JP2000506523A - 血管形成の阻害剤として有用なトロポニンのサブユニットおよびフラグメント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、トロポニンサブユニットおよびそのペプチドフラグメントを用いて異所性の血管形成を阻害する方法に関する。更に、本発明は、トロポニンサブユニットまたはそのフラグメントを含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物および方法は、固形腫瘍、特に中枢神経系および目の腫瘍の治療に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 血管形成の阻害剤として有用なトロポニンのサブユニットおよびフラグメント １．序論 本発明は、異常な血管形成を伴う疾患または障害の治療のための新規の医薬組 成物、およびその使用方法を提供する。 より詳しくは、本発明は、トロポニンサブユニットＣ、ＩおよびＴが、刺激さ れた内皮細胞の増殖を阻害するという発見に部分的に基づく。治療的有効量のト ロポニンのＣ、ＩもしくはＴというサブユニット、フラグメントまたは類似体を 含有する医薬組成物、ならびにそれを治療に用いる方法を提供する。 ２．背景 血管形成、すなわち新たな血管の発生および形成の過程は、正常および病理学 的の双方の無数の生理学的事象において重要な役割を果たしている。血管形成は 、特異的なシグナルに応答して発生し、複雑な過程を伴うが、該過程は、血管形 成性の成長シグナルに応答しての、血管内皮細胞による基底板への浸潤、シグナ ルソースの方への内皮細胞の移動、その後の毛細血管の管の増殖および形成を特 徴とする。新たに形成された毛細血管を通じての血流は、内皮細胞が既存の毛細 血管と接触し、接続した後に開始される。 内因性の血管形成の刺激と阻害剤との間の自然に生じる均衡は、阻害性が優位 に影響するものである[Rastinejadら、1989,Cell 56:345-355]。正常な生理学的 条件下で新生血管形成が生じるような稀な場合、例えば創傷治癒、器官再生、胚 発生、および雌性生殖過程の際は、血管形成は、厳格に調節され、空間的かつ時 間的に範囲が定められている。固形腫瘍の増殖を特徴付けるそれのような病理学 的血管形成の条件下では、これらの調節的な制御が不全となる。 調節されない血管形成は、病的となり、多くの腫瘍性および非腫瘍性疾患の進 行を下支えする。多くの重大な疾患が、固形腫瘍の増殖や転移、関節炎、ある種 の眼科障害、および乾癬を包含する異常な新生血管形成に支配される。例えば、 Mosesら,1991,Biotech.9.:630-634；Folkmanら,1995,N.Engl.J.Med. 333 :1757-1763；Auerbachら,1985,J.Microvasc.Res.29:401-411；Folkman,1985, Advances in Cancer Research,KleinおよびWeinhouse編纂,Academic Press,New York,pp.175-203；Patz,1982,Am.J.Opthalmol.94:715-743；およびFolkmanら,19 83,Science 221:719-725による総説を参照されたい。多くの病理学的条件では、 血管形成の過程が病的状態に寄与する。例えば、固形腫瘍の増殖が血管形成に依 存することを示唆する、有意なデータが蓄積されている[FolkmanおよびKlagsbru n,1987,Science 235:442-447]。 角膜、水晶体および柱状網目構造の無血管性の維持は、視覚はもとより、目の 生理学にも決定的に重要である。その多くが失明へと導くいくつかの眼病がある が、そこでは、病んだ状態に応答して、目の新生血管形成が発生する。これらの 眼科障害は、糖尿病性網膜症、新生血管形成緑内障、炎症性疾患、および目の腫 瘍（例えば網膜芽腫）を包含する。やはり新生血管形成が関わる眼病が他にもい くらか存在し、それらは、水晶体後線維素形成症、葡萄膜炎、早発性の網膜症、 斑紋様変性や、脈絡膜の新生血管形成を伴う約２０の眼病と、虹彩の新生血管形 成を伴う約４０の眼病とを包含する。例えば、Waltmanら,1978,Am.J.Ophthal.85 :704-710、およびGartnerら,1978,Surv.Ophthal.22:291-312による総説を参照さ れたい。現在、これらの疾患の治療は、特に新生血管形成が生じてしまってから は不十分であり、しばしば、失明に至る。研究から、正常な目の組織（角膜およ びガラス体）中に存在する血管阻害因子が、疾患状態では喪失することが示唆さ れる。 血管形成の阻害因子は、その根底にある疾患状態の病理学的進行への上記過程 の寄与を限定することばかりでなく、それらの病因論の研究の貴重な手段を提供 することにも、重要な治療上の役割を有し得ると思われる。例えば、腫瘍の新生 血管形成を阻害する薬剤は、転移性腫瘍の増殖を阻害するのに重要な役割を果た し得ると思われる。 血管内皮細胞の増殖、移動および侵入に関連する血管形成の成分は、部分的に ポリペプチド成長因子によって調節されることが見出されている。培養での実験 は、適切な成長因子を含有する培地に曝された内皮細胞が、血管形成性応答のい くらかまたはすべてを喚起するよう誘導できることを示す。in vitroでの内皮増 殖促進活性を有する、いくつかのポリペプチドが同定されている。その例として は、酸性または塩基性繊維芽細胞成長因子、形質転換成長因子αおよびβ、血小 板由来内皮細胞成長因子、顆粒球コロニー刺激因子、インターロイキン−８、肝 細胞成長因子、プロリフェリン、血管内皮成長因子、ならびに胎盤性成長因子が 挙げられる。例えば、Folkmanら,1995,N.Engl.J.Med.,333:1757-1763による総説 を参照されたい。 いくつかの異なる組織のソースからの抽出物は、抗血管形成活性を含むことが 示されているものの、血小板第４因子、トロンボスポンジン、プロタミンおよび 形質転換成長因子βのようないくつかの分子は、血管形成の異なる様相、例えば 細胞増殖または細胞移動にネガティブに調節することが見出され、血管形成を阻 害できる組織由来の巨大分子で、従来の技術で特定されたものは１つもない。例 えば、Folkmanら,1995,N.Engl.J.Med.,333:1757-1763およびD'Amore,1985,Prog. Clin.Biol.Res.221:269-283による総説を参照されたい。したがって、血管新生 の持続的な脱調節された拡散を妨げることができ、新生血管形成が傑出した役割 を果たすような疾患に対する治療法として、広範囲の適用性を有し得ると思われ る化学的薬剤を更に同定かつ特性記述することに対する多大なニーズが存在する 。 毛細血管の内皮細胞（「ＥＣ」）は、新生血管形成の際の血管形成性刺激に応答 して増殖する[AusprunkおよびFolkman,1977,J.Microvasc.Res.14:153-65]。公知 の血管形成刺激因子、例えば酸性または塩基性繊維芽細胞成長因子（それぞれ、 ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）に応答しての内皮細胞増殖を評価する、in vitroでの アッセイが、in vitroでの新生血管形成の過程を模倣するために開発されている 。この種のアッセイは、様々な血管形成因子による毛細血管ＥＣ増殖の刺激を立 証するために選択されたアッセイである[Shingら,1984,Science223:1296-1298] 。 細胞外基質を経由して血管形成性剌激へと向かう毛細血管ＥＣの移動の過程も 、血管形成に必要とされる死活的事象である。例えば、Ausprunkら,1977,J.Micr ovasc.Res14:53-65による総説を参照されたい。この過程により、新生血管形成 の過程をinvitroで模倣するための追加的アッセイが提供される。ボイデ ンチェンバー技術の改変が、ＥＣの移動を追跡するために開発されている[Boyde nら,1962,J.Exptl.Med 115:453-456、実施例４]。現在まで、数種類の組織由来E Ｃ細胞移動阻害剤のみが、公知であるにすぎない。例えば、Langerら,1976,Scie nce 193:70-72による総説を参照されたい。 1970年代初期には、数多くのinvivoの血管形成モデルのバイオアッセイが広く 用いられた。これらのモデル系は、ウサギ角膜ポケット、ニワトリ漿尿膜(「ＣＡ Ｍ」)、ラット背側肺胞嚢、およびウサギエアチェンバーのバイオアッセイを包含 した。総説については、Bloodら,1990,mBiochem.et Biophys.Acta 1032:89-118 を参照されたい。血管形成の刺激剤や阻害剤のような巨大分子を放出できる制御 放出重合体の開発は、これらのアッセイの利用にとって死活的であった[Langer ら,1976,Nature 263:797-800]。 ＣＡＭバイオアッセイでは、受精したニワトリ胚を、ペトリ皿で培養する。発 生の６日目に、試験サンプル、または適切な対照物質を浸した放出重合体、例え ばメチルセルロース等の円板を、血管の膜のその前進する辺縁に載せる。発生の ８日目に、移植片の周囲の部域を観察かつ査定する。試験移植片の周囲の無血管 帯は、胚の新生血管形成の阻害剤の存在を示す[Mosesら,1990,Science,248:1408 -1410およびTaylorら,1982,Nature,297:307-312]。ＣＡＭアッセイで単独に試験 された前記の血管形成阻害剤についての報告された用量は、プロタミン５０μg[ Taylorら(1982)]、ウシガラス体抽出物２００μg[Luttyら,1983,Invest.Opthalm ol.Vis.Sci.24:53-56]、および血小板第４因子１０μg［Taylorら(1982)］であ った。組合せとして有効な血管形成阻害剤の報告された最低用量は、Folkmanら, 1989,Science 243:1490が報告した、ヘパリン（５０μg）とヒドロコルチゾン( ６０μg)、およびＢ−シクロデキストリンテトラデカサルフェート（１４μg） とヒドロコルチゾン（６０μg）を包含する。 ウサギ角膜ポケットのアッセイによれば、エチレン酢酸ビニル共重合体（「Ｅ ＶＡＣ」）の重合体ペレットを試験物質に浸漬し、縁から約１mmのウサギ角膜の ポケットに外科的に移植する［Langerら,1976,Science 193:707-72]。血管形成 阻害剤について試験するには、癌腫、または他の何らかの血管形成刺激剤のいず れかの１片を、重合体に対して縁から２ｍｍ遠位に移植する。それぞれのウサ ギの反対側の目には、無内容である対照重合体ペレットを、血管形成刺激剤の次 に同じ方法で移植する。これらの対照角膜では、５〜６日で、毛細血管が、腫瘍 移植片に向かって、空の重合体を実質的に跨いで成長を開始する。試験角膜では 、縁の血管から腫瘍への新たな毛細血管の指向性成長は、低下した速度で生じ、 阻害されて重合体の周囲に無血管部域が観察されることも多い。