JP2000507804A

JP2000507804A - 組換え促進酵素による真核生物又は細胞における相同的組換えの刺激

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Publication number: JP2000507804A
Application number: JP9509863A
Authority: JP
Inventors: ライス，ベルント; コザク，ハンス; クレム，マンフレート; シェル，イェフ
Original assignee: マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・アインゲトラーゲナー・フェアアイン
Priority date: 1995-08-30
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2000-06-27
Also published as: DE69636225T2; DE69636225D1; US6583336B1; ATE329047T1; WO1997008331A1; EP0847445B1; EP0847445A1

Abstract

(57)【要約】本発明はトランスジェニック生物又はトランスジェニック細胞の作製のための新規な方法、本発明の方法によって得られたトランスジェニック生物又はトランスジェニック細胞、環境の影響によって引き起こされる植物又は植物細胞における害の治療のための及び哺乳類又は哺乳類細胞における遺伝子治療のための、組換え促進酵素をコードするＤＮＡを含むベクターの使用、及び新規なベクターに関する。

Description

【発明の詳細な説明】組換え促進酵素による真核生物又は細胞における相同的組換えの刺激本発明はトランスジェニック生物又はトランスジェニック細胞の作製のための新規な方法、本発明の方法によって得られたトランスジェニック生物又はトランスジェニック細胞、環境の影響によって引き起こされる植物又は植物細胞における害の治療のための及び哺乳類又は哺乳類細胞における遺伝子治療のための組換え促進酵素をコードするＤＮＡを含むベクターの使用、及び新規なベクターに関する。相同的組換えのプロセスは、相同性の検索、配列類似性の認識、及び２つのＤＮＡ分子の間の鎖の交換を要する。細菌においては、これらの異なった段階が、ある単一のタンパク質すなわちＲecＡタンパク質（Roca及びCox，1990を参照）によって媒介され、このタンパク質は大腸菌（E．coli）の組換え経路において中心的な役割を担っている。しかし、組換えを開始し、ＲecＡによって生成した中間体を分解（resolve）するためには、さらなるタンパク質が必要である。組換えは大腸菌及び恐らくはすべての生物において１本鎖ＤＮＡ（ssＤＮＡ）及びＤＮＡ末端の生成によって開始される。大腸菌においては、recＢ、recＣ及びre cＤ遺伝子産物の複合的な作用によって主要な組換え経路が開始される（Dunderd ale及びWest，1994を参照）。ssＤＮＡはＲecＡタンパク質によって認識され、２本鎖ＤＮＡ（dsＤＮＡ）が活発に検索される。相補鎖の交換によって組換え中間体（ホリデイ構造）が形成する。この中間体は様々な経路によって分解される。主要な経路は、ＲuvＡ、ＲuvＢ及びＲuvＣタンパク質の作用が関係する。組換えタンパク質のすべては、組換えをうまく完了するために共同的にはたらかねばならない。ＲecＡに酷似しているタンパク質が、数多くの真核細胞、例えば出芽酵母、分裂酵母、ヒト、マウス、ニワトリ、及び植物などにおいて見つかっている（Tera sawaら，1995；Kowalczykowski及びEggleston，1994を参照）。最もよくキャラクタライズされたタンパク質は、Saccharomyces cerevisiae由来のＤmc１及びＲ ad５１タンパク質である。どちらの場合も、対応する遺伝子が組換えに必須であり、そのタンパク質はＲecＡにかなりの配列相同性を示す。Ｄmc１と幾つかの細菌ＲecＡタンパク質の一次配列の比較は、これらのタンパク質が、原核生物と真核生物とに分かれる前に単一の先祖から進化したことを示唆している。さらに、Ｒad５１は、ＲecＡと構造的に非常に似ていることが示された。Ｒad５１はＤＮＡ/タンパクフィラメントを形成し、これはＲad５１の場合に形成されるフィラメントと３次構造が著しく似ている（Ogawaら，1983）。以前の研究では、Ｒad ５１によって媒介されるＡＴＰ依存性の相同的対合と鎖の交換を示すことはできなかったが（Shinoharaら，1992；Ogawaら，1983）、より最近の実験により、これらの活性が示された（Sung，1994）。Ｒad５１は、他のタンパク質、例えばＲ ad５２及びＤmc１と相互作用し、従ってＲad５１は組換えに関与する複合体の一部であるかもしれない。しかし、これらタンパク質の複雑さが、それらが大腸菌ＲecＡタンパク質と等価であるような単なる同族体であるとは決して言えない。即ち、様々な様式の生物学的活性が予期し得る。動物、特に哺乳類細胞における大腸菌ＲecＡタンパク質の活性に焦点をあてた様々な報告が発表された。即ち、Kidoら，1992は、ＳＶ４０ラージＴ抗原の核局在化シグナルに融合した機能性細菌ＲecＡタンパク質の哺乳類細胞への導入について報告している。しかし、導入されたタンパク質の機能についての研究はなされていない。ＷＯ９３／２２４４３は、大腸菌ＲecＡタンパク質で覆われた外因性ポリヌクレオチド配列の、哺乳類細胞の染色体ＤＮＡへのターゲティングを論じている。この文献には、ＲecＡタンパク質で覆われたオリゴヌクレオチドが正しい染色体位置へ効果的にターゲティングされ、ＲecＡが染色体外組換えを刺激することができ、ＲecＡショートＤＮＡ複合体は哺乳類細胞における遺伝子ターゲティングに使用することができることが示されている。しかし、その著者は、生細胞又は生物全体における相同的組換えの刺激を示すことはできなかった。Sp ivakら（1991）は、Ｘ線照射後にＲecＡタンパク質を含むリポソームで処理するとＨｅＬａ細胞の生存率が増加することを報告している。しかし、ＲecＡの刺激による生存はごく僅かなものである。Cerrutiらは、プラスミドにおける大腸菌ＲecＡの組換え活性について報告しているが、そのプラスミドはＤＮＡ修復又は細胞生存には効果がないものであった。これは恐らく、プラスミドがＲecＡに相同な固有の組換え促進酵素を有しているという事実によるものであろう。したがって、今までのところ、このようなプロセスの工業上利用性を可能にする著しく高い組換え活性が得られるような、真核生物の核へのＲecＡタンパク質のターゲティングという目標を達成した成功した実験はなされていない。例えば、植物細胞に関して、ＷＯ９３／２２４４３と同様に、ＰＥＧ媒介の形質転換による植物細胞におけるＲecＡ／ＤＮＡ複合体の導入は非常に困難であることが分かった。これらの複合体は、明らかな毒性を示し、ほとんど全部のプロトプラスト細胞死をもたらす。さらに、Kidoらは論文中で哺乳類細胞の核へのＲecＡタンパク質の導入の失敗について報告している。したがって、先行技術における研究を考慮すると、ＲecＡのような組換え促進酵素を真核細胞の核へ機能的に導入し得るかどうかについて、さらに、このような導入されたＲecＡタンパク質が確かに細胞核の中へ入り、工業上利用可能な程度まで活発に組換えを促進することができるかどうかについては非常に疑問であった。したがって、本発明の根底にある技術的課題は、トランスジェニック生物又はトランスジェニック細胞を作製する方法であって、該方法が組換え促進酵素を使用するものである方法を提供することであった。この技術的課題の解決手段は、請求の範囲において特徴づけられた態様によって得られる。したがって、本発明は、以下の工程（ａ）（ａａ）生物又は細胞へのＤＮＡの挿入、（ａａａ）該ＤＮＡは、トランスジェニック生物又はトランスジェニック細胞に１又はそれ以上の所望の特性を与えるものであり、（ａａｂ）さらに、該ＤＮＡは該生物又は該細胞において発現可能な少なくとも１つの選択マーカーをさらにコードするものであり、（ａａｃ）所望により、該ＤＮＡは、組換え促進酵素又は酵素的に活性な誘導体もしくはその一部をコードするものであって、その組換え促進酵素又はその酵素的に活性な部分が所望の特性又はその特性のうちの１つを与えるものである。あるいは（ａａｃ）を適用しない場合は、（ａｂ）前記ＤＮＡ（ａａ）と組み合わせた、組換え促進酵素又は酵素的に活性な誘導体若しくはその一部の、生物又は細胞への挿入（ｂ）（ａ）に記載の前記ＤＮＡ又は前記ＤＮＡと前記タンパク質を取り込んだトランスジェニック生物又は細胞の選択；及び（ｃ）適当な培地における所望のトランスジェニック生物又は所望のトランスジェニック細胞の培養を含んでなる、トランスジェニック生物又はトランスジェニック細胞の作製方法に関する。