JP2000506728A

JP2000506728A - Ｎ―保護されたｄ―プロリン誘導体の製造方法

Info

Publication number: JP2000506728A
Application number: JP9532290A
Authority: JP
Inventors: ザウター，マルティン; フェネツ，ダニエル; ヘンツェン，ファビエンヌ; シュミットハルター，ディエゴ; プファッフェン，ガブリエラ; ヴァーヴィツキィ，オレグ
Original assignee: ロンザアーゲー
Priority date: 1996-03-13
Filing date: 1997-03-12
Publication date: 2000-06-06
Also published as: KR19990087341A; SK282099B6; CA2245543A1; US20020037559A1; AU2155797A; SK117198A3; NO984206L; EP0896617A1; PL328795A1; NO984206D0; CN1213400A; CZ281198A3; WO1997033987A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、一般式（Ｉ）のＮ−保護されたプロリン誘導体［式中、Ｒ¹は−（ＣＨ₂）₂−ＣＯＯＨ、いずれも場合によっては置換されている、Ｃ₁〜Ｃ₄アルコキシ、アリールまたはアリロキシであり、Ｒ²は水素であるかまたはヒドロキシである。］の、ラセミ体またはその光学異性体の一方の形態にあるものを、唯一の炭素源、唯一の窒素源または唯一の炭素源かつ唯一の窒素源として資化することができる微生物に関する。これらの微生物は、一般式（II）または（Ｖ）の、Ｎ−保護された環状の、または脂肪族のＤ−アミノ酸誘導体を製造する方法において使用することができる。［Ａは−Ｎ−および−ＣＨと一体であり、Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵は、所定の意味を有する。］

Description

【発明の詳細な説明】Ｎ−保護されたＤ−プロリン誘導体の製造方法本発明は、下記の一般式の [式中、Ｒ¹は−（ＣＨ₂）₂−ＣＯＯＨであって、場合によってはＣ₁〜Ｃ₄アルコキシ、アリールまたはアリロキシで置換されていてもよく、Ｒ²は水素であるかまたは＝０である。] Ｎ−保護されたプロリン誘導体であって、ラセミ体または光学的に活性な異性体のひとつを唯一の窒素源として、唯一の炭素源として、または唯一の炭素源および窒素源として資化することができる、新規な微生物に関する。これらの微生物およびその細胞を含まない酵素は、Ｎ−保護された、環状のまたは脂肪族のＤ− アミノ酸誘導体、および（または）環状のまたは脂肪族のＬ−アミノ酸誘導体を製造する、新規な方法に使用される。Ｎ−保護された環状のＤ−アミノ酸誘導体、たとえばＮ−ベンジロキシカルボニル−Ｄ−プロリン（Ｎ−Ｚ−Ｄ−プロリン）のようなＮ−保護されたＤ−プロリン誘導体は、医薬を製造するための重要な中間体である（J．Org．Chem.，199 4，59，7496-7498）。今日まで、たとえばＮ−Ｚ−Ｌ−プロリンを基質として受入れ、これを加水分解してＬ−プロリンにする酵素としては、わずか数種のものが知られているに過ぎない。これらの酵素は、ロドトルラ（Rhodotorula）属の微生物（ＪＰ−Ａ０１−０７４９８７）、シュードモナス（Pseudomonas）属の微生物（ＪＰ−Ａ５５−０７１４９１、キクチほかBiochem．Biophys．Acta.，744 1983，180-188）またはアルカリゲネス（Alkaligenes）属の微生物（JＰ−Ａ５５−００７０１５）から単離されたものである。これらの酵素は、好ましくは、構造的に関連のある基質またはＮ−Ｚ−Ｌ−プロリンたとえばＮ−クロロアセチル−Ｌ−プロリンと反応するが、Ｎ−Ｚ−Ｌ− プロリンに対する活性は低い。それゆえ、これらの酵素は、たとえばＮ−Ｚ−Ｌ −プロリンを製造する上で、経済的なプロセスには適当でない。さらなる不利益は、基質の反応はすべての細胞で行われるのではなく、抽出物または単離した酵素で行なわれるということであって、それが工業生産のコストを著しく高くする。ＥＰ−Ａ−０４１６２８２は、Ｎ−アシル−Ｌ−プロリンアシラーゼを開示しており、これは基質として、たとえばＮ−アセチル−Ｌ−プロリンを好み、Ｌ− プロリンを得るために使用される。このＮ−アシル−Ｌ−プロリンアシラーゼは、コマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）種またはアルカリゲネス・デニトリフィカンス（Alkaligenes denitrificans）種の微生物から単離される。これらの微生物の不利益は、Ｎ−Ｚ−Ｌ−プロリンを唯一の窒素源として資化することができないことと、基質としてＮ−Ｚ−Ｌ−プロリンを加水分解することができないことである。ＷＯ９５／１０６０４は、アルカリゲネス・デニトリフィカンス種の微生物を用いた、微生物学的なＬ−ピペコリン酸の製造プロセスを開示している。これらの微生物は、対応するＮ−アシル基質（Ｎアセチル−（ＤＬ）−ピペコリン酸）を唯一の窒素源として資化しないという不利益がある。本発明の目的は、Ｎ−保護された環状の、または脂肪族のＤ−アミノ酸誘導体の製造に実施可能な、単純で技術的に実施可能なプロセスにも、また環状の、または脂肪族のＬ−アミノ酸誘導体を製造するための実施可能なプロセスにも利用することができる、微生物を単離することにある。それと同時に、対応する製品は、良好なエナンチオマー純度で単離することができなければならない。この目的は、請求の範囲第１項に記載の微生物により、それら微生物からの請求の範囲第５項に記載の酵素により、また請求の範囲第６，７，９および１０項に記載の方法により達成される。本発明の微生物は、土壌のサンプル、スラッジまたは汚泥の中から、常用の微生物学的技術の助けを借りて、単離することができる。本発明によれば、こうした微生物の単離は、それらを常用の方法で、一般式のＮ−保護されたプロリン誘導体をラセミ体またはその光学活性な異性体の形で、・唯一の炭素および窒素源として、・適当な炭素源を使用し、唯一の窒素源として、または・適当な窒素源を使用し、唯一の炭素源として、含有する培地で培養することによって行なう。