JP2000507095A

JP2000507095A - ネズミα（１，３）フコシルトランスフェラーゼＦｕｃ―ＴＶＩＩ、それをコードするＤＮＡ、その製造法、それを認識する抗体、それを検出するためのイムノアッセイ、このようなＤＮＡを含むプラスミド、およびこのようなプラスミドを含む細胞

Info

Publication number: JP2000507095A
Application number: JP9531850A
Authority: JP
Inventors: ナツカ、シュンジ; ケビン、エム．ガーステン; ジョン、ビー．ロウ
Original assignee: University of Michigan System
Current assignee: University of Michigan Ann Arbor
Priority date: 1996-03-08
Filing date: 1997-03-07
Publication date: 2000-06-13
Also published as: US20040063178A1; DE69738368D1; EP0888377A4; EP0888377A1; US6693183B2; US20020111469A1; ATE380820T1; DE69738368T2; US7723080B2; WO1997032889A1; AU731261B2; AU2060897A; EP0888377B1

Abstract

(57)【要約】シアリルルイスX決定基を合成することができるネズミ白血球αフコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をクローニングした。

Description

【発明の詳細な説明】ネズミα（１，３）フコシルトランスフェラーゼＦｕｃ−ＴＶＩＩ、それをコードするＤＮＡ、その製造法、それを認識する抗体、それを検出するためのイムノアッセイ、このようなＤＮＡを含むプラスミド、およびこのようなプラスミドを含む細胞発明の背景発明の分野本発明は、ネズミα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ、このようなネズミα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩをコードするＤＮＡ、このようなＤＮＡを含むプラスミド、このようなプラスミドで形質転換した細胞、これらの細胞を培養することによるネズミα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩの製造法、ネズミα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩに特異的に結合するモノクローナル抗体、およびこのようなモノクローナル抗体を用いてネズミα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩを検出するためのイムノアッセイに関する。背景の説明白血球と内皮細胞との間の細胞接着現象は、血管樹から血中白血球の流出(exi t)を促進する作用をする。細胞接着分子のセレクチンファミリー、およびそれらの対レセプターは、この工程の初期に機能して、白血球と内皮細胞単層との間の移行性接着接触(transient adhesive contacts)を媒介する。これらのセレクチン依存性接着接触は、白血球に影響を与える剪断力と一緒になって、内皮単層に沿って白血球の「回転」を引き起こす。白血球が回転すると、白血球の活性化、堅い白血球−内皮細胞付着、経内皮移動などの引き続く現象を促進する（T.A．S pringer，Cell，vol．76，pp．301-314(1994);R.P．McEver et al.，J．Biol．C hem.，vol．270，pp．11025-11028(1995)）。活性化した血管内皮細胞によって発現されるＥ−およびＰ−セレクチンは、白血球によって示される糖タンパク質の対レセプターを認識する。これらのセレクチンのそれぞれは、炎症に関する白血球回転を伝達する作用をすることができる。Ｌ−セレクチンは、余りよく理解されていない内皮細胞リガンドとの相互作用による活性化した血管内皮への白血球の接着の伝達にも関与している(M.L．Arbo nes et al.，Immunity，vol．1，pp．247-260(1994);K．Ley et al.，J．Exp．M ed.，vol．181，pp．669-675(1995))。対照的に、白血球L−セレクチンは、リンパ節とパイアー斑内に高内皮性小静脈（ＨＥＶ）を整列している分化した立方体様細胞によって提示される(displayed)糖タンパク質カウンターレセプターを認識する。これに関するＬ−セレクチン依存性の接着相互作用は、リンパ球のリンパ性集合体へのトラフィキング(trafficking)（リンパ球「ホーミング」）を促進する作用をする。３種類のセレクチンファミリーメンバーのそれぞれに共通のＮＨ₂−末端のＣ −型哺乳類レクチンドメインは、白血球（Ｅ−およびＰ−セレクチンリガンド） (R.P.McEver et al.，J.Biol．Chem.，vol．270，pp．11025-11028(1995);A．Va rki，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，vol.91，pp．7390-7397(1994))、またはＨＥＶ（Ｌ−セレクチン）(S.D．Rosen et al.，Curr．Opin．Cell Biol.，vol ．6，pp．663-673(1994))によって発現される(displayed)特異的なオリゴ糖リガンドとのカルシウム依存性相互作用による細胞接着を伝達する。Ｅ−およびＰ− セレクチンに対する生理学的リガンド活性は、シアリル・Ｌｅｗｉｓｘ（ｓＬｅ^x）［ＮｅｕＮａｃα２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃ −Ｒ］と呼ばれる非還元末端の四糖(A．Varki，Proc．Natl．Acad．Sci． U.S.A.，vol．91，pp．7390-7397(1994))、および／またはそのジフコシル化変異体(T.P．Patel et al.，Biochemistry，vol．33,pp．14815-14824(1994))の発現に決定的に依存している。しかしながら、Ｅ−およびＰ−セレクチンは、異なる状況でこのオリゴ糖を認識する。Ｐ−セレクチン依存性の細胞接着は、ｓＬｅ^x がＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド１（ＰＳＧＬ−１）と呼ばれる特異タンパク質上に存在するセリンおよびトレオニン結合オリゴ糖によって発現される (displayed)とき、最適となる(K.L．Moore et al.，J．Cell．Biol.，vol．188 ，pp．445-456(1992);D．Sako et al.，Cell，vol．75,pp．1179-1186(1993))。ｓＬｅ^xで修飾されたＰＳＧＬ−１も、Ｅ−セレクチンに対する高アフィニティーカウンターレセプターを表すと思われる(D．Asa et al.，J．Biol．Chem.，vo l．270，pp．11622-11670(1995);K.D．Patel et al.，J．Clin．Invest．，vol ．96，pp．1887-1896(1995))。Ｅ−セレクチンリガンド１（ＥＳＬ−１）と呼ばれる異なった白血球糖タンパク質(M．Steegmaler et al.，Nature，vol．373，p p．615-620(1995))およびそのα（１，３）フコシル化し、アスパラギンに結合したオリゴ糖も、Ｅ−セレクチンカウンターレセプターとして機能することがある。ＨＥＶ上の生理学的Ｌ−セレクチンカウンターレセプターは、糖タンパク質であるＧｌｙＣＡＭ−１(L.A．Lasky et al.，Cell，vol．69，pp．927-938(1992) )、ＣＤ３４(S．Baumhueter et al.，Science，vol．262，pp．436-438(1993)) 、およびＭａｄＣＡＭ−１(E.L.Berg et al.,Nature，vol．366，pp．695-698(1 993))によって表される。生化学的検討は、これらの分子のＬ−セレクチンリガンド活性も、グリコシル化による翻訳後修飾に決定的に依存していることを示している。初期の研究には、シアリル化および硫酸化の要件が詳細に記載され(Y.I mai et al.，J．Cell Biol.，vol．113，pp．1213-1221(1991))、α（１，３）フコシル化の要件が暗示され、これらの修飾はセリンおよび／またはトレオニン結合グリカンの成分であることが示されていた。更に最近のオリゴ糖構造解析では、この研究が敷衍され、高アフィニティーＬ−セレクチンリガンド活性はｓＬｅ^x決定基の硫酸化変異体によって変化することが暗示されている。ＮｅｕＮＡｃα２，３（ＳＯ₄６）Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ(S．Hemmerich et al.，Biochemistry，vol．33，pp．4820-4829(1994) ;S．Hemmerich et al.，Biochemistry，vol．33，pp．4830-4835(1994);S．Hemm erich et al.，J．Biol．Chem.，vol．270，pp．12035-12047(1995))。ｓＬｅ^xの発現は、１種類以上のα（１，３）フコシルトランスフェラーゼの細胞系譜特異的発現によって決定される(S．Natsuka et al.，Curr．Opin．Stru c．Biol.，vol．4，pp．683-691(1994))。これらの酵素は、ドナー基質ＧＤＰ− フコースを用い、α１，３−結合フコースの共通の３’−シアリル−Ｎ−アセチル−ラクトースアミン前駆体への付加を伴うグリコシル転移を触媒する。ｓＬｅ^x の硫酸化変異体の発現は、硫酸塩修飾された３’−シアリル−Ｎ−アセチルラクトースアミン前駆体で作用するα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ活性または次に硫酸化によって修飾されたｓＬｅ^x残基を生成するものの系譜特異的発現によっても変化すると考えることができる。白血球でのセレクチンリガンド発現に関与する（複数の）α（１，３）フコシルトランスフェラーゼの本体は余り画定されておらず、ＨＥＶ特異的α（１，３）フコシルトランスフェラーゼは報告されていない。今日までに、５種類の異なるヒトα（１，３）フコシルトランスフェラーゼがクローニングされている（J. F．Kukowska-Latallo et al.，Genes & Dev.，vol．4，pp．1288-1303(1990);B. W．Weston et al.，J．Biol．Chem.，vol．267，pp．24575-24584(1992);B.W．W eston et al.，J．Biol．Chem.，vol．267，pp．4152-4160(1992);J.B．Lowe et al.，J．Biol．Chem.，vol．266，pp．17467-17477(1991);S.E．Goelz et al. ，Cell，vol．63，pp．1349-1356(1990);R．Kumar et al.，J．Bio1．Chem．，vol．266，pp．21777-21783(1991);S．Natsuka et al.，J．Biol．Chem.，vol ．269，pp．16789-16794(1994);K．Sasaki et al.，J．Biol．Chem.，vol．269 ，pp．14730-14737(1994))。ノーザンブロット法および分子クローニング分析法によれば、これらのうちの２個であるＦｕｃ−ＴＩＶ（J.B．Lowe et al.，J．B iol．Chem.，vol．266，pp．17467-17477(1991);S.E．Goelz et al.，Cell，vol ．63，pp．1349-1356(1990);R．Kumar et al.，J．Biol．Chem.，vol．266，pp ．21777-21783(1991))およびＦｕｃ−ＴＶＩＩ（S．Natsuka et al.，J．Biol． Chem.，vol．269，pp．16789-16794(1994);K．Sasaki et al.，J．Biol．Chem. ，vol．269，pp．14730-14737(1994))と呼ばれるものは、白血球細胞で発現され、セレクチンリガンド発現に重要な関与を行う可能性のあるものであることが暗示されている。しかしながら、この過程におけるＦｕｃ−ＴＩＶ（ＥＬＡＭ−１リガンドフコシルトランスロケーションまたはＥＬＦＴとしても知られている）の役割は、明らかになっていない。Ｆｕｃ−ＴＩＶ／ＥＬＦＴは、非シアリル化Ｎ−アセチル−ラクトースアミン前駆体を効率的に用いてＬｅ^x残基を発現させることができるが(J.B．Lowe et al.，J．Biol．Chem.，vol．266，pp．17467-1 7477(1991);R．Kumar et al.，J．Biol．Chem.，vol．266，pp．21777-21783(19 91))、この酵素は総ての細胞に関してＬｅ^x発現を決定することはできず、白血球または白血球の前駆細胞でこれを行う能力は示されていない。対照的に、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩは、ｓＬｅ^x合成が生化学的に可能な検討を行なった総ての哺乳類細胞に関してｓＬｅ^x発現を決定することができることは明らかである(S．Natsu ka et al.，J．Biol．Chem.，vol．269，pp．16789-16794（1994);K．Sasaki et al.，J．Biol．Chem.，vol．269，14730-14737(1994))。硫酸化ｓＬｅ^x決定基によって表されるＬ−セレクチンリガンドの合成に関与するその能力については、いずれの酵素も試験されていない。従って、他のα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ、およびこれを製造するのに有用な方法、細胞、プラスミドおよびＤＮＡが必要とされている。また、このようなα（１，３）フコシルトランスフェラーゼの検出に有用な抗体およびイムノアッセイも求められている。発明の概要従って、本発明の目的は、新規なα（１，３）フコシルトランスフェラーゼを提供することである。本発明のもう一つの目的は、このα（１，３）フコシルトランスフェラーゼをコードする新規なＤＮＡを提供することである。本発明のもう一つの目的は、このようなＤＮＡを含む新規なプラスミドを提供することである。本発明のもう一つの目的は、このようなプラスミドで形質転換した新規な細胞を提供することである。本発明のもう一つの目的は、このような形質転換細胞を培養することによって上記のようなα（１，３）フコシルトランスフェラーゼを製造するための新規な方法を提供することである。本発明のもう一つの目的は、このようなα（１，３）フコシルトランスフェラーゼに特異的に結合する新規なモノクローナル抗体を提供することである。本発明のもう一つの目的は、このようなモノクローナル抗体を用いて上記のようなα（１，３）フコシルトランスフェラーゼを検出するための新規なイムノアッセイを提供することである。本発明のもう一つの目的は、上記のようなα（１，３）フコシルトランスフェラーゼによって残基をフコシル化する新規な方法を提供することである。上記および他の目的は、以下の詳細な説明から明らかになるものであり、α（１，３）フコシルトランスフェラーゼＦｕｃ−ＴＶＩＩの本発明者らによるクローニングによって達成されたものである。図面の簡単な説明添付図面に関して考察するとき、下記の詳細な説明を参照することによって更に理解されるので、本発明およびそれに付随する利点の多くの更に完全な理解が得られる。第１ａ図は、ネズミＦｕｃ−ＴＶＩＩ遺伝子およびｃＤＮＡの構造および機能的活性を示す。ネズミＦｕｃ−ＴＶＩＩ遺伝子の複合エクソン構造を最上段に示す。模式図の下の番号はイントロン−エキソン境界のヌクレオチド位置、および遺伝子座の既知配列の最初(1)および最後(3520)のヌクレオチドに相当する。イントロン−エクソン境界は、ｃＤＮＡ配列を相当するゲノムＤＮＡ配列と比較することによって画定される（第２図参照）。「ＡＴＧ」の直ぐ上の模式図の番号は、下記に詳細に説明するように、３種類の可能性のある開始コドンのそれぞれにおける最初のヌクレオチドのヌクレオチド位置に相当する。「ＳＴＯＰ」の直ぐ上の模式図の番号は、エキソン３ｂに局在した翻訳終止コドン（ＴＧＡ；塩基対１９００〜１９０２）のヌクレオチド位置であって、ｃＤＮＡ６および１０で表されるｃＤＮＡクラスのヌクレオチド９９６〜９９８における開始コドンによって開始される潜在的オープン・リーディング・フレームを切断するものに相当する（詳細については本分を参照されたい）。ネズミ細胞毒性Ｔ−リンパ球細胞系１４〜７ｆｄから単離されたＦｕｃ−ＴＶＩＩｃＤＮＡの５種類の構造的に異なるクラスの代表的メンバーは、遺伝子構造模式図の下に模式的に表されている。示されたｃＤＮＡは、最長の５’伸長を有するそれぞれのクラスの代表的メンバーである。それぞれのクラスで単離されたｃＤＮＡの数は、「ｃＤＮＡの数」と表示した欄に示されている。それぞれのｃＤＮＡを、ＣＯＳ−７細胞で一過性発現を行った（実施例の実験手順を参照）。次に、トランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞を、フローサイトメトリー分析に付し、それぞれのｃＤＮＡによって決定された細胞表面グリコシル化表現型を特性決定した。この酵素をコードするコトランスフェクションしたプラスミドベクターによってコードされたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性によって決定されるトランスフェクション効率に規格化したトランスフェクションした個体数のシアリルＬｅｗｉｓｘ陽性細胞の画分（モノクローナル抗体ＣＳＬＥＸ−１で陽性染色）を、「ＣＳＬＥＸ−１陽性の比率」と表示した欄に示す。