JP2000507108A

JP2000507108A - ナタネ由来のシステインプロテアーゼプロモーターおよび植物胚形質の封じ込めのための方法

Info

Publication number: JP2000507108A
Application number: JP9534108A
Authority: JP
Inventors: ジェプソン，アイアン; ジェイムズグリーンランド，アンドリュー; レーンフィリップトーマス，ディディアー
Original assignee: ゼネカリミテッド
Priority date: 1996-03-22
Filing date: 1997-03-18
Publication date: 2000-06-13
Also published as: ID16297A; AR017187A2; NO984390D0; DE69734058D1; WO1997035983A2; US6228643B1; AR006981A1; AU2033797A; GB9606062D0; ES2245792T3; IL126217A0; NZ331644A; EP0906429A2; ATE302847T1; KR20000004915A; WO1997035983A3; AU716107B2; CA2248536A1; DE69734058T2; SK129098A3

Abstract

(57)【要約】クラス１、２、または６のナタネシステインプロテアーゼ遺伝子プロモーターのDNA配列を含むプロモーターが記載される。このプロモーターは、発芽中の実生または発生中の穀果または植物（例えば、根、子葉、葉、および幹で）の少なくとも１つまたは複数の組織についての発現系で使用され得る。好ましい実施態様では、発現系は、本発明のプロモーターに融合されたディスラプター遺伝子を含む。

Description

【発明の詳細な説明】ナタネ由来のシステインプロテアーゼプロモーターおよび植物胚形質の封じ込めのための方法本発明は、プロモーターおよびそれを含む構築物に関する。本発明はまた、植物胚形質の封じ込めのための方法に関する。特に、本発明は、植物の１つの特定の組織または複数の組織における目的の遺伝子（GOI）の発現のためのプロモーターの使用に関する。より詳細には、本発明は、ジステインプロテアーゼについてのプロモーターに関する。本発明はまた、これらのシステインプロテアーゼプロモーターの、植物の１つの特定の組織または複数の組織においてGOIを発現するための適用に関する。プロモーターは、遺伝子の転写のレベルを調節することによって、遺伝子の空間的および一時的発現を制御する。遺伝子操作した作物植物への初期のアプローチは、外来遺伝子の発現を駆動するために強力な構成的プロモーターを利用した。植物バイオテタノロジーのストラテジーがより精巧になってきたので、特定の組織または特足の発生段階に対して導入遺伝子の発現を標的するための特異的プロモーターの必要性がある。システインプロテアーゼは、植物（Praekeltら，1988；Goetting-MineskyおよびMullin，1994）、動物（Wiederandersら，1992）、および原生動物（Mallinso nら，1994）における大きな多重遺伝子ファミリーのメンバーである。システインプロテアーゼは、不活性前駆体として合成される（Praekeltら，1988）。プレプロ酵素は、分泌経路へ標的され（Marttilaら，1995）、そして活性酵素を産生するためにプロペプチドフラグメントのタンパク質分解切断によって液胞中で転写後プロセスされる（Hara-Nishimuraら，1993および1994）。植物システインプロテアーゼは、生理学的に重要な種々の代謝事象に関与する。種子発芽および植物老化の間、これらは、タンパタ質分解に関連し（Joncsら，1995；Valpuestaら,1995；Smartら，1995）、そして発芽中のタンパク質保存動員に重要な役割を演じる（BoylanおよびSussex，1987）。種子発生の間、システインプロテアーゼは、その成熟形態中へのタンパク質前駆体の翻訳後プロセシングを触媒する（Hara-Nishimuraら，1995）。さらに、いくつかは、ジベレリン酸（ KoehlerおよびHo，1990；Watanabeら，1991）またはエチレン（Cervantesら，19 94；Jonesら，1995）のいずれかによってホルモン調節を受ける。他は、創傷（L inthorstら，1993；Lidgettら，1995）、脱水（Guerreroら，1990）、寒冷（Sch afferおよびFischer，1988）のようなストレスに応答して誘導されるか、または植物-微生物相互作用に関連する（Goetting-MineskyおよびMullin，1994）。発芽特異的システインプロテアーゼは、大麦（Marttilaら，1995）、米（Wata nabeら，1991）、トウモロコシ（Debarrosおよびlarkins，1994）、ヒヨコマメ（Cervantesら，1994）、エンドウ（Beckerら，1994）について特徴づけられており、そして１つのシステインプロテアーゼがナタネについて記載されている（ ComaiよびHarada，1989）。しかし、ナタネについての公表されたデータは矛盾する。さらに、この種は、その複二倍体性質のため研究することが困難である。 cDNAライブラリーのサブストラクティブまたはディファレンシャルスタリーニングあるいはディファレンシャルディスプレイ技法のようなより伝統的および困難な技法を使用するよりもむしろ、発芽中の種子で発現されるナタネ中の未知の同一のシステインプロテイナーゼ（システインプロテアーゼ）の潜在的に生成するタローンを研究した。種子の発芽後に独特に発現される遺伝子からのプロモーターを単離し、そして特徴づけた。したがって、本発明の第１の局面によれば、クラス１、２、または６のナタネシステインプロテアーゼ遺伝子プロモータ０が提供される。本発明の第２の局面によれば、図19、20、または21に示されるような配列の少なくとも一部、あるいはそれと実質的な相同性を有する配列の少なくとも一部、あるいはその改変体を含むプロモーターが提供される。本発明の第３の局面によれば、本発明のプロモーターの特徴的モチーフまたは特徴を有するプロモーターが提供される。本発明の第４の局面によれば、目的のタンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結された上記のようなプロモーターを含む組換えDNA構築物が提供される。本発明の第５の局面によれば、細胞機能を破壊し得る産物をコードするディスラプター遺伝子、および上記のようなプロモーターを含む植物で機能的な組換え DNA構築物が提供され、このディスラプター遺伝子は、化学インデューサーの外部適用によって誘導可能であるプロモーターを含む外部調節可能な遺伝子制御領域によって機能的に連結されそして制御される。本発明の第６の局面によれば、図12、13、14、15、16、もしくは17に示される配列の少なくとも一部、またはそれと実質的な相同性を有する配列の少なくとも一部、またはその改変体を含むDNAが提供され、そしてこれはシステインプロテアーゼをコードする。本発明の第７の局面によれば、プロモーターに作動可能に連結された上記のようなDNAを含む植物で機能的な組換えDNA構築物が提供される。本発明の第８の局面によれば、植物材料の１つまたは複数の組織についての発現系が提供され、この発現系は、上記のような遺伝子プロモーターに融合した目的の遺伝子を含み、ここでこの発現系は、植物材料の１つまたは複数の組織で発現され得る。本発明の第９の局面によれば、上記のような構築物を含む発現系が提供される。本発明の第10の局面によれば、上記のようなプロモーター、上記のようなDNA 、上記のような組換えDNA構築物、または上記のような発現系を含む組換え植物ゲノムが提供される。本発明の第11の局面によれば、上記のような組換え植物ゲノムを有する植物、植物の種子、または植物細胞が提供される。本発明の第12の局面によれば、上記のような組換えDNA構築物を含む防御された胚形質が提供される。本発明の第13の局面によれば、上記のような組換えDNA構築物を含む成熟状態に生長し得る植物または種子が提供される。本発明の第14の局面によれば、植物材料の１つまたは複数の組織で遺伝子プロモーターに融合される場合に目的の遺伝子の発現を誘導するための、上記のような遺伝子プロモーターの使用が提供される。好ましくは、組換えDNA構築物の誘導性プロモーターは、リプレッサータンパク質に機能的に連結されそしてこれを制御し、そしてディスラプター遺伝子プロモーターは、このリプレッサータンパク質によって認識されるオペレーター配列を含み、その結果、インデューサーの存在下、オペレーター配列と相互作用するリプレッサータンパク質が産生され、それによって第２のプロモーターを無能にしそしてディスラプター遺伝子の発現を阻害する。好ましくは、ディスラプター遺伝子はヌクレオチド配列であり、これは植物発生に必須である内因性植物遺伝子、または植物上に所望の特徴を与える遺伝子にセンス配向であり、あるいは内因性植物遺伝子の部分センス配列を含む。好ましくは、ディスラプター遺伝子は、植物発生に必須である内因性植物遺伝子または植物に所望の特徴を与える遺伝子に対してアンチセンス配向であるヌクレオチド配列である。好ましくは、内因性植物遺伝了は、種子発芽または初期実生発生に必須である。好ましくは、外部調節可能な遺伝子制御領域は、グルタチオンS-トランスフェラーゼ系（これは本発明者らの国際特許出願第PCT/GB96/02116号の主題である）、Alc系（これは本発明者らの国際特許出願第PCT/GB96/01883号および第PCT/GB9 6/01846号の主題である）、またはエクジソン系（これは本発明者らの国際特許出願第PCT/GB96/01195号の主題である）からの化学的誘導性遺伝子プロモーター配列である。好ましくは、リプレッサータンパク質遺伝子は、lacリプレッサーのような細菌リプレッサー、あるいは434、P22、またはラムダバクテリオファージによって使用されるリプレッサーをコードする。好ましくは、ディスラプター遺伝子またはディスラプタープロモーターは、「偽オペレーター」を含む。好ましくは、ディスラプター遺伝子は、細胞傷害性遺伝子である。好ましくは、ディスラプター遺伝子は、リコンビナーゼ、またはリコンビナーゼ認識配列に隣接するヌクレオチド配列を切除するために適合されるトランスポゼースをコードする。好ましくは、組換えDNA構築物は、この構築物が、穀果または実生または植物のゲノムDNA内に統合され、好ましくは安定に統合される場合、発芽中の実生または発生中の穀果または植物の１つまたは複数の組織で発現され得る。