培養によって得られた培養物から、微生物は、一般式ＩのＮ−保護されたＬ−プロリン誘導体を唯一の窒素源として、唯一の炭素源として、または唯一の炭素源かつ唯一の窒素源として、資化するものとして選別する。式ＩのＮ−保護されたプロリン誘導体において、基Ｒ¹は、−（ＣＨ₂）₂−ＣＯＯＨ、Ｃ₁〜Ｃ₄アルコキシ、アリールまたはアリロキシを表す。基Ｒ²は、水素または＝０である。Ｃ₁〜Ｃ₄アルコキシとしては、メトキシ、フルオレニルメトキシ、エトキシ、プロボキシ、ｉ−プロポキシ、ブトキシ、ｔ−ブトキシまたはｉ−ブトキシを使用することができる。アリール基としては、置換された、または置換されていないフェニルまたはベンジル、たとえば４−メトキシベンジルまたは４−メトキシフェニルを使用することができる。アリーロキシは、以下、置換された、または置換されていないフェニロキシまたはベンジロキシ基として定義される。アリーロキシ基の例は、ベンジロキシ、４−メトキシベンジロキシ、または４−ニトロベンジロキシである。とくに好適な、式ＩのＮ−保護されたプロリン誘導体は、Ｎ−サクシニル−Ｌ −プロリン（Ｒ¹＝−（ＣＨ₂）₂−ＣＯＯＨ）、Ｎ−フェニルアセチル−Ｌ−プロリン（Ｒ¹＝フェニルメチル）、Ｎ−Ｚ−Ｌ−プロリン（Ｒ¹＝ベンジロキシ）、Ｎ−ベンジロキシ−Ｌ−プロリン（Ｒ¹＝フェニル）、Ｎ−イソブトキシカルボニル−Ｌ−プロリン（Ｒ¹＝イソブトキシ）およびＮ−Ｚ−Ｌ−ピログルタメート（Ｒ¹＝ベンジロキシ、Ｒ²＝０）である。適当な炭素源として、微生物は、たとえば、糖、糖アルコールまたはカルボン酸を、成長の基質として資化することができる。糖としては、ヘキソースたとえばグルコース、フラクトースのようなヘキソース、またはペントースが使用できる。カルボン酸としては、ジ−またはトリ−カルボン酸またはそれらの塩、たとえばクエン酸塩またはマレイン酸塩が使用できる。糖アルコールとしては、たとえばグリセロールが使用できる。適当な窒素源として、微生物は、たとえば、アンモニア、硝酸塩、尿素またはグリシンを資化することができる。選択および増殖用の培地としては、専門家の間で常用されているもの、たとえば表１に記載のものが使用できる。好ましくは、表１に記載のもの使用する。培養および選択の間に、微生物の活性のある酵素が好都合に誘起される。酵素誘起剤として、一般式ＩのＮ−保護されたプロリン誘導体またはそのＬ−異性体が使用できる。通常、培養および選択は、１０から４０℃、好ましくは２０から３５℃の温度と、４ないし１０のｐＨ、好ましくは５ないし９のｐＨとにおいて実施する。好ましい微生物は、Ｎ−Ｚ−Ｌ−プロリン資化性の微生物であって、アースロバクター（プロリンアシラーゼ活性を有する第一のグラム陽性菌）、アグロバクテリウム／リゾビウム、バチルス、シュードモナスまたはアルカリゲネスの属に分類される微生物である。とくに、寄託番号ＤＳＭ１０３２８を与えられたアースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５、アグロバクテリウム／リゾビウムＨＳＺ３０、バチルス・シンプレックスＫ２、シュードモナス・プチダＫ３２、アルカリゲネス・ピエカウディイＫ４、または寄託番号ＤＳＭ１０３２９を与えられたアルカリゲネス・キシロソキシダンスｓｓｐ．デニトリフィカンスＨＳＺ１７、およびそれらの機能的に同等の変異種および突然変異種が単離される。微生物ＤＳＭ１０３２８およびＤＳＭ１０３２９は、１９９５年１１月６日に、ドイッチェ・ザムルング・フォン・ミクロオーガニスメン・ウント・ツエルクルトウーアＧｍｂＨ，マシェローダーヴェク１ｂ，Ｄ−３８１２４，ブラウンシュヴァイクに、ブダペスト条約に従って寄託されている。「機能的に同等な変異種および突然変異種」とは、もとの微生物と本質的に同じ特性と機能とを有する微生物を意味すると理解すべきである。このような変異種および突然変異種は、偶然の機会、たとえばＵＶ照射などによって形成することができる。アルカリゲネス・キシロソキシダンス(Alkaligenes xylosoxydans)ｓｓｐ．デニトリフィカンス（denitrificans）ＨＳＺ１７（ＤＳＭ１０３２９）の分類学的記述菌株の特性：細胞の形桿状幅 μｍ０．５−０．６長さ μｍ１．５−３．０運動性＋べん毛周毛状グラム反応 − ３％ＫＯＨによる分解＋アミノペプチダーゼ（ツエルニー）＋胞子 − オキシダーゼ＋カタラーゼ＋嫌気的増殖 − ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）＋ＮＯ₃からのＮＯ₂ ＋脱窒＋ウレアーゼ − 加水分解ゼラチンの − ツイーン（Tween）８０の − 酸（ＯＦ試験）グルコースから好気的に − キシロース８０から − 基質の資化グルコース − フラクトース − アラビノース − クエン酸塩＋マレイン酸塩＋マンニトール − アースロバクター（Arthrobacter）ｓｐ．ＨＳＺ５（ＤＳＭ１０３２８）の分類学的記述特徴付け：グラム陽性不規則桿状で顕著な桿菌− 球菌の成長サイクル；厳格な好気性；グルコースから酸、ガスを発生しない。運動性 − 胞子 − カタラーゼ＋細胞壁中にメソージアミノピメリン酸：なしペプチドグリカンのタイプ：Ａ３α，Ｌ−Lys−Ｌ−Ser−Ｌ−Thr−Ｌ−Ala １６ＳｒＤＮＡ配列の類似性：最大の変動可能性を有する範囲の配列は、アースロバクター・パッセンス（pascens）、Ａ．ラモスス（A.ramosus）およびＡ．オキシダンス（A．oxydans）との間に、最高９８．２％の値を与えた。アグロバクテリウム／リゾビウム（Agrobacterium/Rhizobium）ＨＳＺ３０の分類学的記述細胞の形多形的桿状幅 μｍ０．６−１．０長さ μｍ１．５−３．０グラム反応 − ３％ＫＯＨによる分解＋アミノペプチダーゼ＋胞子 − オキシダーゼ＋カタラーゼ＋運動性＋嫌気的増殖 − 硝酸塩からの亜硝酸塩 − 脱窒 − ウレアーゼ＋ゼラチンの加水分解 − 酸Ｌ−アラビノースから＋ガラクトースから − メレジトースから − フコースから＋アラビトールから − マンニトールから − エリスリトールから − リトマスミルクのアルカリ性化＋ケトラクトース − １６ＳｒＤＮＡの部分的配列は、アグロバクテリウム亜属およびリゾビウム亜属の代表的なものに対する、比較的高い類似度約９６％を示した。これらの亜属の範囲内で、不明瞭でない種の決定をすることは不可能であった。バチルス・シンプレックス（Bacillus simplex）Ｋ２の分類学的記述細胞の形桿状幅 μｍ０．８−１．０長さ μｍ３．０−５．０胞子 − 楕円形 − 円形 − 胞子嚢 − カタラーゼ＋嫌気的増殖 − ＶＰ反応ｎ．