これらの結果は、ネガティブコントロールベクターｐＣＤＭ８で得られた２％染色のバックグラウンド上で観察された抗原陽性細胞の画分を表している。抽出物もトランスフェクションした細胞から調製して、受容体として５ｍＭシアリル−Ｎ−アセチルラクトースアミンを用いてイン・ビトロでのα（１，３）フコシルトランスフェラーゼアッセイに付した（実施例の実験手順を参照）。（トランスフェクション効率について規格化した）それぞれのｃＤＮＡによってコード化されたα（１，３）フコシルトランスフェラーゼの特異活性を、「Ｓｐ．Ａｃｔ．（ｃｐｍｓ／μｇ／時）」と表示した欄に示す。第１ｂ図は、ｃＤＮＡ３，５，６，１０および１４によってＣＯＳ−７細胞で発現されたポリペプチドのウェスタン・ブロット分析の結果を示す。上記の第１ａ図に示したα（１，３）フコシルトランスフェラーゼアッセイで使用した抽出物も、抗原アフィニティー精製抗Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ抗体を用いてウェスタン・ブロット分析に付した。それぞれの型のトランスフェクションした細胞抽出物から分析したタンパク質の量を変化させ、精確にフローサイトメトリーおよびα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ活性分析について第１ａ図に上記したようにトランスフェクション効率に対して規格化を行った。細胞抽出物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画し、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロッティングし、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ発現ベクターでコードしたポリペプチドを、実施例の実験手順に記載されているように、抗原アフィニティー精製ウサギ抗−Ｆｕｃ −ＴＶＩＩ抗体、ヤギ抗−ウサギＩｇＧ−ペルオキシダーゼ複合体、および市販の向上した化学発光試薬（ＥＣＬ、Amersham）でプロービングすることによって同定した。第２図は、単離したマウスＦｕｃ−ＴＶＩＩ遺伝子のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。ＤＮＡ配列は、ネズミＦｕｃ−ＴＶＩＩ遺伝子座を含むファージから誘導した。ｃＤＮＡ（第１ａ図）に含まれるＤＮＡ配列を上のケースに示し、イントロン位置に相当するＤＮＡ配列を下のケースに示す。ｃＤＮＡ配列によって予言されたアミノ酸配列を、単一文字コードで示す。本分で詳細に説明するように、別のスプライシング現象により、次に３種類の異なるポリペプチドをコードすることができる異なるｃＤＮＡを生成する。一つのタンパク質は、ヌクレオチド位置９９６〜９９８に局在化したメチオニンコドンで開始することが予想されている（３８９残基、４４，４９２Ｄａ；ｃＤＮＡ５；第１図）。第二のタンパク質は、ヌクレオチド位置１９４７〜１９４９に局在化したメチオニンコドンで開始することが予想されている（３４２残基、３９，４２４Ｄａ；ｃＤＮＡ６，１０および１４；第１図）。第三のタンパク質は、ヌクレオチド位置２１２６〜２１２８に局在化したメチオニンコドンで開始することが予想されている（３１８残基、３６，８３６Ｄａ；ｃＤＮＡ３並びに総ての他のｃＤＮＡ；第１図）。第３ａおよびｂ図は、ネズミＦｕｃ−ＴＶＩＩ遺伝子の組織特異的発現パターンを示す。ネズミ組織および細胞系から精製したオリゴ−ｄＴ精製ｍＲＮＡ（５ μｇ）をアガロースゲル電気泳動によって分画し、ナイロンハイブリダイゼーション膜にブロッティングし、マウスＦｕｃ−ＴＶＩＩ遺伝子座のコード領域から誘導した９７９塩基対のＤＮＡセグメントでプローブした（ヌクレオチド２２２８〜３２０７；第２図および実施例の実験手順を参照）。ｋｂでのＲＮＡ分子サイズ標準を、それぞれのパネルの左に表示する。次に、それぞれのブロットをストリッピングし、放射能標識したニワトリグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼプローブで再プロービングし、ＲＮＡ試料が完全なままであり等量で装填されたことを確かめた（実施例の実験手順を参照）。第３ａ図は、マウス組織、およびネズミＴ−リンパ球細胞系１４−７ｆｄ（１４ＦＤ）から単離したポリアデニル化ＲＮＡを示す。第３ｂ図は、マウス骨髄および脾臓、および培養したネズミ白血球細胞系から単離したポリアデニル化ＲＮＡを示す。細胞系は、下記の系譜を表す。ＭＥＬ，ネズミ赤白血病細胞系；Ｐ３８８およびＲＡＷ（ＲＡＷ２６４．７），マクロファージ；ＥＬ４，Ｔ細胞；Ｓ１０７，６３（ＴＨ２．５４．６３）および１８０．１，Ｂ細胞系（ハイブリドーマ）。第４図は、ネズミリンパ節およびパイアー斑のＦｕＣ−ＴＶＩＩ転写体のイン・シトゥ（in situ）でのハイブリダイゼーション分析の結果を示す。腋窩リンパ節（末梢リンパ節と表示された欄；パネルＡ，Ｂ，Ｃ）、腸間膜リンパ節（腸間膜リンパ節と表示された欄；パネルＤ，Ｅ，Ｆ）、およびパイアー斑（パイアー斑と表示された欄；パネルＧ，Ｈ，Ｉ）の連続した厚みが１０μｍの凍結切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し（Ｈ＆Ｅと表示された列；パネルＡ，Ｄ，Ｇ，明視野照明を用いる５倍の倍率の写真）、または実施例の実験手順に記載されているように、インシトゥハイブリダイゼーション処理を行なった。インシトゥハイブリダイゼーションを施した隣接する切片を、ネズミＦｕｃ−ＴＶＩＩ遺伝子座の塩基対２１９６〜２４９７から誘導した³⁵Ｓ−標識アンチセンスＲＮＡプローブでプロービングし（アンチセンスと表示した列；パネルＢ，Ｅ，Ｈ）、またはネズミＦｕｃ−ＴＶＩＩ遺伝子座の塩基対２１９６〜２４９７から誘導した³⁵Ｓ−標識したネガティブコントロールセンスＲＮＡプローブでプロービングした（センスと表示した列；パネルＣ，Ｆ，Ｉ）。インシトゥハイブリダイゼーション処理を行なった切片は、暗視野照明を用いて５倍で写真撮影した。パネルＢ，ＥおよびＨの白色部分は、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩアンチセンスプローブがＦｕｃ−ＴＶＩＩ転写体を同定する部位（すなわち、パネルＢおよびＥでは、高内皮性小静脈性内皮細胞；パネルＨでは、高内皮性小静脈性内皮細胞および管腔に位置した細胞（リンパ球様集合体上の白色染色した「キャップ」））に相当する（詳細については、本文を参照）。第５ａおよびｂ図は、リンパ球様集合体高内皮性小静脈性内皮細胞でのＦｕｃ −ＴＶＩＩ、ＭＥＣＡ−７９およびＬ−セレクチンリガンドの発現の免疫組織化学的同時局在化を示す。第５ａ図は、ＨＥＶにおけるＦｕｃ−ＴＶＩＩ、ＭＥＣＡ−７９およびＬ−セレクチンリガンドの同時局在化発現を示す。腋窩リンパ節（末梢リンパ節と表示された欄）、腸間膜リンパ節（腸間膜リンパ節と表示された欄）、およびパイアー斑（パイアー斑と表示された欄）の連続した厚みが１０μｍの凍結切片を、抗原アフィニティー精製ウサギポリクローナルアンチネズミＦｕｃ−ＴＶＩＩ（Ｆｕｃ−ＴＶＩＩと表示された列）、モノクローナル抗体ＭＥＣＡ−７９（ＭＥＣＡ−７９と表示された列）、ネズミＬ−セレクチン／ヒトＩｇＭキメラ（Ｌ−ｓｅｌ／ＩｇＭキメラと表示された列）、またはＥＤＴＡの存在下で染色したＬ− セレクチン／ＩｇＭキメラ（Ｌ−ｓｅｌ／ＩｇＭキメラ＋ＥＤＴＡと表示された列）で染色した。次いで、切片に結合した一次免疫組織化学的試薬を、実施例の実験手順に記載の方法で、フルオロクロムで標識した二次免疫化学的試薬（Ｆｕｃ−ＴＶＩＩについては、ＦＩＴＣ結合（緑色）アンチヒトＩｇＭ；ＭＥＴＡ− ７９については、ローダミン結合（赤色）アンチラットＩｇＭ）を用いて検出を行った。これらの着色した検出法では、これらの実験の元の写真の黒および白色再生時に白色部分を生じる。従って、「緑色」および「赤色」領域は、白色領域として現れる。顕微鏡写真は、実施例の実験手順に記載の蛍光顕微鏡法を用いて、４０倍の倍率で撮影した。第５ｂ図は、末梢リンパ節ＨＥＶのアンチ−Ｆｕｃ−ＴＶＩＩによる染色を高倍率に拡大したものである。第５ｂ図のパネルＡの薄灰色部分は、ＭＥＣＡ−７９染色に相当する。第５ｂ図のパネルＡの白色部分は、アンチ−Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ抗体で染色した部分に相当する。腋窩リンパ節の１０μｍの厚みの凍結切片を、抗原アフィニティー精製アンチ−Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ抗体およびアンチ−ＭＥＣＡ−７９抗体で同時に染色した（「免疫抗体」と表示したパネル）。切片に結合した抗体は、第５ａ図の説明および実施例の実験手順に記載したのと全く同様にしてフルオロクロムに結合した二次抗体試薬を用いて検出した。同じ腋窩リンパ節の直ぐ隣りの１０μｍの厚みの凍結切片を、代わりに一対のネガティブコントロール抗体（正常ウサギＩｇＧ、および正常ラットＩｇＭ；「非免疫抗体」と表示したパネル）で同時に染色し、「免疫抗体」パネルで用いたのと同じ方法で展開した。顕微鏡写真は、実施例の実験手順に記載した蛍光顕微鏡法を用いて４００倍の倍率で撮影した。好ましい態様の詳細な説明従って、第一の態様では、本発明は、新規な酵素であるネズミα（１，３）フコシルトランスフェラーゼＦｕｃ−ＴＶＩＩを提供する。好ましくは、この酵素は、第１ａ図に示される遺伝子によって２種類の異なるＡＴＧ開始コドンの一つを用いてコードされたポリペプチドに相当する２種類のアミノ酸配列の一つを有する。従って、第一の態様では、本発明の酵素は、第１図のｃＤＮＡ５および第２図のヌクレオチド位置９９６〜１１４９および２０６７〜３０７９に相当するＤＮＡによってコードされたものに相当するアミノ酸配列を有する。もう一つの態様では、この酵素は、第１図のｃＤＮＡ６，１０または１４によってコードされたものに相当し、第２図に示されたヌクレオチド位置１９４７〜１９５９および２０６７〜３０７９に相当するヌクレオチド配列を有するアミノ酸配列を有する。これらの２つの態様では、アミノ酸配列は、（1）第２図のヌクレオチド位置９９６〜１１４９によってコードされたアミノ酸配列のＣ末端を第２図のヌクレオチド位置２０６７〜３０７９によってコードされたアミノ酸配列のＮ末端に連結することによって得られたもの、および（2）第２図のヌクレオチド位置１９４７〜１９５９によってコードされたアミノ酸配列のＣ末端を第２図のヌクレオチド位置２０６７〜３０７９によってコードされたアミノ酸配列のＮ末端に連結することによって得られたものに相当すると理解すべきである。本発明の酵素は、この酵素の活性が保持されるならば、上記アミノ酸配列の一つであって、タンパク質のアミノ末端で５個までのアミノ酸配列が付加され、欠失され、または置換されているものを有することもできる。なお、酵素が、下記の実施例に記載されているようにＧＤＰ−フコースから３’−シアリル−Ｎ−アセチルラクトースアミンヘフコースを移行させる元の酵素の特異活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１／３、更に好ましくは少なくとも１／２を保持する場合には、酵素はその活性を保持すると考えられる。本発明は、新規な融合タンパク質であって、本発明の酵素のいずれかがプロテインＡ、ストレプトアビジン、ｃ−ｍｙｃの断片、マルトース結合タンパク質、ＩｇＧ、ＩｇＭ、アミノ酸タグなどのポリペプチドに結合しているものも提供する。好ましくは、本発明に融合したポリペプチドは、本発明の酵素のアミノ末端に融合する。更に、本発明の酵素に融合したポリペプチドは、原核細胞または真核細胞から培地への融合タンパク質の放出を促進し、その（アフィニティー）精製および可能ならば固相マトリックス上での固定を可能とするように選択されるのが好ましい。このような融合タンパク質の例としては、ポリペプチド、例えばプロテインＡが第２図のヌクレオチド位置２０６７〜２０６９によってコードされたグリシン残基または第２図のヌクレオチド位置２１６２〜２１６４によってコードされたプロリン残基のアミノ基に融合しているものが挙げられる。もう一つの態様では、本発明は、ネズミＦｕｃ−ＴＶＩＩまたは本発明による融合タンパク質をコードする新規なＤＮＡ配列を提供する。好ましくは、本発明のＤＮＡ配列は、上記の２個のアミノ酸配列をコードするあらゆるものである。従って、第一の態様では、ＤＮＡ配列は、第１図のｃＤＮＡ５によってコードされたものに相当するアミノ酸配列を有しかつ第２図のヌクレオチド位置９９６〜１１４９および２０６７〜３０７９に相当する配列を有するポリペプチドをコードする任意のものである。もう一つのの態様では、ＤＮＡ配列は、第１図のｃＤＮＡ６、１０、または１４によってコードされるものに相当する配列を有しかつ第２図に示されるヌクレオチド位置１９４７〜１９５９および２０６７〜３０７９に相当する配列を有するタンパク質をコードする任意のものである。勿論、タンパク質がその活性を保持するならば、ＤＮＡ配列は、上記のもののいずれかに相当するタンパク質であって、５個までのアミノ酸残基がタンパク質のアミノ末端で付加され、欠失され、または置換されているものをコードすることができる。また、ＤＮＡ配列は、本発明の融合タンパク質のいずれかをコードすることもできる。好ましい態様では、ＤＮＡ配列は、第２図に示される９９６〜１１４９位および２０６７〜３０７９位に相当するヌクレオチド配列をゆうする。もう一つの態様では、ＤＮＡ配列は、第２図に示されるヌクレオチド配列の１９４７〜１９５９位および２０６７〜３０７９位に相当するヌクレオチド配列を有する。これらの好ましいＤＮＡ配列では、ＤＮＡ配列は、（1）第２図のヌクレオチド位置９９６〜１１４９に相当する配列３’末端を第２図のヌクレオチド位置２０６７〜３０７９に相当する配列の５’末端に連結することによって得られたもの、および（2）第２図のヌクレオチド位置１９４７〜１９５９に相当する配列の３’ 末端を第２図のヌクレオチド位置２０６７〜３０７９に相当する配列の５’末端に連結することによって得られたものに相当すると理解すべきである。もう一つの組の好ましいＤＮＡ配列としては、第２図のヌクレオチド位置９９６〜３０７９に相当する配列を有するＤＮＡ、および第２図のヌクレオチド位置１９４７〜３０７９に相当する配列を有するＤＮＡが挙げられる。第２図に示される完全長ＤＮＡ配列のクローニングを、下記の実施例で詳細に説明する。この配列の短い長さの断片並びに本発明の他のＤＮＡ配列は、固体状態ＤＮＡ合成または位置指定突然変異誘発のような常法によって得ることができる（Maniatis，T．et al.，分子クローニング：実験室便覧(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Press、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９年）、およびAusebel，F.M.，et al.，分子生物学の最新のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)、John W iley & Sons、ニューヨーク（１９８９年））。更にもう一つの態様では、本発明は、本発明によるＤＮＡ配列を含む新規なプラスミドまたはベクターを提供する。本発明のプラスミドは、クローニングベクターまたは発現プラスミドのいずれかであることができる。好ましいプラスミドまたはベクターは、本発明のＤＮＡ配列をｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１、ｐＲＥＰ８、ｐＣＥＰ４、ＰＴＺ１８などのプラスミドまたはベクターに挿入することによって得られるものである。発現プラスミドの場合には、本発明のＤＮＡ配列は、プロモーターから下流のプラスミドに、および正確なリーディング・フレームおよび転写配向で、挿入するのが好ましい。本発明によるＤＮＡ配列の正確なリーディング・フレームおよび転写配向での任意の通常の発現プラスミドへの挿入、および本発明のＤＮＡ配列の通常のクローニングベクターへの挿入は、通常の組換えＤＮＡ技術を用いて熟練技術者が容易に行なうことができる。本発明は、本発明によるプラスミドまたはベクターを含む形質転換細胞も提供する。好ましい宿主細胞としては、哺乳類細胞が挙げられる。好ましい宿主細胞としては、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞、ＣＯＳ細胞などが挙げられる。このような宿主細胞の本発明によるプラスミドまたはベクターを用いる形質転換は、常法Ausebel，F.M．et al.，分子生物学における最新のプロトコール（Curr ent Protocols in Molecular Biology)、John Wiley & Sons、ニューヨーク（１９８９年）を用いて行なうことができる。更にもう一つの態様では、本発明は、培地中で本発明による形質転換細胞を酵素を産生するのに十分な時間培養することによって本発明の酵素を産生する方法を提供する。好ましくは、細胞を第１ａ図に示されるｃＤＮＡ５、ｃＤＮＡ６、ｃＤＮＡ１０、またはｃＤＮＡ１４のような発現プラスミドで、本発明のＤＮＡの１態様が挿入されているものに形質転換した。温度、媒質などの特定の培養条件により、形質転換細胞の型および個性が変化する。しかしながら、適当な条件を選択することは、十分に熟練技術者の能力の範囲内にある。例えば、様々な細胞の型について好適な培養条件は、Ausebel，F.M．et al.，分子生物学における最新のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)、John Wiley & Sons、ニューヨーク（１９８９年）に教示されており、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。もう一つの態様では、本発明は、本発明の酵素に特異的に結合する新規なモノクローナルまたはポリクローナル抗体を提供する。これらの抗体は、Harlow，E ．et al.