好ましくは、発現系は、発芽中の実生または発生中の穀果または植物（例えば、根、子葉、葉、および幹で）の少なくとも組織についてである。好ましくは、発現系は、発芽中の実生のゲノムDNAまたは発生中の穀果のゲノムDNAまたは植物のゲノムDNA内に統合され、好ましくは安定に統合される。好ましくは、遺伝子プロモーターは、発芽中の実生または発生中の穀果または植物（例えば、根、子葉、葉、および幹で）の少なくとも組織で遺伝子プロモーターに融合される場合、目的の遺伝子の発現を誘導するために使用される。本発明の好ましい実施態様によれば、プロモーターは、図19に示すようなクローンpKS12p6のプロモーター領域の配列に対応するDNA配列を含む。本発明の他の好ましい実施態様によれば、プロモーターは、図20に示すようなタローンpKS25p7のプロモーター領域の配列に対応するDNA配列を含む。本発明のさらに好ましい実施態様によれば、プロモーターは、図21に示すようなクローンpKS66p1のプロモーター領域の配列に対応するDNA配列を含む。本発明のさらにより好ましい実施態様は、システインプロテアーゼプロモーターに融合したディスラプター遺伝子を含む構築物を含む実生、穀果、または植物であり、ここで構築物は、実生、穀果、または植物のゲノムDNA内に統合され、好ましくは安定に統合され、プロモーターは、図19、20、または21に示される配列の少なくとも一部、あるいはそれとの実質的な相同性を有する配列の少なくとも一部、あるいはその改変体を含み、そしてディスラプター遺伝子は、バルナーゼリボヌクレアーゼをコードする遺伝子である。本発明のさらにより好ましい実施態様は、システインプロテアーゼプロモーターに融合したディスラプター遺伝子を含む構築物を含む実生、穀果、または植物であり、ここで構築物は、実生、穀果、または植物のゲノムDNA内に統合され、好ましくは安定に統合され、プロモーターは、図19、20、または21に示される配列の少なくとも一部、あるいはそれとの実質的な相同性を有する配列の少なくとも一部、あるいはその改変体を含み、そしてディスラプター遺伝子は、リコンビナーゼ認識配列に隣接するヌクレオチド配列を切除するために適合されるリコンビナーゼをコードする遺伝子である。したがって、本発明の非常に好ましい実施態様によれば、植物発生の制御を伝えるために植物のゲノムへの挿入のための組換えDNA構築物が提供され、以下の配列を含む：（a）外因性化学インデューサーの存在または不在に応答性の誘導性遺伝子プロモーター配列；（b）上記誘導性遺伝子プロモーター配列の制御下のリプレッサータンパク質をコードする遺伝子または以下の(e)で特定されるディスラプター遺伝子の産物のインヒビターをコードする遺伝子；（c）上記リプレッサータンパク質に応答性のオペレータ一ー列；（d）本発明の遺伝子プロモーター配列；および（e）植物の生長に必須な植物特徴のタンパク質ディスラプターをコードする遺伝子であって、これによって外因性化学インデューサーの存在または不在が成熟状態への生長を可能にするかあるいは生長を遅くさせるかまたは適切な段階で停止させる、遺伝子。本発明で使用される誘導性プロモーターは、外因性化学インデューサーによる刺激に応答してリプレッサータンパク質の発現を促進し得、それによって、化学インデューサーの不在下では、リプレッサータンパク質が発現せず、ディスラプタータンパク質の発現を可能にするオペレーターと相互作用し、そして化学インデューサーの存在下では、リプレッサータンパク質が発現して、植物発生のインヒビターをコードする遺伝子の発現を妨げて、妨げられない植物生長を可能にする。用語「植物材料」には、発生中の頴果、発芽中の頴果または穀果、あるいは苗、苗木、または植物、あるいはその組織または細胞（例えば、発生中の頴果の細胞、あるいは発芽中の苗または発生中の穀果もしくは植物の組織（例えば、根、葉、および幹において））が含まれる。本発明に関して用語「目的の遺伝子」または「GOI」とは、目的の任意の遺伝子を意味する。GOIは、その天然環境中にある場合の野生型機能的遺伝子を除いては、問題の植物に対して外来または天然のいずれかである任意の遺伝子であり得る。 GOIの代表的な例には、細胞機能を破壊するタンパク質および酵素をコードする遺伝子が含まれる。例えば、遺伝子は細胞傷害性遺伝子であり得る。あるいは、遺伝子は、植物発生に必須である内因性植物遺伝子または植物に所望の特徴を与える遺伝子を阻害するために適合される、リコンビナーゼ、トランスポゼース、または同様の特性を有する関連酵素をコードし得る。リコンビナーゼは、特異的切除配列または特異的切除配列のセットを認識し、特異的切除配列間のDNAの除去を行いまたは他にDNAを変化させる酵素である。Cr e-loxのようなリコンビナーゼ系、FLP、SR1、およびSSV1がコードされたインテグラーゼ系が、本発明で使用され得る。 GOIの他の例には、除草剤、菌順または昆虫抵抗性を与える遺伝子のような防御または保護遺伝子が含まれる。このような遺伝子は、実生が特に傷つきやすい実生の発芽中に発現され得る。好ましくは、遺伝子は、植物に生物および環境ストレスへの抵抗性を与えるタンパク質をコードする。 β-チューブリンおよびアデニンヌクレオチドトランスロケーター（ANT）をコードする遺伝子のような内因性遺伝子もまた含まれる。用語「ディスラプター遺伝子」は、植物発生の適切な段階で特異的に発現または抑制される場合に、植物が成熟状態に達しそして種子を蒔くことができないようにする遺伝子である。ディスラプター遺伝子の起源は、種々天然に存在する供給源（例えば、ヒト細胞、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、菌類細胞）であり得、あるいは、それらのいくつかは天然で見いだされ得、いくつかは通常は天然で見いだされず、または両方の混合物である、DNA配列から構成され得る全合成遺伝子であり得る。ディスラプター遺伝子は、好ましくは、DNAおよびRNA代謝物、タンパク質合成、および他の代謝経路のような、必須の生化学的機能に標的される。好ましい実施態様では、ディスラプター遺伝子は、バルナーゼリボヌクレアーゼ、β-チューブリン、またはアデニンヌクレオチドトランスロケーター（ANT）をコードする遺伝子である。本発明に関して用語「その改変体」とは、得られる配列がGOIを発現し得るとすれば、プロモーター配列からまたはプロモーター配列への１つ以上の核酸の任意の置換（substitution）、改変（variation）、改変（modification）、置換（replacement）、欠失、または付加を意味する。この用語はまた、プロモーター配列に実質的にハイブリダイズし得る配列を含む。この用語はまた、本発明の DNAにハイブリダイズしそしてシステインプロテアーゼプロモーターの少なくとも一部をコードするDNAを含む。好ましくは、このようなハイブリダイゼーションは、低いおよび高いストリンジェンシー条件でまたは条件間で起こる。一般的な用語では、低いストリンジェンシー条件は、ほぼ環境温度で約65℃まで３×SS Cとして、および高いストリンジェンシー条件は、約65℃でO.1×SSCとして定義され得る。SSCは、0.15M NaCl、0.015Mクエン酸三ナトリウムの緩衝液の名前である。３×SSCは、SSCなどの３倍の強さである。用語「実質的な相同性」は、相同配列がプロモーター（例えば、GOIを発現し得るシステインプロテアーゼプロモーター）として作用するならば、プロモーター配列の少なくとも必須の核酸／核酸残基に関する相同性を含む。代表的には、相同性は、60％以上のヌクレオチドが本発明のプロモーター配列と共通である場合を示し、より代表的には65％。好ましくは70％、より好ましくは75％、さらにより好ましくは80％または85％、そして特に好ましくは90％、95％、98％、または99％以上相同である。用語「構築物」−これは「カセット」、「ハイブリッド」、および「結合体」のような用語と同義である−は、カセットを形成するためのような、本発明のプロモーターに直接または間接的に付着したGOIを含む。間接的付着の例は、プロモーターおよびGOIを媒介するイントロン配列のような適切なスペーサー基の準備である。直接または間接的付着を含む本発明に関する用語「融合した」について、同様のことが当てはまる。用語「発現系」とは、上で定義された系が、適切な生物、組織、細胞、または培地中で発現され得ることを意味する。これに関して、本発明の発現系は、遺伝子プロモーターの使用によっでGOIの発現を増加させることを確実にする追加の成分を含み得る。本発明のDNAは、単離された形態であるゲノムDNAであり得、そして好ましくは天然で結合されない配列に作動可能に連結されるか、またはDNAは合成DNAまたは cDNAであり得る。発芽における若い実生は、植物発生の傷つきやすい段階を表す。作物生産を改良するためのストラテジーには、寒冷、塩、重金属、菌類の攻撃への抵抗性のような生物および環境ストレスへの実生の抵抗性を増強させるためのこの段階中の遺伝子の発現が含まれ得る。発芽特異的プロモーターの制御下でこのようなストレスに対する抵抗性／耐性の少なくともいくつかの尺度を提供するタンパク質、例えば、抗菌類タンパク質（Cammueら，1992；Terrasら，1993）を発現することによって実生を保護することは、タンパク質が最も効果的である場合、発生の正確な期に発現を限定する。このような発生特異的発現は、食物連鎖にはいる植物材料中でこれらの遺伝子の発現を避けることのようなさらなる利点を有する。本発明のプロモーターはまた、植物胚形質封じ込め系で好都合に使用され得る。農業は、ヒト消費のため、ヒト消費のための商業的加工収穫産物のため、動物飼料生産のため、工業的産物の開発および他の目的のための多くの作付植物を使用する。加工は、通常、種子生産者から購入されている種子の農民による植え付けを含む。作物によって生産された産物は、植物全体であり、植物の種子または果実は収穫され、次いで上記の種々の食物適用に使用される。供給されたハイブリッドまたは近交種子は、除草剤、昆虫の害虫、および菌類の病気に対する耐性のような新規な農業経済的特徴、収穫した産物の改良した収量および／または質、および植物生産力の制御のための新規メカニズムを与える作物の変換によって導入される新規な遺伝情報を組み込み得る。バイオテクノロジー研究によって可能になるこのような改良は、植物育種の質を改良し、そして農民に供給される種子の農業経済作業を改良する。本発明によって示された問題は、栽培の領域内での作付植物の封じ込めである。栽培された作付植物の種子は、多くの経路によって（鳥類または小哺乳動物によってあるいは種子穀物の収穫後輸送中に落とされることによって）、雑草の状態を憶測し、または後年に次の作物でのボランティアとしてのままであり得る、定義された生長領域の外に運ばれ得る。