ｇ．最高温度増殖陽性温度℃ ４０増殖陰性温度℃ ４５増殖培地中ｐＨ５．７ − ＮａＣｌ２％＋５％ − ７％ − １０％ − リゾチーム培地＋酸（ＡＳＳ）Ｄ−グルコースから＋Ｌ−アラビノースから＋Ｄ−キシロースから − Ｄ−マンニトールから＋Ｄ−フラクトースから＋フラクトースからのガスの発生 − レシチナーゼ − 加水分解デンプン＋ゼラチン＋カゼイン − ツイーン８０＋アエスクリン − 資化クエン酸塩＋プロピオン酸塩 − 硝酸塩からの亜硝酸塩＋インドール − フェニルアラニン・デアミナーゼ − アルギニン・ジヒドロラーゼ − 細胞の脂肪酸の分析の結果、バチルス属への帰属が確認された。１６ＳｒＤＮＡの部分配列は、バチルス・シンプレックスへの１００％の類似度を示した。アルカリゲネス・ピエカウディイ（Alkaligenes piechaudii）Ｋ４の分類学的記述細胞の形桿状幅 μｍ０．５−０．６長さ μｍ１．０−２．５運動性＋べん毛周毛グラム反応 − ＫＯＨによる分解＋アミノペプチダーゼ＋胞子 − オキシダーゼ＋カタラーゼ＋ＡＤＨ − 硝酸塩から亜硝酸塩＋脱窒 − ウレアーゼ＋ゼラチンの加水分解 − 基質の資化グルコース − フラクトース − アラビノース − アジピン酸塩＋カプリン酸塩＋クエン酸塩＋マレイン酸塩＋マンニトール − ピメリン酸塩＋細胞の脂肪酸のプロフィールは、アルカリゲネス属の典型的なものであった。１６ＳｒＤＮＡの部分配列は、アルカリゲネス・ピエカウディイに対し９９．３％の割り当てを与えた。シュードモナス・プチダ（Pseudomomnas putida）Ｋ３２の分類学的記述細胞の形桿状幅 μｍ０．８−０．９長さ μｍ１．５−４．０運動性＋べん毛極性＞１グラム反応 − ３％ＫＯＨによる分解＋アミノペプチダーゼ＋胞子 − オキシダーゼ＋カタラーゼ＋嫌気的増殖 − 色素蛍光＋ピオシアニン − ＡＤＨ＋硝酸塩から亜硝酸塩 − 脱窒 − ウレアーゼ − ゼラチンの加水分解 − 基質の資化アジピン酸塩 − クエン酸塩＋マレイン酸塩＋Ｄ−マンデル酸塩＋フェニル酢酸塩＋Ｄ−酒石酸塩 − Ｄ−グルコース＋トレハロース − マンニトール − ベンゾイルフォルメート − プロピレングリコール＋ブチルアミン＋ベンジルアミン＋トリプタミン − アセタミド＋馬尿酸塩＋細胞の脂肪酸のプロフィールは、シュードモナス・プチダに典型的なものであった。１６ＳｒＤＮＡの部分配列は、シュードモナス・メンドキナ（mendocina）およびシュードモナス・アルカリゲネスに対して、約９８％の類似度を与えた。シュードモナス・プチダへの類似度は、９７．４％であった。フェノタイプのデータからみて、この菌株は、不明瞭ではなく、シュードモナス・プチダ種に分類することができる。本発明に従う酵素、Ｎ−アシル−Ｌ−プロリンアシラーゼは、たとえば、上記の微生物の、常用の技術による細胞の破壊によって取得することができる。好ましくは、酵素は、アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５（ＤＳＭ１０３２９）から取得する。このためには、たとえば、超音波、フレンチプレスまたは酵素法を利用することができる。酵素は、下記の特性によって特徴付けられる。下記の特性により特徴付けられるＮ−アシル−Ｌ−プロリンアシラーゼ：ａ）基質の特殊性Ｎ−ベンジロキシカルボニル−Ｌ−プロリンＮ−ベンゾイル−Ｌ−プロリンＮ−イソブトキシカルボニル−Ｌ−プロリンＮ−ベンジロキシカルボニル−Ｌ−ピログルタメートＮ−ベンジロキシカルボニル−ＤＬ−ピペコリン酸Ｎ−ベンジロキシカルボニル−Ｌ−アラニンを加水分解する。ｂ）最適ｐＨ最適なｐＨは、ｐＨ６．５±０．２ｃ）温度安定性６時間の培養後、４３℃まで、ｐＨ６．５において活性の損失は検知されない。ｄ）温度活性５０℃、ｐＨ６．５において、良好な活性が検知される。ｅ）阻害剤の影響ベンジルアルコールおよびＮ−ベンジロキシカルボニル−Ｄ−プロリンが阻害作用を示す。本発明に従う、一般式IIのＮ−保護環状Ｄ−アミノ酸誘導体および（または）一般式IIIの環状Ｌ−アミノ酸誘導体 [式中、Ａは、−Ｎ−および−ＣＨと一体となって、場合によっては置換されている４−，５−または６−員の飽和複素環を形成し、Ｒ³は−（ＣＨ₂）₂−ＣＯＯＨであって、どちらも、場合によっては置換されたアルキル、アルコキシ、アリールまたはアリーロキシである]。の製造方法は、一般式 [式中、Ａは、−Ｎ−および−ＣＨと一体となって、上記した意味を有し、Ｒ³も上記した意味を有する]。のＮ−保護された環状アミノ酸誘導体のラセミ体の中で、Ｎ−保護された環状のＬ−アミノ酸誘導体をすでに述べた微生物を手段として、またはその細胞を含まない酵素を手段として、環状のＬ−アミノ酸誘導体に転化し、これを場合によっては単離し、バイオ変換の間、Ｌ−アミノ酸誘導体に加えて、Ｎ−保護されたＤ −アミノ酸誘導体（式II）とし、場合によってはこれを単離するという方法で実施する。下記の一般式Ｖの、Ｎ−保護された脂肪族Ｄ−アミノ酸誘導体および（または）下記の一般式VIの、脂肪族Ｌ−アミノ酸誘導体 [式中、Ｒ³は上記した意味を有し、Ｒ⁴は水素、場合によっては置換されている分岐のないアルキル基、またはω−ヒドロキシアルキル基であり、Ｒ⁵は水素または場合によっては置換されている分岐のないアルキル基である。] の製造は、対応する環状アミノ酸誘導体の製造方法と同様な方法で実施する。このための出発物質として、下記の一般式 [式中、Ｒ³，Ｒ⁴およびＲ⁵は上記した意味を有する。] のＮ−保護された脂肪族アミノ酸誘導体のラセミ体を使用する。場合によっては置換されている飽和の５員複素環の例は、プロリン、ピラゾリジン、イミダゾリン、オキサゾリジン、イソオキサゾリジン、チアゾリジンおよびトリアゾリジンである。置換された飽和の５員複素環としては、たとえば、５−オキソプロリン（ピログルタメート）を使用することができる。場合によっては置換されている飽和の６員複素環の例は、ピペラジン、ピペコリン、モルフォリン、デカヒドロキノリン類、デカヒドロイソキノリン類、キノキサリンである。場合によっては置換されている飽和の４員複素環としては、アゼチジンを使用することができる。以下において「アルキル」の語は、Ｃ₁〜Ｃ₁₈のアルキル基として規定され、置換されているものも、置換されていないものもある。Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキル基の例は、メチル、クロロメチル、ヒドロキシメチル、エチル、プロピル、ブチル、ｉ−ブチル、ｉ−プロピルおよびステアリルである。