JP2000507085A

JP2000507085A - 上皮膜タンパク質―１

Info

Publication number: JP2000507085A
Application number: JP9519956A
Authority: JP
Inventors: タイラー，フエルドン; ウエルシヤー，アンドリユー・エイ; ズーター，ウエリ
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド; エー・テー・ハー―チユーリヒ
Priority date: 1995-11-23
Filing date: 1996-11-22
Publication date: 2000-06-13
Also published as: AU722990B2; MX9803967A; GR3036770T3; EP0862629B1; EP0862629A1; DK0862629T3; DE69614271T2; WO1997019171A1; ES2160846T3; AU1082197A; ATE203765T1; DE69614271D1; CA2236162A1; PT862629E

Abstract

(57)【要約】上皮膜タンパク質−１（ＥＭＰ−１）は末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）と高い相同性をもつことが確認され、消化管及び神経系で主に発現された。ＥＭＰ−１とＰＭＰ２２は細胞増殖及び／又は分化の調節に関与する膜貫通タンパク質の新規ファミリーを規定する。本発明はＥＭＰ−１核酸と、ＥＭＰ−１の組換え製造のための発現ベクター及び宿主細胞を含む。核酸は生物サンプル中のＥＭＰ−１突然変異を検出し、アンチセンス又は遺伝子治療によりＥＭＰ−１関連症状を治療するために使用される。ＥＭＰ−１を発現する宿主細胞はＥＭＰ−１リガンドとレセプターアゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングするために使用される。

Description

【発明の詳細な説明】上皮膜タンパク質−１発明の技術分野本発明は標的細胞の増殖及び／又は分化を調節するようにシグナル伝達に作用する膜貫通タンパク質に関する。より詳細には、本発明は上皮膜タンパク質−１（ＥＭＰ−１）、ＥＭＰ−１の組換え製造、並びにＥＭＰ−１の活性及び発現を調節するための方法及び試薬に関する。発明の背景細胞増殖及び分化に関与するメカニズムの解明は、ヒト疾病の原因を突き止め、その治療法を提供するのに有用であると考えられる。ある研究分野はシグナル伝達に作用する細胞表面レセプターの同定を主眼としている。細胞表面レセプターは細胞の外側環境から細胞内分子へと刺激を送り、細胞生理に変化をもたらす膜貫通タンパク質である。この生理変化は一般に細胞の増殖又は分化状態に関連する変化である。構造的及び機能的に関連するメンバーから構成される多数のレセプターファミリーが同定されている（ＶａｎｄｅｒＧｅｅｒら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１０，２５１−３３７（１９９４）参照）。一般に、細胞表面レセプターはリガンドと相互作用して細胞内部にシグナルを伝達する。リガンドは通常はポリペプチドであり、一般にレセプターのコンホメーション変化を誘導し、シグナル伝達プロセスを開始する。このプロセスはレセプター活性化と呼ばれ、（レセプターの同異を問わず）レセプターオリゴマー化やレセプターチロシンリン酸化等の事象に関与すると考えられる。従来研究されているポリペプチドリガンドは単一レセプターと優先的に相互作用するが、所与のリガンドがあるレセプターファミリー内の１種以上の他のメンバーと結合してこれを活性化することもあり得る。ＤＮＡを迅速に単離及び配列決定する技術は、レセプターとその同系リガンドの研究に拍車をかけている。特に、ｃＤＮＡライブラリーのランダムシーケンシングにより発現配列タグ（ＥＳＴ）を生成する技術と、新規に得られたＥＳＴを配列データベース中の核酸配列と比較するコンピューター解析法の併用により、今日では高い相同度をもつ配列を迅速に同定することが可能である。今日では、新規配列（完全又は部分）を関連配列のファミリーに迅速に割り当て、こうしてこの配列によりコードされるタンパク質の１種以上の予想機能を推定することが可能である。更に、関連配列のファミリーにおける核酸又はアミノ酸配列の高度に保存された領域を知ることにより、関連分子のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのオリゴヌクレオチドプローブを設計することができる。単一ファミリーのレセプター又はリガンドの関連メンバーの同定は、このファミリーの構造及び機能を解明するのに有用である。あるファミリーの関連メンバーからレセプターファミリーメンバーの役割、その同系リガンド及び細胞生理における補助タンパク質を解明するこどができる。この情報は、レセプター及び／又はリガンド機能の刺激又は遮断に基づく治療法の開発に役立つ。本発明の目的は、レセプター又はその同系リガンドをコードする配列を同定することである。本発明の別の目的は、新規レセプター又はリガンド配列と既存の配列の構造／機能関係を解明することである。末梢ミエリンタンパク質−２２（ＰＭＰ２２）に構造的に関連し、ＰＭＰ２２と共に新規レセプターファミリーを規定する核酸配列が発見された。ＰＭＰ２２即ち末梢ミエリンタンパク質２２は主にシュワン細胞で発現産物として従来同定されている膜貫通タンパク質である（Ｗｅｌｃｈｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８，７１９５−７１９９（１９９１）；Ｓｐｒｅｙｅｒら，ＥＭＢＪ．１０，３６６１−３６６８（１９９１））。ＰＭＰ２２における点突然変異もしくは遺伝子再構成又は対応する遺伝子の異常発現は末梢神経系（ＰＮＳ）の運動及び感覚神経障害を誘発する（Ｓｕｔｅｒら，ＴＩＮＳ１６，５０−５６（１９９３））。ＰＭＰ２２遺伝子の改変に関連するヒト疾患としては、１Ａ型シャルコー−マリー−ツース病やデジェリン−ソッタス症候群等の種々の神経障害が挙げられる（Ｍａｔｓｕｎａｍｉら，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．１，１７６−１７９（１９９２）；Ｐａｔｅｌら，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．１，１５９−１６５（１９９２）；Ｒｏａら，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．５，２６９−２７２（１９９３））。更に、ＰＭＰ２２は細胞培養において増殖停止条件下でアップレギュレートされることが認められ、細胞増殖におけるＰＭＰ２２の役割を示唆していた。他方、公知ＰＭＰ２２突然変異体のうちでＰＮＳで認められる以外の表現型を示すものは皆無であり、非神経組織では関連分子が機能的ＰＭＰ２２の欠損を補っていると考えられた。更に、ＰＭＰ２２のアミノ酸配列と他の公知タンパク質の間に有意な相同性は認められていなかった。ＰＭＰ２２とＰＮＳ障害におけるその関与については、参考資料として本明細書の一部とするＰＣＴ出願第９２／２１６９４号に記載されている。ＰＭＰ２２関連分子の同定により、その表面にＰＭＰ２２関連分子をもち、ＰＭＰ２２関連分子により認識される外部刺激に応答する組織の増殖及び／又は分化の調節に基づく潜在的治療法が提供される。ＰＭＰ２２関連分子の同定により、細胞増殖及び／又は分化の制御のための化合物を設計できる。発明の要約本発明は、ＰＭＰ２２に有意配列相同性をもち、ＰＭＰ２２と共に新規レセプターファミリーを規定する上皮膜タンパク質−１（ＥＭＰ−１）を提供する。