したがって、組換え促進酵素が所望の特性を与えるか又は所望の特徴の１つであるということが、本発明にしたがって考えられる。前者の場合においては、本発明の方法によって、例えば、植物の育種において使用し得る高度の組換え表現型を有する植物、環境の害例えば紫外線やオゾンに対してより抵抗力のある植物、又はＤＮＡ損傷に対してより抵抗力のある植物を得ることができる。後者の場合においては、組換え促進酵素は、組換えを促進することによって、目的とするＤＮＡ配列を細胞又は生物のゲノムに導入するために使用することができる。これらの形質転換体は、例えば植物の育種のために、遺伝子ターゲティングの頻度を改善し、この方法論を応用可能にすると期待される。さらに、組換え促進酵素を、発現すると、その組換え促進酵素を生じる対応ヌクレオチド配列によってその酵素がコードされるようにして細胞又は生物に導入することができる。もしくは、組換え促進酵素そのものをその細胞又は生物に導入することができる。この場合、挿入されるべきＤＮＡは、もう１つのまたはさらなる所望の特性を有するタンパク質をコードする。もう１つの又はさらなる所望の特性をコードするヌクレオチド配列を、次に、組換え促進酵素の活性によってその細胞又は生物のゲノムに導入するが、この組換え酵素はその細胞又は生物において生物学的に活性でなければならないことはもちろんのことである。例えば、もう１つの又はさらなる特性は、その細胞又は生物において発現するさらなるタンパク質であるか、又はその生物又は細胞のゲノムへの組換えが起こると自然に存在する又はトランスジェニックな遺伝子機能の破壊をもたらすＤＮＡでありうる。この方法はまた、外因性の修飾されていないコピーを妨害することなく修飾タンパク質の発現を可能にし、形質転換体における多様性を可能にする。不安定な発現および遺伝子沈黙化（gene silencing）によっておこる問題を、植物における遺伝子ターゲティングを用いて回避することができるということも期待される。本発明の方法の有効性を試験するために、マイトマイシンＣ耐性に関する再現可能で定量可能なアッセイを、Labelら（1993）によって発表されたデータとシステムに基づいて開発した。マイトマイシンＣは、イン・ビボでＤＮＡに挿入して相補鎖を架橋結合することが知られている（Borowy−Borowskiら，1990）。架橋結合は、ＲＮＡ又はタンパク質合成に対する副作用なしに、細菌におけるＤＮＡ合成の阻害をもたらす（Iyer及びSzybalski，1963）。Ustilago maydis及びSa ccharomyces cerevisiaeにおいて、マイトマイシンＣは、突然変異となることなく相同的組換えを刺激することが示された（Holliday，1964）。様々な高等真核細胞においても同様のことが観察された（Suzuki，1965；Shaw及びCohen，1964 ；Wangら，1988）。データは、マイトマイシンＣが効果的にＤＮＡ複製を阻止することを示している。生じた娘鎖ブロック（daughter−strand block）は多くの生物において相同的組換え（姉妹染色分体交換）及び除去修復によって修復されると考えられている。Labelら（1993）は、マイトマイシンＣが植物細胞において染色体間組換えを刺激すること、即ち、マイトマイシンＣ損傷の組換え的修復を示している。本発明にしたがって、高濃度のマイトマイシンＣが、真核細胞の代表としての未処理の植物細胞を効果的に殺すことが分かった。恐らく内因性の修復／組換え機構の能力が使い尽くされるためであろう。即ち、野生型は、マイトマイシンＣ処理下のプロトプラスト生存率が、細菌及び酵母で頻繁にみられる曲線と似た用量−応答曲線：低用量における肩及び高用量における半対数的な減少（第７図）：に従うことがさらに見いだされた。 Friedberg（1985）によって記載された用量−応答曲線（第７図）の評価は、本発明の方法にしたがって得られたnt−ＲecＡ発現により５０μg／ｍLまでのマイトマイシンＣで引き起こされた損傷を修復する能力を細胞に与えるのに対して、野生型タバコプロトプラストにおける内因性修復機構は１５μg／ｍLまでのマイトマイシンＣで引き起こされた損傷を修復できるにすぎないことを示唆している。このように、nt−ＲecＡを発現する植物細胞は、この薬剤に対してかなり高い耐性を示した。このことは、ＲecＡが、内因性の植物組換え機構と相互作用し又はこれを補って植物細胞において機能し得ることを示唆している。さらに、Ｒec Ａは植物における染色体間組換えを直接刺激する。このデータに基づいて、本発明の方法により、従来技術によって記載されたどの方法よりもさらに高い組換え頻度が得られることが期待され得る。本発明を植物細胞についてのみ説明しているが、本明細書に開示した教示は他の真核細胞、例えば哺乳類細胞などにもあてはまる。本発明は、トランスジェニック細胞又は生物の作製のための工業的に利用可能な方法へとつながる、真核細胞又は真核生物の核における組換えの有効性をはじめて可能にすることが期待される。本発明の方法の好ましい態様において、前記のトランスジェニック生物又はトランスジェニック細胞は、植物又は植物細胞である。本発明の方法の最も好ましい態様において、前記の植物又は植物細胞はNicoti ana tabacum又はArabidopsis thalianaであるか又はそれに由来するものである。本発明のさらに好ましい態様は、前記トランスジェニック生物又はトランスジェニック細胞が哺乳類又は哺乳類細胞、菌類、酵母又は細菌である方法に関する。さらに好ましい方法においては、前記所望の特性は、相同的組換えの刺激、遺伝子ターゲティングの増強、ＤＮＡ損傷の修復のための内因性機構の刺激であり、様々な化学的及び物理的な作用物（オゾン、紫外線）に対する耐性をもたらす。さらに、前記のより好ましい特性は、例えば、発現したさらなるタンパク質であって、これは、さらなる表面マーカーの発現又は異なる／さらなる代謝酵素の発現などの、トランスジェニック生物または細胞の表現型を所望のやり方で変える。さらに、前記の特性は、前記の生物又は細胞において天然に存在する遺伝子機能の破壊をもたらし得るものである。別の好ましい方法において、前記の選択マーカーはＨｙｇ^R、Ｋｍ^R、ＰＰＴ^R 、Ｍｔｘ^R又はＳｕｌ^Rである。当業者は、これら選択マーカーには精通しており、Ｈｙｇ^Rはハイグロマイシン耐性を表し、Ｋｍ^Rはカナマイシン耐性を表し、ＰＰＴ^Rはホスホノトリシン（ＢＡＳＴＡ）耐性を表し、Ｍｔｘ^Rはメトトレキセート耐性を表し、そしてＳｕｌ^Rはスルホンアミド耐性を表す。しかし、当業者は、これらの好ましい選択マーカーを、本発明の方法に適する他のいずれのマーカーに置換することもできる。本発明の方法のさらに好ましい態様において、前記の組換え促進酵素は大腸菌ＲecＡタンパク質である。本発明のさらに好ましい方法において、前記の組換え促進酵素の前記誘導体は、大腸菌ＲecＡタンパク質と核ターゲティング配列との融合タンパク質である。この好ましい態様にしたがって得られた実験データにより、nt−ＲecＡがＲec Ａ^-大腸菌の紫外線耐性を増加することができるということが示された。このキメラタンパク質は、ssＤＮＡに結合してイン・ビドロの鎖交換をＲecＡと同じくらい効果的に触媒することが可能であった。興味深いことに、ＲecＡと異なり、 nt−ＲecＡはssＤＮＡの非存在下で高いＡＴＰase活性を示した。nt−ＲecＡのこのssＤＮＡ非依存性の活性は、ssＤＮＡの添加により、ＲecＡそのものと同じ増加量だけ刺激された。これらの活性が、調製物中の２つの異なるタンパク質（ nt−ＲecＡ及びＲecＡ様分解産物）から生じたものなのか、あるいはnt−ＲecＡ本来の特性であるのか現在のところ分かっていない。ssＤＮＡ非存在下でのnt− ＲecＡのＡＴＰase活性は、ゲル電気泳動と染色による検出から逃れた微量の混入ＡＴＰase又はＤＮＡによるものであるという可能性が全くないわけではない。しかし、nt−ＲecＡ融合タンパク質は、確かに異なったＡＴＰase特性を有しているようである。ssＤＮＡ非存在下でのnt−ＲecＡのＡＴＰaseのレベルがss ＤＮＡ存在下でのＲecＡのＡＴＰase活性よりも幾分高いので、nt−ＲecＡは、Ｒe cＡ４４１及びＲecＡ７３０タンパク質（Witkinら，1982）を思い出させる方法で構成的に（constitutively）活性化される修飾されたＲecＡタンパク質であると考えられるであろう。ＲecＡのＡＴＰase活性は、２つの異なる機能、すなわち、酵素のリサイクル及びＤＮＡの非相同領域の乗り越え（overcomming）に供するようである（Kowalczykowski及びEggelston，1994；Roca及びCox，1990を参照）。最も好ましい態様において、前記核ターゲティング配列はＴＳＶ４０核ターゲティング配列である。