JP2000507809A

JP2000507809A - マルチパラメーター蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション

Info

Publication number: JP2000507809A
Application number: JP9519215A
Authority: JP
Inventors: ウォード，デビット・シー; スペイチャー，マイケル; バラード，スティーブン・ジー
Original assignee: Yale University
Current assignee: Yale University
Priority date: 1996-05-01
Filing date: 1996-12-20
Publication date: 2000-06-27

Abstract

(57)【要約】本発明は、コンビナトリアル的に標識されたオリゴヌクレオチドプローブの組であって、その各メンバーが、（ｉ）前記組の別のメンバーの標識と区別可能な予め決定された標識を有し；かつ（ｉｉ）ヒト核型の１つの予め決定された常染色体または性染色体に特異的にハイブリダイズすることができる組、およびヒト核型の個々の常染色体または性染色体を同定するためにそのような分子を使用することに関する。

Description

【発明の詳細な説明】マルチパラメーター蛍光in situハイブリダイゼーション発明の分野本発明は、核酸化学、より詳細には染色体および染色体フラグメントの多重画像分析を達成するための試薬および方法に関する。本発明は、染色体異常、病原体などの判定に利用できる。本発明は一部は政府基金を用いてなされた。政府は本発明に一定の権利をもつ。関連出願の引照この国際特許出願は、1995年12月22日出願の米国特許出願第08/577,622号（現在は放棄）、1995年12月29日出願の米国特許出願第08/580,717号（現在は放棄）、および1996年5月1日出願の米国特許出願第08/640,657号（未決）の一部継続出願である。これらが本明細書に参考として含まれるものとする。発明の背景生物学的試料中の染色体および染色体フラグメントの存在や状態を判定するのは、疾病の診断にきわめて重要である。従来このような判定は、特徴的バンド形成パターンを解明するために特殊な染色法で処理した中期染色体標本を検査することにより、手作業で行われていた。残念ながらこのようなバンド形成パターンの解釈にはかなりの熟練を必要とし、技術的にも困難である。したがって、染色体の存在や状態を分析するための別法が求められている。染色体の同定という問題を解決するための別法のひとつは、標識した染色体特異性オリゴヌクレオチドプローブを用いて、間期染色体の反復配列を標識するものである（Cremer,T.,et al.,Hum.Genet.,74:346-352(1986);Cremer,T.,et al., Exper.Cell.Res.,176:119-220(1988)）。このような方法は、ダウン症候群の出生前診断、および腫瘍細胞系に付随する染色体異常の検出には有用であることが示された。しかし、ある染色体の別個の小領域に局在する反復ＤＮＡの染色体特異性プローブは、多くのタイプの染色体異常（たとえば転座または欠失）の分析に適さない。 Ward,D.C.ら（国際特許出願公開第WO/05789号、本明細書に参考として含まれるものとする）には、染色体異常を認識できる様式で特定の哺乳動物染色体を特異的に標識するための染色体in situ抑制（chromosomal in situ suppression（ “ＣＩＳＳ”））ハイブリダイゼーション法が開示されている。その方法では、試料ＤＮＡを変性させ、そして高い遺伝子複雑度をもつ蛍光標識した染色体特異性プローブおよび標識していない染色体非特異性競合プローブの混合物とハイブリダイズさせる。染色体画像はManuelidisら（Chromosoma 96:397-410(1988)、本明細書に参考として含まれるものとする）が記載した方法で得られた。この方法によれば、個々の哺乳動物染色体を迅速に、高い特異性で評価できる。この方法では、適切なプローブおよび／または標識を慎重に選択することにより、標本中の染色体の一部または全部の小領域を視覚化できる。たとえば、それぞれ標的染色体の小領域に特異的な２以上のプローブを用いることにより、この方法でその染色体上の幾つかの小領域を同時に分析できる。利用可能な発蛍光団の数が、同時に視覚化できる染色体または染色体小領域の数を制限する。国際特許出願公開第WO/05789号に記載されるように、ＣＩＳＳ法の“コンビナトリアル”変法を利用できる。最も簡単な例では、２つの蛍光体で３つの異なる染色体または染色体小領域を同時に視覚化できる。この方法では、それぞれ異なる発蛍光団で別個に標識した半分ずつから構成された一組のプローブ配列により、ハイブリダイゼーションプローブ混合物を調製する。ハイブリダイズすると、これら２つの発蛍光団が、これら個々の発蛍光団の色と光学的に区別できる第３の蛍光信号を発する。この方法をｎ個の発蛍光団のブール組合わせ（Boolean co mbination）に拡張すると、２ⁿ−１個の染色体の標識が可能となる。 Ried,T.ら（Proc.Natl.Acad.Sci,(U.S.A.),89:1388-1392(1992)、本明細書に参考として含まれるものとする）は、ディジタル画像カメラを備えたエピ蛍光顕微鏡（epi-fluorescent microscope）、および３つの発蛍光団を用いた７種類のプローブによる同時in situハイブリダイゼーションで得た蛍光パターンを“擬似カラー化する（pseudocolor）”ためのコンピューターソフトウェアの使用につき記載している。波長選択フィルターの使用により、発蛍光団それぞれの別個のグレースケール画像を分離し、収集できる。次いで、これらの画像を適切なソフトウェアにより組み合わせることができる。ＣＣＤカメラの感度と線形性により、カラーフィルム式の顕微鏡撮影法に固有の技術的困難さが克服される。このような努力によりin situハイブリダイゼーション法で同時に検出、分析できる染色体の数は増加したが、多数の異なる染色体および染色体小領域を同時に検出、分析できるためには、区別できる発光スペクトルをもつ一組の発蛍光団を定めることがきわめて望ましい。本発明はこのような試薬、ならびにそれらの方法および装置を提供する。発明の要旨本発明は、全部で２２の常ヒト染色体およびヒトＸおよびＹ染色体、またはそれらの定義されたサブ領域の可視化並びに同時同定を可能にするのに十分な核酸プローブの組み合わせ標識のための試薬と方法に関する。全染色体またはそれらの定義されたサブ領域のそのような特異的標識は「ペインティング」と称される。詳細には、本発明は、一セットの組み合わせ的に標識されたオリゴヌクレオチド（またはポリヌクレオチド）プローブであって、それらの各メンバーは：（ｉ）そのセットの他のメンバーの標識とは区別できる予め決定された標識を有し、そして（ii）ヒト核型の一つの予め決定された常または性染色体と特異的にハイブリダイズすることができ；そのセットはヒト核型の各々の常または性染色体を少なくとも一つのメンバーに特異的にハイブリダイズさせて、そのように標識されたヒト核型の各々の常または性染色体の区別可能な標識を粒子的に可能にするのに十分なメンバーを有する、一セットのプローブを提供する。本発明は特に、そのセットのメンバーがフルオロフォアで検出可能に標識されていて、そのセットの少なくとも１つのメンバーが、フルオロフォアＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７から成る群から選択されるいずれか１、２、３、４または５のフルオロフォアで組み合わせ的に標識されていて、そしてそのセットの各メンバーは上記フルオロフォア群から選択される少なくとも１つのフルオロフォアで標識されている、実施態様を構想する。本発明はさらに、ヒト核型の個々の常および性染色体を同時に同定および区別するための方法であって：（ａ）一本鎖形態の染色体の試料を、核酸ハイブリダイゼーションが生じるのを可能にするのに十分な条件下で、一セットの組み合わせ的に標識されたオリゴヌクレオチドプローブと接触させ、それらの各メンバーは：（ｉ）そのセットの他のメンバーの標識とは区別できる予め決定された標識を有し、そして（ii）ヒト核型の一つの予め決定された常または性染色体と特異的にハイブリダイズすることができ；そのセットはヒト核型の各々の常または性染色体を少なくとも一つのメンバーに特異的にハイブリダイズさせ得るのに十分なメンバーを有し；ここで接触により、試料の各々の常または性染色体の少なくとも１つはプローブのセットの少なくとも１つのメンバーにハイブリダイズするようになり；（ｂ）プローブのセットのメンバーにハイブリダイズした試料の各々の染色体について、そのメンバーの予め決定された標識を検出および同定し、そのメンバーの標識の同一性を、そのメンバーが特異的にハイブリダイズするヒト核型の常または性染色体の同一性と相関させ、それによってそのメンバーにハイブリダイズした染色体を同定し；そして（ｃ）ヒト核型の各々の常および性染色体が試料中で同定されるまで工程（ｂ）を繰り返す、工程を含む方法を提供する。本発明はさらに、ヒト核型の個々の常および性染色体を同時に同定および区別するための方法であって：（ａ）一本鎖形態の染色体の試料を、核酸ハイブリダイゼーションが生じるのを可能にするのに十分な条件下で、一セットの組み合わせ的に標識されたオリゴヌクレオチドプローブと接触させ、それらの各メンバーは：（ｉ）そのセットの他のメンバーの標識とは区別できる予め決定された標識を有し、そして（ii）ヒト核型の一つの予め決定された常または性染色体と特異的にハイブリダイズすることができ；そのセットはヒト核型の各々の常または性染色体を少なくとも一つのメンバーに特異的にハイブリダイズさせ得るのに十分なメンバーを有し；ここで接触により、試料の各々の常または性染色体の少なくとも１つはプローブのセットの少なくとも１つのメンバーにハイブリダイズするようになり；（ｂ）プローブのセットのメンバーにハイブリダイズした試料の各々の染色体について、干渉計（好ましくは通常の経路干渉計、最も好ましくはSagnacの通常の経路干渉計）を使用してそのメンバーの予め決定された標識を検出および同定し、そのメンバーの標識の同一性を、そのメンバーが特異的にハイブリダイズするヒト核型の常または性染色体の同一性と相関させ、それによってそのメンバーにハイブリダイズした染色体を同定し；そして（ｃ）ヒト核型の各々の常および性染色体が試料中で同定されるまで工程（ｂ）を繰り返す、工程を含む方法を提供する。図面の簡単な説明図１は、本方法に従って使用されたＣＣＤカメラおよび顕微鏡の模式図を提供する。図２は、骨髄患者（ＢＭ２８４６）由来の染色体の核型分析からの生データを示す。各々の源像に隣接するのは、ソフトウエアプログラムによって生成した染色体「マスク」である。