ＥＭＰ−１はこのタンパク質が発現される種々の組織の増殖及び／又は分化の制御に関与する。特に、ＥＭＰ−１は神経系、肺及び胃腸管の内壁の上皮細胞で機能し得る。本発明は、ＥＭＰ−１をコードする単離核酸分子を提供する。ＥＭＰ−１は哺乳動物に由来することが好ましく、例えばマウス、ラット又はヒトに由来してよい。核酸は、天然変異体でもよいし、ＥＭＰ−１核酸配列のｉｎｖｉｔｒｏ突然変異誘発により構築した変異体でもよい。本発明は、ＥＭＰ− １を発現することが可能な発現系を含むＤＮＡ分子と、該ＤＮＡで修飾された宿主細胞も包含する。好ましくは、修飾宿主細胞は細胞表面にＥＭＰ−１を発現する。核酸はＥＭＰ−１に関連する疾患やＥＭＰ−１発現細胞に関連する疾患の治療のための遺伝子治療又はアンチセンス治療にも使用することができる。本発明は、ＥＭＰ−１を発現する宿主細胞の製造方法も提供する。このような宿主細胞はＥＭＰ−１のアゴニスト又はアンタゴニスト及びＥＭＰ−１と相互作用するタンパク質をスクリーニングするために使用することができる。図面の説明図１：ラットＥＭＰ−１のｃＤＮＡ及び予想アミノ酸配列。ラットＥＭＰ−１ｃＤＮＡクローンはヌクレオチド１３２位のＡＴＧコドンから開始して６１２位のＴＡＡ停止コドンで終結する４８０塩基対のオープンリーディングフレームを含む。アミノ酸残基１〜１６に潜在的切断可能シグナルペプチドが存在する。アスパラギン４３の第１及び第２疎水性領域の間に推定Ｎ結合グリコシル化用単一モチーフが存在する。図２：マウスＥＭＰ−１のｃＤＮＡ及び予想アミノ酸配列。マウスｃＤＮＡクローンはヌクレオチド１８３位のＡＴＧコドンから開始して６６３位のＴＡＡコドンで終結する４８０塩基対のオープンリーディングフレームを含む。アミノ酸残基１〜１６に潜在的切断可能シグナルペプチドが存在する。潜在的Ｎ結合グリコシル化部位はラット配列から保存されている。図３：ヒトＥＭＰ−１のｃＤＮＡ及び予想アミノ酸配列。ヒトｃＤＮＡクローンはヌクレオチド８位のＡＴＧコドンから開始して４７９位のＴＡＡ停止コドンで終結する４７１塩基対のオープンリーディングフレームを含む。潜在的シグナルペプチドは残基１〜１６に存在する。潜在的Ｎ結合グリコシル化部位はラット及びマウス配列から保存されている。図４：予想ＥＭＰ−１構造とＰＭＰ２２／ＥＭＰファミリーメンバーのアミノ酸配列比較。Ａ：ラットＥＭＰ−１とラット、マウス及びヒトＰＭＰ２２の予想アミノ酸配列の比較。Ｂ：コンピューター支援疎水性プロット及び二次構造予想に基づく脂質二重層中のＥＭＰ−１のハイポセティカルトポロジー。ラットＰＭＰ２２と同一の残基は白抜きで示す。遺伝性末梢神経障害を誘発することが分かっているＰＭＰ２２の点突然変異（菱形で示す）の大部分はＥＭＰ−１の対応位置で保存されている。Ｙ字記号は潜在的Ｎ結合炭水化物鎖を示す。Ｃ：３種の公知ＰＭＰ２２／ＥＭＰ／ＭＰ２０ファミリーメンバーのアミノ酸比較。残基は逆転型に示すようにＭＰ２０とＰＭＰ２２又はＥＭＰ−１の間で保存されていた。図５：ＥＭＰ−１及びＰＭＰ２２ｃＤＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ転写及び翻訳。［３５ｓ］メチオニン代謝性標識タンパク質を還元用１５％ＳＤＳＰＡＧＥにより分離した。ｐｃＤＮＡ−１を対照として使用すると、特異的タンパク質を検出することはできなかった。ＥＭＰ−１ｃＤＮＡはクラスターを形成する１８ｋＤａタンパク質を生じた（ＥＭＰ−１）。ＣＭＭの存在下でＥＭＰ−１ｃＤＮＡを転写及び翻訳すると、タンパク質（ＥＭＰ−１＋ＣＭＭ）の移動速度は低下する。この移動低下はＮ−グリコシダーゼＦで脱グリコシル化することにより逆転する（脱グリコシル化ＥＭＰ−１）。ＣＭＭの存在下で反応を実施すると（ＰＭＰ２２＋ＣＭＭ）、ＰＭＰ２２ｃＤＮＡは１８ｋＤａよりも４〜６ｋＤａ高い見かけ分子量をもつタンパク質を生じる。Ｎ−グリコシダーゼＦで処理すると、分子量は１８ｋＤａに戻った（脱グリコシル化ＰＭＰ２２）。非グリコシル化翻訳産物（ＥＭＰ−１、ＰＭＰ２２）と脱グリコシル化翻訳産物（ＥＭＰ−１＋ＣＭＭ、ＰＭＰ２２＋ＣＭＭ）の移動速度が同一であることから、ＥＭＰ−１もＰＭＰ２２もシグナルペプチダーゼのｉｎｖｉｔｒｏ基質ではないと思われる。プロラクチン（ａ）はシグナルペプチダーゼの基質であり、タンパク質をＣＭＭの存在下で翻訳すると、約５０％がプロセシングされる（ｃ）（ＰｒｏｍｅｇａＴｅｃｈｎｉｃａｌｍａｎｕａｌ，ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。α因子をＮ結合グリコシル化の対照として使用すると、反応物で完全に修飾された（ｂ）（ＰｒｏｍｅｇａＴｅｃｈｎｉｃａｌｍａｎｕａｌ）。図６：ラットにおけるＥＭＰ−１及びＰＭＰ２２ｍＲＮＡの組織分布。放射性標識ＥＭＰ−１プローブを用いたノーザンブロット分析は、盲嚢、結腸、直腸、胃底及び回腸で２．８ｋｂ転写産物の高い発現を示す（ａ）。小腸の十二指腸及び空腸と胃体と幽門ではより低レベルの発現が観察される（ａ）。胃底、回腸、盲嚢及び結腸では１．７ｋｂの付加的転写産物が検出される（ａ）。腸外組織では、ＥＭＰ−１ｍＲＮＡレベルは皮膚で高いが、脳と肺の発現は十二指腸と同等である（ｂ；パネルａ及びｃは２０時間暴露、ｂ及びｄは同一ブロットの４８時間暴露である）。ＰＭＰ２２ｍＲＮＡも腸で高度に発現され（ｃ）、その１．８ｋｂ転写産物は直腸と盲嚢で最も顕著であり、その発現は肺におけるＰＭＰ２２の発現と同等である（ｃ、ｄ）。各レーン１０μｇの全ＲＮＡをロードし、臭化エチジウム染色により均一ローディングを確認した。図７：座骨神経損傷及び培養細胞におけるＥＭＰ−１及びＰＭＰ２２ｍＲＮＡ発現の調節。Ａ：ＥＭＰ−１ｍＲＮＡのノーザンブロット分析は正常対照神経に比較して損傷座骨神経（神経切断後４日）の変性遠位部分で高い発現を示す。正常神経ではＰＭＰ２２の発現のほうがＥＭＰ−１の発現よりも著しく高い（ＰＭＰ２２プローブによる１時間暴露と、ＥＭＰ−１プローブによる３６時間暴露を比較）。ＥＭＰ−１とは対照的に、ＰＭＰ２２ｍＲＮＡは損傷後に遠位神経で劇的に低下する。Ｂ：培養細胞であるマイトジェンで増殖誘導した一次ラットシュワン細胞（ｐＳＣ）及びＤ６Ｐ２Ｔシュワン細胞はフォルスコリン処理後にＥＭＰ−１発現の低下を示す。他方、ＰＭＰ２２ｍＲＮＡ発現は同一条件下で増加する。Ｃ：ＮＩＨ３Ｔ３細胞の血清飢餓により誘導した増殖停止は、指数増殖期の細胞に比較してＥＭＰ−１ｍＲＮＡ発現の低下とＰＭＰ２２発現の増加をもたらす。ノーザンブロット分析は、同一ブロット（全ＲＮＡ１０μｇ／サンプル）をハイブリダイゼーション間でストリップしながら実施した。図８：ラット腸におけるＥＭＰ−１タンパク質の発現。Ａ：ＥＭＰ−１の推定細胞外ループ１及び２の各々に対する２種のウサギ抗ＥＭＰ−１ペプチド抗血清は胃体で２５ｋＤａタンパク質を認識する（１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングによりタンパク質溶解液５０μｇを分析）。抗ループ１抗血清の免疫反応性は免疫原２５０μｇ／ｍｌと共にプレインキュベートすることにより阻害されるが、ループ２ペプチドでは阻害されない。Ｂ：胃と大腸ではＥＭＰ−１タンパク質の強い発現が認められ、肺ではより低いレベルが存在する。小腸でシグナルを検出するには、酵素検出系の長時間反応が必要である。図９：ＣＯＳ細胞で一過性発現されるＥＭＰ−１の検出。ＣＯＳ細胞にＥＭＰ −１発現構築物を一過性トランスフェクトした後、抗ループ２抗血清とＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇを用いる免疫蛍光により分析した。抗ループ１抗血清を使用しても同一結果が得られた。縮尺線は２０μｍを表す。図１０：胃体におけるＥＭＰ−１タンパク質発現の免疫蛍光局在。