以下において「分岐してない」アルキルとは、メチル、エチル、プロピルおよびブチルとして規定される。以下において「ω−ヒドロキシ基」とは、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピルおよびヒドロキシブチルとして規定される。以下において「アルコキシ」の語は、Ｃ₁〜Ｃ₁₈のアルコキシ基として規定され、置換されているものも、置換されていないものもある。Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルコキシ基の例は、メトキシ、フルオレニルメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｉ−ブトキシおよびステアロキシである。場合によっては置換されているアリールまたはアリーロキシ基としては、上述したところと同じものを使用することができる。とくに好ましい、Ｎ−保護された環状の、または脂肪族のアミノ酸誘導体（式 IVまたはVIIの出発物質）は、Ｎ−Ｚ−プロリン（Ｒ³＝ベンジロキシ）、Ｎ−ｔ −ブトキシカルボニルプロリン（Ｒ³＝ｔ−ブトキシ）、Ｎ−アセチルプロリン（Ｒ³＝メチル）、Ｎ−サクシニルプロリン（Ｒ³＝−（ＣＨ₂）₂−ＣＯＯＨ）、Ｎ−フェニルアセチルプロリン（Ｒ³＝ベンジル）、Ｎ−ベンジロキシプロリン（Ｒ³＝フェニル）、Ｎ−クロロアセチルプロリン（Ｒ³＝クロロメチル）、Ｎ− ｉ−ブトキシカルボニルプロリン（Ｒ³＝ｉ−ブトキシ）、Ｎ−Ｚ−ピペコリン酸（Ｒ³＝ベンジロキシ；６員飽和複素環＝ピペコリン）、Ｎ−Ｚ−アラニン（Ｒ³＝ベンジロキシ、Ｒ⁴＝メチル、Ｒ⁵＝水素）、Ｎ−Ｚ−セリン（Ｒ³＝ベンジロキシ、Ｒ⁴＝ヒドロキシエチル、Ｒ⁵＝水素）、Ｎ−Ｚ−ピログルタメート（Ｒ³ ＝ベンジロキシ、５員飽和置換複素環＝５−オキソプロリン）およびＮ−Ｚ− サルコシン（Ｒ³＝ベンジロキシ、Ｒ⁵＝メチル）である。Ｎ−保護された環状の、または脂肪族のアミノ酸およびその誘導体のラセミ体の製造方法は、原理的に既知である。その製造において、対応するＬ−アミノ酸を、ＥＰ−Ａ００５７０９２により知られている手法でラセミ化し、今度はそれを、やはり既知の手法で、グラスマン・ヴュンシュ(Grassmann & Wuensch)の方法（Chem．Ber．91(1958)，462-465）に従って、対応するＮ−保護基を与える化合物と反応させる。Ｎ−保護された環状の、または脂肪族のアミノ酸を、対応するＬ−アミノ酸から出発して、水性の媒体中、Ｌ−アミノ酸の中でラセミ化と保護基の導入とを行なって製造する方法であって、アミノ酸の単離を行なわずに実施する方法は、知られていない。原理的にいって、Ｎ−保護されたプロリン誘導体を、ラセミ体の形であるにせよ、その光学的に活性な異性体の形であるにせよ、唯一の窒素源として、唯一の炭素源として、または唯一の炭素および窒素源として資化することのできる微生物であれば、何を用いてもバイオ変換は可能である。同様に、それらの微生物から単離したＮ−アシル−Ｌ−プロリンアシラーゼも好適である。本発明の方法にとってとくに適当な微生物は、すでに述べた、アースロバクター属、アルカリゲネス属、アグロバクテリウム／リゾビウム属、バチルス属、シュードモナス属に属する微生物であって、とくにアグロバクテリウム／リゾビウムＨＳＺ３０、バチルス・シンプレックスＫ２、アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５、アルカリゲネス・キシロソキシダンスｓｓｐ．デニトリフィカンスＨＳＺ１７（ＤＳＭ１０３２９）、シュードモナス・プチダＫ３２またはアルカリゲネス・ピエカウディイＫ４、およびそれらの機能的に等価な変異種および突然変異種である。バイオ変換は、常法にしたがって、休眠細胞（増殖していない細胞であって炭素源もエネルギー源も必要としていないもの）または増殖中の細胞を用いて培養を行なうことにより、実施可能である。バイオ変換は、好ましくは休眠細胞を使用して行なう。バイオ変換に当たって、当業技術において常用の培地、たとえば、低モル濃度のリン酸塩緩衝溶液、トリス緩衝溶液または表１に記述した培地を使用することができる。バイオ変換は、好ましくは表１の培地中で行なう。バイオ変換は、Ｎ−保護されたアミノ酸の一回の添加でも実施できるし、また連続的な添加により、その濃度が５０重量％、好ましくは２０重量％を超えないようにして、好都合に実施することもできる。培地のｐＨは、３ないし１２、好ましくは５ないし９の範囲内とすることができる。バイオ変換は、１０から７０℃、好ましくは２０から５０℃の温度で、好都合に実施することができる。本発明の方法によれば、Ｎ−保護された環状の、または脂肪族のアミノ酸誘導体は、環状のまたは脂肪族のＬ−アミノ酸誘導体に完全に転化される。この方法において、Ｎ−保護されたＤ−アミノ酸誘導体が、良好な収率とエナンチオマー純度（ｅｅ９８％以上）とで得られ、ついで単離することができる。このようにして得られた、Ｎ−保護されたＤ−アミノ酸誘導体および（または）Ｄ−アミノ酸誘導体は、常用の仕上げ方法、たとえば抽出によって単離することができる。実施例１Ｎ−Ｚ−Ｌ−プロリンを資化する微生物の選択多くの微生物の成長にとって必要な条件を満たす最小培地（表１）を、まず調製した。表１最小培地Ｎａ₂ＳＯ₄ ０．１ｇ／ｌＮａ₂ＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ２．５ｇ／ｌＫＨ₂ＰＯ₄ １．０ｇ／ｌＮａＣｌ３．０ｇ／ｌＭｇＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ０．４ｇ／ｌＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ１４．５mg／ｌＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ０．８mg／ｌ痕跡元素溶液１．０ml／ｌビタミン溶液１．０ml／ｌｐＨ７．０Ｃ源としては、フラクトース（５ｇ／ｌ）を加えた。Ｎ−Ｚ−Ｌ−プロリンを選択的に加水分解することのできる微生物を濃縮するため、Ｎ−Ｚ−Ｌ−プロリン（５ｇ／ｌ）を、この基本の培地に、唯一のＮ源として加えた。異なる地域から採取した土壌のサンプルを含む種々のバッチを接種し、明白に視認できる成長が検出されるまで、培養（３０℃、１２０ｒｐｍ）した。この培養物のいくつかを等容積の新鮮な培地に接種し、明白な濁りが生じるまで培養した。