナル抗体をこのタンパク質を固相表面に定着させるのに用いてよい。この表 面は前もって調製し、そして保存してよい。 このアッセイを実施するため、非固定化成分も定着成分を含む被覆面に付加す る。反応終了後、未反応の成分を、形成される任意の複合体が固相表面の上に固 定化され続けているような条件下で除去する（例えば洗浄により）。固相表面上 に定着した複合体の検出は数多くの方式で成し遂げることができる。予め固定化 していない成 分を予めラベリングする場合、表面上に固定化されたラベルの検出は複合体が形 成されたことを示唆する。予め固定化していない成分を予めラベリングしない場 合、例えば予め固定化していない成分に特異的なラベル化抗体を用い、表面上に 定着した複合体を検出するのに間接ラベルを利用することができる（抗体はその 後直接ラベリングするか、又はラベル化抗Ig抗体により間接的にラベリングして よい）。 他方、反応を液相の中で実施し、反応産物を未反応成分から分離し、そして複 合体を検出することができる；これは、例えばPIKAPタンパク質、ペプチドもし くは融合タンパク質、又はｐ85タンパク質もしくは融合タンパク質に特異的な固 定化抗体、又は溶液中で形成される任意の複合体を定着する試験化合物、及び定 着タンパク質を検出するための考えられる複合体のその他の成分に特異的なラベ ル化抗体を利用する。 PIKAP と相互作用する細胞内タンパク質についてのアッセイ タンパク質間相互作用を検出するために適当な方法はPIKAP及び／又はｐ85と 相互作用する細胞内タンパク質を同定するために採用し得る。これらの方法はPI KAPとｐ85との相互作用の部位を決定するのにも適用されうる。採用できうる伝 統的な方法は細胞リゼードもしくは細胞リゼートから得られるタンパク質とPIKA Pと相互作用するリゼート中のタンパク質を同定するためのPIKAPとの共免疫沈殿 、架橋及び勾配又はクロマトグラフィークラムを有する共精製である。これらの アッセイに関し、使用するPIKAP成分は全長PIKAP又はトランケーションペプチド であってよい。単離できたら、かかる細胞内タンパク質が同定でき、そして標準 技術に従い、それと相互作用するタンパク質を同定するのに用いることができう る。PIKAPと相互作用する細胞内タンパク質のアミノ酸配列は当業者公知の 技術、例えばエドーマン分離技術を介して確認できうる。（例えば、Creighton ，1983「Proteins：Structures and Molecular Principles」W.H．Freeman & Co .，N.Y．pp.34-49を参照のこと）。得られるアミノ酸配列はかかる細胞内タンパ ク質をコードする遺伝子配列についてスクリーニングするために利用できうるオ リゴヌクレオチド混合物の作製のための指針として利用できうる。スクリーニン グは例えばハイブリダイゼーション又はPCR技術により成し遂げることができう る。（例えば、Ausubol前掲、及びPCR Protocols：A Guide to Methods and App lications，1990，Innis，M．ら編Academic Press，Inc.，New Yorkを参照のこ と）。 更に、PIKAPと相互作用する細胞内タンパク質をコードする遺伝子の同時同定 をもたらす方法を採用してよい。これらの方法には、例えばラベル化PIKAPタン パク質、又はPIKAPポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質、例えばマ ーカー（例えば酵素、蛍光、ルミネッセンスタンパク質、又は色素）に融合した PIKAPポリペプチドもしくはPIKAPドメイン、又はIg−Fcドメインを用い、gtllラ イブラリーの抗体プロービングの周知の技術に似たようにしたプロービング発現 、ライブラリーが含まれる。 in vivoでタンパク質相互作用を検出する一の方法、二系列ハイブリド方式は 限定ではなく例示のために詳細した。この方式の一のバージョンが発表されてお り（Chienら、1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88：9578-9582）、そしてCl ontech（Palo Alto，CA）より市販されている。