JP2000507451A

JP2000507451A - カロテノイド生合成および代謝の遺伝子ならびにかかる遺伝子の選別システム

Info

Publication number: JP2000507451A
Application number: JP9535243A
Authority: JP
Inventors: フランシス、エックス．カニンガム、ジュニア; ザイレン、サン
Original assignee: University of Maryland College Park
Current assignee: University of Maryland College Park
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1997-01-28
Publication date: 2000-06-20
Also published as: EP0889952A1; CA2250096A1; AU719727B2; BR9708375A; US5744341A; WO1997036998A1; ZA971941B; EP0889952A4; US6524811B1; AU1578497A

Abstract

(57)【要約】本発明は、εシクラーゼ、イソペンテニルピロリン酸異性化酵素およびβカロテン水酸化酵素をコードする真核遺伝子に対するＤＮＡ配列およびこれを含有するベクターならびに上記ベクターを用いて形質転換された宿主を記載する。本発明は、宿主中の各種カロテノイドの比率を制御する方法および新規カロテノイド色素の生産方法を提供する。本発明はまた、カロテノイド生合成をコードする真核遺伝子の選別方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】カロテノイド生合成および代謝の遺伝子ならびにかかる遺伝子の選別システム発明の背景発明の分野本発明は、εシクラーゼ、イソペンテニルピロリン酸異性化酵素（ＩＰＰ）、およびβ−カロテン水酸化酵素をコードする真核性遺伝子のＤＮＡ配列、ならびにかかる配列を含むベクターおよび上記ベクターを用いて形質転換した宿主に関する。本発明はまた、カロテノイド蓄積の増大方法および新規で希少なカロテノイドの生産方法を提供する。本発明は、宿主中の各種カロテノイドの比率の制御方法を提供する。その上、本発明はカロテノイド生合成および代謝の酵素をコードする真核遺伝子を選別(screening)する方法を提供する。背景の論議環式末端基を有するカロテノイド色素は、酸素光合成生物（例えば、シアノバクテリア、藻類および植物；Goodwin，1980）における光合成装置の必須成分である。対称二環式黄色カロテノイド色素β−カロテン（または稀には、非対称二環式α−カロテン）は光合成反応中心と密接に関連し、かつ致死の可能性がある光酸化損傷から保護する核心的役割を演じている(Koyama，1991)。βカロテンおよびこれに由来する、またはαカロテンに由来する他のカロテノイドも集光性(l ight-harvesting)色素（Siefermann-Harms，1987）として役立ち、集光性アンテナ（Demmig-Adams & Adams，1992）により捕集された過剰光エネルギーの熱散逸に関与し、植物成長調整体アブシジン酸(Rock & Zeevaart，1991；Parry & Horgan，1991)の生合成用基質を提供し、かつヒトおよび動物食餌中のビタミンＡの前駆体(Krinsky，1987)である。植物もカロテノイドを花や果物の着色剤として利用し、受粉媒介体や種子散布体を誘引する(Goodwin，1980)。またカロテノイドにより提供される色彩は多数の重要な穀物において農学的価値がある。現在、カロテノイドは食物および飼料の色素として使用するために植物から収集される。植物、藻類およびシアノバクテリア中での環式カロテノイドの可能性ある形成経路を図１に示す。環式末端基の二つのタイプは通常は高等植物カロテノイドに見いだされ、これらはβおよびε環式末端基と呼ばれる（図３；この非環式末端基はΨまたはpsi末端基と呼ばれる）。これらの環式末端基は環中の二重結合の位置が異なるだけである。二つのβ環を有するカロテノイドは遍在し、一つのβ および一つのε環を有するカロテノイドは一般的であり、二つのε環を有するカロテノイドは滅多にみられない。βカロテン（図１）は二つのβ末端基を有し、かつゼアキサンチンおよびビオラキサンチン等の多数の他の重要な植物カロテノイドの前駆体である対称化合物である（図２）。カロテノイド酵素は以前にバクテリア(Armstrongら，1989，Mol．Gen．Genet ．216，254−268；Misawaら，1990，J．Bacteriol.，172，6704-12)、黴類（Sch midhauserら，1990，Mol．Cell．Biol．10，5064-70）、シアノバクテリア(Cham qvitzら，1990，Z．Naturforsch，45c，482-86)および高等植物（Bartleyら，Proc．Natl．Acad．Sci USA 88，6532-36；Martinez-Ferez & Vio que，1992，Plant Mol．Biol．18，981-83）を包含する多数の源から単離されている。単離された酵素の多くは源に応じて機能および阻害性において著しい多様性を示す。例えば、Synechococcusおよび高等植物由来のフイトエン不飽和化酵素は２段階の不飽和化を行って反応生成物としてζカロテンを生ずるが；一方、 Erwiniaからの同一酵素は四つの二重結合を導入してリコペンを形成する。バクテリア対植物酵素の場合にはアミノ酸配列の類似性は極めて低い。