図２において、パネルＡおよびＢは、ＤＡＰＩ像およびマスクであり；パネルＣおよびＤは、ＦＩＴＣ像およびマスクであり；パネルＥおよびＦはＣｙ３像およびマスクであり；パネルＧおよびＨはＣｙ３．５像およびマスクであり；パネルＩおよびＪはＣｙ５像およびマスクであり；そしてパネルＫおよびＬはＣｙ７像およびマスクである。図３Ａおよび３Ｂは、患者ＢＭ２４８６のスペクトル特徴による個々の染色体の同定を示す。図２は、グレースケールで疑着色されている以外は、図３Ａと同一の写真である。図３Ｂは染色体の核型整列を示す。好ましい実施態様の説明Ａ．本発明の概要蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、研究および臨床診断の幅広い領域で使用されている（Cray，J.W.他、Curr Opin Biotech 3:623- 631(1992);Xing，Y.他、In:The Causes and Consequences of Chromosomal Aber rations．I.R.Kirsch Ed．CRC Press，Boca Raton，3-28頁(1993)）。細胞核の染色体および染色体上の組織の研究のために、それは不可欠な道具である（Crem er,T.他、In:Cold Spring Harbor Symposiaon Quantitative Biology,Volume LV III，777-792頁，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY(1994)）。最も重要なことに、ＦＩＳＨはマルチパラメーター区別の能力を付与する。これにより、組み合わせ戦略（Nederlof，P.M.他、Cytometry 10:20-27(1989);Nederlof，P .M.他、Cytometry 11:126-131(1990);Ried T.他、Proc Natl Acad Sci（U.S.A） 89:1388-1392(1992a);Ried，T他、Hum Mol Genet 1:307-313(1992b);Lengauer， C.他、Hum Mol Genet 2:505-512(1993);Popp，S.他、Human Getetics 92:527-532(1993);Wiegant，J.他、Cytogenet Cell Genet 63:73-76(1 993)）または比率標識戦略（Dauwerse，J.G.他、Hum Mol Genet 1:593-598(1992 );Nederlof，P.M.他、Cytometry 13:839-845(1992);Du Manoir，S他、Hum Genet 90:590-610(1993)）のいずれかを使用して複数のＤＮＡプローブを同時可視化することが可能になる。１２個までのＤＮＡプローブが可視化された（Dauwerse 他、J.G.他、Hum Mol Genetl:593-598(1992)）。その結果、２４の異なる色の目標が長い間求められていた（Ledbetter，D.H.、Hum Mol Genet 5:297-299(1992) ）。２４の異なる色は、２２の常染色体および両方の性染色体の同時可視化を可能にするので、重要な限界値である。核型分析の改良の上に、２４の異なる区別可能なＤＮＡプローブを同時にハイブリダイズさせる可能性により、多数の重要な生物学的問題の処理が可能になるであろう。しかしながら、以前に公開された多色システムは２４色への拡大への可転性を欠いており、原理の証明実験のみが公開されている。本発明の一部は、組み合わせ標識戦略による２４の異なる遺伝的標的の同時可視化を達成するためのマルチパラメーターの蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションの実用化から生じている。この戦略により、スペクトル的に区別可能な標識が存在する場合よりも、より多くの標的配列間の区別が可能になる。そのような標識を実行する最も簡単な方法は、単純な「Boolean」組み合わせを使用することである。即ち、蛍光体(fluor)は完全に不在であるか（即ち、「０」の値が付与される）、単位量（１の値）で存在する。単一の蛍光体Ａについては、一つのみの有用な組み合わせ（Ａ＝１）が存在し、２つの蛍光体ＡとＢについては、３つの有用な組み合わせ（Ａ＝１／Ｂ＝０；Ａ＝０／Ｂ＝１；Ａ＝１／Ｂ＝１）が存在する。３つの蛍光体の７つの組み合わせ、４つの蛍光体の１５の組み合わせ、５つの蛍光体の３１の組み合わせ、６つの蛍光体の６３の組み合わせなどが存在する（ｎ個のフルオロフォアは、２ⁿ−１の染色体の標識を可能にする）。従って、染色体ペインティングプローブセットを使用してヒトゲノム中の全部で２４の染色体型を特異的に同定するためには、５つのみの区別可能な蛍光体が必要である（３１の全組み合わせ）。各々のプローブセットが、５つのスペクトル的に別個のフルオロフォアの１以上で組み合わせ様式で標識されれば、単純な Boolean組み合わせを使用して、そのフルオロフォア組成によって検出されたスペクトル特徴によって各々のＤＮＡプローブを同定することができる。Ｂ．本発明の用語本発明は、一セットの組み合わせ的に標識されたオリゴヌクレオチドプローブであって、それらの各メンバーは：（ｉ）そのセットの他のメンバーの標識とは区別できる予め決定された標識を有し、そして（ii）ヒト核型の一つの予め決定された常または性染色体と特異的にハイブリダイズすることができる、プローブに関する。最も好ましい実施態様では、そのセットは、上記ヒト核型の各々の常または性染色体を少なくとも１つのメンバーに特異的かつ区別可能的にハイブリダイズさせることができるのに十分な数のメンバーを有するであろう。本明細書で使用する場合、用語「核型」とは、正常または異常細胞中に見られる染色体のコンプリメント（compliment）を示す。正常細胞では、染色体の数は４６であり、２２対の常染色体と２個の性染色体（２個のＸ染色体（女性の場合）またはＸとＹ染色体（男性の場合）のいずれか）とを含む。標識は、セットのいずれか１つのメンバーの特定の標識（およびそのメンバーの同一性）がそのセットのいずれか他のメンバーの特定の標識および同一性と相違するという点で区別可能であると称される。各々のプローブメンバーは一つだけの染色体（またはサブ染色体領域）に特異的にハイブリダイズできるので、そして標識とプローブの同一性は前もって分かっているので、未同定の染色体領域と会合した特定の標識の検出は、その標識を有するプローブが未同定の染色体領域にハイブリダイズするようになったことを意味する。そのプローブが特異的にハイブリダイズする染色体は分かっているので、区別可能な標識の検出により染色体領域の同定が可能になる。より具体的には、本発明は、オリゴヌクレオチドプローブを標識するのに使用して、そのようなプローブをマルチパラメーター蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションで使用できるような蛍光体に関する。本明細書で使用する場合、「蛍光体」または「フルオロフォア」とは、励起により検出可能な蛍光シグナルを放出することができる試薬である。好ましい実施態様では、蛍光体は、修飾されたヌクレオチド残基に結合することができるリガンドに結合している。この目的のために最も好ましいリガンドは、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン −結合抗体およびジゴキシゲニン結合抗体である。そのような結合を行うための方法は、Pinkel，D.他、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)83:2934-2938(1986)に記載されており、これは引用により本明細書中に取り込まれる。あるいは、蛍光体はプローブのヌクレオチドのピリミジンまたはプリン環に直接結合させてもよい(Rie d，T他、Proc,Natl.Acad.Sci．(U.S.A.)89:1388-1392(1992)、これは引用により本明細書中に取り込まれる；米国特許第４，６８７，７３２号、４，７１１，９５５号、５，３２８，８２４号および５，４４９，７６７号、これらは各々引用により本明細書中に取り込まれる）。用語「マルチパラメーター蛍光」とは、同一の染色体またはサブ染色体断片を同時に標識するために複数の蛍光体を組み合わせて使用すること、並びにそれらの検出と特徴付けのことを意味する。染色体またはサブ染色体断片とは、それらを単一より多くの染色体特異的プローブに、各々の染色体特異的プローブがその標的染色体に独立してハイブリダイズするのを可能にするのに十分な条件下で、露出した場合に、同時に標識されると言われる。本明細書で使用する場合、従って、全てのそのようなハイブリダイゼーション反応が、同一の例で開始して終結することは不要である。本発明によって許容される同時標識は、従って、染色体が一度に一つだけの染色体特異的プローブに露出される方法とは対照的である。本発明により許容される同時検出および特徴付けは、最初の染色体の検出後にさらに別の試薬またはプローブの添加を必要とはしない、試料中の常および／または性染色体の複数（最も好ましくは全て）を検出する能力を意味する。最も簡単な実施態様では、染色体のデジタル像が、使用した各々のフルオロフォアについて得られ、それによって各々のフルオロフォアおよび各々の染色体に付随した一連のグレースケールの蛍光強度が得られる。最終的な像は各々の染色体について配合したグレースケールの強度を疑着色することによって得られる。従って、本発明は、ヒト核型の個々の常および性染色体を同時に同定および区別するための方法であって、一本鎖形態になるように予め処理されている染色体の試料を、組み合わせ的に標識されたオリゴヌクレオチドプローブの上記セットと、核酸ハイブリダイゼーションを生じさせるのに十分な条件下で、接触させることを含む方法を提供する。そのような処理により、試料の各々の常または性染色体の少なくとも１つが、プローブの上記セットの少なくとも１つのメンバーにハイブリダイズするようになる。プローブのセットのメンバーにハイブリダイズした試料の各々の染色体について、次いで、そのメンバーの予め決定した標識を検出および同定し、そのメンバーが特異的にハイブリダイズする上記ヒト核型の常または性染色体の同一性とそのメンバーの標識の同一性とを相関させる。このプロセスによって、そのメンバーにハイブリダイズした染色体が同定される。この最後の工程は、ヒト核型の各々のまたは所望の数の常および性染色体が試料中で同定されるまで反復される。本発明の方法に従って使用されるオリゴヌクレオチドプローブは、２つの一般的特徴のいずれかである。一つの実施態様では、そのようなプローブは、染色体またはセブ染色体特異的である（即ち、それらは、他の染色体のＤＮＡとよりも低いＣｏｔ^1/2で特定の染色体のＤＮＡとハイブリダイズする：Ｃｏｔ1/2は、プローブの初期濃度（Ｃｏ）の半分がその相補体にハイブリダイズするのに必要な時間である）。あるいは、そのようなプローブは、特徴（例えば、テロメア、セントロメアなど）特異的である。両方のタイプのプローブを所望により使用できる。