可能であれば、栽培された作物が、生長領域に制限されそして野生で持続することを防ぐことが明らかに適切である。トランスジェニック作物が関連する上記の作物非制限の問題がより激しくなることが理解される。同様に、花粉は、風および／または昆虫輸送（分散）によって長距離を移動し、そして長期間生存したままであり得る。作付植物とその栽培されていない関連種との間の種間交配が可能なので、第２の懸念は、トランスジェニック作物（例えば、除草剤抵抗性作物）から関連の雑草種への花粉の漏れである（Mikkelsen ら，1996）。このようなハイブリッドの生存性を減少する方法は、非作付種への導入遺伝子の危険性を限定し、そのため増強された侵害または雑草から植物の拡張を避ける。本発明の実生プロモーターの使用が、植物発生の適切な段階へディスラプタータンパク質遺伝子の発現を制限することが理解され、そしてまた、その生存性を維持するためにその寿命を通して植物にインデューサー化学物質を適用し続ける必要がないことを意味する。これは、経済学的および生態学的の両方の利益を有する。本発明はまた、本発明の構築物をゲノム中に組み込んだ、好ましくは安定に組み込んだ、細胞プロトプラストおよび種子のような、遺伝子形質転換した植物およびその一部を提供する。したがって、本発明は、適切な発生段階で可逆的に阻害され得る植物を提供し、この植物は、ゲノム中に上記の組換えDNA構築物を含み、好ましくは安定に組み込む。遺伝子によってコードされるタンパク質の発現は、遺伝子の上流に位置する領域と、DNA結合タンパク質として公知の一定の調節タンパク質との相互作用によって制御される。プロモーター領域内には、これらのDNA結合タンパク質が特異的に結合する特定のオリゴヌクレオチド配列を含むいくつかのオペレーター領域が位置する。これらのタンパク貿は、遺伝子発現の活性化または抑制のいずれかを導き得る。したがって、これらは遺伝子の調節された発現を制御する。これらのDNA結合タンパク質は、実際、遺伝子発現のリプレッサーまたはアクチベーターのいずれかであり得、そして本明細書では簡単にするために「リプレッサー」という。本発明は、ディスラプター遺伝子機能の発現を制御するために、細菌オペレーターとそのリプレッサーとの間の十分に特徴づけられた相互作用を使用する。細菌リプレッサー、特にlacリプレッサー、または434、P22、およびラムダバクテリオファージによって使用されるリプレッサーは、植物細胞での発現を非常に効果的に制御するために使用され得る。第２のオペレーター／リプレッサー系は、本発明者らの公開された国際特許出願第WO90/08827号の主題であり、本明細書に参考として援用される。考慮され得るディスラプター遺伝子のダウンレギュレーションのための第３のアプローチは、「アンチセンス」、「センス」、または「部分センス」技法のいずれかの使用である。本発明によればDNA構築物は、「アンチセンス」RNAを生じる「アンチセンス」構築物または「センス」RNAを生じる「部分センス」構築物（少なくとも一部の機能的遺伝子産物をコードする）であり得る。「アンチセンスRNA」は、対応するmRNA中の塩基の配列に相補的であるRNA配列である：アンチセンス配列（3'から5'センスでの読み）中の各塩基（または大多数の塩基）がRNA配列中の対応する塩基（G対C、A対U）と対になり得るセンスでの相補性は、5'から3'センスで読む。このようなアンチセンスRNAは、関連遺伝子（またはそれに実質的な相同性を示すDNA配列）のコード鎖の少なくとも一部に相補的な配列の少なくとも一部を有する転写物を生じるように配列された、適切なDNA構築物との形質転換によって細胞中で産生され得る。「センスRNA」は、対応するmRNA配列の少なくとも一部に実質的に相同であるR NA配列である。このようなセンスRNAまたは部分センスRNAは、関連遺伝子（またはそれに実質的な相同性を示すDNA配列）のコード鎖の少なくとも一部と同一の配列を有する転写物を生じるように正常な方向で配列された、適切なDNA構築物での形質転換によって細胞中で産生され得る。適切なセンスまたは部分センス構築物は、遺伝子発現を阻害するために使用され得る（国際特許公開WO91/08299に記載される）。ディスラプター遺伝子をダウンレギュレートするために使用され得るアンチセンスRNA構築物には、アデニンヌクレオチドトランスロケーターをコードする構築物が含まれる。利用可能であるまたは利用可能になる他のアプローチもまた、使用され得る。このような作物封じ込め系におけるさらなる詳細は、本明細書に参考として援用される本発明者らの公開された国際特許出願第WO94/03619号に見られ得る。次いで、本発明のプロモーターは、外因性または外来遺伝子に連結されそして形質転換によって植物中に導入される場合、外来遺伝子の発現の調節のための手段を提供する。植物細胞の形質転換に用いられる方法は、本発明に特に適切ではなく、そして標的植物に適切な任意の方法が用いられ得る。トランスジェニック植物は、形質転換した細胞からの再生によって得られる。多くの形質転換手順が、少しだけ記載されるように、Agrobacterium tumefaciensもしくはそのTiプラスミドを使用するアグロインフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、または植物細胞およびプロトプラスト、マイクロプロジェクタイル形質転換のように文献から公知である。参考文献は、公知の方法の十分な詳細についての文献になり得る。プロモーター配列が挿入される植物種は、本発明に特に関係がない。双子葉植物および単子葉植物が形質転換され得る。本発明は、形質転換技法が利用可能であるまたは利用可能になる任意の植物に適用され得る。したがって、本発明は、種々の遺伝子改変した植物で遺伝子発現を制御するために使用され得、これらの植物には、キャノーラ、ヒマワリ、タバコ、テンサイ、および綿のような畑作物；小麦、大麦、米、トウモロコシ、およびサトウモロコシのような穀物；トマト、マンゴー、桃、リンゴ、梨、イチゴ、バナナ、およびメロンのような果物；ならびにニンジン、レタス、キャベツ、およびタマネギのような野菜が含まれる。プロモーターはまた、根、葉、幹、および再生組織を含む種々の組織での使用に適切である。したがって、新規システインプロテアーゼをコードする核酸配列が単離されそして特徴付けされている。図12〜17のいずれか１つに示す配列の少なくとも一部を含むDNAは、システインプロテアーゼをコードし、そして配列のコード領域に対応する。本発明はまた、本発明の配列に相同性を示すDNAを含む。本発明はまた、本発明のDNAにハイブリダイズしそしてシステインプロテアーゼの少なくとも一部をコードするDNAを含む。このような相同性およびハイブリダイゼーションは、プロモーター配列に関して上で論議される。本発明はさらに、本発明のDNAに対する遺伝コードの結果としての変性でありそしてシステインプロテアーゼをコードするDNAを含む。通常結合される他のタンパク質が実質的になく、そして本発明のシステインプロテアーゼ遺伝子DNAによってコードされるシステインプロテアーゼも、本発明によって提供される。本発明は、ここでは限定されない実施例によってのみ、そして以下の添付の図面を参照して記載される：図１は、逆転写されたPCRライブラリーを使用するシステインプロテアーゼイソ型の同定の概略図を示す；図２は、アガロースゲル電気泳動によるRT-PCR産物の分析を示し、そしてここでDG1＝DEGCYS1およびDG2＝DEGCYS2オリゴである；図３Ａは、RT-PCRクローンOSR8.401、OSR8.406、OSR8.403、OSR8.404、OSR8.4 02、OSR8.389、およびOSR8.387の予備核酸配列のコード領域の整列を示す；図３Ｂは、RT-PCRクローンOSR8.389、OSR8.387、OSR8.402、およびOSR8.404の予備核酸配列の非コード領域の整列を示す；図４は、クローンOSR8.401、OSR8.402、およびOSR8.389の予備核酸配列を示す；図５は、プローブとしてランダムプライムした全RT-PCRフラグメントを使用する、種子におけるおよび発芽中の発現を比較する、クラス２クローンOSR8.402のノーザンブロットの結果を示す。この図では、L＝葉、C＝子葉、S＝種子、およびB＝芽である；図６は、発生段階の範囲での発現を比較する、クラス１クローンCDCYS12（プローブとしてPCRによって標識されたクローンのコード領域を使用して）、クラス２クローンCDCYS25（プローブとしてPCRによって標識されたクローンの非コード領域を使用して）、およびクラス６クローンCDCYS66（プローブとしてPCRによって標識されたクローンの非コード領域を使用して）のノーザンブロットの結果を示す。この図では、B＝芽、W＝全植物、およびL＝葉である；図７は、COT44（CYS4.BRANAと命名された）の公表された配列との、クローンO SR.8.403、OSR8.404、OSR8.402、OSR8.389、OSR8.387、OSR8.406、およびOSR8.4 01の推定アミノ酸配列の整列を示す；図８は、cDNAライブラリーを使用するシステインプロテアーゼイソ型の同定の概略図を示す；図９は、部分長cDNクタラス２クローンCYS2UP6.1、CYS2UP7.1、およびCYS2UP8 .2の推定アミノ酸配列の、互いにおよびCOT44（CYS4.BRANAと命名された）との整列を示す；図10は、部分cDNAクローンCYS2UP6、CYS2UP7、CYS2UP8、CYS6UP3、CYS6UP5、C YS6UP2、およびCYS6UP4の核酸配列の、互いにおよびCOT44との整列を示す；図11は、全長cDNAクローンCDCYS66、CDCYS24、CDCYS22、CDCYS25、CDCYS12、およびCDCYS14の、互いにおよびCOT44との整列を示す；図12は、cDNAクローンCDCYS12の核酸配列を示す；図13は、cDNAクローンCDCYS14の核酸配列を示す；図14は、cDNAクローンCDCYS22の核酸配列を示す；図15は、cDNAクローンCDCYS24の核酸配列を示す；図16は、cDNAクローンCDCYS25の核酸配列を示す；図17は、cDNAクローンCDCYS66の核酸配列を示す；図18は、cDNAクローンCDCYS12、CDCYS14、CDCYS22、CDCYS24、CDCYS25、およびCDCYS66の推定アミノ酸配列の整列を示し、そして植物システインプロテアーゼの特徴付けとなる特徴と配列を比較する；図19は、クラス１ゲノムクローンpKS12p6由来のプロモーター核酸配列を示す。図20は、クラス２ゲノムクローンpKS25p7由来のプロモーター核酸配列を示す。図21は、クラス６ゲノムクローンPKS66P1由来のプロモーター核酸配列を示す。