このアッセイは 、最大血管長を立体特異性顕微鏡で測定することによって定量化される。 トロポニン、すなわち３ペプチドの複合体は、脊椎動物の筋のアクチンフィラ メントに密接に付随する補助タンパク質である。トロポニン複合体は、トロポミ オシンの筋形態とともに作用して、ミオシンＡＴＰアーゼ活性のＣａ²⁺依存性を 仲介し、それによって筋収縮を調節する。トロポニンのポリペプチドＴ、Ｉおよ びＣは、それぞれ、そのトロポニン結合、阻害およびカルシウム結合の活性に対 して名付けられている。トロポニンＴは、トロポミオシンと結合し、筋の細いフ ィラメント上のトロポニン複合体の位置づけを担当すると考えられている。トロ ポニンＩは、アクチンと結合し、トロポニンＩおよびＴが形成する複合体と、ト ロポミオシンとは、アクチンとミオシンとの相互作用を阻害する。トロポニンＣ は、最高４個のカルシウム分子と結合することができる。研究からは、筋内のカ ルシウムのレベルが上昇したとき、トロポニンＣは、トロポニンＩにアクチン分 子上でのその固着を緩めさせて、トロポミオシン分子の変位を生じさせ、それに よってアクチン上のミオシンの結合部位を露出させ、ミオシンのＡＴＰアーゼ活 性を刺激する。本発明の発見以前は、トロポニンサブユニットは、内皮細胞増殖 の過程を阻害するとは知られていなかった。 本明細書中の参考文献の援用は、そのような参考文献が本発明に対する先行技 術であるとの承認として解されてはならない。 ３．発明の要旨 本発明は、トロポニンサブユニットＣ、ＩもしくはＴ、またはそれらのフラグ メントを、内皮細胞増殖を阻害できる治療的有効量で含有する医薬組成物に関す る。本発明はまた、トロポニンサブユニットＣ、ＩまたはＴの類似体、およびそ れらのフラグメントの類似体を、内皮細胞増殖を阻害できる治療的有効量で含有 する医薬組成物に関する。本発明は、更に、本発明の治療化合物の投与による、 新生血管形成障害の治療に関する。そのような治療化合物（本明細書では「治療 剤」と称する）は：トロポニンサブユニットＣ、ＩおよびＴ、ならびにそれらの フラグメントおよび類似体を包含する。一つの実施態様では、癌性症状を治療す るため、または前腫瘍性もしくは前悪性の状態から腫瘍性または悪性の状態への 進行を予防するために、本発明の治療剤を投与する。他の特定の実施態様では、 新生血管形成に付随する目の障害を治療するために、本発明の治療剤を投与する 。 ３．１．定義 本明細書に用いられる限りで： 用語「トロポニンサブユニット」は、用語Ｃ、ＩまたはＴに先行しないときは 、トロポニンサブユニットＣ、ＩまたはＴのいずれかを総称的に意味する。 ４．図面の簡単な説明 図１．トロポニンＣによるウシ毛細血管内皮細胞（ＢＣＥ）の増殖の阻害。ｂ ＦＧＦ刺激ＢＣＥ増殖の阻害の％を、トロポニンＣの濃度（nM）の関数として示 す。阻害の％は、刺激のみで処理した細胞について得られた結果を、刺激と阻害 剤との双方に曝したサンプルについて得られたものと比較することによって決定 した。ウェルの容積は、２００μlであった。 図２．トロポニンＩによる毛細血管ＢＣＥ増殖の阻害。ｂＦＧＦ剌激ＢＣＥ増 殖の阻害の％を、トロポニンＩの濃度（nM）の関数として示す。阻害の％は、図 １に記載したとおりに決定した。ウェル容積は２００μlであった。 図３．トロポニンＴによる毛細血管ＢＣＥ増殖の阻害。ｂＦＧＦ刺激ＢＣＥ増 殖の阻害の％を、トロポニンＴの濃度（nM）の関数として示す。阻害の％は、図 １に記載したとおりに決定した。ウェル容積は２００μlであった。 図４．トロポニンＣおよびＩによるＢＣＥ増殖の阻害。ｂＦＧＦ刺激ＢＣＥ増 殖の阻害の％を、トロポニンＩおよびＣの濃度（nM）の関数として示す。阻害の ％は、図１に記載したとおりに決定した。ウェル容積は２００μlであった。 図５．トロポニンＣ、ＩおよびＴによる毛細血管ＢＣＥ増殖の阻害。ｂＦＧＦ 刺激ＢＣＥ増殖の阻害の％を、トロポニンＣ、ＩおよびＴの濃度（nM）の関数と して示す。阻害の％は、図１に記載したとおりに決定した。ウェル容積は２００ μlであった。 図６．ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍成長の阻害。 ５．発明の詳細な説明 本発明は、トロポニンサブユニットに基づく治療の方法および組成物に関する 。本発明は、本発明の治療化合物の投与による新生血管形成性障害の治療を提供 する。 そのような治療化合物（本明細書では「治療剤」と呼ぶ）は：トロポニンのＣ、 ＩおよびＴサブユニット、それらのフラグメントおよび類似体（集合的には「本 発明のペプチド」）を包含する。本発明のペプチドは、培養中のウシ内皮細胞増 殖を１０μＭ以下のＩＣ₅₀で阻害する特性を特徴とする。好適な実施態様では、 癌性症状を治療するため、あるいは前腫瘍性もしくは非悪性の状態から腫瘍性も しくは悪性の状態への進行を予防するために、本発明の治療剤を投与する。他の 特定の実施態様では、新生血管形成に付随する目の障害を治療するために、本発 明の治療剤を投与する。 好適な実施態様では、本発明の治療剤は、内皮細胞の増殖を阻害するのに効果 的である、トロポニンＣ、トロポニンＩ、トロポニンＴ、またはトロポニンＣお よびＩの少なくともフラグメントよりなるペプチドである。 本発明に従って利用できるトロポニンサブユニットの例は、ヒトの速単収縮骨 格筋(fast tvvitch skeletal muscle）からのトロポニンのサブユニットを包含 し、その配列を下記に示す： ヒトの速単収縮骨格筋トロポニンＣ（配列番号１） ヒトの速単収縮骨格筋トロポニンＩ（配列番号２） ヒトの速単収縮骨格筋βトロボニンＴ（配列番号３） 別の実施態様では、本発明は、ヒト速単収縮骨格筋トロポニンＣ（配列番号１ ）またはそのフラグメントと相同であるペプチドを包含する。一つの実施態様で は、該ペプチドのアミノ酸配列は、それが由来するヒト速単収縮骨格筋トロポニ ンＣのフラグメント（「原型フラグメント」）と比較して、少なくとも８０％の同 一性を有する。別の実施態様では、この同一性は、８５％を上回る。より好適な 実施態様では、この同一性は９０％を上回る。最も好適な実施態様では、該ペプ チドのアミノ酸配列は、原型フラグメントと少なくとも９５％の同一性を有する 。フラグメントは、少なくとも１０個のアミノ酸であり得、好適な実施態様では 、それぞれ、少なくとも５０、７５、１００および１２０個のアミノ酸であり得 る。 別の実施態様では、本発明は、ヒトの速単収縮骨格筋トロポニンＩ（配列番号 ２）またはそのフラグメントと相同であるペプチドを包含する。一つの実施態様 では、該ペプチドのアミノ酸配列は、原型のヒト速単収縮骨格筋トロポニンＩフ ラグメントと少なくとも８０％の同一性を有する。別の実施態様では、この同一 性は８５％を上回る。より好適な実施態様では、この同一性は、９０％を上回る 。 最も好適な実施態様では、該ペプチドのアミノ酸配列は、原型フラグメントと少 なくとも９５％の同一性を有する。フラグメントは、少なくとも１０個のアミノ 酸であり得、好適な実施態様では、それぞれの長さが、少なくとも５０、７５、 １００、および１２０個のアミノ酸であり得る。 別の実施態様では、本発明ば、ヒトの速単収縮骨格筋トロポニンＴ（配列番号 ３）またはそのフラグメントと相同であるペプチドを包含する。一つの実施態様 では、該ペプチドのアミノ酸配列は、原型のヒト速単収縮骨格筋βトロポニンＴ との少なくとも８０％の同一性を有する。別の実施態様では、この同一性は８５ ％を上回る。より好適な実施態様では、この同一性は９０％を上回る。最も好適 な実施態様では、該ペプチドのアミノ酸配列は、原型フラグメントと少なくとも ９５％の同一性を有する。フラグメントは、少なくとも１０個のアミノ酸であり 得、好適な実施態様では、それぞれの長さが少なくとも５０、７５、１００、１ ２０、および２００個のアミノ酸であり得る。 別の特定の実施態様では、本発明のペプチドは、他の哺乳動物種、例えばヒト 、ウサギ、ラット、マウス、ウシ、ヒツジおよびブタからの速単収縮、緩縮およ び心筋イソ型のトロポニンＣ、トロポニンＩおよびトロポニンＴサブユニットで ある。 特定の実施態様では、本発明の治療剤は、血管形成をネガティブに調節し、血 小板第４因子、トロンボスポンジン−１、金属プロテアーゼの組織阻害剤(ＴＩ ＭＰ１およびＴＩＭＰ２)、プロラクチン(１６-Ｋｄフラグメント)、アンギオス タチン(プラスミノーゲンの３８-Ｋｄフラグメント)、ｂｆＧｆ可溶性受容体、 形質転換成長因子β、インターフェロンαおよび胎盤プロリフェリン関連タンパ ク質であってよいが、それらに限定されない、治療的有効量のもう１種類の分子 と組合される。 逆説的には、新生血管形成は、血管の圧縮と中心部の壊死とを生じる腫瘍内部 の間隙圧力の上昇のために、化学療法薬物に対する腫瘍の接近可能性を次第に低 下させる。invivoの結果によれば、血管形成療法を受ける齧歯動物は、腫瘍への 化学療法の増大した送達を示すことが立証されている[Teicherら,1994,Int.J.Ca ncer57:920-925]。したがって、一つの実施態様では、本発明は、化学療法剤 と組み合わせた本発明の医薬組成物を提供する。 別の好適な態様では、本発明の治療剤を化学療法剤、または放射性同位元素の 暴露と組み合せる。 本発明を以下の実施例を用いて記載するが、とりわけ、トロポニンサブユニッ トＣ、ＩおよびＴによる毛細血管内皮細胞の増殖の阻害と、トロポニンサブユニ ットによる毛細血管内皮細胞の移動の阻害、およびin vivoでの新生血管形成の 阻害を決定する手段とを開示する。 開示を明確にするために、以下に限定されることなく、本発明の詳細な説明を 以下の副節に分割する。 ５．１．トロポニンサブユニット、フラグメントおよび類似体 本発明は、トロポニンサブユニット、それらのフラグメントおよび類似体を含 む医薬組成物を提供する。特定の態様では、該サブユニッドフラグメントまたは 類似体は、ハエ、カエル、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、イヌ、サルま たはヒトのトロポニンサブユニットのものである。 トロポニンサブユニットフラグメントは、機能的に等価の分子を与える置換、 付加または削除によりトロポニンの配列を変えることによって作成できることが 構想される。これらは、機能的の等価のアミノ酸残基が配列内の残基と置き換え られてサイレントな変化を生じている、変更された配列を含むトロポニンサブユ ニットのアミノ酸配列の全部または一部を一次アミノ酸配列として含むトロポニ ンサブユニット、フラグメントまたは類似体を包含するが、それらに限定されな い。例えば、配列内の一つ以上のアミノ酸残基を、機能的等価体として作用する 類似の極性を有するもう一つのアミノ酸と置換し、サイレントな変化を生じるこ とができる。配列内のアミノ酸についての置換体は、そのアミノ酸が属する分類 群の他の成員から選んでよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン 、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトフ ァンおよびメチオニンを包含する。