したがって、一つの源から手中にした遺伝子を用いた時ですら、他の一つの源において類似機能を有する遺伝子を選別するのは困難である。特に、原核および真核遺伝子間の配列類似性は全く低い。さらに、原核生物および真核生物における遺伝子発現の機構は十分に違っているようなので、単離した真核遺伝子が原核宿主中で適切に発現されるであろうことを期待することはできない。関連遺伝子を単離する困難性は、非環式前駆体リコペンからのβカロテンの形成を触媒する酵素を単離する最近の奮闘により例証される。この酵素は原核生物では単離されているが、光合成性生物のいずれからも単離されていないのみならず、対応遺伝子も同定および配列決定されておらず、共同因子必要条件も確立されていない。シアノバクテリアSynechococcus PCC7942中でのβカロテン形成を触媒する酵素の単離および特性化は本発明者ら他により記載されている (Cunninghamら，1992および1994)。 εシクラーゼ、ＩＰＰ異性化酵素およびβカロテン水酸化酵素をコードする遺伝子を包含する、カロテノイド生合成経路に関与する真核遺伝子の単離の必要性が依然として残されている。カロテノイド生産を増進する方法の必要性も残されている。同時に、カロテノイド生合成および代謝の酵素をコードする真核遺伝子を選別する方法に対する、当分野における必要性も残されている。発明の概要したがって本発明の第一目的は、カロテノイド生合成に関与する酵素特にεシクラーゼ、ＩＰＰ異性化酵素およびβ−カロテン水酸化酵素をコードする、単離された真核遺伝子の提供にある。本発明の第二目的は、新規カロテノイドを生産する酵素をコードする真核遺伝子の提供にある。本発明の第三目的は、上記遺伝子を含むベクターの提供にある。本発明の第四目的は、上記ベクターを用いて形質転換した宿主の提供にある。本発明の他の一つの目的は、新規もしくは希少カロテノイドを蓄積する、または既知カロテノイドを過剰生産する宿主の提供にある。本発明の他の一つの目的は、カロテノイド生産が抑制された宿主の提供にある。本発明の他の一つの目的は、組み換え原核生物宿主中の真核カロテノイド関連遺伝子の発現の確保にある。本発明の最後の目的は、カロテノイド生合成および代謝に関与する酵素をコードする真核遺伝子を選別する方法の提供にある。本発明のこれら、および他の目的は本発明者らにより以下に記載のように実現された。図面の簡単な説明本発明および付随の有利性の多くは、添付図面との関連で考慮した場合、次の詳細な説明を参照することにより、一層よく理解できるはずであり、図面において：図１はシアノバクテリア、藻類および植物中のβ−カロテン生合成経路の略説明図である。各種工程を触媒する酵素を左に示す。漂白除草剤ＮＦＺおよびＭＰＴＡの標的部位も左に示す。略号：ＤＭＡＰＰ、ジメチルアリルピロリン酸；ＦＰＰ、フアルネシルピロリン酸；ＧＧＰＰ、ゲラニルゲラニルピロリン酸；ＧＰＰ、ゲラニルピロリン酸；ＩＰＰ、イソペンテニルピロリン酸；ＬＣＹ、リコペンシクラーゼ；ＭＶＡ、メバロン酸；ＭＰＴＡ、２−（４−メチルフエノキシ）トリエチルアミン・塩酸塩；ＮＦＺ、ノルフルラゾン；ＰＤＳ、フイトエン不飽和化酵素；ＰＳＹ、フイトエン合成酵素；ＺＤＳ、ζカロテン不飽和化酵素；ＰＰＰＰ、プレフイトエンピロリン酸。図２はノイロスポレンからの環式カロテノイドならびに通常植物および藻類キサントフイル（オキシカロテノイド）の推定合成経路を示す。A．thalianaのβ およびεシクラーゼ酵素の活性はβおよびεそれぞれで標識した太矢で示す。ε カロテンへの矢印下方の棒印は、酵素活性は試験したが産物(product)が検出されなかったことを示す。点線を伴った矢印でマークした工程は特には試験しなかった。ノイロスポレンおよびα−カロテンの場合には炭素原子の通常の番号付けを行ってある。逆三角（▼）は不飽和化反応の結果として導入された二重結合の位置を示す。図３は植物中に見いだされるカロテン末端基を示す。図４は、A．thalianaから単離されたεシクラーゼのＤＮＡ配列および予想アミノ酸配列（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１および２）である。これらの配列はＧｅｎｂａｎｋ受入番号：Ｕ５０７３８号の下に寄託された。このｃＤＮＡをプラスミドｐＡＴｅｐｓ中に組み込む。図５は、A．thalianaから単離されたβ−カロテン水酸化酵素をコードするＤＮＡ配列（配列番号：３）である。このｃＤＮＡをプラスミドｐＡＴＯＨＢ中に組み込む。図６は、、Alicalgenes sp．（配列番号：５）（Genbank D58422）、Erwinia herbicola Eho10（配列番号：６）（Genbank M872280）、Erwinia uredovora （配列番号：７）（Genbank D90087）およびAgrobacterium aurianticum（配列番号：８）（Genbank D58420）からのバクテリア酵素と共にA．thaliana βカロテン水酸化酵素（配列番号：４）の予想アミノ酸配列の整列である。共通(con sensus)配列も示す。大文字で示した全ての五つの遺伝子の場合、コンセンサスは同一である。小文字は、A．thalianaを包含する五つの内三つが同一残基を有することを示す。ＴＭ；トランスメンブレン図７は、A．thaliana（配列番号：９）から単離したＩＰＰ異性化酵素をコードするｃＤＮＡのＤＮＡ配列である。このｃＤＮＡをプラスミドｐＡＴＤＰ５中に取り込む。図８は、A．thalianaから単離された他のＩＰＰ異性化酵素をコードする第２ｃＤＮＡのＤＮＡ配列（配列番号：１０）である。このｃＤＮＡをプラスミドｐＡＴＤＰ７中に組み込む。図９は、Haematococcus pluvialisから単離されたＩＰＰ異性化酵素をコードするｃＤＮＡのＤＮＡ配列（配列番号：１１）である。