そのようなプローブの出所源は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションおよび同様の寄託機関から入手可能である。本発明の方法によって使用されるオリゴヌクレオチドプローブは、プローブ浸透を許容し、再アニーリングハイブリダイゼーションを最適化するのに十分な大きさである。一般に、５００ヌクレオチドより小さい長さ、より好ましくは約１５０〜２００ヌクレオチドの長さの標識ＤＮＡ断片のプローブが使用される。そのような長さのプローブは、合成または半合成手段により作製することができ、あるいは制限エンドヌクレアーゼまたはＤＮＡ分子を断片化するのに適切な他の技術を使用して、より長いポリヌクレオチドから得ることができる。あるいは、（ポリヌクレオチドのような）より長いプローブを使用してもよい。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブは、ビオチニル化または他に修飾されたヌクレオチド残基を含むように合成される。そのようなビオチニル化または修飾の達成方法は、米国特許第４，６８７，７３２号；４，７１１，９５５号；５，３２８，８２４号；及び５，４４９，７６７号に記載されており、これらは各々引用により本明細書中に取り込まれる。ビオチニル化ヌクレオチドおよびプローブは、Enzo Biochem，Boehringer Mannheim、Amershamおよび他の会社から入手可能である。簡単に言うと、そのようなビオチニル化または他に修飾されたヌクレオチドは、ヌクレオシド又はヌクレオチドを水銀塩と水銀化されたヌクレオシドまたはヌクレオチド誘導体を形成するのに十分な条件下で反応させることによって作製される。次いで、水銀化生成物は、反応性末端基を有し、３以上の炭素原子を含む成分（例えば、ビオチン基）と、パラジウム触媒の存在下で反応させる。この反応は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドのプリンまたはピリミジン環にその成分を付加する。非常に好ましい実施態様では、そのような修飾されたプローブは、Ward他（Ｗ０９０／０５７８９：引用により本明細書中に取り込む）に記載された方法で競合ＤＮＡと組み合わせて使用される。競合ＤＮＡは、ヒトおよび他の頬乳動物ＤＮＡ中に存在する偏在性の反復配列からのハイブリダイゼーションシグナルを抑制するように作用するＤＮＡである。ヒトＤＮＡの場合、ａｌｕまたはｋｐｎ断片をWard他（ＷＯ９０／０５７８９）に記載されているように使用できる。最初に、検出可能な標識を有するプローブＤＮＡと競合ＤＮＡを相補配列を有する分子間でハイブリダイゼーションを生じさせるのに十分な条件下で混合する。本明細書で使用する場合、２つの配列は、それらが相補的であり、従って安定な逆平行二本鎖核酸構造を形成することができる場合に、もう一方の配列にハイブリダイズできると称される。そのような二本鎖構造を形成するのに適した核酸ハイブリダイゼーションの条件は、Maniatis，T.他（In:Molecular Clonong，A Labora tory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，NY(198 2)）;Haymes,B.D.,他(In:Nucleic Acid Hybridization,A Practica1 Approach， IRL Press，ワシントン、D.C.(1985)）、およびRied，T他（Proc.Nat1.Acad.Sci .(U.S.A.)89:1388-1392(1992)）に記載されている。本発明の目的のためには、配列は正確な相補性を示す必要はないが、安定な二本鎖構造を形成できるのに十分なほど配列が相補的であることが必要なだけである。従って、完全な相補性からの離脱は、そのような離脱がハイブリダイゼーションと二本鎖構造の形成を完全に妨げるのに十分ではない限り、許容可能である。競合ＤＮＡと混合するプローブＤＮＡの量は染色体標的の相対的ＤＮＡ含量を反映するように調整される。例えば、Ward他（ＷＯ９０／０５７８９）に記載されているように、染色体１は染色体２１に存在するＤＮＡの約５．３倍の量のＤＮＡを含有する。従って、染色体１特異的プローブを使用する場合は、比例して高いプローブ濃度が使用されるであろう。次いで、得られたハイブリダイゼーション混合物を（例えば、加熱により）処理して存在するＤＮＡを変性させ、部分的再アニーリングを促進するのに十分な時間だけ約３７℃でインキュベートする。同定すべき染色体ＤＮＡを含有する試料も加熱して、プローブにハイブリダイズされ易いようにする。ハイブリダイゼーション混合物および試料を次いでハイブリダイゼーションを生じさせるのに十分な条件下で混合する。その後、ハイブリダイズした生成物の検出と分析を、以下に記載する方法のいずれかでプローブのフルオロフォア標識を検出することによって行う。別の実施態様では、Ried，T.他（Proc,Natl.Acad Sci.(U.S.A.)89:1388-1392( 1992)；引用により本明細書中に取り込む）の方法の改良を使用する。即ち、プローブをビオチニル化したヌクレオチドで標識し、染色体ＤＮＡにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズした複合体を、１以上の蛍光体に結合させておいたストレプトアビジンの存在下でインキュベートする。ストレプトアビジンはハイブリダイズした複合体のビオチニル化プローブに結合し、それによって以下に記載するように複合体の検出が可能になる。Ｃ．本発明の奸ましいフルオロホアー２又はそれ以上の蛍光体の組合せで標識することにより、利用できる蛍光体よりも多数の目的物質を区別することができる。このような標識を実施する最も簡単な方法は、ボーリーン（Ｂｏｏｌｅａｎ）組合せによる。即ち、蛍光体は完全に不存在（０）であるか、又は単位量で存在する（１）か、のいずれかである。単一の蛍光体Ａについては、唯一の有用な組合せ（１）だけである（Ａ＝１）。２個の蛍光体Ａ，Ｂでは、３つの有用な組合せがある（Ａ＝１，Ｂ＝０；Ａ＝０，Ｂ＝１；Ａ＝１，Ｂ＝１）．３個の蛍光体の場合には、７つの組合せがある（Ａ＝1，Ｂ＝０，Ｃ＝０；Ａ＝０，Ｂ＝１，Ｃ＝０：Ａ＝０，Ｂ＝０，Ｃ＝１：Ａ＝1，Ｂ＝1，Ｃ＝Ｏ：Ａ＝１，Ｂ＝Ｏ，Ｃ＝１：Ａ＝O，Ｂ＝1，Ｃ＝１；Ａ＝１，Ｂ＝1．Ｃ＝1）。４この蛍光体の場合１５の有用な組合せがあり、５個の蛍光体の場合、３１の組合せがある。６蛍光体の場合３１の組合せがあり、以下、同様である。ヒト遺伝子における２４個のクロモソームタイプの全てを特有にコードするためには、５個の区別し得る蛍光体が必要である。５蛍光体のセットでは、５個のうちの４個の組合せを用いて、１５のクロモソームを区別できる。残りの９個のクロモソームの標識には、組合せて使用する５個の蛍光体全てが必要である。利用できる５蛍光体組合せのうち７つは必要でない。したがって、決定するのが特に困難であることを証明できるであろう、全ての５蛍光体組合せを避けるために、一定範囲の許容度がある。特に、４個の又は５個の組合せを避けることができる。本発明の１つの観点は、励起発光コントラスト（ＥＥＣ）法によって良好に決定できる、７蛍光体のセットの同定に関する。上述のとうり、多数蛍光体組合せによる標識は、一般に各目的物のスペクトル上の特徴を捕捉し、分析すること、即ち、成分蛍光体の相対的重量係数を得ることによる。混合蛍光体のスペクトルの分光分析的に解析すること（例えば、インターフェロメトリーによって）は十分に開発されていないので、選択される方法は、エピ蛍光体エッセンス・トリプレット、即ち、励起フィルター、ダイロニックリフレクター及び発光バンドパスフィルターを使用する慣用のバンド幅限定、ワイドフィールドイメージングであった。イメージングに利用できる、限定された分光バンド幅（おおよそ、３８０−７５０ｎｍ）、及び有機蛍光体のスペクトルの広範囲にわたる重複のために、イメージング工程における複数蛍光体を分光分析的に分離することは、困難な技術的試みであった。実用的に可能である限り直接的に、元になるイメージのソフトウエアー解析（ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を行うために、与えられた全ての蛍光体と２つの隣接するチャンネルとの間に、１０％以下のクロストークの目的数値を設定した。コンピューターモデリングでは、ＤＡＰＩと５つの組合せ蛍光体ＦＩＴＣ，Ｃｙ３，Ｃｙ３．５，Ｃｙ５，Ｃｙ５．５とについて、このコントラスト水準は、どのような狭いフィルターバンド幅であっても、励起選択又は発光選択のいずれかを用いても達成できないことを、示した。したがって、励起選択及び発光選択の両者を同時に実施しなければならない。これは、励起発光コントラスト（ＥＥＣ）と呼ばれる。コントラスト比率のプロットは各蛍光体とその２つの隣接物について、最初コンピュータ処理された。これらのプロットは対になったコントラストが有用であるのに十分高い領域を示す。実際上達成できるコントラストにおける制約は、少なくとも１つのフランクス一般的にかなり下にある高コントラストの領域である。即ち、励起及び／又は発光が、最適値からかなり下にある場合である。さらに、必要とされる程度の選択性を達成するために、５〜１５ｎｍのバンド幅のフィルターを用いることが必要である。（注：標準フィルターセットでは約５０ｎｍである。）それと共に、これらは幾つかの厳しい感受性ペナルティーを課している。最大１．０％のクロストークという目標により、感受性と選択性とについての許容し得る、現実的な妥協を示される。励起コントラストと発光コントラストとの間に、基礎的な非対称が存在している。冷却ＣＣＤのような低雑音検知器では、励起バンド幅を制限することは、達成されるイメージＳ／Ｎ比率について殆ど影響を持たない。唯一のペナルティーはより長い露光時間が必要であることである。しかしながら、フィルターによって遮断されるすべての蛍光フォトンは、蛍光体の不可逆的の光化学的脱色を示すため、発光バンド幅を制限することは、非常に不都合なことである。このような理由により、実用的に最高のコントラストは、励起サイドに生じた。好適な発光フィルターは、必要なＥＥＣ比率を与えることが見いだされた。フィルター選択は以下の事実により更に制約される。各チャンネルは、隣接チャンネルを同時に十分に拒絶しなければならない。１つを改善すれば、他方を著しく損なうことがある。良孝なコントラストは、Ｃｙ５．５／Ｃｙ５のペアーを除き（限界値付近であるが）、現実的に全ての蛍光体について達成された。この理由により、Ｃｙ５．５は後にＣｙ７に置換された。フィルターの選択に関するその他の考慮事項は次のものである。１．市販の狭バンド・インターフェアレンス・フィルターは大量のウエッジグ（ｗｅｄｇｉｎｇ）、即ち頂部面と底面との非平行関係を持つことができる。これは、（数ミクロン当量以下の）大きいイメージシフトを生じる。このシフトは、各フィルターのベクトル特性及びエピキュブ（ｅｐｉｃｕｂｅ）中での配向である。