ＳＶ４０核ターゲティング配列は当業者によく知られており、それ以上ここで説明する必要はない。本発明のさらに好ましい態様では、前記挿入は、植物形質転換におけるＰＥＧ形質転換、アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換、エレクトロポレーション、パーティクル衝撃（particle bonbardment）、リポソーム融合、リン酸カルシウム沈殿又はウイルス感染によって媒介される。用いる最適な方法は、形質転換するべきその生物または細胞の分類学的起源に依存する。当業者は、どの挿入方法がこの目的にとって最良であるかをよく理解している。本発明はさらに、本発明の方法によって得られるトランスジェニック生物又はトランスジェニック細胞に関する。さらに、本発明は、組換え促進酵素又はその酵素的に活性な一部をコードするＤＮＡに作用可能なように結合した、核ターゲティング配列をコードするＤＮＡ、少なくとも１つの選択マーカー、及び場合により、所望の特性をコードする少なくとも１つのさらなるＤＮＡを含むベクターに関し、該ベクターによってコードされる核ターゲティング配列／組換え促進酵素融合タンパク質はＡＴＰase活性を有する。驚くべきことに、核ターゲティング配列がＳＶ４０に由来し、組換え促進酵素が大腸菌ＲecＡタンパク質に由来する融合タンパク質によって例示される、核ターゲティング配列／組換え促進酵素融合タンパク質は、高いＡＴＰase活性をもたらすことが本発明によって分かった。この活性は、２つの異なる機能を発揮すると思われる。第１に酵素をリサイクルするようであり、第２にＤＮＡの非相同領域を乗り越えるようである。前記のベクターに含まれる様々なＤＮＡ配列を発現することが可能な前記ベクターに含まれる少なくと１つの選択マーカーは、すでに上で議論した。同じことが本発明のベクターに同様に含まれる所望の特性をコードするさらなるＤＮＡにもあてはまる。前記ベクターの好ましい態様において、前記核ターゲティング配列はＴＳＶ４０核ターゲティング配列である。さらに又は若しくは、組換え促進酵素は大腸菌ＲecＡタンパク質である。最も好ましい態様において、本発明の前記ベクターは、ｐＳ／nt−ＲecＡ又はｐＥＶ／nt−ＲecＡである。前記ベクターの構築については、実施例１に十分に記載している。このベクターのさらなる詳細を第１図に示す。さらに、本発明は、植物又は植物細胞における環境の影響によって引き起こされる害を治療するための本発明のベクター、すなわちＤＮＡにより形質転換される又はトランスフェクションされる細胞に１又はそれ以上の所望の特性を与えるＤＮＡを含むベクターの使用に関し、該ＤＮＡはさらに該細胞において発現可能な少なくとも１つの選択マーカーをコードし、さらに組換え促進酵素又は酵素的に活性な誘導体又はその一部をコードし、組換え促進酵素又はその酵素的に活性な一部が所望の特性若しくはそのうちの１つを与える。選択マーカー、組換え促進酵素及び挿入方法に関して、その好ましい態様を本明細書中の上に記載した。前記使用の好ましい態様において、前記害はＤＮＡの損傷によって引き起こされ、好ましくは紫外線照射、オゾン、ＳＯ₂、メチル化剤又は突然変異剤によるものである。本発明の最後の好ましい態様では、本明細書の上に記載したベクターを哺乳類又は哺乳類細胞における遺伝子治療に用いる。遺伝子治療のためのこのような方法は当技術分野において十分に議論されているので、技術的な詳細は当業者に知られているか又はさらなる苦労することなく導くことができる。図面は以下のことを示す。第１図：トランスジェニックｒecＡ遺伝子の構成図コード配列は、黒棒で示す。ｒecA導入遺伝子において、白の囲み(openbox)は、recＡコード配列に付加された配列を示す。小さい囲み（small box）は、タンパク質をコードしない配列である。ｐＳ／nt−ｒecＡ及びｐＥＶ／nt−ｒecＡを作成するために付加されたヌクレオチド配列及び対応のアミノ酸配列を示す。プロモーターは白の矢印で示し、ポリアデニル化シグナルを白の囲みで示す。略号：ＨindIII、ＨindIIIエンドヌクレアーゼの認識配列；Ｐ３５Ｓ、ＣaＭＶ３５Ｓプロモーター；ＰＡＡ、ＣaＭＶ由来のポリアデニル化シグナル；ｏｒｉ、大腸菌複製起点；Ｓｕｌ^r、スルホンアミド耐性遺伝子；Ａmp^r、アンピシリン耐性４遺伝子；Ｂr、Ｔ−ＤＮＡライトボーダー配列；Ｂ1、Ｔ−ＤＮＡレフトボーダー配列；λＰ₁、λファージのレフトワード（leftward）プロモーター。第２図：recＡとnt−recＡのＡＴＰaseの比較ＲecＡ及びnt−ＲecＡタンパク質（１００ｐMol）を、ssＤＮＡの存在下又は非存在下で、放射能標識したＡＴＰとそれぞれインキュベーションした。ＡＴＰ代謝回転数を測定し、比活性を計算した。第３図：ＲecＡとnt−ＲecＡの１本鎖結合活性の比較ＲecＡ及びnt−ＲecＡの０、２０、５０及び１００pMolを、それぞれ、４００ｐMol（ヌクレオチド）のssＤＮＡと、γＳＡＴＰの存在下でインキュベーションした。反応混合物を０．８％アガロースゲルの電気泳動（４℃）により分析し、ＤＮＡを臭化エチジウムで染色した。（＋deprot.）と示したものは、試料を電気泳動の前に除タンパクした。マーカー：ＰstＩエンドヌクレアーゼで消化したλファージＤＮＡ。ゲル中の１本鎖基質ＤＮＡの位置を示す（ssＤＮＡ）。第４図：ＲecＡとnt−ＲecＡの鎖交換活性の比較ＲecＡ及びnt−ＲecＡタンパク質を、Menetskiら（1990）に記載の通り、直鎖状２本鎖と環状ssＤＮＡの混合物と、１本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）及びγＳＡＴＰの存在下で、図に示した時間インキュベーションした。混合物を、室温で０．８％アガロースゲルの電気泳動により分析し、ＤＮＡを臭化エチジウムで染色した。対照の反応、すなわち、ＲecＡ又はnt−ＲecＡタンパク質を含まない（ −（nt）ＲecＡ）、γＳＡＴＰを含まない（−ＡＴＰ）、マグネシウムを含まない（−Ｍg）、１本鎖結合タンパク質を含まない（−ＳＳＢ）、又は１本鎖結合タンパク質及びγＳＡＴＰを含まない（−ＳＳＢ−ＡＴＰ）反応も含んでいる。マーカーＭ１は、ＰstＩエンドヌクレアーゼで消化したλファージＤＮＡであり、マーカーＭ２は、弛緩型（開環状、oc）、直鎖型（lin）、スーパーコイル（閉環状コイル、occ）、２本鎖及び環状１本鎖（ss）ＤＮＡの混合物であった。オープンサークルの位置、つまり、ゲル中に見える鎖交換反応の反応生成物を矢印で示す。第５図：ＲecＡ及びnt−ＲecＡをそれぞれ発現したトランスジェニック植物ＳＤＳを含む１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離したタンパク質をニトロセルロースにブロットし、ＲecＡ抗原を抗ＲecＡモノクローナル抗体ＡＲＭ４１４（Ikedaら，1990）で検出した。大腸菌から精製したＲecＡの位置を示す。同時電気泳動（coelectrophoresis）した染色前（pre-stained）のタンパク質（BioRad）の混合物から分子量を推定した。第６図：トランスジェニックタバコ植物におけるＲecＡ及びnt−ＲecＡの細胞内分布葉からプロトプラストを調製し、ホルムアルデヒドによりタンパク質を固定した。核をＤＡＰＩ染色により視覚化した（ＤＡＰＩパネル）。同じプロトプラストを抗ＲecＡ抗体ＡＲＭ４１４及びＦＩＴＣ標識二次抗体で染色してＲecＡ抗原を視覚化した（抗ＲecＡパネル）。Ａ：非トランスジェニックＳＲ１植物由来のプロトプラスト。Ｂ：ＲecＡを発現しているＧ６４／２植物由来のプロトプラスト。Ｃ：nt−ＲecＡを発現しているＧ６３／１９植物のプロトプラスト。第７図：ＲecＡ及びｎｔ−ＲecＡトランスジェニックプロトプラストはマイトマイシンＣの毒性作用に対してより抵抗力がある。ＳＲ１、Ｇ６４／２及びＧ６３／１９植物から得たプロトプラストをマイトマイシンＣの存在下又は非存在下でミクロカルス(microcalli)に再生した。生存頻度（survival frequency）はマイトマイシンＣ存在下で再生したミクロカルスの数を非存在下で再生したミクロカルスの数で割ることにより定義される。異なる３つのデータの組から得た平均値を示す。エラーバーは、各データ点について計算された標準偏差を示す。さらなる３回の独立した実験では、データ点が、０、１０、２５及び５０μg／ｍLマイトマイシンＣについて±２５％の範囲内で再現された。第８図：ＲecＡ及びnt−ＲecＡ発現は染色体間組換えの刺激につながる。少なくとも５×１０⁶個の、この３系統のそれぞれから調製したプロトプラストを、３つの独立した実験において、カナマイシンの存在下で再生させた。染色体間組換えの頻度は、カナマイシンの存在下で成長したカルスの数を、各実験において得られた再生頻度で割って計算した。平均値を示し、エラーバーを標準偏差で示す。