図22は、プライマー伸長実験による転写開始点、ならびにクローンpKS12P6（クラス１）、pKS25P7（クラス２）、およびpKS66P1（クラス６）の推定TATAボックスの位置のマッピングを示す。数字はcDNAの5'末端までの距離を示す。図23は、タバコの形質転換のためのベクター構築物を示す。図24は、形質転換中の茎頂生成カルスでのGUS発現のレベルを示す。図25は、初代形質転換体由来の葉でのGUS発現のレベルを示す。図26は、膨潤後０〜36日（DAI）の、クラス当たり２つのランダムな初代形質転換体の子孫におけるGUS発現の時間経過を示す。NVSは、野生型ネガティブコントロールを示す。図27は、クラス１の24初代形質転換体の子孫におけるGUS活性を示す。実生を、０、14、および28DAIで評価した。図はまた、初代形質転換体由来の若葉におけるGUS活性を含む。図28は、クラス２の24初代形質転換体の子孫におけるGUS活性を示す。実生を、０、14、および28DAIで評価した。図はまた、初代形質転換体由来の若葉におけるGUS活性を含む。図29は、クラス６の24初代形質転換体の子孫におけるGUS活性を示す。実生を、０、14、および28DAIで評価した。図はまた、初代形質転換体由来の若葉におけるGUS活性を含む。一般的に、図では、クローンに関連した表示COまたはCODはコード領域を示し、そしてNCまたはNCDは非コード領域を示す。概略では、実施例は、発芽中のナタネRNAにおける逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）による発芽発現されたシステインプロテアーゼ部分クローンのある範囲の増幅を記載する。乾燥種子および発芽中の実生におけるクローンの発現の予備評価を、ノーザンブロットによって、次いで選択したクローンにおいてより詳細なノーザンブロット実験によって行い、発現の時間経過を評価する。cD NAライブラリーを、これらのクローンの高発現を示す組織から構築し、次いでゲノムライブラリーをスクリーニングして、プロモーター領域をサブクローニングした。クローニングしたプロモーターの空間的および一時的調節の最終評価を、 β-グルクロニダーゼ（GUS）レポーター遺伝子を有するプロモーターフラグメントの転写融合およびタバコへの形質転換によって行った。実施例１−発芽中のナタネ実生からのシステインプロテアーゼ逆転写PCRライブラリーの構築発芽特異的配列を同定するために、ナタネ実生RNAにおけるRT-PCRアプローチを利用した。いくつかの植物種間で保存されたシステインプロテアーゼコード領域に対して設計した逆オリゴ(dT)プライマーおよび正方向プライマーを使用して、500bpのコード領域および約250bpの非コード領域をカバーする750bpのRT-PCR 産物を増幅した。5'末端を配列決定して、システインプロテアーゼ関連クローンとしてのRT-PCR産物の同定を確認した。非コード領域における選択の圧力がほとんどないので、3'末端非コード領域における顕著な差は、プロモーターに効果のある3'末端非翻訳領域での差異を予測し得る。この一般的アプローチを、図１に模式的に示す。調製方法：植物材料種々のWestarからの５グラムのナタネ種子（Brassica napus）を、１％次亜塩素酸ナトリウム中で10分間滅菌した。滅菌水での数回の洗浄後、種子を暗中12時間４℃で滅菌水中で膨潤させて、発芽を同調させた。これらを湿った滅菌Whattm anペーパー上に蒔き、そして子葉を採取する前に暗中で25℃で生長させた。 RNA抽出塩化リチウム方法トータルRNAを、Jepsonら（1991）に記載のプロトコルの改変を使用して、乾燥種子および３日齢のナタネ実生から単離した。組織（5g）を、微粉末が得られるまで、乳鉢および乳棒で液体窒素を用いて粉にした。９mlのホモジナイゼーション緩衝液［400mM NaCl；50mM Tris-HCl，pH9.0；１％ SDS；5mM エチレンジアミン四酢酸（EDTA）；４U/ml ヘパリン；１mM アウリントリカルボン酸（ATT）；10mM ジチオトレイトール（DTT）］およびホモジナイゼーション緩衝液で飽和しそして使用前に10％（v/v）m-クレゾールを補充した4.0ml フェノールの添加後、細かいペーストが得られるまで、組織を再度粉にした。ペーストを冷やしたコレックスチューブに移し、そして13,000rpmにて15分間遠心分離した（Sor val，SS34，４℃）。上清を他のチューブに移し、５mlのフェノール−クロロホルムで５分間抽出し、そして9,000rpmにて30分間遠心分離（Sorval，SS34,４℃ ）して水相を回収した。３回のフェノール−クロロホルム抽出後、５分の１容量の12M 塩化リチウムで氷上にて一晩上清を沈殿させることによって、RNAを回収した。9,000rpmにて30分間遠心分離（Sorval，SS34，４℃）した後、上清を除去し、そしてペレットを、マクロチューブに移す前に、1mlの５mM Tris（pH7.5)に再懸濁した。一晩の２回目の塩化リチウム沈殿後、ペレットを70％エタノールで２回洗浄し、0.2ml DEPC処理水に再懸濁し、そして−70℃で保存した。塩化セシウム方法トータルRNAを、Okayamaら（1979）から改変されたプロトコルを使用して、ナタネ実生の発生段階の範囲から崖離した。組織（２〜４ｇ）を液体窒素の存在下、1g Al₂O₃とともに乳鉢および乳棒で粉にした。次いで、ドライアイス中で保たれた粉を、コレックスチューブ中で、使用前に2.5％（v/v）β-メルカプトエタノールを補充した８mlの予め温めた（65℃）ホモジナイゼーション緩衝液［５M グアニジンチオシアネート；0.5％，w/v，ラウリルサルコシンナトリウム；0.02 5Mクエン酸ナトリウム；pH7.0］と混合し、そして組織が完全に解凍するまでボルテックスしながら40℃にで10分間インキュベートした。15℃で12,000rpmにて3 0分間の遠心分離（Sorval，SS34ローター）後、上清を回収し、ホモジナイゼーション緩衝液を８mlまで加えで、１ml当たり0.1g CsClを補充した。CsClが溶解した後、ホモジネートを、2.5mlのCsCl高密度クッション［5.7M CsCl：0.1M EDT A］を含む12ml ポリアロマーチューブ中に、クッションをかき混ぜずに添加した。20℃で25,000rpmでの24時間の遠心分離（Sorval，TH-641ローター）後、上清を吸引によって除去し、そしてチューブの壁を、300μl再懸濁緩衝液［7M尿素；２％，w/v，ラウリルサルコシンナトリウム］中へのRNAループの再懸濁前に吸着ペーパーで浄化した。次いで、RNAを、1.5mlチューブに移し、そして等容量のフェノールおよび等容量のクロロホルム／イソアミルアルコール［24:1，v/v］で抽出した。13,000rpmでの５分間の遠心分離後、水相を回収し、そして等容量のクロロホルムで再度抽出した。10分の１容量の３M酢酸ナトリウムおよび2.5 容量の冷エタノールを添加することによって、RNAを−20℃にて一晩沈殿させた。４℃で13,000rpmでの15分間の遠心分離後、上清を捨て、そしてペレットを1.5 mlの冷70％エタノールで洗浄した。遠心分離を10分間繰り返し、上清を捨て、そしてペレットを高速真空中で３〜４分間乾燥した。ペレットを滅菌DEPC処理水に再懸濁し、RNAを再度沈殿させ、そして上記のようにペレットを洗浄し、最終的に50μlのDEPC処理水に再懸濁し、そして−70℃で保存した。 DNAプローブの標識末端交換オリゴ（25〜50ng）を、25μl反応液［30uCi[γ-³²P]ATP(Amersham，5000Ci/m mol)、１×キナーゼ緩衝液］中で37℃にて30分間、20U T4ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs）を使用して、そのヒドロキシル化された5’末端をリン酸化することによって標識した。オリゴを、製造者によって推奨されるて、組み込まれていないヌクレオチドから精製した。 PCR プラスミドDNA（５ng）を、50μl PCR反応液［0.25μM［α-³²P]dATP（Amersh am，3000Ci/mmol）；0.4μM dATP；50μM他のdNTP；1.5mM MgCl2；0.5μMオリゴ；１×PCR緩衝液］中で2.5UのTaqポリメラーゼ（Gibco BRL）を使用して増幅した［（94℃、１分；65℃、１分；72℃、１分）×17サイクル；（72℃、７分）× １サイクル］。プローブを、製造者によって推奨されるように、G-50セファデックススパンカラム（Pharmacia Biotech）を使用して、組み込まれていないヌクレオチドから精製した。ランダムプライミングプラスミドDNA（25〜50ng）を、製造者の推奨に従って、「Oligolabelling Ki t」（Pharmacia）を使用して標識した。ノーザンブロットハイブリダイゼーションノーザンブロット実験を、Sambrookらに従って行った。トータルRNA（10μg）リ電気泳動緩衝液［１×MOPS；７％，v/v，ホルムアルデヒド］中で1.2％アガロース変性ゲル［１×MOPS（40mM MOPS，pH7.0；10mM酢酸ナトリウム；１mM EDTA ）；17％，v/v，ホルムアルデヒド］上での電気泳動によってサイズ分離し、そして製造者の推奨に従ってキャピラリーブロッティングによってナイロンメンブラン（Hybond N，Amersham）に移した。ハイブリダイゼーションを、100μg/ml の変性したサケ精子DNAを補充したハイブリダイゼーション緩衝液［５×SSPE（9 00mM NaCl；50mM NaH₂PO₄・H₂O；5mM EDTA；pH7.4，NaOH）；0.5％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）；１％粉ミルク］中で65℃にて一晩行った。ブロットを、３ ×SSC［20×SSC；450mM NaCl；45mM Na₃クエン酸.H₂Ｏ；pH7.0，HCl］および１％SDSで65℃にて１時間洗浄し、そして増感スクリーンとともに−80℃にてＸ線フィルム（X-OMAT AR，Kodak）に曝露した。 RT-PCRライブラリー構築およびスクリーニングそして製造者の推奨に従って、発芽中のナタネ実生から構築した。種子膨潤後３日の子葉から抽出したトータルRNA（１μg）を、PCRのために安定化したオリゴ（dT）プライマー（MPRACE1B）を使用して逆転写した［65℃、２分；42℃、30分；99℃、５分；６℃、５分］。次に、ヘテロ二本鎖DNA-RNAを、逆転写についてのような同じ下流プライマー、およびほとんどの植物種中で保存されるシステインプロテアーゼコード領域のモチーフ（DCNCCLM(NED)）からのペプチドレベルで設計された１セットの２つの上流変性プライマー（DEGCYS1およびDEGCYS2）を使用するPCRによって増幅した。