このｃＤＮＡをプラスミドｐＨＰ０４中に組み込む。図１０は、Haematococcus pluvialisから単離された他のＩＰＰ異性化酵素をコードする第２ｃＤＮＡのＤＮＡ配列（配列番号：１２）である。このｃＤＮＡをプラスミドｐＨＰ０５中に組み込む。図１１は、A．thaliana（配列番号：１６および１８）、H．pluvialis（配列番号：１４および１５）、Clarkia breweri）（配列番号：１７）（Blanc & Pic hersky，Plant Physiol．（1995）108:855;Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号：Ｘ８２６２７参照）およびSaccharomyces cerevisiae（配列番号：１９）（Genbank受入番号：J05090）から単離されたＩＰＰ異性化酵素の予想アミノ酸配列の整列である。図１２は、marigoldから単離されたＩＰＰ異性化酵素をコードするｃＤＮＡのＤＮＡ配列（配列番号：１３）である。このｃＤＮＡをプラスミドｐＰＭＤＰ１中に組み込む。ｘｘｘはこの出願の準備時点では未だ配列決定されていない領域を示す。図１３は、A．thaliana εシクラーゼ（配列番号：２１）と共に４つの植物β −シクラーゼ（配列番号：２０）の共通配列の整列である。植物βコンセンサスにおける大文字は、全ての４つのβシクラーゼ遺伝子がこの位置で同一アミノ酸残基を予想する場合に用いる。小文字は、同一の残基が３または４に見いだされたことを示す。ダッシュは、アミノ酸残基が保存されなかったことを示し、かつ配列における点はギヤップを示す。整列配列の場合のコンセンサスを整列下方に大文字で示すが、ここでβおよびεシクラーゼは同じアミノ酸残基を有する。矢印は、新規酵素活性を有するキメラシクラーゼの構築のための接合部位として使用される保存アミノ酸の幾つかを示す。この整列の下方に、ジヌクレオチド結合モチーフを示す配列記号を包含する幾つかの重要領域および２つの予想トランスメンブラン（ＴＭ）らせん領域を示し下線で示す。好ましい実施態様の説明カロテノイド生合成に関与する酵素をコードする、単離された真核遺伝子この度び本発明者らは、A．thaliana由来のεシクラーゼおよびβ−カロテン水酸化酵素および幾つかの源からのＩＰＰ異性化酵素をコードする、真核遺伝子を単離した。この度び本発明者らは、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）のジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）への転化を触媒するＩＰＰ異性化酵素をコードする真核遺伝子を単離した。ＩＰＰ異性化酵素はA．thaliana、H．pluvialisおよびm arigoldから単離された。図１２にこれらの整列を示す(marigold配列は除く）。これらの遺伝子を含むプラスミドはＡＴＣＣ受入番号９８０００（ｐＨＰ05-H．pluvialis)；９８００１(ｐＭＤＰ１-marigold);９８００２（ｐＡＴＤＰ7-H．pluvialis）および９８００４(ｐＨＰ04-H．pluvialis)の下に、１９９６年３月４日付きでthe America n Type Culture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockville MD 20852に寄託された。また本発明者らは、カロテノイドε末端基の形成に責任がある酵素εシクラーゼをコードする遺伝子を単離した。いずれの生物からのεシクラーゼコード遺伝子についてはこれまで記載がない。このA．thaliana εシクラーゼは対称リコペンの一端のみにε−環を追加するのに対して、関連βシクラーゼは両端に環を追加する。本発明のこのＤＮＡを図４および配列番号：１に示す。この遺伝子を含むプラスミドは、ＡＴＣＣ受入番号９８００５（ｐＡＴｅｐｓ-A．thaliana）の下に、１９９６年３月４日付きでthe American Type Culture Collection，12 301 Parklawn Drive，Rockville MD 20852に寄託された。本発明者らはまた、カロテノイドのβ末端基を水酸化するのに責任がある酵素 βカロテン水酸化酵素をコードする遺伝子も単離した。本発明のこのＤＮＡを配列番号：３および図５に示す。この完全長遺伝子産物は、Ｎ末端から５０アミノ酸までを切り詰めたタンパクをコードする遺伝子の産物と同様に、β−カロテンの両末端を水酸化する。Ｎ末端から約６０−１１０アミノ酸間で切り詰めたタンパクをコードする遺伝子の産物は一つの環のみを優先して水酸化する。この遺伝子を含むプラスミドはＡＴＣＣ受入番号：９８００３（ｐＡＴＯＨＢ-A.thalian a）の下に、１９９６年３月４日付きでthe American Type Culture Collection ，12301 Parklawn Drive，Rockville MD 20852に寄託された。新規または希少なカロテノイドを生産する酵素をコードする真核遺伝子本発明はまた、既知カロテノイドを新規または希少産物に転換し得る新しい酵素にも関する。すなわち現在ではε−カロテン（図２参照）およびγ−カロテンは小量で単離できるだけである。以下に述べるが、リコペンをγカロテンに、およびリコペンをεカロテンに転換する酵素は生産できる。これらの産物を手中にして、これらに由来する他のカロテノイドを大量に合成することが可能である。例えばεカロテンは水酸化されてルテイン（１ε−および１β−環）および両末端基が代わりにε環であるゼアキサンチン（２β−環）の異性体を形成する。カロテノイド生合成経路における真核遺伝子は、それらの原核生物対応体とは５’領域において異なっている。