本発明を説明する実施例：実施例１：植物におけるＲecＡの発現及び核ターゲティング核タンパク質は核内でその大きさに関係なく集まる。アミノ酸の短い鎖である「核局在化シグナル」は、核タンパク質のターゲティングの原因になると考えられている（Dingwall及びLaskey，1986；Silver，1991を参照）。大腸菌ＲecＡモノマーの大きさは真核生物の核膜孔の排除限界に近い；細胞質ssＤＮＡ／ＲecＡフィラメントはまず排除されるであろう。ＲecＡタンパク質は核局在化シグナルを含んでいないようであり、従って核から排除され、それ故その標的から排除される。この可能性を抑えるため、真核生物の１例として、植物において、ＲecＡタンパク質をその真正の形だけでなく、核局在化シグナルと融合させた形でも発現させた。はじめに、recＡ遺伝子を修飾して細菌の大部分の配列をその上流又は下流の非翻訳領域から切り出した。第２段階で、コード配列をＳＶ４０ラージＴ抗原（ Kalderonら，1984）の核局在化配列の５'側に結合し、融合タンパク質（nt−Ｒe cＡ）を得た。nt−ＲecＡ翻訳を最適にするため、翻訳開始コドンをコードするR ubisco ＳＳＵ遺伝子から得たリーダー配列（Cashmore，1983）をnt−ＲecＡコード配列の５'側に融合させた。recＡ及びnt−recＡ配列の両方を、カリフラワーモザイクウイルス（ＣaＭＶ）３５Ｓプロモーターの転写調節下に置き、３'側に真核ポリアデニル化シグナルをつないだ（第１図）。最後に、この遺伝子を、形質転換された植物を選択するために、スルホンアミド耐性遺伝子（Ｓul^r）を用いてアグロバクテリウム媒介の植物形質転換に適当なバイナリーベクター中に挿入した（第１図）。ｐＳ／recＡプラスミドにおいては、Ｓul^r遺伝子に対するre cＡ導入遺伝子の方向は、両方の遺伝子が反対方向に転写されるような方向であった。しかし、ｐＳ／nt−recＡプラスミドでは、nt−recＡとＳul^r遺伝子は同じ方向に転写される。生化学的キャタクタリゼーションのために、nt−ＲecＡ融合タンパク質を大腸菌内でも発現させた。この目的のために、nt−recＡが人工のリボソーム結合部位に融合したｐＥＶ／nt−recＡプラスミドを構築した（第１図）。実験の詳細は以下のとおりである：修飾したrecＡ遺伝子は、プラスミドｐＤＲ１４５３（Sancar及びRupp，1979 ）から得た。このプラスミドをＳacＩＩ制限酵素で消化し、末端をＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメントで平滑にし、recＡ遺伝子のアミノ末端部分をＳac ＩＩ／ＥcoＲＩフラグメントとして、ＥcoＲＩ及びＳmaＩで切断したプラスミドｐＵＣ１８中でサブクローンし、プラスミドｐＲecＡ−１を得た。同じプラスミドをＨinfＩで消化し、末端を平滑にし、recＡ遺伝子のカルボキシ末端部分をｐＵＣ１９（ＥcoＲＩ／ＳmaＩ）へ、ＨinfＩ／ＥcoＲＩフラグメンとしてサブクローンした（ｐＲecＡ−２）。アミノ末端部分をさらに修飾した。開始コドンなしの、recＡのアミノ末端部分をコードするｐＲecＡ−１から得たＢstxＩ／Ｅco ＲＩ及びＴaqＩ／ＢstＸＩフラグメントと、失われたコドンをコードする２つの相補オリゴヌクレオチド（５’GGG GAC TCC TCC TAA GAA GAA GCG TAA GGT TAT GGC GAT ３’（配列番号１）及び５’CGA TCG CCA TAA CCT TAC GCT TCT TCT TA G GAG GAG TCC CC ３’（配列番号２））、そしてまたＳＶ４０核局在化配列を、ＥcoＲＩ及びＳmaＩで消化したプラスミドｐＵＣ１８中に挿入し、プラスミドｐＲecＡ−３を得た。関係する連結点のＤＮＡ配列によって、その構築物が予想されたとおりの構造であると確認された。植物中でのnt−ＲecＡの発現のために、Rubisco ＳＳＵ遺伝子のリーダー配列及び始めの４つのアミノ酸をコードするコドンをrecＡ遺伝子に融合した。プラスミドｐＳＰ６４／ＴＰＮＰＴＩＩ(Wassmannら，1986）は、ＳＳＵ遺伝子のアミノ末端部分を含んでいる。このプラスミドをＥcoＲＶ及びSalＩで消化し、ｒe cＡ遺伝子のアミノ末端部分を有するｐＲecＡ−３より得たＳmaＩ／ＥcoＲＩフラグメントと、カルボキシ末端部分を含むｐＲecＡ−２に由来するＥcoＲＩ／Ｓ alＩフラグメントを、それに挿入してｐＲecＡ−４プラスミドを得た。完全なnt −ｒecＡ遺伝子を、ＨindＩＩＩ及びＳalＩによる消化によってｐＲecＡ−４から切り出した。ＨindIII末端を平滑にし、さらなるＨindIII部位を唯一のＥcoＲＩ部位の上流に含むよう修飾されたプラスミドｐＤＨ５１（Pietrzakら，1986）へ挿入した。この工程によりＣaＭＶ３５Ｓプロモーターとポリアデニル化シグナルがそれぞれnt−recＡ遺伝子に融合した。植物におけるＲecＡの発現のために、ｒecＡ遺伝子のアミノ末端部分を有するｐＲecＡ−３由来のＳmaＩ／ＥcoＲＩフラグメントと、カルボキシ末端を含んでいるｐＲecＡ−２由来のＥcoＲＩ／ＳalＩフラグメントを、対応する部位を介して、修飾したｐＤＨ５１プラスミドに挿入した。大腸菌での発現のためのプラスミドｐＥＶ／nt−recＡを得るため、recＡ遺伝子のアミノ末端部分を有するｐＲecＡ−３由来のＢamＨＩ／ＥcoＲＩフラグメントと、カルボキシ末端部分を含むｐＲecＡ−２由来のＥcoＲＩ／Ｓ alＩフラグメントとをプラスミドｐＥＶｖｆｒ１に挿入した（Crowlら,1985）。Ｓul^r選択マーカー遺伝子を有するバイナリーベクターを以下のように構築した：プラスミドｐＪＩＴ１１９（Guerineauら，1990）をＨindＩＩＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメントで末端を補充し、Sul^r遺伝子を有するＨindＩＩＩ／ＳaＩＩフラグメントをＳmaＩ及びＳalＩで消化したプラスミドｐＤＨ５１に挿入した。ｐＳ００１を得るため、ＣaＭＶ３５Ｓプロモーター及びポリアデニル化シグナルに融合したSul^r遺伝子を、NcoＩ及びSstＩ部位を介して、ｐＭ００１のメトトレキセート耐性遺伝子と交換した（Reissら，1994）。ｒecＡ及びnt−ｒecＡ遺伝子を、ＨindＩＩＩによる消化によってそれぞれ切り出し、プラスミドｐＳ００１の唯一のＨindＩＩＩ部位に挿入してプラスミドｐＳ／ｒecＡとｐＳ／nt−ｒecＡを得た。実施例２：nt−ＲecＡのキャラクタリゼーション核局在化シグナルの融合が、ＲecＡの生物学的特性になんらかの影響を与えるかどうかを決定するために、数多くの反応を試験した：（Ｉ）大腸菌において、ＲecＡは、複製ブロックの組換え的修復により直接的に、ＲecＡ自体の発現の増加を含むＳＯＳ応答の誘導を媒介することによって間接的に、紫外線耐性をもたらす（Robertsら，1978）。nt−ＲecＡの機能を試験するために、nt−ｒecＡ遺伝子がファージλＰ₁プロモーターから転写されるプラスミドｐＥＶ／nt−recＡを、大腸菌ＲecＡ−株ＤＨ５αに挿入した。具体的には、プラスミドｐＥＶ／nt−recＡを、熱誘導性ラムダリプレッサー遺伝子をコードする５３７と命名されたプラスミド（Strebelら，1986）を含んでいる大腸菌ＤＨ５α株（ｓｕｐＥ４４，△ｌａｃＵ１６９（Φ８０ｌａｃＺ△ Ｍ１５），ｈｓｄＲ１７，ｒｅｃＡ１，ｅｎｄＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｔｈｉ−１，ｒｅｌＡ１，Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）に形質転換した。培養細胞をアンピシリン（１００μg／ｍL）及びカナマイシン（２５μg／ｍL）を添加したＬＢ培地中、２８℃で培養した。温度を４２℃へと変化させることにより発現を誘導した。さらに２時間培養し発現させた後、細胞を遠心分離により採集し、２５０mＭ Tri s／ＨＣl（ｐＨ７．５），２５％（ｗ／ｖ）スクロース中で洗浄した。λｃＩ８５７リプレッサーの熱的不活化による、高レベルの発現は致死的となった。しかし、細胞は２８℃で生育可能で紫外線に対して耐性であり、nt−ＲecＡが機能していることを示した。nt−ＲecＡの精製は、Griffith及びShores（1985）の修飾を加えて、Coxら（1981）によってＲecＡについて記載された通りに行い、細胞２ｇからnt−ＲecＡ２０ｍgを得た。そのタンパク質を、２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む２０ｍＭＴris／ＨＣl（ｐＨ７．５），１mＭＥＤＴＡ，１mＭＤＴＴ緩衝液中、−２０℃で保存した。タンパク濃度はBradfordの方法（1976）に従って決定した。