JP2000507214A

JP2000507214A - Ｂ細胞悪性疾患用ワクチン

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Publication number: JP2000507214A
Application number: JP9529517A
Authority: JP
Inventors: ポペスク，ミルセア・シー; クワク，ラリー; オチョア，アウグスト・シー; ボーニ，ラリー
Original assignee: バイオミラ・ユーエスエイ・インコーポレイテッド
Priority date: 1996-02-16
Filing date: 1997-02-13
Publication date: 2000-06-13
Anticipated expiration: 2017-02-13
Also published as: EP0918539A4; EP0918539B1; US20030021838A1; ATE306937T1; DE69734392T2; CA2246708A1; EP0918539A1; CA2246708C; JP3948751B2; US6312718B1; WO1997029769A1; DE69734392D1; AU2273497A

Abstract

(57)【要約】少なくとも１種のＢ細胞悪性腫瘍関連抗原と、単独または少なくとも１種の他のサイトカインと組み合わせたＩＬ−２と、少なくとも１種の脂質分子とを含むリポソーム製剤を含むワクチンは、哺乳動物で、悪性Ｂ細胞に対する体液性免疫応答または細胞性免疫応答を誘導する方法に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】Ｂ細胞悪性疾患用ワクチン発明の背景１．発明の分野本発明は、悪性Ｂ細胞に対する体液免疫応答および細胞免疫応答を誘導する方法に関する。特に、本発明は、Ｂ細胞悪性疾患関連の抗原を使用して、腫瘍細胞に対する完全な免疫学的応答を惹起する方法に関する。２．背景免疫療法の主な目的の１つは、腫瘍細胞または感染性生物に対する患者の免疫系を利用することである。癌治療に関しては、その目的は、腫瘍細胞と関連しているが正常な相対物とは関連がない抗原を標的とすることによって、患者の免疫系を腫瘍に向けることである。この腫瘍関連抗原（ＴＡＡ:tumor associated antigen）は、同定することが困難であった。ある腫瘍細胞は、胎児発育中には存在するが、成体では通常は発現しないか非常に低レベルで発現する抗原を発現する。このような腫瘍胎児性ＴＡＡの１例は、肝癌細胞によって発現されるα− フェトプロテイン（α-fetoprotein）である。別の腫瘍胎児性ＴＡＡは、ほとんどの内肺葉由来消化系上皮の腺癌ならびに乳癌細胞および非小細胞性肺癌細胞に発現される癌胎児性抗原（ＣＥＡ）である。Thomas et al.,Biochim.Biophys.Ac ta 1032:177(1990)。ＴＡＡによく似た抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）の投与は、前途有望な癌免疫療法へのアプローチである。Goldenberg,Amer.J.Med.94:297 1993)。Ａｂ２は、従来の抗体（Ａｂ１）の可変領域に対する抗体である。あるＡｂ２（「Ａｂ２ β」、「抗イディオタイプ」または「内部イメージ」抗体と呼ばれる）は、名目上の抗原の三次元構造によく似ている可能性があり、したがって、Ａｂ２と抗原はＡｂ１結合部位の同一領域に結合する可能性がある。Jerne et al.,EMBO J.1: 243(1982)、Losman et al.,Int.J.Cancer 46:310(1990)、Losman et al.,Proc.N at'l Acad.Sci.USA 88:3421(1991)、Losman et al.,Int.J.Cancer 56:580(1994) 。Ａｂ２βで免疫化した者には、抗−抗−抗体（Ａｂ３）が生じ、その一部は名目上の抗原に結合することができる。抗イディオタイプ抗体には抗原模倣特性があるため、名目上の抗原を容易に入手できないときまたは宿主が名目上の抗原に耐性であるとき、Ａｂ２βを代理抗原（またはイディオタイプワクチン）として使用するに至った。実験系では、あるＴＡＡによく似ているＡｂ２βで免疫化すると、ＴＡＡに対する特異的免疫性を惹起し、その後の腫瘍成長を防ぐ。たとえば、Nepom et al.,Proc.Nat'l Acad .Sci.USA 81 2864(1984)、Raychaudhuri et al,J.Immunol.139:271(1987)。同様に、Streptococcus pneumoniae[McNamara et al.,Science 226:1325(1984)]、Ｂ型肝炎ウイルス[Kenncdy et al.,Science 223:930(1984)]、Escherichia coli Ｋ13[Stein et al.,J.Exp.Med.160:1001(1984)]、Schistosomiasis mansoni[Kre sina et al.,J.Clin.Invest.83:912(1989)]、およびMoloneyネズミ肉腫ウイルス [Powell et al,J.Immunol.142：1318(1989)]など、感染性生物に対する抗イディオタイプワクチンが開発されている。しかし、このアプローチの有用性は限定されている。動物起源の抗ＴＡＡを受けている癌患者は通常、Ａｂ１に対する抗体を産生し、これらの抗イムノグロブリン抗体はＡｂ２を含む。Herlyn et al.,J.Immunol.Methods 85:27(1985)、Tra ub et al.,Cancer Res.48:4002(1988)。抗イディオタイプ応答もＴ細胞（Ｔ２）の発生を含むと考えられる。