、抗体：実験室便覧(Antibodies:A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Press、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８８年）に記載されているような常法を用いて産生することができ、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。好ましくは、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。本発明の抗体は、放射能標識、発色団（例えば、蛍光標識）、または酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ）のような任意の通常の標識で標識することができる。本発明は、試料中の本発明の酵素の検出および／または定量のための新規なイムノアッセイも提供する。本発明のイムノアッセイは、本発明の酵素に特異的に結合する本発明のモノクローナルまたはポリクローナル抗体の１種類以上を用いている。好ましくは、本発明のイムノアッセイでは、モノクローナル抗体を用いている。本発明のイムノアッセイは、競争アッセイ、サンドイッチアッセイ、または置換アッセイ、例えばHarlow，E．et al.、抗体：実験室便覧(Antibodies:A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８８年）に記載されているようなものであることができ、放射能標識、発色団、または酵素、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼによって生成されるシグナルに依存することがある。本発明のＤＮＡ配列、酵素、プラスミド、細胞および方法は、多くの用途を有する。例えば、本発明は、ＧＤＰ−Ｆｕｃ：ＮｅｕＮＡｃα（２，３）−β−Ｄ −Ｇａｌ（１，４）−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃα（１，３）フコシルトランスフェラーゼとして機能することができる特異的なこれまで発見されていなかったタンパク質配列をコードする以前には発見されていなかったネズミＤＮＡ配列を提供する。これらの酵素は、本発明のＤＮＡ配列によって発現すると、哺乳類細胞内で、これらの細胞上で特異的細胞表面複合糖質構造のデ・ノボ発現を生成する働きをする。これらの構造は、シアリルＬｅｗｉｓｘ決定基｛ＮｅｕＡｃα（２，３）Ｇａｌβ（１，４）［Ｆｕｃα（１，３）］ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ｝であって、Ｒが下になっている複合糖質−糖タンパク質、糖脂質、遊離オリゴ糖、またはヒドロキシル基であるものに対する抗体によって認識される。これらの酵素は、発生段階特異的胎児性抗原Ｉ（ＳＳＥＡ−１またはＬｅｗｉｓｘ；構造Ｇａｌβ（１，４）［Ｆｕｃα（１，３）］ＧｌｃＮＡｃ）、Ｌｅｗｉｓａ構造またはシアリルＬｅｗｉｓａ構造として知られる特異的細胞表面複合糖質構造のデ・ノボ発現を生じないことが示されている。この酵素は、本明細劃己載のクローニングしたＤＮＡ配列によって発現されるときには、ＤＮＡ配列を発現する細胞から調製される抽出物でアッセイするときにその名称で暗示される酵素的に作用することも示されている。この酵素のオリゴ糖生成物は、α（２，３）シアリル化した「ＩＩ型」ラクトースアミン受容体のＧｌｃＮＡｃ残基にα１，３配置で連結したフコースを表す。この生成物を、以後シアリルＬｅｗｉｓｘ決定基と呼ぶ。便宜上、この反応は、下記の式で示される。ＧＤＰ−フコースのＮｅｕＮＡｃα（２，３）Ｇａｌβ［ＳＯ₄−６］ＧｌｃＮＡｃへの移行も、同様に進行する。この酵素は、下記に示されるものに類似または同一の他のオリゴ糖前駆体であって、下線部のＧａｌまたはＧａｌＮＡｃ残基が別の分子（単糖またはオリゴ糖、修飾されたシアリル酸残基、または硫酸塩など）で置換されており、簡単のため以後シアリルＬｅｗｉｓｘとも表されるこれらの分子上のＧｌｃＮＡｃ残基へα（１，３）結合のフコースを移行するものを用いることもできる。Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃ−ＲＮｅｕＮＡｃα（２，３）［ＧａｌＮＡｃβ（１，４）］Ｇａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃ−ＲＮｅｕＮＡｃα（２，３）ＧａｌＮＡｃβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃ−ＲＮ−グリコリルＮｅｕα（２，３）Ｇａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃ−ＲＳＯ₄−３−Ｇａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃ−ＲＮｅｕＮＡｃα（２，３）［ＳＯ⁴−６］Ｇａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃ− ＲＮｅｕＮＡｃα（２，３）［ＳＯ₄−６］Ｇａｌβ（１，４）［ＳＯ₄−６］ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（上記式中、ＲはＮに結合したまたはＯに結合したオリゴ糖残基または主鎖である）。本発明の触媒ドメインの配置は、数種類の構造的に類似した酵素の触媒ドメインと比較することによって推定される。具体的な実用的特徴としては、下記のものが挙げられる。 i. （バイオテクノロジー工業による診断薬および治療薬の生産のための）この酵素の生成物を表すシアリルＬｅｗｉｓｘ決定基による細胞表面、細胞内または分泌タンパク質または脂質上でのオリゴ糖の翻訳後修飾に関する特異的可能性を有する動物細胞系の構築。具体的には、本明細書に記載のクローニングしたＤＮＡ配列は、通常は同系酵素またはその生成物（オリゴ糖上のシアリルＬｅｗｉｓｘ決定基）を発現しないが、適当な（複数の）オリゴ糖前駆体およびＧＤＰ−フコースの発現を保持している哺乳類細胞系に標準的手法によって導入され、「センス」方向でその細胞に転写され、細胞表面、細胞内または分泌タンパク質または脂質上のオリゴ糖のシアリルＬｅｗｉｓｘ決定基を発現することができる細胞系を生成することができる。あるいは、これらのクローニングしたＤＮＡ配列を、標準的手法によって、同系酵素およびその生成物（シアリルＬｅｗｉｓｘ決定基）を発現する哺乳類細胞系に導入して、「アンチ−センス」方向でその細胞に転写して、細胞表面、細胞内または分泌タンパク質または脂質上のシアリルＬｅｗｉｓｘ決定基を発現することができない細胞系を生成することができる。細胞中での本発明のＤＮＡ配列の導入および「アンチ−センス」転写は、Maniatis，T．et al.，分子クローニング：実験室便覧(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９年）に記載されているような常法を用いて行なうことができ、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。あるいは、（複数の）同系酵素を発現する哺乳類細胞中の内因性の（複数の）ＧＤＰ−Ｆｕｃ：ＮｅｕＮＡｃα（２，３）−β−Ｄ−Ｇａｌ（１，４）−Ｄ−ＧｌｃＮａｃα （１，３）フコシルトランスフェラーゼは、相同組換え技術によって、または本発明のＤＮＡ配列を用いる「アンチ−センス」オリゴヌクレオチド法によって、または本発明のＤＮＡ配列からまたは構造的に関連しているが他は野生型のα（１，３）フコシルトランスフェラーゼから突然変異誘発および遺伝学的選択法によって誘導される内因性の（複数の）ＧＤＰ−Ｆｕｃ：ＮｅｕＮＡｃα（２，３）−β−Ｄ−Ｇａｌ（１，４）−Ｄ−ＧｌｃＮａｃα（１，３）フコシルトランスフェラーゼを不活性化する極めて有力なネガティブ突然変異体フコシルトランスフェラーゼ配列によって、本発明のＤＮＡ配列を用いて不活性化することができる。この方法を用いて、本発明のクローニングしたＤＮＡ配列およびそれらの同系酵素によって決定される特異的翻訳後修飾によって有用性または効力が変化する診断薬または治療薬材料を産生するのに適した宿主細胞である動物細胞系を構築することができる。例えば、多くの治療用タンパク質またはペプチド、組替え体など生物学的効果は、それらに共有結合している（複数の）オリゴ糖構造によって決定的に変化することが知られている。これらのオリゴ糖の構造は、主として、これらの治療用生成物を産生するのに用いられる細胞で見出だされるグリコシルトランスフェラーゼの数および種類の関数である。動物細胞および幾つかの酵母は、これらのグリコシル化反応を行なうのに適しているが、総ての動物細胞または酵母によって総てのグリコシルトランスフェラーゼ酵素が産生されるのではないので、幾つかのオリゴ糖構造（本発明の酵素によって生成されるシアリルＬｅｗｉｓｘ決定基など）は、それらによって産生されない。逆も正しく、すなわち産生細胞は、本明細書記載のＤＮＡ配列によってコードされるＧＤＰ−Ｆｕｃ：ＮｅｕＮＡｃα（２，３）−β−Ｄ−Ｇａｌ（１，４）−Ｄ−ＧｌｃＮａｃα （１，３）−フコシルトランスフェラーゼに類似のまたは同一のグリコシルトランスフェラーゼを発現することができる。シアリルＬｅｗｉｓｘ決定基は、哺乳類または他の真核宿主によって産生される天然または組替え治療または診断薬（糖タンパク質または糖脂質）の生物学的活性を（よかれ悪かれ）変化させることがあると思われる。これらの組替え化合物を産生するのにバイオテクノロジー産業で用いられる真核宿主細胞を、ＤＮＡ配列情報および本発明に記載の関連情報を用いて変化させ、所望な宿主で本明細書に記載のクローニングした配列の総てまたは一部を発現することによってシアリルＬｅｗｉｓｘ決定基を組替え生成物上のオリゴ糖に付加することができる。あるいは、シアリルＬｅｗｉｓｘ決定基を、トランスフェクションした「アンチ−センス」ベクター構築物、組替えに基づいた遺伝子不活性化、「アンチ−センス」オリゴヌクレオチド法、または上記の最有力なネガティブ突然変異体フコシルトランスフェラーゼの使用により、これらの宿主細胞で産生される生成物から除去することができる。この工程に用いた古い「方法」としては、この特定の酵素、または適当に修飾した組替えまたは天然生成物の産生のために同様なまたは同一の方法で機能する酵素を発現するまたは発現しない細胞系を同定する経験的方法が挙げられる。この特定の翻訳後修飾能力を有する細胞系は天然には存在せずまたは適当に修飾した生成物の高水準の産生に特に適してはいないことがあるので、これは常に最適ではない。あるいは、経験的に同定された動物細胞系によって産生された治療薬材料上に存在する好ましくないシアリルＬｅｗｉｓｘ決定基を、化学的または酵素的に除去しなければならず、この工程は費用がかかったりまたは非効率的であることがある。これらの古い方法に対して、上記手法と共同したクローニングした機能的な本発明のＤＮＡ配列を用いることの利点としては、糖タンパク質または糖脂質のオリゴ糖上にシアリルＬｅｗｉｓｘ決定基を生成する能力を特異的に欠いている細胞系を構築する能力が挙げられる。適正に構築されたこれらの細胞系では、好ましくないシアリルＬｅｗｉｓｘ決定基を除去する目的での治療薬または診断薬材料の化学的または酵素的処理の必要性は全くなくなる。更に、シアリルＬｅｗｉｓｘ決定基が、動物細胞によって産生される特定の診断または治療生成物に望ましいことが見出だされる場合には、これらの残基を生成させる目的で、細胞系を本発明のクローニングしたＤＮＡ配列で処理することができる。 ii．（酵素反応器などでの）オリゴヌクレオチドの効率的な酵素合成および産生に適した試薬の単離オリゴヌクレオチドは、臓器移植の分野での免疫調節試薬としての治療用途を有することがある。特に、可溶性および固相オリゴ糖は、Ｌｅｗｉｓ血液型群系などの臓器提供者と受容者との主要な血液型群抗原系の差による不適合などの場合の抗体によって伝達される臓器移植拒絶反応をブロックまたは改善するための治療薬として使用されることがある。同様に、可溶性オリゴ糖は、細菌性、ウイルス性または寄生虫性病原体が侵襲する動物組織の表面に見られる複合糖質「受容体」へのこれらの病原体の付着をブロックすることによって機能する治療薬としても用いられることがある。例えば、Ｌｅｗｉｓ血液型群のオリゴ糖抗原の一部は、幾つかの形態の尿路病原性細菌の「受容体」として作用している証拠がある。更に、このような複合糖質は、発生および分化過程での細胞間および細胞とそれらの環境との間の接着現象の調節に関与している。これらの現象としては、精子の卵への結合、および着床の開始時における受精卵の子宮壁への付着を媒介する初期現象が挙げられる。これらの観察は、例えば（生物学的に「自然な」オリゴ糖分子の避妊薬としての用途があることを示唆している。更に、シアリルＬｅｗｉｓｘ決定基を含む特異的複合糖質は、免疫系の細胞間、およびある種の腫瘍細胞と血管樹を整列させる内皮細胞の表面との間の接着の媒介に重要な役割を演じている接着分子のセレクチンファミリーのリガンドとして包含されている。報告された観察により、本明細書記載のクローニングしたフコシルトランスフェラーゼ配列は、抗炎症および抗腫瘍転移機能を有する薬学特性を有するオリゴ糖型分子を構築するのに用いることができ、かつ急性肺疾患（ＡＲＤＳ）および心筋梗塞の後の組織再灌流における生命を脅かすような組織の損傷を防止することができることが確認されている（例えば、Buerke，M.，et al.，J．Clin．Inv est.，vol．93，pp．1140-1148(1994);Mulligan，M.S.，et al.，Nature，vol． 364，pp．149-151(1993);およびMulligan，M.S.，et al.，J．Exp．Med.，178， pp．623-631(1993)を参照されたい）。現在は、シアリルＬｅｗｉｓｘ決定基を含むオリゴ糖の薬学上有用な量は、化学合成（非効率的で費用がかかる方法）、（多量の動物または植物材料の処理および他の混入オリゴ糖から所望なオリゴ糖を精製する必要が多い費用がかかり、非効率的方法を用いる）天然供給源からの単離、または他の組替えα（１，３）フコシルトランスフェラーゼを用いるグリコシルトランスフェラーゼによって補助される合成法によって生産されている。本発明は、本明細書において、多量の精製ＧＤＰ−Ｆｕｃ：ＮｅｕＮＡｃα（２，３）−β−Ｄ−Ｇａｌ（１，４） −Ｄ−ＧｌｃＮＡｃα（１，３）−フコシルトランスフェラーゼを合成する機構を提供する。これは、シアリルＬｅｗｊｓｘ決定基を含む構造の酵素的合成が可能な酵素バイオリアクター（例えば、Ball，et al.，J．Am．Chem．Soc.，vol 114，pp．5449-5451(1992)に記載されているような溶液状、または酵素の触媒ドメインに融合したプロテインＡ残基を介する固相マトリックス上に固定された酵素）を構築するのに用いることができた。これは、様々な理由から、シアリルＬｅｗｉｓｘ決定基を含む構造の化学合成または天然資源からのそれらの精製を伴うまたは他の既知のα（１，３）フコシルトランスフェラーゼを用いることによる方法よりも効率的である。第一に、必要な化合物だけが酵素基質であり、これらは容易に得られまたは合成される。第二に、このような構造の酵素合成は、基質加水分解の所望な生成物およびヌクレオチド二リン酸生成物だけを生成する。この後者の化合物は、動物細胞におけるこれらの反応の天然の副生成物として見出だされ、比較的毒性がなく、オリゴ糖合成生成物から容易に分離することができる。対照的に、化学合成法は、典型的には除去しなければならずかつ有毒でもある副反応の多数の生成物を生じる。同様に、天然資源からのオリゴ糖の精製は、天然材料に含まれる他の混入オリゴ糖を除去する必要がある。第三に、酵素触媒は、予想外に効率的であり、基質をほとんど完全に生成物に転換することができる。対照的に、オリゴ糖上でのシアリルＬｅｗｉｓｘ決定基の化学合成は、多段階工程であり、各段階の収率は１００％よりかなり低いことがあり、現在用いられている化学合成法の累積効率は、酵素的合成で可能な効率には近づかない。同様に、天然資源からのシアリルＬｅｗｉｓｘ決定基を有するオリゴ糖の精製では、混入している関係のないオリゴ糖から所望なオリゴ糖を分離するのにようする精製法に固有なかなりの損失を伴い、所望なオリゴ糖の単離が非効率的になることがある。本発明のＤＮＡ配列によってコードされるＧＤＰＦｕｃ：ＮｅｕＮＡｃα（２，３）−β−Ｄ−Ｇａｌ（１，４）−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃα（１，３）−フコシルトランスフェラーゼは、これまで動物組織では同定されていなかった。しかしながら、理論的には、この活性は、合成目的で動物組織から部分的に精製することができる。しかしながら、これらの精製は、主としてこれらの酵素は典型的には極めて低い存在量で含まれているので、それ自身典型的には非効率的である。本発明は、この酵素を多量に産生することができる２種類の機構を提供する。第一に、これは、比較的多量の酵素を産生する動物細胞の構築および選択によって行なうことができる。あるいは、次に、本発明の核酸配列を、標準的組替えＤＮＡ技術によって用いて、哺乳類宿主細胞、真菌、酵母において、または他の真核細胞を基剤とする系（すなわち、バキュロウイルス哺乳類宿主）を用い、または原核性宿主でグリコシルトランスフェラーゼを多量に産生させることができる。更に、この酵素をコードする配列を、標準的分子クローニング法または突然変異誘発によって修飾して、野生型酵素より所望な新規特性を有する組替えフコシルトランスフェラーゼを生成させることができる。例えば、この修飾は、酵素をバイオリアクターで一層安定で、固定に一層適するようにし、または特定の基質に対する触媒効率を一層向上させるようにすることができる。 iii. 検索試薬として直接用いられる、または検索用途にＧＤＰＦｕｃ：ＮｅｕＮＡｃα（２，３）−β−Ｄ−Ｇａｌ（１，４）−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃα（１，３）−フコシルトランスフェラーゼに対する抗体を生成させるのに用いられる組替えＧＤＰＦｕｃ：ＮｅｕＮＡｃα（２，３）−β−Ｄ−Ｇａｌ（１，４）− Ｄ−ＧｌｃＮＡｃα（１，３）−フコシルトランスフェラーゼの産生に適した試薬の単離本発明は、オリゴ糖および糖タンパク質の構造および機能を検討するための検索手段として用いることができる本発明の酵素（上記ii.