この方法を３回繰り返した。ついで、濃縮された微生物を単離し、固体培地（２０ｇ／ｌの寒天を添加したほかは、液体培地を同じ組成）上で精製した。このようにして、Ｎ−Ｚ−Ｌ−プロリンを唯一のＮ源として資化することのできるバクテリアの単離体を、約３０種得た。実施例２選択された微生物の培養実施例１に記載の方法によって得た単離体を、そこに記述した培地中で複製した。十分な細胞密度を有する（ＯＤ₆₅₀ ２．０）すべての培養物を、遠心分離によって収穫した。沈降した細胞を再度懸濁させ、０．８５％ＮａＣｌ中で洗浄した。ＮａＣｌ溶液中でもう一度懸濁させた後、Ｎ−Ｚ−Ｌ−プロリンを加水分解する能力を、休眠細胞を使用して試験した。このためには、適当な量の細胞を、緩衝溶液（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ，ｐＨ７．０）中のＮ−Ｚ−Ｌ−プロリン（５ｇ／ｌ）で培養した（３０℃）。アリコートを何回か取り出し、Ｎ−Ｚ−プロリンからのプロリンの放出を、薄層クロマトグラフを用いてチェックした。多数の単離体がこの加水分解活性を示し、とくに、ＤＳＭによりアースロバクターｓｐ．およびアルカリゲネス・キシロソキシダンスｓｐｐ．として同定されている、二つの菌株ＨＳＺ５およびＨＳＺ１７の活性が高かった。実施例３アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５（ＤＳＭ１０３２８）の成長と酵素的活性アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５を、種々のＣ源（Ｎ源としてはＮ−Ｚ−Ｌ− プロリン）またはＮ源（Ｃ源としてはフラクトース）を使用して増殖させた。Ｃ源を５ｇ／ｌ、Ｎ源を２ｇ／ｌ加えた。所望の酵素活性を誘導するため、必要であれば、１ｇ／ｌのＮ−Ｚ−Ｌ−プロリンを追加的に加えた。試験したＣ源のうちで、フラクトース、グルコース、シュクロースおよびマンニトールだけが資化された。その他のすべての場合、Ｎ−Ｚ−Ｌ−プロリンをＣ源として使用した。酵素活性は、わずかな程度、使用したＣ源に依存した。これに対して、使用したすべてのＮ源が資化されたが、酵素活性はいくつかの場合、顕著に減少した（表２）。表２アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５を種々のＣ源（Ａ）またはＮ源（Ｂ）を用いて培養したときの増殖および酵素活性Ａ）Ｃ源細胞密度［ＯＤ₆₅₀］相対活性［％］フラクトース１２．０１００グルコース１５．０１５０シュクロース１２．４１４８グリセリン３．７１８３マンニトール１１．２１５４クエン酸塩２．７１０６マレイン酸塩３．９１２４酢酸塩３．５１４４Ｎ−Ｚ−Ｌ−プロリン２．８１０９Ｂ）Ｎ源細胞密度［ＯＤ₆₅₀］相対活性［％］アンモニア８．４２２硝酸塩７．６６尿素７．８１２グリシン８．０１７Ｌ−グルタミン酸塩９．６４３Ｌ−プロリン１０．８６４実施例４Ｎ−アシル−Ｌ−プロリンアシラーゼの誘起剤アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５を、最小培地（実施例１）中で、フラクトース（５ｇ／ｌ）をＣ源とし、Ｌ−グルタミン酸塩（２ｇ／ｌ）をＮ源として増殖させた。Ｎ−Ｚ−Ｌ−プロリン、Ｎ−Ｚ−ＤＬ−プロリン、Ｎ−Ｚ−Ｄ−プロリン、Ｎ−Ｚ−サルコシン、Ｎ−Ｚ−ジエチルアミン、Ｎ−Ｚ−グリシン、Ｌ−フェニルアラニンアミド、ベンズアミド、Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチルグリシン、アセトアミド（各場合１ｇ／ｌ）またはゼラチン（５ｇ／ｌ）を、追加的に加えた。細胞を収穫した後、休眠細胞を使用して、Ｎ−Ｚ−Ｌ−プロリンおよびＮ−Ｚ−Ｄ−プロリンに対する酵素活性を試験した（実施例２に記載のようにして）。ＨＰＣＬによるプロリンの定性分析の結果は、Ｎ−Ｚ−Ｌ−プロリンおよびＮ−Ｚ−ＤＬ−プロリンだけが所望の酵素活性を誘起することを示しており、どちらの場合も、Ｎ−Ｚ−Ｌ−プロリンだけが基質として受け入れられたこと、すなわち酵素の選択性はどちらの場合も高いということを示していた。実施例５Ｎ−Ｚ−Ｄ−プロリンの製造ａ）アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５を、最小培地（実施例１）中で、フラクトース（５ｇ／ｌ）をＣ源とし、Ｎ−Ｚ−Ｌ−プロリン（５ｇ／ｌ）をＮ源として増殖させた。細胞を収穫し、すでに述べたように洗浄した。休眠細胞（ＯＤ₆₅₀ ＝３０）を、３０℃においてＮ−Ｚ−ＤＬ−プロリン（５０ｇ／ｌ）を用いて、ｐＨ−定（ｐＨ７．０）、撹拌下に培養した。種々の時間においてアリコートを採取し、Ｎ−Ｚ−Ｌ−プロリンおよびＮ−Ｚ−Ｄ−プロリンの濃度を、ＨＰＬＣでモニターした（第１図参照）。６０分後、Ｎ−Ｚ−Ｌ− プロリンはほぼ完全に加水分解され、一方、Ｎ−Ｚ−Ｄ−プロリンは溶液中に未変化で存在していた。このようにして、Ｎ−Ｚ−Ｄ−プロリンが溶液中に高い光学純度で（ｅｅ＞９９％）存在していた。ｂ）アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５を、細胞密度ＯＤ₆₅₀＞３５となるまで、３０℃において、ケマップ（Chemap）ファーメンター（実効容積２リットル）中、最小培地（実施例１参照）上で、グルコース（３０ｇ／ｌ）およびＬ−プロリン（７ｇ／ｌ）をＣ源およびＮ源として増殖させた。酵素活性を誘起するため、少量のＮ−Ｚ−ＤＬ−プロリン（５ｇ／ｌ）を添加し、混合物をさらに若干の時間培養した。最後に、さらに１４５ｇのＮ−Ｚ−ＤＬ−プロリンを２０時間にわたって連続的に添加し、混合物をさらに５時間培養した。ついで、細胞を遠心分離により取り出した。発酵ブロスは、塩酸を用いてそのｐＨを＜３に調節し、この条件下ではほとんど水不溶性のＮ−Ｚ−プロリンを、酢酸ブチルの助けを借りて抽出した。Ｌ−プロリンの水溶液および有機溶媒中のＮ−Ｚ−プロリンの溶液を、二層の分離によって取得した。有機層を減圧下に濃縮し、得られたＮ−Ｚ− プロリンを酢酸エチル中に溶解し、ヘキサンの添加により結晶化させた。４１．４ｇのＮ−Ｚ−Ｄ−プロリンが結晶として単離され（理論値の５３．４％）、その同定および純度測定を、¹Ｈ−ＮＭＲにより行ない、融点を測定した（７５．３℃）。すぐれた光学純度を有し（ＨＰＬＣによれば、ｅｅ＞９９．５％）、酢酸中で〔α〕₄＝６０．０であった。