サイクリング条件：［（95℃、２分；55℃、２分；７2℃、1.5分）×２サイクル；（95℃、２分；55℃、１分；72℃、1.5分）×3 3サイクル］の後で、72℃で７分行った。用して、E．coliを形質転換する前に、pCRIIベクターに連結した。この系は、PC Rによって提供されるすべての二本鎖分子の3'末端に単一のデオキシアデノシンを付加するPCRで使用される、熱安定ポリメラーゼの温度非依存性活性を利用する。これは、突き出しているデオキシチミジンを含むpCRIIベクターへの直接クローニングを可能にする。プラスミドDNAを、「Wizard DNA miniprep DNA purif ication System」(Promega)を使用して精製し、そして製造者の推奨に従って「S equenase version 2.0 T7 DNA polymerase」(USB)とともにチェーンターミネーション方法（Sangerら，1977）によって配列決定した。分析 RT-PCR産物を、アガロースゲル上での電気泳動によって分析した。図２に示され得るように、予測したサイズの２つの主要な750bpフラグメントは、子葉RNAから増幅したが、種子RNAからは見いださなかった。これらをゲルから切り出しそしてクローニングした。並行アプローチでは、ゲル精製していないRT-PCR産物のアリコートをクローニングして、そのうちの22がゲル切り出しに由来する400クローンを含む３日齢発現したジステインプロテアーゼライブラリーを生成した。 RT-PCRについて使用されるオリゴでのコロニースクリーニングは、250の推定システインプロテアーゼを同定した。ゲル切り出しからの７つのクローンをランダムに取り、そして完全に配列決定し、それらのすべてはシステインプロテアーゼであり、そして３クラスに分かれた。これらのクローンに以下の名称を与えた：これらのクローンの予備DNA配列およびそれらの整列を図3Aおよび3Bに示す。予備DNA配列が図４に示される、１クラス当たり１つの、３つのクローン、OSR 8.401（クラス１）；OSR8.402（クラス２）；およびPSR8.389（クラス６）を、ランダムプライミングによって標識し、そして塩化リチウム方法を使用して種子および子葉から抽出したトータルRNAを含むノーザンブロットで評価した。これらは発芽中によく発現されるようであるが、乾燥種子では見られなかった。さらに、いくつかの交差ハイブリダイゼーションを、プローブの性質のため、異なるクラス間で観察した。これは、図５で説明され、これはプローブとしてランダムプライムされた全RT-PCRフラグメントでのクラス２クローンOSR8.402についての結果を示す。次いで、ライブラリーを、ランダムプライミングによって標識した５つのシステインプロテアーゼクローンを使用してスクリーニングした。新しいクラスは明らかには同定されず、すべてのクローンの多様性は、ゲル切り出ししたフラグメント中に存在した。３つのクラスのクローンの発現パターンを、図６に示すような発生段階の範囲から、塩化セシウム方法で抽出したRNAとのノーザンブロットによって評価した。クラス２および６について、ハイブリダイセーションを、何らかの交差ハイブリダイゼーションを避けるために、それぞれクローンOSR8.402 およびOSR8.389の3'非コード領域を使用して行った。クラス１については、非コード領域がRT-PCRクローンで利用可能なので、OSR8.401クローンのコード領域の一部をプローブとして使用した。特異性を増加させるために、クラス２および６についてはオリゴ(dT)逆プライマー（MPRACE1B）および内部逆プライマー（CYS8 .402およびCYS8.389）を使用したが、クラス１については２つの内部プライマー（CYS8.401およびCYS8.401R）を使用して、プローブをPCRによって標識した。クラス２および６は、種子膨潤後および初期実生生長の最初の４〜５日間に発現されるが、成熟植物器官でまたは発生中の種子で発現されない。クラス１は、芽および葉での発現を示すが、これは、プローブの性質に起因するいくつかの交差ハイブリダイゼーションの結果であり得る。クラス２は、ナタネについて刊行された唯一のシステインプロテアーゼあるCOT44に非常に関連する（ComaiおよびHarr ada，1989）。図７は、COT44とのクローンの推定アミノ酸配列の整列を示す。実施例２−発芽中のナタネ実生からの標準オリゴ(dT)プライムしたcDNAライブラリーおよびシステインプロテアーゼ特異的にプライムしたcDNAライブラリーの構築 RT-PCR産物は全長ではなく、そしてPCR生成した変異を避けるために、ナタネc DNAライブラリーを、目的の３つのクローンの高発現を示す発生段階から構築した。特異的にプライムしたライブラリーを、オリゴ(dT)プライマーを使用するよりもむしろ、RT-PCRクローンの３つのクラスに基づいて設計した２つの特異的オリゴを使用して構築した。結果として、システインプロテアーゼクローンのみが逆転写され、これは少数の約650bpの短いクローンを提供し、そのすべては5'末端で全長であった。これは、全長クローンについて標準オリゴ(dT)プライムした cDNAライブラリーを直接スタリーニングすることにおける使用のために5'-非コード領域へのオリゴの設計を可能にした。この一般的アプローチを、図８に図示する。調製方法：植物材料種々のWestarからの５グラムのナタネ種子（Brassica napus）を、１％次亜塩素酸ナトリウム中で10分間滅菌した。滅菌水で数回洗浄後、種子を暗中12時間滅菌水中で膨潤させて、発芽を同調させた。これらを湿った滅菌Whattmanペーパー上に蒔き、そして子葉を採取する前に暗中で２日間25℃で生長させた。 RNA抽出および精製トータルRNAを、上記の塩化セシウム方法を使用して、２日齢のナタネ実生から単離した。ポリアデニル化RNAを、製造者の推奨に従って「Poly A Tract mRNA isolation system」(Promega)を使用して、１mgのトータルRNAから精製した。このシステムは、mRNAの3'-ポリ(A)領域に溶液中で高い効率でハイブリダイズさせるために、ビオチン化オリゴ(dT)プライマーを使用する。次いで、ハイブリッドを捕獲し、そして水での溶出前に、常磁性粒子に結合したストレプトアビジンおよび磁性分離鎖を使用して高ストリンジェンシーで洗浄した。 cDNAライブラリー構築およびスクリーニング標準オリゴ(dT)プライムしたcDNAライブラリーおよびシステインプロテアーゼ gene)を使用して、２日齢ナタネポリ(A)RNA（５μg）から構築した。製造者の推奨に厳密に従ったが、特異的ライブラリーについては、逆転写を、5'末端にXhoI 部位を含むように改変した、RT-PCRクローンのクラス１についておよびクラス２および６についてはそれぞれ、２つの特異的オリゴ（CDNA8.401RおよびCDNA8.38 7R）の混合物を使用してプライム、した。第２の鎖を、RNase Hとのヘテロ二本鎖の処理後、DNAポリメラーゼIを使用するニックトランスレーションによって合成スパンカラム(Pharmacia)でのサイズ分画およびUni-ZAPベクターアーム内に含まれるpBluescriptファージミドのポリリンカーへのEcoRI-XhoI挿入のような指向性クローニングの前にXhoIで切断した。λ-ZAPは、pBluescriptファージミドを含むように操作されている置挨λであり、このポリリンカーはcDNAをクローニングするために使用される。してインビトロパッケージし、E．coli細胞株XL1-Blue MRF'にプレーティングし、そして製造者に推奨に従ってナイロンメンブラン（Hybond N，Amersham）上に移した。プローブの標識、ハイブリダイゼーション、および洗浄を、上記のように行った。選択したλ-ZAPクローンを、インビボで切り出し、pBluescript SK^-中のファージミドとしてクローニングしたcDNAを回収した。E．coli SolR細胞を、組換えλ-ZAPと、一旦環状化すると機能的ファージミドを提供するDNAの一本鎖の合成に必要なタンパク質を提供するヘルパーファージとを、同時トランスフェクトした。分析ａ）1.10⁴プラーク形成単位（pfu）を含む小さなシステインプロテアーゼに富む特異的にプライムしたcDNAライブラリーを、２日齢のナタネ子葉から得た。5.10³ pfuをプレーティングし、そして３つの複製メンブラン上に移して交差ハイブリダイゼーションをチェックした。メンブランを、RT-PCRクローンのクラス１、２、および６の5'末端に対してそれぞれ設計した３つのオリゴ（CYS8.401MR、CY S8.402MR、CYS8.406MR）でスクリーニングし、そして上記のように標識した。短い5'非翻訳領域および650bpのコード領域を含む５つの類似するが異なる5' 末端システインプロテアーゼcDNAを得、インビボで切り出し、そして配列決定した。これらはクラス２および６に分かれるが、5'末端cDNAはクラス１については見られなかった。クラス２からのクローンはCOT44 cDNAに高度に関連するが（Co maiおよびHarrada，1989）、それらの5'末端は160bp長い。これは、COT44が、シグナルペプチドおよびプロペプチドの一部に対応する欠如した46アミノ酸(aa)であることを示す。これは、図９によってさらに説明され、COT44を有するクラス２からのcDNAクローンCYS2UP6、CYS2UP7、およびCYS2UP8の推定アミノ酸配列の整列を示す。２つのオリゴ（CYS6B-UPおよびCYS6A-UP）を、クラス２および６からのcDNAのそれぞれの5'非コード領域に対して設計して、全長クローンについて標準オリゴ (dT)プライムしたライブラリーを直接スクリーニングした。互いにおよびCOT44 とのクローンの予備配列整列を図10に示す。ｂ）1.10⁷pfuを含む代表的なオリゴ(dT)プライムしたcDNAライブラリーを、２日齢ナタネ子葉から得た。PCRによって推定されるインサートのサイズは、平均インサートサイズ1.5kbを有する0.75kbから３kbの範囲である。1.10⁶pfuをプレーティングし、そして３つの複製メンブラン上に移して交差ハイブリダイゼーションをチェックした。メンブランを、クラス１ RT-PCRクローンの5'末端コード領域に対してならびにクラス２およびクラス６cDNAの5'非翻訳領域に対してそれぞれ設計された5'末端オリゴ（CYS8.401MR、CYS6B-UP、およびCYS6A-UP）で最初にスクリーニングして、クラス２および６についての全長クローンを同定した（クラス１、20ポジティブ；クラス２、250ポジティブ；クラス６、130ポジティブ）。