ここに記載する”５’領域”とは、原核ＤＮＡ中の対応遺伝子の開始コドンに先立つ真核ＤＮＡの領域のことである。すなわち、真核遺伝子および原核遺伝子の共通領域を整列すると、この真核遺伝子は原核開始コドンの上流に追加的コード配列を含んでいる。本発明者らは、存在する上記５’領域の量が真核酵素の活性を変え得ることを見いだした。活性低減の代わりに、真核遺伝子の５’領域を切り詰めると異なった特異性を示す酵素が生ずる。かくして本発明は、整列地図により決められるような、これらの原核対応体の５’開始コドンの０−５０、好ましくは０−２５コドン以内に切り詰めされた酵素に関する。例えば上記のように、A．thaliana βカロテン水酸化酵素をコードする遺伝子が切り詰めされると、ゼアキサンチンの正常の生産とは対照的に、この生成酵素は主産物としてのβ−クリプトキサンチンおよび小量産物としてのゼアキサンチンの形成を触媒した。既知酵素の５’領域を切り詰めて生ずる新規酵素以外にも、新規カロテノイド形成に関与できる新規酵素が、類似配列を用いて一つの遺伝子の部分を構造的に関連する遺伝子から置き換えることにより形成できる。例えば、β−シクラーゼおよびε−シクラーゼは構造的に関連している（図１３参照）。β−リコペンシクラーゼの一部をεシクラーゼの類似部分で置き換えると、γカロテンを生ずる酵素が生ずる（１末端基）。その上、εリコペンシクラーゼの一部をβシクラーゼの類似部分で置き換えると、εカロテンを生ずる酵素が生ずる（通常、εシクラーゼは２ではなく、１ε末端基を有する化合物（δカロテン）を生じる）。同様に、β水酸化酵素を修飾すると、ε水酸化酵素とのハイブリッド形成により新規機能の酵素が生ずる。ベクター上記のようにカロテノイド酵素をコードする遺伝子は、適当な発現ベクター中にクローン化(cloned)すると、植物発現システム中でこれら酵素を過剰発現させ、またはこれら酵素の発現を阻害させるのに使用できる。例えば、εシクラーゼをコードする遺伝子を含むベクターは、生物中のαカロテン量を増加させ、これにより生物の栄養価、薬理的および外観価値を変えるのに使用できる。好ましい実施態様での本発明ベクターは、第２真核カロテノイド酵素をコードするＤＮＡの上流に、真核ＩＰＰ異性化酵素をコードするＤＮＡを含む。本発明者らは、ＩＰＰ異性化酵素遺伝子の包含がカロテノイド経路に対する基質の供給を増加させ；これによりカロテノイド最終産物の生産が増進することを見いだした。この事は、この追加的ＩＰＰ異性化酵素遺伝子が欠失しているコロニーに比べると、上記ＩＰＰ異性化酵素遺伝子の一つを同時に含むE．coliのカロテノイド蓄積コロニーにおける著しく深い一層の着色からみて明らかである。同様に、ＩＰＰ異性化酵素遺伝子を含むベクターはジメチルアリルピロリン酸（イソプレノイド、ステロイド、カロテノイド等）の任意の第２代謝産物の生産をも増進させるのに使用できる。別法として、上記遺伝子の一つのアンチセンス鎖をベクター中に挿入できる。例えば、このεシクラーゼ遺伝子をベクター中に挿入して宿主のゲノムＤＮＡ中に組み込み、これによりε、βカロテノイド（ルテインおよびα−カロテン）の合成を阻害したり、β，βカロテノイド（ゼアキサンチンおよびβカロテン）の合成を増進することができる。本発明に適するベクターの例には、カロテノイド生合成または代謝に関与する酵素をコードする真核遺伝子が包含され、かつ宿主に適するプロモーターは当分野で周知の技法を用いて構築できる（例えばSambrookらの、Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989）。植物における真核発現に適するベクターはFreyらのPlant J．（1995）8(5): 693およびMisawaら1994a;に記載さわ、引用によりここに包含する。原核発現に適するベクターには、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１１９、およびｐＢＲ３２２（New England BioLabs，Bevery，MAから入手可）およびｐＴｒｅＨｉｓ（Invitrogen）およびｐＥＴ２８（Novagene）ならびにこれらの誘導体等が包含される。本発明ベクターは、プロモーター、リプレッサー、抗生物質抵抗性遺伝子等の選択性マーカー等、調節要素を追加的に含んでいてもよい。宿主本発明の宿主システムは、既にカロテノイドを生ずる任意の生物またはカロテノイドを生ずるように遺伝子的に修飾されている任意の生物を含むことができる。ＩＰＰ異性化酵素遺伝子は、前駆体としてのＤＭＡＰＰに依存するいずれの産物の生産をも増進するのに一層広範に適用される。既にカロテノイドを生産する生物には、植物、藻類、ある種酵母、黴類およびシアノバクテリアならびに他の光合成バクテリアが包含される。本発明のベクターを用いるこれら宿主の形質転換は、Misawaら，（1990）上記；Hundleら，（19 93）上記；Hundleら，（1991）上記;Misawaら，（1991）上記;Sandmannら，上記；およびScnurrら，上記;に記載されるような標準技法を用いて行うことができる。これらの内容を引用によりここに包含する。別法として、本発明ＤＮＡ配列を含むトランスジェニック生物を構築することもできる（Birdら，1991；Bramleyら，1992；Misawaら，1994a；Misawaら，1994 b；Cunninghamら，1993）。これらの配列を組み込むと、宿主中のカロテノイド生合成、含有量、または組成の制御が可能になる。本発明のカロテノイド遺伝子の過剰生産を許容する配列を組み込むように、これらのトランスジェニックシステムを構築することができる。本発明ＤＮＡ配列のアンチセンス発現を含むトランスジェニツクシステムもまた構築できる。