特異的なPIKAP及びｐ85構築体に この方法を利用し、PIKAPがｐ85に対して中間SH２ドメインにおいて結合するこ とが示された。以下の構築体を作製し、そして二系列ハイブリドアッセイにおい て試験した。表１は試験した様々なｐ85又はPIKAP構築体についての構築戦略を 示す。表１ プラスミド構築 全長ｐ85：ヒトｐ85αのクレノウ補完Asp 178(bp56)−PstＩ（bp2315）GBT８ベ クターのSmaＩ−PstＩへの挿入。 ｐ85 SH3ドメイン：ヒトｐ85αのクレノウ補完Asp178(Lp56)−XboII(bp390)のG BT８ベクターのSmaＩ−BamHＩへの挿入。 ｐ85 Bcr相同性ドメイン：ヒトｐ85αのクレノウ補完XhoII(bp390)−XboＩ（bp1 055）のGBT８ベクターのクレノウ補完BamHＩ−SalＩへの挿入。 ｐ85 SH2ドメイン及びインターSH２ドメイン：ヒトｐ85αのScaＩ(bp830)−Pst Ｉ（bp2315）のGBT８ベクターのSmaＩ−PstＩへの挿入。 p85 Ｎ末端SH２及びインターSH２ドメイン：ｐ85SH２ドメイン及びインターSH ２ドメイン構築体をRcaＩ（bp1896）及びStuＩ（bp2263）で切り、クレノウで補 完し、そしてこのRcaＩ−StuＩフラグメント抜きで再ライゲーション。 ｐ85 Ｃ末端SH２ドメイン：ヒトｐ85αのクレノウ補完RcaＩ（bp1896）−StuＩ （bp2263）のGBT８ベクターのクレノウ補完BamHＩへの挿入。 ｐ85インターSH２ドメイン：ヒトｐ85αのDpnＩ(bpl343)−クレノウ補完RcaＩ（ bp1896）のGBT８ベクターのSmaＩへの挿入。 PIKAP AA 277−589：２系列ハイブリドスクリーニング由来のオリジナル単離物 ：PIKAP配列のbp989に融合したEcoRＩリンカー（５’GAATTCGGCACGAG３’）〜Xh oＩリンカーに融合したPIKAP配列のCADGHベクターのEcoRＩ−XhoＩへの挿入。 PIKAP AA 277−360：bp989に融合したEcoRＩリンカー（前述)−BamHＩ（bp1232 ）のCADGHベクターのEcoRＩ−BamHＩへの挿入。 PIKAP AA 361−516：BamHＩ（bp1232）−ScaＩ(bp1703)のCADGHベクターのBamH Ｉ−SmaＩへの挿入。 PIKAP AA 517−589：ScaＩ(bp1703)−EcoRＶ(bpｌ974)のCADGHのクレノウ補完Cl aＩへの挿入。 表２は上記の構築体を利用しての２系列ハイブリドアッセイの実施の結果を示 す。中間SH２ドメインの欠失した３つの構築体がPIKAP構築体のいづれにも結合 していないことが明らかである。即ち、sh３ドメインaa 6−117、又はBcr相同性 ドメインaa 118−340、又はＣ末端sh２ドメインのみを含むｐ85構築体はどのPIK AP構築体に対しても結合を示さなかった。対して、全長ｐ85(aa 6−727)等のイ ンターsh２ドメインを含む、又はsh２及びインターsh２ドメイン（aa 263-727） を含む、又はＮ末端sh２及びインターsh２ドメイン(aa 263−620)を含む、又は インターsh２ドメイン(aa435−625)のみを含むｐ85構築体はPIKAPに対してのみ ならず、分子のＣ末端の最後の74個のアミノ酸を示すPIKAP構築に対しても結合 した。 PIKAPがp110と同様にｐ85のインター−SH２領域に結合することは有意義であ る。Klippelら、Mol．Cell．Biol.，14:頁2675-2685(1984)を参照のこと。即ち 、PIKAPはｐ85上のインターsh２ドメインに対してｐ85と結合について競合する ことによりｐ110の触媒活性に対する調節的な機能を有しうる。 細胞増殖のコントロールを助長するPIKAP発現又は活性の復帰又は増大 正常PIKAP遺伝子発現及び／又はPIKAP遺伝子産物活性のレベルの上昇に関し、 PIKAP核酸配列は再狭窄及び癌等の細胞増殖障害の処置のために利用できうる。 細胞増殖障害の原因が欠損PIKAPの場合、処置は例えば遺伝子置換治療の態様で 施すことができる。