ａ）胃粘膜の模式図であり、胃腺の頚／峡部領域における増殖ゾーンと、胃小窩に向かう分化中の上皮細胞の移動を示す。ｂ）ポリクローナル抗ＥＭＰ−１ループ２抗血清で標識し、テキサスレッド標識ロバ抗ウサギ抗体で検出した胃粘膜の低倍率顕微鏡写真。外側粘膜の上皮細胞中に強い免疫反応性を検出することができる。胃小窩基底部側又は粘膜下筋肉層（ｓｍ）には免疫反応性細胞を検出できない。胃粘膜基底部における単離細胞の強い標識は前免疫血清と共にインキュベートした対照切片にも存在する（図示せず）ので特異的ではない。ｃ）小窩領域における標識上皮細胞の高倍率顕微鏡写真。峡部で移動しながら分化している上皮細胞は高レベルのＥＭＰ−１タンパク質を発現する。ｄ）パネルｃに示す領域の透過型顕微鏡写真。ｅ）胃小窩断面は上皮細胞の強い血漿膜関連標識を示すが、間葉の標識は示さない。胃腺の基底部の横断面には染色は検出されない（図示せず）。ｆ）パネルｅに示す断面の透過型顕微鏡写真。縮尺線はｂでは１００μｍ、パネルｃ〜ｆでは６０μｍである。ｓｍは粘膜下筋肉層を表す。発明の詳細な説明ｃＤＮＡライブラリーをランダムに配列決定すると、発現配列タグ（ＥＳＴ）と呼ばれる多数の部分配列を迅速に生成することができる。マウス及びラットｃＤＮＡライブラリーから得られた２種のＥＳＴは、対応するＰＭＰ２２ＤＮＡ配列と有意相同性をもつことが判明した。更に解析すると、上皮膜タンパク質− １（ＥＭＰ−１）と呼ばれるタンパク質の完全長コーディング配列が明らかになった。これらの配列をプローブとして使用し、ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより対応するヒト配列を単離した。コンピューター支援解析の結果、ラット、マウス及びヒトＥＭＰ−１は以下の性質をもつことが予想された。これらのタンパク質は高疎水性であり、４個の膜貫通領域を含むと思われる。ラットＥＭＰ−１の膜貫通領域はアミノ酸残基１〜２８、６４〜８９、９５〜１１７及び１３４〜１５７に存在すると予想される。アミノ酸残基２９〜６３及び１１３〜１３３には２個の推定細胞外領域が存在する。従って、これらのタンパク質は内在膜タンパク質であり、レセプター又はチャネルのいずれかであると考えられる。ＧｅｎＢａｎｋデータベースでこれらのタンパク質と相同を示す唯一の配列はＰＭＰ２２である。ＥＭＰ−１とＰＭＰ２２は４０％のアミノ酸相同性と予想構造の非常に顕著な保存を示す。ＥＭＰ−１種間で比較すると、マウスとヒトのタンパク質は７８％の相同性をもつことが判明した。これらの比較によると、ＰＭＰ２２、ＥＭＰ−１及び従来クローニングされている水晶体膜タンパク質２０（ＭＰ２０）は新規タンパク質ファミリーを規定する。アミノ酸レベルにおける高い相同性は、ＥＭＰ−１とＰＭＰ２２が類似の機能をもつことを示唆するものである。これらのタンパク質のアミノ酸配列を綿密に試験すると、疎水性領域、特に最初の２個の膜貫通領域が高度に保存されており、機能的に特に重要であると思われる。この仮説は、疎水性領域がＰＭＰ２２種相同体間で最も高度に保存された領域であるという知見により更に裏付けられる。興味深いことに、遺伝性末梢神経障害における突然変異部位であるＰＭＰ２２のアミノ酸残基は推定膜貫通領域内に位置し、これらの突然変異アミノ酸残基の大半は同様にＥＭＰ−１とＭＰ２０の対応位置で保存されている。ＥＭＰ−１及びＰＭＰ２２の推定細胞外領域内に保存された特徴は、Ｎ結合グリコシル化のコンセンサス配列である。ＰＭＰ２２におけるこのグリコシル化部位は、その構造が細胞−細胞認識及び接着プロセスに関係があるとされているＬ２／ＨＮＫ−１エピトープを含む修飾炭水化物鎖をもつ（最近の研究論文では、Ｓｃｈａｃｈｎｅｒら，ＴＩＮＳ１８，１８３−１９１（１９９５）参照）。ＥＭＰ−１に結合した炭水化物部分の存在及び種類は不明であるが、ＥＭＰ−１の同一位置におけるＮ結合グリコシル化は腸の上皮における細胞認識プロセスに関与しているらしい。ＥＭＰ−１及びＰＭＰ２２の発現ラットＥＭＰ−１及びラットＰＭＰ２２のｍＲＮＡの組織分布を図６に示す。ＥＭＰ−１ｍＲＮＡは盲嚢、結腸、回腸、空腸、結腸陰窩（colonic crypts）、十二指腸及び胃を含む成熟消化器系で高度に発現される。より低レベルであるが、皮膚、心臓、脳、胸腺、肺及び腎臓を含む大部分の他の組織にも発現が見られる。消化器系における発現はＰＭＰ２２と同様である。ＥＭＰ−１ｍＲＮＡは末梢神経で発現されるが、その発現レベルはＰＭＰ２２よりも著しく低い。ＥＭＰ−１ｍＲＮＡはＰＭＰ２２よりも広い範囲の組織で発現される。ＥＭＰ−１ｍＲＮＡは心臓、脳、肺、筋肉、腎臓、結腸及び小腸等の大部分の試験ヒト成熟組織で検出された。ＥＭＰ−１及びＰＭＰ２２発現の調節を数種の異なる系で試験した。切断後もシュワン細胞が引き続き分裂している座骨神経でＥＭＰ−１ｍＲＮＡは増加するが、ＰＭＰ２２は減少する。シュワン細胞（一次細胞と細胞系の両者）では、ＥＭＰ−１ｍＲＮＡはフォルスコリン処理後にダウンレギュレートされるが、ＰＭＰ２２は増加する。繊維芽細胞では、ＥＭＰ−１ｍＲＮＡは迅速に分裂している細胞に関連するが、ＰＭＰ２２は増殖停止（非分裂）細胞に関連する。全体として、これらの３種のノーザンブロットはＥＭＰ−１ｍＲＮＡ発現と活発に分裂している細胞の相関を立証し、ＥＭＰ−１タンパク質が正常細胞分裂に必要であることを示唆している。ＣＯＳ細胞における組換えラットＥＭＰ−１タンパク質の発現を図９に示す。組換えヒトＥＭＰ−１は実施例６に記載するように発現させることができる。ＥＭＰ−１タンパク質はｍＲＮＡを合成しているラット組織、特に消化器系の組織で発現される。消化器系において、ＥＭＰ−１タンパク質は上皮細胞で発現されることがわかっている。ＥＭＰ−１とＰＭＰ２２の顕著な相同性はＥＭＰ−１に予想される機能を示唆するものである。発明の背景の項に記載したように、ＰＭＰ２２の突然変異は、発現細胞の増殖状態の改変即ち細胞が不適切な時期に分裂したり、あるいは分裂できないことにその大半が起因すると考えられる数種の重要なヒト疾患を誘発する。ＥＭＰ−１は細胞の増殖状態の制御にも関与していると考えられる。ＥＭＰ −１は多様な組織で発現されるので、ＥＭＰ−１の突然変異又はＥＭＰ−１の発現の変化は多様な組織の異常増殖／分化に関連していると予想される。胃腸管における高レベルのＥＭＰ−１発現は、この領域での細胞の増殖及び分化におけるＥＭＰ−１の役割を示唆している。胃腸管は動物寿命を通して続けられるその上皮表面の絶え間ない迅速な再生により特徴付けられる。胃腺の峡部／頚領域に固定された多能性幹細胞は増殖の増加と潜在性の低下を示す子孫をもたらし、末端分化成熟細胞となる（Ｇｏｒｄｏｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．６，７９５−８０３（１９９４））。この分化プロセス中に、細胞は高度に移動性であり、増殖、移動及び分化は全て緊密に連携している。ＥＭＰ−１は主に外側胃腺の増殖分化ゾーンと胃小窩領域の成熟上皮細胞に存在する。これらの細胞において、ＥＭＰ−１は血漿膜に関連すると思われ、基底部、先端部及び側面部の間に明白な区別はない。ＥＭＰ−１核酸本発明はＥＭＰ−１をコードする単離核酸分子を提供する。これらの分子は、予想寸法の組換えタンパク質の生成と内因性タンパク質に類似の翻訳後修飾から明らかなように、ＥＭＰ−１をコードする配列を含む。ＥＭＰ−１は哺乳動物に由来することが好ましく、夫々図１、２及び３（配列番号１、３及び５）に示すようなラット、マウス又はヒトＥＭＰ−１であり得る。ＥＭＰ−１核酸は具体的に開示する配列の変異体でもよく、変異体は天然対立遺伝子変異体でもよいし、組換えＤＮＡ技術により製造した１個以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加変異体でもよい。