JP2000507457A

JP2000507457A - 酵素センサ

Info

Publication number: JP2000507457A
Application number: JP10522060A
Authority: JP
Inventors: アール，トーマス; ビールナード，アラン・ミルトン
Original assignee: ラジオメーター・メディカル・アクティーゼルスカブ
Priority date: 1996-11-14
Filing date: 1997-11-07
Publication date: 2000-06-20
Also published as: ATE316147T1; DE69735127T2; US6051389A; DK0944731T3; EP0944731A1; EP0944731B1; WO1998021356A1; DE69735127D1

Abstract

(57)【要約】本発明は検査流体中の分析物の濃度もしくは活性を測定する酵素センサに関する。センサは、分析物がその基質となる固定酵素を含む少なくとも１つの酵素層を有している。固定酵素は、該酵素と少なくとも１つのマクロ分子との間に１個もしくはそれ以上の共役結合を、該酵素に対する競合インヒビタの存在下で任意に架橋剤を用いて形成することによって得られる。本発明はまた酵素センサに対する薄膜に関する。更に、本発明は、酵素センサの酵素活性を安定化するための方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】酵素センサ背景技術技術分野本発明は、初期比酵素活性が改良された、試験流体中の分析物の濃度もしくは活性を測定するための酵素センサと、酵素センサのための薄膜（メンブレン）とに関する。また、本発明は、一般的な酵素センサの酵素安定性（寿命）を改良する方法に関する。関連技術の簡単な説明酵素センサは、測定化学種（分析物）が検出前にセンサ中で酵素触媒反応を受けるセンサである。分析物と酵素（分析物が基質となる）との反応は、その濃度（理想的な条件下では）が、分析物の濃度と比例するか同一であるところの２次種を生成する。次いで、２次種の濃度はトランスデューサ、例えば電極等の手段によって検出される。酵素センサの酵素は、通常、試験流体に接触するのに適した薄膜中に含まれる。酵素はセンサの薄膜の１部としてまたはかかる薄膜の後部に配置することができる。別の手段としては、酵素を、例えば、電極の炭素ペースト層の１部としてセンサプロパー(sensor proper)中に導入することである。したがって、分析物は、センサの外部（例えば、薄膜もしくは炭素ペースト層）に拡散した後に酵素と接触し、酵素と分析物との間で反応を起こし、次に、得られた２次種がセンサの検出部、例えば電極にまで拡散する。薄膜を含む伝統的な酵素センサでは、薄膜は、一方では、分析物を試験流体から酵素に調節して拡散するのに適当な空隙率を有しているとともに、他方では、当該酵素には非透過性もしくは実質的には非透過性であって、酵素を試験流体中に漏れるのを避けるものでなければならない。この問題を克服する１つの方法としては、当該酵素をマクロ分子に固定化して、酵素/マクロ分子の物理的サイズと全般的に低溶解度によって多孔性薄膜を通って漏れるのを防止することである。現場で重合する薄膜にとってより適当になる可能な別の方法は、酵素を高分子中にトラップすることである。たとえば、体液中に存在する分析物の興味ある例としてはラクテート（乳酸塩）がある。ラクテートキシダーゼがウシ血清アルブミンに固定化されているラクテートセンサが知られている(Hu et al.，1993，Analytica Chimica Acta，281 ，pp 503-511;Tsuchida et al.，1985，Biotechnology and Bioengineering，27 ，pp 837-841;Pfeiffer et al.，1992，Biosensors & Bioelectronics，7，pp66 1-671;Baker et al.，1995，Anal．Chem.，67，pp 1536−1540;Liu et al.，199 5，Electrochemica Acta，40，pp 1845-1849)．ラクテートセンサの報告されている寿命は普通には１４日程度である(例えば、Winckers et al.，1996，Clinic al Chemistry，42，No．S6，p S278，poster No．761)。通常は、酵素、例えばラクテートキシダーゼが固定化されると、固定化酵素の初期比酵素活性は、対応する量の非固定酵素に比べて減少する。これは、酵素もしくは少なくともその１部（ドメイン）は、固定化反応の間にもしくはその反応の後に、その活性配座を保持しないこと、または、固定化反応が酵素の活性部位中にもしくはそのに非常に近接して位置する酵素の機能グループに関与していることに由来する。したがって、酵素の相当量が固定化反応中に不活性化されうる。センサ中に多量の不活性、部分不活性もしくは変性酵素が存在することは、このことが応答時間をより長くするので非常に望ましくないことである。競合インヒビタの存在下で固相物質にトリプシンを固定することが初期比酵素活性をほぼ完全に保持する結果になると報告されている(Kuga et al.，1976，Me m．Fac．Sci．Kyushu Univ．Ser．C，10，pp 77-90;CA:85:42969h)。トリプシンを水不溶解性担体に固定するときに重合性競合インヒビタを使用することも記載されている(Brown et al.，1981，Makromol．Chem.，182，pp 1605-1616)。これらの刊行物のいずれにも、酵素センサに固定トリプシンを使用することを示していない。そして、出願人の知っている限りでは、その他の刊行物のいずれにも、酵素センサに固定トリプシンを使用することは示されていない。したがって、固定酵素を酵素センサに応用する特別の条件と要件とは明白に示されていないし、示唆されてもいない。本発明の目的は、改善された初期比酵素活性を持つ酵素センサを提供することである。本発明の別の目的は、酵素センサの酵素活性を安定化して、酵素の寿命を延長するする方法を提供する。発明の要旨出願人は、競合インヒビタの存在下で固定した酵素が、活性酵素と不活性酵素との間の高い（初期）割合が望ましいかもしくは要求される酵素センサに特に適していることを見出した。したがって、本発明は、試験流体の分析物の濃度もしくは活性を測定する酵素センサを提供する。この態様において、該酵素センサは、分析物が基質として作用する固定酵素を含む少なくとも１つの酵素層を有し、かつ、該固定酵素が、当該酵素に対する競合インヒビタの存在下で酵素と少なくとも１つの形式のマクロ分子との間の１つもしくはそれ以上の共役結合を、任意に架橋化剤を使用して、形成している。競合酵素の存在下で酵素センサ中に固定した固定酵素を使用することは自明ではないと考えられる。当業者であれば、競合インヒビタが、センサの性質を後で測定することに対して負の影響を持つかも知れないと結論づけるであろう。酵素層は種々の方法でセンサに応用することができる。したがって、酵素層は、センサの薄膜の１部として含まれるかまたは薄膜の後部に配置することができる。別の形式として、酵素層は、センサの一体化した１部、例えば、電極の炭素ペースト層中に含ませることができる。好ましい態様では、酵素層はセンサに取り付ける薄膜に含まれる。また、本発明は、検査流体の分析物の濃度もしくは活性を測定する酵素センサのための薄膜を提供する。この態様において、該薄膜は、分析物が基質として作用する固定酵素を含む酵素層を有し、かつ、該固定酵素が、当該酵素に対する競合インヒビタの存在下で酵素と少なくとも１つの形式のマクロ分子との間の１つもしくはそれ以上の共役結合を、任意に架橋化剤を使用して、形成している。上記のように作成した酵素センサと薄膜とは、従来製造されているセンサと薄膜とに比べて、これまで超えることができなかった初期比酵素活性を有する酵素センサと薄膜とになるものと信じられている。更に、本発明は、検査流体の分析物の濃度もしくは活性を測定するための酵素センサを提供する。