Fagerberg et al.,Cancer Immunol.Immunother.37: 264(1993)。さらに、Ａｂ２はＡｂ１．Ｉｄ．と同じエピトープを認識することが可能な体液性抗−抗−イディオタイプおよび細胞性抗−抗−イディオタイプ応答を続いて誘導する（それぞれＡｂ３およびＴ３）。これは、免疫応答の効果を低減する可能性があるため、問題である。それ故、体液性免疫系と細胞性免疫系の両者を利用する免疫療法への取り組みを提供する機会がある。腫瘍細胞、特に悪性Ｂ細胞に対する完全な応答を誘発する本方法は、このアプローチの最初の結果である。発明の概要したがって、本発明の目的は、悪性Ｂ細胞、特にリンパ腫、慢性リンパ性白血病、および多発性骨髄腫に対する体液性免疫応答および細胞性免疫応答を誘導することによってワクチンおよび治療方法を提供することである。このワクチンは、抗原関連の少なくとも１種のＢ細胞悪性疾患、少なくとも１種のサイトカイン、および少なくとも１種の脂質分子を組込んだリポソーム製剤を含む。したがって、この配合剤は、斬新で且つより強力なＢ細胞悪性疾患用ワクチンとなる。Ｂ細胞悪性疾患関連抗原は治療を受ける患者に由来し、したがって、このワクチンは患者の悪性疾患に好ましく向けられる。それ故、１つの実施態様で、本発明は（１）少なくとも１種のＢ細胞悪性疾患関連抗原と、（２）単独でまたは少なくとも１種の他のサイトカインと組み合わせたＩＬ−２と、（３）少なくとも１種の脂質分子とを含むリポソーム製剤を含むワクチンを提供する。別の実施態様で、Ｂ細胞悪性疾患関連抗原は、悪性Ｂ細胞関連抗体または悪性Ｂ細胞によって産生された抗体の全部または一部を含む。このような悪性Ｂ細胞には、リンパ腫、慢性リンパ性白血病および多発性骨髄腫と関連したものが含まれる。さらなる実施態様で、本発明のワクチンは、抗体または抗体フラグメントではない腫瘍関連抗原をさらに含む。このような付加的ＴＡＡの例としては、たとえば、ＭＵＣ−１、エプスタイン・バーウイルス（Epstein Barr Virus）（ＥＢＶ）抗原、バーキットリンパ腫(Burkitt's lymphoma)関連抗原などがある。代替実施態様で、本発明のワクチンは、ＨＬＡ抗原など、正常Ｂ細胞抗原をさらに含む。別の実施態様で、本発明のワクチンは別のサイトカインをさらに含み、付加的サイトカインの例としては、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γなどがある。本発明のワクチンは、リン脂質、コレステロール、および糖脂質およびこれらの脂質類の誘導体から成る群から選択された少なくとも１種の脂質分子を含む。さらなる実施態様で、本発明のワクチンはキャリヤータンパク、たとえば、アルブミンも含む。別の実施態様では、（１）少なくとも１種のＢ細胞悪性疾患関連抗原と、（２）単独でまたは少なくとも１種の他のサイトカインと組み合わせたＩＬ−２と、（３）少なくとも１種の脂質分子とを含むリポソーム製剤を含むワクチンを前記哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物で悪性Ｂ細胞に対する体液性免疫応答および細胞性免疫応答を誘導する方法を提供する。図面の簡単な説明図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、本発明に従って調製したリポソームの特徴を示す図である。図２は、実施例２によって免疫化したマウスとコントロールマウスの生存率を示す図である。図３は、実施例３によって免疫化したマウスとコントロールマウスの生存率を示す図である。図４は、実施例５によって免疫化したマウスとコントロールマウスの生存率を示す図である。図５は、実施例６に従って、抗イディオタイプ力価をＩＬ−２の関数として示す図である。図６は、実施例７に従って、Ｔ細胞増殖をワチン投与量の関数として示す図である。図７は、実施例８によって免疫化したマウスとコントロールマウスの生存率を示す図である。詳細な説明ワクチンは、次の３つのカテゴリーの分子を含む。１．少なくとも１種のＢ細胞悪性疾患関連抗原。このような抗原は、抗体または抗体のフラグメントであることが好ましい。２．ＩＬ−２のみ、またはＩＬ−２にＩＬ−２、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＦＮ−γなど１種以上の異なるサイトカインを加えた形の、サイトカイン。３．１種以上のリン脂質のみ、またはコレステロールなど、１種以上の異なる脂質と組合せた形の、少なくとも１種の脂質分子。ワクチン構造は、脂質（類）、サイトカイン（類）および少なくとも１種のＢ細胞悪性疾患関連抗原を含む微細小胞を含む。本発明のワクチンは、アジュバントまたはアルブミンなどのキャリヤータンパクも含む。１．定義抗原は、脊椎動物に導入されると、抗体の産生を刺激する物質である。イディオタイプは、抗体の可変領域の抗原決定基である。Ｂ細胞悪性疾患関連抗原は、悪性Ｂ細胞によって産生されるか悪性Ｂ細胞と関連があるが、通常は非悪性Ｂ細胞によって発現されないか、または非常に低レベルで発現される分子である。Ｂ細胞悪性疾患関連抗原の例としては、悪性Ｂ細胞によって産生される抗体、抗体フラグメント、および悪性Ｂ細胞によって産生されるか悪性Ｂ細胞と関連がある他の非抗体抗原などがある。通常、本発明による抗体フラグメントはイディオタイプを含む。腫瘍細胞関連抗原（ＴＡＡ）は、悪性細胞によって産生されるか悪性細胞と関連があるが、通常は非悪性細胞によって発現されないか、または非常に低レベルで発現される分子である。脂質は、アルコールなどの有機溶剤に可変的に溶解する生化学薬品である。脂質の例としては、リン脂質類、脂肪類、ワックス類およびコレステロールなどのステロール類などがある。ワクチンは、脊椎宿主に物質を投与して宿主を同一物質に対して免疫化するための物質である。一般に、ワクチンはウイルス感染、細菌感染、および様々な悪性疾患など、病状と関連した物質を含む。