ＥＭＰ−１生物活性に及ぼす突然変異の効果は、関連ＰＭＰ２２における対応する突然変異に基づいて予想することができる。末梢神経系疾患を誘発するＰＭＰ２２突然変異は、ＥＭＰ−１で高度に保存された膜貫通領域に位置する（図４Ｃ参照）。これらの領域内の突然変異はＥＭＰ−１活性にも影響すると予想される。従って、生物活性を維持するＥＭＰ−１変異体は図４Ｃに示すＰＭＰ／ＥＭＰファミリーメンバーの保存領域の外側に存在する可能性が高い。ＥＭＰ−１核酸は生物サンプル中のＥＭＰ−１遺伝子の構造を試験するために診断試薬として使用することができる。分子と試薬は、ＥＭＰ−１を発現する細胞の異常増殖に起因する癌や、ＥＭＰ−１を発現する細胞が正常生理及び分化状態を維持できなくなることに起因する神経変性疾患等の病理状態を予測又は診断するのに有用なＥＭＰ−１の突然変異又は改変を生物サンプル中で同定するために使用することができる。核酸配列は、種々の病理状態の原因となり得るＥＭＰ −１の突然変異を探索するためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計するためにも使用できる。本発明の方法は、改変ＥＭＰ−１核酸配列をもつ生物サンプルを完全長又は部分ＥＭＰ−１配列と共にインキュベートし、サンプル中のＥＭＰ −１核酸を単離し、突然変異又は改変を同定することを特徴とする。ＥＭＰ−１の異常に最も影響され易い特定組織としては、消化器系、神経系及び肺が挙げられる。ＥＭＰ核酸は、ＰＭＰ２２／ＥＭＰ−１ファミリーのメンバーである関連遺伝子を同定するためにも使用できる。ＥＭＰ／ＰＭＰ２２ファミリーメンバーの保存領域（例えば膜貫通領域）の核酸プローブを作製し、これを使用してハイブリダイゼーション又は関連分子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。本発明の核酸は選択された組織におけるＥＭＰ−１の発現を調節するために遺伝子治療及びアンチセンス治療用試薬として使用することもできる。ＥＭＰ−１発現を増加するには、ＥＭＰ−１をコードする領域を含み、組織特異的にＥＭＰ −１を産生する発現ベクターで組織を修飾すればよい。ＥＭＰ−１遺伝子治療の標的にできる組織としては、消化器系、神経系、肺及び皮膚に関連する組織が挙げられる、遺伝子治療は神経変性疾患、肺病及び胃腸管病等の種々の症状を治療するために使用される。内因性ＥＭＰ−１発現を低下させるには、ＥＭＰ−１をコードする領域の一部又は該部分に作動的に連結した制御領域に対するアンチセンス核酸を使用すればよい。アンチセンス核酸は完全長ＥＭＰ−１遺伝子でもよいし、内因性ＥＭＰ−１遺伝子又は該遺伝子の発現を制御する制御領域にハイブリダイズするそのフラグメントでもよい。アンチセンス治療は、神経変性疾患、癌、肺病及び胃腸管病等のＥＭＰ−１の過剰発現に起因する症状を治療するために使用される。本発明の核酸配列は下記のように組換えＥＭＰ−１を製造するためにも使用される。ＥＭＰ−１の組換え製造本発明は修飾宿主細胞におけるＥＭＰ−１の組換え製造を提供する。本発明は本発明を実施するための材料、即ちＥＭＰ−１をコードする核酸配列、タンパク質を産生するためにＥＭＰ−１配列を含む発現ベクター、及びＥＭＰ−１発現ベクターを宿す修飾宿主細胞を提供する。標準技術を使用してＥＭＰ−１をコードする核酸分子を発現ベクターに挿入し、宿主細胞に導入する。利用可能な発現ベクターは宿主細胞でＥＭＰ−１を発現させることが可能な任意のベクターである。発現ベクターは哺乳動物宿主細胞でＥＭＰ−１を産生することが好ましい。ＥＭＰ−１の発現を助長する条件下で修飾宿主細胞（即ち適当な発現ベクター中にＥＭＰ−１核酸配列を含む細胞）を培養する。本発明の宿主細胞はＥＭＰ−１発現を維持する任意の細胞であり得る。好適態様において、宿主細胞は機能的配置で組換えＥＭＰ−１の膜挿入を可能にする。ＥＭＰ−１の機能的配置とは、活性化可能な分子に接触するとＥＭＰ−１の活性化が生じるように宿主細胞膜に適正に挿入することである。このような配置の１例を図４Ｂに示す。宿主細胞は一般に哺乳動物細胞であると予想される。好ましくは、宿主細胞はＣＯＳ７、ＣＨＯｄ^-、ＮＩＨ３Ｔ３、２９３又は３２Ｄ細胞である。ＥＭＰ−１の組換え製造と宿主細胞上の組換え産物の発現は、候補物質がＥＭＰ−１と結合し、ＥＭＰ−１と複合体を形成して生物学的応答を生じる能力を評価するために有用である。宿主細胞はＥＭＰ−１のリガンドをスクリーニングするために使用される。宿主細胞はＥＭＰ−１のペプチド及び小分子エフェクター並びにＥＭＰ−１と相互作用するタンパク質を同定するためのスクリーニング法でも使用することができる。ＥＭＰ−１アゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニングＥＭＰ−１アゴニストはＥＭＰ−１の生物活性を刺激する物質又は化合物として定義される。ＥＭＰ−１アンタゴニストは刺激化合物の存在下でＥＭＰ−１の生物活性を低下又は阻害する物質又は化合物として定義される。一般に、ＥＭＰ −１アゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニング法は、レセプターと結合して（アゴニストの場合には）レセプター活性化の程度又は（アンタゴニストの場合には）レセプター活性化の低下を測定するのに好ましい条件下でＥＭＰ−１をもつ宿主細胞と候補物質を接触させることにより実施される。ＥＭＰ−１活性化は数種の方法で測定することができる。一般に、ＥＭＰ−１活性化は増殖速度の増加もしくは減少等の細胞生理の変化、分化状態の変化、又はマイクロフィジオメーターで検出可能な細胞代謝の変化により識別できる。抗体実施例４に記載するように、マウス及びラット両者の細胞外領域からのペプチドに対する抗体を作製した。ヒトＥＭＰ−１に対する抗体も同様の方法により作製することができる。本発明は、ＥＭＰ−１を特異的に認識する抗体を提供する。標準免疫学的技術を使用してＥＭＰ−１の細胞外領域に対する抗体を作製する。抗原は膜結合ＥＭＰ−１の無傷の細胞外領域でもよいし、細胞外領域の一部を含む合成ペプチドでもよい。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、ヒト化抗体のように組換えにより製造してもよい。ＥＭＰ−１と相互作用する能力を維持する抗体フラグメントも提供される。このようなフラグメントは完全長分子のタンパク分解切断又は組換えＤＮＡ法により作製される。本発明の抗体は診断及び治療用途で有用である。これらの抗体は生物サンプル、特に組織サンプル中でＥＭＰ−１を検出及び定量するために使用される。アゴニスト又はアンタゴニストとして作用することによりＥＭＰ−１の活性を調節するためにも使用できる。図１（配列番号１）に示すラットＥＭＰ−１ｃＤＮＡ配列はＲｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに所在のＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに1995 年11月28日付けで受託番号97345で寄託された。図２（配列番号３）に示すマウスＥＭＰ−１ｃＤＮＡ配列はＲｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに所在のＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに19 95 年11月28 日付けで受託番号97346で寄託された。図３（配列番号５）に示すヒトＥＭＰ−１ｃＤＮＡ配列を含むベクターλｇｔ１０はＲｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに所在のＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに1995 年11月28日付けで受託番号97347で寄託された。