この態様において、該酵素センサは、分析物が基質として作用する固定酵素を含む酵素層を有し、かつ、該固定酵素の初期比酵素活性が、同一試験で決めた対応する量の非固定酵素の初期比酵素活性の少なくとも５０％である。酵素は、上記したようにセンサに適用することができる。更に、本発明は、検査流体の分析物の濃度もしくは活性を測定する酵素センサのための薄膜を提供する。この態様においては、該薄膜は、分析物が基質として作用する固定酵素を含む少なくとも１つの酵素層を有し、かつ、該固定酵素の初期比酵素活性が、同一試験で決めた対応する量の非固定酵素の初期比酵素活性の少なくとも５０％である。その上、これまで信じられていたこととは対照的に、酵素センサ中に競合インヒビタが存在していることが、固定化反応の間ばかりではなく、その後でも有利であることが判明した。本出願人は、酵素活性の安定性を増進し、それによってセンサの寿命を延長するためには、センサに含まれる固定酵素を競合インヒビタに曝すことが特に有利であることを見出した。したがって、本発明は、酵素センサに含まれる固定酵素の酵素活性の安定性を改善するための方法であって、該固定酵素を、該酵素に対する競合インヒビタを含む溶液に断続的にもしくは連続的に曝す工程を含む方法を提供する。改良された安定性は、酵素に対する競合インヒビタの存在下での酵素とマクロ分子との間に共役結合を形成することによって得られる固定酵素を有する酵素センサに対しても、また、競合インヒビタの不存在下で上記のようにして得られた固定酵素を有する酵素センサに対しても、更には、固定酵素を有するその他のあらゆる酵素センサに対しても同様に達成される。前記したように、本発明は、新規でかつ非常に価値ある酵素センサと、酵素センサのための薄膜とを提供する。酵素センサは、完全自動装置を用いて多量の検査流体の濃度（もしくは活性）を日常的に分析することが望まれる場合にその重要性が増している。生物試料を取り扱う完全自動分析装置の例としては、ＡＢＬ^TM システム６２５血液ガスシステム（ラジオメータ・メデイカルＡ／Ｓ、コペンハーゲン、デンマーク）が挙げられる。かかるシステムは、使用者側からすれば、操作時間が長くなり（”アップ”時間）かつサービス時間が非常に短くなるか、ほとんど掛からない（”ダウン”時間）ようにすることが期待される。したがって、かかる装置に使用する酵素センサは、長い寿命を有しているべきである。本発明は、酵素センサにとって長寿命の酵素層を提供する。酵素センサによって測定される分析物は、センサの薄膜中に含まれ得る酵素に対する基質である物質であればいずれでもよい。本発明に使用される特に興味のある分析物は、グルコース、コレステロール、ラクテート、クレアチン、クレアチニン、尿素、尿酸、ピルビン酸塩、アルコール類、ビリルビン、アスコルビン酸塩、リン酸塩類、タンパク、トリグリセライド、フェニルアラニン、チロシン、ヒポキサンチンなどである。本発明において特に関連のある分析物はラクテートである。測定するのに興味のあるその他の分析物は、グリコシル化アミノ酸、凝固因子、セプシスマーカーなどである。センサに対して関係する酵素を選択するには、分析物によって自然に指示される。また、酵素／分析物反応の反応生成物（２次種）の１つが、直接に検出できるか、または、反応後の検出可能な物質への変換後に検出しなければならないかのいずれかを考慮すべきである。好ましい２次種としては、従来の電極で検出可能な過酸化水素を挙げることができる。上記のことから、本発明において好ましい酵素としては、グルコース、コレステロール、ラクテート、クレアチン、クレアチニン、尿素、尿酸、ピルビン酸塩、アルコール類、ビリルビン、アスコルビン酸塩、リン酸塩類、タンパク、トリグリセライド、フェニルアラニン、チロシン、ヒポキサンチンなどから選択された分析物が基質として作用するものが挙げられる。特に興味のある酵素としては、α−ヒドロキシオキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．３．１５）、ラクテートオキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．３．２）、グルコースオキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．３．４）、ウレアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．５）、クレアチンアミドヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．２．１０）、クレアチンアミジノヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．３．３）、サルコシンオキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．５．３．１）、グルタメートデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．３）、ピルベートキナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．１．４０）、長鎖アルコールオキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．３．２０）、ラクテートデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２７）などが挙げられる。これらのうちで、ラクテートオキシダーゼが特に好ましい。分析物は、原則として、いかなる型式の検査流体に存在していてもよい。したがって、本発明においては、「検査流体」という用語は、濃度もしくは活性の測定が所望される分析物を含むあらゆる液体を意味する意図で使用されている。酵素センサ、特に薄膜のために選択された物質によっては、検査流体の性質が時には制限されることがある。好ましくは、検査流体として、水性検査流体、例えば、自然由来の試験液体が使用される。本発明において特に興味のある検査流体としては、動物やヒト、特にヒトの生物試料が挙げられる。かかる生物試料は、直接にまたは、酵素、検出器もしくは分析物と抵触するであろう物質を除去するために、種々の方法で希釈もしくは処理されるかのいずれかの方法で使用される。生物試料の例としては、全血、例えば、希釈もしくは未希釈全血、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿、唾液、乳などがある。この他の興味のある検査流体としては、例えば、透析液などが挙げられる。本発明においては、競合インヒビタを固定化反応に利用した後、安定化剤として利用する。酵素とマクロ分子との間に共役結合が形成するときには、競合インヒビタが存在すれば、共役結合形成反応において形成される酵素の活性部位（酵素作用が発現したときに酵素の基質が結合している部位）の化学機能性の危険性を除去したりもしくは減少して、共役結合を形成する反応が起こるものと、特定の原理に拘束されることなく信じられる。したがって、競合インヒビタが存在しない場合には、活性部位、例えば、リジンやアルギニンのそれぞれのアミノ基やグアニジノ基中の化学機能性が共役結合形成反応に関与していて、それによって酵素活性が減少したりもしくは除去されたりすると信じられる。特異的酵素に対する競合インヒビタは、該インヒビタが、酵素の活性部位に結合するかもしくは結合に極めて近似する状態になって、酵素に対する基質が直ちに活性部位を占拠することを妨害していることに特徴がある。しかしながら、基質の（当該酵素に対する）親和性と濃度とに対する、競合インヒビタの（当該酵素に対する）親和性と濃度に依存して、該インヒビタと基質との間で活性部位を占拠するための競争（つまり、競合）が起こっている。適当な競合インヒビタとしては、当該技術分野で既知の当該酵素に対する競合インヒビタであればいずれでもよい。また、本発明においては、「部分」競合インヒビタであっても、競合インヒビタとして考えられる。しかしながら、本発明において特に関係する競合インヒビタとしては、一方では、固定化反応中に当該酵素と効率的に結合し、他方では、固定酵素が酵素センサ中に含まれているときに、当該酵素に対する基質（分析物）によって入れ替えられるところの競合インヒビタであると考えられる。