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、ト レオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを包含する。 正に帯電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシンおよびヒスチジンを包 含する。負に帯電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸 を包含する。 本発明の一つの実施態様は、内皮細胞の増殖を阻害できるトロポニンサブユニ ットの少なくとも１０個の（連続する）アミノ酸のフラグメントよりなるか、ま たはそれを含む分子を提供する。別の実施態様では、この分子は、トロポニンサ ブユニットの少なくとも２０または５０個のアミノ酸よりなる。特定の実施態様 では、そのような分子は、少なくとも７５、１２０または２００個のアミノ酸の トロポニンサブユニットのフラグメントよりなるか、またはそれを含む。 好適な実施態様では、該タンパク質は、哺乳動物のトロポニンサブユニットで ある。代替的な実施態様では、それは哺乳動物のトロポニンＣ、ＩまたはＴサブ ユニットである。 本発明のトロポニンサブユニットのフラグメントおよび類似体は、組織から誘 導できるか(例えば、実施例１；Ebashiら,1968,J.Biochem.64:465；Yasuiら,196 8,J.Biol.Chem.243:735；Hartshorneら,1968,Biochem.Biophys.Res.Commun.31:6 47；Shaubら,1969,Biochem.J.115:993；Greaserら,1971,J.Biol.Chem.246:4226- 4733；Brekkeら,1976,J.Biol.Chem.251:866-871；およびYatesら,1983,J.BioLCh em.258:5770-5774を参照されたい)、または当該分野において公知の様々な方法 によって製造できる。それらの製造を生じる操作は、遺伝子またはタンパク質レ ベルで生じることができる。例えば、トロポニンサブユニットＣ、ＩまたはＴを コードするクローニングされたトロポニン遺伝子配列を、当該分野に公知の多数 の方法のいずれかによって変えることができる[Sambrookら,1990,Molecular Clo ning,ALaboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Sprin g Harbor,New York]。該配列は、in vitroで、制限エンドヌクレアーゼ、次いで 、所望ならば、更に酵素による修飾によって適切な部位で切断し、単離し、結合 することができる。トロポニンサブユニットの誘導体または類似体をコードする 遺伝子の生産の際は、修飾された遺伝子が、望みのトロポニン活性がコードされ る遺伝子領域内で、翻訳停止シグナルで遮断されずに、トロポニンサブユニット 遺伝子と同じ翻訳読み枠内に留まるのを確実にするよう注意を払わなければなら ない。 加えて、核酸配列をコードするトロポニンサブユニットは、in vitroまたはin vivoで突然変異させて、翻訳、開始および／もしくは終止配列を生成ならびに／ または破壊するか、あるいはコード化領域での変異を生成し、ならびに／または 新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を形成または既存のものを破壊して、in vit roでのそれ以上の修飾を容易にすることができる。当該分野に公知の突然変異誘 発のための、in vitroでの部位指向性突然変異誘発(Hutchinsonら,1978,J.Biol. Chem.253:6551)、ＴＡＢ（登録商標）リンカー（Pharmacia）の使用等々を包含 するが、それらに限定されない、いかなる手法を用いることもできる。 トロポニンサブユニットＣ、ＩまたはＴの配列の操作は、タンパク質レベルで 実施してもよい。本発明の範囲内に包含されるのは、例えば、アセチル化、リン 酸化、カルボキシル化、アミド化、公知の保護基／遮断基による誘導体化、タン パク質分解性切断、抗体分子またはその他の細胞性リガンドとの結合等々によっ て、翻訳の際、またはその後に差別的に修飾されたトロポニンサブユニットのフ ラグメントまたは他のフラグメントもしくは類似体である。臭化シアン、トリプ シン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ₄、アセチル化 、ホルミル化、酸化、還元等による特異的化学的切断を包含するが、これらに限 定されない公知の手法によって、多数の化学的修飾のいずれを実施してもよい。 加えて、トロポニンサブユニットのフラグメントおよび類似体は、化学的に合 成することができる。例えば、トロポニンサブユニットの、望みのドメインを含 むか、または望みの活性をin vitroで仲介する部分に相当するペプチドを、ペプ チド合成装置を用いることによって合成することができる。更に、所望であれば 、正統でないアミノ酸、または化学的アミノ酸類似体を、置換または付加として トロポニンサブユニット配列に導入することができる。正統でないアミノ酸は、 一般的なアミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、ヒドロ キシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、 ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニ ンや、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸およびＮα−メチルアミノ酸 のようなデザイナーアミノ酸を包含するが、これらに限定されない。 特定の実施態様では、本発明は、そのアミノまたはカルボキシ末端で異なるタ ンパク質のアミノ酸配列にペプチド結合を介して結合された、（内皮細胞の増殖 を阻害する原因となるトロポニンサブユニットの少なくともドメインまたはモチ ーフよりなる）トロポニンサブユニットもしくはそのフラグメントを含むキメラ または融合タンパク質を包含する。そのようなキメラ生成物は、望みのアミノ酸 配列をコードする適切な核酸配列を、当該分野に公知の方法を用いて、適正なコ ーディングフレーム内で互いに結合し、当該分野に一般的に公知である方法を用 いて該キメラ生成物を発現することによって、製造することができる。これに代 えて、そのようなキメラ生成物を、タンパク質合成手法、例えばペプチド合成装 置の利用によって製造してもよい。 ５．２．トロポニンタンパク質、フラグメント及び類似体の検定 トロポニンのサブユニット、フラグメント及び類似体の機能的活性及び／また は治療に有効な用量は、種々の方法でin vitroで検定できる。これらの方法は血 管形成に関与する生理的プロセスを基礎とし、これらの方法が本発明の範囲内に あれば、これら方法は、血管形成を阻害するトロポニンのサブユニット、フラグ メント及び類似体の範囲を定め、及び／またはこの医薬組成物の治療に有効な用 量を決定する方法を限定するものではない。 例えばin vitroで毛細管内皮細胞（ＥＣ）の増殖を阻害または干渉するトロポ ニンのサブユニット、フラグメント及び類似体の能力を検定する場合には、これ らには限定はされないが核酸への放射性組み込み、比色検定及び細胞計数を含む この分野で周知の各種の生物検定法が使用できる。 内皮細胞増殖の阻害を、細胞の酸ホスファターゼ活性の比色定量または電子的 細胞計数により測定してもよい。これらの方法は、本発明のトロポニンのサブユ ニット、誘導体または類似体による処理後の培養中の内皮細胞の数、及びａＦＧ Ｆのような血管形成刺激因子を決定する迅速で感度のよいスクリーニング法を提 供する。細胞の酸ホスファターゼ活性の比色定量はＣｏｎｎｏｌｌｙ等（１９８ ６、Ｊ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５２：１３６−１４０）により記述され ている。実施例３に記載するこの方法によれば、毛細管内皮細胞はａＦＧＦのよ うな血管形成刺激因子とある濃度範囲の潜在的阻害剤により処理される。これら のサンプルをインキュベーションして増殖を可能とした後に収集し、洗浄し、ホ スファターゼ基質含有バッファー内で溶解し、次に再度インキュベーションする 。塩基性溶液を添加して反応を停止し、４０ ５λで色の発生を測定する。Ｃｏｎｎｏｌｌｙ等によれば、酸ホスファターゼの 活性と１０，０００細胞／サンプルまでの内皮細胞の数との間には直線の関係が 成立する。また酸ホスファターゼ活性の標準曲線は、この酵素レベルが実際のＥ Ｃ数を反映することを確認するために既知の細胞数から作製される。パーセント 阻害は、刺激に曝されたサンプルの細胞数と刺激及び阻害剤に曝されたそれらと を比較して決定される。 内皮細胞の増殖に及ぼすトロポニンのサブユニットＣ、Ｉ及びＴの影響を決め るための比色検定により、三種のトロポニンのサブユニットの何れもがｂＦＧＦ 刺激内皮細胞の増殖を干渉することが示される。 トロポニンＣは、試験した何れの濃度においても用量に依存した形でｂＦＧＦ 刺激内皮細胞の増殖を阻害した(図１)。ウシの内皮細胞増殖（「ＢＣＥ」）のパー セント阻害は、２８０ｎＭ、１．４μｍ、２．８μＭ及び５．６μＭの濃度にお いてそれぞれ５４％、８６％、８３％及び１００％であった。１００％の阻害は ２０μｇ／ウェル（５．６μＭ）の濃度で観測された。ＩＣ₅₀は、ａＦＧＦ増殖 因子‐誘発剌激の５０％阻害が観測された濃度を表す。トロポニンＣのＩＣ₅₀は ２７８ｎＭであると決定された。 トロポニンＩは、１及び５μｇ／ウェルの濃度においてｂＦＧＦ‐刺激ＢＣＥ の増殖を阻害するが、１０μｇ／ウェルでは試験したサンプルに阻害が観測され なかった(図２)。ＢＣＥのパーセント阻害は、２４０ｎＭと１．２μＭの濃度に おいてそれぞれ３３％と４６％であった。トロポニンＩのＩＣ₅₀は１．１４μＭ であると決定された。 トロポニンＴは、１０と２０μｇ／ウエルの濃度においてｂＦＧＦ‐刺激ＥＣ 増殖を阻害するが、１と５μｇ／ウェルの濃度においては阻害しなかった(図３) 。ＢＣＥ増殖は、１．６μＭと３．３μＭにおいてそれぞれ２３％と６２％が阻 害された。トロポニンＴのＩＣ₅₀は２．１４μＭであると決定された。 トロポニンサブユニットＣ及びＩを組み合わせると、試験した何れの濃度にお いてもＥＣを阻害した(図４)。ＢＣＥのパーセント阻害は、１３０ｎＭ、６４５ ｎＭ、１．３μＭ及び２．６μＭにおいてそれぞれ５２％、５４％、７３％及び ４７％であった。この組合せのＩＣ₅₀は１１０ｎＭであると決定された。 トロポニンサブユニットＣ、Ｉ及びＴを組み合わせると、３６０ｎＭの濃度に おい て１６％だけａＦＧＦ‐刺激ＢＣＥの増殖を阻害するのが観察された（５μｇ／ ウェル、図５）。 