以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、発明の範囲はこれに制限されない。実施例１：ＥＭＰ−１ｃＤＮＡのクローニング及びシーケンシングラット胎児腸ｃＤＮＡシーケンシングプロジェクト中に、４８０ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む１００３塩基対のｃＤＮＡが同定された（図１）。１６０アミノ酸残基の予想ＥＭＰ−１ポリペプチドは約１８ｋＤａの計算分子量をもつ。ＧＣＧソフトウェアパッケージを用いたコンピューター支援解析によると、アミノ酸残基１〜２８、６４〜８９、９５〜１１７及び１３４〜１５７が潜在的に膜貫通性の４個の疎水性領域に相当することが判明した（図４Ｃ）。１６個のアミノ末端アミノ酸はアラニン−１６の後にシグナルペプチダーゼ切断部位を含むシグナルペプチドの特徴をもつ（図１）。更に、Ｎ結合グリコシル化の単一コンセンサス配列がアスパラギン−４３に存在する（図１、図４Ｂ）。実施例２：ＥＭＰ−１及びＰＭＰ２２ＤＮＡ配列の比較ＥＭＰ−１ｃＤＮＡ配列をＧｅｎＢａｎｋデータベースと比較した処、公知配列のうちではＰＭＰ２２が最近縁であり、オープンリーディングフレームに５８％のヌクレオチドと相同性をもつことが確認された。予想ＥＭＰ−１タンパク質とＰＭＰ２２はいずれも１６０アミノ酸のポリペプチドであり、４０％のアミノ酸相同性を示す（図４Ａ）。ＥＭＰ−１とＰＭＰ２２の４個の推定膜貫通領域は特に保存度が高い。これらの疎水性領域のうち第１及び第２の領域は夫々５４％及び６７％の最高アミノ酸相同性を示すが、第３及び第４の領域は３０％及び３７％の相同性に過ぎない。図４ＢはＰＭＰ２２の疎水性プロフィルと指示構造に基づくＥＭＰ−１タンパク質構造の理論モデルを示す。黒丸はラットＥＭＰ−１とラットＰＭＰ２２に共通する同一アミノ酸残基を示し、相違する残基は白丸で示す。突然変異すると遺伝性運動及び感覚神経障害を生じることがわかっているＰＭＰ２２中のアミノ酸の位置(Ｓｕｔｅｒら、Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ３，９５−１０２（１９９４）)をＥＭＰ−１配列中に菱形で強調する（図４Ｂ）。興味深いことに、これらの全突然変異は推定される膜にあるドメイン内に位置し、６残基のうちの５残基はラットＥＭＰ−１で保存されている。これらのアミノ酸残基の保存は、これらの残基が機能的に重要であることを示唆している。ＥＭＰ−１及びＰＭＰ２２配列に関して更にデータベース探索した処、両者は水晶体繊維細胞タンパク質ＭＰ２０（Ｋｕｍａｒら，Ｅｘｐ．ＥｙｅＲｅｓ．５６，３５−４３（１９９３））と３０％のアミノ酸相同性を示すことが判明した。ＭＰ２０はＥＭＰ−１とＰＭＰ２２に類似の構造特徴をもつ１７３アミノ酸タンパク質である（図４Ｃ）。ＭＰ２０をＰＭＰ２２とＥＭＰ−１に同時に比較すると、アミノ酸相同性は推定膜貫通領域の高度に保存されたモチーフを含めて３６％まで増加する（図４Ｃ）。実施例３：ＥＭＰ−１のｉｎｖｉｔｒｏ転写及び翻訳図１に示すＥＭＰ−１ｃＤＮＡとマウスＰＭＰ２２ｃＤＮＡ（Ｓｕｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，４３８２−４３８６（１９９２））の両者をバクテリオファージＴ７プロモーター領域の下流でｐｃＤＮＡ−１発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳アッセイに使用した。Ｔ７ポリメラーゼを用いてＤＮＡ０．５μｇからｍＲＮＡを作製し、網状赤血球溶解液系（ＴＮＴ，Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してイヌミクロソーム膜（ＣＭＭ）の存在下又は不在下でｉｎｖｉｔｒｏ翻訳した。［３５ｓ］メチオニンを反応に用いて翻訳産物を代謝性標識した。ベクターｐｃＤＮＡ−１を対照として使用して反応の特異性を試験した。対照試薬 α因子（グリコシル化）及びプロラクチン（シグナルペプチド切断）を製造業者（ＴＮＴ，Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示に従って使用してＣＭＭの効果を試験した。翻訳産物の１０分の１を１％ＳＤＳで変性させ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１２．５ｍＭＥＤＴＡ、２．５ｍＭアジ化ナトリウム、２５％グリセロール及び０．２％ＳＤＳ中で１単位のＮ−グリコシダーゼＦと共に３７℃ で４時間インキュベートした。還元用１５％ＳＤＳＰＡＧＥによりタンパク質を分離した後、ゲルを５０％メタノール、１０％酢酸で３０分間固定し、エンハンサー（ＮＥＦ−９８１Ｇ，Ｄｕｐｏｎｔ）で処理した。乾燥後、ゲルをＸ線フィルム（ＲＸ，Ｆｕｊｉ）に−７０℃で一晩露光した。イヌミクロソーム膜（ＣＭＭ）の不在下におけるＥＭＰ−１ｃＤＮＡの翻訳産物は、ＥＭＰ−１タンパク質の計算分子量に一致する約１８ｋＤａの見かけ分子量をもつ。ＣＭＭの存在下で翻訳すると分子量は４〜６ｋＤａ増加し、ＥＭＰ− １アミノ酸配列における単一推定Ｎ結合グリコシル化部位の存在に一致する（図５）。この移動シフトは、翻訳産物をＮ−グリコシダーゼＦで脱グリコシル化することにより逆転できる（図５）。脱グリコシル化タンパク質は非グリコシル化ＥＭＰ−１タンパク質と同様に移動するので、推定Ｎ末端シグナルペプチドはＥＭＰ−１タンパク質生合成中に除去されないと考えられる。ＰＭＰ２２にもＣＭＭによる同様の修飾が観察され、内因性ＰＭＰ２２が非切断シグナルペプチドをもつという従来の報告（Ｋｉｔａｍｕｒａら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅ６ｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎＧｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（Ｙａｍａｎａ，Ｔ．ら編）２７３〜２７４頁，Ｊｐｎ．Ｓｃｉ．Ｓｏｃ．Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｋｙｏ（１９８１））を裏付けた。実施例４：ラットＥＭＰ−１に反応性の抗体ＥＭＰ−１の第１及び第２の推定細胞外ループ：の領域に相当する合成ペプチドに対する抗ペプチド抗体を作製した。尚、アミノ酸番号は図１に示すｃＤＮＡ予想ポリペプチドに準じる。ループ１ペプチドには結合の目的でＣ末端システイン残基を付加した。両者ペプチドを従来記載されているようにキーホールリンペットヘモシアニンに結合した（Ｓｎｉｐｅｓら，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１１７，２２５−２３８（１９９２））。結合体を使用してニュージーランドシロウサギに完全フロイントアジュバントと共に免疫し、動物に２週間隔でペプチド５００μｇと不完全アジュバントを４回追加免疫した。動物から採血し、血清を単離した。免疫血清の活性を免疫原で固相ＥＬＩＳＡにより試験した。実施例５：ＥＭＰ−１ｍＲＮＡの発現パターンＡ．ＥＭＰ−１及びＰＭＰ２２ｍＲＮＡの組織分布ラットにおけるＥＭＰ−１ｍＲＮＡの分布を解明するために、ＥＭＰ−１ｃＤＮＡ（図１）を使用して種々の組織から抽出した全ＲＮＡのノーザンブロットをプローブした。ＲＮＡ単離及びノーザンブロット分析は次のように実施した。酸フェノール変法を用いて全ＲＮＡをラット組織から抽出した。