同じメンブランを、開発ノーザンブロット(developmental northern blot)で使用される3'末端プローブで再度スクリーニングして、正確な形態を選択したことを確実にした。クラス２および６については、ハイブリダイゼーションを、何らかの交差ハイブリダイゼーションを避けるためにPCRによって標識された3’非コード領域を使用して行った。クラス１については、非コード領域がRT-PCRクローンで利用可能ではないので、コード領域の一部をプローブとして使用した（クラス１、84ポジティブ；クラス２、205強ポジティブ；クラス６、85強ポジティブ）。両方の特異的プローブ（5'および3’）で同定されたクローンの数の間の比較は、ライブラリーに存在するほとんどのシステインプロテアーゼcDNAクローンが全長であることを確認した。クラス当たり10のクローン（これらは、（5'および3'プローブ）とハイブリダイズするが２つの他のクラスからのプローブと交差ハイブリダイズしない）をプラーク精製し、そしてクラス当たり４のクローンをインビボで切り出した。RT-P CR研究から同定されたシステインプロテアーゼの３つのクラスに分かれる６つの全長システインプロテアーゼcDNAクローンを単離し、そして完全に配列決定した（クラス１については２つ、クラス２については３つ、およびクラス６については１つ）。cDNAクローンの整列を図11に示す。これらは、パパインスーパーファミリーに関連するCPの３つのクラスに分かれ、そしてプレプロ酵素は、cot44と5 2％（クラス１）、90％（クラス６）、および96％（クラス２）の同一性を共有する。図12〜17は、それぞれクローンCDCYS12、CDCYS14、CDCYS22、CDCYS24、CD CYS25、およびCDCYS66の核酸配列を示す。ペプチド配列を予測し、そしてクローンCDCYS12、CDCYS14、CDCYS22、CDCYS24、CDCYS25、およびCDCYS66について図18 に示すように、ほとんどの植物システインプロテアーゼに存在する特徴的な特徴を示した。実施例３−ナタネゲノムライブラリーのスクリーニングならびにプロモーター領域のサブクローニングおよび特徴付けオリゴヌクレオチドプローブを、クラス当たり１つのcDNAの5'末端非コード領域に対して生成し、そしてプロモーター領域を有するクローンを単離するためにゲノムライブラリーをスタクリーニングするために使用した。各クラスについて、ゲノムクローンを単離し、そしてプロモーターをより正確な特徴付けおよび欠失のためにファージミド中にサブクローニングした。ゲノムライブラリー構築およびスクリーニングナタネ（Brassica napus cv．Bridger)からの増幅したλEMBL-3ランダムゲノムライブラリー(Clontcch)を構築した。DNAを、MboIで部分切断し、そしてフラグメントを、スクロースグラジエントで分離して、８〜22kbの間のサイズ範囲を生成し、λEMBL-3置換ベクターのBamHI部位へクローニングした、。ライブラリーを、E．coli株LE392細胞にプレーティングした。スクリーニングおよびプラーク精製を、Sambrookら（1989）によって記載されるように行った。cDNAの３つのクラスに対応するゲノムクローンを単離し、そしてλDNAミニプレパレーション( minipreparation)を、Grossberger（1987）からのプロトコルを使用して行った。ゲノムクローンを、制限フラグメント長多型（RFLP）パターンを使用してマッピングした：クローンを制限酵素のセットで切断し、0.8％アガロースゲルで分析し、そしてハイブリダイゼーションの前に、Sambrookら（1989）に従って２つのメンブラン（Hybond N，Amersham）上に同時に移した。分析一次スクリーニングのために、20ゲノム等量（2.10⁶pfu）をプレーティングし、そして３つの複製メンブラン上に移し、交差ハイブリダイゼーションについてチェックした。メンブランを、cDNAクローンのクラス１、２、および６の5’末端に対してそれぞれ設計された３つのオリゴ（CDNA12、CDNA25、およびCDNA66）とハイブリダイズし、プロモーター領域にできるだけ密接させた（クラス１、16 強ポジティブ；クラス２、９強ポジティブ；クラス６、８強ポジティブ）。交差ハイブリダイゼーションは、３つのクラス間で検出されず、そしてクラス当たり 10のクローンを二次スクリーニングのために選択した。二次スクリーニングを、図６に関連して記載したように3'末端PCRプローブを使用して行って、ノーザンブロットによって評価されたRT-PCRクローンに対応するゲノムクローンを特異的に検出した。これらはその3'末端で短いクローンであるようであり、そのためプロモーター単離に有用であり、一次スクリーニングからのプローブを使用して救出されたので、クローンのいくつかは、これらのプローブによって同定されなかった（クラス１については１つおよびクラス６については２つ）。クラス当たり10のクローンを、一次スクリーニングからのプローブを使用する２回以上の精製によってプラーク精製した。余分なクローン（増幅された、ランダムライブラリー）を避けるために、DNAを、クラス当たり８のゲノムクローンから調製し、そしてRFLPによって特徴付けた。クローンを、SalIおよびBamHIで切断し、0.8％アガロースで分析し、複製メンブラン上に移し、そして２セットのプローブとハイブリダイズした。オリゴを、cDNAクローンCDCYS12、C DCYS25、およびCDCYS66の5'末端コード領域（CDNA12、CYS6B-UP、およびCYS6A-U P）に対しておよびコード領域の中間（CYS8.401MR．CYS8.406MR、およびCYS8.40 6MR）に対してそれぞれ設計した。クラス当たり４つの残りのクローン（12g4、12g5、12g6、12g8；25g2、25g4、 25g5、25g7；66g1、66g4、66g8、および66g9）を、もう１回の切断／ハイブリダイゼーションを使用してさらに特徴付けた。クラス１cDNAは、翻訳開始点から50 0bpのBglII部位を含み、そしてクラス２および３cDNAは、翻訳開始点から300bp のHindIII部位を含み、これらの酵素を、挿入を放出するSalIとともにおよびなしで使用して、サブクローニングに適切なゲノムフラグメントを生成した。PCR 実験を、ゲノムDNAおよびcDNAで行って、推定イントロンを同定することによってプロモーター領域のサイズを予測した。5'非コード領域の前方プライマーならびにBglIIおよびHindIII制限部位の後に位置する逆プライマーを使用するPCRは、クラス１cDNAの最初の600bp内に400bpイントロンの存在を示したが、クラス２およびクラス６の最初の300bp内にイントロンは存在しなかった。２〜５kbの範囲の予測サイズを有するプロモーターフラグメントを、クラス当たり１つのゲノムクローン（12g6、25g7、および66g1）について同定し、pBluescript KS⁺へのサブクローニングの準備をした。実施例４−転写開始点の特徴付けプロモーターを含むゲノムλフラグメントを、より正確な特徴付けのためにpB luescript KS⁺にサブクローニングした。配列決定は、プライマー伸長実験による実際の転写開始点をマッピングする前に、推定転写シグナルの同定を可能にした。これは、翻訳開始点に密接した領域において設計された標識した逆プライマーの伸長に関連した。RNAテンプレートの分解後、伸長産物を、ポリアクリルアミドゲルでサイズ分離した。分析プロモーターを含むゲノムフラグメントを、クラス１（pKS12P6）についてはB amHIでクローニングしたBglII-2.6kbインサートとして、クラス２（pKS25P7）についてはHindIII-4.2kbインサートとして、およびクラス６（pKS66P1）についてはBamHI-HindlII-2.4kbインサートとして、pBluescript中にサブクローニングした。pUC1およびpUC4ベクターオリゴでのならびにcDNAの5'末端に対して設計した２つの内部逆プライマー（クラス１についてはCDNA14R、ならびにクラス２および６についてはCDNA66R）での配列決定は、クローンの配向および推定転写シグナルの同定を可能にした（Pautotら，1989）。サブクローニングしたゲノムフラグメントからのプロモーターの全ヌクレオチド配列を、クラス１、２、および６についてそれぞれ図19、20、および21に示す。転写開始点を、以下のように改変したSambrookら（1989）に従ってプライマー伸長実験によって正確にマッピングした。クラス１、２、および６についてそれぞれ設計したオリゴ（CYSGE12R，CYSGE25R、およびCYSGE66R）を、上記のように末端交換によって標識した。塩化セシウム方法を使用して３日齢のナタネ子葉から単離したトータルRNA（50ug）を、２ngのプライマーとともに沈殿させ、そして30μlのハイブリダイゼーション緩衝液［１mM EDTA；400mM NaCl；40mM Pipes ，pH6.4；70％，v/v，脱イオン化ホルムアミド］に再懸濁した。アニーリングを、85℃で10分間変性させた後に32℃にて一晩行った。沈殿および25μlの逆転写緩衝液［50mM KCl；10mM MgCl₂；１mM dNTP；1U/ul RNaseインヒビター］での再懸濁後、プライマーを、2.5U MuLV逆転写酵素（Perkin-Elmer）で42℃にて90分間伸長した。テンプレートRNAを、20UのRNase（RNace-it，Stratagene）で37℃ にて30分間分解した。各クラスについて、伸長産物を、プライマー伸長と同一のプライマーを使用して、ゲノムクローン（pKS12P6、pKS25P7、およびpKS66P1）で行った配列決定反応と並行して、ポリアクリルアミド変性ゲルで分析した。図22に示すように、クラス１転写開始点は、Pautotら（1989）によって編集された49の他の植物遺伝子と比較して良好な状況［t₂₇T₃₅C₄₉ A ₇₈a₁₈C₄₅g_8%］である。保存されたヌクレオチドは大文字であり、重要なものは太字であり、そして転写開始点に下線を引いた。この転写開始点は、翻訳開始点の前の179ヌクレオチドおよび最長cDNAの上流の152ヌクレオチドに位置する推定TATAボックスの下流の22ヌクレオチドにマッピングされている。 TATAボックスについてのコンセンサスは、Pautotら（1989）によって編集された79の他の植物遺伝子と比較して最適［c₃₄a₁₈t₃₂t₃₄a₃A₉₇T₉₀A₉₄a₄₇A₉₅a₃₀A₇₁G_44% ］ではないが、この結果は、ATGの下流の34ヌクレオチドをプライミングするオリゴを使用するこれまでのプライマー伸長実験の確認である。