詳しくは、正常PIKAP遺伝子の１もしくは複数のコピー又は 正常機能を発揮するPIKAP遺伝子産物の産生を指令するPIKAP遺伝子の一部を患者 又は動物対象体内の適当な細胞の中に、ウィルス、例えば限定することなくアデ ノウィルス、アデノ関連ウィルス、レトロウィルス及びヘルペスウィルスと、細 胞の中にDNAを導入するその他の粒子、例えばリポソームとを用い、挿入するこ とができる。 PIKAP遺伝子はほとんどの細胞において発現されるため、遺伝子置換治療技術 はPIKAP遺伝子配列と患者内のこのようなタイプの細胞に導入することができる 。他方、標的とする相同組換は適当な細胞タイプ、例えば骨髄細胞又は好中球及 び／又はその他の白血球内の欠損内性PIKAP遺伝子を修復するのに利用できうる 。 最後に、例えばPIKAPアスケードの下流シグナル生成タンパク質を活性化し、 それ故欠損PIKAPを迂回することにより活性化PIKAPにより変換されるシグナルを 剌激、増強又は改変する上記のアッセイにおいて同定された化合物を免疫系剌激 を達成するために利用できうる。この製剤及び投与方式は化合物の物理化学特性 に依存するであろう。 薬理製剤 PIKAP遺伝子発現もしくはPIKAP活性、又はPIKAPと任意の結合性パートナー、 例えば限定することなくｐ85との相互作用に影響を及ぼすものと決定された化合 物は再狭窄及び癌等の造血幹細胞増殖障害を処置又は緩和するために治療的に有 効な用量で患者に投与してよい。治療的に有効な用量はかかる障害の症状の緩和 をもたらすに足りる量の化合物を意味する。 有効用量 かかる化合物の毒性及び治療効能は細胞培養物又は実験動物における、例えば LD₅₀（集団の50％に対して致死的な用量）及びED₅₀（集団の50％に治療的に有効 な用量）を決定するための標準の薬理手順により決定できる。毒性と治療的効果 との間での用量比は治療指数であり、そしてLD₅₀／ED₅₀比で表わすことができる 。大きい治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を発揮する化合物を使用 してよいが、未感染細胞に対する潜在的な損傷を最低限にし、それ故副作用を少 なくするため、当該化合物が冒された組織の部位を標 的とするデリバリー系を考案するように注意を払うべきでる。 細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデーターはヒトに使用するための 用量域を処方する方法で利用できる。かかる化合物の用量は毒性をほとんど又は 全くもたずにED₅₀を含む循環濃度の範囲内に属するのが好ましい。用量は採用す る剤型及び利用する投与ルートに依存してこの範囲内で変えてよい。本発明の方 法において利用する任意の化合物に関し、治療的に有効な用量はまず細胞培養ア ッセイにより推定できる。用量は細胞培養物における決定に従い、IC₅₀（即ち、 症状の最大阻害の半分を達成せしめる試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度を 達成せしめるよう動物モデルにおいて処方される。かかる情報はヒトにおける有 用用量をより正確に決定するのに利用できる。血漿レベルは例えば高性能液体ク ロマトグラフィーにより測定できうる。 製剤及び用途 本発明に従って利用するための薬理組成物は１又は複数種の生理学的に許容さ れる担体又は賦形剤を利用する慣用の手段で処方できうる。 即ち、これらの化合物並びにその生理学的に許容される塩及び溶媒和物は吸引 もしくは吸入（いづれも口又は鼻を介して）による投与、又は経口、経頬、非経 腸もしくは経直腸投与のために処方されうる。 経口投与のため、薬理組成物は例えば慣用の手段により、薬理学的に許容され る賦形剤、例えば結合剤（例えばα化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリ ドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えばラクトース、 微結晶セルロース又はリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えばステアリン酸マ グネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えばポテトデンプン又はグリコー ル酸ナトリウムデンプン）；又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）を用 い、錠剤又はカプセルの剤型にすることができうる。