要約すると、組織をＧＴ緩衝液中でホモジナイズした（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６−１５９（１９８７））。溶解液を遠心分離し、フェノール／クロロホルム（１：１）で２回抽出した。ＲＮＡを沈殿させ、ピロ炭酸ジエチルで処理したＨ₂Ｏに再懸濁し、ＯＤ２６０／ＯＤ２８０測定により定量した。全ＲＮＡ１０μｇを変性用１．２％アガロースホルムアルデヒドゲルにロードした。分離したＲＮＡを毛管現象によりナイロン膜（ＨｙｂｏｎｄＮ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写し、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で２４０ｍＪの紫外線照射により架橋した。均一ローディング及び膜転写を臭化エチジウム染色により確認した。膜を６時間プレハイブリダイズし、５０％ホルムアミドを含有する溶液中で４２℃で３６時間ハイブリダイズした。完全なオープンリーディングフレームを含むＰＭＰ２２とＥＭＰ−１のｃＤＮＡフラグメントをランダムヘキサマープライミング（Ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｌｉｎｇｋｉｔ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識した。ノーザンブロットを高ストリンジェンシーで洗浄し、Ｘ線フィルム（ＲＸ，Ｆｕｊｉ）に１２〜７２時間露光した。ＥＭＰ−１転写産物は肝臓以外の全試験臓器で検出することができる（図６ａ及びｂ）。最も顕著なＥＭＰ−１ｍＲＮＡ発現は尾からの皮膚と胃腸管で観察される。潜在的特異的局所発現パターンを試験するために、胃腸管の種々の領域からＲＮＡを抽出した。興味深いことに、本発明者らはＥＭＰ−１ｍＲＮＡがラットの胃全体に均一に発現される訳ではないことを知見した。胃底領域は高レベルのＥＭＰ−１ｍＲＮＡを示すが、胃体及び幽門での発現は著しく低い。腸管では、盲嚢と大腸（結腸及び直腸）が最高レベルのＥＭＰ−１ｍＲＮＡを含有する。ＥＭＰ−１転写産物は小腸の全域にも検出できるが、胃底、盲嚢及び大腸より遥かに低レベルである。十二指腸での発現と同様に相当量のＥＭＰ−１ｍＲＮＡが脳と肺でも検出される。心臓、腎臓、脾臓、胸腺及び骨格筋では低レベルのＥＭＰ−１発現が検出可能である。ＥＭＰ−１ｍＲＮＡを発現する全組織は２．８ｋｂＥＭＰ−１転写産物を含む。他方、胃底、回腸、盲嚢及び結腸等の胃腸管の所定領域では、約１．７ｋｂの付加的転写産物がＥＭＰ−１ｃＤＮＡとハイブリダイズする（図６ａ）。ブロットを高ストリンジェンシーで長時間洗浄してもシグナルの相対的な優先的低下は生じなかったため、本発明者らは２．８ｋｂ及び１．７ｋｂ転写産物のいずれもＥＭＰ−１遺伝子に由来するという解釈を支持する。寸法の異なる転写産物を更に検討するならば、これらの転写産物が代替ポリアデニル化部位の使用に起因するのか又は代替スプライシングに起因するのか判明しよう。ＥＭＰ−１でプローブしたノーザンブロットをストリップし、標識ラットＰＭＰ２２ｃＤＮＡで再プローブした（図６ｃ及びｄ）。その結果、ＰＭＰ２２ｍＲＮＡとＥＭＰ−１ｍＲＮＡの組織分布は類似しているが、その相対発現レベルには微妙な差があることがわかった。ＰＭＰ２２及びＥＭＰ−１転写産物は皮膚、胃底、盲嚢、結腸、直腸及び十二指腸で高レベルまで同時に発現される。しかし、ＥＭＰ−１ｍＲＮＡレベルは直腸よりも結腸のほうが高いが、ＰＭＰ２２ｍＲＮＡは低い。更に、ＰＭＰ２２ｍＲＮＡはＥＭＰ−１ｍＲＮＡよりも肺で高レベルで発現されるが、脳では比較的低レベルである（図６）。肝臓ＲＮＡのノーザン分析ではＥＭＰ−１又はＰＭＰ２２転写産物のいずれも検出することができなかった。Ｂ．座骨神経損傷後のＥＭＰ−１及びＰＭＰ２２発現の調節最高レベルのＰＭＰ２２はＰＮＳのミエリン形成中のシュワン細胞で検出され、発現は圧潰又は切断損傷後にラット座骨神経の遠位部分でダウンレギュレートされる（Ｗｅｌｃｈｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８８，７１９５−７１９９（１９９１）；Ｓｐｒｅｙｅｒら，ＥＭＢＯＪ．１０，３６６１−３６６８（１９９１）；Ｓｎｉｐｅｓら，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１１７，２２５−２３８（１９９２）；ＤｅＬｅｏｎら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．２９，４３７−４４８（１９９１））。座骨神経におけるＥＭＰ−１ｍＲＮＡレベルを同一条件下で試験した。雄ＳＩＶラット（８週齢；スイス、チューリッヒ大学）の座骨神経を両側で露出させ、片側を切断した。損傷から４日後に、外傷神経の変性遠位部分と対照として未損傷の反対側の神経を取り出し、全ＲＮＡを単離した。ノーザンブロット分析によると、ＥＭＰ−１転写産物はＰＭＰ２２転写産物よりも著しく低レベルで成熟座骨神経中に存在し、図７ＡはＰＭＰ２２の１時間暴露とＥＭＰ−１の約３６時間暴露を示す。更に、ＥＭＰ−１発現は損傷後に遠位神経で増加し、ＰＭＰ２２とは著しく対照的である（図７Ａ）。以上の知見から明らかなように、ＥＭＰ−１とＰＭＰ２２はＰＮＳ神経で同時に発現されるが、発現の調節は異なると思われる。Ｃ．シュワン細胞におけるｉｎｖｉｔｒｏＥＭＰ−１及びＰＭＰ２２発現の調節マイトジェンで増殖誘導した一次ラットシュワン細胞（ｐＳＣ）とＤ６Ｐ２Ｔシュワン細胞をフォルスコリンの存在下又は不在下で増殖させ、ＥＭＰ−１及びＰＭＰ２２ｍＲＮＡレベルを比較した。フォルスコリンはミエリン形成中に生じる軸索−シュワン細胞相互作用に部分的に類似すると示唆されているメカニズムを通して培養シュワン細胞でＰＭＰ２２及び他のミエリンタンパク質の発現を誘導することが示されている(Ｓｐｒｅｙｅｒら，前出；Ｐａｒｅｅｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１０３７２−１０３７９（１９９３）；Ｌｅｍｋｅら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１０２，４９９−５０４(１９８８))。ラットシュワン細胞は、Ｂｒｏｃｋｅｓらの方法(Ｂｒｏｃｋｅｓら，ＢｒａｉｎＲｅｓ．１６５，１０５−１１８(１９７９))の従来記載されている変法（Ｐａｒｅｅｋら，前出）により新生ラットの座骨神経から単離した。マイトジェンで増殖誘導した一次ラットシュワン細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２０μｇ／ｍｌ粗グリア増殖因子、５μｇ／ｍｌフォルスコリン及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有するダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でポリ−Ｌ−リジン被覆培養プレートで培養した（Ｐａｒｅｅｋら，前出）。シュワン細胞由来細胞系Ｄ６Ｐ２Ｔ（Ｂａｎｓａｌら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．４９，１９０２−１９１１（１９８７））は、５％ＦＣＳと５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有するＤＭＥＭ中でプラスチック培養皿で培養した。細胞を２群に分け、フォルスコリンを加えずに同一培地で培養した。３日後に細胞は７０％集密に達していたので、第１の細胞群を２０μ ｇ／ｍｌフォルスコリンで３６時間処理し、第２群はフォルスコリンの不在下に維持した。その後、細胞を５ＭＧＴ緩衝液中で回収し、全ＲＮＡを抽出した。