このようなアンチセンス発現は、センス鎖によりコードされる酵素の基質の蓄積を生ずる結果になる。カロテノイド生合成に関与する酵素をコードする真核遺伝子の選別方法本発明方法は、真核または原核カロテノイド生合成遺伝子を含むＤＮＡを用いて原核生物宿主を形質転換し；上記形質転換した宿主を培養してコロニーを得て；かつ色が未形質転換宿主のコロニーと異なるコロニーを選別する；工程を包含する。適当な宿主には、E．coli、SynechococcusおよびSynechocystis等のシアノバクテリア、藻類および植物細胞が包含されるが、E．coliが好ましい。好ましい実施態様における上記”色相補性検定(color complementation test) ”は、（１）少なくとも一つのカロテノイド生合成遺伝子が不完全である (deficient)か、または（２）少なくとも一つのカロテノイド生合成遺伝子を過剰発現するかのいずれかの変異体を用いることにより増進され得る。いずれの場合でも、かかる変異体はカロテノイド前駆体を蓄積する。原核および真核生物ＤＮＡライブラリーはカロテノイド生合成、代謝および分解の遺伝子の存在を全体で選別できる。選別されるのに好ましい生物には光合成性生物が包含される。 E．coliは、Sambrook（1989）らにより記載された従来法、およびクローニングベクター供給者が記載したプロトコールに従って、これら真核ｃＤＡＮライブラリーを用いて形質転換できる。例えば、lambdaZAP（Stratagene）またはlambdaZIP0L0X(Gibco BRL)等のバクテリオフアージベクター中のｃＤＮＡライブラリーは、まとめて切除してE.coli の形質転換に使用でき、適当なベクター中に挿入して、これらのベクターをE．c oliの形質転換に使用できる。適当なベクターにはｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２（New Englnd BioLabs、Bevery，MAから入手できる）が包含されるが、ｐＡＣＹＣが好ましい。形質転換したE．coliは従来技術を採用して培養できる。培養ブロス(broth)には、プラスミドの選択および維持のための抗生物質を含有することが好ましい。適当な抗生物質には、ペニシリン、アンピシリン、クロラムフエニコール等が包含される。通常、培養は２０−４０℃、好ましくは室温（２０−２５℃）で１２時間から７日間実施される。培養物を塗布し、そのプレートを未形質転換宿主E．coliのコロニーより色相が異なったコロニーを視覚により選別する。例えば、プラスミドpＡＣ-BETA（後刻記載）で形質転換されたE．coliはβカロテンを蓄積した黄色コロニーを生ずる。ｃＤＮＡライブラリーで形質転換後、E．coli／pAC-BETAにより形成されるものとは異なった色相を含むコロニーは、βカロテンの構造または発現程度を修飾する酵素を含むことが予想される。リコペン、γカロテン等のカロテノイド生合成における初期産物を過剰発現する類似の標準物（standards）が工学的操作により作成する(engineered)ことができる。本発明を一般的に記載してきたが、ある種特定実施例を参照することにより一層の理解が得られるはずである。これら実施例は説明のみの目的でここに記載し、かつ特記しない限り発明の制限を意図したものではない。実施例Ｉ． β−カロテン水酸化酵素の単離プラスミド構築先ずErwinia herbicolaのカロテノイド生合成遺伝子を含む８．６kb ＢｇｌＩＩ断片をプラスミドベクタ−ｐＡＣＹＣ１８４（クロラムフエニコール抵抗性）のＢａｍＨＩ部位中にクローン化し、次いでβカロテン水酸化酵素（ＣｒｔＺ）を含む１．１kb ＢａｍＨＩ断片を削除した。生成プラスミドpＡＣ−ＢＥＴＡはβカロテン形成のための全ての遺伝子を含む。このプラスミドを含むE.coli株はβカロテンを蓄積し、黄色のコロニーを形成する（Curminghamら，1994）。先ずHaematococcus pluvialis（HP04）のＩＰＰ異性化酵素をコードする完全長遺伝子をＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩを用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋から切り出し、次いでｔｒｃプロモーター(Invitrogen Inc.)からの高レベル発現ｐＴｒｃＨｉｓＡベクター中にクローン化した。ＩＰＰ異性化酵素およびｔｒｃプロモーターを含む断片をＥｃｏＲＶ−Ｋｐｎｌを用いて切除し、ｐＡＣ−ＢＥＴＡのＨｉｎｄＩＩＩ部位中にクローン化した。この新規プラスミドｐＡＣ−ＢＥＴＡ−０４で形質転換したE．coli細胞はＬＢプレート上でオレンジ色（深黄色）コロニーを形成し、ｐＡＣ−ＢＥＴＡを含む細胞よりも一層β−カロテンを蓄積する。Arabidopsis ｃＤＮＡライブラリーの選別 Arabidopsisの幾つかのλｃＤＮＡ発現ライブラリーをArabidopsis Biologica l Resource Center(OhioStateUniversity，Columbus，OH）（kieberら，1993）から入手した。このλｃＤＮＡライブラリーをinvivoで Stratagene's ＥｘＡｓｓｉｓｔＳＯＬＲシステムを用いて切除し、各クローンもアンフイシリンを含むphagemid ｃＤＮＡライブラリーを生じさせた。選別および色素生産用宿主細胞としてE．coli株ＤＨ１０ＢＺＩＰを選択した。ＤＨ１０Ｂ細胞はプラスミドｐＡＣ−ＢＥＴＡ−０４で形質転換し、かつ５０ μｇ／ｍｌのクロラムフエニコール（United States Biochemical Corporation から）を含むＬＢ寒天プレート上にプレートした。