を参照されたい、すなわち特別に構築された動物細胞、またはこれらの酵素をコードする天然または合成遺伝子による）を多量に産生する２種類の方法を提供する。同様に、この方法によって産生された酵素、またはこの方法によって提供された核酸配列および誘導タンパク質配列を用いて、（合成ペプチドまたは組替えタンパク質による）この酵素に対する抗体を生成させることができる。これらの抗体を検索試薬として用いて、これらの酵素の生合成および加工を検討することもでき、本明細書記載の総ての用途を目的とするそれらの精製における助剤として用いることもできる。 iv．診断試薬としてのグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体 α（１，３）フコシルトランスフェラーゼの異常発現は、ヒトの悪性疾患と関連しており、この酵素は多数のヒト組織に関する悪性疾患の早期検出の腫瘍マーカーとして作用することができることを示している。酵素腫瘍マーカーは、典型的には競合グリコシルトランスフェラーゼ活性により非特異性を施すことができる活性分析法によって体液中で分析されてきた。これらの分析法は、不活性酵素を主要マーカーとして用いることができるが、酵素活性分析法によっては検出されない可能性があるので、感受性が鈍いこともある。本発明は、この酵素に対する抗体（ＧＤＰ−Ｆｕｃ：ＮｅｕＮＡｃα（２，３）−β−Ｄ−Ｇａｌ（１，４）−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃα（１，３）−フコシルトランスフェラーゼをコードするクローニングしたＤＮＡ配列から誘導される情報から構築される合成ペプチドに対する、または真核または原核宿主によって産生された組替え酵素に対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体）を生成する機構を提供する。このようにして産生したこのＧＤＰ−Ｆｕｃ：ＮｅｕＮＡｃα（２，３）−β−Ｄ−Ｇａｌ（１，４）−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃα（１，３）−フコシルトランスフェラーゼに特異的な抗体を用いて、酵素活性分析法を凌ぐ特異性および感受性で体液中のこのグリコシルトランスフェラーゼを検出し定量して、悪性疾患の早期検出のための方法として用いることができる。 v. フコシルトランスフェラーゼ阻害剤または不活性化剤のための天然および合成化合物のスクリーニングに用いる組替え酵素シアリルＬｅｗｉｓｘ決定基は、Ｅ−セレクチンおよびＰ−セレクチンのカウンターレセプターの必須成分である。関連化合物は、Ｌ−セレクチンの候補リガンドである。これらのレセプター−カウンターレセプターは、白血球（（再循環現象での）通常の好中球、単球、好酸球、リンパ球、およびある種のＴリンパ球）を血管樹に残し、ヒトの正常な炎症現象またはヒトの病的炎症現象（例えば、ＡＲＤＳ、組織再潅流時の損傷、および他の現象の宿主）に関与させる作用を行なう。本発明のＧＤＰ−Ｆｕｃ：ＮｅｕＮＡｃα（２，３）−β−Ｄ−Ｇａｌ（１，４）−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃα（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、ヒト白血球で発現し、シアリルＬｅｗｉｓｘ生合成に中心的役割を演じているので、この酵素の薬理学的阻害剤は、白血球のシアリルＬｅｗｉｓｘ発現を少なくし、急性および慢性セレクチン依存性炎症状態におけるヒトまたは他の動物で使用する抗炎症性医薬品として作用する。本明細書に記載のＧＤＰ−Ｆｕｃ：ＮｅｕＮＡｃα（２，３）−β−Ｄ−Ｇａｌ（１，４）−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃα（１，３）−フコシルトランスフェラーゼは、天然生成物または化学的ライブラリーの化合物を（スクリーニングアッセイにおいて組替え酵素またはこの酵素を発現する細胞系を用いて）同定する「スクリーニング法」により、または（組替え酵素による酵素の三次構造を解決した後、酵素の触媒活性または他の本質的機能を阻害する分子のデザインまたは同定による）「合理的な薬剤デザイン」法によりこの酵素を阻害する化合物を同定する手段を表している。多数の研究が、細胞のオリゴ糖での多数の細胞表面シアリルＬｅｗｉｓｘ決定基とその細胞を悪性疾患のように転移させる能力との間の関連に注目してきた。ここで因果関係があれば、本発明の酵素を阻害する薬剤を抗腫瘍薬として用いることができる。本開示に記載の試薬は、クローニングした配列を標準的手法で用いて比較的多量のフコシルトランスフェラーゼを産生させることができるので、抗フコシルトランスフェラーゼ活性の化合物をスクリーニングに有用であることを示すことができる。これは、可能性のある阻害剤の効果を純粋な酵素で試験するので、スクリーニングに役立ち、全細胞抽出物でまたは部分的に精製した酵素を用いて見られるような結果の混同はない。 vi．分泌または細胞関連複合糖質での新規な複合糖質構造を生じるためのグリコシルトランスフェラーゼ基質特異性の処理法本発明は、クローニングしたＧＤＰ−Ｆｕｃ：ＮｅｕＮＡｃα（２，３）−β −Ｄ−Ｇａｌ（１，４）−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃα（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子であって、適当な転移および遺伝学的選択法で用いるとき、野生型酵素によって生成されるものとは異なるグルコース結合を生成する突然変異体ＧＤＰ−Ｆｕｃ：ＮｅｕＮＡｃα（２，３）−β−Ｄ−Ｇａｌ（１，４）−Ｄ− ＧｌｃＮＡｃα（１，３）−フコシルトランスフェラーゼを生成することができるものを提供する。これらの新規結合は、天然に存在することがありまたは存在することができず、それらが結合する分子の生物学的活性を向上させる残基として用いることができる。この酵素は、他のα（１，３）フコシルトランスフェラーゼに対する一次配列類似性を維持しており、かつ異なる組の受容体基質利用特性を示すので、指定突然変異誘発を考えることもできる。あるいは、突然変異誘発および選択法を用いて、有力なネガティブ的に作用する突然変異体ＧＤＰ−Ｆｕｃ：ＮｅｕＮＡｃα（２，３）−β−Ｄ−Ｇａｌ（１，４）−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃα（１，３）−フコシルトランスフェラーゼを生成させることもできる。このような酵素の（複数の）生成物が所望でない場合には、このようにして生成した有力なネガティブ突然変異体を用いて内因性グリコシルトランスフェラーゼ活性を不活性化することができる。例えば、オリゴ糖からの各種の糖結合（フコース、マンノースなど）をイン・ビトロおよびイン・ビボで加水分解するフコシダーゼとして作用する突然変異体ＧＤＰ−Ｆｕｃ：ＮｅｕＮＡｃα（２，３）−β− Ｄ−Ｇａｌ（１，４）−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃα（１，３）−フコシルトランスフェラーゼを生成させることもできる。 vii. このフコシルトランスフェラーゼ座における遺伝子型形成個体本明細書で詳細に説明されるＤＮＡ配列によってコードされるものと類似のフコシルトランスフェラーゼが存在しないことは、数種類のファミリーで認められている。このような不在が有害な表現型と関連している場合には、このクローニングした遺伝子セグメントに相当する遺伝子内またはこれに結合した制限断片長多型などのＤＮＡ配列多型を用いて、遺伝学的カウンセリングの目的でこの座における個体の遺伝子型形成を行なうことができる。同様に、本明細書記載の遺伝子セグメントがこのような有害な表現型に原因的に関連している場合には、このような表現型の分子的基礎を本明細書に記載の遺伝子セグメントの研究によって解明することができる。 viii．抗炎症医薬として作用する阻害薬の同定および産生ヒト白血球でシアリルＬｅｗｉｓｘ形成を阻害する化合物が、毒性を持たないならば、白血球におけるシアリルＬｅｗｉｓｘの合成を防止して、炎症の際に細胞が炎症を起こした血管内皮に（セレクチンを介して）結合することができなくすることによって、抗炎症性医薬として作用し、血管外の炎症作用に関与することができないので、このような化合物を同定する目的で多くの努力が払われてきている。このような分子に対する一つの候補標的は、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ酵素である。白血球およびリンパ球集合体の高内皮性小静脈で有意な量で発現され、シアリルＬｅｗｉｓｘ決定基も合成することができるのは、既知のフコシルトランスフェラーゼだけであるので、他の既知のフコシルトランスフェラーゼのいずれよりも良好な候補である。更に、この酵素の欠損について遺伝学的処理を施したマウスの白血球は、Ｅ−セレクチンおよびＰ−セレクチンの機能的リガンドの発現を欠いており、炎症部位への白血球の移動が欠損していることを特徴とする付随する免疫欠損を示す。これらの観察は、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩが白血球セレクチンリガンド発現を制御することを示しており、医薬化合物または手段によるこの酵素の阻害は、セレクチン依存性の炎症が病理学的なものであるヒトの疾患で治療効果を有することがある抗炎症作用を表すことを示している。組替えＦｕｃ −ＴＶＩＩの利用可能性は、阻害薬についての化学的ライブラリーおよび天然生成物ライブラリーをスクリーニングする目的で高スループットアッセイ(highthr oughput assays)で用いられるので、このような阻害化合物の同定が容易になる。更に、組替え形態の酵素または組替え技術によって作成した酵素の誘導体を用いて、機能的に重要な表面（すなわち、ＧＤＰ−フコース結合ポケット、金属結合ポケット、オリゴ糖受容体基質結合ポケットなど）の形態を包含するその三次配座を決定することができる。次に、「合理的薬剤デザイン」法を用いて、阻害薬として作用する形態学的相補性を有する分子を同定または合成することができる。 ix．シアリルＬｅｗｉｓｘ四糖の「１ポット」のイン・ビボ合成シアリルＬｅｗｉｓｘ四糖、および幾つかの誘導体は、セレクチン依存性炎症の動物モデルでの抗炎症性分子として作用することが示されている（例えば、 M．Buerke et al.，J．Clin．Invest.，vol.93，pp．1140-1148(1994);M.S．Mul ligan et al.，Nature，vol．364，pp．149-151(1993);およびM.S．Mulligan et al.，J．Exp．Med.，vol．178，pp．623-631(1993)を参照されたい）。これらの分子は、現在臨床試験を行われている。シアリルＬｅｗｉｓｘ分子の化学合成は、非常に費用がかかる。従って、グリコシルトランスフェラーゼを用いた合成法であって、組替えグリコシルトランスフェラーゼを用いてシアリルＬｅｗｉｓｘ残基の特異的かつ効率的合成を行なう方法が開発された。これらの系は、グリコシルトランスフェラーゼに必要なヌクレオチド糖基質を連続的に形成する追加の酵素（下記の工程図には示されていない）を伴う（Ichikawa et al.，J． Am．Chem．Soc.，vol．114，p．9283(1992)を参照されたい）。以前に存在している酵素の性質により、従来の合成法では、「二ポット」合成で進行しなければならず（下記を参照）、最初のポットのシアリル化生成物を（Ｒｘｎ＃１の）非シアリル化中間生成物から分離した後、Ｒｘｎ＃３を行なう第二の「ポット」に加えなければならない。これは、利用可能なフコシルトランスフェラーゼ（すなわち、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ、Ｆｕｃ−ＴＶ、およびＦｕｃ−ＴＶＩ）はＧａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃ（Ｌｅｗｉｓｘを形成）およびＮｅｕＮＡｃα（２，３）Ｇａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃ（シアリルＬｅｗｉｓｘを形成）に移動するので、競争反応（Ｒｘｎ＃４）を回避するために必要であった。Ｌｅｗｉｓｘは任意の既知のα（２，３）シアリルトランスフェラーゼによってシアリル化することができないので（Ｒｘｎ＃５）、Ｌｅｗｉｓｘが形成すると、Ｒｘｎ＃２の基質を消費することによって収率が著しく減少する。この問題は、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩを用いて回避することができる。この酵素は、Ｇａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃ上で作用することができないので、最初のポットに入れることができる。Ｒｘｎ＃２の生成物が製造されるまでは、これは作用せず、この時点でＲｘｎ＃３を完結することになる。従って、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩは、下記のような１ポット合成が可能である。１ポット合成本発明の他の特徴は、下記の典型的な態様の説明の経過において明らかになるものであり、これらの態様は、本発明の例示の目的で示したものであり、発明の制限しようとするものではない。実施例実験手順細胞培養ＣＯＳ−７細胞(K.M．Gersten et al.，J．Biol．Chem.，vol．2 70，pp．25047-25056(1995))、ＣＨＯ−Ｔａｇ細胞(P.L．Smith et al.，J．Bio l．Chem.，vol．269，pp．15162-15171(1994))、および培養したネズミ血液細胞系（Ｂ細胞系Ｓ１０７、(M.L．Atchison et al.，Cell，vol．48，pp．121-128( 1987))；Ｔ細胞系ＥＬ４(L.J．Old et al.，Cancer Res.，vol．25，pp．813-81 9(1965);Ｂ細胞ハイブリドーマ系ＴＨ２．５４．６３(T．Hamano et al.，J．Im munol.，vol．130，pp．2027-2032(1983))；Ｂ細胞ハイブリドーマ系１８０．１ (M．Hummel et al.，J．Immunol.，vol．138，pp．3539-3548(1987))；Ｆｒｉｅｎｄネズミ赤白血球系ＭＥＬ(D．Singer et al.，Proc．Natl．Acad．S ci．U.S.A.，vol．71，pp．2668-2670(1974);B.L．Weber et al.，Science，vol ．249，pp．1291-1293(1990));マクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４．７(P．Ralp h et al.，J．Immunol.，vol．119，pp．950-954(1977);W.C．Raschke et al.， Cell，vol．15，pp．261-267(1978));マクロファージ細胞系Ｐ３８８Ｄ₁(H.S．K oren et al.，J．Immunol.，vol．114，pp．894-897(1975));および細胞毒性Ｔ −細胞系１４−７ｆｄ(T.J．Braciale et al.，J．Exp．Med.，vol．153，pp．9 10-923(1981);M.E．Andrew et al.，J．Immunol.，vol．132，pp．839-844(1984 ))の供給源および成長条件。抗体本明細書で用いられるモノクローナル抗体の供給源は、以前に記載されている（抗−Ｌｅｗｉｓｘ／抗−ＳＳＥＡ−１(D．Solter et al.，Proc．N atl．Acad．Sci．U.S.A.，vol．75，pp．5565-5569(1978));抗−Ｈおよび抗−Ｌｅｗｉｓａ(K.M．Gersten et al.，J．Biol．Chem.，vol．270，pp．25047-25 056(1995));抗−シアリルＬｅｗｉｓｘ／ＣＤＬＥＸ（K．Fukushma et al.，C ancer Res.，vol．44，pp．5279-5285(1984));抗−シアリルＬｅｗｉｓａ(D.C hia et al.，Cancer Res.，vol．45，pp．435-437(1985));抗−ＶＩＭ−２抗体( B.A．Macher et al.，J．Biol．Chem.，vol．263，pp．10186-10191(1988));フルオレセインと複合化したヤギ抗−マウスＩｇＭおよびＩｇＧ抗体；Sigma）。ＭＥＣＡ−７９(P.R．Streeter et al.，J．Cell Biol.，vol．107，pp．1853-1 862(1988))は、Louis PickerおよびEugene Butcher両博士（スタンフォード大学）のご好意により寄贈された。ｃＤＮＡクローニングマウスＦｕｃ−ＴＶＩＩｃＤＮＡは、マウス細胞毒性T細胞系１４−７ｆｄ(P.L．Smith et al.，J．Biol．Chem.，vol.269，pp．15 162-14171(1994))から構築したｃＤＮＡライブラリーから、コロニーハイブリダイゼーション法(T．Maniatis et al.，分子クローニング：実験室便覧(Molecula r Cloning:A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory Pres s、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８２年）)およびヌクレオチド２０５３〜２２８５に相当するマウスＦｕｃ−ＴＶＩＩ遺伝子（第２図）のセグメントを用いて単離した。ネズミゲノムライブラリースクリーニングマウス３Ｔ３細胞ＤＮＡ(Strat agene)から調製したゲノムライブラリーからの約１．