特に適当な競合インヒビタとしては、当該酵素に対する親和性（１／Ｋｉ）が、同一酵素に対する基質の親和性に比べて、約０．０００１倍ないし１０倍、例えば、０．００１倍ないし５倍であるところの競合インヒビタが挙げられる。本発明において最も興味のある酵素、つまり、ラクテートオキシダーゼに対する好ましい競合インヒビタは、オキサルアセテート、オキサレート（蓚酸塩）、 α−ヒドロキシスルホネート、ビスルファイト、フェニルアセテートなどが挙げられる。これらのうちで特に好ましいのはオキサレートである。酵素が酵素活性を示すのに必要ないかなるコエンザイムが固定化反応中に存在していて、（ｉ）酵素が活性な配座内に存在しているときに固定化反応が起こり、かつ、（ｉｉ）コエンザイムが結合する部位がマクロ分子に結合した共役結合によって閉塞されなければ、競合インヒビタの存在と類似することとして、理解される。本発明において、「マクロ分子」という用語は、酵素プロパーとなりうる高分子量分子として理解される。マクロ分子は、マクロ分子と当該酵素との間に共役結合を形成できる化学機能性を有しているべきである。マクロ分子は、天然由来であっても、合成由来（例えば、合成有機ポリマー）であってもよい。天然由来のマクロ分子としては、タンパク、例えば、アルブミンやアルブミン誘導体、例えば、血清アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミンやウシ血清アルブミン−システイニル）、コナルブミン（オボトランスフェリン）、オバルブミン（卵白アルブミン）、ラクタルブミン、穀物アルブミン、大豆アルブミンなどが挙げられる。合成由来のマクロ分子としては、例えば、重合性化合物、例えば、ポリオレフィンやその誘導体、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなど、ポリ（メタ）アクリレート、ポリエステル類、ポリエーテル類、ポリアルキレングリコール類、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコールなど、ポリアミド類、合成ポリペプチド類、デキストラン類、タンパクなどが挙げられる。関係する上記例のうち、特に好ましいマクロ分子としては、例えば、アルブミンやアルブミン誘導体、例えば、ウシ血清アルブミンやウシ血清アルブミン−システイニルなど、コナルブミン（オボトランスフェリン）、オバルブミン（卵白アルブミン）などが挙げられる。酵素の固定に特に関係するマクロ分子の重量平均分子量は、１０、０００以上であって、例えば、１０、０００ないし１、０００，０００、好ましくは１０、０００ないし２００、０００、より好ましくは２０、０００ないし１００、０００である。固定化反応（架橋反応）は、酵素とマクロ分子との間の直接反応か、架橋剤を使用するかのいずれかによって行うことができる。通常は、架橋剤が必要である。当業者に知られている架橋剤であればいずれも使用できるが、上記酵素にとって特に好ましい架橋剤としては、例えば、グルタールアルデヒド、ジビニルスルホン、塩化シアヌール酸、ジイソシアネート類、ポリイソシアネート類、ジイソチオシアネート類、ポリイソチオシアネート類が挙げられる。これらのうちで好ましいのは、グルタールアルデヒドである。架橋の程度は、一方では、固定酵素の滲出が避けられ、他方では、酵素の種々のドメインの流動性が維持される（そうでなければ酵素活性が阻害されるであろう）ようにすべきである。固定酵素が酵素センサの外層中、例えば、拡散制限層中に拡散することができないもしくは実質的にできないと同時に、水性媒体中、例えば、緩衝液中に溶解できるかもしくは拡散できるためには、酵素／マクロ分子共役物（固定酵素）の重量平均分子量は、少なくとも１００、０００であって、好ましくは１００、０００から５，０００、０００までの範囲、より好ましくは２００，０００から４、０００，０００の範囲であるのがよいと考えられる。これによって、マクロ分子中への含有前に取り扱いが可能になる。固定酵素は以下のように調製するのが好ましい。つまり、（ａ）酵素と、少なくとも１種のマクロ分子と、該酵素に対する競合インヒビタとを含む溶液を調製し、（ｂ）架橋剤を上記溶液に添加する。更に、（ｃ）残存架橋剤を不活性化させ、反応を効果的に終了させるために、急冷（クエンチング）剤を所望の反応時間経過後に添加してもよい。急冷剤とは、架橋剤もしくは該架橋剤から誘導されたあらゆる中間体と反応する試薬を意味する。該酵素と、マクロ分子と、該酵素に対する競合インヒビタとを含む溶液を完全に混合すれば、溶解競合インヒビタと、酵素結合競合インヒビタとの間に平衡が達成されると考えられる。架橋反応は、架橋反応の間に酵素が変性しないように、０〜４０℃、好ましくは１０〜３０℃の温度範囲で行うべきである。架橋反応は常温で行うのが好ましい。反応媒体については、有機媒体のうちの水性媒体が好ましいと考えられる。水性媒体としては、ｐＨ値が５．０〜９．０、好ましくは６．０〜８．０に調整された緩衝液が好ましく、特にリン酸緩衝液が好ましい。本発明の１つの具体例では、酵素センサに対する固定ラクテートオキシダーゼは、４−７重量部、例えば５−６重量部のラクテートオキシダーゼと、８−１２重量部、例えば９−１１重量部のウシ血清アルブミン−システイニルと、１．５ −３．５重量部、例えば２−３重量部の架橋剤とから、１２−１５重量部、例えば１３−１４重量部の蓚酸ナトリウムを用いて調製される（実施例１）。固定酵素をセンサ中にまたはセンサの薄膜中に包含する前に保存する場合には、酵素に対する競合インヒビタを添加することが有利になる場合もあると理解すべきである。酵素センサの酵素は普通検査流体に接触させるのに適した薄膜に包含させる。本発明による薄膜は、薄膜の１部として包含されるかまたはかかる薄膜の後部に位置する酵素層を含む薄膜であるのが好ましい。かかる薄膜は種々の目的のために、例えば、検査流体中の潜在的な有害物質からの保護の提供、薄膜中における酵素の保持の確保、ならびにセンサに対して十分な直線性を得るための測定分析物に対する最適拡散制限条件の提供などの目的に役立っている。したがって、本発明に係る薄膜は、酵素層と検査流体とを分離するのに適合する拡散制限層を含むのが好ましい。拡散制限層は多孔薄膜層であって、分析物の酵素層への拡散を制限して、固定酵素の分析物変換能力がその限度を超えないようにし、かつ、分析物の酵素変換のために十分な酸素（Ｏ₂）が酵素層中に存在するようにしている。拡散制限層の原理についてはデンマーク特許第１７０１０３号に記載されている。拡散制限層は、センサに通常使用されている型式の薄膜から構成されていてもよい。これらは、溶液／拡散型薄膜（例えば、ハイドロゲルなど）、トラッキング腐蝕（track etch）薄膜（直線の孔（ポア）を有する）、複合薄膜、曲路（to rtuous path）薄膜などが挙げられる。拡散制限層のための物質としては、当該技術分野で公知のセンサ用薄膜物質であればいずれであってもよい。かかる物質の例としては、ポリオレフィンやその誘導体、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなど、ポリ（メタ）アクリレート、ポリエステル類、ポリエーテル類、ポリアルキレングリコール類、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコールなど、ポリアミド類、シリコーン類、再生セルロースなどが挙げられる。これらのうちでポリエチレンテレフタレートなどが特に適している。その他のポリマー、例えば、ポリカーボネートや、ポリウレタンなども同様に使用される。好ましい具体例としては、拡散制限層は貫通孔を有していて、該貫通孔が、分析物に対しては透過性であるのに対して、固定酵素に対しては非透過性もしくは実質的に非透過性であって、該孔の少なくとも１部が、当然のこととして、検査流体に対面するように適合させた該拡散制限層の表面から、酵素層に対面するように適合させた該拡散制限層の表面にまで延伸するように構成されている。拡散制限層の貫通孔には壁があり、その壁の表面は、検査流体に対面するように適合している表面と一緒になって、拡散制限層の接触表面、つまり、検査流体に接触可能な表面を規定する。