転写開始点と最長cDNAとの間の距離は、5'非翻訳領域内のイントロンの存在によって、または代わりの転写開始点の存在によって説明され得る。クラス２転写開始点は、良好な状況にあり［a₁₈a₂₀a₂₂ A ₇₈T₄₉C₄₅A_43%］、そして植物コンセンサス［T₃₇g₁₁g₁₄t₃₄T₉₆A₉₇T₉₀A₉₄a₄₇A₉₅T₆₃A₇₁G_44%]内の非常によく適合する推定TATAボックスの後の33ヌクレオチドに位置している。これは、翻訳開始点の前の53ヌクレオチドおよびcDNAの上流の26ヌクレオチドに対応する（図22）。クラス６転写開始点は、クラス２とほぼ同様の状況にあり［g₁₈a₂₀a₂₂ A ₇₈T₄₉C₄₅ A_43%］、そしてクラス２と正確に同様のコンセンサスを示す推定TATAボックスの後の30ヌクレオチドに位置している。これは、翻訳開始点の前の51ヌクレオチドおよびcDNAの上流の19ヌクレオチドに対応する（図22）。実施例５−プロモーター切除レポーター遺伝子との融合の前に、プロモーターは、転写開始点および翻訳開始点間で正確に切断されなければならない。有用な制限部位がクラス２および６ゲノム遺伝子に利用可能ではないので、部位を、対応する内因性フラグメントを置換するために使用されるPCRフラグメントに対して操作した。分析コード領域の残りの部分を排除するために、HindIII部位を、クラス１ゲノムクローンの翻訳開始点の前の２ヌクレオチドにPCRによって導入した。270bpフラグメントを、CYSGE12CおよびCYSG12CRオリゴを使用して、pKS12p6 DNAでの15サイクルのPCRによって生成した。同様に、BamHI部位を、pKS25p7およびpKS66p1 DNAで、それぞれ２セットのオリゴ（CYSGE25C、CYSG25CR、およびCYSGE66C、CYSG66CR）を使用してクラス２およびクラス６ゲノムクローンの翻訳開始点の前に導入して、165bpフラグメントを生成した。クラス１については、pKS12p6をBsmIおよびHindIIIで切断し、そしてゲル回収して900bpフラグメントを切り出し、BsmIおよびHindIIIによるPCRフラグメントカットで置換して、pKS12Pを生成した。クラス２については、pKS25p7をSphIおよびBamHIで切断し、ゲル回収して460b pフラグメントを切り出し、そしてSphIおよびBamHIによる置換PCRフラグメントカットに連結して、pKS25Pを生成した。クラス６については、pKS66p1をHindIIIで切断し、DNAポリメラーゼIのKlenow フラグメントで埋め、SphIで切断し、そしてゲル回収して400bpフラグメントを切り出した。PCRフラグメントをT4 DNAポリメラーゼで末端を平滑にし、SphIで切断し、そして除去されたpKS66p1中にクローニングしてpKS66Pを生成した。実施例６−プロモーターGUS構築物異種系においてならびに種々の生物および環境条件下でクローニングされたプロモーター領域の空間的および時間的調節を評価するために、これらを使用してタバコ中にレポーター遺伝子を駆動させた。各プロモーターフラグメントとβ− グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子との間の転写融合物を、植物アッセイおよび組織化学的局在のために操作した。疑いを避けるために、ここではレポーター遺伝子を便宜のためのみで使用して、そして関連する原理を証明した。非テスト(non -test)状況では、本発明のプロモーターによって制御される遺伝子は、所望の効果を生じるものである。プラスミド構築標準的組換えDNA方法を、プラスミドベクターの構築に適合させた（Sambrook ら，1989）。CP12 HindIII-NotI-1.7kbプロモーターフラグメントを、pKS12Pから切り出し、DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメントを使用して埋め、そしてβ -グルクロニダーゼをコードするE．coli uidA遺伝子を含むAgrobacterium TiベクターpTAK1のSmaI部位に連結して（Jeffersonら，1987）、pTAKCP12バイナリーベクターを産生した。同様に、CP25 HindIII-BamHI-3.7kbおよびCP66 BamHI-1.9 kbプロモーターフラグメントを、それぞれpKS25PおよびpKS66Pから切り出し、そして同じ酵素でpTAK1カット中に連結して、pTAKCP25およびpTAKCP66バイナリーベクターを産生した。すべての構築物を、ベクター構築のための中間宿主として E．coli株DH5α中に形質転換した。得られるキメラレポーター遺伝子構築物の構造を、PCR、制限切断、および配列分析によって検証した。図23は、植物形質転換のための構築物の概略図を示す。植物形質転換プラスミドpTAKCP12、pTAKCP25、およびpTAKCP66を、Holstersら（1978）によって記載される凍結／融解方法を使用して、Agrobacterium tumefaciens LBA440 4に移した。タバコ（Nicotiana tabacum var．Samsun）形質転換体を、リーフディスク方法（Bevan，1984）によって産生した。苗条を、100mg/lカナマイシンおよび200mg/lカルベニシリンを含む培地で再生した。発根の後、苗木を温室に移し、そして16時間照明／８時間暗条件下で生長させた。結果初代形質転換体分析目的初代形質転換体を、植物の数を減少させるためにポリメラーゼ連鎖反応（PCR ）によって最初に分析して、それらがインタクトなプロモータ一レポーター遺伝子カセットを含むことを分析しそして確実にした。プロモーターがカルスにおいて脱調節され得るので、GUS分析を形質転換からのカルスで行って、プロモーターが、（例えば、バルナーゼリボヌクレアーゼ遺伝子がこれらのプロモーターの１つにより駆動されるならば）導入遺伝子の性質に依存する、将来の形質転換の効率での有害な効果を有し得るこの段階で活性ではないことを確実にした。プロモーター活性をまた、初代形質転換体からの若葉で評価して、この段階での異所性発現の不在を確認した。ポリメラーゼ連鎖反応トランスジェニック植物のPCR分析のためのゲノムDNAを、Edwardsら（1992）に従って調製した。植物抽出DNA（2.5ul）を、25ul PCR反応液［200uM dNTP；３ mM MgCl2；１uMオリゴ；１×PCR緩衝液］中２UのTaqポリメラーゼ（Gibco BRL）を使用して増幅した［80℃での熱開始；（94℃、１分；63℃、１分；72℃、１分）×35サイクル；（72℃、７分）×１サイクル］。結果クラス当たり37の個々の形質転換体のトータルを、インビトロ培養物12CP、25 CP、および66CP外植体からランダムに選択し、そして２セットのプライマーで分析した。第１のセットは、NPTII遺伝子のNOSターミネーターの5'末端に特異的な１つのプライマー（NOSTER1）およびクローニングしたプロモーターの5'末端に特異的な逆プライマー（CYSGE12R、CYSGE25R、またはCYSGE66R）を含んだ。第２のセットは、プロモーターの3'末端に特異的な１つのプライマー（CYSGE12C，CY SGE25C、またはCYSGE66C）およびGUS遺伝子の5'部分に特異的な逆プライマー(GU S1R)を含んだ。34の外植体のトータルを、クラス６について２倍PCRポジティブであることを見いだした（テストした植物の94％）が、クラス１およびクラス２について27の植物のみが予測した結果を示した（テストした植物の73％）。インタクトなカセットを含む植物をガラス温室に移しそして自家受粉させた。GUS酵素アッセイ基質4-メチルウンベリフェリル-D-グルクロニド（Sigma）で行ったGUS活性についての蛍光アッセイを、Perkin-Elmer LS-35フルオロメーター（Jeffersonら，1987）を使用して行った。組織ホモジネートのタンパク質濃度を、Bio-Radタンパク質アッセイ（Bradford，1976）によって決定した。結果 GUSアッセイを、形質転換プロセスから得られる20の再生カルスでの各クラスについて行った。野生型の葉およびカルスからのならびに35S-GUSトランスジェニック植物からの葉からのタバコ抽出物を、それぞれネガティブおよびポジティブコントロールとして使用した。図24に示すように、35S-GUS植物からの葉に存在するレベルと比較して、カルスでは有意なGUS活性は検出され得なかった。図25は、各クラスの初代形質転換体からの若葉におけるGUS活性のレベルの予備評価を示す。結果は、プロモーターがこの段階で活性ではないことを示す。これは、クラス２および６について得られるノーザンブロット結果の確認であるが、クラス１についての結果に反する（図６）。クラス1CPは、葉においていくらかの発現を示したが、これはプローブの性質のための交差ハイブリダイゼーションの問題によると考えられる。GUS結果は、最新の仮説を確認するようであった。隔離している集団の分析目的目的は、低発現物から高発現物までの範囲の、好ましくはこれが株間の比較を容易にするように導入遺伝子の単一遺伝子座挿入を有する株からの、４つのGUS 発現株を各クラスについて選択することであった。初代形質転換体における遺伝子座の数は、子孫におけるNPTII（カナマイシン耐性）遺伝子の隔離によって推定される。隔離テスト種子を、10％漂白剤で15分間滅菌した。滅菌水で数回洗浄後、約150個の種子を100mg/lカナマイシンを含む1/2MS培地（2.3g/l MS塩、1.5％スクロース、0.8 ％Bactoagar、pH5.9）上に蒔いた。種子を、スコア付けの前に16時間／８時間の明／暗にて26℃で３週間生長させた。初代形質転換体が導入遺伝子の１つのコピーを含むならば、kan^R対kan^S種子についての予測される比は、３対１であった（しかし、非常にまれな場合には、１つの遺伝子座はおそらくいくつかの導入遺伝子を含み得る）。結果合は花弁によって置き換えられた１つ以上の正常な雄しべを有する。これらの植物のいくつかは、まったく種子を回収し得ないという非常に悪い影響を受けた。以下の表は、初代形質転換体についての遺伝データを要約する。予備時間経過実験ノーザンブロット結果は、種子膨潤後（DAI）２〜３日に、ナタネ中のCPm RNA の蓄積を示した。しかし、タバコでの異種発現は、生理学および転写機構における差異のため、ナタネでの内因性発現とは異なり得る。さらに、プロモーターの活性を、検出を遅延するレポータータンパク質を介して間接的に分析した。そのため、F1世代のすべてが分析されるべきである時点で計算するために、各プロモーターからのGUS発現の時間経過が確立されなければならなかった。