０×１０⁶個の組替えλファージを、ヒトＦｕｃ−ＴＶＩＩ遺伝子（ヌクレオチド５７１〜８９４）の３２４ｂｐセグメントと、以前に報告された低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション法(K.M．Gersten et al.，J．Biol．Chem.，vol．270，pp．25047-25056( 1995);K.M．Gersten et al.，博士論文，pp．66-98，University of Michigan， Ann Arbor，ミシガン（１９９５年）)を用いてプラークハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。独特な制限パターンを有するファージ由来のＤＮＡをＳａｃＩで消化して、ヒトＦｕｃ−ＴＶＩＩプローブと交差ハイブリダイゼーションした２．６ｋｂ断片をゲル精製し、ｐＴＺ１９Ｒ(Pharmacia LKB Biote chnology，Inc.)のＳａｃＩ部位にクローニングした。単一のインサートを含む代表的なサブクローンをｐＭＦｕｃ−ＴＶＩＩと命名した。２．６ｋｂインサートのＤＮＡ配列を、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ(Sequenase，United States Bioche mical Corp.)および隣接プラスミド配列によって合成されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてジデオキシチェインターミネーション法(F．Sanger et al．，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，vol．74，pp．5463-5467(1977))によって決定した。配列データを用いて、追加の合成プライマーをデザインした後、これを用いてｐＭＦｕｃ−ＴＶＩＩにおけるＳａｃＩインサートの残りの部分を配列決定した。配列分析は、University of Wisconsin Genetics Computor Group(GCG) の配列分析ソフトウェアパッケージ(J．Devereux et al.，Nucleic Acids Res. ，vol．12，pp．387-395(1984))およびIBI Pustell Sequence Analysis Softwar eパッケージ(IBI)を用いて行なった。配列整列を、ＧＣＧパッケージのＧａｐ機能で集めた。ＣＯＳ−７細胞およびＣＨＯ−Ｔａｇ細胞のトランスフェクションおよび分析ＣＯＳ−７細胞を、以前に報告されたＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション法を用いて、各種のＦｕｃ−ＴＶＩＩ発現ベクターでトランスフェクションした（J.F．Kukowska-Latallo et al.，Genes & Dev.，vol．4，pp．1288-1 303(1990);T．Maniatis et al.，分子クローニング：実験室便覧(Molecular Clo ning:A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８２年））。ＣＨＯ−Ｔａｇ細胞を、以前に修飾したように(P.L．Smithetal.，J．Biol．Chem.，vol．269，pp． 15162-15171(1994))、リポソームを基剤とした試薬（Ｎ−［２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル」−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート、ＤＯＴＡＰ、Boehringer Mannheim）を用いてプラスミドＤＮＡでトランスフェクションした。一過性トランスフェクションした細胞を、トランスフェクションの７２時間後に回収し、以前に記載したように(B.W．Weston et al.，J．Biol．Chem.，vol． 267，pp．24575-24584(1992))染色媒質で希釈したモノクローナル抗体で染色した。抗−Ｌｅｗｉｓａ、抗−Ｈおよび抗−シアリルＬｅｗｉｓｘ抗体を１０ μｇ／ｍｌで用いた。抗−Ｌｅｗｉｓｘは、１：１０００の希釈倍率で用いた。抗−シアリルＬｅｗｉｓａは、１：５００の希釈倍率で用いた。抗−ＶＩＭ −２抗体は、１：２００の希釈倍率で用いた。次いで、細胞を、フルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗−マウスＩｇＭまたは抗−マウスＩｇＧで染色して、以前に記載の方法でＦＡＣＳｃａｎ(Becton-Dickinson)上で分析を行なった (B.W．Weston et al.，J．Bio1．Chem.，vol．267，pp．24575-24584(1992))。細胞を、プラスミドｐＣＤＭ８−ＣＡＴ(P.L．Smith et al.，J．Biol．Chem.， vol．269，pp．15162-15171(1994))を用いてコトランスフェクションを行ない、これらの細胞から調製された抽出物をクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性分析に付し(P.L．Smith et al.，J．Biol．Chem.，vol．269，pp．15 162-15171(1994))、トランスフェクション効率に対するフローサイトメトリーおよびウェスタン・ブロットデータを考慮した。フコシルトランスフェラーゼアッセイＦｕｃ−ＴＶＩＩ発現ベクターで一過性トランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞を、トランスフェクションの７２時間後に回収し、抽出物を以前に報告した通りにこれらの細胞から調製した(J.F ．Kukowska-Latallo et al.，Genes & Dev.，vol．4，pp．1288-1303(1990);B.W ．Weston et al.，J．Biol．Chem.，vol．267，pp．4152-4160(1992))。これらの抽出物を、α（１，３）フコシルトランスフェラーゼアッセイに付し(B.W．We ston et al.，J．Biol．Chem.，vol．267，pp．24575-24584(1992))、総容量を２０μｌに集めた。反応混合物は、３μＭＧＤＰ−［¹⁴Ｃ］フコース、２０ｍＭ受容体（Ｎ−アセチルラクトースアミン、ラクトース、ラクト−Ｎ−ビオースＩ、２’−フコシルラクトース(Sigma)、または３’−シアリル−Ｎ−アセチルラクトースアミン(Oxford Glycosystems)）、５０ｍＭカコジレート緩衝液、ｐＨ６．２、５ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭＬ−フコース、１５ｍＭＭｎＣｌ₂、および反応の経過中に（１時間）ほぼ線状反応条件を生じるのに十分な量の細胞抽出物タンパク質（ＧＤＰ−フコース基質の１５％未満の消費）を含んでいた。コントロール反応は、反応混合物に受容体を省くことによって調製し、これらの反応で得られた値を、相当する受容体を含む反応から差し引いた。このバックグラウンド放射能は、再現可能にアッセイの総放射能の１％未満であり、製造業者から得たＧＤＰ−［¹⁴Ｃ］フコースに含まれる遊離の［¹⁴Ｃ］フコースに相当する。同一の酵素調製物を、異なる受容体基質を用いる酵素活性の測定のためのアッセイに用いた。中性受容体（Ｎ−アセチルラクトースアミン、ラクトース、ラクト−Ｎ−ビオースＩ、２’−フコシルラクトース、いずれもSigma製）を含む反応を、２０μ ｌエタノールおよび５６０μｌ水を加えて停止した。試料を１５，０００×ｇで５分間遠心分離し、５０μｌの分量をシンチレーションカウンティングに付し、反応における放射能の総量を測定した。２００μｌの分量を、Dowex 1X2-400、ギ酸型(J.F．Kukowska-Latallo et al.，Genes & Dev.，vol．4，pp．1288-1303 (1990);B.W．Weston et al.，J．Biol．Chem.，vol．267，pp．4152-4160(1992) ４００μｌを含むカラムに適用した。カラムを水２ｍｌで洗浄し、カラムによって保持されない放射性反応生成物をシンチレーションカウンティングによって定量した。受容体ＮｅｕＮＡｃα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ(Oxford Glyc osystems，Inc.)との反応を、５．０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ６．８９８０μｌを加えることによって停止した。次いで、試料を１５，０００×ｇで５分間遠心分離し、５００μｌの分量をリン酸型で調製したDowex 1X8-200カラム（１ｍｌ）に適用した。反応生成物を集めて、上記のようにして定量した(B .W．Weston et al.，J．Biol．Chem.，vol．267，pp．24575-24584(1992))。ウサギ抗−Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ抗体の生成ＰＣＲを用いて、酵素の「幹」および触媒ドメインに相当するネズミＦｕｃ−ＴＶＩI遺伝子のセグメントを、塩基対２１９４〜２２２４および３０５３〜３０８５；第２図；５’プライマーgc gcggatccCACCATCCTTATCTGGCACTGGCCTTTCACC；３’プライマーgcgcggatccAGTTCAA GCCTGGAACCAGCTTTCAAGGTCTTC；ＢａｍＨｌ部位に下線を施した）に相当するＰＣＲプライマーを用いて増幅した(J.B．Lowe，Seminars in Cell Biology，vol．2 ，pp．289-307(1991))。ＰＣＲは、１．５分、９４℃の変性段階および２．０分、７２℃アニーリング／伸長段階からなる増幅２０回を用いて完了した。次に、ＰＣＲ生成物を、Ｔ７Escherichia coli発現ベクターｐＥＴ−３ｂのＢａｍＨＩ部位にクローニングした(F.W．Studier et al.，Methods Enzymol.，vol．185， pp．60-89(1990))。正確な配向の単一インサートを含む（ｐＥＴ−３ｂ−Ｆｕｃ − ＴＶＩＩ幹／ｃａｔと呼ばれる）１つのクローンのインサートを配列決定して、ＤＮＡ増幅の際にエラーが導入されなかったことを確認した。組替えＦｕｃ−ＴＶＩＩ融合タンパク質をｐＥＴ−３ｂ−Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ幹／ｃａｔを有する中期−対数相E．coli(BL21 Lys S)を３時間誘導することによって産生した（K.M． Gersten et al.，博士論文，pp．66-98，UniversityofMichigan，Ann Arbor，ミシガン（１９９５年）;F.W．Studier et al.，Methods enzymol，vol．185，pp ．60-89(1990)）。次に、細菌を集めて、細菌懸濁液を凍結した後、融解することによってリーシスした。細菌性ゲノムＤＮＡを音波処理によって剪断した後、可溶性および不溶性材料を遠心分離によって分離した。Ｆｕｃ−ＴＶＩＩタンパク質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によって測定した通り、不溶性画分に見出だされた(E．Harlow et al.，抗体：実験室便覧(Antibodies:A Laborat ory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク（１９８８年）)。組替え体E．coliから誘導されるＦｕｃ−ＴＶＩＩをSＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画し、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩを含むゲルのセグメントを切り出した後、ウサギ免疫の抗原として用いた。ウサギ免疫化供給物は購入した(P el-Freeze Biologicals; Rogers，アリゾナ)。最初に、３羽のウサギのそれぞれを、完全Freundのアジュバントと混合した粉末化したポリアクリルアミドゲルスライス中Ｆｕｃ−ＴＶＩＩを総量で約２００μｇで皮下免疫した。引き続く免疫化は、抗原を不完全Freundのアジュバントに投与したことを除き、１４日間隔で本質的に同一の方法で行なった。総数で約６回の二次免疫化の最後のものの１０日後に抗血清を集めた。抗−Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ抗体の抗原アフィニティー精製ｐＥＴ−３ｂ−Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ幹／ｃａｔのインサートをＢａｍＨＩで消化することによって放出させ、E．coli発現ベクターｐＡＴＨ１０(T.J．Koerner et al.，Methods Enzy mol.，vol．194，pp．477-490(1991))のＢａｍＨＩ部位の間にクローニングし、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ配列にフレームで融合したE．coliアントラニレートシンターゼ配列から誘導される融合タンパク質を生成した。この組替え融合タンパク質を、E．coli菌株ＤＨ５α（Ｍ９培地中０．０１２５％インドールアクリル酸で６時間誘導）で発現した。細菌を集め、洗浄して、５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭＥＤＴＡ中リゾチームで処理し、０．６５％ＮＰ−４０，０．３８ＭＮａＣｌで処理した後、最大マイクロチップセッティングで２０秒間音波処理(Vibracell，Sonics and Materials，Inc.，ダンバリー，コネチカット )により崩壊させた(T.J．Koerner et al.，Methods Enzymol，vol．194，pp．47 7-490(1991))。封入体を５０ｍＭＴｒｉｓＨCｌ、ｐＨ７．５，５ｍＭＥＤＴＡで２回洗浄し、１％ＳＤＳ、１２ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、５％グリセロール、１％２−メルカプトエタノール中で１００℃まで加熱することによって可溶化させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。分画したタンパク質を、電気ブロッティング（１ｍＡ／ｃｍ²）によってＰＶＤＦ膜（Bio-Rad Labor atories,ヘラクレス，カリフォルニア）に移した。次に、膜を、１０％ウシ血清アルブミンおよび０．２％Tween-20を含むＰＢＳで４℃で４〜６時間ブロックした。組み替えＦｕｃ−ＴＶＩＩ融合タンパク質を含む膜のストリップを、０．５ｍｌのウサギ抗−マウスＦｕｃ−ＴＶＩＩ抗血清で４℃で一晩インキュベーションし、３％ウシ血清アルブミンおよび０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ２．５ｍｌで希釈した。次に、膜を室温で、ＰＢＳ，０．０５％Tween-20で洗浄し、小切片にスライスし、結合した抗体を、氷上の膜断片を４５０μｌＴｒｉｓ −グリシン，ｐＨ２．５中でインキュベーションすることによって溶出した。上清を集めて、１００μｌの１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０で直ちに中和した。溶出手順は１秒間行ない、２種類の溶出液をプールし、続いて免疫組織化学的手続きに用いた。ウェスタン・ブロット分析細胞抽出物は、トランスフェクションの７２時間後にトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞から調製した。抽出物は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１％ＳＤＳ、および１０％グリセロールを含んでいた。抽出物を、調製後直ちに３分間煮沸し、使用まで凍結保管した。タンパク質含量は、ＢＣＡ試薬法を用いて測定した。抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に、ジチオトレイトールを０．１Ｍの最終濃度まで、ブロモフェノールブルーを０．０５％の最終濃度まで加えることによって調製した。次いで、試料を煮沸し、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動によって分画した。電気泳動の後、タンパク質をＰＶＤＦ膜(Biorad)に電気移動した。膜を濯いだ後、１０％ウシ血清アルブミンおよび０．２％Tween-20を含むリン酸緩衝食塩水，ｐＨ７．４中で４℃で１２〜１４時間ブロックした。ブロットをリン酸緩衝食塩水，ｐＨ７．４、０．２％Tween-20中で室温にて洗浄し、抗原アフィニティー精製ウサギ抗−Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ抗体の１：２００の希釈率でプローブした。次に、ブロットを洗浄し、セイヨウワサビ結合抗−ウサギ免疫グロブリン(Sigma) の１：２５００希釈率でプローブした。次に、ブロットを濯ぎ、ＥＣＬ試薬(Ame rsham，英国）に暴露し、オートラジオグラフィに付した。ノーザンブロット分析総ＲＮＡを、マウス（ＦＶＢ／Ｎ）組織および培養した細胞系から、公表された手続きを用いて調製した（T．Maniatis et al.，分子クローニング：実験室便覧(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８２年））。オリゴ−ｄＴ−精製ポリＡ＋ＲＮＡ試料を、ホルムアルデヒドを含む１．０％アガロースゲル中で電気泳動し、ナイロン膜(Hybond-N，A mersham)に移した。