拡散制限層の接触表面は、親水性であって、例えば血液タンパクが表面に付着しないようになるのが好ましい。したがって、拡散制限層の接触表面は、それ自体が十分な親水性でない場合には、その少なくとも１部が親水成分で誘導されている誘導化学基を有していてもよく、それによって接触表面が対応する非誘導表面に比べてより親水性になる。誘導化学基は、薄膜層物質の自然の形で存在していてもよく、薄膜層物質を処理した後もしくは薄膜を照射した後に化学薬剤で処理して発生させてもよい。親水性成分は、酵素センサに適用される通常の洗浄すすぎ条件下で変質しないように選択すべきである。したがって、かかる親水性成分としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリアルキレングリコール類、ヘパリン、ヒアルロン酸、ホスホリピッド、アガロース、キトサン、シクロデキストリン、アルギン酸塩、コラーゲン、リグニン、ペクチン、ならびにデキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースアセテート類、アルブミン、ゼラチン、寒天、カラゲナン類、デンプンなどのポリサッカライド類やセルロースベースポリマーなどが適している。また、親水性合成有機ポリマー、例えば、ポリビニルアルコール／ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシメチル（メタ）アクリレートやヒドロキシエチル（メタ）アクリレートなどのヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルアルコール、アクリルポリマー（ハイドロゲル類）なども使用できる。これらの親水性成分のうち、ポリエチレングリコールとヘパリンとが特に好ましい。更に、ポリエチレングリコールで、平均重量分子量が約１００ないし約２０００，例えば約２００ないし約１０００の範囲にあるものが特に親水性成分として好ましい。実用的な理由から、薄膜層の全表面と孔（ポア）とは、例えば、酵素層に対面するように適合させた薄膜層の表面もまた、しばしば修飾されると理解すべきである。本発明にかかる薄膜には、酵素／分析物反応の生成物に対して透過性であり、分析物と固定酵素とに対しては非透過性かもしくは実質的に非透過性である干渉除去層が更に具備されていてもよい。干渉除去層は、検査流体中に存在しうる他の化学成分に対しても非透過性であるのが好ましい。例えばＨＥＰＥＳ、アスコルビン酸、パラセタモールに対しては非透過性であって、例えば過酸化水素（Ｈ₂ Ｏ₂）に対しては透過性である非常に適した材質としては、例えばセルロースアセテート類がある。したがって、本発明の１つの具体例として、薄膜は次のように構成されていてもよい。つまり、薄膜は、（ａ）拡散制限層として、ポリエチレンテレフタレートからなり、拡散制限層の接触表面にはカルボキシル基があり、そのカルボキシル基の少なくとも１部が共役的に結合しているポリエチレングリコール（平均重量分子量が１００〜１０００の範囲にある）によって誘導されているものと、（ｂ）固定ラクテートオキシダーゼを含む酵素層と、（ｃ）セルロースアセテート類を含む干渉制限層とから構成されている。個々の薄膜層は、一致する小片に切断して、例えば薄膜リングの形に組み合わせる。薄膜は、１０〜５０μｍの範囲、好ましくは１０〜３０μｍの範囲の厚みを持つことが好ましい。拡散制限多孔薄膜層は５〜２０μｍの範囲の厚み、酵素層は１〜３μｍの範囲、干渉制限層は５〜１０μｍの範囲の厚みを持つことが好ましい。本発明に係るセンサは、１つもしくは複数の検出法則、例えば電気化学的もしくは光学的法則に基づくのがよい。したがって、センサの検出部面は、例えば電極もしくは光学検出器の１部であってもよい。センサの検出部は電極の１部であるのが好ましい。電極は、例えば炭素ペースト、プラチナ、金、イリジウム、ロジウム、パラジウムもしくはそれらの合金やペーストのアノードと、例えば銀／塩化銀、銀／酸化銀もしくは水銀／塩化水銀（Ｉ）の標準電極とから構成されていてよい。電極はあらゆる電解質溶液から更になっていてもよい。電極は、プラチナアノードと銀／塩化銀の標準電極とから構成するのが好ましい。上記したように、本発明は、初期比酵素活性が改善されたところの、酵素センサと、酵素センサのための薄膜とを提供する。したがって、本発明の１つの具体例においては、酵素センサに対する薄膜に含まれる固定酵素の初期比酵素活性は、対応する量の非固定酵素の初期比酵素活性の少なくとも５０％である。好ましくはまた現実的には、その初期比酵素活性は、対応する量の非固定酵素の初期比酵素活性に比較して、少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、特に少なくとも８０％、更には少なくとも９０％である。実施例４においては、固定ラクテートオキシダーゼの初期比酵素活性は７８％（表１）である。したがって、実施例４で調製された固定ラクテートオキシダーゼは、酵素センサの薄膜に導入されると、本発明の好ましい具体例を構成する。本発明の別の具体例においては、固定酵素の初期比酵素活性は、酵素に対する競合インヒビタの不存在下にて適用可能ならば同種の架橋剤を使用して固定させた対応する量の酵素の初期比酵素活性に比べて、少なくとも１．５倍である。実施例４においては、固定ラクテートオキシダーゼはこの範疇を達成していることが分かる（表１参照）。上記から明らかなように、本発明は、従来超えられなかった長寿命を有するように構成することができるところの、酵素センサと、酵素センサのための薄膜とを提供する。したがって、特定量の（非固定）酵素を上記固定化反応において使用するときに、該初期比酵素活性は従来の条件を適用する場合よりもより高くなり、その結果、センサが使用できなくなるレベルに酵素活性が達する以前の期間を延ばすことができる。新規な長寿命酵素センサの他に、本出願人は、酵素に対する競合インヒビタを含む媒体中に酵素を保存することが酵素活性の安定性を改良する（実施例５）ことを見出した。したがって、上記したように、本発明は、酵素の基質である検査流体中の分析物の濃度を測定するための酵素センサに含まれた固定酵素の酵素活性の安定性を改良する方法であって、固定酵素を該酵素に対する競合インヒビタを含む溶液に曝す工程を含む方法を提供する。上記定義ならびに好ましい具体例は、本方法のセンサと、酵素と、競合インヒビタとについて適用される。したがって、固定酵素は、酵素センサの一体化部分として包含されているかまたは酵素センサの薄膜中に包含されていてもよい。本方法は、酵素センサのための交換薄膜がセンサに取り付ける前に保存されなければならない場合にも同様に適用できる。したがって、本発明はまた、酵素センサの薄膜中に包含される固定酵素の酵素活性の安定性を改善する方法を提供する。本方法が別個に使用するかもしくは完全自動装置に組み込んで使用する酵素センサに対して実施される場合の非常に興味ある具体例においては、固定酵素を含む酵素層は、分析物の各測定もしくは実質的な各測定の間に、または、分析物の測定の各シリーズもしくは実質的な各シリーズの間に該酵素に対する競合インヒビタを含む溶液に曝される。したがって、センサのためのすすぎ工程を最適化するため、また酵素層を競合インヒビタに曝す工程が別個の操作工程になることを避けるために、競合インヒビタは該センサのすすぎ用流体に含まれていてもよい。すすぎ用流体中に含まれる競合インヒビタの濃度は、当該酵素が競合インヒビタを含むすすぎ用流体中に特定濃度で永続的に保存される場合には、酵素活性のｔ_1/2の増加が少なくとも５０％、例えば少なくとも１００％、特に少なくとも２００％になるように設定するのが好ましい。関連する競合インヒビタであって、酵素組成物、特に固定酵素組成物を効率的に安定化する能力を有し、かつ、酵素に対する基質の（同時）存在下で酵素反応を発生させるところの競合インヒビタとは、関連する基質の結合親和力と等しいかもしくは僅かに低い、酵素の活性部位に対する結合親和力を有している競合インヒビタである。特に興味ある具体例においては、本方法は、生物試料中のラクテート（乳酸塩）を測定するための酵素センサに包含されるラクテートオキシダーゼに対して実施される。この酵素活性を安定化させる非常に高い価値のある法則はセンサ一般に利用することができる。