これらの錠剤は当業界公知 の方法によりコーティングされうる。経口投与のための液体製剤は例えば溶液、 シロップもしくは懸濁物の剤型をとるか、又は使用前に水もしくはその他の適当 なビヒクルによる構築のための乾燥製品として提供されうる。かかる液体製剤は 慣用の手段により、薬理学的に許容される添加剤、例えば懸濁剤（例えば、ソル ビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素化食用脂肪）；乳化剤（例えばレ チチンまたアカシア）；非水性ビヒクル（例えばアーモンド油、油状エステル、 エチルアルコール又は精留植物油）；及び保存剤（例えばメチル又はプロピル− ｐ−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）で調製されうる。これらの調製品 は更に緩衝塩、風味料、着色料及び甘味料を適宜含んでよい。 経口投与のための製剤は活性化合物のコントロールされた放出を供するように 適当に処方されていてよい。 経頬投与のため、当該組成物は慣用の手法で処方された錠剤又はロゼンジであ ってよい。 吸引による投与のため、本発明に従って利用するための化合物は加圧パック又 はニュブライザーからエアゾールスプレー供与剤型で好適に送達され、この場合 適当な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、 ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又はその他の適当なガスを利用する 。加圧式エアロゾールの場合、用量単位は計量を送達するバルブを設けることに よって決定されうる。吸引器又は吸入器において利用するためのゼラチンの如き カプセル及びカートリッジは当該化合物と適当な粉末ベース、例えばラクトース 又はデンプンとの粉末混合物を含むように処方されうる。 当該化合物は注射、例えばボーラス注射又は連続点滴による非経腸投与のため に処方されうる。注射用の製剤は単位投与形態、例えばアンプル又はマルチ投与 容器において、保存剤の添加された状態で提供されうる。この組成物は油性及び 水性ビヒクル中の懸濁物、溶液又はエマルションの如き剤型をとってよく、そし て製剤化剤、例えば懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤を含みうる。他方、この 活性成分は使用前に適当なビヒクル、例えば無菌パイロジェンフリー水により構 築するための粉末形態をとってよい。 当該化合物は直腸組成物、例えば座薬又は停留浣腸において処方されてもよく 、慣用の座薬ベース、例えばココアバター又はその他のグリセリドを含む。 上記の製剤に加えて、当該化合物は貯蔵調製品としても処方されうる。かかる 長期作用性製剤は移植により（例えば皮下的又は筋肉内的に）、又は筋肉内注射 により投与されうる。即ち、例えば当該化合物は適当なポリマーもしくは疎水性 材料（例えば許容される油中のエマルションとして）、又はイオン交換樹脂と共 に処方されうるか、又は溶解性の乏しい誘導体として、例えば溶解性の乏しい塩 として処方されうる。 当該組成物は、所望するなら、活性成分を含む１又は複数の単位投与形態を含 みうるパック又は分注器において提供されうる。このパックは例えば金属又はプ ラスチックホイルを含んで成ってよく、例えばブリスターパックである。このパ ック又は分注器には投与の説明書が入っていてよい。 クローンの寄託 以下の微生物又はクローンは表示の日付においてアメリカン・タイプ・カルチ ャー・コレクション（ATCC）、Rockville，Marylandに寄託され、そして表示の 受託番号が付してある。クローン 受託番号 寄託日 PIKAP 98189 1996年９月30日