ノーザンブロットを、１×ＰＥ、５×ＳＳＣ、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、および１５０μｇ／ｍｌの剪断を加えたサケ精子ＤＮＡ中４２℃で２時間プレハイブリダイゼーションした。ブロットを、ｐＭＦｕｃ− ＴＶＩＩ中のインサートから単離したα［³²Ｐ］で標識した９７４ｂｐのＥａｇＩ−ＥｃｏＲＩ断片を含むプレハイブリダイゼーション溶液で４２℃で１８時間ハイブリダイゼーションした。Ｅａｇｌ部位をヌクレオチド２２２８〜２２３３に配置し、ＥｃｏＲＩ部位は塩基対３２０２〜３２０７に亙っている。ブロットを沸騰している０．１ＳＤＳ中でストリッピングし、ニワトリグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼプローブ(A．Dugaiczyk et al.，Biochemistry， vol．22，pp．1605-1613(1983))で再ハイブリダイゼーションして、ＲＮＡ試料が完全なままであり、等量で載荷されたことを確認した。マウスＬ−セレクチン／ＩｇＭキメラ組織化学的プローブの構築マウスＬ −セレクチンｃＤＮＡ(M.H．Siegelman et al.，Science，vol．243，pp．1165- 1172(1989))は、University of Texas Southwesten Medical Center、ダラス、テキサスのMark Siegelman博士の好意により提供された。細胞外ドメインを、そのトランスメンブランドメインの結合点でＨｐｈｌ消化物に続いてアダプターのリチゲーション(litigation)で切断した。ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメインを含むヒトＩｇＭｃＤＮＡ（Dr．Ernie Kawasakiの好意により提供された）を、Ｌ−セレクチンをコードするオープン・リーディング・フレームをヒトＩｇＭのＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメインをコードするオープン・リーディング・フレームに融合する方法でＬ−セレクチン配列のアダプター修飾末端に連結した。この断片を、ＳＲαプロモーターに関してセンス配向でＳＲαプロモーターの直ぐ下流のベクターＳＲα−ＰＣＤＭ８に挿入した。このベクターを、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション法を用いてＣＯＳ−７細胞に導入した(J.F ．Kukowska-Latallo et al.，Genes & Dev.，vol．4，pp．1288-1303(1990);T． Maniatis et al.，分子クローニング：実験室便覧(Molecular Cloning:A Labora tory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８２年）)。トランスフェクションの３日後に、トランスフェクションした細胞から培地を回収して、新たな培地（ＤＭＥＭ，１０％ＦＣＳ，Ｐ／Ｓ，Ｑ）に置き換え、４日後に回収した。Ｌ−セレクチン／ＩｇＭキメラを、ヤギ抗−ヒトＩｇＭアガロース上でアフィニティークロマトグラフィーによって精製して、約４０倍に濃縮した。免疫組織化学的手続き末梢（腋窩）および腸間膜リンパ節、およびパイアー斑を、マウスから屠殺直後に単離した。これらのリンパ様組織をＯＣＴ培地（ Tissue-Tek，Miles，エルクハート，インディアナ）に埋設し、Leica 2800N低温槽で切断し、ガラス顕微鏡スライド上に集めた。抗−Ｆｕｃ−ＴＶＩＩで染色される切片を、氷上でリン酸緩衝食塩水中２％パラホルムアルデヒド中で２０分間固定した。切片を室温でリン酸緩衝食塩水で濯ぎ、室温でリン酸緩衝食塩水中５０ｍＭＮＨ₄Ｃｌで急冷した後、水で簡単に濯いだ。次に、組織を、氷上で１００％メタノールで２０分間浸透性にし、リン酸緩衝食塩水で再水和した後、室温でブロッキング溶液Ａ（２％ヤギ血清、０．０５％Triton X-100、０．０５％Tween 20を含むリン酸緩衝食塩水）で３０分間インキュベーションした。ブロッキング溶液を吸引し、切片をブロッキング溶液Ａ中で５μｇ／ｍｌの最終濃度で用いた抗原アフィニティー精製抗−Ｆｕｃ−ＴＶＩＩで７℃で一晩インキュベーションした。一晩インキュベーションした後、抗−Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ／ブロッキング溶液を除去し、スライドをリン酸緩衝食塩水で洗浄し、ブロッキング溶液Ａで１：２００倍に希釈したＦＩＴＣ接合ヤギ抗 −ウサギＩｇＧ試薬(Sigma)で室温にて１時間インキュベーションした。次に、スライドを、シチフルオル(citifluor)(Citifluor Products，Chemical Laborat ory，The University，Canterbury，Kent CT2 7NH)を設けたリン酸緩衝食塩水中で室温で洗浄し、免疫蛍光顕微鏡法(Leitz DM RB顕微鏡)によって検討した。モノクローナル抗体ＭＥＣＡ−７９(P.R．Streeter et al.，J．Cell Biol.， vol．107，pp．1853-1862(1988))で染色を行なう切片を、２％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝食塩水中で氷上に固定し、室温でリン酸緩衝食塩水で洗浄し、室温で５０ｍＭＮＨ₄Ｃｌ／リン酸緩衝食塩水で２０分間急冷した。次に、スライドを水で簡単に濯ぎ、１００％メタノールで２０分間氷上で浸透性化し、リン酸緩衝食塩水中で再水和した後、ブロッキング溶液Ａ（２％ヤギ血清、０．０５％Triton X-100、０．０５％Tween 20を含むリン酸緩衝食塩水）で室温にて一晩インキュベーションした。次に、ブロッキング溶液を吸引し、切片を、ブロッキング溶液Ａ中でＭＥＣＡ−７９を５μｇ／ｍｌの濃度で１時間７℃でインキュベーションした。次いで、切片を、リン酸緩衝食塩水で室温で十分に洗浄した。次いで、洗浄した切片を、ブロッキング溶液Ａ中で１：２００倍の希釈率で用いたＴＲＩＴＣ接合ヤギ抗−ラットＩｇＭ試薬（Jackson ImmunoResearch、ペンシルバニア）を用いて、室温で１時間インキュベーションした。次に、スライドをシチフルオルを設けたリン酸緩衝食塩水で室温で３回洗浄し、検討を行なった。Ｌ−セレクチン／ＩｇＭキメラで染色を行なう切片を１％パラホルムアルデヒド、０．１Ｍカコジレート，ｐＨ７．１中で２０分間氷上で固定した後、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水，ｐＨ７．４で洗浄した。Ｌ−セレクチン／ＩｇＭキメラを、３ｍＭＣａＣｌ₂または５ｍＭＥＤＴＡを補足したブロッキング溶液Ｂ（２％ヤギ血清を含むＴｒｉｓ緩衝食塩水，ｐＨ７．４）中６０μｇ／ｍｌの濃度で切片に適用し、７℃で一晩インキュベーションを行なった。次いで、切片を、３ｍＭＣａＣｌ₂Ｏ補足した氷冷Ｔｒｉｓ緩衝食塩水で十分に洗浄した。次に、切片を、ブロッキング溶液Ｂで１：２００倍に希釈し、３ｍＭＣａＣｌ₂または５ｍＭＥＤＴＡを補足したビオチニル化ヤギ抗−ヒトＩｇＭ試薬(Sigma)で、７℃ で１時間インキュベーションした。次に、切片を、３ｍＭＣａＣｌ₂を補足した氷冷Ｔｒｉｓ緩衝食塩水で洗浄し、３ｍＭＣａＣｌ₂を補足したブロッキング溶液Ｂで１：２００倍に希釈したＦＩＴＣ接合ストレプトアビジン試薬(Vecto r Labs、バーリンガム、カリフォルニア）を用いて７℃で１時間インキュベーションした。スライドを、３ｍＭＣａＣｌ₂を補足し、シチフルオルを設けた氷冷Ｔｒｉｓ緩衝食塩水で洗浄し、免疫蛍光顕微鏡法（Leitz DM RB顕微鏡）によって検討した。インシトゥでのハイブリダイゼーション法インシトゥでのハイブリダイゼーション法を、公表された手続きの変法を用いて行なった（D.G．Wilkinson，インシトゥハイブリダイゼーション：実際的方法(In Situ Hybridization:A Pract ical Approach)，IRL Press，Oxford University Press，オックスフオード、英国）。新鮮なネズミ腋窩リンパ節、腸間膜リンパ節、およびパイアー斑をＯＣＴ培地（Tissue-Tek，MILES，エルクハート，インディアナ）中に埋設し、イソペンタン中液体窒素上で急速凍結した。低温槽切片（１０ｐＭ）をSuperfrost/Plu s顕微鏡スライド（Fisher Scientific，ピッツバーグ，ペンシルバニア）上に集め、新たに調製した４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で３０分間氷上で固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、５ｍＭＥＤＴＡ中１μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫで、室温にて５分間消化した。次いで、スライドをＰＢＳで洗浄し、再度４％パラホルムアルデヒド中で固定し、水で濯ぎ、０．２５％無水酢酸／０．１Ｍトリエタノールアミン，ｐＨ８．０で１０分間室温で処理した。アセチル化に続いて、ＰＢＳ、次いで０．８５％ＮａＣｌでの室温洗浄を行なった。次に、スライドを、等級付けした一連のエタノールの水溶液（３０％、５０％、８０％、９５％、１００％エタノール）中で脱水した。風乾した切片に、³⁵Ｓで標識したＲＮＡをセンスまたはアンチセンスの配向で含むハイブリダイゼーション溶液を重層した。ＲＮＡプローブは、組替え体Ｔ７またはＳｐ６ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ベクターｐＣＤＮＡＩ(Invitrogen) にサブクローニングしたマウスＦｕｃ−ＴＶＩＩ遺伝子（塩基対２１９７〜２４９４，第２図）のコード領域から誘導されるＤＮＡセグメントに隣接するＴ７またはＳｐ６プロモーター配列上で開始するイン・ビトロ転写手続きによって誘導された。ハイブリダイゼーション溶液は、５０％脱イオンホルムアミド、０．３ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０、５ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ８．０、１０％硫酸デキストラン、１Ｘデンハート溶液（T．Maniatis et al.，分子クローニング：実験室便覧(Molecular C loning:A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８２年））、０．５ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、１０ｍＭジチオトレイトール、および１０⁷ｃｐｍ／ｍｌの放射能標識したプローブを含んでいた。ハイブリダイゼーション溶液を、切片上でカバースリップおよびＤＰＸ配設培地（BDH Lab Supplies，プール，英国）でシールした。ハイブリダイゼーションを、５Ｘ標準食塩水クエン酸塩(Standard Sa line Citrate)（ＳＳＣ）で加湿したシールした容器で５５℃で１６時間行なった。ハイブリダイゼーションの後、ＤＰＸ配設培地シールを除き、スライドを５５℃で５ＸＳＳＣ、１０ｍＭジチオトレイトールで洗浄した後、６５℃で３０分間ホルムアミド洗浄緩衝液（５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、２０ｍＭジチオトレイトール）で洗浄した。次に、スライドを、３７℃で、０．５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、５ｍＭＥＤＴＡで洗浄した。次に、スライドを、ＲＮＡアーゼＡ（１μｇ／ｍｌ）で３７℃で３０分間消化し、ホルムアミド緩衝液で洗浄した後、２×ＳＳＣ、次いで０．１×ＳＳＣで洗浄した。スライドを、等級付けした一連のエタノールの０．３Ｍ酢酸アンモニウム溶液（３０％、５０％、８０％、９５％、１００％エタノール）で脱水し、風乾して、ＮＴＢ２液体エマルション(Kodak)でコーティングした。２〜３週間の暴露時間の後、エマルションを製造業者によって示唆された手続きを用いて展開した。次に、切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、Leitz DMRB顕微鏡を用いて明視野および暗視野様式で検討を行ない、撮影した。結果ハイブリダイゼーションスクリーンは、新規なネズミα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ座を同定する。新規なネズミα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を単離する努力において、ネズミのゲノムＤＮＡファージライブラリーをヒトＬｅｗｉｓα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｃ−ＴＩＩＩ）(Ｊ.F．Kukowska-Lata llo et al.，Genes & Dev.，vol．4，pp．1288-1303(1990))の触媒ドメインに相当するプローブで、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を用いてスクリーニングした（実験手順を参照されたい）。１種類のファージであって、ヒトα（１，３）フコシルトランスフェラーゼファミリー（Ｆｕｃ−ＴＩＩＩ− ＶＩ）の４種類の以前にクローニングしたメンバーによってコードされたアミノ酸配列と約４０％のアミノ酸配列類似性を有する翻訳リーディング・フレームを有するインサートを含むものを単離した(J.F．Kukowska-Latallo et al.，Genes & Dev.，vol．4，pp．1288-1303(1990);B.W．Weston et al.，J．Biol．Chem. ，vol．267，pp.24575-24584(1992);B.W．Weston et al.，J．Biol．Chem.，vol ．267，pp．4152-4160(1992);J.B．Lowe et al.，J．Biol．Chem.，vol．266，p p．17467-17477(1991);S.E．Goelz et al.，Cell，vol．63，pp．1349-1356(199 0);R．Kumar et al.，J．Biol．Chem.，vol．266，21777-21783(1991))。このゲノム配列に相当する転写体を同定するため、オープン・リーディング・フレームを表すファージインサートのセグメントを用いて、マウス細胞系および組織から調製したノーザンブロットをプローブした。このプローブに相当する転写体を、ネズミ細胞毒性Ｔ−細胞系１４−７ｆｄで同定した(T.J．Braciale et al.，J．Exp．Med.，vol．153，pp．910-923(1981);M.E．Andrew et al.，J．lm munol.，vol．132，pp．839-844(1984))。この細胞系から構築されたｃＤＮＡライブラリー(P.L．Smith et al.，J．Biol．Chem.，vol．269，pp．15162-15 171(1994)を、ファージインサートのセグメントとのハイブリダイゼーションによってスクリ-ニングし、１６種類のハイブリダイゼーション陽性コロニーを生成した。総てで１６種類のｃＤＮＡクローンを、相当するゲノムＤＮＡの配列と同様に測定した（第１ａ図）。この配列データの解析により、この座は、別のスプライシング現象および恐らくは別の転写開始現象から誘導された複数の構造的に異なる転写体を生成することを示している。５クラスのｃＤＮＡが同定された（第１図）。これらのｃＤＮＡ配列の解析により、ヒトＦｕｃ−ＴＩＩＩ、Ｆｕｃ−ＴＩＶ、Ｆｕｃ−ＴＶ、およびＦｕｃ−ＴＶＩに対するアミノ酸配列類似性を有するオープン・リーディング・フレームの翻訳を開始する働きをすることがある３種類のメチオニンコドンが同定されている（第２図）。これらのメチオニンコドンの位置は、異なるサイトゾルドメイン（エキソン２および／または３によってコードされる）を有するが、同一のゴルジ体に局在した触媒ドメイン（エキソン４によってコードされる）を有するα（１，３）フコシルトランスフェラーゼの合成を予想している。１つの比較的多量に存在するクラスのｃＤＮＡ（ｃＤＮＡ１４で表される）は、ヌクレオチド１９４７のメチオニンコドンで開始するオープン・リーディング・フレームを保持している。このリーディング・フレームは、アミノ酸９〜３１から誘導される疎水性のトランスメンブランセグメントを有する３４２残基の３９，４２４ＤａのＩＩ型トランスメンブランタンパク質を予想している（第２図）。ヌクレオチド２１２６のインフレームメチオニンコドンは、３１８残基の３６，８３６Ｄａのポリペプチドであって、ヌクレオチド１９４７で開始されたより長いリーディング・フレームによって予想されたポリペプチドの疎水性のトランスメンブランセグメント内で開始するものを予想している。同様な構造上の配置は、ｃＤＮＡ６および１０によって表される２種類の他のｃＤＮＡクラスで認められる。しかしながら、これらの２種類のｃＤＮＡは、ヌクレオチド９９６に相当するメチオニンコドンを有する追加の上流エキソンを含む点でｃＤＮＡ１４とは異なる。このメチオニンコドンによって開始された翻訳リーディング・フレームは、ヌクレオチド１９４７のメチオニンコドンに近い位置のエキソン２における終止コドンによって切断され、従ってヒトα（１，３）フコシルトランスフェラーゼと類似性を共有するポリペプチドを生成することはできない。しかしながら、ｃＤＮＡ５では、エキソン２が存在しないため、ヌクレオチド９９６のメチオニンコドンによって生成した翻訳リーディング・フレームは、エキソン４における配列とインフレームで継続することができる。この配置は、ｃＤＮＡ１４によって予想されたタンパク質について画定された同じ推定上のトランスメンブランセグメントを有する３８９残基の４４，４９２ＤａのＩＩ型トランスメンブランタンパク質の合成を予想している（第２図）。