したがって、更に、本発明は、該酵素に対する競合インヒビタを含む溶液の酵素センサに包含される固定酵素に対する安定化剤としての用途に関する。かかる溶液はセンサに対するすすぎ用もしくは洗浄用流体であってもよい。しかしながら、競合インヒビタを含む溶液は非固定酵素もしくは上記した以外の方法で固定化した酵素の安定性のためにも使用できることにも注目すべきである。上記した酵素センサならびに薄膜は、検査流体中の１種もしくはそれ以上の分析物の濃度もしくは活性を測定するための完全自動装置に使用するために特に適している。かかる市販されている完全自動装置においては、僅かな再構築の努力によってまたは酵素センサに対するすすぎ用流体の入れ替えによってでさえ、本発明の本方法を利用することができる。したがって、本発明はまた、検査流体中の１種もしくはそれ以上の分析物の濃度もしくは活性を測定するための装置であって、少なくとも１種の分析物が基質として作用する固定酵素層を有する酵素センサと、更に、該装置の操作に必要な溶液を入れた１つもしくはそれ以上の容器と、酵素に対する競合インヒビタを含む少なくとも１つの溶液と、該センサを該競合インヒビタを含む該溶液に断続的に露出させる手段と、を含む装置を提供する。図面の簡単な説明図１は電極と薄膜とを含む酵素センサ１を示す図である。図２は図１の薄膜の薄膜部分の詳細図である。図３は本発明に係る装置の１具体例を示す説明図である。発明の詳細な説明図１はラクテートを測定する酵素センサ１を示す。ラクテートと酸素との間の酵素触媒反応は過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）とピルビン酸塩とを発生する。過酸化水素は次いでアンペロメトリック(amperometric)電極によって検出される。センサ１は、生物試料中の分析物濃度を測定する装置（例えばＡＢＬ^TMシステム６２５血液ガスシステム（ラジオメータ・メデイカルＡ／Ｓ、コペンハーゲン、デンマーク）に取り付けるのに適している。基本的には、センサ１は、その上に薄膜リング３を結合させた電極２から構成されている。電極２は、銀アノード接触体７にミクロプラグ６を介して結合された、プラチナ線５に結合したプラチナアノード４から構成されている。プラチナアノード４とプラチナ線５の下部とはガラス体８中に封入されている。ガラス体８とミクロプラグ６との間で、プラチナ線５は熱収縮チューブによって保護される。チューブ状銀標準電極１０は、ガラス体８の上部を取り囲み、電極２の長さ方向に銀アノード接触体７にまで延伸し、標準電極１０の内部で固定体１１とエポキシ１２を用いて固定されている。ガラス体８の下部は、薄膜リング３が結合している電極ベース１３によって覆われている。標準電極１０の上部は、分析装置（図示せず）の対応するプラグに電極２を取り付けるための、また、外被１５を固定するためのプラグ部４によって覆われる。ガスケット１６，１７は、電極２の測定表面に位置する電解液が蒸発しないようにするために、電極２と外被１５との間に配置される。外被１５の１端に取り付ける薄膜リング３はリング２０からなる。薄膜２１はリング２０の下部開口全域に亘って延伸される。薄膜２１は図２に詳細に図示されている。図２は、３層、つまり、電極２のプラチナアノード４に面する干渉制限薄膜層２２と、酵素層２３と、検査流体に面する拡散制限多孔薄膜層２４とを含む薄膜２１を示す。干渉制限薄膜層２２は、セルロースアセテート（ＣＡ）の、ポア径が６±２μｍである多孔性薄膜であってもよい。酵素層２３は通常架橋ラクテートオキシダーゼ（薄膜当たり７単位）の約１〜２μｍ厚の層であってもよい。拡散制限多孔薄膜層２４はポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴＰ）（ポア直径：約０．１μｍ；ポア密度：８・１０⁵ポア／ｃｍ²）の約１０μｍ厚の層であってもよい。図３は本発明にかかる装置３０の１具体例を説明する図である。装置３０は、検査流体中の異なる分析物の濃度もしくは活性を測定するための複数のセンサ１、３１〜３６を備えている。センサは、標準電極３１と、例えばｐＨ、ｐＯ₂、ｐＯ₂などを測定するセンサ３２〜３６と、図１、図２に関連した上記センサに類似するラクテート測定用酵素センサ１とを含む。センサ１，３１〜３６は、点線３８で示す測定部分に配置される。装置３０は、検査流体を装置３０内に導入する流入口４０と、装置３０のために必要な溶液を入れた複数個の容器５０〜５４とを有する。したがって、容器５０は標準電極３１に対する塩−ブリッジ溶液からなり、容器５１と５３とはセンサ１、３２〜３６に対する異なる計数用溶液ならなり、容器５２はセンサ１、３１〜３６に対する洗浄用溶液からなり、容器５４はセンサ３２〜３６に対するすすぎ用溶液を含む。容器５４のすすぎ用溶液はラクテート酵素センサ１内のラクテートオキシダーゼ酵素に対する競合インヒビタである前述の蓚酸塩（オキサレート）を含む。装置３０は更に排出用容器５５と空気流入口５６、５７とを更に具備する。流体導路システム（図示せず）は、流入口４０と、容器５０〜５５と、空気流入口５６，５７とをセンサ１，３１〜３６に結合する。該流入口からの検査流体と、異なる容器５０〜５４からの溶液と、必要に応じての空気流入口５６，５７からの空気とは、ポンプ６１，６２と、装置３０のソフトウエア手段（図示せず）で制御する主バルブ６３とによって流体導路システムに移動させることができる。検査流体が流入口に導入されると、ポンプ６１，６２と、主バルブ６３とが起動し、検査流体を測定部２８に移動し、検査流体を分析する。次いで、検査流体は排出用容器５５に移される。更に、ポンプ６１，６３と主バルブを起動して、容器５４から流体導路システムを介して測定部２８のセンサ１，３１〜３６にすすぎ用流体を移し、次に排出用容器５５に移してすすぎ操作を行う。このすすぎ操作中に、ラクテート酵素センサ１はすすぎ用流体に含まれる蓚酸塩に曝される。したがって、すすぎ操作が各測定の間に装置３０に対して行われる度に、装置３０に含まれるラクテート酵素センサ１は競合インヒビタの蓚酸塩にしばしば露出される。試験仕様酵素活性試験ラクテートオキシダーゼ熱量アッセイラクテートオキシダーゼ（ＬＯＤ）は次の反応を触媒する。Ｌ−ラクテート＋１／２Ｏ₂＋Ｈ₂Ｏ → ピルベート＋Ｈ₂Ｏ₂ 過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）の形成は、キノニミン色素が形成するパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）アッセイシステムで決められる。形成したキノニミン色素の量は分光光度法によって４９０ｎｍで決められる。パーオキシダーゼは次の反応を触媒する。Ｈ₂Ｏ₂＋４−ヒドロキシベンゼンスルホン酸＋４−アミノアンチピリン → キノニミン（λｍａｘ：５０５ｎｍ）試験手順試薬Ａ２ｍｌ３，３−ジメチルグルタール酸／ＮａＯＨ（５０ｍＭ）バッファーｐＨ６．５１ｍｌパーオキシダーゼ（５０Ｕ／ｍｌ；３．２５ｍｇ／１０ｍｌＨ₂Ｏ）１ｍｌ４−アミノアンチピリン（１５ｍＭ／Ｈ₂Ｏ）１ｍｌＤＬ−ラクテート（０．５Ｍ，ＮａＯＨでｐＨ６．５に調節）３ｍｌＨ₂Ｏ２ｍｌ０．２％ｖ／ｖ４−ヒドロキシベンゼンスルホン酸水溶液酵素溶液（試験用酵素組成物）１０ｍｌ（固定ラクテートオキシダーゼ（試験溶液、約０．０４Ｕ／ｍｌ（５ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄／ＮａＯＨバッファー、ｐＨ７．０）標準酵素溶液１０ｍｌラクテートオキシダーゼ（ペデイオコッカスPediococcus）０．０４Ｕ／ｍｌ（５ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄／ＮａＯＨバッファー、ｐＨ７．０）試薬Ａ１００μｌをマイクロタイタープレート（イムノプレート、ヌンク、ロスキルデ、デンマーク）のウエルに添加する。着色反応が酵素溶液１００μｌを添加することによって開始する。その直後に、マイクロタイタープレートを、３７℃、カイネチックモード、ラグタイム５分、読み出し時間１５分、自動撹拌に予め設定したＴＨＥＲＭＯｍａｘインキュベータ（モレキュラー・デバイス、メンロパーク、ＣＡ、アメリカ）のプレートホルダーに設置する。