ＰＭＰ２２ｍＲＮＡはｐＳＣ及びＤ６Ｐ２Ｔ細胞中でフォルスコリンによりアップレギュレートされる（図７Ｂ）。他方、ＥＭＰ−１ｍＲＮＡレベルは同一条件下で低下する。この調節はＤ６Ｐ２Ｔ細胞系で特に顕著であり、ＥＭＰ−１ｍＲＮＡはフォルスコリンの存在下では殆ど検出不能なレベルまで低下する。Ｄ．ＮＩＨ３Ｔ３細胞中の増殖停止後のＥＭＰ−１及びＰＭＰ２２の調節ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞を従来記載されているように培養し、血清飢餓により増殖停止した（Ｓｕｔｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１−１４（１９９４））。指数増殖期の細胞と増殖停止した細胞を５ＭＧＴ緩衝液中に回収した。これらの条件下で、ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞はＰＭＰ２２ｍＲＮＡ発現の増加を示した（図７Ｃ）。Ｍａｎｆｉｏｌｅｔｔｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０，２９２４−２９３０（１９９０）。ＰＭＰ２２の調節とは対照的に、ＥＭＰ−１ｍＲＮＡレベルは同一実験条件下で著しく低下する（図７Ｃ）。Ｅ．ラット腸におけるＥＭＰ−１タンパク質の発現ラット組織を８Ｍ尿素中でホモジナイズし、１０，０００ｇで１０分間４℃で遠心分離した。上清のタンパク質濃度をブラッドフォードアッセイにより測定し、２％β−メルカプトエタノールを含有するサンプル緩衝液中で９５℃まで３分間加熱することによりタンパク質５０μｇを変性させ、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードした。半乾燥ブロッター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してタンパク質をニトロセルロースメンブラン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）に電気転写した。メンブランをＰｏｎｃｅａｕＳで染色して転写効率を試験した。０．２％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）を含有するリン酸緩衝溶液中０．１５％カゼインでブロットをブロックし、ブロッキング緩衝液に１：５００の希釈度で希釈したポリクローナルウサギ血清と共にインキュベートした後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギイムノグロブリン（１：５０００，Ｓｉｇｍａ）と共に１時間インキュベートした。検出は化学発光（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）とＸ線フィルム（ＲＸ，Ｆｕｊｉ）の露光により行った。抗ループ１及び抗ループ２抗体のいずれも種々の胃腸管組織溶解液のウェスタンブロッティングにより約２５ｋＤａのタンパク質を認識する（図８）が、抗ループ１抗体のほうが著しく有効である。ウェスタンブロット上の免疫反応性タンパク質の標識は、免疫原ペプチド２５０μｇ／ｍｌの存在下で抗血清のプレインキュベーションによりブロックすることができ（図８Ａ）、シグナルの特異性を裏付ける。ブロッキングは免疫原に特異的であり、同一濃度の別のペプチドと共にプレインキュベートしてもブロッキングは行われない（図８Ａ）。コアＥＭＰ −１タンパク質の計算分子量は約１８ｋＤａであり、ｃＤＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ転写及び翻訳により確認することができる（図５）。推定Ｎ結合炭水化物鎖の存在は還元用ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に２５ｋＤａの見かけ分子量をもつタンパク質を生じると考えられる。しかし、ＥＭＰ−１タンパク質のその他の翻訳後修飾も排除できない。ＥＭＰ−１タンパク質の最も顕著な発現は胃に見られ、盲嚢と大腸ではより低レベルで検出できる。小腸の十二指腸と空腸における発現は、これらの組織に検出される低いｍＲＮＡレベルに対応して、腸管の他の領域よりも著しく低い（図６、８Ａ）。肺（図８Ａ）、脾臓及び胸腺にも、非常に低レベルの２５ｋＤａのＥＭＰ−１タンパク質が検出できる。２５ｋＤａタンパク質以外に、両者ＥＭＰ−１抗血清はより大きいタンパク質の類似配列を腸で検出する（図８Ｂ）。これらの付加的免疫反応種の存在は実験間及び組織間で異なる。一般に、付加的バンドはＥＭＰ−１タンパク質の含有量が高い溶解液ほど顕著である。２種の抗血清はＥＭＰ−１タンパク質の独立領域に特異的であるので、これらのより大きい免疫反応種は高疎水性タンパク質に多く見られる現象である分子凝集によるものであると思われる。組織によっては観察されるＥＭＰ−１タンパク質レベルがＥＭＰ−１ｍＲＮＡ発現に厳密に相関しない場合もあるが、ＥＭＰ−１タンパク質はＥＭＰ−１ｍＲＮＡ発現が見られる組織にしか検出できない。ＥＭＰ−１ｍＲＮＡ陰性である肝臓の溶解液中の抗血清では免疫反応性タンパク質は検出されない（図８Ａ）。実施例６：組換えＥＭＰ−１の発現Ａ．組換えラットＥＭＰ−１の一過性発現図１に示すＥＭＰ−１ｃＤＮＡをサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの下流のｐｃＤＮＡ１（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）発現ベクターのＥｃｏＲＶ部位にサブクローニングした。ｃＤＮＡインサートを挿入していない親ベクターを陰性対照トランスフェクションで使用した。組換えＤＮＡをＱＩＡＧＥＮカラム単離により精製し、ＯＤ２６０により定量した。１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で指数的に増殖するＣＯＳ細胞をトリプシン処理し、リン酸緩衝溶液で洗浄し、８００ｇでペレット化した。ベクターＤＮＡ５μｇを含むリン酸緩衝溶液２００μｌに細胞１．５×１０⁶個を再懸濁した。細胞を氷上で５分間冷却し、４ｍｍギャップエレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移し、３００ボルト、１２５μファラドでエレクトロポレーションによりＤＮＡを導入した。トランスフェクトした細胞を氷上で５分間冷却し、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ２ｍｌを収容する７個の３５ｍｍ培養皿に分配し、４８時間培養した。次に細胞をトリス緩衝溶液で洗浄し、２％パラホルムアルデヒドを含有するＤＭＥＭで３０分間固定し、トリス緩衝溶液で洗浄し、０．１％サポニンを含有するトリス緩衝溶液で３０分間透過性にした。２％ウシ血清アルブミン、０．１％ブタ皮膚ゼラチン（タイプＡ，Ｓｉｇｍａ）、２％ヤギ血清及び０．１％サポニンを含有するトリス緩衝溶液で非特異的結合部位を室温で３０分間ブロックした。０．０２％サポニンを含有するブロッキング緩衝液で１：５００に希釈した抗ＥＭＰ−１抗体と共に細胞を４℃で一晩インキュベートした後、０．０２％サポニンを含有するブロッキング緩衝液で１：２００に希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギイムノグロブリン（Ｃａｐｐｅｌ）と共にインキュベートした。トリス緩衝溶液で洗浄後、ＡＦ１（Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ）を使用してカバースリップを載せ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＭＲＣ−６００スキャナーとＺｅｉｓｓＡｘｉｏｐｈｏｔ蛍光顕微鏡を組み合わせ、Ｉｍａｒｉｓ画像処理ソフトウェア（ＢｉｔｐｌａｎｅＡＧ，ＴｅｃｈｎｏｐａｒｋＺｕｒｉｃｈ，スイス）を使用して共焦点顕微鏡試験により免疫反応性を可視化した。