試験したトロポニンのサンプルは、非内皮細胞型のＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞の 増殖に対する検出可能の阻害効果を持たなかった。 毛細管内皮細胞によって放射性チミジンを組み込むと、潜在的な血管形成阻害 剤による内皮細胞増殖の阻害を検定するための他の手段が示される。この方法に よれば、３Hチミジンストック、例えばｂＦＧＦのような血管形成刺激因子、及 びある濃度範囲の試験対象の血管形成阻害因子の存在下に、予め測定した数の毛 細管内皮細胞が成長する。インキュベーションした後にこの細胞を収集し、チミ ジン組み入れの程度を測定する。実施例２を参照のこと。 血管形成刺激に応答する毛細管内皮細胞の移動のプロセスを干渉するトロポニ ンのサブユニット、フラグメントまたは類似体の濃度を変化させるの能力は、改 良ボイデンチェンバー（Boydenchamber）技術を用いて検定できる。以下の２節 及び実施例４を参照のこと。 トロポニンのサブユニット、フラグメント及び類似体の機能的活性を検定する 他の手段は、最後には毛細管形成を生じる毛細管内皮細胞の特異的な移動を阻害 するこれら化合物の能力を検査することを含む。この能力は例えば、コラーゲン ゲル上にプレーティングした毛細管内皮細胞をこの阻害剤に対抗させ、毛細管様 の管構造が培養した内皮細胞により形成したか否かを決める検定法を用いて評価 できる。 in vivoで血管形成を阻害する能力の検定には、ニワトリの漿尿膜検定（以下 の２節と実施例５を参照のこと）及びラットまたはウサギ角膜ポケット検定が含 まれる。Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ等（１９９１、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９８：４４０−４５０）を参照のこと。角膜ポケット検定によれば、角膜ポケ ットの形状の試験用動物の角膜に選択した腫瘍を移植する。この角膜ポケットに 潜在的な血管形成阻害剤を付与し、新生血管形成のためのルーチン検査を角膜ポ ケットに実施する。以下の２節と実施例６を参照のこと。 本発明の一つの実施態様では、血管形成を阻害するための本発明のトロポニン のサブユニット、フラグメントまたは類似体の組合せを提供する。他の実施態様 では、トロポニンのサブユニット、フラグメントまたは類似体と他の血管形成の 阻害剤との組 合せを提供する。このような血管形成の阻害剤には、アンギオスターテックステ ロイド(angiostatic steroid)、トロンボスポンジン、血小板因子IV、形質転換 増殖因子β、インターフェロン、腫瘍壊死因子α、ウシのガラス様抽出物、プロ タミン、金属プロテイナーゼの組織阻害因子(ＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２)、 プロラクチン(１６−ｋｄフラグメント)、アンギオスタチン(プラスミノーゲン の３８−ｋｄフラグメント)、ｂｆＧｆ可溶レセプター及び胎盤プロリフェリン 関連タンパク質が含まれるが、これらに限定はされない。例えばＦｏｌｋｍａｎ 等による概説（１９９５、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３３：１７５７−１７ ６３）及びＫｌａｇｓｂｒｕｎ等（１９９１、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏ ｌ．５３：２１７−２３９）を参照のこと。 毛細管内皮細胞増殖の阻害、移動及び／または血管内方成長として定義される in vivoでの血管形成の阻害のための治療に有効な用量は、上記本発明の組成物 または他の血管形成の阻害因子との組合せを用いたin vitroの阻害検定から推定 できる。また有効な用量は、送達の方法と手段に左右される。例えば乾せん性ま たは糖尿病性の網膜症の治療における場合の適用法では、阻害剤は局所性の眼へ の担体中において送達される。固形腫瘍の治療の場合のような他の適用法では、 阻害剤は生物分解性で重合体性の移植組織を介して送達される。またこのタンパ ク質は例えば、ポリエチレングリコール処理により改質できる。 ５．３．治療用途 本発明は、本発明の治療用化合物の投与による新生血管形成に関連する疾病ま たは疾患の治療法を提供する。このような治療用化合物（以下は「治療薬剤」と 称す）にはトロポニンのサブユニット、フラグメントまたは類似体（例えば以下 に記述されるようなもの）が含まれる。 ５．３．１．悪性 本発明の治療用化合物により治療できる悪性または転移性の状態には、表１に 列記した固形腫瘍（このような疾患の概説にはＦｉｓｈｍａｎ等（１９８５、Ｍ ｅｄｉｃｉｎｅ、２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ.、Ｐｈｉｌａｄ ｅlｐｈｉａ）を参照のこと）が含まれるが、これらのみに限定はされない。 表１ 悪性疾患及び関連する疾患 固形腫瘍 肉腫及び癌腫 繊維肉腫 粘液肉腫 脂肪肉腫 軟骨肉腫 骨形成性肉腫 脊索腫 血管肉腫 内皮肉腫 リンパ管肉腫 リンパ管内皮肉腫 滑膜腫 中皮腫 ユーイング腫瘍 平滑筋肉腫 横紋筋肉腫 結腸癌 膵臓癌 乳癌 卵巣癌 前立腺癌 扁平細胞癌種 基底細胞癌種 腺癌種 汗腺癌種 脂腺癌種 乳頭癌種 乳頭状腺癌種 嚢胞腺癌種 髄様癌種 気管支原生癌種 腎細胞癌種 肝癌 胆汁腺管癌種 絨毛癌種 精上皮腫 胎生期癌種 ウィルムス腫瘍 頚癌 精巣腫瘍 肺癌種 小細胞肺癌種 膀胱癌種 上皮癌種 神経膠腫 星状細胞腫 髄芽腫 頭蓋咽頭腫 上衣細胞腫 カポージ肉腫 松果体腫 血管芽細胞腫 聴神経腫 稀突起神経膠腫 メナンジオマ 黒色腫 神経芽細胞腫 網膜芽細胞腫 ５．３．２．視覚障害 本発明の治療薬化合物で治療できる新生血管形成に関連する視覚障害には、新 生血管形成緑内障、糖尿病性網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後方線維組織形成、 ブドウ膜炎、早発網膜症、黄斑変性、角膜移植新生血管形成、並びにその他の眼 科炎症性疾病、眼科腫瘍及び脈絡膜または虹彩の新生血管形成に関連する疾病が 含まれるが、これらに限定はされない。例えばWaltmanらによる概説1978,Am.J.O phthal.85:704-710)及びGartnerら1978,Surv.Ophthal.22:291-312による概説を 参照のこと。 ５．３．３．その他の障害 本発明の治療薬化合物で治療できる他の障害には、血管腫、関節炎、乾癬、血 管線維腫、アテローム硬化斑、創傷治癒遅れ、肉芽形成、血友病性関節、過性成 性搬痕、癒着不良骨折、オスラー‐ウェバー症候群、化膿性肉芽腫、硬皮症、ト ラホーム及び血管癒着が含まれるが、これらに限定はされない。 ５．４．治療上または予防上の効用の例証 本発明の治療薬剤は、所望の治療上または予防上の活性のため並びに治療上有 効な用量の決定についてin vivoで試験が可能である。例えば、そのような化合 物は、人体で試験する前に、限定はしないがラット、マウス、ニワトリ、ウシ、 サル、ウサギ等を含む適当な動物モデル系で試験することができる。人体投与の 前のin vivo試験のために、この分野で公知のいかなる動物モデル系も使用でき る。 ５．５．治療／予防の投与及び組成物 本発明は、本発明の治療薬剤の有効量を被験体に投与することによる治療方法 （及び予防方法）を提供する。好ましい態様においては、この治療薬は実施例１ に述べるように実質的に精製されている。被験体は限定はされないが好ましくは ウシ、ブタ、ニワトリ等を含む動物であり、好ましくは哺乳動物であり、最も好 ましくはヒトである。 更に本発明は、化学療法薬剤及び／または放射性アイソトープ照射と組み合わ せた 本発明の治療薬の有効量を被験体に投与することによる治療法を提供する。 また本発明は、睡眠状態を維持するために鎮静に入った忠者に対する本発明の 治療薬剤による治療の方法を提供する。 本発明の治療薬剤を投与するための各種の送達系が知られており、使用するこ とができる。例えば、リポソーム中にカプセル化、微粒子、ミクロカプセル、受 容体介在内向きエンドーサイトーシス（例えばWu及びWu、1987、J.Biol.Chem.、262 :4429-4432を参照のこと）が挙げられる。導入方法には、局所、皮膚内、筋 肉内、腹膜内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、目及び口の各経路が含まれるが、 これらには限定はされない。これら化合物は任意の都合よい経路、例えば浸剤ま たは全量注射、上皮または皮膚／粘膜ライニング、（例えば口粘膜、直腸及び腸 粘膜等）を介した吸収等により投与でき、他の生物学的に活性な試剤と共に投与 できる。投与は局在化されるのが好ましいが、投与は全身的でもよい。さらに加 えて、胃内及び包膜の注射を含む任意の適切な経路により本発明の医薬組成物を 中枢神経系に導入するのが望ましい。胃内注射は、Ommayaリザーバーのようなリ ザーバーに付設された胃内カテーテルにより容易と￥なる。肺投与も、例えば吸 入器または噴霧器の使用とエアロゾール化剤を含む組成化により応用できる。 特定の実施態様においては、本発明の医薬組成物を治療を必要とする部位に局 所投与することが望ましい。これは、限定はしないが例えば、手術の間の局所注 入、手術後の傷口包帯との組み合わせのような局所適用、注射、カテーテルの手 法、座薬の手法またはシアラスチック膜のような膜か繊維を含む多孔性、非多孔 性またはゼラチン状材質のインプラントの手法により達成される。一つの実施態 様においては、悪性腫瘍または腫瘍性か前腫瘍性組織の部位（または前部位）へ の直接注射により投与が可能となる。 局所適用には精製したトロポニンサブユニットが、担体と組み合わせられ、所 望の活性度（即ち、局所血管形成、内皮細胞の移動及び／または毛細管内皮細胞 の増殖を防止するために例えば１．０μＭから１．０ｍＭの有効用量の範囲）を 基準として有効容量が送達される。一つの実施態様においては、局所トロポニン サブユニット、フラグメントまたは類似体が、乾せんのような疾病の治療のため に皮膚に適用される。この担体は、限定はしないが例えば軟膏、クリーム、ゲル 、ペースト、発泡体、エー ロゾル、座薬、パッドまたはゲル化ステックの形態にある。 以下に論ずるある種の眼科障害の治療のための局所治療薬は、緩衝された生理 食塩水、鉱物性オイル、コーンやピーナッツ等の植物性オイル、ワセリン、ミグ リオール１８２、アルコール溶液、またはリポソームかリポソーム様製品のよう な眼科学的に許容される賦形剤中のトロポニンのサブユニット、フラグメントま たは類似体の有効量から成る。またこれら組成物の何れもが、保存剤、抗酸化剤 、抗生物質、免疫阻害剤、及びトロポニンのサブユニットに対して有害な影響を 及ばさない他の生物学的または製剤学的に有効な試剤を含有できる。 