nt−ＲecＡタンパク質の純度と同一性は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、クーマシーブルー染色、及び慣用の方法に従って製造したＡＲＭ４１４抗体を用いるウェスタンブロッティングにより確認した。調製物は、クーマシーブルー染色において視覚化される単一のタンパク質を含んでいた。このタンパク質は、ウェスタンブロッティングにおいて抗ＲecＡ抗体と反応した。これらの基準を用いて、nt−ＲecＡ調製物は、同じプロトコルに従ってプラスミドｐＤＲ１４５３を含んでいるナリジキシン酸誘導性大腸菌細胞から精製したＲecＡの調製物と同じ純度であった。（ＩＩ）ＡＴＰase、ssＤＮＡ結合、及び鎖交換活性を、ｐＥＶ／nt−recＡを含むｒecＡ１大腸菌株の熱誘導により産生した、高度に精製されたnt−RecＡタンパク質を用いて分析した。精製されたnt−recＡ調製物は、非特異的プロテアーゼによるプロセシングから、又はnt−recＡの内部の開始コドンでの翻訳開始から恐らく生じるであろう、真正ＲecＡの分子量を有する少量（５％未満）のタンパク質を含んでいることが分かった。どちらも大腸菌培養細胞から同じ方法（Griffith及びShores，1985）によって精製した、nt−ＲecＡ及び真正ＲecＡのＡＴＰase活性を、ssＤＮＡの存在下及び非存在下で平行して分析した（Shibataら，1981）。本質的に、ＡＴＰase活性は、［³Ｈ］ＡＴＰを［¹⁴Ｃ］ＡＴＰで置換したこと以外は、Shibataら（1981）によって記載された通りに測定した（Amersham，比活性５×１０¹²Ｃｉ／Mol）。真正ＲecＡの基礎ＡＴＰase活性は低いが、ssＤＮＡの添加により、予想どおり２０倍刺激される（Roca及びCox（1990）を参照）ことが分かった。対照的に、nt−ＲecＡの基礎ＡＴＰase活性はさらに高く、ssＤＮＡの添加により比例的により少なく刺激されることが分かった（第２図）。（ＩＩＩ）精製したnt−ＲecＡのssＤＮＡへの結合を、ゲル遅延分析を用いて分析した。一定した量のssＤＮＡを、増加する量の精製したＲecＡ及びnt−Ｒec Ａタンパク質と、複合体の解離を防ぐためにγＳＡＴＰの存在下でインキュベーションした。具体的には、nt−ＲecＡ及びＲecＡのssＤＮＡへの結合を、総体積２０μLの２５mＭＴris／酢酸、４mＭＭｇＣl₂、１mＭＤＴＴ、２０μＭのファージＭ１３ｍｐ１８の誘導体由来のヌクレオチドssＤＮＡ（Wadaら（1994）により記載）及び２ｍμ γＳＡＴＰ中で測定した。種々の量のタンパク質（０、２０、５０、及び１００pMol)を、３７℃で３０分間、この混合物とインキュベーションした。除タンパクのために、ＳＤＳ及びＥＤＴＡを加えてそれぞれ終濃度１％（ｗ／ｖ）及び１０mＭとした（Riddles及びLehmann，1985）。結合動力学の違いは観察されなかった（第３図）。（ＩＶ）ＲecＡ及びnt−ＲecＡタンパク質は、直鎖状dsＤＮＡ及び環状ssＤＮＡ（Mnetskiら，1990）との間の鎖交換反応を同じ動力学で促進した（第４図）。鎖交換反応は、Mnetskiら（1990）によって記載されている通りに行った。ファージＭ１３ｍｐ１８の誘導体から調製した閉環状ssＤＮＡ及びＢglＩ直鎖状ds ＤＮＡを基質として用いた（Wadaら，1994）。これらの試験は、nt−ＲecＡが、ＲecＡタンパク質の期待される活性を示すことを示した。実施例３：ＲecＡ及びnt−ＲecＡトランスジェニック植物のキャラクタリゼーション recＡ及びnt−recＡ導入遺伝子を有するバイナリーベクターを含むアグロバクテリウムを、タバコリーフディスクを感染させるために用いた：プラスミドｐＳ／recＡ及びｐＳ／nt−recＡをAgrobacterium tumefaciens株ＧＶ３１０１／ｐＭＰ９０ＲＫ（Koncz及びSchell，1986）へ、エレクトロポレーションにより導入し、得られた株（recＡについてトランスジェニックな植物をＧ６４、そしてn t−recＡトランスジェニック植物をＧ６３と命名する）を、公開された方法（Ko ncz及びSchell，1986）に従って滅菌タバコＳＲ１植物から作成したリーフディスクを接種するために用いた。形質転換されたシュートを、スルフアジアジン（１００ｍg／L）上で選択した。植物を再生させ、スルフアジアジン（１００ｍg ／L）上で発根（rooting）について試験した。トランスジェニック植物を温室内で成熟するまで生育させ、種子を採集した。導入遺伝子の遺伝は、同じ培地上でのスルフアジアジンの存在下での種子の発芽によって試験した。ＳＲ１ｈｐｈ２植物は、滅菌条件下、ハイグロマイシン（１５ｍg／L）上で選択された実生から生育させた。Ｇ６３及びＧ６４植物を温室内でＳＲ１ｈｐｈ２植物と交雑させた。ｒecＡとｈｐｈ２導入遺伝子を含んでいる同胞（sibling）を、滅菌条件下、スルフアジアジン（１００ｍg／L）とハイグロマイシン（１５ｍg／L）の両方の存在下で、実生の生育により選択した。植物をそれ以上選択することなく成熟するまで生育させた。個々のトランスジェニック植物に連続的に番号を付した。スルホンアミドを含む選択培地上で発根したシュートは耐性であるとみなし、さらなる分析のために選択した。 recＡ導入遺伝子の存在をサザンブロットにより確認した。サザンハイブリダイゼーションのために、葉から調製した全ＤＮＡ（Murray及びThompson，1980）をＥcoＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によりフラグメントを分離し、ナイロン膜にブロットした（Zetaprobe，Biorad）。この膜を製造元の指針に従い、Feinberg及びVogelstein（1984）によって記載されたとおりに放射能標識したプローブとハイブリダイズさせた。recＡ配列をコードするフラグメントを、全遺伝子をカバーするｐＲecＡ−４由来のフラグメントを用いて検出した。挿入物のコピー数をＳul^r及びrecＡ遺伝子から得られたボーダーフラグメントに特異的なプローブを用いて決定した。１２のスルホンアミド耐性Ｇ６４植物のうち１１が無損傷のrecＡ導入遺伝子を有することが分かった。シングルコピー挿入物を有する植物は選択され、スルホンアミド耐性マーカーがシングルのメンデル特質（Mandelian trait）としてその子孫に遺伝することが示された。対照的に、３６のＧ６３植物のうち３つのみが、無損傷のnt−recＡ遺伝子を有していることが分かった。そのうちの１つであるＧ６３／１９は、Ｔ−ＤＮＡのライトボーダーが欠損していた。この欠損は、nt−recＡ発現を調節する３５Ｓプロモーター配列の植物ゲノム配列への融合をもたらした。他のトランスジェニック植物系は、recＡ配列がないか又は再編成されたnt−recＡ遺伝子を有するかのいずれかであった。３つの独立したトランスジェニック植物における無損傷のnt−recＡ導入遺伝子は、単一のコピーで存在し、単一のメンデル特質として遺伝することが示された。 recＡ及びｎｔ−ｒｅｃＡ遺伝子の発現を、ＲecＡ特異的モノクローナルマウス抗体（Ikedaら，1990）でプローブする、葉のタンパク質抽出物のウェスタン・ブロッティングを用いてモニターした。始めに、タンパク質を滅菌培地で培養した植物の葉から抽出した。葉を、海砂（sea sand）を加えたLaemmliサンプル緩衝液（Laemmli，1970）を用い、エッペンドルフチューブ中、ガラス棒を用いて摩砕した。試料を１５分間９５℃で熱変性させた後、抽出物を遠心分離により透明にし、上清をさらなる分析に使用した。タンパク濃度を測定し（Bradford，19 76）、５０μgを、Laemmli（1970）に従ってポリアクリルアミドゲル電気泳動に使用した。タンパク質を、記載されたとおり（Towbin，1979）、ニトロセルロース膜（Schleicher及びSchull，孔サイズ０.４５μｍ）に移した。ＲecＡタンパク質を、ＴＢＳＴ緩衝液で１：２００に希釈したモノクローナル抗体ＡＲＭ４１４（Ikedaら，1990）を用い、５％脱脂乾燥ミルクによる非特異的タンパク結合をブロック後に検出した。アルカリホスファターゼをカップリングした二次抗体（ヤギ抗マウス，Promega）及びＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Promega）染色、又は西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた抗マウス二次抗体及び化学蛍光（ＥＣＬ，Am ersham）を用いてブロットを発色させた。無損傷のrecＡ又はnt−recＡ遺伝子を有する植物はすべて、このようにＲecＡタンパク質を発現することが示された。Ｇ６４植物（ＲecＡ）における発現は、大部分の形質転換体の間で同様であり、染色強度と精製ＲecＡタンパク質の一連の希釈物の染色強度との比較から判断して、総植物タンパク質の約０.