したがって、イメージの移動についての自動的補償は、処理ソフトウエアーの必要部分である。２．ピーク波長における数ミクロンの変更の作成及びＦＷＨＭ仕様は、ＥＥＣ比率に関する顕著な影響を持つことがある。長波長におけるフィルターのエラーは、ティルティング（ｔｉｌｔｉｎｇ）することにより微調節できる。ただし、このやり方はイメージの変調を助長し、ピクセル（ｐｉｘｅｌ）シフトを悪化させるため発光フィルターの場合には厳しく制限される。短波長での誤差を補正する別の方法はない。３．アークランプによって発光される赤外線が検知器に到達するこを防止することの必要性。シリコーンＣＣＤは、この領域で極めて感受性が高い。青色及び中間可視蛍光体のためのフィルターセットでは、付加的なＩＲ遮断は不要であることが分かった。しかしながら、見せかけのＩＲによるイメージコントラストの損失は、赤色−遠赤外−近赤外蛍光体にとって重大な問題であることが分かった。顕微鏡に通常使用される熱フィルター（例えば、ＳｃｈｏｔｔＢＧ−３８ｇｌａｓｓ）はこの問題を解決するには全く不十分である。したがって、より効果のある、付加的な遮蔽が要求される。しかしながら、赤外遮蔽フィルター用の、入手可能な市販の干渉フィルターは近紫外について、低い透過性であり、したがって、励起通路に挿入できない。それに代わって、このＩＲ遮蔽フィルターを発光通路に挿入することが必要であることが見いだされた。イメージ通路にこれらのフィルターを挿入することによる画像品質の低下を最小にするために、これらはＣＣＤカメラ内でウインドウの直ぐ前に設置される。実際には、２つの交換可能なフィルターが選ばれる。１つはＣｙ５，Ｃｙ５．５との使用によるもの（Ｏｒｉｅｌ＃５８８９３；７４０ｎｍカットオフ）であり、他のものはＣｙ７との使用によるもの（Ｏｒｉｅｌ＃５８８９５；７９０ｎｍカットオフ）である。蛍光体のセットの最初のものは、カウンターステイン（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｔａｉｎ）ＤＡＰＩであり、これは弱いＧ−様バンディングパターンを与える。残りの６個の蛍光体のうちの５つは、組合せて使用して全ヒトクロモソームセットを彩色できる。これら全ては、アビジン複合体（ビオチニル化プローブライブラリーの二次検出用）として、または直接にｄＵＴＰに結合したもの（直接標識化）として入手可能である。このようにして、３５０〜７５０ｎｍのスペクトルインターバルわたって間隔を置かれる６個の蛍光体及びこれらに相応する光学フィルターが同定された。これらは、全ての可能な蛍光体ペアーを高度に区別できる。これらの蛍光体は本発明の好ましい蛍光体を含み、これらは、４’，６−ジアミジノ２−フェニルインドール(ＤＡＰＩ)，フルオルエセイン（ＦＩＴＣ）及び、新世代シアニン染料、Ｃｙ３，Ｃｙ３．５，Ｃｙ５，Ｃｙ５．５及びＣｙ７である。これらのＣｙ３，Ｃｙ３．５，Ｃｙ５，及びＣｙ７は特に好ましい。涸々の蛍光体についての極大吸収及び極大発光は：ＤＡＰＩ（極大吸収：３５０ｎｍ；極大発光：４５６ｎｍ）、ＦＩＴＣ（極大吸収：４９０ｎｍ，極大発光：５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（極大吸収：５５４ｎｍ；極大発光：５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（極大吸収：５８１ｎｍ；極大発光：５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（極大吸収：６５２ｎｍ；極大発光：６７２ｎｍ）、Ｃｙ７（極大吸収：７５５ｎｍ；極大発光：７７８ｎｍ）。選択された蛍光標識試薬の完全な特性は、ワゴナー（Waggoner．A.）によって提供されている(Methods in Enzymology 246:362-373(1995))。なお、この文献は本件明細書の一部に含まれるものとする。Ｄ．その場での蛍光ハイブリダイゼーションの検出方法１．蛍光検出の理論位置特定標識におけるコントラスト発生のための種々の方法において、蛍光物質が最も強力であると言える。これは、高い絶対感受性及び高いマルチパラメター区別能による。高い開口数の顕微鏡オブジェクティブと通常の光学フィルターとを組合せて使用したモデム電子カメラは、ピクセル当たり１０〜１００蛍光体分子で標識された構造をイメージングできる。かくして、数百塩基程度のサイズの蛍光体結合、単一コピーＤＮＡ断片は、好ましい条件下で検出可能である。スペクトルによって区別できる蛍光体類を利用することにより、同一種において幾つかの異なる標的について同時にイメージングできる。これは、直接的にまたは順列組合又はアナログ多重法のいずれかで行われる。原則として、複数蛍光体による区別は、蛍光体の異なる励起、異なる発光、蛍光寿命の差、又は蛍光異方性のような複雑であるが分析可能な識別要素の１つ又は２つ以上に基づくことができる。この議論は、エピイメージングジェオメトリーであると推測される。表１は蛍光物質の理論的考察に関する記号及び演算子を説明するものである。ピクセルの位置（ｐ）における与えられる励起速度が、所定の連続する一定期間における、許容できる蛍光信号／雑音比率（Ｓ／Ｎ＝［信号媒介］／［全ての雑音源による変動］）を与えるか否かは、ｐ内における蛍光体分子の数、それらの量子収量及び光子化学的安定性、及び検出器の量子効率及びノイズ挙動に依存する。弱い励起の極限において（Ψ⁽ ^λ)σ_F ⁽ ^λ))＜＜τ^-l）、対象スペース中の絵素ｐ内の蛍光ＦのＮ分子の励起速度は：Ｒ(ｐ)＝Ｎ∫ｉΨ⁵⁽ ^λ、p)．σ_F ⁽ ^λ)．ｄλｓ^-lであり、 Ψ⁵⁽ ^λ)は、顕微鏡の焦点平面を通過する光を励起するスペクトルの分布である（フォトンnm^-1.cm^-2.s^-1）。それは、Ψ_s ⁽ ^λ).φ_s.ｆ１(λ).Ｒ(λ).α².μによりおおよそ与えられ、式中、αは対物レンズのエントリーの瞳孔（objective Iensentry pupil）の直径／コンデンサーからの平行にされたビームの直径である。積分は、蛍光がゼロでない吸収横断面を有するようなバンド幅（ｉ）にわたってとられ、式： σ_F ⁽ ^λ)＝3.825×10^-2lsp(λ)cm² によるモル吸光係数（molar decadic extinction coefficient）ε_F(λ)と相関する。実際上、∫ｉΨ⁵⁽ ^λ、p).ｄλは、ボロメーター検出機、例えば対物レンズの焦点平面の上に置かれたかまたは隣接して置かれた検量マイクロ熱電対列を用いて測定することができる。完全なノイズレス検出機および非漂白可能蛍光に関しては、各々の絵素のＳ／Ｎが（検出されたフォトン）^1/2として無限に増加する。如何に速くＳ／Ｎが増加するのかは励起強度に依存するが、Ｓ／Ｎと用量の間の関係は依存しない。非ゼロ漂白定数の効果は、ｔ^1/2関数を漸近的関数に変化させることであり、その形態は漂白機構に依存する。しかしながら、漂白速度およびシグナル強度は比例関係にあるため、漸近線はもう一度励起速度に全く依存しなくなるが、漸近線への接近スピードは依存する。有限のカメラノイズが光漂白に付加されたなら、Ｓ／Ｎは最大値に上昇して、次に蛍光の消費と共に低下することが見いだされる。今、動力学とピークＳ／Ｎの両者は励起速度に依存し、一般的には励起が速ければ速いほど、最大の達成可能Ｓ／Ｎは高くなる。しかしながら、現代の冷却されたＣＣＤカメラに関しては、暗黒ノイズが低いので漂白の時間目盛が事実上無視できず（典型的には数分）、極値のＳ／Ｎを測定する際のより重要な因子は漂遊光バックグラウンドである（特に、非特異的発光および励起光の漏れから）。注目すべきは、顕微鏡対象物は励起ビームを圧縮するが、非共焦点顕微鏡においては、点に焦点を合わせず、よって、蛍光イメージ解析力と関係がないことである（非干渉性エミッター）。蛍光顕微鏡のための最も共通の励起源は高圧短水銀アークであり、そのスペクトルは、ＵＶから可視スペクトルの中間領域への圧力拡張ラインからなり（主波長は、334.1nm，365.6nm，404.7nm，435.8nm，546.1nm，577.9nm）、弱熱連続体（weaker thermal contlnuum）上に置かれる。多くのフルオロフォアは、受容可能な範囲でひとつまたは他の水銀線と重複する励起スペクトルを有する。その他（そのうちで最も知られているのはFITC）はそうではないが、十分に広い励起バンド幅を用いた場合に連続体により十分に励起されてよい。他の共通の源は高圧キセノン短アークであり、計算上300nmから900nmを越えるほとんど一定の連続体を生じる。しかしながら、電力nm^-1は、同じアークワット数に関する水銀連続体に比してほとんどいたるところで低い。構造をもたない高い強度の光が必要ならば（例えば、蛍光比率イメージングのため）、高いＣＷ電力またはパルスされたクオーツハロゲンランプは、約450nmを越えるキセノンより性能が優れている。特定の蛍光をレーザー励起にうまく適合させる（例えば、FITCに関してはAr＋＠ 488nm，Cy5に関してはHe-Ne＠632.8nm、Cy5.5に関してはセミコンダクターダイオードをポンプしたYAG＠680nm）。単一蛍光イメージングにおいては、利用可能なスペクトルバンド幅の使用は稀にストリンジェントである。源のスペクトルと蛍光励起スペクトルの間の十分な重複を与えるためには、通常は、励起フィルタ−Ｆ１および二色性ビームスプリッターＤＢＩを選択することができる。一つのアークラインが利用可能であるならば、Ｆ１帯電濾波は該ラインより広い必要はない。もしそうでなくて、しかも熱連続体の一部を使用せねばならないなら、Ｆ１帯電濾波が高くなればなるほど、利用可能な励起フラックスはより大きくなる。しかしながら、低いノイズの積算検出機を用いるなら、高い励起効率の到達点は、放射経路からの励起光を除外する要求に対しては通常二次的である。これは、如何に励起帯電濾波と放射帯電濾波を近づけて互いを配置することができるかを制限し、よって励起バンド幅を圧迫する。小さなストークスシフトを有する蛍光に関しては、極めて鋭いスカートを有する高い質のフィルターが必要である。励起フィルターは長波長側上において厳しく「ブロック」されなければならず、そしてピンホール、スクラッチまたはエッジの回りの光の漏れを有していてはならない。二色性ビームスプリッターは、帯電濾波フィルターより現在はるかに進化しておらず、このことはそれらの伝達の＜−＞反射遷移のスロープが希少なノッチフィルターのスカートのスロープよりはるかに低く、そして部分反射の中間状態と伝達の間を振動する大きなスペクトル間隔が存在するかもしれないことを意味する。二色性ビームスプリッターの主な目的は、機器の波長応答を定義するよりも、むしろ励起と放射の組合わされた効率を改良することである。イメージ化鏡検法における重複蛍光の解析能は、達成されうる励起コントラストの程度に精密に依存してよい（以下のＣを参照）。２つの蛍光の吸光係数比の波長を伴う分散は、励起コントラストスペクトルである。それは、デジタル化吸収スペクトルから容易に計算することができる。吸収の重複に依存して、それらの比のスペクトルは、明確なピークを示すか、または無限に大きく成長してよい。