例えば潰瘍や痔の治療のための方向づけられた内部局所適用には、トロポニン のサブユニット、フラグメントまたは類似体の組成物は錠剤またはカプセルの形 態にあり、これは以下の成分または類似性質の化合物の何れをも含有できる：微 結晶性セルロース、トラガカントガム、またはゼラチンのような結合剤、デンプ ンまたはラクトースのような賦形剤、アルギン酸、プリモゲルまたはトウモロコ シデンプンのような砕解剤、ステアリン酸マグネシウムやステロートのような潤 滑剤またはコロイド状二酸化珪素のような滑り剤。投薬量単位の形態がカプセル の場合は、上記タイプの試剤に加えて脂肪オイルのような液状担体を含有できる 。更に投薬量単位の形態では、投薬量単位の物性形態を改変する例えば、糖のコ ーティング、シェラックまたは他の腸溶性試剤等の他の各種の材料を含有できる 。 座薬は一般に０．５％から１０％重量の範囲の活性成分を含有し、経口組成物 は好ましくは１０％ないし９５％の活性成分を含有する。 他の実施態様では、この治療剤は小胞、特にリポソーム中で送達することがで きる。Langerら、1990、Science、249:1527-1533；Treatら、1989、感染病及び 癌の治療におけるリポソーム類、Lopez-Berestein及びFidler(編集)、Liss、New York、pp.353-365；Lopez-Berestein（同書、pp.317-327）を参照のこと。 更に別の実施態様では、この治療剤は制御された放出システムで送り出すこと ができる。一つの実施態様では、例えばインシュリンや化学療法剤を特定の器官 または腫瘍に送り出すのに使用する注入ポンプを利用してトロポニンのサブユニ ットを投与できる(上記のLanger:Sefton、CRC.Crit.Ref.Biomed.、1987、Eng.14 :201；Buchwaldら、1980、Surgery88:507；Saudekら、1989、N.Engl.J.Med.、32 1 :574を参照)。 好ましい一形態においては、トロポニンのサブユニット、フラグメントまたは 類似体は、トロポニンのサブユニット、フラグメントまたは類似体を選択位置に 制御した時間間隔で放出する生分解性および生物互換性を有するポリマー内イン プラントと組み合わせて投与される。好ましいポリマー材の例に、ポリ無水物、 ポリオルソエステル、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリエチレン ビニル酢酸 及びそれらの共重合体と混合物が挙げられる。Medical Appcliation of Control led Release、Langer及びWise(編集)1974、CRC Pres.、Boca Raton、Florida;Co ntrolled Drug Bioavailability、Drug Product Design and Performance、Smol en及びBall(編集)、1984、Wiley,New York;Ranger及びPeppas、1983、J.Macromo l.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61を参照のこと。またLevy等、1985、Science 228 :190;During等、1989、Ann.Neurol.25:351;Howard等、1989、J.Neurosurg.71:10 5も参照のこと。更に他の実施態様では、制御された放出システムを治療ターゲ ット、即ち脳に接近して設置できるので全身服用量の一部分のみが必要となる( 例えば、Goodson、MedicalApplication of Controlled Releaseを参照のこと。 同書のvol.2、pp.115-138)。 その他の制御された放出システムはＬａｎｇｅｒによる概説で論じられている (1990、Science、249:1527-1533)。 また本発明は医薬組成物を提供する。このような組成物は、治療剤の治療に有 効な量と製剤学的に許容される担体から成る。 本発明の医薬組成物は中性または塩の形状に調合できる。製剤学的に許容され る塩には、塩酸、燐酸、酢酸、蓚酸、酒石酸等から誘導された塩等の遊離アミノ 基から形成した塩、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、鉄水酸 化物、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２‐エチルアミノエタノール、 ヒスチジン、プロカイン等から誘導された塩等の遊離カルボン酸から形成した塩 が挙げられる。 特定の実施態様では、用語「製剤学上許容される」は、連邦政府または州政府 の規制当局により是認されたか、動物または特にヒトでの使用のための米国薬局 方または一般的に認可された他の薬局方に一覧されていることを意味する。用語 「担体」は、薬剤がそれと共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤または ビヒクルを指す。このような製剤学上の担体として水またはオイルのような無菌 液体があり、オイルにはピーナツ油、大豆油、鉱物油、胡麻油等、ポリエチレン グリコール、グリセリン、 プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒のような石油、動物、植物または 合成を起源とするオイルが含まれる。医薬組成物が静脈内に投与される時は、水 が好ましい担体である。食塩水、及びデキストロースとグリセロールの水性溶液 も、特に注射溶液の液体担体として利用できる。適当な製剤学上の賦形剤には、 デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉 、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール モノステアレー ト、タルク塩化ナトリウム、乾燥スキムミルクグリセロール、プロピレン、グリ コール、水、エタノール等が含まれる。必要に応じて、組成物は、湿潤剤、乳化 剤または、酢酸塩、クエン酸塩、燐酸塩等のｐＨ緩衝剤を少量含んでいても良い 。塩化ベンジルまたはメチルパラベン等の抗菌剤、アスコルビン酸、重亜硫酸ナ トリウム等の抗酸化剤、エチレンジアミンテトラ酢酸のようなキレート剤、塩化 ナトリウム、デキストロース等の張度の調整剤もまた想定される。非経口製剤は 、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回投与 用のバイアルに封入できる。 これら組成物は溶液、懸濁液、乳化液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、持続放 出製剤等の形態をとることができる。組成物は、トリグリセリド、微結晶性セル ロース、トラガカントガムまたはゼラチンのような従来の結合剤及び担体と一緒 に座薬として製剤化することができる。経口組成物は、薬品級のマンニトール、 ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セ ルロース、炭酸マグネシウム等の標準担体を含有できる。適当な製剤学上の担体 の例は、E.ＷMartinによる“Remington's Pharmaceutical Sciences”に記載さ れている。このような組成物は、患者への適当な投与の形状を提供するような適 量の担体と共に、好ましくは精製した形態の治療剤の治療に有効な量を含有する 。この製剤は、投与様式に適するものである必要がある。 好ましい実施態様においては、組成物は、ヒトへの静脈投与に適応した医薬組 成物としての通常の手順に従って製剤化される。一般には静脈投与用の組成物は 、無菌の等張水性緩衝液中に溶解した溶液である。必要なら、組成物は、可溶化 剤及び注射部位の痛みを緩和するリグノカインのような局所麻酔薬も含有できる 。一般的には各成分は、活性剤の量を表示しているアンプルまたはプラスチック 袋のような気密容器中の例えば凍結乾燥粉体または水フリーの濃縮物として、単 位剤形で一緒に混合してま たは別個に供与される。組成物を注入により投与する場合は、無菌の薬品級の水 または食塩水を含有する注入ボトルにより分配される。組成物を注射により投与 する場合は、投与前に各成分が混合されるように注射用の無菌の水または食塩水 のアンプルを用意することが可能である。 特定の疾病または状態の治療に有効となる本発明の治療剤の量は、その疾病ま たは状態の性質に依存し、標準臨床技術により決定できる。加えて、５．２節で 論じたようなin vitroアッセイが任意に使用でき、最適服用量の範囲を確認する のに役立つ。製剤中での使用されるすべき正確な用量は、投与の経路及び疾病ま たは障害の重症度にも依存し、医師の判定及び各患者の状況に従って決定すべき である。それでも一般には、静脈投与の適当な服用量範囲は、キログラム体重当 り活性化合物の約２０−５００μgである。鼻腔内投与の適当な服用量範囲は、 一般には約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重ないし１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効用量は 、生体外または動物モデル試験バイオアッセイまたは即ちシステムから誘導した 用量応答曲線から外挿できる。 本発明は更に、本発明の医薬組成物の成分の一種または複数種を詰め込んだ一 または複数の容器から構成される医薬パックまたはキットを提供する。医薬また は生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により規定された様 式の通知書がこのような容器に付設されてもよく、この通知書はヒトへの投与の ための製造、使用または販売に対する当局による認可を表している。 本発明の組成物及び使用法の改変及び変更は、前記の詳細な説明から当業者に は明かである。このような改変及び変更は、付記した請求の範囲内に入るもので ある。 以下の非限定的実施例は、血管形成剌激因子が誘発する内皮細胞の増殖のトロ ポニンサブユニットによる阻害の発見、血管形成を阻害するトロポニンのサブユ ニット、フラグメント及び類似体の有効投薬量を決定する手段、並びにトロポニ ンサブユニットのフラグメント及び類似体（即ち、血管形成を阻害することがで きるトロポニンサブユニットのフラグメント及び類似体）を同定するための手段 を例示する。実施例で使用するトロポニンサブユニットは以下に述べる様に精製 される。 ６．実施例 実施例１：トロポニンサブユニット成分の精製 組織から心臓トロポニンの単離 トロポニンを精製するＥｂａｓｉ等の手法(１９６８、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６４：４６５−４７７)；Ｙａｓｕｉ等の手法(１９６８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ ｍ．