初期比酵素活性に対する標準値を得るために、標準酵素溶液１００μｌを、上記において、酵素溶液の代わりにウエルに添加する。他の酵素も、当該酵素が過酸化水素を生成する場合には同じ試薬を用いて、または、酵素／基質反応の生成物に対する感受性のある他の試薬を用いて、同様の方法で試験できる。酵素安定性試験ラクテートオキシダーゼまたは別の酵素の酵素活性は指数関数的に減少する。したがって、酵素活性に対する半減期（ｔ_1/2）は初期濃度には依存していないので、半減期は種々の条件下での酵素の安定性に対する優れた表示である。酵素活性は、酵素組成物に対して、上記酵素活性試験について記載したように、所定の期間に少なくとも４回、例えば少なくとも４日間に毎日（０日から３日まで）測定して決められる。次いで、半減期（ｔ_1/2）は標準数学的方法に従って計算される。実施例実施例１固定ラクテートオキシダーゼの製造ラクテートオキシダーゼ２７２０単位とウシ血清アルブミン−システイニル４０．０ｍｇとを１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４００μlと蓚酸ジナトリウム１．６０ｍｌとに溶解し、得られた混合物を１分間当たり２００回振動させて１０分間混合した。これに２．５％（ｖ／ｖ水溶液）グルタルアルデヒド４００μｌを添加し、得られた混合物を１０分間撹拌した。混合物を１Ｍグリシン１００μｌで急冷した。固定ラクテートオキシダーゼをウルトラフィルターでろ過し、容量を４００μ ｌにした。次いで、４０％シュークロースを含む１０ｍＭイミダゾールバッファー（ｐＨ７．０）４００μlを添加した。固定ラクテートオキシダーゼの最終濃度は約３４００Ｕ／ｍｌであった。実施例２修飾ＰＥＴＰ薄膜層の製造材料：マイラーＡポリエチレンテレフタレートホイル（ホワットマンＳＡ、ルヴァン・ラーヌーブ、ベルギー）（厚み：１０μｍ±１μｍ；ポア直径：約０．１μｍ；ポア密度：８・１０⁵ポア／ｃｍ²）１０ｇＰＥＧ−２００−（ＯＨ）₂（２つのヒドロキシ基を持つポリエチレングリコール；平均重量分子量：２００ｇ／モル；テトラエチレングリコールの最低含量：２０％：トリー、テトラー、ペンタエチレングリコールの最低含量：６０％）２ｇＣＭＣ−ＭＴＳ（１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホネート、９５％）カップリング剤として。０．２ｇトリトンＣＦ−５４４０００ｍｌ脱ミネラル化水（ｐＨ６．０−６．５）ＰＥＴＰ材料をシート状に切断し、各シートを枠に固定した。枠をＰＥＧ−２００−（ＯＨ）₂とＣＭＣ−ＭＴＳと、トリトンＣＦ−５４と水とを含む反応混合物中に１８時間吊して置いた。次いで、シートを１５分間撹拌しながら０．１％トリトンＸ−１００の脱ミネラル化水溶液で洗浄した。その後、それぞれ１０分間脱ミネラル化水で２度洗浄した。最後にシートをフード内で少なくとも１６時間乾燥した。全ての操作は室温で行った。薄膜層の表面上のＰＥＧ−２００の鎖は、該表面を極性にしかつ不反応性にするハイドロゲルとして機能する。したがって、例えば血液プロテインが表面に付着する能力が減少するか除去される。実施例３薄膜の製造例えばアメリカ特許第３９７９２７４号に記載されているような既知のセルロースアセテート薄膜を調製した。固定ラクテートオキシダーゼ（実施例１）を含む溶液２．０μｌをセルロースアセテート薄膜層に分散させた。表面を修飾したＰＥＴＰ薄膜層をセルロースアセテート／酵素層の全面上に配置し、サンドイッチ状の薄膜を乾燥した。次いで、薄膜を酵素センサの薄膜リングに組み込んだ。実施例４蓚酸塩の架橋反応に対する効果３種類の溶液Ａ，Ｂ，Ｃを次のようにして調製した。基本溶液ラクテートオキシダーゼ２０ｍｇ（６８０単位）とウシ血清アルブミン−システイニル１０ｍｇを１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）１００μｌに５分間撹拌しながら溶解した。本溶液２５μｌを各溶液Ａ，Ｂ，Ｃに用いた。酵素溶液Ａ２５０ｍＭ蓚酸ジナトリウム１００μｌを基本溶液に添加して５分間撹拌した。２．５％（ｖ／ｖ水溶液）グルタルアルデヒド２５μｌを添加して、撹拌を１０分間続けた後、１Ｍグリシン６．２５μｌを添加して酵素溶液Ａを調製した。酵素溶液Ｂ（競合インヒビタ未含有）蒸留水１００μｌを基本溶液に添加して５分間撹拌した。２．５％（ｖ／ｖ水溶液）グルタルアルデヒド２５μｌを添加して、撹拌を１０分間続けた後、１Ｍグリシン６．２５μｌを添加して酵素溶液Ｂを調製した。酵素溶液Ｃ（架橋剤なし）２５０ｍＭ蓚酸ジナトリウム１００μｌを基本溶液に添加して５分間撹拌した。蒸留水２５μｌを添加して、撹拌を１０分間続けた後、１Ｍグリシン６．２５ μｌを添加して酵素溶液Ｃを調製した。各溶液を１０ｍＭイミダゾールバッファー（ｐＨ７．０）で０．０４Ｕ／ｍｌに希釈した。酵素組成物の安定性は、本書に記載する安定性試験によって決められた。酵素溶液ＡとＢの初期比酵素活性を標準酵素溶液（酵素溶液Ｃ）の初期比酵素活性と比較した。その結果を下表１に示す。表１の結果から、蓚酸塩の存在下でのラクテートオキシダーゼの架橋後の初期比酵素活性は、標準の非固定酵素の初期比酵素活性に比べて７８％であることが分かる。蓚酸塩の不存在下での架橋はわずか３７％の初期比酵素活性であった。実施例５ラクテートオキシダーゼに対する安定化剤としての蓚酸塩蓚酸塩はラクテートオキシダーゼに対する競合インヒビタである。蓚酸塩は酵素の活性部位におそらく結合している。したがって、蓚酸塩は、蓚酸塩が存在しているときには、酵素がその活性配座に”封鎖”されているようにラクテートオキシダーゼの酵素活性を安定化しているものと考えられる。０．０４Ｕ／ｍｌラクテートオキシダーゼをＳ４９３２すすぎ用溶液（ラジオメータ・メデイカルＡ／Ｓ、コペンハーゲン、デンマーク）に溶解した溶液を調製した。蓚酸塩の濃度、つまり、１，２，４，８，１６ｍＭのそれぞれの濃度に対応した蓚酸ジナトリウムを添加した。各溶液の酵素活性は、１３日間に亘って５回測定して決めた。これらの溶液の酵素活性は蓚酸塩を含有しない溶液の酵素活性と比較した。その結果を下表２に示す。表２は、分光光度測定（ＯＤ：光学密度）とｔ_1/2計算値とから得られた結果を示す。溶液に対するｔ_1/2値は、蓚酸塩の存在が安定性ｎに対して著しく積極的な効果を有することを明確に示している。例えば１６ｍＭと濃度が最も高くなると、ｔ_1/2値で示される安定性は３倍になる。したがって、それより僅かに低い初期比酵素活性は８〜９日後に完全に補償される。

【手続補正書】【提出日】１９９９年６月９日（１９９９．６．９）【補正内容】請求の範囲１．検査流体の分析物の濃度もしくは活性を測定するための酵素センサであって、該酵素センサが、該分析物が基質となる固定酵素を含む少なくとも１つの酵素層を有し、該固定酵素が、該酵素と少なくとも１つの形のマクロ分子との間に１個もしくはそれ以上の共役結合を、該酵素に対する競合インヒビタの存在下で架橋剤を任意に用いて形成することによって得られるところの酵素センサ。２．前記酵素層が前記酵素センサの薄膜に含まれている、請求の範囲第１項に記載の酵素センサ。３．前記酵素が、グルコース、コレステロール、ラクテート、クレアチン、クレアチニン、尿素、尿酸、ピルビン酸塩（ピルベート）、アルコール類、ビリルビン、アスコルビン酸塩、リン酸塩類、タンパク、トリグリセライド、フェニルアラニン、チロシン及びヒポキサンチンから選ばれた物質が基質として作用する酵素から選択されている、請求の範囲第１項または第２項に記載の酵素センサ。４．前記酵素がラクテートオキシダーゼである、請求の範囲第１ないし３項のいずれか１項に記載の酵素センサ。５．前記酵素が、ウシ血清アルブミン、ウシ血清アルブミン−システイニル、コナルブミン（オボトランスフェリン）、オバルブミン（卵白アルブミン）などのアルブミン類やアルブミン誘導体から選ばれるマクロ分子に固定されている、請求の範囲第１ないし４項のいずれか１項に記載の酵素センサ。６．前記固定酵素の初期比酵素活性が、それに対応する量の非固定酵素の初期比酵素活性の少なくとも５０％である、請求の範囲第１ないし５項のいずれか１項に記載の酵素センサ。７．