１％の量であった。nt−ＲecＡの発現レベルは、総タンパク量の０．０１％（Ｇ６３／１７）〜０．１％（Ｇ６３／１９）の範囲であった。ＲecＡ及びnt−ＲecＡタンパク質のいずれも植物細胞中で安定であるようであり、予想どおりの分子量を示した（第５図）。nt−ＲecＡトランスジェニック植物においては、少量のさらなるタンパク質が抗体で検出された。これらのタンパク質は低分子量であるので、恐らくnt−ＲecＡタンパク質の分解産物であろう。細胞におけるＲecＡ及びnt−ＲecＡタンパク質の所在を間接的な免疫蛍光法によって調べた。比較しうる発現レベルを有する植物を選択し（Ｇ６４／２及びＧ６３／１９）、プロトプラスト又はルートスカッシュ（root squash）を調製した。プロトプラストの調製は、ＲecＡ及びnt−ＲecＡタンパク質の免疫組織化学的ローカリゼーション（localisation）のために、Negrutiu（1987）の方法に従って行った。タンパク質を、室温にて、５％ホルムアルデヒドで固定した（２ｍL Ｋ3，０．４Ｍスクロース中１０⁵個のプロトプラスト）。ホルムアルデヒドをＷ５中で洗浄して除去し、クロロフィルをメタノールにより抽出した。ＴＢＳＴ中の５％ＢＳＡ中で、プロトプラスト調製物を１時間インキュベーションすることにより非特異的結合をブロックした。プロトプラストを遠心分離により集め、ＴＢＳＴ中、抗ＲecＡ抗体ＡＲＭ４１４（１：５０）とインキュベーションした。５％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ緩衝液で十分に洗浄した後、プロトプラストをＦＩＴＣ標識抗体マウス抗体（Promega，１：1000）とインキュベーションした。結合しなかった抗体を５％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴで洗浄することにより除去した。核を、同一の緩衝液中で、ＤＡＰＩ（２μg／ｍL）により染色した。調製物を蛍光顕微鏡法（Zeiss Axiophot）を用いて調べた。メタノール：酢酸（３：１）中で葉及び根を１時間室温で固定の後に、ＲecＡ及びnt−ＲecＡタンパク質を若い植物由来の全組織においてローカライズした。組織をＫ3培地で平衡化し、同じ培地中で０．９％セルロースと一晩インキュベーションした。酢酸中で５分間インキュベーションした後、組織をスライドに移しスカッシュした。抗ＲecＡ抗体による染色は、プロトプラストについて上に記載したように行った。Ｇ６３／１９植物において、ＦＩＴＣ蛍光は核内にほぼ限られて見られた（第６図）。クロロプラストにもみられる染色も幾つかあった。対照的に、Ｇ６４／２細胞においては、核は特には染色されなかった。しかし、核との会合及び核に周辺の領域での集中については、弱い優先性があるようであった（第６図）。非トランスジェニックＳＲ１タバコ植物においては、バックグランドの染色のみが観察された。nt−ＲecＡにおけるＳＶ４０核局在化配列は、植物細胞の核におけるこのタンパク質の効果的な蓄積をもたらすと結論できる。実施例４：ＲecＡ及びnt−ＲecＡの発現はマイトマイシンＣに対する耐性の増加をもたらす。植物の生育に対するマイトマイシンＣの影響を分析するため、定量的で再現性のある分析を用いた。単一の植物細胞の運命を追跡することができるLabelら（1 993）によって記載された系をさらに発展させ、マイトマイシンＣに対するより大きい感受性、及びモノトニック（monotonic）な生存−用量−応答曲線を得た。この系では、滅菌培養したタバコＳＲ１植物よりプロトプラストを調製し、同様の調製物を様々な濃度のマイトマイシンＣで処理した。次いで、プロトプラストをビーズタイプの培地中でマイトマイシンＣの存在下で培養した。未処理のプロトプラストは活発に分裂し、４〜８週間の間にミクロカルスを形成した。実験の詳細は以下の通りである： Negrutiu（1987）によって記載された方法に若干の修飾を加えて、無菌的に生育させた植物の葉からプロトプラストを調製した。切断した葉（３ｇ）を、１４５ｍｍのペトリ皿中、５０ｍL Ｋ3，０.４Ｍスクロース，１ｍｇ／LＮＡＡ，０．２ｍg／Lキネチン，０．６％セルラーゼオノヅカＲ１０（Serva），０．３％マセロザイムＲ１０（Serva）中で、２２℃にて、暗所で１６時間消化した。プロトプラストをスチールシーブ（メッシュ幅２５０μｍと１００μｍ）で濾過して、Ｗ５培地中で１回洗浄した。プロトプラストを１ｍLのＭaＭg緩衝液（０.５Ｍマンニトール、１５mＭＭgＣl₂，０.１％ＭＥＳ，ｐＨ５.７）中に懸濁し、光学顕微鏡下で計数し、Ｋ3，０．４Ｍスクロースで終濃度１０⁶細胞／ｍLに希釈した。プロトプラスト溶液１ｍLを９ｍL Ｋ3，０．４％スクロース培地で希釈し、マイトマイシンＣをストック溶液より加え、第７図に示した終濃度にした。暗所で、２２℃で２日間インキュベーションした後、Shillitoら（1983）のビーズタイプ法を若干修飾した方法を用いてプロトプラストを培養した。ゲル化剤として０．８％低融点アガロース（ＦＭＣ）を含む同体積の培地で希釈することにより、プロトプラストを包埋し、２０ｍL液体培地中の固体支持担体系（濾紙ディスク）上で培養した。週ごとに培地を交換しながら、培養細胞を約４週間培養した。ミクロカルスが２〜４ｍｍに達したら生存と評価した。植物を典型的なサンプルから再生した。これらの植物は、なんら生育異常が観察されなかった。典型的な対照実験においては、プレートしたプロトプラストの１０％〜２０％がミクロカルスに生育した。マイトマイシンＣの濃度の増加にしたがって、ミクロカルスの形成が段々阻害される（第７図）。４０μg／ｍL及びそれを越える濃度では生育は観察されなかった（対照値の１０^-3％未満）。生存曲線は、マイトマイシンＣに対する耐性を生じる修復機構の存在を示唆する低用量の肩（Should er）に続き、もはや内因性修復機構による修復ができない損傷を引き起こす高用量のマイトマイシンＣでの半対数領域を示した。 recＡ導入遺伝子についてホモ接合性の植物のプロトプラスト（Ｇ６４／２）は、マイトマイシンＣの毒性効果に対して、対照の細胞と比較して僅かではあるが有意により耐性であった。４０μg／ｍLのマイトマイシンＣの濃度で、細胞の０.１％以上が生存しミクロカルスに生育した（第７図）。しかし、５０μg／ｍL以上のマイトマイシンＣ濃度では、recＡトランスジェニック細胞は生育しなかった（対照値の１０^-3％未満）。対照的にnt−recＡトランスジェニックプロトプラスト（ホモ接合性Ｇ６３／１９）の０．１％以上が、６０μg／ｍLまでのマイトマイシンＣ濃度、すなわち試験した最高濃度で生育及び再生可能であった（第７図）。実施例５：ＲecＡ及びnt−ＲecＡによって染色体マーカーの染色体内組換えが刺激される植物は通常、大量の反復ＤＮＡ配列を含んでいる。これらの配列内の組換えは、ゲノム進化においてある役割を担っているらしい（Flavell，1982を参照）。植物における染色体内組換えのプロセスを調べるために、Peterhansら（1990）はトランスジェニック系を開発した。選択可能なマーカー遺伝子ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（nptＩＩ，Beckら，1982）の欠失誘導体のペアを、タバコゲノムに安定に組み込んだ。欠失は遺伝子の５'又は３'末端のいずれかの部分を除去して、それを非機能的にした。ＳＲ１ｈｐｈ２系列（Peterhansら，199 0）におけるセグメントは、３５２ｂｐホモローガスオーバーラップを直に反復する方向に向き、機能的ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Va nden Elzenら，1985）によって中断されている。この系列では、基本モジュールが、３つの強く結合したコピーとしてゲノムに存在していた。機能的nptＩＩ遺伝子の修復につながる染色体内組換えの結果は、組織培養におけるカナマイシン耐性の選択により容易に検出することができる。ＲecＡ及びnt−ＲecＡ発現の染色体内組換えに対する影響を調べるために、欠損nptＩＩ遺伝子を含むＳＲ１ｈｐｈ２系列を、ホモ接合性系列Ｇ６４／２及びＧ６３／１９とそれぞれ交雑させた。欠損nptＩＩ遺伝子並びにrecＡ及びnt−re cＡをそれぞれ有する子孫植物を、ハイグロマイシン及びスルホンアミド上の種子発芽によって選択した。両方の抗生物質に耐性の植物を、さらに選択することなく滅菌培地状態で培養し、葉肉プロトプラストを実施例４で記載したように調製した。染色体内組換えの結果の数を測定するために、培養細胞を、包埋後にカナマイシン１００μg／ｍLの存在下に６〜８週間培養した。再生頻度を測定するために、同一の条件下でカナマイシンなしで培養した。