２．抗原の生産ａ．Ｂ細胞悪性疾患関連抗体および抗体フラグメント本発明による抗原は、悪性Ｂ細胞によって産生された抗体分子またはこのような抗体のフラグメントであってもよい。リンパ腫の場合、Ｂ細胞関連抗体は一般に貫膜ドメインを含む。慢性リンパ性白血病の場合、このような抗体も貫膜ドメインを有する。多発性骨髄腫の場合、悪性Ｂ細胞は抗体のフラグメントを分泌することが多い。１つの実施態様では、これらの抗体はＢ細胞悪性疾患の治療を受ける患者に由来する。抗体は、Ｂ細胞悪性疾患患者から採取した悪性Ｂ細胞含有組織の試料から抽出することができる。一般に、このような組織試料は、患者のリンパ節から採取される。多発性骨髄腫患者では、患者の血清または尿から抗体を抽出することができる。ある抗体軽鎖分子が多発性骨髄腫と関連していることは、当該技術上周知である。このようなタンパクの１例としては、ベンス・ジョーンズ（Bence-Jones）タンパクがある。当業者に周知のタンパク抽出手順および精製手順を使用して、Ｂ細胞抗体を単離し、精製することができる。このような単離技術および精製技術としては、たとえばプロテインＡセファロースを用いたアフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどがある。たとえば、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,VOL 1, 2.7.1-2.7.12ページ(John Wiley & Sone 1991)、METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY ,VOL.10,79-104ページ(The Humana Press,Inc.1992)を参照されたい。３種の主要なイディオタイプが慢性リンパ性白血病と関連していることも当該技術上周知である。別の実施態様では、悪性Ｂ細胞含有患者組織試料を使用してin vitroでモノクローナル抗体を創る。一般に、悪性Ｂ細胞を含有する悪性組織をマウス細胞株と融合させて、悪性Ｂ細胞関連抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を生産する。モノクローナル抗体を創る技術は当業者に周知である。たとえば、Kohler and M illstein,Nature 256:495(1975)およびCURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,VOL 1 ,2.5.1-2.6.7ページ(John Wilcy & Sone 1991)を参照されたい。１つの実施態様で、抗原は悪性Ｂ細胞によって産生された抗体のフラグメントを含む。通常、このようなフラグメントは悪性Ｂ細胞と関連したイディオタイプを含む。本発明による抗体フラグメントは、（Ａ）「半抗体」分子、すなわち、１つの重鎖：軽鎖対と、（Ｂ）１価フラグメントＦａｂおよびＦａｂ’、２価フラグメントＦ（ａｂ’）₂、１本鎖または２本鎖Ｆｖフラグメントなど、酵素的に切断された抗体フラグメントとを含む。抗体のＦｖフラグメントは、抗体の重鎖の可変領域（Ｖｈ）と抗体の掲載の可変領域（Ｖｌ）で構成される。本発明によれば、本発明内のフラグメントは、ペプシンやパパインなどのプロテアーゼによる消化および／または化学的還元によるジスルフィド結合の切断を含む方法によって、抗体から入手することができる。たとえば、抗体をペプシンで酵素的に切断して抗体フラグメントを作り、Ｆ（ａｂ’）₂と表示される５Ｓフラグメントとすることができる。チオール還元剤、および場合に応じて、ジスルフィド結合の切断によって生じるスルフヒドリル基のブロッキング剤を使用して、このフラグメントをさらに切断し、３．５ＳＦａｂ’１価フラグメントを創ることができる。あるいは、ペプシンを使用して酵素的に切断すると、１価Ｆａｂフラグメント２個とＦｃフラグメント１個が直接生じる。これらの方法は、たとえば、Goldcnbergにより米国特許第４，０３５，９４５号および第４，３３１，６４７号およびその中に含まれている参考文献に記載されており、これらの特許をそっくりそのまま本願の一部を構成するものとする。Nisonoff et al.,Arch Bio chem.biophys.89:230(1960)、Porter,Biocem.J.73:119(1959)、Edelman et al., METHOD IN ENZYMOLOGY VOL.1,422ページ(Academic Prcss 1967)、およびColigan 2.8.1-2.8.10ページおよび2.10.-2.10.4ページも参照されたい。あるいは、本発明に含まれる抗体フラグメントは、Applied Biosystemsや Multiple Peptide Systemsから市販されている自動ペプチドシンセサイザーを使用して合成することができ、また、当該技術上周知の技術を使用して、手で創ることも可能である。たとえば、Geysen et al.,J.Immunol.Methds 102:259(1978) を参照されたい。従来の技術を使用して、本発明による抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を直接決定することができる。抗体をタンパク分解的に切断すると、Ｖｈ領域とＶｌ領域が非共有的に会合したままであり、且つ抗原結合能を保持している２本鎖Ｆｖフラグメントを創ることができる。２本鎖Ｆｖフラグメントは、当該技術上周知の組換え発現法で創ることもできる。Skerra et al.,Science 240:1038(1988)、およびKing et al., Biochemical J.290:723(1991)を参照されたい。