次いでこのArabidopsis ｃＤＮＡライブラリーを、既にｐＡＣ−ＢＥＴＡ−０４を含むＤＨ１０Ｂ細胞中に導入した。ｐＡＣ−ＢＥＴＡ−０４およびArabidopsis ｃＤＮＡの両方を含む形質転換した細胞をクロラムフエニコール＋アンピシリン（１５０μｇ／ｍｌ）寒天プレート上で選択した。室温で５日間保温後に、最大の色展開が起こり、淡い黄色コロニーを選択した。選択コロニーをアンピシリンおよびクロラムフエニコール含有液状ＬＢ培地（３ｍｌ）中に接種し、培養物を保温した。次いで細胞をペレット化し、８０μｌの１００％アセトン中で微量遠心分離管中で抽出した。遠心分離後、着色上清をシリカゲル薄層クロマトグラフイー（ＴＬＣ）プレート上にスポットし、ヘキサン；エーテル（１：１）溶媒系を用いて展開した。 βカロテン水酸化酵素クローンはＴＬＣプレート上のゼアキサンチンの外観に準拠して同定した。サブクローニングおよび配列決定 βカロテン水酸化酵素ｃＤＮＡを標準手法（Sambrookら，1989）により単離した。制限地図によれば、三つの独立したインサート（１．９kb、０．９kbおよび０．８kb）がｃＤＮＡ中に存在することを示した。いずれのｃＤＮＡインサートがβカロテン水酸化酵素活性を与えるかを決めるために、プラスミドＤＮＡをＮｏｔＩ（ｃＤＮＡライブラリーのアダプター中の部位）を用いて消化し、三つのインサートをＳＫベクターのＮｏｔＩ部位中にサブクローン化した(subcloned) 。再度水酸化酵素活性を検定するために、これらのサブクローンを用いてｐＡＣ −ＢＥＴＡ−０４含有E．coli細胞を形質転換した。水酸化酵素遺伝子を含むことが後刻判明した０．９５kb断片も平滑末端とし、ｐＴｒｃＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃベクター中にクローン化した。Ｎ末端配列を除くために、バクテリア遺伝子を有する保存配列の直前に位置する制限部位（ＢｇｌＩＩ）を用いた。ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片はＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ消化ｔｒｃベクター中に方向付でクローン化した。機能性クローンは色相補検定により同定した。βカロテン水酸化酵素はｐＡＣ−ＢＥＴＡ−０４のみを含む細胞で見いだされるよりも一層淡い黄色のコロニーを生じる。 Arabidopsisβカロテン水酸化酵素が、自動シークエンサー（Applied Biosyst ems，Model 373A，Version 2.0.1S）を用いて両鎖につき完全に配列決定された。色素分析２５０ｍｌフラスコ中で、アンピシリンおよびクロラムフエニコールを含む５０ｍｌのＬＢを単一コロニーを用いて接種した。培養物を穏やかに震盪しながら２８℃で３６時間保温し、次いでＳＳ−３４ローター中５０００ｒｐｍで収集した。この細胞を蒸留水で一回洗浄し、水０．５ｍｌで再懸濁した。抽出操作およびＨＰＬＣは以前の記載と本質的には同じであった（Cumminghamら，1994）。ＩＩ．εシクラーゼの単離プラスミド構築プラスミドｐＡＣ−ＬＹＣ、ｐＡＣ−ＮＥＵＲおよびｐＡＣ−ＺＥＴＡの構築はCunninghamら（1994）による記載がある。簡単にいえば、Erwinia herbicola 、Rhodobacter capsulatus、およびSynechococcus sp．株ＰＣＣ７９４２からの適当なカロテノイド生合成遺伝子をプラスミドベクターｐＡＣＹＣ１８４（New Englnd BioLabs，Beverly，MA）中にクローン化した。プラスミドｐＡＣ−ＺＥＴＡ、ｐＡＣ−ＮＥＵＲ、およびｐＡＣ−ＬＹＣを含むE．coliの培養物はζカロテン、ノイロスポレン、およびリコペンそれぞれを蓄積する。このプラスミドｐＡＣ−ＺＥＴＡは次のように構築した：E.herbicola(GenBank M87280；Hundle ら，1991)のカロテノイド生合成遺伝子を含む８．６-kbＢｇＩＩＩ断片をプラスミドｐＰＬ３７６（Perryら，1986;Tuvesonら，1986）の部分消化後に取得し、ｐＡＣＹＣ１８４のＢａｍＨＩ部位にクローン化してプラスミドｐＡＣ−ＥＨＥＲを得た。隣接０．８−および１．１−ｋｂＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片（欠失Ｚ、Cunninghamら，1994）の削除および１．１kB ＳａｌＩ−ＳａｌＩ断片（欠失Ｘ）の削除は、E．herbicola β−カロテン水酸化酵素（ｃｒｔ遺伝子）およびゼアキサンチングルコシルトランスフエラーゼ（ｃｒｔＸ遺伝子）それぞれに対する大半のコード領域の除去に役立った。生成プラスミドｐＡＣ−ＢＥＴＡはゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（ｃｒｔＥ）、およびフイトエン合成酵素（ｃｒｔＢ）、フイトエン不飽和化酵素（ｃｒｔＩ）およびリコペンシクラーゼ（ｃｒｔＹ）に対する機能遺伝子を保持する。このプラスミドを含むE．coli細胞は黄色コロニーを形成し、βカロテンを蓄積する。A ．thalianaのε−およびβ−シクラーゼｃＤＮＡ両方を含むプラスミドは、ＰｖｕＩ−ＰｖｕＩＩ断片としてのクローンy2中でεシクラーゼを切除し、かつこの断片を既にβシクラーゼを含むプラスミド（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬからのｐＳＰＯＲＴ１）のＳｎａＢＩ部位に連結して構築した。生物および成長条件 E．