いずれの場合においても、有用な範囲で他の蛍光以上に一つの蛍光を好む励起波長を選択くすることが通常は可能である（３−４倍から百以上の因子から）。高コントラスト複数蛍光イメージを得るための幾つかの困難は以下を含む：ａ．高コントラストイメージングに必要な励起波長がしばしば吸収ピークから遠く離れている。即ち、高いシグナルコントラスト対他の蛍光を得るための高い程度の強度交換が存在するかもしれない。ｂ．上記から、標準フィルターセットを用いることができない。ｃ．単一蛍光を励起するために有用なアーク源スペクトルラインは隣接する蛍光に対して高いコントラストの区別を与えないかもしれない。ｄ．広いバンドの源またはアーク源の連続体スペクトルを用いる場合、励起バンド幅を狭める要求が、励起フラックスを疑わしく低いレベルに減じるかもしれない。より効率的な励起のためには、励起波長上の束縛を和らげることが時々可能である。Ｆの蛍光を補正して高い効率で検出機上にそれをイメージ化することは、放射光学の主要な計画上の到達点である。操作上は、効果的な励起経路よりも効果的な放射経路を有することがより重要でさえある。その理由は、非効果的な励起が非効果的な光漂白を起こすからであり；唯一のペナルティは長いイメージの積算時間である（低ノイズ検出機を仮定する）。一方、検出機へのその経路上のあらゆる蛍光の損失は、イメージの情報含有量中の付随の増加を伴わない光漂白を表す。検出機の絵素ｐは、速度：Ｆ(ｐ)＝Ｇ.Ｒ(ｐ).φ_F.∫iiＴ(λ).ｆ２(λ).φ_d(λ).ｄλ.ｓ^-1 においてシグナル（検出されたフォトン）を蓄積する。積分は、検出機の量子効率φ_d(λ)＞０のバンド幅(ii)を越える。Ｇは、光学が蛍光を集めて検出機にそれを伝達する際の効率を表し、第１順位とは独立な波長であると予測してよい。Ｇ中の主要な因子は対物レンズの開口数（ＮＡ）であり、イメージングシステム（§＝１/π.sin^-1(θ)＝１/π.sin^-1（ＮＡ／ｎ）、式中θはその焦点から対物レンズにより境界を示される半分の角である。オイル浸漬レンズに関して、ＮＡ＝1.3;ｎ＝1.515；§＝0.328）により補正された等方性照射蛍光の画分を決定する。ＮＡはさらに、顕微鏡の立体解析力を決定するが、なぜならば検体平面中の点源によるイメージ平面中に生じるフラウンホーファーの回折パターンの寸法を概算するからである。幾つかの「ルール」がレンズの解析力を特定するために使用されるが、２つの隣接する対象の架空の円盤のとれほどの重複が解析の閾値を構成すると見なされるかに依存する。共通に使用されるレイライ（Rayleigh）の基準は、ｒ＝1.22λ／２ＮＡである（例えば、上記に関してＮＡ＝1.3レンズ作用（500nmにおいて）、ｒ＝0.24μ）。ノイズレス検出機に関しては、ｐにおけるイメージ「ノイズ」は、時間間隔Δ ｔ中で検出された蛍光フォトンの数Ｓ(ｐ)中の統計分散により決定される。これとあらゆる関係のある唯一の検出機の特徴は、その量子効果φｄ(λ)である。光漂白の不在下では（ヒットあたりの破壊の確率II_b＝０）、Ｓ（ｐ）＝Ｆ(ｐ )Δｔであって分散Ｓ(ｐ)^1/2、即ちＳ／Ｎ＝Ｓ(ｐ)^1/2を伴う。イメージの質は、したがって、Δtと共に、なお低下し続ける速度ではあるが、無限に増加する。光漂白の不在下では（II_b≠０）、Ｓ(ｐ)は式：Ｓ(ｐ)＝Ｆ(ｐ)∫Δ_tｆ(ｔ)ｄｔの積分であるが、式中、ｆ(ｔ)は光漂白の減衰の関数である。Ｓ／Ｎは多かれ少なかれ複雑な経路に沿って、蛍光の全消耗に対応する漸近値に上昇する。単分子光漂白法の場合には、これは対数関数、即ちＮ（p,t）＝Ｎ₀（１-exp-［ｋ_b/Σ ｋ］.ｔ）のはずであり、式中ｋ_b＝II_b ^-1は光漂白定数であり、そしてΣｋはＦの励起状態が脱活性化されるすべての他の方法を表す。注目すべきは、この第１順位システムにおける標準化漸近線はｋ_b／Σｋのみに依存して、励起の強度とは独立であることである。即ち、漂白の程度は蓄積した励起用量に指数的に相関するが、しかし経路とは独立である。実際は、しかしながら、溶液中の蛍光の漂白は機械論的かつ動力学的なより多くの複合でありうる。共通の機構は蛍光励起状態の過酸化に続く開環を含み、例えば¹Ｏ₂またはＯ₂ ^2-による。この種の漂白は、激しい脱酸素によるかまたは酸素のラジカルスキャベンジャー（即ち、フェージング防止剤）、例えば第四アミン（ｐ−フェニレンジアミンまたはDABCO）の使用によりかなり遅延させてよい。にもかかわらず、他の（まだほとんど特徴付けされていないような）不可逆法は除外されず、不純物との反応が包含される。非理想的な検出機はあらゆる種類のノイズの原因となり、その詳細な分析は手におえないかもしれない。最も単純なノイズの成分はいわゆる「暗流」の中の変動、即ち検出機内の熱により励起されたキャリアーの流れである。このノイズがランダムと仮定されれば、ＲＭＳ様式によりフォトンのショットノイズにそれを付加する。即ち、平均光生成シグナルがＦｓ^-1であり、そして平均の暗黒カウントがＤｓ^-1であれば、時間Δｔの後のＳ／ＮはＦ(Δｔ)^1/2/(Ｆ＋Ｄ)^1/2であり；Ｓ／Ｎは(Δt)^1/2としてまだ増加するが、ノイズレス検出機に関するよりも低い。光漂白が存在する場合は、しかしながら、状況は完全に異なる。この場合、Ｓ／Ｎは最初(Δt)^1/2として増加するものの、幾つかの点において浅い最大に達して、次に再び落ち始めるが、蛍光シグナルは低下するが熱ノイズパワーは一定のままであるからである。この場合、イメージのＳ／Ｎを監視し続けて、ピークに達したら暴露を停止することが原理上は望まれる。最も商業的なデジタルイメージングシステムはこれに関しての準備がない。幸運にも、この技術分野の冷却されたＣＣＤカメラの状態は、絵素あたりほとんどわずかな暗黒ノイズしか有さず（典型的には、倒置時計モードにおいて＜0.01電子s^-1）、Ｓ／Ｎは蛍光のほとんど完全な消耗まで落ち続けないはずである。実際は、自己蛍光および漂遊光支配システムは、ＣＣＤのノイズ閾値が到達するまで効能を有する単一蛍光イメージングシステムのための主要な計画上の到達点は：１．蛍光（Ｆ）の十分な励起速度を達成すること２．Ｆの蛍光を補正して、高い効率で必要な立体解析を伴う検出機上にそれをイメージ化すること３．反射された励起光および／または分散された励起光が検出機に到達するのを妨害することである。単一蛍光のための放射チャンネルのデザインは簡単である。二色性ビームスプリッター遷移波長は、例えば20mnから励起通過帯域の赤までにおいて特定される。これは、検体および／または顕微鏡光学からの反射されたおよび／または分散された光を励起する高いレベルの拒絶を保証する。放射フィルターのカットオンは、通常は二色性エッジより顕著に鋭く、そして実用上はそれに一致させて配置することができる。最も効率的な放射フィルターは長い列の要素（long-pass el ement）である。この種の好ましいフィルターはショット（Schott）ガラスであり、全蛍光の90％以上を赤またはそのカットオンに伝達するが、他の光（特に、二色性ビームスプリッターを通して得るあらゆる励起光）を極めて高いオーダー −典型的には＞10⁵に退ける。しかしながら、放射チャンネル「ワイドオープン」を近赤外に残すことは、特に高い感度を有するシリコン検出機を用いた場合に、通常は薦められない。本発明のマルチパラメーター画像形成は、観察下におけるシステムについて情報のスループットを増加し、そして生物学的材料をより効率よく使用することができるようにするだけでなく、そうでなければ確実性を確立することが難しいであろう空間的および時間的相関性を示すことができる。多数の異なる対象を視覚化しなければならない場合、２種またはそれ以上の標識を組み合わせとして使用することができ、それによりスペクトルにより識別可能な標識として存在するよりもずっと多くの対象タイプの間で識別することができる。マルチ蛍光物質画像形成のいくつかの例としては、以下のものがある。ａ．微少管ネットワークなどの構造におけるタンパク質の共局在性を、異なる蛍光物質と結合した免疫標識を使用して容易に視覚化することができる。ｂ．単一の中期染色体を展開したもの（spread）に対する蛍光in situハイブリダイゼーション法（FISH法）により、複数の遺伝子を同時にマップすることができる。このようなシグナルは、通常は強度のみに基づいて確実に識別することはできず、そして通常は形態学的にも同様である(回折制限点(diffraction-li mited point))。しかしながら、複数蛍光標識を個々にまたは組み合わせることにより、それらを容易に識別する。ｃ．別々の蛍光物質と結合した染色体特異的DNAプローブライブラリーを単独にまたは組み合わせて使用して色づけることにより、小染色体の転座をもっとも容易に行う。ｄ．別々の蛍光物質と結合した種特異的DNAまたはリボゾームRNAプローブを使用して、形態学的に同一な細菌の混合された集団の解析を達成することも可能である。マルチ蛍光物質画像形成の当初の設計目標は（単一蛍光物質画像形成の目標に加えて)、いずれかのピクセル位置において、蛍光をそれぞれの蛍光物質に対応する成分にスペクトル分解することである。蛍光顕微鏡画像中で複合シグナルをスペクトル分解する方法は、以下に概説する。複合シグナルをスペクトル分解する方法は、例えば蛍光物質が所定のピクセル位置において蛍光を生成することを検出する等、いくつか存在する。原則としてもっとも一般的な方法は、ｘ、ｙ軸に直交する第三の軸に沿って、２Ｄ画像をスペクトル分散させることである。これは、非常に多くの色彩的収差（chromati c aberration）を伴う光学系を介して画像形成することに等しく、そのためｚ軸上のそれぞれの位置において小さなスペクトルバンド幅であるλ＋△λしか含まない画像ｘ、ｙが存在する。次いで、非常の小さな領域深度を有する領域検出器（例えば、空間的にフィルター化された共焦点画像形成機）は、それぞれが小さなスペクトル間隔を有する画像ファミリーを得るために、ｚ軸に沿って増大するように移動することができる。所定のｘ、ｙでの画像を介したトレースは、そのピクセルに対する放出スペクトルを構成しうる。残念ながらそのような概要を満たすことは、技術的に非常に難しい。画像中の少数の対象のみのスペクトルが必要とされている場合（例えば、望遠鏡画像中の個々の星など)、解決方法は、それぞれの対象に対応する光をプローブ（例えばfiber optic等）で抽出し、１次元アレー検出器上の画像形成スペクトログラフによってそれを分散することである。顕微鏡において有用であるために、このような装置は場において任意に位置取りすることができそして調節可能な許容領域を有する。顕微鏡における完全スペクトル解析（full spectral analysis）に対してもっとも合理的な方法は、変動する狭いバンドフィルターを介して画像形成することである。画像は、それぞれの波長で記録される；すなわち成分蛍光物質の既知のスペクトル一次組み合わせ（a linear combination）に適合することができる加重放出スペクトル（weighted emission spectrum）を表す一連のものを介した所定のピクセル位置での強度値が記録される。