２４３：７３５−７４２)；Ｈａｒｔｓｈｏｒｎｅ等の手法(１９６９、Ｂｉ ｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１７５：３０)；Ｓｃｈａｕｂ等の手 法(１９６９、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１１５：９９３−１００４)；Ｇｒｅａｓｅ ｒ等の手法(１９７１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６：４２２６−４２３３ ）；及びＧｒｅａｓｅｒ等の手法（１９７３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４８ ：２１２５−２１３３）が利用できる。ウサギの背と足の筋肉を切除し、脂肪と 結合組織を除去し、摩砕する。摩砕した筋肉（１ｋｇ）を、２０ｍＭのＫＣｌ、 １ｍＭのＫＨＣＯ₃、０．１ｍＭのＣａＣｌ₂及び０．１ｍＭのＤＴＴ¹を含有す る溶液２リットル中で５分間攪拌する。（¹以下の略号が使用されている。ＤＤ Ｔ、ジチオトレイトール;ＥＧＴＡ、エチレングリコール ビス（β‐アミノエ チルエーテル）‐Ｎ，Ｎ‐テトラアセテート；ＳＤＳ、ドデシル硫酸ナトリウム 塩；ＳＥ‐、スルフォエチル） この懸濁液を薄地の綿布を通して濾過し、残留物の洗浄を４回繰り返す。次にこ の洗浄した残留物に９５％エタノール２リットルを加え、１０分後に溶液を濾過 する。エタノール抽出を２度繰り返す。次ぎに残留物をジエチルエーテル２リッ トルで１０分間洗浄し、この洗浄を２回行う。最後に、残留物を室温で２〜３時 間乾燥する。 乾燥した粉体（筋肉１ｋｇからの）を１ＭのＫＣｌ，２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐ Ｈ８．０)、０．１ｍＭのＣａＣｌ₂及び１ｍＭのＤＴＴを含有する溶液により２ ２℃で一晩抽出する。薄地の綿布を通して濾過した後に、残留物を１ＭのＫＣｌ の１リットルでもう一度抽出する。 各抽出液を一つに集め、４℃に冷却する。固体の硫酸アンモニウムを約４０％ 飽和になるまで加える(１リットル当り２３０ｇ)。３０分後に、この溶液を遠心 し、次に上清１リットル当り硫酸アンモニウム１２５ｇを加える(６０％飽和)。 遠心後、沈降物を５ｍＭのＴｒｉｓ(ｐＨ７．５)、０．１ｍＭのＣａＣｌ₂及び ０．１ｍＭのＤＴＴを含有する溶液の５００ｍｌに溶解し、同溶液の１５リット ルに対して６時間、新しい溶液に対して一晩透析する。 固体のＫＣｌを最終濃度が１Ｍになるまで添加し、１ＭのＫＣｌの溶液を容積 が１ リットルになるまで加える。次に、ＨＣｌを添加してｐＨを４．６に調整し、遠 心によりトロポミオシンの沈降物を除去する。上清のｐＨをＫＯＨで７．０に調 整し、１リットル当り硫酸アンモニウムの４５０ｇを加える(７０％飽和)。沈降 物を５ｍＭのＴｒｉｓ(ｐＨ７．５)、０．１ｍＭのＣａＣｌ₂及び０．１ｍＭの ＤＴＴを含有する溶液に溶解し、同溶液に対して一晩透析する。固体のＫＣｌを 濃度が１Ｍになるまで添加し、ｐＨを４．６に調節し、生じる沈降物を遠心で除 去する。中性にした上清を、ネスラー反応がネガティブになるまで２ｍＭのＴｒ ｉｓ（ｐＨ７．５）に対して透析する。トロポニンの最終収量は、通常は新しい 筋肉の１ｋｇ当り２．５〜３．０ｇである。 組織から心臓トロポニンの単離 死後約３０分のウシの心臓を準備し、直ちに切り開き、血液を洗い出し、氷に 浸す。左心室を除去し、過剰の脂肪と結合組織を切取り、摩砕する。以後の全て の抽出と調合のステップは、特記がなければ０−３°で実施する。摩砕した筋肉 （５００ｇ）を、０．０９ＭのＫＨ₂ＰＯ₄、０．０６ＭのＫ₂ＨＰＯ₄、０．３Ｍ のＫＣｌ、５ｍＭの２‐メルカプトエタノールを含有する溶液（ｐＨ６．８）２ ．５リットル中でＷａｒｉｎｇブレンダーで１分間ホモジナイズする。次にホモ ジナイズした筋肉懸濁液を３０分間撹き混ぜ、１０００×ｇで２０分間遠心する 。沈降物を３０分間再度抽出し、遠心する。次いで残留物を５ｍＭの２‐メルカ プトエタノール２．５リットルで洗浄し、１０００×ｇで１０分間遠心し、続い て５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ(ｐＨ８．１／５)、５ｍＭの２ ‐メルカプトエタノールから成る１．５リットルで２回の連続洗浄と遠心を実施 する。次ぎに残留物を、５０ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．１）と５ｍＭの ２‐メルカプトエタノールから成る１．５リットルで２回の洗浄と遠心を実施す る。残留物の容積を測定し、残留物と３ＭのＫＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣ ｌ（ｐＨ８．１）及び５ｍＭの２‐メルカプトエタノールからなる０．５容積と 混合する。０℃で１６〜２０時間抽出した後、懸濁液を１５０００×ｇで１０分 間遠心する。沈降物を破棄し、上清を０．０５Ｎの塩酸でｐＨ７．６に調節する 。抽出物をナイロンガーゼを通して濾過することでｐＨ調節により生じた線状沈 降物を除く。３０と５０％の硫酸アンモニウム飽和の間に沈降するタンパク質を 収 集し、１ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭの燐酸カリ（ｐＨ６．８）及び５ｍＭの２‐メル カプトエタノールを含有する溶液に溶解し、同溶液に対して４時間、新しい溶液 に対して一晩透析する。このタンパク質溶液を、１０５０００×ｇで３０分間遠 心して清澄にする。次ぎにトロポニンを、ヒドロキシルアパタイトのカラムのク ロマトグラフィにより精製し、タンパク質を０．０８と０．１０Ｍとの間の燐酸 塩溶液で溶出させる(Ｇｒｅａｓｅｒ等、１９７２、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．３７：２３５−２４４)。ウ サギ心臓トロポニンも、抽出前に−２０℃で保存された一群の貯蔵心臓を用いて 同様な方法で調整する。 トロポニンサブユニットは６Ｍの尿素中のＤＥＡＥ‐セファデックス クロマ トグラフィにより分離される。ウシ心臓トロポミオシンは、トロポニン抽出スキ ーム(上記を参照)に由来する５０％硫酸アンモニウム飽和の上清から調製される 。硫酸アンモニウムを６５％飽和まで加え、沈降物を１ＭのＫＣｌ、１ｍＭの燐 酸カリ（ｐＨ７．０）及び５ｍＭの２‐メルカプトエタノールに溶解し、それに 対して透析する。次ぎにタンパク質を、ヒドロキシルアパタイトのクロマトグラ フィーより精製する。 タンパク質の測定：タンパク質の濃度は、標準としてウシの血清アルブミンを 用いたＧｏｒｎａｌｌ等のビュレット法により決定される(Ｇｏｒｎａｌ１等、 １９４９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.、１７７：７５１−７６６)。 成分の分離：ＳＰ‐セファデックス及びＤＥＡＥ‐セファデックスのクロマト グラフィーにより、三種の心臓トロポニン成分は完全に分離する。 組換えトロポニン単離と再構成プロトコール トロポニンＩとＴ 各種のトロポニンサブユニットとイソ型のものとをコードしたＤＮＡがこの分 野で知られている。例えば、Ｗｕ等（１９９４、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １３：２１７−２３３）;Ｓｃｈｒｅｉｅｒ等（１９９０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ ｅｍ．２６５：２１２４７−２１２５３）及びＧａｈｌｍａｎｎ等（１９９０， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２５２０−１２５２８）を参照のこと。 トロポニンサブユニットを発現するために、このサブユニットをコードしたＤ ＮＡを、この分野で知られる組換え技術を用いてＫＰ３９９８のような高コピィ 数発現プ ラスミドにサブクローン化する。 クローン化ｃＤＮＡを発現するために、挿入断片含有ｐＫＰ１５００ベクター で形質転換された大腸菌を３７℃で一晩成長させ、Ｌｕｒｉａ‐Ｂｅｒｔａｎｉ broth（ＬＢ）培地４リットルに接種し、４２℃でｍｉｄ‐ｌｏｇ相まで成長さ せる。次ぎにイソプロピル‐１‐チオ‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシドを０．５ｍ Ｍまで添加し、４２℃で一晩培養物を成長させる。発現化トロポニンサブユニッ ト、フラグメントまたは類似体の精製には報告された手法を適合できる(Ｒｅｉ ｎａｃｈ等、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：４６２８−４６３３ ；及びＸｕ等、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１３９６２−１３ ９６９)。細胞を遠心で収集し、２０ｍＭのＴｒｉｓ、２０％のスクロース、１ ｍＭのＥＤＴＡ、０．２ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオリド、１ｍｇ ／ｍｌのリゾチームから成る２０ｍｌ（ｐＨ７．５）に懸濁させる。３０分間氷 の上でインキュベーションした後、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０ ．２ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオリド、０．５ｍＭのＤＴＴから成 る８０ｍｌを加え、細胞をフレンチプレス（ＳＬＭ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ） 中で破砕する。細胞砕片をペレット化する。上清を飽和（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄が３５ ％になるように整え、氷上で３０分間撹き混ぜる。沈降化の後、上清をＮａＣｌ が５０ｍＭ、ＣａＣｌ₂が５ｍＭ、ＭｇＣｌ₂が１ｍＭ_、ＤＴＴが１ｍＭになるよ うに整え、次いで１．５×２５‐ｃｍのフェニル‐セファロース（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ.）カラムにかける。カ ラムをまず５０ｍＭのTｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ₂、１ｍ ＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．５）で洗浄し、次ぎにタンパク質が もはや溶出しなくなるまで５０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭ のＣａＣｌ₂、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．５）で洗浄する。粗製トロポニンサブ ユニットを次ぎに、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴで 溶出（ｐＨ７．