簡単に記載すると、本発明による抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、当該技術上周知の方法を使用した直接アミノ酸配列決定によって入手することができる。これらのアミノ酸配列から、これらの可変領域をコードする合成遺伝子を設計することができ、両者を発現ベクターに挿入することができる。哺乳動物宿主または細菌宿主由来の２種のポリペプチドを同時に発現することが可能であり、その結果、活性なＦｖフラグメントが形成される。本発明の抗原は「１本鎖抗体」であってもよく、この語句は、この説明では、抗原を特異性と結びつけ且つ抗体の重鎖および軽鎖の可変領域および超可変領域を含む線状ペプチドを表すために使用される。従来の方法論で、本発明による他の１本鎖抗体を創ることができる。ジフルフィド結合を挿入することによって、ＦｖフラグメントのＶｈ領域とＶｌ領域を共有結合させ、安定化させることができる。Glockshuber,et al.,Biochemistry 1362(1990)を参照されたい。あるいは、ペプチドリンカーを挿入することによりＶｈ領域とＶｌ領域を結合することができる。組換え発現ベクターを使用して、Ｖｈ配列、Ｖｌ配列およびペプチドリンカー配列をコード化している遺伝子を構築して発現させることができる。Colc her,et al.,J.Nat'l Cancer Inst 82:1991(1990)を参照されたい。本願明細書に記載の通り、ジスルフィド結合またはペプチドリンカーを使用して、Ｖｈ抗体鎖およびＶｌ抗体鎖由来の超可変領域を含むアミノ酸配列も構築することができる。別の形の抗体フラグメントは、相補性決定領域（ＣＤＲ）１個を構成するペプチドである。ＣＤＲ３など、ＣＤＲペプチド、（「最小認識単位」）は、関心事の抗体のＣＤＲをコード化している遺伝子を構築して発現させることによって、入手することができる。このような遺伝子は、たとえばポリメラーゼ連鎖反応を使用して、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって調製することができる。たとえば、Larrick et al.,Enzymology 2:106(1991)のMethods:A Comparison to Methodsを参照されたい。ｂ．非悪性疾患関連Ｂ細胞抗原本発明のワクチンは、悪性Ｂ細胞と特に関連のないＢ細胞抗原（「非悪性疾患関連Ｂ細胞抗原」）も含む。これらの抗原の例は当該技術上周知であり、ＣＤ1 ９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ５、およびＦＭＣ７などがある。Foon,K.Stem Cells 13(1):1-21(1995)。この群には、クラス１ＨＬＡ抗原およびクラス２ＨＬＡ抗原も含まれる（組織適合性分子）。クラス１ＨＬＡ抗原は、ほとんどすべての他の哺乳動物細胞でも見られる。ｃ．他の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）本発明のワクチンは、他のＴＡＡをさらに含んでもよい。このような腫瘍関連抗原の例は、ＭＵＣ−１、ＥＢＶ抗原およびバーキットリンパ腫である。３．リポソームの調製リポソームは、水性成分を包囲する１種以上の脂質２層構造体微細小胞である。一般に、Bakker-Woundenberg et al.,Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12(S uppl.1):S61(1993)、およびKim,Drugs 46:618(1993)。比較すると、リポソームは細胞膜に似ており、結果として、リポソームは一般に安全に投与され、且つ生物分解性である。リポソームは、調製方法によって１層であっても多層であってもよく、０．０２μｍから１０μｍより大きい範囲の直径でサイズが異なってもよい。様々な薬剤をリポソームで包むことができ、疎水性薬剤は２層構造体内に区分され、親水性薬剤は内部の水性空間内に区分される。たとえば、Machy et a l.,LIPOSOMES IN CELL BIOLOGY AND PHARMACOLOGY(John Libbey 1987)、およびO stro et al.,American J.Hosp.Pharm.46:1576(1989)を参照されたい。リポソームは実質的にあらゆるタイプの細胞に吸着し、その後、包まれた薬剤を徐々に放出する。あるいは、吸着されたリポソームは、食細胞で飲食される可能性がある。食作用に続いて、リポソーム脂質のリソソーム内分解および包まれた薬剤の放出が起こる。Schecrphof et al.,Ann.N.Y.Acad Sci.446:368(1985)。陽イオンリポソームは、in vitroでの哺乳動物細胞トランスフェクションの媒介に有効であるため、リポソームベクターの中で、陽イオンリポソームに関する研究が最も多い。陽イオンリポソームは、核酸のデリバリーに使用されることが多いが、薬剤やホルモンなど、他の治療法のデリバリーにも使用することができる。陽イオンリポソームは自然界には存在せず、陰イオン分子が多いin vivoでの生理学的環境と相容れないと思われるため、細胞毒性の可能性がある。リポソームは内網系内に優先的に飲食される。しかし、多量のリポソーム粒子による飽和や薬理学的手段による選択的マクロファージ不活化をはじめとする幾つかの方法で、内網系を取り囲むことができる。Classen et al.,Biochim.biophys.Acta 80 2:428(1984)。さらに、糖脂質誘導性脂質またはポリエチレングリコール誘導性脂質をリポソーム膜に組込むと、内網系による取り込みが有意に減少することが証明されている。Allen et al.,Biochim.Biophys.Acta 1068:133(1991)、Allen et al.,Biochim.Biophys.Acta 1150:９(1993)。陰イオンリポソームベクターの試験も行われてきた。