最後に、ｃＤＮＡ３は、エキソン４のスプライス受容体部位とヌクレオチド２１２６のメチオニンコドンとの間でそれぞれ開始する比較的多量に存在するクラスのｃＤＮＡの代表例である。このクラスのｃＤＮＡは、他のクラスのｃＤＮＡに相当するタンパク質について予想されたトランスメンブランセグメント内で開始する３１８残基の３６，８３６Ｄａのポリペプチドを予想している。これらのネズミｃＤＮＡによって予想されたポリペプチドは、その時点で知られている４種類のヒトα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｃ−ＴＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩ）に対する一次配列類似性を共有するため、それらの１個以上がα（１，３）フコシルトランスフェラーゼとして機能すると思われる。しかしながら、ネズミペプチド配列は、これらのヒト酵素のそれぞれに対するほぼ同等の配列類似性を共有するので、それらのいずれかのネズミ同族体を表さず、従ってＦｕｃ−ＴＶＩＩと命名されるものと思われる。この名称は、このネズミ遺伝子を用いて、ヒトＦｕｃ−ＴＶＩＩをコードするｃＤＮＡを単離する引き続く研究によって正当化された(S．Natuska et al.，J．Biol．Chem.，vol．2 69，pp．16789-16794(1994))。３種類の推定的開始コドンのいずれも、翻訳開始のKozakの法則と一致する配列に関しては埋設されていない（第２図）(M．Kozak，Cell，vol．44，pp．283- 292(1986))。これらの開始コドンおよび同族のｃＤＮＡのいずれが予想された（複数の）ポリペプチドをコードするかを決定し、この座がα（１，３）フコシルトランスフェラーゼをコードすることを確かめるため、ＣＯＳ−７細胞をそれぞれのクラスの代表的なｃＤＮＡでトランスフェクションし、トランスフェクション生成物を(i)ｃＤＮＡによって決定される細胞表面に局在したフコシル化オリゴ糖抗原を同定し、(ii)ｃＤＮＡによってコードされたポリペプチドを同定して、定量子、(iii)イン・ビトロα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ活性分析を用いてトランスフェクション生成物細胞抽出物におけるｃＤＮＡによって決定されるα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ活性を同定し、部分的に特性決定するために分析を行なった。５クラスの内の３個に代表的なｃＤＮＡ（ｃＤＮＡ６、１０および１４）（第１図）は、トランスフェクションによってＣＯＳ−７細胞に導入されるときには、比較的高濃度の細胞表面に局在したｓＬｅ^X発現（それぞれ３５．１％、２１．８％、および１６．５％、２％のバックグラウンドより高い）を決定する。ｃＤＮＡ５も、ＣＯＳ−７細胞での細胞表面ｓＬｅ^X発現を、ｃＤＮＡ６、１０および１４によって決定されるｓＬｅ^X発現水準より低い水準（９％陽性細胞）で指示している。対照的に、これら４種類のｃＤＮＡのいずれも、Ｌｅｗｉｓｘ、Ｌｅｗｉｓａ、またはシアリルＬｅｗｉｓｘ決定基の発現を指示しない。これらの結果は、それぞれのｃＤＮＡにおける２個の潜在的なメチオニンイニシエーターコドンが、翻訳を効率的に指示し、α（１，３）フコシルトランスフェラーゼ活性を生成することができることを示している。これらの観察は、更に、このα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ活性がｓＬｅ^X決定基を形成するためにα（２，３）シアリル化ラクトースアミンを基剤としたグリカン構造を用いることができることを示しているが、この活性は、中性のＩＩ型オリゴ糖Ｌｅｗｉｓｘ前駆体、Ｌｅｗｉｓａ異性体に対する中性またはα（２，３）シアリル化Ｉ型前駆体も効率的に利用しない。これらの４種類のｃＤＮＡ総ては、ＣＯＳ−７細胞における定量的に同一の細胞表面抗原プロフィールを定量的に指示するので、それぞれは、個々にまたは一緒にポリペプチドであって、個々にまたは一緒に本質的に同一の受容体基質特異性を維持するものの発現を指示すると思われる（少なくとも検討を行なった４種類の抗原について）。ｃＤＮＡ５、６、１０、および１４で得られた結果とは対照的に、ｃＤＮＡ３は検出可能なｓＬｅ^X発現を指示しない。この結果は、このｃＤＮＡのヌクレオチド２１２６でのメチオニンコドンが同族ｍＲＮＡの翻訳の開始を効率的に促進せず、従って機能的に有意な濃度の酵素活性をコードしないことを示唆している。あるいは、このｃＤＮＡは、α（１，３）フコシルトランスフェラーゼ活性を持たないポリペプチドをコードすることがある。これら５種類のｃＤＮＡをＬｅｗｉｓｘおよびsＬｅ^X決定基の発現に重要な別の細胞系（ＣＨＯ−Ｔａｇ細胞）で発現すると、定量的に同一の結果が得られた。ＣＯＳ−７細胞とは異なり、この細胞系は、内部的にフコシル化したＶＩＭ −２決定基（ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ １，４−（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ）を形成することもできる(B.W． Weston et al.，J．Biol．Chem.，vol．267，pp．24575-24584(1992))。ＣＨＯ −Ｔａｇ細胞で発現するときには、ｃＤＮＡのいずれもＶＩＭ−２エピトープの発現を指示しないことが分かった。一緒に考慮すると、これらの結果は、ｃＤＮＡの総てではなくとも、幾つかは、末端のα（２，３）シアリル化ラクトースアミン単位上でＮ−アセチルガラクトースアミン残基のα（１，３）フコシル化を触媒することができるα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ活性をコードすることができるが、α（２，３）シアリル化ポリラクトースアミン前駆体上の内部Ｎ−アセチルガラクトースアミン残基や中性のＩＩ型前駆体についてはそうではないことを示している。それぞれのｃＤＮＡに特徴的なｓＬｅｘ発現効率が相当するタンパク質の発現の水準と相関することを確かめるため、トランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞の細胞抽出物を、予想したポリペプチドの組替え形態に対して生じたアフィニティー精製ウサギポリクローナル抗体を用いてウェスタン・ブロット分析を行なった（第１ｂ図）。ｃＤＮＡ６、１０および１４でトランスフェクションした細胞は、分子量が３５ｋＤａ〜３７ｋＤａの２種類の主要な形態のタンパク質を発現する。少量の数種類の他のタンパク質も、これらの細胞で明らかである。これら３種類のｃＤＮＡによって生じた免疫反応性タンパク質の量は、それぞれによって指定されたｓＬｅｘ発現の濃度と相関する。この観察は、それぞれによって指定された相対的ｓＬｅｘ発現水準は、それぞれの相当するｍＲＮＡが翻訳される効率によって変化し、従って同族のポリペプチドの相対的な細胞内蓄積によって変化することを示している。ｃＤＮＡ５でトランスフェクションした細胞は、複数の免疫反応性ポリペプチドも含む（第１ｂ図）。これらのタンパク質の最も多量に存在する対は、ｃＤＮＡ６、１０および１４でトランスフェクションした細胞で検出されたタンパク質よりも速やかに移動し、ｃＤＮＡ６および１０によって指定される免疫反応性タンパク質とほぼ同様な量である。ｃＤＮＡ５は、これら２種類のｃＤＮＡよりも低水準の細胞表面ｓＬｅｘ発現を指示するので、ｃＤＮＡ５でトランスフェクションした細胞に見られる低Ｍｒ免疫反応性ポリペプチドは、ｃＤＮＡ６、１０および１４によってコードされるタンパク質よりも実質的に低い特異的酵素活性を維持し、またはＣＯＳ−７細胞におけるｓＬｅｘ発現を指示することが余りできない。最後に、ｃＤＮＡ３でトランスフェクションした細胞は、如何なる検出可能な免疫反応性タンパク質も含まない。これは、このｃＤＮＡの塩基対２１２６での推定的イニシエーターコドンが免疫反応性生成物の翻訳を開始せず、このｃＤＮＡはＣＯＳ−７細胞へのトランスフェクションの後ｓＬｅｘ発現を生成しないという観察と一致している。上記にまとめたフローサイトメトリーおよびウェスタン・ブロット分析から誘導される結論は、同じ細胞抽出物で行なわれたイン・ビトロでのα（１，３）フコシルトランスフェラーゼアッセイの結果によって支持されている。これらのアッセイは、ｃＤＮＡ５、６、１０、および１４でトランスフェクションした細胞が、ヌクレオチドドナー基質ＧＤＰ−フコースから低分子量受容体３’−シアリル−Ｎ−アセチルラクトースアミン（ＳＬＮ；ＮｅｕＮＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）へ¹⁴Ｃで標識したフコースを移行することができる酵素活性を含むことを示している（第１ａ図）。それぞれのｃＤＮＡについて、この反応の生成物は、イオン抑制アミン吸着ＨＰＬＣによって分画すると、放射能標識したｓＬｅ^X四糖標準と共に同時溶出する。これらの４種類のｃＤＮＡのそれぞれによって指示されたα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ活性は、中性受容体基質Ｎ−アセチルラクトースアミンまたはラクト−Ｎ−ビオースＩを用いない。また、ｃＤＮＡ３でトランスフェクションした細胞から調製した抽出物は、３ ’−シアリル−Ｎ−アセチルラクトースアミンで試験したときにも、中性受容体基質Ｎ−アセチルラクトースアミンまたはラクト−Ｎ−ビオースＩで試験したときにも、検出可能なα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ活性を含まない。これらの結果は、上記にまとめたフローサイトメトリーデータと完全に一致しており、この座が、末端がα（２，３）結合シアル酸残基で置換しているＩＩ型受容体基質を明らかに必要としているα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ活性をコードすることを示している。一緒に考慮すれば、これらの結果は、特異的スプライシング(differential splicing)および／または転写開始現象は、α（１，３）フコシルトランスフェラーゼ活性の水準を制御することができ、従って、それぞれの転写体が翻訳される効率によって変化する機構を介して細胞表面sＬｅｘ発現水準を制御することができることを示唆している。マウスＦｕｃ−ＴＶＩＩ座の転写は、骨髄および肺に見られる細胞に限定される。ノーザンブロット分析は、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ座に相当する転写体が、成熟マウスの若干の組織だけで検出可能な濃度にまで蓄積することを示している（第３図）。多量の転写体の蓄積は、肺および骨髄に見られるだけであり、脾臓、すい臓および骨格筋では極めて微量が認められる。培養したネズミ血液細胞型細胞系のノーザンブロット分析では、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ転写体はマウス細胞毒性Ｔ系１４ −ｆｄ（Ｆｕｃ−ＴＶＩＩｃＤＮＡのクローニングに使用）およびマウスＴ細胞系ＥＬ４(L.J．Old et al.，Cancer Res.，vol．25，pp．813-819(1965))に比較的多量に存在することを示している。ネズミマクロファージ由来の系RAＷ(P．Ra lph et al.，J．Immunol.，vol．119，pp．950-954(1977);W.C．Raschke et al. ，Cell，vol．15，pp．261-267(1978))およびＰ３８８(H.S．Koren et al.，J． Immunol.，vol．114，pp．894-897(1975))では、転写体の蓄積は余り多くはない。Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ転写体は、ネズミ赤白血球細胞系MEＬ(D．Singer et al.，P roc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，vol．71，pp．2668-2670(1974);B.L．Weber et al.，Science，vol．249，pp．1291-1293(1990))でも、または３種類のネズミＢ−リンパ系譜細胞系［Ｓ１０７(M.L．Atchison et al.，Cell，vol．48，pp． 121-128(1987));ＴＨ２．５４．６３(T．Hamano et al.，J．Immunol.，vol．13 0，pp．2027-2032(1983));１８０．１(M．Hummel et al.，J．Immunol.，vol．1 38，pp．3539-3548(1987))］でも認められない。骨髄および肺はいずれも、数種類の大きさの異なる転写体、例えば大きさが約１．６および２．２ｋｂの２種類の多量に存在する転写体、および約３．０ｋｂの僅かな転写体を維持している。これらの３種類の転写体は、ネズミ１４−７ｆｄ細胞毒性T細胞系で見られた３種類の極めて多量に存在する転写体と大きさが類似している。これらの観察は、骨髄および肺の細胞が、１４−７ｆｄ細胞でのｃＤＮＡクローニング検討を特徴とするものに構造が類似した別にスプライシングした転写体を生じることを示唆している。これらのデータは、骨髄では、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ座が骨髄様およびＴ−リンパ球様系譜に割り当てられた細胞で転写されるが、Ｂ−リンパ球様系譜細胞型では転写されないことを示唆し、このフコシルトランスフェラーゼの発現は、骨髄様およびＴ−リンパ球様系譜細胞型でのセレクチンリガンド発現と相関していることを示唆している。Ｆｕｃ−ＴＶＩＩは、末梢リンパ節、腸間膜リンパ節、およびパイアー斑の高内皮性小静脈の内側を覆っている内皮細胞で発現する。肺におけるノーザンブロットシグナルに関与する肺における細胞型の同一性は、インシトゥハイブリダイゼーション分析によって開示された。これらの検討により、摘出した肺内部の側部気管リンパ節(paratracheal lymph nodes)のＦｕｃ −ＴＶＩＩ転写体を同定したが、他の細胞型では同定されなかった。これらの節での発現のパターンは、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ転写体は、これらの節内部の高内皮性小静脈に局在していることを示唆していた。シアリルＬｅｗｉｓｘ決定基の硫酸化誘導体がＨＥＶ特異性Ｌ−セレクチンリガンドに見られる末端オリゴ糖残基を表すことを示唆している最近の観察結果と一緒に考察すると(S．Hemmmerich e t al.，Biochemistry，vol．33，pp．4830-4835(1994);S．Hemmerich et al.，J ．Biol．Chem.，vol．270，pp．12035-12047(1995))、これらのＨＥＶでのＦｕｃ−ＴＶＩＩ転写体の検出は、このフコシル化オリゴ糖の合成における、およびリンパ球ホーミングの制御におけるこの座の可能な役割を示唆している。Ｆｕｃ −ＴＶＩＩのＨＥＶ特異性発現を更に特性決定するため、これを、Ｌ−セレクチンリガンド発現が十分に特性決定されている末梢リンパ節、腸間膜リンパ節、およびパイアー斑でのインシトゥハイブリダイゼーション分析を用いて系統的に評価した(S.D．Rosen et al.，Curr．0pin．Cell Biol.，vol．6，pp．663-673(19 94))。これらの解析（第４図）は、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ転写体が、３種類のリンパ様集合体総てのＨＥＶに容易に検出され得る水準まで蓄積することを示している。インシトゥハイブリダイゼーションシグナルは、パイアー斑を覆っている腸管腔表面を覆っている細胞の集合ではアンチ−センスＦｕｃ−ＴＶＩＩプローブでも得られる。これらは上皮細胞であると推定され、いわゆるＭ細胞と呼ばれることがあるが(R.L．Owen，Gastroenterology，vol．72，pp．440-451(1977))、それらの正確な同一性は未知のままである。上記のように、総てのＦｕｃ−ＴＶＩＩ由来の転写体がタンパク質生成物を生じるものではない。従って、免疫組織化学的解析を用いてＨＥＶに検出されるＦｕｃ−ＴＶＩＩ転写体がＦｕｃ−ＴＶＩＩポリペプチド発現を伴うことを確認し、このような発現がＬ−セレクチンリガンド発現と同時局在化する(co-localize s)ことを確認した。Ｆｕｃ−ＴＶＩＩペプチドに対して生じたウサギポリクローナル抗体は、３種類総てのリンパ様集合体でのＨＥＶ内の内皮細胞で細胞内染色パターンを生じる（第５図）。アンチ−Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ抗体で見られる核周囲の細胞内染色パターンは、この酵素がゴルジ装置に局在しており、Ｌ−セレクチンリガンド活性を有するフコシル化オリゴ糖の合成に関与することがあるという概念と一致している。３種類のリンパ様集合体のそれぞれにおいて、免疫反応性のＦｕｃ−ＴＶＩＩの発現は、ＨＥＶを染色し、ＨＥＶへのＬ−セレクチン結合と干渉することが以前に示されたＭＥＣＡ−７９抗体によって認識されたエピトープの発現と同時局在している(P.R．Streeter et al.，J．Cell Biol.，vol．1 07，pp．1853-1862(1988))。Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ発現は、組替えマウスＬ−セレクチン／ヒトＩｇＭキメラタンパク質で検出されたように、ＨＥＶ上のＬ−セレクチンリガンドの発現とも同時局在している。これらの観察は、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩが、ＨＥＶ由来のＬ−セレクチンリガンドのシアリル化、硫酸化、およびα（１，３）フコシル化候補のオリゴ糖成分の合成に関与することがあることを示している。