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（CD₃OD中、400MHz）；ppm：７．３５（ｍ，５Ｈ）；５．１（ｍ，２Ｈ）；４．３（ｍ，１Ｈ）；３．６−３．４（ｍ，２Ｈ）；２．３−２．２（ｍ，１Ｈ）；２．１−１．９（ｍ，３Ｈ）．ｃ）アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５を、細胞密度ＯＤ₆₅₀＞３０となるまで、ファーメンター（名目容積２０リットル）中の６リットルの最小培地（実施例１参照）中で、グルコース（２０ｇ／ｌ）およびＬ−プロリン（７ｇ／ｌ）をＣ源およびＮ源として増殖させた。酵素活性を誘起させるため、１１２ｇの５０％（w/w）Ｎ−Ｚ−ＤＬ−プロリン溶液を添加し、混合物をさらに１時間培養した。ついで、培養物の容積を、不要な量を捨てることにより４リットルに減少させた。さらに７０９ｇの５０％（ｗ／ｗ）Ｎ−Ｚ−ＤＬ−プロリン溶液を、誘起された細胞を含むこの４リットルの培養物に、５．５時間かけて連続的に添加し、混合物をさらに１７．５時間培養した。バイオ変換を行なっている間、ｐＨは７．５−８．８に保った。反応の終了後、４０７７ｇの細胞懸濁液が得られ、そこから、細胞をウルトラフィルトレーションによって除去した。得られた発酵ブロスのありこと（１０００ｇ）を、６ａ）に記載のようにして処理した。３１．２４ｇのＮ−Ｚ−Ｄ−プロリンが結晶として単離され（理論値の８５．０％）、すぐれた純度（滴定による含有量＝９９．６％）および光学純度を有し（ＨＰＬＣによれば、ｅｅ＞９９．５％）、酢酸中ｃ＝２において〔α〕⁴＝６０．２であった。ｄ）アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５を、所望の細胞密度（ＯＤ₆₅₀約２５）となるまで、３０℃において、４５０リットルのファーメンター中で、２５０ kgのミネラル培地（実施例１参照）上、グルコース（１３ｇ／ｌ）およびＬ− プロリン（７ｇ／ｌ）をＣ源およびＮ源として増殖させた。ついで、４kgの５０％（w/w）Ｎ−Ｚ−ＤＬ−プロリン溶液を添加して、酵素活性を誘起させた。培養の間にｐＨは徐々に上昇し（ｐＨ＝７．５〜８．５)た。１時間の後、一定ｐＨで、さらに６７kgの５０％Ｎ−Ｚ−ＤＬ−プロリン溶液を２０kg/hの速度で添加し、混合物をさらに２０時間培養した。反応が速やかである（Ｎ− Ｚ−Ｌ−プロリン加水分解の最大速度は１２ｇ／ｌ・ｈ）結果、誘起開始から８時間後すでに、反応はほとんど完了していた（ｅｅ＞９８％）。最終的に得られた３２０kgの培養物から、細胞を超遠心分離によって除去し、細胞を含まない発酵ブロスからのアリコート（１４４４ｇ）を、６ａ）に記載したようにして仕上げ処理した。５０．０ｇのＮ−Ｚ−Ｄ−プロリン（理論値の８３．２％）が結晶の形で単離され、すぐれた純度（滴定による含有量＞９９％）および光学純度（ＨＰＬＣによれば、ｅｅ＞９９％）を示した。第１図アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５の休眠細胞によるＮ−Ｚ−Ｌ−プロリンの酵素加水分解実施例６Ｌ−プロリンのラセミ化５００mmolのＬ−プロリンを１２５mlの４Ｎ−ＮａＯＨ（５００mmol）に溶解した。この溶液を圧力容器中で１６０℃に加熱し、この温度に６時間保った。圧力は最大４．５気圧に達した。溶液を冷却したのち、比旋光度（〔α〕⁵＝−１．５）の手段により、プロリンがほとんど完全にラセミ体であることが証明できた。わずか０．１５mol当量のＮａＯＨを使用してラセミ化を実施した場合でも、同様な結果が得られた。しかしながら、反応時間は１６時間に延長しなければならなかった。実施例７Ｎ−Ｚ−（ＤＬ）−プロリンの製造１００．０ｇのＤＬ−プロリンを、２１７mlの４Ｎ−ＮａＯＨに溶解した。この溶液に、ベンジル・クロロホルメート（Ｚ−Ｃｌ）を、温度を一定（５〜１０℃）にし、ｐＨを一定（ｐＨ＝１１．５〜１２．０）にした状態で滴下して加えた。１５８．１ｇのＺ−Ｃｌおよび、さらに２５１．２ｇの４Ｎ−ＮａＯＨを、一体に加えた。反応混合物の撹拌性をよく保つために、１５０mlの蒸留水を追加的に加えた。濃塩酸（７６ml）を用いて、混合物をｐＨ＝２．４に酸性化し、全部で５８４mlの酢酸ブチルで抽出した。有機層に含有されているＮ−Ｚ−ＤＬ −プロリンを、実施例６の方法と同様にして結晶化した。このようにして、１８７．４ｇのＮ−Ｚ−DL−プロリン（理論値の８６．５％）を得た。実施例８Ｎ−Ｚ−（ＤＬ）−プロリンの製造（ワンポット反応）８０．０ｇのＬ−プロリンを、１７４mlの４Ｎ−ＮａＯＨに溶解し、この溶液を、圧力容器の中で１６０℃に加熱した。この温度を６時間保ったところ、最高４．４気圧の圧力が生じた。溶液を冷却した後、比旋光度（〔α〕⁵＝−０．６）にもとづいて、ほとんど完全なラセミ化が認められた。ついで、ベンジルクロロホルメート（Ｚ−Ｃｌ）を、温度を一定（４℃）、ｐＨを一定（ｐＨ＝１１．５〜１２．０）にした状態で、滴下して加えた。全体で１２４．５ｇのＺ−Ｃｌおよび、さらに２０３．７ｇの４Ｎ−ＮａＯＨを加え、それとともに、反応混合物の撹拌性を保証するために、５０mlの蒸留水を加えた。混合物は、ついで４．７ｇの濃塩酸を添加して中和した。２００mlの酢酸ブチルを添加したのち、水層のｐＨを、６７．４ｇの濃塩酸の添加により、最終的に２．０に調整した。水層を分離し、もう一度、全部で２００mlの酢酸ブチルで抽出した。有機層を一体にし、Ｎ−Ｚ−ＤＬ−プロリンを、実施例６の方法と同様にして結晶化した。このようにして、１５１．３ｇのＮ−Ｚ−ＤＬ−プロリン（理論値の８７．３％）が得られた。実施例９アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５のＮ−アシル−Ｌ−プロリンアシラーゼの特徴付けａ）Ｎ−アシル−Ｌ−プロリンアシラーゼの最適ｐＨアースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５を、表１に記載の培地中で、フラクトース（５ｇ／ｌ）およびＮ−Ｚ−Ｌ−プロリン（５ｇ／ｌ）をＣまたはＮ源として増殖させた（３０℃，１２０rpm）。所望の細胞密度に達した後、細胞を遠心分離によって収穫し、塩化ナトリウム溶液（０．９％）中で洗浄し、最終的にはこの溶液に再度懸濁させた。ｐＨを関数とする酵素活性を、その他のパラメターはすべて一定に保って（３０℃，Ｎ−Ｚ−Ｌ−プロリン５０ｇ／ｌ，ＯＤ₆₅₀＝１５〜２０）測定した。