この中には、飲食作用およびエンドソーム酸性化後にエンドソーム膜を破壊したりエンドソーム膜と融合するｐＨ感受性リポソームが含まれる。リポソーム複合体は、相応する細胞受容体が同定されているリガンド（通常はポリペプチド）をリポソーム製剤に加えることによって、関心事の細胞タイプまたは組織に向けて送られる。標的にされることができる細胞受容体の例は、特に卵巣癌の卓越した腫瘍マーカーとして最近認定された葉酸受容体である。KB細胞は葉酸受容体を非常に過剰発現することが判明している。Cambell et al., Cancer Res.51:6125-6132(1991)。トランスフェリン、プロテインＡ、ApoE、p- 糖タンパク、α２−マクログロビン、インスリン、アシオロフェツイン、アシアロオルソムコイド、様々な組織特異性を具有するモノクローナル抗体、ビオチン、ガラクトースまたはラクトース含有ハプテン（１価で且つ３触覚）、マンノース、ジニトロフェノール、およびビタミンＢ１２を含め、さらに他のターゲティングリガンドのリポソームターゲッティングが試験されている。リガンドは、予め形成されたリポソーム中の脂質アンカーに共有結合されるか、リポソーム調製中に組込まれる。Lee and Low J.Biol.Chem.Acta 1233:134-144(1995)。時には、合成ペプチドをＤＮＡ／リポソーム複合体に組込んで、その活性を増強したり、それらを核に向けて送ることがある。たとえば、細胞質に接近するためには、デリバーすべき分子は原形質膜バリヤーを乗り越えなければならない。事実上、ウイルス融合ペプチドは、原形質膜とのウイルス膜融合を促進することによつて、細胞質へのデリバリーを促進する。この問題に関する最近の総説については、Stegmann et al.,Ann.Rev.Biophys.Chem.18:187-221(1989)を参照されたい。インフルエンザウイルスの場合、赤血球凝集素（３量体）ＨＡペプチドＮ −末端セグメント（疎水性螺旋配列）は、エンドソーム内の酸性ｐＨ（ｐＨ５〜６）によって誘導された配置の変化によって露出し、標的膜内に入り、ウイルスと標的エンドソーム膜との間の融合を媒介する。Weber et al.,J.Biol.Chem.269 :18353-58(1994)。最近、ウイルス融合タンパクの挙動を模倣する幾つかの両親媒性螺旋形成オリゴペプチドが設計された。たとえば、Haensler and Szoka,Bio cuj.Chem.4:372-79(1993)を参照されたい。従来の方法論で陽イオンリポソーム製剤を創ることができる。たとえば、 Felgneret al.,Proc.Nat'l Acad.Sci USA 84:7413(1987)、Schreier,J.of Lipos ome Res.2:145(1982)、Chang et al.(1988)、前出、を参照されたい。Lipofecti n ョ(Life Technologies,inc.,gaithersburg,Maryland USA)など、市販の製剤も利用できる。使用する方法に関する最近の総説については、Wassef et al.,Immu nomethods 4:217-222(1994)およびWeiner,A.L.,4:217-222(1994)を参照されたい。リポソームサイズ、二層構造体の数、脂質組成、ならびにリポソームの電荷および表面特性を変えることによって、包まれた薬剤の治療利用率を調節することができる。リポソーム製剤は、１種以上のアジュバントを含んでもよい。さらに、血清アルブミンなどのキャリヤータンパクを加えることができる。４．リポソーム製剤のデリバリー一般に、リポソーム製剤の投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、医学的全身状態およびこれまでの病歴などの因子によって異なる。個々の製剤の用量範囲は、適当な動物モデルを使用して決定することができる。リポソームは、静脈内投与、腹腔内投与、鞘内投与、筋肉内投与、または皮下投与することが可能である。たとえば、Kim前出、Bakker-wounderberg et al.,( 1993)前出、Allen et al.(1993)前出、およびFielding et al.,Clin.Pharmacoki netics 21:155(1991)を参照されたい。治療用には、抗体またはフラグメントが治療上有効な量で哺乳動物に投与される。投与された量が生理学的に有意であった場合、抗体製剤は、「治療上有効な量で投与された」と言われる。薬剤の存在によって受容哺乳動物の生理学に検出可能な変化が生じた場合、その薬剤は生理学的に有意である。特に、本発明の抗体製剤は、その存在によって受容哺乳動物の体液性および／または細胞性免疫応答を惹起した場合、生理学的に有意である。５．サイトカイン類本発明のワクチンはサイトカイン類を含む。サイトカインの例としては、ＩＦＮ−γなどのインターフェロン類（ＩＦＮ）、インターロイキン類（ＩＬ）、Ｍ −ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、および腫瘍壊死因子などがある。ＩＦＮ−γは、マクロファージ、ならびにリンパ様細胞上および単球上の細胞表面クラスII組織適合性抗原を誘導する。たとえば、Klegerman et al.,BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY の"Lymphokines and Monokines"、Pezzuto et al.（編）、53-70ページ（Chapma n & Hall 1993）、およびRoitt et al,IMMUNOLOGY,第３版、7.8-7.14ページ(mos by 1993)。ＩＬ−２はＴ細胞成長因子であり、ナチュラルキラー細胞および腫瘍反応性Ｔ細胞Ｉｄ．の刺激因子である。