前記酵素がラクテートオキシダーゼであり、前記競合インヒビタがオキサルアセテート、オキサレート、α−ヒドロキシスルホネート、ビスルファイトまたはフェニルアセテートである、請求の範囲第１ないし６項のいずれか１項に記載の酵素センサ。８．前記競合インヒビタが蓚酸塩である、請求の範囲第７項に記載の酵素センサ。９．前記固定酵素の初期比酵素活性が、該酵素に対する競合インヒビタの不存在下で、適用できるのであれば同一種の架橋剤を用いて、同一種のマクロ分子に固定した酵素の対応量の初期比酵素活性の少なくとも１．５倍である、請求の範囲第１ないし８項のいずれか１項に記載の酵素センサ。１０．検査流体の分析物の濃度もしくは活性を測定するための酵素センサに対する薄膜であって、該薄膜が、該分析物が基質となる固定酵素を含む少なくとも１つの酵素層を有し、該固定酵素が、該酵素と少なくとも１つの形のマクロ分子との間に１個もしくはそれ以上の共役結合を、該酵素に対する競合インヒビタの存在下で架橋剤を任意に用いて形成することによって得られるところの薄膜。１１．前記酵素が、グルコース、コレステロール、ラクテート、クレアチン、クレアチニン、尿素、尿酸、ピルビン酸塩、アルコール類、ビリルビン、アスコルビン酸塩、リン酸塩類、タンパク、トリグリセライド、フェニルアラニン、チロシン及びヒポキサンチンから選ばれた物質が基質として作用する酵素から選択されていて、かつ、該酵素が好ましくはラクテートオキシダーゼである、請求の範囲第１０項に記載の薄膜。１２．前記酵素が、ウシ血清アルブミン、ウシ血清アルブミン−システイニル、コナルブミン（オボトランスフェリン）、オバルブミン（卵白アルブミン）などのアルブミン類やアルブミン誘導体から選ばれるマクロ分子に固定されている、請求の範囲第１０項または第１１項に記載の薄膜。１３．前記酵素がラクテートオキシダーゼであり、競合インヒビタがオキサルアセテート、オキサレート、α−ヒドロキシスルホネート、ビスルファイトまたはフェニルアセテートであり、該競合インヒビタが好ましくは蓚酸塩である、請求の範囲第１０ないし１２項のいずれか１項に記載の薄膜。１４．検査流体の分析物の濃度を測定するための酵素センサに含まれる固定酵素の酵素活性の安定性を改良する方法であって、前記分析物が該固定酵素に対する基質であって、前記固定酵素を、該固定酵素に対する競合インヒビタを含む溶液に断続的にもしくは連続的に曝す工程を含む方法。１５．前記固定酵素が前記酵素センサの薄膜に含まれている、請求の範囲第１４項に記載の方法。１６．前記酵素が、該酵素に対する競合インヒビタを含む溶液に、各測定もしくは実質的に各測定の間に、または、各１連の測定もしくは実質的に各１連の測定の間に曝される、請求の範囲第１４項または第１５項に記載の方法。１７．前記競合インヒビタを含む前記溶液が前記センサに対するすすぎ用流体である、請求の範囲第第１６項に記載の方法。１８．前記酵素が、グルコース、コレステロール、ラクテート、クレアチン、クレアチニン、尿素、尿酸、ピルビン酸塩、アルコール類、ビリルビン、アスコルビン酸塩、リン酸塩類、タンパク、トリグリセライド、フェニルアラニン、チロシンまたはヒポキサンチンから選ばれた物質が基質として作用する酵素から選択されている、請求の範囲第１４ないし１７項のいずれか１項に記載の方法。１９．前記酵素がラクテートオキシダーゼである、請求の範囲第１８項に記載の方法。２０．前記競合インヒビタがオキサルアセテート、オキサレート、α−ヒドロキシスルホネート、ビスルファイトまたはフェニルアセテートである、請求の範囲第１９項に記載の薄膜。２１．前記競合インヒビタが蓚酸塩である、請求の範囲第２０項に記載の薄膜。２２．酵素に対する競合インヒビタを含む溶液の酵素センサに含まれる固定酵素の安定化剤としての使用法において、該酵素センサが検査流体中の分析物の濃度もしくは活性の測定に適合していること、かつ、該分析物が該酵素に対する基質であることからなる使用法。２３．前記固定酵素が前記酵素センサの薄膜に含まれている、請求の範囲第２２項に記載の使用法。２４．前記酵素が、グルコース、コレステロール、ラクテート、クレアチン、クレアチニン、尿素、尿酸、ピルビン酸塩、アルコール類、ビリルビン、アスコルビン酸塩、リン酸塩類、タンパク、トリグリセライド、フェニルアラニン、チロシンまたはヒポキサンチンから選ばれた物質が基質として作用する酵素から選択されている、請求の範囲第２２項または第２３項に記載の使用法。２５．前記酵素がラクテートオキシダーゼであり、前記分析物がラクテートである、請求の範囲第２４項に記載の使用法。２６．前記競合インヒビタがオキサルアセテート、オキサレート、α−ヒドロキシスルホネート、ビスルファイトまたはフェニルアセテートである、請求の範囲第２５項に記載の使用法。２７．前記競合インヒビタがオキサレートである、請求の範囲第２６項に記載の使用法。２８．前記競合インヒビタを含む前記溶液が前記酵素センサに対するすすぎ用流体である、請求の範囲第２２ないし２７項のいずれか１項に記載の方法。２９．検査流体中の１つもしくはそれ以上の分析物の濃度もしくは活性を測定するための装置であって、該装置が、該１つもしくはそれ以上の分析物が基質となる少なくとも１つの固定酵素層を有する酵素センサと、該装置の操作に必要な溶液であって、そのうちの少なくとも１つの溶液が該酵素に対する競合インヒビタを含む溶液を入れた１つもしくはそれ以上の容器と、該センサを該競合インヒビタを含む該溶液に断続的に曝す手段とを含む装置。３０．前記固定酵素が前記酵素センサの薄膜に含まれている、請求の範囲第２９項に記載の装置。３１．前記競合インヒビタを含む前記溶液が前記酵素センサに対するすすぎ用流体である、請求の範囲第２９項または第３０項に記載の装置。３２．前記分析物がラクテートであり、前記酵素がラクテートオキシダーゼであり、前記競合インヒビタが蓚酸塩である、請求の範囲第２９ないし３１項のいずれか１項に記載の装置。

Claims

【特許請求の範囲】１．検査流体の分析物の濃度もしくは活性を測定するための酵素センサであって、該酵素センサが、該分析物が基質となる固定酵素を含む少なくとも１つの酵素層を有し、該固定酵素が、該酵素と少なくとも１つの形のマクロ分子との間に１個もしくはそれ以上の共役結合を、該酵素に対する競合インヒビタの存在下で架橋剤を任意に用いて形成することによって得られるところの酵素センサ。２．前記酵素層が前記酵素センサの薄膜に含まれている、請求の範囲第１項に記載の酵素センサ。３．前記酵素が、グルコース、コレステロール、ラクテート、クレアチン、クレアチニン、尿素、尿酸、ピルビン酸塩（ピルベート）、アルコール類、ビリルビン、アスコルビン酸塩、リン酸塩類、タンパク、トリグリセライド、フェニルアラニン、チロシン及びヒポキサンチンから選ばれた物質が基質として作用する酵素から選択される、請求の範囲第１項または第２項に記載の酵素センサ。４．前記酵素がラクテートオキシダーゼである、請求の範囲第１ないし３項のいずれか１項に記載の酵素センサ。５．前記酵素が、ウシ血清アルブミン、ウシ血清アルブミン−システイニル、コナルブミン（オボトランスフェリン）、オバルブミン（卵白アルブミン）などのアルブミン類やアルブミン誘導体から選ばれるマクロ分子に固定されている、請求の範囲第１ないし４項のいずれか１項に記載の酵素センサ。６．前記固定酵素の初期比酵素活性が、それに対応する量の非固定酵素の初期比酵素活性の少なくとも５０％である、請求の範囲第１ないし５項のいずれか１項に記載の酵素センサ。７．前記酵素がラクテートオキシダーゼであり、競合インヒビタがオキサルアセテート、オキサレート、α−ヒドロキシスルホネート、ビスルファイトまたはフェニルアセテートである、請求の範囲第１ないし６項のいずれか１項に記載の酵素センサ。８．前記競合インヒビタが蓚酸塩である、請求の範囲第７項に記載の酵素センサ。９．前記固定酵素の初期比酵素活性が、該酵素に対する競合インヒビタの不存在下で、適用できるのであれば同一種の架橋剤を用いて、同一種のマクロ分子に固定した酵素の対応量の初期比酵素活性の少なくとも１．５倍である、請求の範囲第１ないし８項のいずれか１項に記載の酵素センサ。１０．前記酵素センサが、該分析物が基質となる固定酵素を含む少なくとも１つの酵素層を有し、該固定酵素の初期比酵素活性が、それに対応する量の非固定酵素の初期比酵素活性の少なくとも５０％である、検査流体の分析物の濃度もしくは活性を測定するための酵素センサ。