１００％値として、ｐＨ＝７．０のときのバッチの結果を採用した。第２図アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５のＮ−アシル−Ｌ−プロリンアシラーゼの、ｐＨの関数としての活性ここでは、ｐＨ＝６．４〜６．６の範囲内に最適値をもつ、典型的な最適値曲線が得られた。ｐＨ＝５．０およびｐＨ＝８．５においては、酵素活性はもはや測定できなかった。ｂ）アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５によるＮ−アシル−Ｌ−プロリンアシラーゼの、温度の関数としての活性Ｎ−アシル−Ｌ−プロリンアシラーゼ活性を有する細胞を、９ａ）に記載のようにして製造した。今回は、酵素活性を、温度を変化させて測定した。その他のパラメーターは、一定に保った（ｐＨ６．５，Ｎ−Ｚ−Ｌ−プロリン５０ｇ／ｌ，ＯＤ₆₅₀〜２０−２５）。１００％値としては、３０℃におけるバッチの結果を採用した。第３図アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５のＮ−アシル−Ｌ−プロリンアシラーゼの、温度の関数としての活性酵素活性は、わずかにＳ字形をした曲線に沿って増大する。５０℃においてすら、なお良好な活性が検出され、このことは、酵素の良好な安定性を示している。ｃ）アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５によるＮ−アシル−Ｌ−プロリンアシラーゼの、温度の関数としての活性Ｎ−Ｚ−Ｌ−プロリンアシラーゼ活性を有する細胞を、９ａ）に記載のようにして製造した。酵素の活性を測定するため、細胞懸濁液のアリコート（撹拌下、ｐＨ＝６．５，ＯＤ₆₅₀〜４０−５０）を種々の温度で培養し、標準条件（ｐＨ６．５，Ｎ−Ｚ−Ｌ−プロリン５０ｇ／ｌ，ＯＤ₆₅₀〜１５−２０）下に残りのＮ−アシル−Ｌ−プロリンアシラーゼの活性を分析したサンプルを、時間を変えて採取した。下記の結果が観察された。・４３℃までは、少なくとも６時間にわたって、十分な活性が検出可能であった。・４３℃から５３℃までの温度においては、最初は活性の増大すら見られた。ついでわずかな活性の低下が見られたが、５ないし６時間後には、当初の活性の約８０％が残っていた。・より高い温度は、酵素の活性の低下をもたらした（６０℃においては２時間後の残留活性５０％、６５℃においては１時間後に完全な不活性化）。ｄ）アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５によるＮ−アシル−Ｌ−プロリンアシラーゼの活性に対する生成物の与える障害Ｎ−Ｚ−Ｌ−プロリンアシラーゼ活性を有するＨＳＺ５の細胞を、９ａ）に記載のようにして製造した。細胞懸濁液のアリコートを、３０分間（３０℃，ｐＨ＝６．４）、Ｎ−Ｚ−Ｌ−プロリンの加水分解により得られた生成物（Ｌ−プロリン、Ｎ−Ｚ−Ｄ−プロリン、ベンジルアルコール）の種々の濃度において培養したのち、それぞれのバッチの酵素活性を標準条件（３０℃，ｐＨ６．５，Ｎ− Ｚ−Ｌ−プロリン５０ｇ／ｌ，ＯＤ₆₅₀〜１５−２０）下に測定した。１００％値としては、各バッチに生成物のいずれかを添加しないで培養したもの結果を採用した。第４図アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５のＮ−アシル−Ｌ−プロリンアシラーゼの、生成物濃度の関数としての活性これから、Ｌ−プロリンもまた、高い濃度においてさえ、酵素活性に対する障害をまったく引き起こさないことがわかる。Ｎ−Ｚ−Ｄ−プロリンおよびベンジルアルコールは、これに反して、濃度が高くなると、酵素活性の劇的な低下に至る。Ｎ−Ｚ−Ｄ−プロリンは、競合的な阻害剤（濃度の上昇につれて直線的に増大する障害）として作用するようであるが、ベンジルアルコールはむしろ、非競合的な様相（しきい値を超える濃度で活性を示す）で阻害作用をするようである。実施例１０種々の菌株のＮ−アシル−Ｌ−プロリンアシラーゼに関する基質スペクトラムａ）種々のＮ−保護されたアミノ酸を唯一のＮ源として利用する増殖アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５、アルカリゲネス・キシロソキシダンスｓｓｐ．デニトリフィカンスＨＳＺ１７、アグロバクテリウム／リゾビウムＨＳＺ３０、バチルス・シンプレックスＫ２、アルカリゲネス・ピエカウディイＫ４およびシュードモナス・プチダＫ３２を、表１に記載の培地中で、フラクトース（５ｇ／ｌ）をＣ源として使用し、増殖させた（３０℃，１２０rpm）。Ｎ源（５ｇ／ｌ）としては、どの場合も、種々のＮ−保護されたアミノ酸を添加した。細胞密度ＯＤ₆₅₀＞０．５に達したところで、バッチを試験したところ陽性であった。第３表唯一の窒素源としての種々のＮ−保護されたアミノ酸を使用したときの、種々の菌株の成長ｂ）種々のＮ−保護されたアミノ酸の酵素による加水分解アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５、アルカリゲネス・キシロソキシダンスｓｓｐ．デニトリフィカンスＨＳＺ１７、アグロバクテリウム／リゾビウムＨＳＺ３０、バチルス・シンプレックスＫ２、アルカリゲネス・ピエカウディイＫ４およびシュードモナス・プチダＫ３２を、表１に記載の培地中で、フラクトース（５ｇ／ｌ）およびＮ−Ｚ−Ｌ−プロリン（５ｇ／ｌ）をＣ源およびＮ源として使用し、増殖させた（３０℃，１２０rpm)。所望の細胞密度に達した後、細胞を遠心分離によって収穫し、塩化ナトリウム溶液（０．９％）中で洗浄した。すべての菌株について、所望の酵素活性が得られたことを試験した後、細胞を１００ｍＭのリン酸カリウムの緩衝溶液（ｐＨ７．０）中に再度懸濁させた。種々のＮ−保護されたアミノ酸を添加した後（最終濃度１００ｍＭ）、バッチを３０℃ において振とう下に培養して、サンプルを適宜の時間間隔で採取した。これらのサンプルを分析して、使用した基質の加水分解性能を調べた。第４表種々のＮ−保護されたアミノ酸の、種々のＮ−アシル−Ｌ−プロリンアシラーゼ含有菌株の全細胞による酵素的加水分解

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:06） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者シュミットハルター，ディエゴスイス国グリスＣＨ―3902 トラヴェク 20 (72)発明者プファッフェン，ガブリエラスイス国ヴィスプＣＨ―3930 レルヒェンヴェク１ (72)発明者ヴァーヴィツキィ，オレグスイス国ヴィスプＣＨ―3930 タービナーシュトラーセ 12