それ故、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２が免疫応答増強に好ましいサイトカインである。６．実施例 oncovax材料マウス抗原３８ｃＩｄ DMPC：Survival Tech Lot RD 1426 MSA 25％）：Biocell Laboratories,CAlot#4002160 IL-2:Survival Tech Lot#RD 1534＠9.38mg/ml) OTx Buffer PEG ５０〜２００mgのDMPCまたは４／１の比率のDMPC/DMPGに以下のものを加え、最終体積を０．４〜１．０mlとした。抗原、すなわち、３８ｃＩｄ０．３〜１０mg ＩＬ−２０．０〜７×１０⁶単位マウス血清アルブミン０．０〜１２mg実施例１（ワクチン調製用凍結−解凍法）：水性成分を混合する。５mLバイアルガラスバイアル中で、粉末になった液体に加える。３５〜３９℃の水浴中で１０分間温める。３０秒間、渦巻き撹拌する。２４〜４５℃で１５分間、槽音波処理する。−８０℃の乾燥した氷／エタノール槽内でバイアルを１５分間凍結する。３５〜３９℃の水浴中で１０分間解凍する。渦巻き撹拌工程、音波処理工程、凍結工程および解凍を合計３回繰り返す。必要に応じて水性緩衝液を加えて希釈する。遠心分離によって試料を洗浄することが可能である。１２，０００rpmで２０分間遠心分離する。上清を除去し、さらに２回洗浄する。実施例２（ワクチン調製用音波処理−融合法）：水性緩衝液中、濃度１００〜３００mg/mLで脂質を水和する。３０〜４５℃の槽音波処理装置内で透き通るまで音波処理する。０．２μのフィルターを通過させて滅菌濾過する。抗原、ＩＬ−２および血清アルブミンを加える。試料を４〜１５℃に冷却する。これは、低温として−８０℃から１５℃まで、高温として２３℃から５０℃まで、任意の回数循環される温度である。実施例１と同様に、必要に応じて試料を希釈し、遠心分離によって洗浄することが可能である。実施例３（ＰＥＧ−融合法）：水性緩衝液中、濃度１００〜３００mg/mLで脂質を水和する。３０〜４５℃の槽音波処理装置内で透き通るまで音波処理した。０．２μのフィルターを通過させて滅菌濾過する。抗原、ＩＬ−２およびマウス血清アルブミンを加える。同量の分子量１，０００〜２０，００００のＰＥＧ溶液と混合する。ＰＥＧ溶液は６〜６０％（w/v）でなければならない。４〜２５℃で１〜２４時間インキュベートした後、遠心分離で洗浄してＰＥＧおよび組込まれていない活性成分を除去する。実施例４（押出法）：実施例１〜３の試料を１．０μ、０．４μおよび０．２μのポリカーボネートフィルターを通して押し出すことにより、小型化することが可能である。最終サイズは１００〜２００nmでなければならない。この開示に従ったワクチン製品をOncoVAXと呼ぶ。抗原（Ｉｄ）、ＩＬ−２および脂質の量、ならびにOncoVAX粒子のサイズを測定することによって、各OncoV ax製剤ならびに(KLH-Id)コントロールを分析した。 OncoVAXの構造成分の最終濃度（範囲）は次の通りであった。表１以下は、OncoVAXの特性化の例、および抗腫瘍免疫性、抗原含有量およびＩＬ −２含有量に関する有効なリポソーム投与量、リポソームワクチンによって誘導される体液性応答および細胞性応答、およびin vivo Ｔ細胞枯渇に対する作用を示すマウス試験である。抗原濃度は、ウサギ抗マウスＩｇＭに結合した未知の抗原にビオチニル化したウサギ抗マウスＩｇＭを加えたサンドイッチＥＬＩＳＡ法で決定した。これにストレプトアビジンーユーロピウムを加えてユーロピウム発光を測定した。実施例５（典型的なOncoVAX製剤の特性化）試料を、凍結防止剤を使用せずに液体プロパン中、銅地板の間で室温から急速に凍結し、Balzers凍結破砕ユニットで繰返してPhilips ３００電子顕微鏡で検査した。図５Ａは、形成した多層リポソームを示す。１粒子オプティカルセンシング（ＳＰＯＳ）で決定したとき、平均サイズは凡そ３．０μである。図５Ｂは、多数の隆起がある表面構造および波状パターンにおける切形変化を示す。図５Ｃ、マウス血清アルブミンを含むコントロールＤＭＣリポソームでわかるように、滑らかな波状パターンは室温でのＤＭＰＣリポソームの特徴である。棒＝０．４μ。実施例６（免疫性試験）Ｉｄのリポソーム製剤によって保護的抗腫瘍免疫性を獲得できるかどうかを決定するために、群当たり１０匹の同系Ｃ３Ｈ／ＨＥＮマウスをリポソームＩｄ製剤またはコントロールＩｄ製剤、あるいは体積０．２mlのＰＢＳ中５０μｇ３８Ｃ１３誘導Ｉｄで腹腔内免疫化した。２週間後、致死量である２×１０³個の３８Ｃ１３細胞をマウスに投与した。ノンパラメトリックマンテル対数順位ｐ値に基づいて、生存率の統計学的比較を行った。腫瘍投与後９０日を超えて生存しているマウスを安楽死させ、長期生存者として報告した。リポソームＩｄで免疫化すると、有意に長い生存ならびに保護（３０％）を示した。実施例７（リポソームワクチン有効性の最適化およびＫＬＨ複合Ｉｄワクチンとの有効性の比較。）投入Ｉｄ抗原の段階希釈液を製作し、それ以外は同じであるリポソームワクチンを準備した。調製後、組込まれたＩｄの実際の量を、前述の通りに各ワクチンについて決定した。ＩｄとＫＬＨの比率１：１で、且つ括弧内に示した動物当たりのＩｄ投与量のグルテルアルデヒド複合体によってＩｄ−ＫＬＨを調製した。保護的抗腫瘍免疫製に対する明らかな用量依存性効果が認められ、マウス当たり４０μｇ、１０μｇおよび２μｇのＩｄをデリバーするリポソームワクチン製剤を投与したマウスは、遊離Ｉｄ(free Id)で免疫化したコントロールと比較して有意に優れた生存率を示した。マウス当たり０．４μｇのＩｄをデリバーするリポソームワクチンで免疫化したマウスは、その後の腫瘍投与から保護されなかった。実施例８ＰＢＳ中のＩＤ−ＫＬＨの段階希釈液と比較した、少量のＩｄを含有する代表的なリポソームワクチンの効果を試験した。以前の試験で、複合体製剤中に５０ μｇのＩｄが最適投与量であることが証明されている。