ミクロカルスの代表的なサンプルから植物を再生して、カナマイシンに対する耐性を確認した。プロトプラストをプレートし、ミクロカルスが現れるまで培養した。選択の非存在下でミクロカルスを形成したプロトプラストの数（再生頻度）を、それぞれのプロトプラストのバッチについて測定し、その数は全プロトプラスト調製物の約２０〜３０％であることが分かった。カナマイシン存在下で再生したプロトプラストの数を測定した。染色体内組換えの頻度は、非選択性培地上で現れたカルスの全数に対するカナマイシン上で生育したミクロカルスの数から計算した。２０のカナマイシン耐性ミクロカルスを、植物への再生のためにランダムに選択した。すべての再生した植物は、カナマイシン含有培地上で根を形成し、カナマイシンの存在下で生育したカルスが抗生物質に対し確かに耐性であることが確認された。染色体内組換えの頻度は、対照系列ＳＲ１ｈｐｈ２において１.０４×１０^-5 であった。対照的にＧ６４／２×ＳＲ１ｈｐｈ２及びＧ６３／１９×ＳＲ１ｈｐｈ２における頻度はそれぞれ、５.３７×１０^-5及び１０.３×１０^-5であった（第８図）。これらのデータは、ＲecＡタンパク質が、特に核にターゲティングされた場合に、植物の染色体及び宿主組換え機構と相互作用し、染色体内体細胞組換えのレベルを著しく増加させることが可能であることを示す。実施例６：エコトロピックnt−ＲecＡ発現による植物における遺伝子ターゲティングの増強種子特異的（seed specific）高分子量グルテニン（ＨＭＷ）プロモーター（C olotら，1987）及びｐＢＲ３２２及び植物においてメトトレキセート耐性を与える選択可能マーカーからなるさらなる配列を含むキメラ標的領域（locus）を作成した。この構築物を得るために、ＨＭＷプロモーターをＥcoＲＩ／ＢamＨＩフラグメントとしてバイナリーベクターｐＭＮ００１（Reissら，1994）中へクローンした。得られたプラスミドをエレクトロポレーションによりアグロバクテリウム（ＧＶ３１０１ｐＭＰ９０ＲＫ，Koncz及びSchell，1986）へ移入し、得られた株を公開された方法（Martonら，1982；De Blockら，1984；Marton，1984;H orschら，1985）に従ってリーフディスク感染によるトランスジェニックタバコＳＲ１植物の作製に使用した。これらの植物を、サザンブロッティングによりキャラクタリゼーションし、単一のコピーでキメラ標的領域を含む１つの系列をＢ１８／４と命名した。この系列は種子においてＮＰＴＩＩを発現するが、葉においては感受性酵素アッセイを用いて活性は検出されなかった（Reissら，1984）。カルスをこれら植物由来のリーフディスク上に誘導すると、すぐに緑色の生命物体（living material）がメトトレキセート上で発生したが、カナマイシン上ではカルスは形成しなかった。これらの植物をnt−ＲecＡタンパク質を発現するＧ６３／１９ＳＲ１植物と交雑させた（Reissら，1996）。Ｂ１８／４標的との相同的組換えによりＮＰＴＩＩの構成的発現をもたらす修復構築物を作成した。この構築物はＢ１８／４の作製に使用するものと同一であるが、ＨＭＷプロモーターとnptＩＩ遺伝子との間のBamＨＩ部位に挿入された、全組織において発現するプロモーターすなわちＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含んでおり、nptＩＩ遺伝子は非機能性変異体Ｄ４２であり、これはカルボキシ末端欠失を含んでおり大腸菌において非活性なタンパク質を生じることが示された（Beckら，1982）。このプラスミドをアグロバクテリウム（ＧＶ３１０１ｐＭＰ９０ＲＫ）へ上で記載したように導入し、Ｇ１２５株を得た。遺伝子ターゲティングを分析するために、Ｂ１８／４と交雑させたＧ６３／１９植物より得た同胞をメトトレキセート及びスルホンアミド上で選択し、両方の導入遺伝子の組の存在について選択した。リーフディスクを調製し、修復構築物を含むアグロバクテリウムＧ１２５株で形質転換した。対照の形質転換体では、メトトレキセート上の選択の後、合計５８のＳＲ１リーフディスクからＧ１２５により５００個のカルスが得られた。このことによって、Ｇ１２５が完全に機能することが実証された。全体で、Ｂ１８／４×Ｇ６３／１９由来の１８９のリーフディスクがＧ１２５により感染し、カナマイシン上の選択により２１のカナマイシン耐性カルスが得られた。耐性カルスが、可能性のある遺伝子ターゲティング結果により得られたのかどうかを決定するために、それらのうちの９つから全ゲノムＤＮＡを調製した。ＤＮＡを、３５Ｓプロモーター制御下の無損傷のｎｐｔＩＩ遺伝子に特異的なプライマーペア（３５Ｓプロモーターの−９０領域に対してホモローガスなプライマー１：５’GTG GAT TGA TGT GAT ATC TCC ３’（配列番号３）；Ｄ４２において欠失したｎｐｔＩＩ遺伝子にホモローガスなプライマー２：５’CCG CTC AGA AG A ACT CGT CA ３’（配列番号４））を用いてＰＣＲにより増幅した。このプライマーペアによる修復されたnptＩＩ遺伝子の増幅について予期された、予想した大きさのフラグメントを６つのカルスにおいて得た。Ｂ１８／４母系統及び残りの３つのカルス由来のＤＮＡからは増幅産物は得られなかった。これらの結果は、試験した９つのカルスのうち６つにおいて、３５Ｓプロモーター制御下の無損傷のｎｐｔＩＩ遺伝子の存在を示している。カナマイシン耐性だがＰＣＲネガティブである３つのカルスのｎｐｔＩＩ遺伝子は、恐らくは、遺伝子ターゲティングによってではなく、ソマクローナル変異によって活性化された。Ｇ１２５による形質転換によって葉組織において発現した無損傷ｎｐｔＩＩ遺伝子の修復の頻度を以下のように計算することができる：対照実験における形質転換頻度は、リーフディスク５８あたり形質転換体50０、すなわち８．６／リーフディスクであった。よって、合計１８９の形質転換体されたＢ１８／４×Ｇ６３／１９リーフディスクでは、約１８９×８．６＝１６２５の形質転換体が、カナマイシン上の選択なしで生じると予想された。検出されたカナマイシン耐性カルスの数は２１であった。従って、これらのカルスは２１／１６２５、すなわち約１．３％の頻度で現れる。９つの代表的なサンプルのうち、６つが修復されたｎｐｔＩＩ遺伝子を含んでいた。従って、この実験におけるターゲティングの頻度は０．８７％であった。本明細書に記載したシステムと同様のトランスジェニック標的領域は以前に使用されたものである。アグロバクテリウム媒介の形質転換を用いてこれら標的領域について観察されたターゲティング頻度は１０^-4程度であった（Offringaら， 1990）。これらの実験を直接比較できないかもしれないが、我々が観察した頻度の大きな増加は、ＲecＡ発現の剌激的役割を示している。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年７月２１日（１９９７．７．２１）【補正内容】請求の範囲１．以下の工程（ａ）（ａａ）生物又は細胞へのＤＮＡの挿入、（ａａａ）該ＤＮＡは、トランスジェニック生物又はトランスジェニック細胞に１又はそれ以上の所望の特性を与えるものであり、（ａａｂ）さらに、該ＤＮＡは該生物又は該細胞において発現可能な少なくとも１つの選択マーカーをさらにコードするものであり、（ａａｃ）所望により、該ＤＮＡは、相同的組換えを刺激することが可能な組換え促進酵素又は酵素的に活性な誘導体もしくはその一部をコードするものであって、該組換え促進酵素又はその酵素的に活性な部分が所望の特性又はその特性のうちの１つを与えるものである。あるいは（ａａｃ）を適用しない場合は、（ａｂ）前記ＤＮＡ（ａａ）と組み合わせた、相同的組換えを刺激することが可能な組換え促進酵素又は酵素的に活性な誘導体若しくはその一部の、生物又は細胞への挿入（ｂ）（ａ）に記載の前記ＤＮＡ又は前記ＤＮＡと前記タンパク質を取り込んだトランスジェニック生物又は細胞の選択；及び（ｃ）適当な培地における所望のトランスジェニック生物又は所望のトランスジェニック細胞の培養を含んでなる、トランスジェニック生物又はトランスジェニック細胞の作製方法。２．該トランスジェニック生物又はトランスジェニック細胞が植物又は植物細胞である請求項１に記載の方法。３．該植物又は植物細胞が、Nicotiana tabacum又はArabidopsis thalianaであるか又はそれに由来するものである請求項２に記載の方法。４．該トランスジェニック生物又はトランスジェニック細胞が、哺乳類又は哺乳類細胞、菌類、酵母又は細菌である請求項１に記載の方法。５．該所望の特性が、相同的組換えの刺激、遺伝子ターゲティングの増強、ＤＮＡ損傷の修復のための内因性機構の刺激である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。６．