係数は、励起波長での吸光係数に対する相対モル数の蛍光物質およびその蛍光量子収量の産生である。直前の二つが既知であれば、第一のものは一時的興奮（fit）から得ることができる。一般的に、独特の一時的興奮を得るために、いくつかのこのような画像セットを、いくつかの励起波長でとることが必要である。十分な反復により、このプロセスは、励起波長と放出波長の両方の作用として強度値の３Ｄ表面に生成する。これには、その成分蛍光物質の相対量に対する非常に高度に束縛された溶液（highly c onstrained solution）を与える、ピクセルの完全スペクトルシグナチュアー（s ignature）が含まれる。モル比は、“組成物マップ”を提供するために、適当な疑似色コードを使用して、画像のｘ、ｙ座標上にマップし直すことができる。この一般的（および定量的）方法は、克服しがたいものではないが多くの技術的困難を有する。第一は、単一の顕微鏡視野を評価するために多くの画像を必要とする点である。画像形成時間は長く、そして蛍光物質の広範囲応差写真漂白（extensiv e differntial photobleaching）のために、スペクトルデータに対して自己矛盾のない“一時的興奮”を達成することが困難になりうる。機器安定性も、特に弧光源（arc source）について、そじ寿命を通して変化する出力スペクトルを伴う問題である。最終的に、組成物マップを作成するために必要とされる評価量は、実際に解析を小さな画像領域のみに限定しうる。ほとんどの応用について、解析すべき蛍光物質が早めに知られるため、成熟したスペクトル解析可能性は必要とされない。したがって、どの蛍光物質がどれかという同定することができること、および複合の画像形成に対してそれぞれの存在の相対量を確かめることだけが必要である。問題のこのカテゴリーに対する好ましいアプローチには、高度なそれぞれの蛍光物質の選択的励起および視覚化を達成するフィルターセットの使用が含まれる。このタイプの理想的なシステムは、例えば“１イメージ−１蛍光物質”の様に、それぞれの蛍光源（fluorofore ）を完全に分離し、そして強度係数のマトリックス中における斜線からはずれた（off-diagonal）成分のすべては、ゼロであってもよい。しかしながら、一般的な蛍光源のスペクトルが全体で利用可能なバンド幅の10−30％であり、そして放出フィルターは、使用可能な量の光を透過するバンド幅を有さなければならないという事実は、スペクトル分解の達成できる程度に対して、厳しい限界を設定する。それにもかかわらず、適切に選択された蛍光物質間でのコントラストの有用なレベルを達成することは困難ではなく、それにより残存するクロストークを数の上では除去することができる。励起−放出コントラスト（excitation-emission contrast；EEC）アプローチは、画像S/Nを条件としてそしてを画像形成しそして応差写真漂白比率そして供給源不安定性を限定することを条件として、原則として、モル画分のきめの細かい配置で（例えば蛍光比率画像形成）、複数の蛍光物質を含む画像解析に応用することができる。しかしながら、厳密なBoolean様式（存在＝１または不存在＝０）において蛍光物質を多様にするコンビナトリアル標識の限定的なケースのために、特に単純である。この場合、１および０の間を確実に識別することができることのみ必要であり、そのためにいずれかの蛍光物質とその近傍との10：１（10倍の）強度比率で十分であり得る。しかしながら、多くの有用な蛍光物質については、励起コントラストまたは放出コントラスト単独をもとにしては達成されない。励起および放出の両方に基づいて同時に選択することが必要である。いくつかの状況においては、いくつかの蛍光物質を同時に励起しそして（例えば直接観察および／またはカラービデオ記録等の）画像形成をすることが必要である。検出器内で散乱した励起光はいくつかのオーダー（order）の光度等級（magnitude）により蛍光を覆ってしまうため、波長選択性のない励起および放出工学を使用することはできない。一つの解決法は、使用すべき特定のセットの蛍光物質に対して指定された複数バンド透過性フィルターを使用することである。励起フィルターは、蛍光物質の励起スペクトルとオーバーラップする狭いバンド透過に限定する。放出フィルターは、励起バンド間で互いにかみ合い、そして蛍光物質放出スペクトルとオーバーラップする（もっとも赤色側の蛍光は、ロングパスフィルターを使用することができる)、同様な透過バンドに限定する。二色性のバンドビームは、反射（励起透過バンドとオーバーラップする）および透過（放出透過バンドとオーバーラップする）との間で変化する。マルチカラー視覚化が必要とされない場合、すなわちいくつかの放出透過バンドを介して透過するシグナル間で幾何的な置換（ピクセルシフト）が存在しない場合であっても、マルチ透過フィルターセットの使用もまた、利点を有する。しかしながら、白黒の画像形成システムをしようした場合には、白黒のシグナルがどの蛍光物質に対応するのかを決定するために、励起フィルターまたは放出フィルターのいずれかが変換可能であることが必要である。画像置換を引き起こさないという点から、励起フィルターを変換することが好ましい選択である。第２の理論的解決は全ての蛍光体が吸収する波長で励起することである。多くの蛍光体が中間波長UVにおける光子を用いてS1よりも高い状態に励起可能であるが、内部緩和プロセスにより正常な蛍光が得られるので、これが可能になることが多い。例えば、多くのレーザー色素はその可視吸光度の青からは遠く離れた窒素レーザー波長337nmで励起することができる。全ての蛍光を検出器に同時に到達させながら、このような発光側の波長からの励起光を長波長フィルター（例えば380nm）を用いてブロックすることは簡単であろう。UV励起を使用する欠点には、蛍光体の光化学的分解の速度が増加することや、適当なUV光学系が高価であることが挙げられる。従って、この方法はそれほど広く用いられてこなかった。３つ以上の蛍光体間の適切なコントラストを与えるような多重バンドパスエレメントを作り出すのがきわめて難しいので多重バンドパス法には限界がある。一般にもっと強力なアプローチは、各蛍光体について最適化されたフィルターセットを作って、必要に応じてこれらをスイッチすることである。蛍光体が１つである場合には、励起側での第１目標は高い励起光束で鮮明な画像を得ることである。しかしながら、複数の蛍光体を画像形成するときには、蛍光体間の高いコントラストを得るという目標にとってこれは二次的なこととなる。オーバーラップ限界が小さい場合には、単一蛍光体セットと同じ基準を用いて設計したフィルターを連続的にスイッチすることによって蛍光体を画像形成できる（最長波長の蛍光体以外の全ての蛍光体について、長波長を通過させる発光フィルターを用いない限りは）。数パーセントのクロストークは通常許容でき、必要ならば数値処理によって補正可能である。しかし、もっと一般的には、蛍光体間の適切なコントラストを作るには、厳しく選択した励起と発光の両方を用いることが必要である。最適波長を選ぶには、隣接した蛍光体のスペクトルを加減することで見いだすことができる。この波長は最大励起から遠く離れているかも知れないが、これはシグナルの鮮明度とコントラストとの間の兼ね合いが重要なことを意味している。標準のフィルターセットは使えない。精密に調製された励起を必要とするならば、強い励起線が得られる可能性が低くなってしまい、また連続波長光源(continu um source)から得られる光束を減少することになってしまう。広帯域光源（アーク光又はフィラメントランプ）を一時的に非常に高い出力レベルにパルス発光するか、又はレーザー光源によって補うことが必要である。連続画像形成の主な技術的問題は、フィルター交換時の画像の変位(displacem ent)、すなわち一連の画像のうちの個々の画像の座標系が精密に位置合わせされていないことである。この問題は発光チャネル光学系が理想的なものでないことに由来する。２つの変位を起こす成分は以下のように同定できる：ｉ．各フィルターセットに固有な再現可能な偏り(offset)。この成分は決まったベクトルであり、主として発光バンドパスフィルターの上面と下面の平行性が不完全であること（すなわち、ウェッジング）に由来する。ダイクロイックビームスプリッターのウェッジングに依存する小さな成分もあるが、この要素は極めて薄いので影響は小さい。ウェッジングベクターは各フィルターセットについて固有であるので、コンピューターで自動的に除去できる。例えばレーザーオートコリメーターで測定するなど、高度な平行性をもつ発光フィルターを選択することによって、偏りの大きさを非常に小さい値（＜０．１μ）に減少できる。ｉｉ．フィルター交換機構の振動やヒステレシスに依存するランダムな成分。ノイズの大きさはフィルター交換機構に依存する。最悪なのは手動による差込−引き出し(push-pull)スライダー、特にオペレーターが力の加減なしに操作した場合である。一番好ましいのはモーター制御のフィルターカセットであり、これは全ての機械的トルクが顕微鏡の鏡体に対して働く。画像の偏りノイズの一定成分及びランダム成分はいずれも最高倍率の対物レンズを用いること、及びカメラの投影光学系の倍率を最小にすることによって最小とすることができる。光学顕微鏡で遭遇する画像の変位は線形ベクターのみで表せる、すなわち回転やスケール（倍率）の顕著な変化の証拠はない。複数のオーバーラップする蛍光体を高コントラストで画像形成するための設計について考慮すべきことは、励起チャネルについてすでに記載したのと同様である。各蛍光体の発光スペクトルと隣接する蛍光体の発光スペクトルとの比を計算することにより、狭帯域フィルターで規定される高コントラストのスペクトル領域を同定することができる。高コントラストを得ようとすると、蛍光量のかなりな部分（９０％以上）を犠牲にして始めて達成することができる場合が多い。蛍光チャネルの効率劣化は、画像のS/N比を劣化させるうえで励起の効率劣化よりも寄与がずっと大きい。従って、可能な場合には、複数の蛍光体間のコントラストを得る好ましい方法は選択的励起である。しかし、これが困難な場合には、励起と発光の両方のコントラストが要求される。２．光学フィルター上述したように、本発明の好ましい態様では、蛍光体の検出はRied,T et al.( Proc.Natl.Acad.Sic.(USA)89:1388-1391,1992:この文献を参照としてここに援用する)に記載の方法を修飾して、光学フィルターを用いて行う。ＤＡＰＩの画像形成 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（ＤＡＰＩ）は、染色体のＡＴに富む領域に優先的にインターカレートして弱いＧ型バンドパターンを生じるよく使用されているＤＮＡ対比染料(counterstain)である。非常に明るい蛍光体であり（ 347nmでε=3.3x10⁴M^-1cm^-1であり、二重鎖ＤＮＡの小さい溝にインターカレートすると約２０倍に蛍光量子収率が増強される）、光ブリーチングに比較的抵抗性である。