動物での細胞表面のフコシル化オリゴ糖の機能を理解するための努力において、初期に細胞表面がフコシル化したオリゴ糖の発現を制御する座の組織特異的発現パターンを特性決定するための試薬として用いられたネズミα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を単離するためのプログラムを確立した。これらの試薬およびそれらの応用から収集された情報は、最終的にはそれらの発現パターンを摂動することによって同族の細胞表面フコシル化オリゴ糖の機能を解明するトランスジェニック法と共に用いられるであろう。本明細書に記載した交差ハイブリダイゼーション法では、触媒ドメインに相当する位置におけるヒトＦｕｃ−ＴｓＩＩＩ、Ｖ、およびＶＩ遺伝子の保存された部分から誘導されるセグメントと交差ハイブリダイゼーションする新規なゲノム配列を生じた。このネズミのゲノム座の単離の後、機能解析では、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩと呼ばれ、単離の時点ではα（１，３）フコシルトランスフェラーゼファミリーにとって独特な構造的特徴と触媒活性を有するα（１，３）フコシルトランスフェラーゼをコードすることが示された。特に、この座は、２個以上のエキソンに亙ってＣ分布したコード領域を維持することが知られている唯一のα（１，３）フコシルトランスフェラーゼであり、かつ異なる細胞質ドメインを特徴とする構造的に異なるポリペプチドを生成する可能性を有する複数の異なる開始コドンを有するが、本質的に同一の触媒活性を有する最初のフコシルトランスフェラーゼであった。それぞれのＦｕｃ−ＴＶＩＩイソ酵素の触媒活性は、α２，３シアリル化ＩＩ型Ｎ−アセチルラクトースアミン前駆体を用いることができ、中性のＩＩ型、中性Ｉ型またはシアリル化Ｉ型Ｎ−アセチルラクトースアミン基質を用いることはできないことを特徴とする。同様な観察は、続いて単離されたＦｕｃ−ＴＶＩＩのヒト同族体についてなされている(S．Natsuka et al.，J．Biol ．Chem.，vol．269，pp．16789-16794(1994);K．Sasaki et al.，J．Biol．Che m.，vol．269，pp．14730-14737(1994))。この触媒特異性およびこの遺伝子の白血球特異的発現パターンは、Ｅ−およびＰ−セレクチンリガンド活性に本質的な α２，３シアリル化、α1，３フコシル化ラクトースアミングリカンを生成する生合成過程において極めて重要な役割を果たしていることを強く示唆している。更に、この酵素の欠損について遺伝子操作したマウスの白血球は、Ｅ−セレクチンおよびＰ−セレクチンの機能的リガンドの発現を欠き、炎症部位への白血球の移動を欠くことを特徴とする同時免疫欠損を示す。これらの観測は、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩが白血球セレクチンリガンド発現を制御することを示し、この酵素の医薬化合物またはマニューバー(maneuvers)による阻害は、セレクチン依存性炎症が病的であるヒト疾患における治療効果を有することがある抗炎症法を表すことを示している。本明細書記載の作業で得られた他の観察は、Ｌ−セレクチンのリガンドのオリゴ糖成分の合成の指示におけるＦｕｃ−ＴＶＩＩの役割を示唆している。Rosen とその共同研究者らが示したように、ＨＥＶ上のＬ−セレクチンリガンドは、ムチン型糖タンパク質ＧｌｙＣＡＭ−１、ＣＤ３４、およびＭＡｄＣＡＭ−１によって示されるＯ−結合炭水化物決定基に相当する(L.A．Lasky et al.，Cell，vo l．69,pp．927-938(1992);S．Baumhuester et al.,Science,vol．262,pp．436-4 38(1993))。それらの初期の生化学的分析では、Ｌ−セレクチンリガンド活性に関するオリゴ糖は、シアリル化、硫酸化、および可能な場合にはフコシル化されていることを示している(Y．Imai et al.，J．Cell Biol.，vol．113，pp．1213 -1221(1991))。Rosenグループによる更に最近の構造解析は、これらのオリゴ糖のキャッピング基が、シアリルｓＬｅ^X残基の硫酸化誘導体に相当し、硫酸塩は末端のガラクトース残基の６−ヒドロキシルを介して［ＮｅｕＮＡｃα２，３（ＳＯ₄６）Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡＣ−Ｒ］またはサブ末端のＮ−アセチル−グルコースアミン残基の６−ヒドロキシルを介して［ＮｅｕＮＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４（ＳＯ₄６）（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ］、または両方によって結合しているという過程と一致している(S．Hemm erich et al.，Biochemistry，vol.33，pp．4820-4829(1994);S．Hemmerich et al.，Biochemistry，vol.33，pp．4830-3835(1994);S．Hemmerich et al.，J．B iol．Chem.，vol．270，pp．12035-12047(1995))。これらの構造の非フコシル化形態も同定されているが、生理学的なＬ−セレクチンリガンドの活性にはフコースが必要であるという証拠は形式的なままである。このような非フコシル化構造の同定は、これらのシアリル化および硫酸化分子は、ＨＥＶ内皮細胞で発現したα（１，３）フコシルトランスフェラーゼの受容体基質を表すという可能性を示唆している。Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ座の発現がこれらの細胞でのＬ−セレクチンリガンド発現と同時局在しているという本発明者らの観察は、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩがこれに関して働くことがあることを示唆している。更に、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩの欠損について遺伝子操作したマウスは、リンパ節へのＬ−セレクチン依存性リンパホーミングを欠き、末梢および腸間膜リンパ節、およびパイアー斑の抗内皮性小静脈でのＬ−セレクチンリガンド活性の発現を欠いている。これらの観察は、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩがＨＥＶセレクチンリガンド発現を制御することを示し、この酵素の医薬化合物またはマニューバー(maneuvers)による阻害は、セレクチン依存性リンパ球輸送が病的であるヒト疾患における治療効果を有することがある抗炎症法を表すことを示している。硫酸化およびシアリル化ラクトースアミン残基がＦｕｃ−ＴＶＩＩのような酵素の受容体基質を表すという概念は、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ（E.V．Chandrasekaran et al.，Biochem．Bio phys．Res．Commun.，vol．201，pp．78-89(1994))およびFｕｃ−ＴＶ(P.R．Scu dder et al.，Glycobiology，vol．4，pp．929-933(1994))がシアリル化、硫酸化したラクトースアミン型受容体を用いることができることを示唆する研究によって支持されている。ＧｌｙＣＡＭ−１の生合成についての研究から得られる間接的証拠も、この仮定と一致している(S．Hemmerichetal.，Biochemistry，vo l．33，pp．4820-4829(1994);D．Crommie et al.，J．Biol．Chem.，vol．270， pp．22614-22624(1995))。しかしながら、本発明者らの結果は、非硫酸化体ＮｅｕＮＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃがＦｕｃ−ＴＶＩＩによってイン・ビトロおよびイン・ビボで用いられることを示している。生化学的分析は、このシアリル化分子のＧｌｃＮＡｃ残基の６−Ｏ硫酸化により、マウスＦｕｃ−ＴＶＩＩによって効果的に用いられる基質を生成することを示している。従って、この硫酸化分子などがＨＥＶ内皮細胞でＦｕｃ−ＴＶＩＩによって利用されるかどうかを決定しなければならない。例えば、このような分子の生合成過程は画定すべきであるが、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩはこの過程において重要な役割を果たしていることは明らかである。顆粒細胞および他の白血球によって発現されるＬ−セレクチンは、これらの細胞の未だ未画定の細胞外内皮細胞カウンターレセプターを介して活性化した血管内皮への接着を媒介することを示している証拠がある(M.L．Arbones et al.，Im munity，vol．1，pp．247-260(1994);K．Ley et al.，J．Exp．Med.，vol．181 ，pp．669-675(1995))。この（複数の）カウンターレセプターの化学的性質は知られていないので、このリガンドの合成におけるＦｕｃ−ＴＶＩＩの役割も推測であり、本実験室の最新の研究の主題である。とにかく、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩが白血球で発現し、Ｅ−およびＰ−セレクチンのリガンドの合成を支持することができることを示す以前の観察と共に、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩの存在しないマウスはＥ− 、Ｐ−およびＬ−セレクチンのリガンドを欠いているという証拠と共に考慮すると、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩがＨＥＶ上でＬ−セレクチンリガンドと同時発現するという説明は、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩがこれら３種類総てのセレクチンのリガンドの合成、およびセレクチン依存性白血球輸送の制御のマスター制御座であることを示している。明らかに、本の多数の修飾および変更が、上記の教示から可能である。従って、本発明は、添付の請求の範囲内において、本明細書に具体的に記載されている以外でも実施することができることを理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 45/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 9/10 33/573 ＡＧ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/573 Ａ６１Ｋ 37/52 (72)発明者ジョン、ビー．ロウアメリカ合衆国ミシガン州、アン、アーバー、ウォーターシェッド、ドライブ、830 (54)【発明の名称】ネズミα（１，３）フコシルトランスフェラーゼＦｕｃ―ＴＶＩＩ、それをコードするＤＮＡ、その製造法、それを認識する抗体、それを検出するためのイムノアッセイ、このようなＤＮＡを含むプラスミド、およびこのようなプラスミドを含む細胞

Claims

【特許請求の範囲】１．アミノ酸サブ配列を含んでなるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、上記アミノ酸サブ配列が、 (a) 第２図に示されるヌクレオチド配列の９６６〜１１４９位および２０６７〜３０７９位に相当するＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸配列、および (b) 第２図に示されるヌクレオチド配列の１９４７〜１９５９位および２０６７〜３０７９位に相当するＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸配列、からなる群から選択されることを特徴とする、ポリペプチド。２．アミノ酸サブ配列を含んでなるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの単離配列であって、上記アミノ酸サブ配列が、 (a) 第２図に示されるヌクレオチド配列の９６６〜１１４９位および２０６７〜３０７９位に相当するＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸配列、および (b) 第２図に示されるヌクレオチド配列の１９４７〜１９５９位および２０６７〜３０７９位に相当するＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸配列、からなる群から選択されることを特徴とする、単離配列。３．第２図に示されるＤＮＡ配列の９６６〜１１４９位および２０６７〜３０７９位に相当するＤＮＡサブ配列を含んでなる、請求項２に記載のＤＮＡ配列。４．第２図に示されるＤＮＡ配列の１９４７〜１９５９位および２０６７〜３０７９位に相当するＤＮＡサブ配列を含んでなる、請求項２に記載のＤＮＡ配列。５．アミノ酸サブ配列を含んでなるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの配列を含んでなるプラスミドであって、上記アミノ酸サブ配列が、 (a) 第２図に示されるヌクレオチド配列の９９６〜１１４９位および２０６７〜３０７９位に相当するＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸配列、および (b) 第２図に示されるヌクレオチド配列の１９４７〜１９５９位および２０６７〜３０７９位に相当するＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸配列、からなる群から選択されることを特徴とする、プラスミド。６．第２図に示されるＤＮＡ配列の９９６〜１１４９位および２０６７〜３０７９位に相当するＤＮＡ配列を含んでなる、請求項５に記載のプラスミド。７．第２図に示されるＤＮＡ配列の１９４７〜１９５９位および２０６７〜３０７９位に相当するＤＮＡ配列を含んでなる、請求項５に記載のＤＮＡ配列。８．アミノ酸サブ配列を含んでなるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの配列を含んでなるプラスミドを含んでなる形質転換細胞であって、上記アミノ酸サブ配列が、 (a) 第２図に示されるヌクレオチド配列の９９６〜１１４９位および２０６７〜３０７９位に相当するＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸配列、および (b) 第２図に示されるヌクレオチド配列の１９４７〜１９５９位および２０６７〜３０７９位に相当するＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸配列、からなる群から選択されることを特徴とする、形質転換細胞。９．上記プラスミドが、第２図に示されるＤＮＡ配列の９９６〜１１４９位および２０６７〜３０７９位に相当するＤＮＡ配列を含んでなる、請求項８に記載の形質転換細胞。１０．上記プラスミドが、第２図に示されるＤＮＡ配列の１９４７〜１９５９位および２０６７〜３０７９位に相当するＤＮＡ配列を含んでなる、請求項８に記載の形質転換細胞。１１．アミノ酸サブ配列を含んでなるアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、上記アミノ酸サブ配列が、 (a) 第２図に示されるヌクレオチド配列の９９６〜１１４９位および２０６７〜３０７９位に相当するＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸配列、および (b) 第２図に示されるヌクレオチド配列の１９４７〜１９５９位および２０６７〜３０７９位に相当するＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸配列、からなる群から選択されることを特徴とする、抗体。１２．モノクローナル抗体である、請求項１１に記載の抗体。１３． (i) 上記ポリペプチドを含むことがある試料を、このポリペプチドに特異的に結合する抗体と接触させて、抗体−ポリペプチド複合体を形成させ、 (ii) 上記抗体−ポリペプチド複合体を検出することを含んでなるポリペプチドのイムノアッセイであって、上記ポリペプチドが、アミノ酸サブ配列を含んでなるアミノ酸配列を有し、上記アミノ酸サブ配列が、 (a) 第２図に示されるヌクレオチド配列の９９６〜１１４９位および２０６７〜３０７９位に相当するＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸配列、および (b) 第２図に示されるヌクレオチド配列の１９４７〜１９５９位および２０６７〜３０７９位に相当するＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸配列、からなる群から選択されることを特徴とする、イムノアッセイ。１４．第２図に示されるＤＮＡ配列のヌクレオチド位置９６６〜３０７９に相当するＤＮＡサブ配列を含んでなる、ＤＮＡの単離配列。１５．第２図に示されるＤＮＡ配列のヌクレオチド位置１９４７〜３０７９に相当するＤＮＡサブ配列を含んでなる、ＤＮＡの単離配列。１６．アミノ酸サブ配列を含んでなるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んでなるプラスミドを含んでなる形質転換細胞を培養してなる、ポリペプチドの産生法であって、上記アミノ酸サブ配列が、 (a) 第２図に示されるヌクレオチド配列の９９６〜１１４９位および２０６７〜３０７９位に相当するＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸配列、および (b) 第２図に示されるヌクレオチド配列の１９４７〜１９５９位および２０６７〜３０７９位に相当するＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸配列、からなる群から選択されることを特徴とする、方法。