coli株ＴＯＰ１０およびＴＯＰ１０Ｆ’（Invitrogen Corporation，San D iego，CAから入手）およびＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Stratagene）をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（Sambrookら，1989）中、３７℃で、プラットフオームシェカー上の暗所で２２５サイクル／分で成長させた。培地成分はDifco（酵母抽出物およびトリプトン）またはSigma（ＮａＣｌ）から入手した。プラスミドの選択と維持の目的でアンピシリン１５０μｇ／ｍｌおよび／またはクロラムフエニコール５０μｇ／ｍｌ（両方共United States Biochemical Corporationから）を適当なので使用した。A ．thaliana ｃＤＮＡライブラリーのマス切除および色相補選別 A．thaliana in lambda ZAPII（Kieberら，1993）のサイズ分画１−２kB ｃＤＮＡをArabiodopsis Biological Resource Center（The Ohio State Univer sity）(ストック番号：ＣＤ４−１４)から入手した。他のサイズ分画ライブラリーも得られた（ストック番号ＣＤ４−１３、ＣＤ４−１５、およびＣＤ４−１６）。各ライブラリーのアリコットを処理してｃＤＮＡのマス（mass）切除を生起させ、これによりクローニングベクター供給者（Stratsgene;E.coli株ＸＬ１− ＢｌｕｅおよびヘルパーフアージＲ４０８を使用）により提供された指示書に従ってphagemidライブラリーを生じさせた。切除phagemidの力価を決定し、かつこのphagemidをE．coli細胞と共に３７℃で１５分間保温することにより、このライブラリーをE．coli ＴＯＰ１０Ｆ’（この株はプラスミドｐＡＣ−ＬＹＣを含んでいた）のリコペン蓄積株中に導入した。細胞は、２％（ｗ／ｖ）マルトースおよび１０ｍＭＭｇＳＯ₄（最終濃度）を補充したＬＢ培地中、３０℃で一夜成長させ、Eppendorfミクロ遠心分離機（５４１４Ｃ）を用いて３に設定したミクロ遠心管１．５ｍｌ中で１０分間収集した。このペレットを１０ｍＭＭｇＳＯ₄中に再懸濁し，初期培養容量の１／２にした。形質転換体を坑生物質含有の大きな（１５０ｍｍ直径）ＬＢ寒天ペトリ皿上に拡げて、ｃＤＮＡクローン（アンピシリン）の選択およびｐＡＣ−ＬＹＣ（クロラムフエニコール）維持の準備をした。約１０，０００コロニー形成単位を各プレート上に拡げた。ペトリ皿を３７℃で１６時間保温し、次いで室温で２日から７日間保温して最高の色展開をさせた。照明３Ｘ拡大鏡および低パワーのステージ解剖顕微鏡を用いてピンク色のコロニーの背景中に観察される薄いピンク系黄色から深黄色コロニーを視覚で選別した。黄色またはピンク系黄色コロニー色は環化活性の推測的証拠として採用した。これらの黄色コロニーを滅菌爪楊枝で採取し、培養管中のＬＢ培地３ｍｌの接種に用い、３７℃で一夜、２２５サイクル／分で震盪ながら成長させた。ミクロ遠心管中で培養物を二つのアリコットに分割し、 Eppendorf 5415Cミクロ遠心機で５に設定した遠心分離により収集した。液を廃棄した後、一つのペレットを後刻のプラスミドＤＮＡの精製のために冷凍した。二番目のペレットにＥｔＯＨ１．５ｍｌを加え、回転混合によりペレットを再懸濁し、時々再混合して１５−３０分間暗所で抽出を進行させた。不溶性材料を最高速度で１０分間、ミクロ遠心機で遠心してペレット化した。上清液の吸収スペクトルをPerkin Elmer lambda six分光光度計を用いて３５０−５５０ｎｍから記録した。単離したクローンの分析黄色コロニーの八つはβカロテンを含み、対称前駆体リコペンから対称βカロテンの二つのβ末端基を形成するのに必要な両方の環化を単一遺伝子産物が触媒することを示している。黄色コロニーの一つはδ−カロテン、すなわち単一ε末端基を有するモノ環式カロテノイドのスペクトル特性を示す色素を含んでいた。 βシクラーゼとは異なって、このεシクラーゼは分子の他端で第２環化を行なえないようである。 εシクラーゼが二つの環式ε末端基（例えば、二環式εカロテン）を形成し得ないという観察は、βカロテン由来のカロテノイド対αカロテン由来のカロテノイド中への基質の流れを植物が調整し制御でき、およびまた二つのε末端基を有するカロテノイドの形成を植物が阻害できる機構を説明する。 εシクラーゼをコードするA．thaliana遺伝子が入手できることは、植物種および藻類種を方向付け操作してカロテノイド含有量および組成の修飾を可能にする。遺伝子欠失によるか、または挿入による不活性化によるか、または形成酵素の量的低減（アンチセンス技術等による）によるかのいずれかの遺伝子レベルでのεシクラーゼの不活性化を通じて、β−カロテンおよびそれに由来する他の色素の形成を増強できる。ビタミンＡはβ末端基を有するカロテノイドからのみ誘導されるが、βカロテン対αカロテンの生産の増進は作物植物の栄養価を増進できる。ε末端基を有するカロテノイドの低減は、穀物植物の色特性およびこれら植物の特定組織の修飾にも価値がある。これに代えて、αカロテン、またはα カロテン由来のルテイン等の色素の生産が所望される場合には、色特性、栄養価または他の理由のいずれの場合でも、εシクラーゼを過剰生産させたり、または特定組織内でこれを発現させることができる。作物の農学的価値がカロテノイド色素により提供される着色に関連する限りは、εシクラーゼ遺伝子の発現および／またはその酵素の生産を方向付け操作することは商業的に価値がある。 A．thaliana εシクラーゼ酵素の予測アミノ酸配列が決定された。 Arabidopsis thalianaのβおよびεシクラーゼ酵素のアミノ酸配列の比較（図１３）によると、それぞれの遺伝子（εシクラーゼｃＤＮＡ配列の場合は図４）のＤＮＡ配列により予見されるように、これら二つの酵素は配列類似性の多数の領域を有するが、同一性はアミノ酸レベルでは全体の僅か約３７％のみに過ぎない。