マウス当たり５０μｇ、１０μｇ、または２μｇのＩｄを含有するＩｄ−ＫＬＨで免疫化した群当たり１０匹のマウスは、それぞれ４０％、３０％、および０％の保護を示したのに対して、２μｇのＩｄを含有するリポソームワクチンで免疫化したマウス９匹は、その後の致死量腫瘍投与を３３％保護した(Ｉｄ−ＫＬＨ２μｇＩｄ投与と比較して対数順位ｐ＝０．００７)。実施例９投入ＩＬ−２の連続希釈液を含み、他の成分は一定に保った数種の製剤を調製することによって、リポソームＩｄワクチン製剤の成分としてのＩＬ−２必要量を試験した。このようにして得られたリポソーム製剤（すべて４０μｇのＩｄを含有する）を使用してマウスを免疫化した。２週間後、１つ腫瘍製剤から２×１０³個の３８Ｃ１３細胞をすべてのマウスに投与して、生存率を追跡調査した。対数順位ｐ値はＩｄ３群に対する比較を示す。致死量の腫瘍投与後のマウスの生存率パターンは、保護的腫瘍免疫性の誘導に対して明らかなＩＬ−２用量依存性を示した。ＩＬ−２を含有しないリポソームＩｄワクチンは有意な抗腫瘍免疫性を誘導できないことを示す他の実験によって、ＩＬ−２はワクチン製剤の重要な成分であるが、投入ＩＬ−２の量の１／１０を含有するリポソームワクチンは、有意な保護的腫瘍免疫性を誘導することができるという結論が裏付けられる（遊離Ｉｄ(free Id)に対して対数順位ｐ０．００４）。実施例１０リポソームＩｄワクチンが保護的抗腫瘍免疫性獲得を推進することによる細胞のメカニズも調査しようとして、筆者らは、異なる用量のＩｄを含有する様々なリポソームワクチン製剤によってマウスに誘導された血清抗イディオタイプ抗体レベルを最初に測定した。個々の血清試料を、Ｉｄ被覆微量滴定プレートへの結合について直接ＥＬＩＳＡで分析した。イディオタイプの抗体応答の特異性は、コントロールＩｇＭタンパクに結合しないことによって証明された。免疫化の２週間後、腫瘍投与の直前に、群当たり５匹のマウスから血清試料を採取し、平均抗イディオタイプ抗体レベルを示した。リポソーム捕獲Ｉｄの明らかな用量依存性作用が見られ、平均抗イディオタイプ抗体レベル１５μg/ml、７μg/ml、１μ g/mlおよび０．１μｇ/mlがＥＬＩＳＡで検出された。２μｇ、１０μｇおよび４０μｇのＩｄを含有するリポソームワクチン３群で、イディオタイプに特異的な体液性が証明されたことは、１回免疫化したマウスでも検出可能な抗イディオタイプ抗体を誘導することができなかった遊離Ｉｄ(free Id)と比較して完全に卓越している。しかし、リポソームＩｄワクチンによって誘導された抗イディオタイプの平均レベルはＩＤ−ＫＬＨによって誘導されたレベル（５５μg/ml）よりかなり低かった。実施例１１抗イディオタイプ抗体応答の強さは、リポソームＩｄワクチンおよびＩｄ−ＫＬＨによって誘導される相対保護レベルと完全に相関関係があるわけではないため、筆者らは、イディオタイプ特異的Ｔ細胞活性化の証拠を調査した。２週間前に表示通りに腹腔内免疫化しておいた群当たり２〜３匹のマウスから採取した脾細胞をプールし、ナイロンウールを通過させたＴ細胞で富化し、様々な濃度のＩｄ（２００μｌ、２×１０⁵細胞／ウェル）と一緒に９６ウェル微量滴定プレートに入れた。正常な同系マウスの照射（２０００rad）脾細胞も抗原提示細胞源として脾細胞培養に加えた（２×１０⁵個）。培養を３７℃、５％ＣＯ₂で５〜７日間維持し、収穫の１８〜２４時間前に、培地５０μｌ中１μＣｉ［³Ｈ−チミジン］（２Ｃ i/mmol、New England Nuclear Research Products,Bostn,MA）を各ウェルに加えた。組込まれた放射能を、LKB 1205βプレート液体シンチレーションカウンターで測定した。測定はすべて４重に実施し、データーは平均CPMと平均の標準誤差で示した。２週間前にリポソームＩｄワクチン、空のリポソーム、遊離Ｉｄ、またはＩｄ−ＫＬＨで１回免疫化したマウスから採取した脾臓Ｔ細胞の、様々な用量のＩｄに対する増殖応答についてin vitroで分析した。代表的実験で、Ｉｄに対する有意なＴ細胞増殖応答が認められたが、空のリポソームまたは遊離Ｉｄを投与した群では認められなかった。このようなＴ細胞活性化の証拠は、今までにＩｄ−ＫＬＨによる免疫化後に観察されたことがなく、Ｉｄ−サイトカイン融合タンパクで観察されなかったため、以上の結果も特に意味深い。実施例１２誘導された保護的抗腫瘍免疫性のエフェクター相におけるイディオタイプ特異的Ｔ細胞の役割を決定的に実証するために、筆者らはin vivoにおけるＴ細胞部分集合枯渇の影響を免疫化マウスで試験した。免疫化の２週間後、単一のリポソームＩｄワクチン製剤でマウスを免疫化し、単一の腫瘍製剤を投与する直前に隔日に３回、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＢＲＰＭ前臨床貯蔵所、Frederick,ＭＤの、ＧＫ１ .５、硫酸アンモニウム精製品）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＢＲＰＭ前臨床貯蔵所、Fre dcrick,ＭＤの、５３．６〜７２、硫酸アンモニウム精製品）のいずれかに特異的なｍＡｂの枯渇、２種の抗体の組み合わせ、正常なラットＩｇＧ(Sigma,St.Lo uis,MO)のによる処理を受けるように群当たり８匹のマウスを無作為に割り当てた。免疫化の３週間後に、単一の腫瘍製剤から２×１０³個の３８ｃ１３細胞をすべてのマウスに腹腔内投与し、生存率を追跡調査した。最終処置の２週間後に、並行してモノクローナル抗体を投与した正常マウスの脾細胞のサイトメトリー分析で、リンパ球枯渇を評価した。両分析時点で、９５％を超える当該部分集合の枯渇が達成されたが、他の部分集合は正常レベルであった。免疫化されたマウスの中で、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかが枯渇すると、保護的抗腫瘍免疫性が明らかに低減した（リポソームＩｄ免疫化した、正常なラットＩｇ投与マウスに対して対数順位ｐ＝０．