Claims

【特許請求の範囲】１．下記の一般式のＮ−保護されたプロリン誘導体 [式中、Ｒ¹は−（ＣＨ₂）₂−ＣＯＯＨ、いずれも場合によっては置換されている、Ｃ₁〜Ｃ₄アルコキシ、アリールまたはアリロキシであり、Ｒ²は水素であるかまたは＝０である。] のラセミ体またはその光学異性体の一方を、唯一の炭素源、唯一の窒素源または唯一の炭素源および窒素源として資化することができることを特徴とする微生物。２．一般式ＩのＮ−保護されたＬ−プロリン誘導体を唯一の窒素源、唯一の炭素源、または唯一の窒素源および唯一の炭素源として資化することのできる請求の範囲第１項の微生物。３．アースロバクター属、アグロバクテリウム／リゾビウム属、バチルス属、シュードモナス属またはアルカリゲネス属に属する請求の範囲第１項または第２項の微生物。４．アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５（ＤＳＭ１０３２８）、アルカリゲネス・キシロソキシダンスｓｓｐ．デニトリフィカンスＨＳＺ１７（ＤＳＭ１０３２９）、アグロバクテリウム／リゾビウムＨＳＺ３０、バチルス・シンプレックスＫ２、シュードモナス・プチダＫ３２またはアルカリゲネス・ピエカウディイＫ４、およびその機能的に等価な変異種およびに属する請求の範囲第１項または第２項の微生物。５．下記の特性を有することを特徴とするＮ−アシル−Ｌ−プロリンアシラーゼ：ａ）基質の特異性：Ｎ−ベンジロキシカルボニル−Ｌ−プロリンＮ−ベンジロキシ−Ｌ−プロリンＮ−イソブトキシカルボニル−Ｌ−プロリンＮ−ベンジロキシカルボニル−Ｌ−ピログルタメートＮ−ベンジロキシカルボニル−ＤＬ−ピペコリン酸Ｎ−ベンジロキシカルボニル−Ｌ−アラニンが加水分解されることｂ）最適ｐＨ最適ｐＨはｐＨ６．５±０．２ｃ）温度安定性４３℃でｐＨ６．５において、６時間培養後に活性の低下が認められないことｄ）温度活性５０℃でｐＨ６．５において、良好な活性が認められることｅ）阻害剤の効果ベンジルアルコールおよびＮ−ベンジロキシカルボニル−Ｄ−プロリンが阻害作用をする。６．下記の一般式IIの、Ｎ−保護された環状Ｄ−アミノ酸誘導体および（または）下記の一般式IIIの、環状Ｌ−アミノ酸誘導体 [式中、Ａは−Ｎ−および−ＣＨとともに、場合によっては置換されている４，５または６員の飽和複素環であり、Ｒ³は−（ＣＨ₂）₂−ＣＯＯＨ、場合によっては置換されているアルキル、アルコキシ、アリールまたはアリロキシである。]の製造方法であって、一般式[式中、Ａは−Ｎ−および−ＣＨとともに上記した意味を有し、Ｒ³も上記した意味を有する。] のＮ−保護された環状Ｌ−アミノ酸誘導体を、請求の範囲第１項ないし第４項の微生物を利用して、または請求の範囲第５項の細胞を含まない酵素を使用して、環状のＬ−アミノ酸誘導体（式III）に転化し、場合によってはこれを単離し、バイオ転換において、環状Ｌ−アミノ酸誘導体に加えて、Ｎ−保護された環状Ｄ −アミノ酸誘導体（式II）を取得し、場合によってはこれを単離することを特徴とする製造方法。７．下記の一般式ｖの、Ｎ−保護された脂肪族Ｄ−アミノ酸誘導体および（または）下記の一般式VIの、脂肪族Ｌ−アミノ酸誘導体 [式中、Ｒ³は上記した意味を有し、Ｒ⁴は水素、場合によっては置換されている分岐のないアルキル基、またはω−ヒドロキシアルキル基であり、Ｒ⁵は水素または場合によっては置換されている分岐のないアルキル基である。] の製造方法であって、一般式 [式中、Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵は上記した意味を有する。] のＮ−保護された脂肪族アミノ酸誘導体のラセミ体の中で、Ｎ−保護された脂肪族アミノ酸誘導体を、請求の範囲第１項ないし第４項の微生物を利用して、または請求の範囲第５項の細胞を含まない酵素を使用して、脂肪族のＬ−アミノ酸誘導体（式VI）に転化し、場合によってはこれを単離し、バイオ転換において、脂肪族Ｌ−アミノ酸誘導体に加えて、Ｎ−保護された脂肪族Ｄ−アミノ酸誘導体（式Ｖ）を取得し、場合によってはこれを単離することを特徴とする製造方法。８．バイオ変換を、アースロバクター属、アグロバクテリウム／リゾビウム属、バチルス属、シュードモナス属またはアルカリゲネス属の微生物を利用して実施することを特徴とする請求の範囲第６項または第７項の製造方法。９．下記の一般式のＮ−保護された環状Ｄ−アミノ酸誘導体 [式中、Ａは−Ｎ−および−ＣＨとともに、場合によっては置換されている４，５または６員の飽和複素環であり、Ｒ³は−（ＣＨ₂）₂−ＣＯＯＨ、場合によっては置換されているアルキル、アルコキシ、アリールまたはアリロキシである。 ]の製造方法であって、一般式 [式中、Ａは−Ｎ−および−ＣＨとともに上記した意味を有する。] の環状Ｌ−アミノ酸誘導体をラセミ化して対応する環状アミノ酸誘導体とし、これを、一般式のＮ−保護された環状のアミノ酸誘導体（式III）に転化し、場合によってはこれを単離し、バイオ転換において、環状Ｌ−アミノ酸誘導体に加えて、Ｎ−保護された環状Ｄ−アミノ酸誘導体（式II）を取得し、場合によってはこれを単離することを特徴とする製造方法。１０．下記の一般式の、Ｎ−保護された脂肪族Ｄ−アミノ酸誘導体 [Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵は上記した意味を有する。] の製造方法であって、一般式 [Ｒ⁴は上記した意味を有する。] の脂肪族アミノ酸誘導体をラセミ化して対応する脂肪族アミノ酸誘導体とし、これを一般式 [Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵は上記した意味を有する。] のＮ−保護された脂肪族アミノ酸誘導体に転化し、この脂肪族アミノ酸誘導体を、請求の範囲第１項ないし第４項の微生物を利用して、または請求の範囲第５項の細胞を含まない酵素を使用して、脂肪族のＬ−アミノ酸誘導体に転化し、場合によってはこれを単離し、バイオ転換において、脂肪族Ｌ−アミノ酸誘導体に加えて、Ｎ−保護された脂肪族Ｄ−アミノ酸誘導体（式Ｖ）を取得し、これを単離することを特徴とする製造方法。１１．反応を水系媒体中で行ない、アミノ酸誘導体のラセミ体を単離することなく実施する請求の範囲第９項または第１０項の製造方法。