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 16/18 16/18 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/64 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. ホスファチジルイノシトール−３’キナーゼ関連タンパク質をコードする ヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。 2. Ｃ末端側のアミノ酸を介してPI3Kの調節サブユニット上の中間SH２ドメイ ンに結合し、且つ ａ）図２に示すアミノ酸配列をコードする；又は ｂ）受託番号98189でATCCに寄託されたcDNAクローン内に含まれるcDNAにより コードされるアミノ酸配列をコードする；又は ｃ）（ａ）のヌクレオチド配列又はその相補体にストリンジェンシー条件下で ハイブリダイズする； ホスファチジルイノシトール−３’キナーゼ関連タンパク質をコードする請求 項１記載の単離された核酸分子。 3. 異種ポリペプチドをコードする第二ヌクレオチド配列に融合した請求項１ 記載のヌクレオチド配列を含んで成るキメラタンパク質をコードする単離された ヌクレオチド配列。 4. 請求項１記載のヌクレオチド配列を含むヌクレオチドベクター。 5. 宿主細胞内での前記ヌクレオチド配列の発現をコントロールするヌクレオ チド調節配列に作動可能式に一体化した請求項１記載のヌクレオチド配列を含む 発現ベクター。 6. 請求項１記載のヌクレオチド配列を含むように遺伝子操作された宿主細胞 。 7. 宿主細胞内であって、その中での前記ヌクレオチド配列の発現をコントロ ールするヌクレオチド調節配列に作動可能式に一体化した請求項１記載のヌクレ オチド配列を含むように遺伝子操作された宿主細胞。 8. 単離されたホスファチジルイノシトール−３’キナーゼ関連タンパク質で あって、そのＣ末端側のアミノ酸を介してホスファチジルイノシトール−３’キ ナーゼの調節サブユニット上の中間SH２ドメインに結合するタンパク質。 9. ブロモドメインを更に含んで成る、請求項８記載の単離されたホスファチ ジルイノシトール−３’キナーゼ関連タンパク質。 10．図２に示すアミノ酸配列又は図１に示すcDNAによりコードされるアミノ酸 配列を含んで成る請求項９記載の単離されたホスファチジルイノシトール−３’ キナーゼ関連タンパク質。 11．異種ポリペプチドに融合した請求項10記載のホスファチジルイノシトール −３’キナーゼ関連タンパク質を含んで成るキメラタンパク質。 12．前記異種タンパク質がGluタグ又はmycエピトープタグである、請求項11記 載のキメラタンパク質。 13．請求項８記載のホスファチジルイノシトール−３’キナーゼ関連タンパク 質に免疫特異的に結合する抗体。 14．哺乳動物の病気を診断する方法であって、前記哺乳動物のゲノム内に含ま れているホスファチジルイノシトール−３’キナーゼ関連タンパク質の遺伝子突 然変異の検出を含んで成る方法。 15．細胞増殖障害の処置のために有用な化合物をスクリーニングするための方 法であって： 溶液中で化合物、活性化PI3K、ホスファチジルイノシトール−３’キナーゼ関 連タンパク質、ATP及び脂質を混合する、そして 前記化合物の存在下又は非存在下でのATPから脂質へのリン酸の転移をアッセ イする、 工程を含んで成る方法。 16．前記脂質がPtdIns(4,5)P₂を含む、請求項15記載の方法。 17．哺乳動物の細胞増殖障害を処置するための方法であって、PI3Kの活性化を その調節サブユニットｐ85のホスファチジルイノシトール−３’キナーゼ関連タ ンパク質との結合を介して阻害するのに十分な量の化合物を前記哺乳動物に投与 することを含んで成る方法。 18．前記細胞増殖障害が再狭窄及び癌により成る群から選ばれる請求項17記載 の方法。 19．前記化合物がｐ85調節サブユニットとホスファチジルイノシトール−３’ キナーゼ関連タンパク質とのｐ85の中間共通相同性ドメインでの相互作用を破綻 せしめるものである、請求項18記載の方法。 20．哺乳動物の細胞増殖障害を処置するための方法であって、in vivoでのホ スファチジルイノシトール−３’キナーゼ関連タンパク質の発現を阻害するのに 十分な量の化合物を前記哺乳動物に投与することを含んで成る方法。 21．前記細胞増殖障害が再狭窄及び癌より成る群から選ばれる、請求項20記載 の方法。 22．哺乳動物の細胞増殖障害を処置するための方法であって、哺乳動物内での 機能性ホスファチジルイノシトール−３’キナーゼ関連タンパク質の発現を上昇 調節するのに十分な量の化合物を前記哺乳動物に投与することを含んで成る方法 。