一次抗血清としての前免疫血清（１：５００）を陰性対照として使用した。ＣＯＳ細胞トランスフェクション後に、抗ループ１及び抗ループ２抗血清の両者は細胞の約２５％が強い免疫反応性をもつことが確認された（図９）。ＥＭＰ −１インサートを挿入していない親発現ベクターをトランスフェクトした対照ＣＯＳ細胞は、抗血清も前免疫血清も認識しなかった。抗ループ２抗血清による検出は抗ループ１抗血清による検出よりも有効であったので、その後の試験では主に抗ループ２抗血清を使用した。Ｂ．組換えヒトＥＭＰ−１の発現図３に示すＥＭＰ−１ｃＤＮＡ配列をｐＣＤＮＡ−１にクローニングし、ＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。ＣＯＳ細胞を実施例６Ａに記載したように培養し、細胞溶解液を調製し、ウェスタン分析によりＥＭＰ−１タンパク質発現を分析した。このタンパク質はヒトＥＭＰ−１に対する抗血清により検出される。実施例７：ラット腸におけるＥＭＰ−１タンパク質発現の局在図１０ａはラット胃粘膜のトポロジーの概略図である。胃小窩の上皮細胞は胃腺の峡部／頚領域で幹細胞により産生される。これらの細胞は胃小窩への移動中に分化し、胃小窩で絨毛の先端から押し出される（剥離される）（ＧｏｒｄｏｎとＨｅｒｍｉｓｔｏｎＣｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６，７９５−８０３（１９９４））。胃小窩の横断面は腸内腔の周囲に円形に組織化された上皮細胞を示す（図１０ａ）。組織調製と免疫蛍光を次のように行った。成熟ＳＩＶラットから胃を取り出し、１０ｍｍ×５ｍｍのブロックに切断し、液体窒素上でイソペンタン中のＯＣＴ載物用媒質（ＴｉｓｓｕｅＴｅｃｈ）にスナップフリーズした。１０μｍの凍結切片を切り取り、０．５％ゼラチンと０．０５％クロム酸塩カリウムを下塗りしたスライドに融解載物した。切片を１％パラホルムアルデヒドで５分間固定し、リン酸緩衝溶液で洗浄した。リン酸緩衝溶液で１：５０に希釈したヤギ血清で非特異的結合部位を１時間ブロックした。０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝溶液で１：５００に希釈した一次抗血清と共に４℃で一晩又は室温で４時間、次いでテキサスレッド標識ロバ抗ウサギイムノグロブリン（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の１：２００希釈液と共に切片を２時間インキュベートした。０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝溶液で十分に洗浄後、切片をＡＦ１（Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ）で被覆し、カバースリップを載せた。高解像度共焦点顕微鏡試験により免疫反応性を可視化した。一次抗血清としての前免疫血清（１：５００）を陰性対照として使用した。胃体の１０μｍ凍結切片を抗ループ２抗血清で染色した。繊毛の先端から胃腺の峡部及び頚に向かう胃粘膜の外側上皮細胞に強い免疫反応性が検出された（図１０ｂ、ｃ）。横断面において、ＥＭＰ−１免疫反応性は胃小窩の上皮細胞の血漿膜に関連すると思われる（図１０ｅ）。胃腺の深部の上皮細胞は免疫反応性を殆ど又は全く示さす、胃腺の基底部又は粘膜下筋肉層に特異的標識を検出することはできなかった（図１０ｂ）。以上、好適態様に関して本発明を説明したが、本発明は開示した態様に制限されず、請求の範囲の精神及び範囲に含まれる種々の変形及び均等態様に及び、その範囲はこのような全変形及び均等態様を網羅するように最も広義に解釈されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｑ 1/68 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/15 33/566 33/53 Ａ６１Ｋ 45/00 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ // Ａ６１Ｋ 45/00 5/00 ＢＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ウエルシヤー，アンドリユー・エイアメリカ合衆国、カリフオルニア・91320、サウザンド・オークス、キヤピタン・ストリート・786 (72)発明者ズーター，ウエリスイス国、ツエー・ハー―5436・ブエレンロス、ラントシユトラーセ・104

Claims

【特許請求の範囲】１．ＥＭＰ−１をコードする単離核酸分子。２．哺乳動物ＥＭＰ−１をコードする請求項１に記載の分子。３．図１に示す配列をもつラットＥＭＰ−１をコードする請求項１に記載の分子。４．図２に示す配列をもつマウスＥＭＰ−１をコードする請求項１に記載の分子。５．図３に示す配列をもつヒトＥＭＰ−１をコードする請求項１に記載の分子。６．宿主細胞にトランスフェクトされるとＥＭＰ−１を発現することが可能な発現系を含むＤＮＡ分子。７．発現系がＥＭＰ−１をコードするヌクレオチド配列を含む請求項６に記載のＤＮＡ分子。８．請求項６に記載のＤＮＡ分子で修飾された宿主細胞。９．哺乳動物細胞である請求項８に記載の宿主細胞。１０．ＥＭＰ−１が細胞表面に発現される請求項８に記載の宿主細胞。１１．ＥＭＰ−１に特異的に結合する抗体又はそのフラグメント。１２．ＥＭＰ−１活性のアゴニストである請求項１１に記載の抗体。１３．ＥＭＰ−１活性のアンタゴニストである請求項１１に記載の抗体。１４．宿主細胞でＥＭＰ−１を発現させる方法であって、請求項６に記載のＤＮＡ分子で細胞を修飾する段階と、ＥＭＰ−１の発現を可能にする条件下で細胞を培養する段階を含む前記方法。１５．ＥＭＰ−１が宿主細胞の表面で発現される請求項１４に記載の方法。１６．選択された組織における内因性ＥＭＰ−１遺伝子の発現を改変する方法であって、ＥＭＰ−１の組織レベルを増加又は減少させる外因性ＥＭＰ−１核酸配列で組織を修飾することを特徴とする前記方法。１７．外因性ＥＭＰ−１核酸配列が組織特異的発現系に作動可能に連結されたＥＭＰ−１コーディング領域を含む請求項１６に記載の方法。１８．外因性ＥＭＰ−１核酸配列が内因性ＥＭＰ−１遺伝子の一部に相補的である請求項１６に記載の方法。１９．候補物質がＥＭＰ−１アゴニストとして作用する能力を評価する方法であって、ＥＭＰ−１の活性化を可能にする条件下で候補物質と共に請求項１０に記載の細胞をインキュベートする段階と、その結果として生じるＥＭＰ−１の活性化を測定する段階を含む前記方法。２０．候補物質がＥＭＰ−１アンタゴニストとして作用する能力を評価する方法であって、候補物質と共にＥＭＰ−１が活性化されている請求項１０に記載の細胞をインキュベートする段階と、その後のＥＭＰ−１の活性化の低下を測定する段階を含む前記方法。２１．生物サンプル中のＥＭＰ−１の存在を検出する方法であって、抗体とＥＭＰ−１の結合を可能にする条件下でサンプルを請求項１１に記載の抗体と共にインキュベートする段階と、結合した抗体を検出する段階を含む前記方法。２２．ＥＭＰ−１核酸配列の突然変異又は改変を生物サンプル中で同定する方法であって、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で請求項１に記載の核酸又はその一部と共にサンプルをインキュベートする段階と、サンプル中のＥＭＰ −１核酸を単離する段階と、ＥＭＰ−１核酸の突然変異又は改変を同定する段階を含む前記方法。