０１２）。ｍＡｂ投与群は、遊離Ｉｄで免疫化したコントロールマウスと比較して有意差が認められなかった（遊離Ｉｄに対して、それぞれ対数順位ｐ＝０．０９おおよび０．１６）。抗ＣＤ４ｍＡｂと抗ＣＤ８ｍＡｂを併用投与しても、保護はそれ以上破棄されなかった（遊離Ｉｄに対して、対数順位ｐ＝０．１０）。それ故、リポソームＩｄワクチン誘導性保護的抗腫瘍免疫性には、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞とＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の両者が絶対必要である。実施例１３先に確立された腫瘍に対するリポソームＩｄ免疫化を試験する初期段階として、筆者らは腫瘍投与を最初に実施し、その後、同日に、ワクチン投与する実験を実施した。この試験用に、筆者らは、悪性腫瘍の成長を遅らせるために第１０日に非治療的用量のシクロホスファミド（ＣＴＸ）化学療法を必要とする皮下３８Ｃ１３腫瘍に対する既存のプロトコールワクチン投与を修正した。マウスの側腹に１０⁴個の腫瘍細胞を皮下注射し、リポソームＩｄ、リポソームコントロールＩｄワクチン、またはで腹腔内ＰＢＳのいずれかに無作為に割り当てた。生存率の代理エンドポイントとして腫瘍サイズをモニタリングすることがが可能なため、皮下経路の腫瘍接種を使用した。第１０日までに、すべてのマウスに肉眼で確認できる触知可能な直径約１cmの腫瘍塊が発生した。ＣＴＸ投与（７５mg/kg、腹腔内）は腫瘍の完全消失と関連があり、その消失は、すべてのコントロールマウスでは一様に一時的であったが、リポソームＩｄワクチンで免疫化したマウスでは、多くはないがかなりの比率で永続した（コントロール群に対して、プールしたリポソームＩｄでは対数順位ｐ＝０．０１）。表２．多量の皮下腫瘍接種材料に対するリポソームＩｄワクチンの治療効果Ｃ３Ｈマウスに１０⁴個の３８Ｃ１３腫瘍細胞を皮下注射し、その後、同日に（第０日）、表示の通りに免疫化した。第１０日に、全ての群にＣＴＸ７５mg/kg 、腹腔内、を投与した。腫瘍が再発せずに６０日を超えて生存しているマウスは明らかに治癒した。具体的な実施例について記載してきたが、本発明はこのように限定されるものではないことが理解されるであろう。当該技術上通常に熟練した者には、開示された実施態様に対して様々な修正が行われること、およびそのような修正は本発明の範囲内でることが理解されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 38/21 Ａ６１Ｋ 37/66 Ｇ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者クワク，ラリーアメリカ合衆国、21702 メリーランド、フレデリック、メドウサイド・ドライヴ 6753 (72)発明者オチョア，アウグスト・シーアメリカ合衆国、21702―1210 メリーランド、フレデリック、アレッサンドラ・コート 103、＃180 (72)発明者ボーニ，ラリーアメリカ合衆国、 08852 ニュー・ジャージー、モンマス・ジャンクション、カミングズ・ロード 40

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）少なくとも１種のＢ細胞悪性腫瘍関連抗原と、（ｂ）単独でまたは少なくとも１種の他のサイトカインと組み合わせたＩＬ−２と、（ｃ）少なくとも１種の脂質分子とを含むリポソーム製剤を含むワクチン。２．前記抗原が悪性Ｂ細胞と関連があるかまたは悪性Ｂ細胞によって産生された抗体の全部または一部を含むことを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。３．前記悪性Ｂ細胞がリンパ腫関連であることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。４．前記悪性Ｂ細胞が慢性リンパ性白血病関連であることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。５．前記悪性Ｂ細胞が多発性骨髄腫関連であることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。６．抗体または抗体フラグメントではない腫瘍関連抗原をさらに含む、請求項２に記載のワクチン。７．前記腫瘍関連抗原がＭＵＣ−１、ＥＢＶ抗原またはバーキットリンパ腫関連の抗原であることを特徴とする、請求項６に記載のワクチン。８．非悪性Ｂ細胞によって産生されるか非悪性Ｂ細胞と関連のあるＢ細胞抗原をさらに含む、請求項１に記載のワクチン。９．前記Ｂ細胞抗原がクラス１のＨＬＡ抗原またはクラス２のＨＬＡ抗原であることを特徴とする、請求項８に記載のワクチン。１０．前記少なくとも１種の他のサイトカインがＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＦＮ−γから成る群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。１１．前記脂質分子がリン脂質、糖脂質、コレステロール、および前記各脂質の誘導体から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。１２．キャリヤータンパクをさらに含む、請求項１に記載のワクチン。１３．前記キャリヤータンパクがアルブミンであることを特徴とする、請求項１２に記載のワクチン。１４．アジュバントをさらに含む、請求項１に記載のワクチン。１５．哺乳動物において、悪性Ｂ細胞に対する体液性免疫応答または細胞性免疫応答を誘導する方法であって、前記哺乳動物に請求項１〜１４のいずれか１項に記載のワクチンを投与することを含む方法。