隣接蛍光体に対して高コントラストでＤＡＰＩを画像形成するには以下の点が関連する：ａ．ＤＡＰＩは極めて広い励起と発光スペクトルをもち、非常に大きいストークシフトをもつ。従って、ＤＡＰＩの最大励起(347nm)は、Cascade Blue（ＣＢ）の青まで至るが、ＤＡＰＩピークの蛍光はCascade Blueの赤まで至り、実際ＦＩＴＣと強くオーバーラップする。ｂ．ＤＡＰＩの通常の励起波長（Hg366nm線）はＤＡＰＩとＣＢでほぼ等吸収であり、励起コントラストを生じないので、この用途には使用できない。ｃ．ＤＡＰＩ／ＣＢの励起コントラストスペクトルのピークは320nmである。この値はＵＶ領域に深く入り込んでおり、顕微鏡光学系を透過できない。許容可能な代替え値は、Hg334.1nm線で励起することで、この波長では顕微鏡を30％の効率で透過する。Ealing35-2989干渉フィルターは、適切な帯域をもっている。ＤＡＰ／ＣＢの、334.1nmにおける励起コントラスト比は、絶対値として4.0の値を有している。ｄ．ＤＡＰＩ／ＣＢの選択性を更に上げるためには、励起コントラストに加えて、発光コントラストを用いなければならない。ＤＡＰＩはＣＢの赤方に蛍光の大部分を放出することに注意されたい。ＤＡＰＩ対ＣＢ、およびＤＡＰＩ対ＦＩＴＣに対する最大放出コントラストの波長はいずれも490nmである。画像形成に適した格子フィルターはOmega 485DF22である。この帯域には水銀の輝線は存在せず、したがつて、低フレアーのＤＡＰＩ画像が得られることが期待される。ＤＡＰＩとCascade Blue、および、ＤＡＰＩとＦＩＴＣ間の計算上の放出(emission)コントラストは６．８である。従って、ＤＡＰＩとCascade Blue間で達成可能な全体のコントラストは、約27倍である。ＤＡＰＩとFITCの、全体的なコントラストは、この値よりずっと大きいが、その理由は、ＤＡＰＩ励起波長では、ＦＩＴＣの励起はほとんどゼロになるからである。ｅ．Omega 450DRLP02ダイクロイックの光線分割器(beam splitter)は、ここに提案する励起と発光（放出）フィルターによくマッチしている。 Cascade Blueの画像形成 Cascade Blue(CB)は、ＤＡＰＩに大きくオーバーラップする、幅の広い、２ピーク性の励起スペクトルを持つが、赤方の(FITC)隣接にはオーバーラップしない。ＣＢのストークシフトは極めて小さい；すなわち、励起スペクトルと発光スペクトル間には、オーバーラップが極めて大きい。これらの要因が組み合わされて、ＤＡＰＩの存在下でＣＢの画像形成を行うことには問題がある。要約すると：ａ．ＣＢ／ＤＡＰＩ励起コントラストのスペクトルのピークは396-404nmにある。しかし、ＣＢのストークシフトが極めて小さいということから、これは発光コントラストのピーク（408nm）に極めて近い。画像のＳ／Ｎにとっては、励起をより効率的に行うというよりは、高効率で発光を集光する方がより重要であるから、400-410nm領域はＣＢ蛍光のために保持されている。ＣＢ励起の最良妥協点はOmega 38OHT15であり、これはHg366nm線にオーバーラップして十分な強度の励起を生じさせる。ｂ．DAPIに対して少しでも発光コントラストを達成するためには、発光フイルターは狭帯域でなければならず、しかも、注意深く設置されなければならない。適当なフィルターは、Omega 405DF10であるが、それでも理論的最高コントラストは2.5に過ぎない。このように、DAPIを除きながらCBを画像化することは困難であることが予想される。ｃ．Cascade BlueはFITCに対して高い励起コントラストを示す（Omega 38OHT15 フィルターによってコントラスト比が６）。ｄ．CB／FITCに対する発光コントラスト比は、490nm以下では、非常に大きな値にまで達し、405DF10フィルターの位置では実質的に無限大となる。以上の考察から、DAPIまたはCascade Blueを使うことが可能であるが、DAPIの対比染色(counterstain)が弱くない限りは、両方一度には使えないことを示唆している。Cascade BlueはFITCから容易に分離可能であり、他の５つの蛍光体の組み合わせが考察された。 FITCの画像形成以下の点が高コントラストのFITCの画像形成に関連する：ａ．FITCの励起スペクトルはCascade Blue（420nmの先では、FITC／CBのコントラストパラメータRbは極めて大きな値になる）の励起スペクトルと大きくオーバーラップする。このことによって、吸収曲線の高周波数側の肩におけるFTTCを励起させることが可能になり、Cy3の目に見える程の励起を防ぐことができる。ｂ．FITC励起スペクトルと充分オーバーラップする水銀の輝線は存在しない。従って、この蛍光体を励起するには、単蛍光体の画像形成のように、連続体（cont inuum）を使用する必要がある。FITCとCBのギャップによって非常に広い励起フィルターを利用することが可能になる。この機能には、Omega 455DF70がよく適している。ｃ．Omega 455DF70の帯域はまた幸運にもFITC／Cy3(460nm；絶対消滅比Ｒ_a=8.8) に対する励起コントラスト比が最大となるところに対応している。ｄ.FITCの発光スペクトルはCy3の発光スペクトルとオーバーラップ（赤方で）し、DAPIとCBの両方とかなりオーバーラップする（青方で）。しかしながら、FITC 励起について規定される条件ではDAPI又はCascade Blueを全く励起しないので、これらは関係がない。FITC／Cy3の発光コントラスト比は540nm以下で非常に高い値になる。従って、Omega 530DF30フィルターは非常に高い発光コントラストを与え、これは、455DF70によって得られるFITC／Cy3(8.8)についての高励起コントラストを増す。従って、FITCをはっきりと画像形成することが可能であると思われる。 Cy3の画像形成 Cy3の高コントラスト画像形成には以下の点が関係する：ａ．Cy3の吸収ピークは551nmにあり、この波長ではFITCの励起は実質的にゼロである（コントラストパラメーターRbは525nmの赤方までの極端に高い値にジャンプする）。ｂ．Cy3の消光ピークはHg 546.1nm線と強くオーバーラップする。ｃ．Cy3／Cy3.5の励起コントラスト比はあらゆる波長で小さく、波長によってやや変化する。551nmでは、Cy3／Cy3.5の励起コントラストの絶対値は２より小さく、Cy3吸光度が非常に低くてFITC吸光度が高い場合には、青方までかなり上昇するだけである。実際、460-470nmあたりのRaにおける見かけの上昇は、この領域のスペクトルの絶対精度が低いために生じたものかも知れない。上述した議論からすると、Cy3／Cy3.5で使用できる励起コントラストは低すぎて使用できないことは明らかである。ｄ．Cy3／Cy3.5の励起コントラスト比は570nm以下で突然上昇する。Cy3蛍光の56 7nmのピークにおいては、Saの絶対値は約６である。励起コントラストパラメーターのファクター２とあわせると、これはCy3とCy3.5とを１０倍区別するという目標にやっと合致するであろう。Ealing 35-3722狭帯域干渉フィルターは、Hg 5 77/579輝線とかなりオーバーラップするが、適している。しかしながち、546DF1 0フィルターを通ってきたこの輝線からの迷光は、選択したダイクロイックであるOmega 560DRLP02によって十分ブロックされることが期待できる。ｅ．Cy3とCy3.5とを区別して励起できないことは、Cy3の画像形成中にCy3.5が無駄にブリーチングされた(wasteful bleaching)ことを意味する。Ｃｙ３．５の画像形成下記の点が本染料を用いる高コントラスト画像形成の要約である：ａ．Ｃｙ３．５およびＣｙ３間の励起コントラスト比が約５６５ｎｍを超える非常に高い値に上昇する。この領域にはＣｙ３．５の励起スペクトルのピークが含まれる。ｂ．５７７／５７９ｎｍにおける水銀アーク線はＣｙ３．５の吸光度のピークと殆ど正確に一致する。この波長において、励起コントラスト比は約２５である。すなわち、Ｃｙ３に対してＣｙ３．５の非常に強い選択的励起が可能である。本目的のための理想フイルターはEaling 35-3763である。高コントラストが、フイルターの帯域幅ではなく主にＨｇ線の位置の結果であることに注意。ｃ．Ｈｇ５７７／５７９励起波長において、Ｃｙ５に対するＣｙ３．５についての励起コントラスト比も全く大きい（絶対値約８．０）。ｄ．Ｃｙ３．５の発光が有用的に強い、すなわち、Ｃｙ３からのＣｙ３．５の単離が主に励起コントラストに依存する場合に、Ｃｙ３に対するＣｙ３．５についての発光コントラストパラメーターは全ての波長において小さい。ｅ．Ｃｙ５に対するＣｙ３．５についての発光コントラストも相当広いスペクトル間隔にわたって大きい（そして６４０ｎｍ未満で非常に高い値に上昇する）。このことにより、本当に広帯域のフイルターをＣｙ３．５の画像形成するのに使用し得る。適当な要素はOmega 615DF45である。上記励起条件および発光条件の組み合わせでは、Ｃｙ３．５チャンネル中にＣｙ３またはＣｙ５のいずれの滲み出し(bleadthrough)が殆どないと思われる。ｆ． Omega 590DRLP02はこのチャンネルのための適切な二色性である。Ｃｙ５の画像形成次の点がこの染料を用いる画像形成に関連する。ａ．６００ｎｍを超えると、Ｃｙ５対Ｃｙ３．５についての励起コントラスト比が非常に大きい。すなわち、Ｃｙ３．５に対して非常に高い励起コントラストが可能である。ｂ．Ｃｙ５励起の配置は、Ｃｙ３．５ではなくてＣｙ５．５に対する励起比により決定される。Ｃｙ５／Ｃｙ５．５励起コントラストパラメーターは６５０ｎｍにおいて２．２５の数値のピークとなる。したがって、Ｃｙ３／Ｃｙ３．５対に類似して、Ｃｙ５／Ｃｙ５．５についての励起コントラストは小さい。ｃ．Ｃｙ５を励起するにのに利用できるＨｇ線はない。したがって、FITC励起と同様、アーク源を用いて連続体を使用しなければならない。この方法において、Ｃｙ５を励起するための「公認な("official")」フイルターはOmega 640DF20 であり、Ｃｙ５を用いて約１．８の励起コントラストを与える。ｄ．Ｃｙ５を励起するためのより明るい光源はＨｅ−Ｎｅレーザー（６３２．８ｎｍ）である。しかし、それはＣｙ５．５に対して励起コントラストを改善しない。ｅ．Ｃｙ３．５に対するＣｙ５についての発光コントラストは６７３ｎｍにピークを示し、これはちようど赤色の蛍光強度ピークに相当する。発光コントラスト比が約３．１の場合に、最も接近して利用できるフイルターはOmega 660DF32 である。これは、Ｃｙ３に対するＣｙ５について非常に高い励起コントラストを一層増加する。ｆ．Ｃｙ５．５に対するＣｙ５についての発光コントラストは６７５ｎｍよりも短い波長で非常に高い値をもたらす。Omega 660DF32フイルターはこれを完全に利用するために理想的に設定される。