該選択マーカーが、Ｈｙｇ^R、Ｋｍ^R、ＰＰＴ^R、Ｍｔｘ^R又はＳｕｌ^Rである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。７．該組換え促進酵素が、大腸菌ＲecＡタンパク質である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。８．該組換え促進酵素の該誘導体が、大腸菌ＲecＡタンパク質と核ターゲティング配列との融合タンパク質である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。９．該核ターゲティング配列が、ＴＳＶ４０核ターゲティング配列である請求項８に記載の方法。１０．該挿入が、植物形質転換におけるＰＥＧ形質転換、アグロバクテリウム形質転換、エレクトロポレーション、パーティクル衝撃、リポソーム融合、リン酸カルシウム沈殿又はウイルス感染によって媒介されるものである請求項１〜９のいずれかに記載の方法。１１．請求項１〜１０のいずれかに記載の方法によって得られるトランスジェニック生物又はトランスジェニック細胞。１２．相同的組換えを刺激することが可能な組換え促進酵素又はその酵素的に活性な一部をコードするＤＮＡに作用可能なように結合した、核ターゲティング配列をコードするＤＮＡ、少なくとも１つの選択マーカー、及び場合により、所望の特性をコードする少なくとも１つのさらなるＤＮＡを含むベクターであって、該ベクターによってコードされる核ターゲティング配列／組換え促進酵素融合タンパク質がＡＴＰase活性を有するものであるベクター。１３．該核ターゲティング配列が、ＴＳＶ４０核ターゲティング配列であり、及び／又は、組換え促進酵素が大腸菌ＲecＡタンパク質である請求項１２に記載のベクター。１４．ｐＳ／nt−ＲecＡ又はｐＥＶ／nt−ＲecＡであって、該ベクターの構築が実施例１に記載されている請求項１３に記載のベクター。１５．請求項１２〜１４のいずれかに記載のベクターの、又はＤＮＡにより形質転換される又はトランスフェクションされる細胞に１又はそれ以上の所望の特性を与えるＤＮＡであって該ＤＮＡが該細胞において発現可能な少なくとも１つの選択マーカーをさらにコードし、該ＤＮＡがさらに、相同的組換えを刺激することが可能な組換え促進酵素又は酵素的に活性な誘導体又はその一部をコードし、該組換え促進酵素又はその酵素的に活性な部分がその所望の特性若しくはそのうちの１つを与えるベクターの、環境の影響によって引き起こされる生物又は細胞における害を治療するための使用。１６．該害が、ＤＮＡの損傷、好ましくは紫外線照射、オゾン、ＳＯ₂、メチル化剤又は突然変異剤によって引き起こされるものである請求項１５に記載の使用。１７．請求項１２〜１４のいずれかに記載のベクターの、又はＤＮＡにより形質転換される又はトランスフェクションされる細胞に１又はそれ以上の所望の特性を与えるＤＮＡであって該ＤＮＡが該細胞において発現可能な少なくとも１つの選択マーカーをさらにコードし、該ＤＮＡがさらに、相同的組換えを刺激することが可能な組換え促進酵素又は酵素的に活性な誘導体又はその一部をコードし、該組換え促進酵素又はその酵素的に活性な部分がその所望の特性若しくはそのうちの１つを与えるベクターの、哺乳類又は哺乳類細胞における遺伝子治療のための使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 5/10 9/00 // Ｃ１２Ｎ 9/00 5/00 ＣＢ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者クレム，マンフレートドイツ連邦共和国デー−50259プルハイム、ロベルト−コッホ−シュトラーセ19番 (72)発明者シェル，イェフドイツ連邦共和国デー−50829ケルン、カルル−フォン−リンネ−ヴェーク12番

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の工程（ａ）（ａａ）生物又は細胞へのＤＮＡの挿入、（ａａａ）該ＤＮＡは、トランスジェニック生物又はトランスジェニック細胞に１又はそれ以上の所望の特性を与えるものであり、（ａａｂ）さらに、該ＤＮＡは該生物又は該細胞において発現可能な少なくとも１つの選択マーカーをさらにコードするものであり、（ａａｃ）所望により、該ＤＮＡは、組換え促進酵素又は酵素的に活性な誘導体もしくはその一部をコードするものであって、その組換え促進酵素又はその酵素的に活性な部分が所望の特性又はその特性のうちの１つを与えるものである。あるいは（ａａｃ）を適用しない場合は、（ａｂ）前記ＤＮＡ（ａａ）と組み合わせた、組換え促進酵素又は酵素的に活性な誘導体若しくはその一部の、生物又は細胞への挿入（ｂ）（ａ）に記載の前記ＤＮＡ又は前記ＤＮＡと前記タンパク質を取り込んだトランスジェニック生物又は細胞の選択；及び（ｃ）適当な培地における所望のトランスジェニック生物又は所望のトランスジェニック細胞の培養を含んでなる、トランスジェニック生物又はトランスジェニック細胞の作製方法。２．該トランスジェニック生物又はトランスジェニック細胞が植物又は植物細胞である請求項１に記載の方法。３．該植物又は植物細胞が、Nicotiana tabacum又はArabidopsis thalianaであるか又はそれに由来するものである請求項２に記載の方法。４．該トランスジェニック生物又はトランスジェニック細胞が、哺乳類又は哺乳類細胞、菌類、酵母又は細菌である請求項１に記載の方法。５．該所望の特性が、相同的組換えの刺激、遺伝子ターゲティングの増強、ＤＮＡ損傷の修復のための内因性機構の刺激である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。６．該選択マーカーが、Ｈｙｇ^R、Ｋｍ^R、ＰＰＴ^R、Ｍｔｘ^R又はＳｕｌ^Rである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。７．該組換え促進酵素が、大腸菌ＲecＡタンパク質である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。８．該組換え促進酵素の該誘導体が、大腸菌ＲecＡタンパク質と核ターゲティング配列との融合タンパク質である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。９．該核ターゲティング配列が、ＴＳＶ４０核ターゲティング配列である請求項８に記載の方法。１０．該挿入が、植物形質転換におけるＰＥＧ形質転換、アグロバクテリウム形質転換、エレクトロポレーション、パーティクル衝撃、リポソーム融合、リン酸カルシウム沈殿又はウイルス感染によって媒介されるものである請求項１〜９のいずれかに記載の方法。１１．請求項１〜１０のいずれかに記載の方法によって得られるトランスジェニック生物又はトランスジェニック細胞。１２．組換え促進酵素又はその酵素的に活性な一部をコードするＤＮＡに作用可能なように結合した、核ターゲティング配列をコードするＤＮＡ、少なくとも１つの選択マーカー、及び場合により、所望の特性をコードする少なくとも１つのさらなるＤＮＡを含むベクターであって、該ベクターによってコードされる核ターゲティング配列／組換え促進酵素融合タンパク質がＡＴＰase活性を有するものであるベクター。１３．該核ターゲティング配列が、ＴＳＶ４０核ターゲティング配列であり、及び／又は、組換え促進酵素が大腸菌ＲecＡタンパク質である請求項１２に記載のベクター。１４．ｐＳ／nt−ＲecＡ又はｐＥＶ／nt−ＲecＡであって、該ベクターの構築が実施例１に記載されている請求項１３に記載のベクター。１５．請求項１２〜１４のいずれかに記載のベクターの、又はＤＮＡにより形質転換される又はトランスフェクションされる細胞に１又はそれ以上の所望の特性を与えるＤＮＡであって該ＤＮＡが該細胞において発現可能な少なくとも１つの選択マーカーをさらにコードし、該ＤＮＡがさらに組換え促進酵素又は酵素的に活性な誘導体又はその一部をコードし、該組換え促進酵素又はその酵素的に活性な部分がその所望の特性若しくはそのうちの１つを与えるベクターの、環境の影響によって引き起こされる生物又は細胞における害を治療するための使用。１６．該害が、ＤＮＡの損傷、好ましくは紫外線照射、オゾン、ＳＯ₂、メチル化剤又は突然変異剤によって引き起こされるものである請求項15に記載の使用。１７．請求項１２〜１４のいずれかに記載のベクターの、又はＤＮＡにより形質転換される又はトランスフェクションされる細胞に１又はそれ以上の所望の特性を与えるＤＮＡであって該ＤＮＡが該細胞において発現可能な少なくとも１つの選択マーカーをさらにコードし、該ＤＮＡがさらに組換え促進酵素又は酵素的に活性な誘導体又はその一部をコードし、該組換え促進酵素又はその酵素的に活性な部分がその所望の特性若しくはそのうちの１つを与えるベクターの、哺乳類又は哺乳類細胞における遺伝子治療のための使用。