１１．前記酵素層が該酵素センサの薄膜に含まれている、請求の範囲第１０項に記載の酵素センサ。１２．前記酵素が、グルコース、コレステロール、ラクテート、クレアチン、クレアチニン、尿素、尿酸、ピルビン酸塩、アルコール類、ビリルビン、アスコルビン酸塩、リン酸塩類、タンパク、トリグリセライド、フェニルアラニン、チロシン及びヒポキサンチンから選ばれた物質が基質として作用する酵素から選択される、請求の範囲第１０項または第１１項に記載の酵素センサ。１３．前記酵素がラクテートオキシダーゼである、請求の範囲第１０ないし１２項のいずれか１項に記載の酵素センサ。１４．前記酵素が、ウシ血清アルブミン、ウシ血清アルブミン−システイニル）、コナルブミン（オボトランスフェリン）、オバルブミン（卵白アルブミン）などのアルブミン類やアルブミン誘導体から選ばれるマクロ分子に固定されている、請求の範囲第１０ないし１３項のいずれか１項に記載の酵素センサ。１５．前記固定酵素の初期比酵素活性が、それに対応する量の非固定酵素の初期比酵素活性の少なくとも６０％である、請求の範囲第１０ないし１４項のいずれか１項に記載の酵素センサ。１６．検査流体の分析物の濃度もしくは活性を測定するための酵素センサに対する薄膜であって、該薄膜が、該分析物が基質となる固定酵素を含む少なくとも１つの酵素層を有し、該固定酵素の初期比酵素活性が、それに対応する量の非固定酵素の初期比酵素活性の少なくとも５０％である、前記薄膜。１７．前記酵素が、グルコース、コレステロール、ラクテート、クレアチン、クレアチニン、尿素、尿酸、ピルビン酸塩、アルコール類、ビリルビン、アスコルビン酸塩、リン酸塩類、タンパク、トリグリセライド、フェニルアラニン、チロシンまたはヒポキサンチンから選ばれた物質が基質として作用する酵素から選択される、請求の範囲第１６項に記載の薄膜。１８．前記酵素がラクテートオキシダーゼである、請求の範囲第１６項または第１７項に記載の薄膜。１９．前記酵素が、ウシ血清アルブミン、ウシ血清アルブミン−システイニル）、コナルブミン（オボトランスフェリン）、オバルブミン（卵白アルブミン）などのアルブミン類やアルブミン誘導体から選ばれるマクロ分子に固定されている、請求の範囲第１６ないし１８項のいずれか１項に記載の薄膜。２０．前記固定酵素の初期比酵素活性が、それに対応する量の非固定酵素の初期比酵素活性の少なくとも６０％である、請求の範囲第１６ないし１９項のいずれか１項に記載の薄膜。２１．検査流体の分析物の濃度もしくは活性を測定するための酵素センサに対する薄膜であって、該薄膜が、該分析物が基質となる固定酵素を含む少なくとも１つの酵素層を有し、該固定酵素が、該酵素と少なくとも１つの形のマクロ分子との間に１個もしくはそれ以上の共役結合を、該酵素に対する競合インヒビタの存在下で架橋剤を任意に用いて形成することによって得られるところの前記薄膜。２２．前記酵素が、グルコース、コレステロール、ラクテート、クレアチン、クレアチニン、尿素、尿酸、ピルビン酸塩、アルコール類、ビリルビン、アスコルビン酸塩、リン酸塩類、タンパク、トリグリセライド、フェニルアラニン、チロシン及びヒポキサンチンから選ばれた物質が基質として作用する酵素から選択される、請求の範囲第２１項に記載の薄膜。２３．前記酵素がラクテートオキシダーゼである、請求の範囲第２１項または第２２項に記載の薄膜。２４．前記酵素が、ウシ血清アルブミン、ウシ血清アルブミン−システイニル、コナルブミン（オボトランスフェリン）、オバルブミン（卵白アルブミン）などのアルブミン類やアルブミン誘導体から選ばれるマクロ分子に固定される、請求の範囲第２１ないし２３項のいずれか１項に記載の薄膜。２５．前記固定酵素の初期比酵素活性が、それに対応する量の非固定酵素の初期比酵素活性の少なくとも５０％である、請求の範囲第２１ないし２４項のいずれか１項に記載の薄膜。２６．前記酵素がラクテートオキシダーゼであり、競合インヒビタがオキサルアセテート、オキサレート、α−ヒドロキシスルホネート、ビスルファイトまたはフェニルアセテートである、請求の範囲第２１ないし２５項のいずれか１項に記載の薄膜。２７．前記競合インヒビタが蓚酸塩である、請求の範囲第２６項に記載の薄膜。２８．前記固定酵素の初期比酵素活性が、該酵素に対する競合インヒビタの不存在下で、適用できるのであれば同一種の架橋剤を用いて、同一種のマクロ分子に固定した酵素の対応量の初期比酵素活性の少なくとも１．５倍である、請求の範囲第２１ないし２７項のいずれか１項に記載の薄膜。２９．検査流体の分析物の濃度を測定するための酵素センサに含まれる固定酵素の酵素活性の安定性を改良する方法であって、該分析物が該酵素に対する基質であり、前記酵素に対する競合インヒビタを含む溶液に該固定酵素を断続的にもしくは連続的に曝す工程を含む、前記方法。３０．前記固定酵素が前記酵素センサの薄膜に含まれている、請求の範囲第２９項に記載の方法。３１．前記酵素が、前記酵素に対する競合インヒビタを含む溶液に、各測定もしくは実質的に各測定の間に、または、各１連の測定もしくは実質的に各１連の測定の間に、曝される、請求の範囲第２９項または第３０項に記載の方法。３２．前記競合インヒビタを含む該溶液が該センサに対するすすぎ用流体である、請求の範囲第３１項に記載の方法。３３．前記酵素が、グルコース、コレステロール、ラクテート、クレアチン、クレアチニン、尿素、尿酸、ピルビン酸塩、アルコール類、ビリルビン、アスコルビン酸塩、リン酸塩類、タンパク、トリグリセライド、フェニルアラニン、チロシン及びヒポキサンチンから選ばれた物質が基質として作用する酵素から選択される、請求の範囲第２９ないし３２項のいずれか１項に記載の方法。３４．前記酵素がラクテートオキシダーゼである、請求の範囲第３３項に記載の方法。３５．前記競合インヒビタがオキサルアセテート、オキサレート、α−ヒドロキシスルホネート、ビスルファイト及びフェニルアセテートのいずれかである、請求の範囲第３４項に記載の薄膜。３６．前記競合インヒビタが蓚酸塩である、請求の範囲第３５項に記載の薄膜。３７．酵素に対する競合インヒビタを含む溶液の酵素センサに含まれる固定酵素の安定化剤としての使用法において、該酵素センサが検査流体中の分析物の濃度もしくは活性の測定に適合していること、かつ、該分析物が該酵素の基質であることを含む使用法。３８．前記固定酵素が該酵素センサの薄膜に含まれている、請求の範囲第３７項に記載の使用法。３９．前記酵素が、グルコース、コレステロール、ラクテート、クレアチン、クレアチニン、尿素、尿酸、ピルビン酸塩、アルコール類、ビリルビン、アスコルビン酸塩、リン酸塩類、タンパク、トリグリセライド、フェニルアラニン、チロシン及びヒポキサンチンから選ばれた物質が基質として作用する酵素から選択される、請求の範囲第３７項または第３８項に記載の使用法。４０．前記酵素がラクテートオキシダーゼであり、前記分析物がラクテートである、請求の範囲第３９項に記載の使用法。４１．前記競合インヒビタがオキサルアセテート、オキサレート、α−ヒドロキシスルホネート、ビスルファイト及びフェニルアセテートのいずれかである、請求の範囲第４０項に記載の使用法。４２．前記競合インヒビタがオキサレートである、請求の範囲第４１項に記載の使用法。４３．前記競合インヒビタを含む該溶液が前記酵素センサに対するすすぎ用流体である、請求の範囲第３７ないし４２項のいずれか１項に記載の方法。４４．検査流体の１つもしくはそれ以上の分析物の濃度もしくは活性を測定するための装置であって、該装置が、該１つもしくはそれ以上の分析物が基質となる少なくとも１つの固定酵素層を有する酵素センサと、該装置の操作に必要な溶液であって、そのうちの少なくとも１つの溶液が該酵素に対する競合インヒビタを含む溶液を入れた１つもしくはそれ以上の容器と、該センサを該競合インヒビタを含む該溶液に断続的に曝す手段とを含む、前記装置。４５．前記固定酵素が前記酵素センサの薄膜に含まれている、請求の範囲第４４項に記載の装置。４６．前記競合インヒビタを含む該溶液が前記酵素センサに対するすすぎ用流体である、請求の範囲第４４項または第４５項に記載の装置。４７．前記分析物がラクテートであり、前記酵素がラクテートオキシダーゼであり、前記競合インヒビタが蓚酸塩である、請求の範囲第４４ないし４６項のいずれか１項に記載の装置。