５）させる。トロポニンサブユニット、フラグメントまたは類似 体を含有する画分をプールし、２５ｍＭのＴｒｉｓ、６Ｍの尿素(Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ.)、１ｍＭのＭｇＣｌ₂、 １ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ８．０）に対して透析し、１．５×２５−ｃｍ(7)ＤＥ５ ２（Ｗｈａｔｍａｎ）カラムにかける。カラムを、０から０．６ＭのＮａＣｌの 線形のグラジエントで溶出する。カラムから溶出し たトロポニンサブユニット、フラグメントまたは類似体を０．１ｍＭのＮＨ₄Ｈ ＣＯ₃、１ｍＭのβ‐メルカプトエタノールに対して透析し、凍結乾燥し、保存 する。純度は、ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動とＵＶ分光測光法で評 価する。細菌培養液１リットル当り、精製した組換えトロポニンサブユニット、 フラグメントまたは類似体の典型的収量６ｍｇが期待される。 凍結乾燥した組換えタンパク質を、６Ｍの尿素、２０ｍＭのHepes(ｐＨ７．５ )、０．５ＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ及び５ｍＭのＤＴＴから成るtake up 緩衝液に再懸濁する。混合物を室温で１時間、成長運動（nutate）をさせる。そ れから溶液を、０．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのHｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）及び ０．５ｍＭのＤＴＴから成る透析緩衝液に対して４℃で６時間１回交換の透析を 行う。 各ユニットのタンパク質濃度は２８０λで測定する。トロポニンＩの伸長係数 は０．４０であり、トロポニンＴは０．５０である。 トロポニンＣ 凍結乾燥した組換えタンパク質を、０．１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのHepes(ｐ Ｈ７．５)、２ｍＭのＥＤＴＡ及び５ｍＭのＤＴＴから成るtake up緩衝液に再懸 濁する。この溶液を０．１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５） 及び０．５ｍＭのＤＴＴから成る透析緩衝液に対して４℃で６時間１回交換の透 析を行う。 タンパク質の濃度は、２８０λで吸光度を測定することにより決定される。ト ロポニンＣの伸長係数０．１８である。 組合せたユニットの再構成 トロポニンサブユニットＣ、Ｉ及びＴの同じ再構成モル比を有すタンパク質濃 厚物を、全ての各種組合せ用に保存する。それぞれのタンパク質のこれらの濃厚 物を、０．１ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＣａＣｌ₂、５ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭの Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）から成る再構成緩衝液中で組み合わせる。０．１Ｍの ＮａＣｌ、０．１ｍのＣａＣｌ₂、０．５ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ ｐＨ７．５）から成る透析緩衝液で、３回交換の透析を４℃で２０−２４時間実 施する。 タンパク質の濃度は、２７８λで吸光度を測定して近似的に求める。トロポニ ン三 量体は、２７８λで０．４５の伸長係数を有する。 実施例２：ＤＮＡ合成により測定される内皮細胞増殖の阻害 ｂＦＧＦ‐刺激ＥＣの増殖に及ぼすトロポニンサブユニット、フラグメントま たは類似体の阻害効果は、以下の手法に従い測定できる。 内皮細胞ＤＮＡ合成 同日の第一に、ＤＭＥＭ／１０％、ＣＳ／１％ＧＰＳ中の５０００のウシ毛細 管内皮細胞を、９６‐ウェルの予めゼラチン化した組織培養プレートの各ウェル にプレーティングする。同日の第二に、細胞培養液を、培養液５０ｍｌ当り１mg /mlの「冷」チミジン１０μｌを補充した、ＤＭＥＭ、２％ＣＳ、１％ＧＰＳ、 ０．５％ＢＳＡ（完全培養液）に変える。同日の第三に、完全培養液中の試験サ ンプルを複製体に加える。加えてｂＦＧＦを、最終濃度が０．２ｎｇ／ウェルに なるまで適切な対照を除く各ウェルに加える。同日の第四に、１：１３希釈³Ｈ ‐チミジンストック５μｌを各ウェルに加え、プレートを５−６時間インキュベ ーションする。インキュベーションに続き、培養液を吸引し、残留物をＰＢＳで 一度洗浄し、次いでメタノールで各５分間の洗浄を２回行い、その後５％ＴＣＡ で各１０分間の洗浄を２回行う。更に細胞ウェルの内容物を水で３回洗浄し、プ レートまで乾燥し、０．３ＮのＮａＯＨ１００μｌを各ウェルに加える。ウェル の内容物をシンチレーションカウンター用バイアルに移し、各バイアルにＥｃｏ ｌｕｍｅ３ｍｌを添加する。その後、サンプルをシンチレーションカウンターで カウントする。 ３Ｔ３細胞 ＤＮＡ合成 ｂＦＧＦ‐刺激３Ｔ３細胞におけるＤＮＡ合成は、ｂＦＧＦ‐刺激内皮細胞の 増殖で生じる結果を評価するための対照を提供する。３Ｔ３細胞におけるＤＮＡ 合成は、以下の方法に従い測定できる。 ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞をトリプシン化し、５×１０⁴細胞／ｍｌの濃度に再 懸濁する。０．３ｃｍ²マイクロタイターウェル（ＭｉｃｒｏｔｅｓｔII ｔｉ ｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｐｌａｔｅｓ、Ｆａｌｃｏｎ）に２００μｌのアリコ ートをプレー ティングする。２〜３日の期間で集合体となった後、細胞を更に最低５日間イン キュベーションして増殖促進因子の媒体を枯渇させる。この成長条件により、非 分裂性ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞の集合性単一層が生じる。試験サンプルを０．１ ５ＭのＮａＣｌ５０μｌに溶解し、「³Ｈ」ＴｄＲと共にマイクロタイターウェ ルに添加する。少なくとも２４時間のインキュベーションの後、培養液を除き、 細胞をＰＢＳ中で洗う。細胞の固定及び組み込まれなかった「³Ｈ」ＴｄＲの除 去は、以下の連続ステップで達せられる；５分の間の二度のメタノールの添加、 Ｈ₂Ｏによる４回の洗浄、１０分間の二度の冷５％ＴＣＡの添加及びＨ₂Ｏによる ４回の洗浄。ＤＮＡ合成は、液体シンチレーションカウントまたはＨａｕｄｅｎ ｓｃｈｉｌｄ等により記述されたオートラジオグラフィーを改良した方法（1976 、Ｍ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．９８：１７５）のいずれかにより測定される 。シンチレーションカウントのためには、細胞を０．３ＮのＮａＣｌの１５０μ ｌ中で溶解し、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｒｉ‐Ｃａｒｂ液体シンチレーションカウン ターを用いてＩｎｓｔａ‐Ｇｅｌ液体シンチレーションカクテル（Ｐａｃｋａｒ ｄ）５ｍｌ中で計数する。一方、オートラジオグラフィーは、マイクロタイター ウェルの底部に穴をあけ、それをシラスティック（シリコンゴム）膠を備えたガ ラススライド上に載置することによってＤＮＡ合成を定量化するのに使用できる 。スライドをＮＴＢ２核トラックエマルション（Ｋｏｄａｋ）の１ｇ／ｍｌ溶液 に浸し、３−４日の間露光する。このエマルションを１０分間Ｍｉｃｒｏｄｏｌ ‐Ｘ溶液（Ｋｏｄａｋ）で現像し、蒸留水で洗い、３分間Ｒａｐｉｄ Ｆｉｘｅ ｒ（Ｋｏｄａｋ）により定着させる。オートラジオグラフを、改質Ｇｉｅｍsaス テインで染色する。標識された核のパーセンテージで表された少なくとも１００ ０の核が、各ウェルとＤＮＡ合成とでカウントされる。細胞分裂は、試験サンプ ルとともに４０−４８時間インキュベーションした後、マイクロタイターウェル 中の細胞数をグリッドを補助としてカウントすることにより測定される。 実施例３：細胞性酸性ホスフェターゼ活性の比色測定及び電子的細胞カウント により測定された内皮細胞増殖の阻害 本発明のトロポニンサブユニット、類似体または誘導体による治療に応答した ＥＣ増殖の阻害についての迅速で鋭敏なスクリーン法は、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ等（ １９８６、 Ｊ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５２：１３６−１４０）に述べられているよ うに、様々な濃度の阻害因子の存在下で細胞をインキュベーションし、細胞性酸 性ホスフェターゼ活性の比色測定に基づいて培養物中の内皮細胞の数を測定する ことを含む。 本発明者らは、毛細管内皮細胞（ＥＣ）の増殖に及ぼすトロポニンの効果を、 既知の血管形成因子（ｂＦＧＦ）による内皮細胞増殖の刺激を干渉するこのタン パク質の能力を測定する検定法で測定した。 第一日に、毛細管内皮細胞及びＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞を別々に、ゼラチン‐ 被覆９６‐ウェル組織培養皿にプレーティングした（２×１０³／０．２ｍｌ)。 第二日に、細胞に、５％子ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）（ＤＭＥＭ／５）及びｂ ＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）（ＦＧＦ Ｃｏ.）と共に、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’s改変 Ｅａｇｌｅ’s培養液（Ｇｉｂｃｏ）をトロポニンサブユニットの濃度を増加し ながら再度供給した。これらの物質は、最終容積の１０％を越えない容積で同時 に添加した。燐酸塩緩衝化食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）のみを含有するウェ ル及びＰＢＳ＋ｂＦＧＦを含有するウェルを対照としてその中に含めた。第五日 に、培養液を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍの酢酸ナトリウム(ｐＨ ５．５)、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び１００ｍＭのｐ‐ニトロフ ェニル燐酸エステル（ｓｉｇｍａ １０４ホスフェターゼ基質）を含む緩衝液の １００μｌ内に溶菌した。３７℃で２時間のインキュベーションの後、反応を１ ＮのＮａＯＨの１０μｌを添加して停止した。色の発生を、迅速マイクロプレー トリーダー（Ｂｉｏ‐Ｔｅｋ）を用いて４０５ｎｍで測定した。 