ＤＮＡ塩基レベルでの配列の同一性の程度が僅かに約５０％であって十分に低いので、ＤＮＡゲルブロット実験でのプローブとしてβシクラーゼを用いたハイブリッド形成により、この遺伝子を検出するのはこれまで不可能であった。本発明を以上のように十分説明してきたので、当業者は、上述したような本発明の思想および範囲を逸脱することなくそれらに多くの変更および修飾を行なうことができることは明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 23/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ザイレン、サンアメリカ合衆国メリーランド州、ハイアッツビル、トゥーレーン、ドライブ、ナンバー22、3405

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２、４、１４、１５、１６または１８のアミノ酸配列を有する、単離された真核性酵素。２．配列番号：２のアミノ酸配列を有するεシクラーゼ酵素である、請求項１に記載の単離された真核性酵素。３．請求項２に記載の真核εシクラーゼをコードする遺伝子を含む、単離されたＤＮＡ配列。４．配列番号：１の核酸配列を有する、請求項３の単離されたＤＮＡ配列。５．請求項３のＤＮＡ配列を含む発現ベクター。６．受入番号９８００５の下に１９９６年３月４日付きでthe American Typ e Culture Collectionに寄託されたｐＡＴｅｐｓである，請求項５の発現ベクター。７．請求項５の発現ベクター含む宿主。８．請求項６の発現ベクター含む宿主。９．配列番号：１４、１５、１６または１８のアミノ酸配列を有するイソペンテニル異性化酵素（ＩＰＰ）である、請求項１の単離された真核酵素。１０．請求項９のＩＰＰ酵素をコードする遺伝子を含む、単離されたＤＮＡ配列。１１．配列番号：９、１０、１１または１２の核酸配列を有する、請求項１０の単離されたＤＮＡ配列。１２．請求項１０のＤＮＡ配列を含む発現ベクター。１３．受入番号：９８０００、９８００１、９８００２または９８００４の下に１９９６年３月４日付きでthe American Type Culture Collectionに寄託されたｐＨＰ０５、ｐＭＤＰ１、ｐＡＴＤＰ７、またはｐＨＰ０４である、請求項１１の発現ベクター。１４．請求項１２の発現ベクターを含む宿主。１５．配列番号：４のアミノ酸配列を有するβ−カロテン水酸化酵素である、請求項１の単離された真核酵素。１６．請求項１５のβ−カロテン水酸化酵素をコードする遺伝子を含む、単離されたＤＮＡ配列。１７．配列番号：３の核酸配列を有する、請求項１６の単離されたＤＮＡ配列。１８．請求項１６のＤＮＡ配列を含む発現ベクター。１９．受入番号：９８００３の下に１９９６年３月４日付きでthe American Type Culture Collectionに寄託されたｐＡＴＯＨＢである、請求項１８の発現ベクター。２０．請求項１８の発現ベクターを含む宿主。２１．請求項１９の発現ベクターを含む宿主。２２．原核生物宿主中に組み込まれた場合に、真核カロテノイド生合成酵素の発現を生ずるＤＮＡ配列であって、上記ＤＮＡ配列が、上記真核カロテノイド生合成酵素をコードする自然生起ＤＮＡ配列の切り詰め部分を含み、上記切り詰め部分が５’末端の少なくとも一つのコドンで上記自然配列マイナスを含むＤＮＡ配列。２３．上記真核カロテノイド生合成酵素がβ−カロテン水酸化酵素である、請求項２２のＤＮＡ配列。２４．５’ＡＴＧ開始コドンに融合した、配列番号：３のＢａｌＩＩ−３’ 末端エキソ断片である、請求項２３のＤＮＡ配列。２５．カロテノイドまたはカロテノイド前駆体を蓄積する原核宿主またはカロテノイド経路の酵素が不完全な原核宿主を工学的操作により作成する工程；真核カロテノイド生合成遺伝子を含むＤＮＡを用いて上記宿主を形質転換する工程；コロニーを得るために形質転換された上記宿主を培養する工程；および未形質転換宿主のコロニーとは異なった視覚外観を示すコロニーを選別する工程；の諸工程を含む、カロテノイド生合成、代謝または分解に関与する真核遺伝子の選別方法。２６．上記原核宿主がE．coliである，請求項２５の方法。２７．真核カロテノイド生合成遺伝子を含むＤＮＡを用いて宿主を形質転換する工程；上記宿主にとり十分な時間に亘り上記宿主を培養して上記カロテノイドを生成させる工程：および上記カロテノイドを宿主から収集する工程；の諸工程を含む、カロテノイド生産方法。２８．上記ＤＮＡがイソペンチルピロリン酸異性化酵素遺伝子をさらに含む、請求項２６の方法。２９．アンチセンスＤＮＡを用いて上記宿主を真核カロテノイド生合成遺伝子に形質転換する工程：および上記宿主を培養する工程；の諸工程を含む、宿主中のカロテノイド生合成の阻害方法。３０．イソペンチルピロリン酸異性化酵素遺伝子を含むＤＮＡを用いて宿主を形質転換する工程；上記第２代謝産物を生ずるに十分な時間に亙って上記宿主を培養する工程；および上記宿主から上記第２代謝産物を回収する工程の諸工程を含む、宿主によりイソペンチルピロリン酸（ＩＰＰ）の第２代謝産物の生産増加方法。３１．上記第２代謝産物がカロテノイドである，請求項３０の方法。３２．イソペンチルピロリン酸（ＩＰＰ）の第２代謝産物または第２代謝産物前駆体を蓄積する宿主を工学的操作により作成する工程；およびＩＰＰ異性化酵素遺伝子を含むＤＮＡを用いて上記宿主を形質転換する工程；および上記第２代謝産物または前駆体を蓄積するのに十分な時間に亙って上記宿主を培養する工程；および上記第２代謝産物または前駆体を選別する工程；を含む、第２代謝産物の選別方法。