結果実験を、クラス当たり２つのランダム株で、ならびに野生型および35S-GUSコントロール株で行った。各時点について、株12CP5、12CP14、25CP8、25CP13、66 CP8、および66CP76の40の種子ならびにコントロールを、1/2MS培地を含むプレート上に、16時間／８時間の明／暗で26℃にて生長させた。実生を、０、２、４、６、８、10、29、および36DAIでサンプリングし、そして−70℃で保存した。０〜10DAIの時点で、10の最大実生を採集したが、５個のみが29および36DAIに採取され、これはこれらの試料内の変動を増加させた。上記の条件下で生長させたタバコ実生では、６つのうちの３つの株は、発芽中にGUS発現の誘導を示した（図26）。活性は約30DAIでピークであったが、タンパク質蓄積は、８DAIで明確に開始した。したがって、F1世代は、GUS発現体(expre ssor)の範囲を同定するために、14および28DAIで評価されるべきである。最大の活性は、最良の発現株（12CP5）において約５％の35S-GUSであるが、葉における比較的高レベルの発現は、これが導入遺伝子の位置効果によるものであり得ることを示唆する。正常レベルの発現は、約１％の35S-GUSであるようである。発芽中の高GUS発現株の同定結果実生を、上記の条件で100mg/lカナマイシンを補充した1/2MS培地で生長させた。５つの実生を、０DAI（乾燥種子）、14DAI（２倍に広がった葉）、および28DA I（４倍に広がった葉）で採取し、プールし、そして上記のように２連で評価した。図27、28、および29は、それぞれクラス１、２、および６についての発現レベルを要約する。これらの予備データは、プロモーターがタバコにおいて実生特異的な様式で発現されることを示唆する。ナタネにおけるRNA研究から予測されるように、発現のレベルは低い。クラス２プロモーターフラグメントは、この段階でクラス１よりも活性であるが、クラス６は、非常に低い発現レベルを示す。 GUS組織化学的検出全実生のGUS組織化学的染色を、１mM X-gluc(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル)-D-グルクロニド、100mM NaPO4 pH7.5、10mM EDTA、0.5mM K3Fe(CN)6、0.5mM K4Fe(CN)6、0.1％Titon X-100、0.1％DMSOを含む溶液を用いて真空浸潤によって達成した。37℃での12時間インキュベーション後、インタクトな実生の写真を撮った。あるいは、染色した実生を、液体窒素で凍結する前に、Tissue-Tek OCT 化合物を用いて真空浸潤した。明るい低温槽ミクロトーン（model 5030）を使用して−23℃にて20μm切片に切断した。本発明の範囲から逸脱することのない本発明の他の改変は、当業者には明らかである。参考文献

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者グリーンランド，アンドリュージェイムズイギリス国アールジー42 ６イーワイバークシャー，ブラックネル，ジャロッツヒルリサーチステイション（番地なし) (72)発明者トーマス，ディディアーレーンフィリップイギリス国アールジー42 ６イーワイバークシャー，ブラックネル，ジャロッツヒルリサーチステイション（番地なし)

Claims

【特許請求の範囲】１．ナタネシステインプロテアーゼ遺伝子プロモーターのDNA配列を含むプロモーターであって、該プロモーターが、図19、20、もしくは21に示すDNA配列の少なくとも一部、またはそれとの実質的な相同性を有する配列、あるいはその改変体を含む、プロモーター。２．図19に示すDNA配列の少なくとも一部、またはそれとの実質的な相同性を有する配列、あるいはその改変体を含む、プロモーター。３．図20に示すDNA配列の少なくとも一部、またはそれとの実質的な相同性を有する配列の少なくとも一部、あるいはその改変体を含む、プロモーター。４．図21に示すDNA配列の少なくとも一部、またはそれとの実質的な相同性を有する配列の少なくとも一部、あるいはその改変体を含む、プロモーター。５．目的の遺伝子に作動可能に連結された請求項１〜４のいずれかに記載のプロモーターを含む、組換えDNA構築物。６．細胞機能を破壊し得る産物をコードするディスラプター遺伝子、および該ディスラプター遺伝子についての請求項１〜４のいずれかに記載のプロモーターを含む、植物において機能的な組換えDNA構築物であって、該ディスラプター遺伝子が、化学インデューサーの外部適用によって誘導可能であるプロモーターを含む外部調節可能な遺伝子制御領域に機能的に連結されそしてこれによって制御される、組換えDNA構築物。７．請求項６に記載の組換えDNA構築物であって、前記誘導性プロモーターが、リプレッサータンパク質遺伝子に機能的に連結されそしてこれを制御し、そして前記ディスラプター遺伝子プロモーターが、該リプレッサータンパク質によって認識されるオペレーター配列を含み、その結果前記インデューサーの存在下、該オペレーター配列と相互作用する該リプレッサータンパク質が産生され、それによって第２のプロモーターを無能にしそして該ディスラプター遺伝子の発現を阻害する、組換えDNA構築物。８．請求項６または７に記載の組換えDNA構築物であって、前記ディスラプター遺伝子がヌクレオチド配列であり、これが植物発生に必須である内因性植物遺伝子、または植物上に所望の特徴を与える遺伝子にセンス配向であるか、あるいは内因性植物遺伝子の部分センス配列を含む、組換えDNA構築物。９．前記ディスラプター遺伝子が、植物発生に必須である内因性植物遺伝子または植物に所望の特徴を与える遺伝子に対してアンチセンス配向であるヌタレオチド配列である、請求項６または７に記載の組換えDNA構築物。１０．前記内因性植物遺伝子が、種子発芽または初期実生発生に必須である、請求項８または９に記載の組換えDNA構築物。１１．前記外部調節可能な遺伝子制御領域が、グルタチオンS-トランスフェラーゼ系、Alc系、またはエクジソン系からの化学的誘導性遺伝子プロモーター配列である、請求項６〜１０のいずれかに記載の組換えDNA構築物。１２．前記リプレッサータンパク質遺伝子が、細菌リプレッサーをコードする、請求項８〜１１のいずれかに記載の組換えDNA構築物。１３．前記リプレッサータンパク質遺伝子が、lacリプレッサー、あるいは434 、P22、またはラムダバクテリオファージによって使用されるリプレッサーをコードする、請求項１２に記載の組換えDNA構築物。１４．前記ディスラプター遺伝子またはディスラプタープロモーターが、「偽オペレーター」を含む、請求項６〜１３のいずれかに記載の組換えDNA構築物。１５．前記ディスラプター遺伝子が、細胞傷害性遺伝子である、請求項６〜１４のいずれかに記載の組換えDNA構築物。１６．前記ディスラプター遺伝子が、リコンビナーゼ、またはリコンビナーゼ認識部位に隣接するヌクレオチド配列を切除するために適合されるトランスポゼースをコードする、請求項６〜１４のいずれかに記載の組換えDNA構築物。１７．図12に示される配列の少なくとも一部、またはそれとの実質的な相同性を有する配列、あるいはその改変体を含み、そしてシステインプロテアーゼをコードする、DNA。１８．図13に示される配列の少なくとも一部、またはそれとの実質的な相同性を有する配列、あるいはその改変体を含み、そしてシステインプロテアーゼをコードする、DNA。１９．図14に示される配列の少なくとも一部、またはそれとの実質的な相同性を有する配列、あるいはその改変体を含み、そしてシステインプロテアーゼをコードする、DNA。２０．図15に示される配列の少なくとも一部、またはそれとの実質的な相同性を有する配列、あるいはその改変体を含み、そしてシステインプロテアーゼをコードする、DNA。２１．図16に示される配列の少なくとも一部、またはそれとの実質的な相同性を有する配列、あるいはその改変体を含み、そしてシステインプロテアーゼをコードする、DNA。２２．図17に示される配列の少なくとも一部、またはそれとの実質的な相同性を有する配列、あるいはその改変体を含み、そしてシステインプロテアーゼをコードする、DNA。２３．プロモーターに作動可能に連結された請求項１７〜２２のいずれかに記載のDNAを含む植物において機能的な、組換えDNA構築物。２４．請求項５〜１６および２３のいずれかに記載の組換えDNA構築物であって、該構築物が、穀果または実生または植物のゲノムDNA内に統合され、好ましくは安定に統合される場合、発芽中の実生または発生中の穀果または植物の１つまたは複数の組織で発現され得る、組換えDNA構築物。２５．植物材料の１つまたは複数の組織についての発現系であって、該発現系が、請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子プロモーターに融合した目的の遺伝子を含み、ここで、該発現系が、植物材料の１つまたは複数の組織で発現され得る、発現系。２６．前記発現系が、発芽中の実生または発生中の穀果または植物（例えば、根、子葉、葉、および幹）の少なくとも組織についての発現系である、請求項２５に記載の発現系。２７．前記発現系が、発芽中の実生のゲノムDNAまたは発生中の穀果のゲノムD NAまたは植物のゲノムDNA内に統合され、好ましくは安定に統合される、請求項２５または２６に記載の発現系。２８．請求項５〜１６および２３のいずれかに記載の構築物を含む、発現系。２９．請求項１〜４のいずれかに記載のプロモーター、請求項１７〜２２のいずれかに記載のDNA、請求項５〜１６または２３のいずれかに記載の組換えDNA構築物、または請求項２４〜２８のいずれかに記載の発現系を含む、組換え植物ゲノム。３０．請求項２９に記載の組換え植物ゲノムを有する植物、植物の種子、または植物細胞。３１．請求項５〜１６または２３のいずれかに記載の組換えDNA構築物を含む植物を含む、防御された植物胚形質。３２．請求項５〜１６または２３のいずれかに記載の組換えDNA構築物を含む成熟状態に生長し得ない、植物または種子。３３．植物材料の１つまたは複数の組織で遺伝子プロモーターに融合される場合に目的の遺伝子の発現を誘導するための、請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子プロモーターの使用。３４．前記遺伝子プロモーターが、発芽中の実生または発生中の穀果または植物（例えば、根、子葉、葉、および幹）の少なくとも１つまたは複数の組織で、該遺伝子プロモーターに融合される場合に目的の遺伝子の発現を誘導するために使用される、請求項３３に記載の使用。３５．図12〜17および図19〜21のいずれか１つに関して上記のように実質的に記載される、プロモーター、構築物、または発現系。