パーセント阻害を、刺激に曝されたウェルの細胞数と剌激及びトロポニンサブ ユニットに曝されたそれらとを比較して求めた。 三種のトロポニンサブユニットは、比色検定により測定した結果、ｂＦＧＦ‐ 刺激ＥＣ増殖を阻害することが判明した。 トロポニンＣは、試験した全濃度において用量‐依存的にｂＦＧＦ‐刺激内皮 細胞の増殖を阻害した(図１)。ウシ内皮細胞増殖（「ＢＣＥ」）のパーセント阻害 は、２８０ｎＭ、１．４μＭ、２．８μＭ及び５．６μＭの濃度において、それ ぞれ５４％、８６％、８３％及び１００％であった。１００％の阻害は２０μｇ ／ウェルの濃度(５．６μＭ)において観察された。ＩＣ₅₀は、ｂＦＧＦ増殖因子 ‐誘発刺激の５０％阻害 が観察される濃度を表す。トロポニンＣのＩＣ₅₀は２７８ｎＭであると測定され た。 トロポニンＩは、ｂＦＧＦ‐刺激ＢＣＥの増殖を１及び５μｇ／ウェルの濃度 で阻害したが、１０μｇ／ウェルでは試験サンプルに阻害が観察されなかった( 図２)。ＢＣＥのパーセント阻害は、２４０ｎＭ及び１．２μＭの濃度において それぞれ３３％及び４６％であった。トロポニンＩのＩＣ₅₀は１．１４μＭと測 定された。 トロポニンＴは、ｂＦＧＦ‐刺激ＥＣの増殖を１０及び２０μｇ／ウェルの濃 度で阻害したが、１及び５μｇ／ウェルの濃度では阻害は観察されなかった(図 ３)。ＢＣＥ増殖は、１．６μＭ及び３．３μＭにおいてそれぞれ２３％及び６ ２％阻害された。トロポニンＴのＩＣ₅₀は２．１４μＭであると決定された。 トロポニンサブユニットＣとＩの組合せは、試験した全濃度においてＥＣを阻 害した(図４)。ＢＣＥの増殖のパーセント阻害は、１３０ｎＭ、６４５ｎＭ、１ ．３μＭ及び２．６μＭにおいてそれぞれ５２％、５４％、７３％及び４７％で あった。この組合せののＩＣ₅₀は１１０ｎＭであると決定された。 トロポニンサブユニットＣ、Ｉ及びＴの組合せは、ｂＦＧＦ‐刺激ＢＣＥの増 殖を３６０ｎＭの濃度で１６％だけ阻害することが観察された(５μｇ／ウェル 、図５)。 試験した各トロポニンサンプルは、非内皮細胞型であるＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３細 胞の増殖に対しては検出可能の阻害効果を持たなかった。 実施例４：トロポニンによる毛細管内皮細胞の移動の阻害 血管形成刺激因子に応答する毛細管ＥＣ移動の血管形成プロセスを阻害するト ロポニンサブユニット、誘導体または類似体の能力は、毛細管ＥＣ移動に及ぼす トロポニンサブユニット、誘導体または類似体の効果を研究するのに使用する改 良ボイデンチェンバー技術（Ｆａｌｋ等、１９８０、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１ ８：２３９−２４７(１９８０)）を用いて決定できる。ブラインド‐ウェルボイ デンチェンバーは、多孔性膜で分離した二つのウェル（上と下）から構成されて いる(Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１１５：４５３−４５６、1962)。既知濃度の成長因 子を下部ウェルに設置し、所定数の細胞とトロポニンサブユニット、誘導体また は類似体を上ウェルに設置する。細胞は膜の上部表面に付着し、下部の膜を通し て移動し、表面に付着する。次に膜を固定し、Ｇｌａｓｅｒ等の方法（１９８０ 、Ｎａｔｕｒｅ ２８８：４８３−４８４） を用いてカウントのために染色できる。 移動は、ブラインド‐ウェルチェンバー（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ，Ｎｏ．０２ ５‐１８７）と、フィブロネクチン（ＰＢＳ中の６．６７μｇ／ｍｌ）（ｈｕｍ ａｎ、Ｃｏｏｐｅｒ）で前コーティングした８つのミクロ細孔を有するポリカー ボネート膜（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）を利用して測定する。１％子ウシ血清を含 むＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／ｌ）中に希釈した塩基性ＦＧＦ（Ｔａｋｅｄａ Ｃｏ） を１０ｎｇ／ｍｌの濃度、低部ウェルに加える。上部ウェルは５×１０⁵毛細管 ＥＣ／ｍｌを受容し、精製の２４時間内に純化したトロポニン サブユニット、 誘導体または類似体の濃度の増加が採用される。対照ウェルは、ＤＭＥＭ／１（ 時にはｂＦＧＦと共に）を受容する。移動チャンバーを１０％ＣＯ₂中３７℃で ４時間インキュベーションする。次ぎに膜の上部表面の細胞を、ワイパー刃(Neu roprobe)の上で膜を移動させる(draw)ことで払い落とす。膜を通り低部表面に移 動した細胞を、２％グルタルアルデヒド次にメタノール（４℃）中で固定し、そ してヘマトキシリンで染色する。１６油浸液場（oil immersion fields）におけ る低部表面上の細胞の数を数え、この数と対照で得られたそれとを比較すること で、移動を定量化する。 実施例５：ＳＣＩＤマウスモデル系により測定された腫瘍増殖の阻害 組換え型トロポニンＩのヒトＰＣ‐３前立腺癌種細胞の増殖に対する効果を、 各四匹のマウスからなる治療及び対照グループにおける免疫不全（ＳＣＩＤ）マ ウスから求めた。１０⁶ＰＣ‐３細胞の背側皮下移植を行い、１００−４００ｍ ｍ³の間の容積に到達するまで皮下移植を観察した。腫瘍が閾値に到達した後、 一日２回の５０ｍｇ／ｋｇの組換え型トロポニンＩの皮下注射を治療グループに 対して開始した。 図６は、対照グループの腫瘍体積に比較し、２８日の治療処理の結果、治療グ ループに腫瘍容積の約５０％が低減したこと表している。 実施例６：マウス角膜ポケット検定で決定したトロポニンによる新生血管形成 のin vivo阻害 スクロース オクタ硫酸塩、Ｈｙｄｒｏｎ（登録商標）及び塩基性繊維芽細胞 増殖因子（４０ｎｇ／ペレット）のペレットをマウスの角膜ミクロポケット内に 置いた。 移植前４８時間から開始して５０ｍｇ／ｋｇの組換え型トロポニンＩを１２時間 毎にマウスへ皮下注射した。 角膜血管形成をスリットランプ顕微鏡により評価した。６日までの対照の目の 血管形成では、６日までには血管がペレットまで達してした。この時、処理した 動物では血管密度が５０％減少し、血管長が３０％阻害されたことが観察された 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 ＺＮＡ Ｃ０７Ｋ 14/47 ＺＮＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 レンジャー，ロバート，エス. アメリカ合衆国 02158 マサチューセッ ツ州 ニュートン，ロンバード ストリー ト 77 (72)発明者 ウィーダースチェイン，ディミトリ，ジ ー. アメリカ合衆国 02146 マサチューセッ ツ州 ブルックリン，スティームス ロー ド 11 (72)発明者 ウー，インミン アメリカ合衆国 02115 マサチューセッ ツ州 ボストン，ハンチントン アベニュ ー 650 (72)発明者 シトコウスキー，アーサー アメリカ合衆国 02174 マサチューセッ ツ州 アーリントン，パーク アベニュー 203

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．血管形成を阻害するのに効果的である量のペプチドおよび薬学的に許容され 得る担体を含有する医薬組成物であって、該ペプチドが、 ａ．少なくとも１０μＭのＩＣ₅₀を有する、ｂＦＧＦで刺激されたウシ内皮細胞 の増殖阻害剤であり； ｂ．長さが７５アミノ酸を上回り；さらに、 ｃ．ヒトの速単収縮トロポニンサブユニットＣ(配列番号１)、ヒトの速単収縮ト ロポニンサブユニットＩ(配列番号２)、およびヒトの速単収縮トロポニンサブユ ニットＴ（配列番号３）からなる群より選ばれるサブユニットと８０％を上回る 相同性を有する ペプチドである、前記医薬組成物。 ２．前記サブユニットが、ヒトの速単収縮トロポニンＣ、またはヒトの速単収縮 トロボニンＩである請求項１記載の組成物。 ３．前記サブユニットがヒトの速単収縮トロポニンＣである請求項１記載の組成 物。 ４．前記サブユニットがヒトの速単収縮トロポニンＩである請求項１記載の組成 物。 ５．前記ペプチドが、ヒトトロポニンサブユニットと９５％を上回る相同性を有 する請求項１記載の組成物。 ６．前記サブユニットが、ヒトの速単収縮トロポニンＣである請求項５記載の組 成物。 ７．前記サブユニットが、ヒトの速単収縮トロポニンＩである請求項５記載の組 成物。 ８．前記ペプチドが、哺乳動物のトロポニンサブユニットである請求項１記載の 組成物。 ９．前記ペプチドが、哺乳動物のトロポニンＣまたはトロポニンＩサブユニット である請求項８記載の組成物。 １０．前記ペプチドが、ウシ、ウサギ、マウスおよびラットのトロポニンサブユ ニットからなる群より選ばれるトロポニンサブユニットである請求項９記載の組 成物。 １１．前記ペプチドが、ヒトのトロポニンＣまたはトロポニンＩサブユニットで ある請求項８記載の組成物。 １２．前記ペプチドが、ウシ、ウサギ、マウスおよびラットのトロポニンサブユ ニットからなる群より選ばれるトロポニンサブユニットである請求項８記載の組 成物。 １３．前記ペプチドが、哨乳動物のトロポニンサブユニットのフラグメントであ る請求項１記載の組成物。 １４．前記ペプチドが、ヒトのトロポニンＣまたはトロポニンＩサブユニットの フラグメントである請求項１３記載の組成物。 １５．前記ペプチドが、ウシ、ウサギ、マウスならびにラットのトロポニンＣお よびＩサブユニットからなる群より選ばれるトロボニンＩまたはトロポニンＣサ ブユニットのフラグメントである請求項１３記載の組成物。 １６．前記担体が、目への局所的適用に対して許容され得る請求項１記載の組成 物。 １７．前記担体が、皮膚への局所的適用に対して許容され得る請求項１記載の組 成物。 １８．前記血管形成阻害剤が、生物分解性かつ生物学的適合性である重合体性送 達装置中に存在する請求項１記載の組成物。 １９．阻害を要する異所性の血管形成を生じる疾患または障害を有する被験者に おける該異所性の血管形成を阻害する方法であって、血管形成を阻害するのに効 果的である量の、 ａ．少なくとも１０μＭのＩＣ₅₀を有する、ｂＦＧＦで刺激されたウシ内皮細 胞の増殖阻害剤であり； ｂ．長さが７５アミノ酸を上回り；さらに ｃ．ヒトの速単収縮トロポニンＩサブユニット、ヒトの速単収縮トロポニンＣ サブユニット、およびヒトの速単収縮トロポニンＴサブユニットからなる群より 選ばれるサブユニットと８０％を上回る相同性を有する ペプチドを異所性の血管形成部位に適用する工程を含む前記方法。 ２０．前記サブユニットが、ヒトの速単収縮トロポニンＣ、またはヒトの速単収 縮トロポニンＩである請求項１９記載の方法。 ２１．前記疾患または障害が、固形腫瘍である請求項２０記載の方法。 ２２．前記腫瘍が、中枢神経系の腫瘍である請求項２０記載の方法。 ２３．前記疾患または障害が、眼科の疾患または障害である請求項２０記載の方 法。