残念なことに、それは前記640DF20励起装置にうまく接近されておらず、そのため、反射／散乱励起光からの一定のフレア(flare)が予期される。Ｈｅ−Ｎｅレーザーの使用はこの問題を取り除く。ｇ．Ｃｙ５イメージングについて最も良く利用できる二色ビームスプリッターはOmega 645DRLP02であり、特に励起光源としてＨｅ−Ｎｅが使用される場合にそうである。Ｃｙ５．５の画像形成Ｃｙ５．５はこのセットの最後から二番目の染料であり、Ｃｙ７から非常によく分離される。したがって、Ｃｙ５に対するそのコントラストのみを詳細に考慮する必要がある。ａ．Ｃｙ５．５／Ｃｙ５対についてのコントラストパラメーターＲｂは大きい値に上昇し、６７０ｎｍの赤色に達する。したがって、この蛍光体対について非常に高い励起コントラストを達成できる（Ｃｙ３．５／Ｃｙ３と同様に）。Ｃｙ５と同様、ＨｇアークはＣｙ５．５を励起するのに良い光源でない。最も利用できる光源は６８０ｎｍダイオード−励起逓倍周波数(diode-pumped frequency do ubled)ＹＡＧマイクロレーザー(Amoco製)であり、これはＣｙ５．５の吸光度のピークと一致する。６８０ｎｍにおいて、Ｃｙ５．５／Ｃｙ５についての励起コントラスト比は５．１である。適切な励起フイルターはEaling 35-4068である。ｃ．Ｃｙ５．５およびＣｙ５間の発光コントラスト比は７０５ｎｍにピークを示し、約３ｎｍであり、Ｃｙ５．５強度曲線の赤色にまで達する。この点におけるＳｂについての数値は４である。Omega 700EFLPロングパス発光フイルターを使用する場合、約３のコントラスト比（平均して８００ｎｍになる）が予期される。これは、光励起コントラストと組み合わせられ、Ｃｙ５．５の画像形成を極めて綺麗にする。ｄ．わずかに低い発光コントラストの労費（これはそんなに意味がないと思われる）および強度のいくらかの損失において、Ealing 35-6345のような帯域フイルターをOmcga 700EFLPと置換できるであろう。潜在的な利点は赤外バックグラウンドの減少、すなわち、全体的に改良されたイメージコントラストであろう。Ｃｙ７の画像形成Ｃｙ７はセットの内で最も赤い染料である。励起スペクトルと発光スペクトルはＣｙ５．５から良く分離されており、Omcga 740DF25/770DRLPO2/780EFLPトリプレットに良く一致する。Oriel 58895はＣｙ７についての適切なＩＲブロッカーである。 DAPI，FITC，Ｃｙ３，Ｃｙ３．５，Ｃｙ５，Ｃｙ５．５，Ｃｙ７蛍光体セットの画像形成のために選択されたフイルターを下の表２に要約する。狭い帯域の励起および蛍光の検出が充分なコントラストを達成するのに必須であるので、これらのフイルターセットの内のいずれも従来の蛍光顕微鏡の製造者により供給されるフイルターセットに対応しない。顕微鏡システムの特徴は、Ballard S.G.等(J.Histochem．Cytochem 41:1755-1 759(1993)、参照として本明細書に含める）により詳細に記載されている。大凡定常的なスペクトル力分布のため、高圧75W DCキセノンアーク(XBO)が励起光源として使用された。冷却されたＣＣＤカメラ(Photomctrics CH250)を装備したZe iss Axioskop顕微鏡ワークステーションを使用した。対物レンズは63×1.25NA P lan Neofluarであり、これは「平面("plan")」および高い開口数をもつアポクロマート系でなければならなかった。選択したフイルターセットは最大コントラストをもつ６種の蛍光体間を識別できた（表２）。フルオロフオア間のクロストーク(crosstalk)を可及的に少なくするために、フイルターセットを、フオトンの最大情報量ではなくてスペクトルの最大識別を基準に選択した。イメージ露出時間をフオトン束差および束励起断面積について調節するために変化させた。充分なコントラストを達成するために、狭い帯域の励起および蛍光検出が必須である。適切な励起および発光フイルターセットを使用してこれらの蛍光体を光学的に識別した（表２）。組み合わせ標識方法は各フルオロフオアについての強度値の正確な測定値に依存する。臨界的な特徴は異なるイメージの正確な調節、色収差の補正および各フルオロフオアの特定の量である。簡単なマニュアル画像形成手法はこれらの要求事項を実現できないので、新たなソフトウエアを発明者等の実験室で開発した。このプログラムは順番に次のステップを含む。すなわち、（１）幾何学的画像シフトの補正、（２）DAP［セグメント化マスクの計算、（３）各組み合わせ蛍光体について、バックグラウンド強度値の計算と差し引き、閾値の計算およびセグメント化マスクの創設、（４）各プローブの「Boolean」サイン(signature)を確立するために各蛍光体のこのセグメント化マスクの使用、（５）各染色体について、DAPI画像に次ぐ染色体物質の表示、（６）合成グレー値画像の創設、ここで、各標識された対象は単一のグレー値を用いてコード化される、（７）各グレー値を個々の色に割り当てるルックアップテーブル(look-up-table:LUT)を使用して結果の最終提示のステップである。上述のプログラムは、Macintosh Quadra 900で実行される画像分析パッケージ (BDS-Image)を基礎に開発された。光学的および機械的欠陥によりもたらされる画像シフトを、Waggoner，A.等(Methods Cell Biol 30:449-478(1989))により記載され、修正された（du Manoir，S.等、Cytometry 9:4-9(1995);du Manoir，S. 等、Cytometry 9:21-49(1995)、これらすべてを参照として本明細書中に含める）手順にしたがって各画像中の単一染色体の重力中心（質量の中心）の調節により補正した。DAPI画像を使用して各染色体の形態学的境界を画定した。染色体の正確なセグメント化をシルクハットフイルター(top-hat filter)により画像を予備濾過することにより行った(Smith，T.G.等、J．Neurosci Methods 26:75-81(1 988);du Manoir，S.等により修正された、Cytometry 9:4-9(1995);duManoir,S. 等、Cytometry 9:21-49(1995))。シルクハット濾過したDAPI価像のグレーレベルヒストグラムの形態を閾値として使用した。各蛍光体バックグラウンドを、画像から平均染色体内蛍光強度を差し引くことにより除去した。染色体の蛍光強度の平均値を使用して各蛍光体の個々のセグメント化マスクについての閾値を計算した。個々のDNAターゲットは、各プローブ、すなわち、このDNAプローブを標識するのに使用される蛍光体の組み合わせ、の「Boolean」サインに依存する割り当てられた識別グレー値であった。最終ステップにおいて、表示のため、ルックアップテーブルを使用して各DNAターゲットにこのグレー値に依存する偽色を割り当てた。励起および発光路ならびに二色ミラー中のフイルターセットを切り替えることはマニュアルによりなされるが、コンピューターで制御した電気機械的解決が手順の自動化をもたらし得る。３．光学的くし(Optical Combs) 別の態様では、多数蛍光体の選択的励起および蛍光スペクトルサインの分析を、波長選択的透過フイルターではなくて分散光学(dispersion optics)を使用して実施できる。このような光学は、ショートパス、ロングパス、単一通過帯域および複数通過帯域機能を含む通過帯域特徴を創設することにより使用できる。この方法では、分散要素（プリズムまたは回折格子）を波長選択的空間フイルターと共に使用して所望のスペクトル応答を創設する。本明細書中ではこの組み合わせを「くしフイルター("comb filter")」と称する。くしフイルターを使用して、励起用光のスペクトル分布を多数の蛍光体の同時最適化励起のために目的にあわせて設定できる。逆くしフイルターも、励起のために使用される波長のみをCC Dカメラから選択的にブロックするのに使用でき、残りの波長間隔（くしの歯の間のギャップに相当する）を蛍光体により発光した蛍光のスペクトル分析に利用できる。この分析はスペクトルサインに寄与する。４．干渉計上記の光学フィルターを用いる代わりに、干渉計をエピ蛍光顕微鏡と共に用いてもよい。干渉性（例えば、アルゴンレーザー）か又は非干渉性（例えば、水銀アークランプ）である蛍光の励起のための光源を用いることができる。水銀−キセノン混合ガスアークランプが、その強烈な水銀線及び広域キセノン可視及び近赤外連続性の故に好ましい。種々の干渉計デザインのいずれ（Michelson干渉計のようなデザイン）を用いてもよいが、Sagnac干渉計を用いるのが好ましい。Sagnac干渉計は、類似の Michelson干渉計よりも、大きな受入れ角度、大きなエンテンデュー（ entendue）を有し、そしてアラインメント、振動、及び温度変動に対してより小さな感受性しか有さない。 Sagnac干渉計は、共通路（common path）干渉計である。干渉計とは、２又はそれを越える光の干渉ビームからなる。共通路干渉計においては、各々が同じ路であるが反対方向を進行する２本のビームが存在する。その光路は、例えば、ビームスプリッターを介して光を反射することにより作られる。マルチビーム干渉計は、光源からの光学的エネルギーを２本の実質的に等しい光ビームに分割することによって機能する。これら２本の光ビームを、１本がサンプルを通過した後に結合させ、その干渉パターン（２本のビームの干渉によって生じる結合光の強度の変化）を検出するのである。 Sagnac干渉計では、光源も２本の実質的に等しい部分に分割される。ビームスプリッター上での光の入射角の変化（干渉計の回転、又は干渉計内の検流計駆動ミラーのような光学素子の回転による）が、その干渉計の１本の光学軸に沿って光路の長さを変化させる。これが、検出器、例えば、ＣＣＤ検出器の１本の光学軸に沿って縞模様（fringe pattern）をもたらす。その検出器の他の軸は、グレースケールのサンプル取りができる。干渉計又はミラーを回転することにより光路長を走査すると、その縞模様は、それぞれの絵画素に干渉像を作る。この干渉像をフーリエ変換すると、そのＣＣＤのその絵画素上に当たる光のスペクトルができる。かくして、Sagnac干渉計の利点は、それが、一点においてというよりも視野全体にわたって光路差をもたらすということである。 Sagnac干渉計の簡単な一例を図１に示す。諸光学素子のうちの１つが小さくシフトするような攪乱は、両方のビームに同じように作用するので、その測定値には影響しない。この機械的安定性は、温度変化に対してもこの干渉計を比較的非感受性にする。かくして、この共通路干渉計のもう一つの利点は、その本来的な安定性である。Sagnac干渉計及びそれらの使用は周知である（例えば、米国特許第３,９２４,９５２号；４,４１０,２７５号；４,５２９,３１２号；４,６３７, ７２２号；４,６７１,６５８号；４,６８７,３３０号；４,８３６,６７６号及び５,１０８,１８３号を参照のこと）。 Sagnac干渉計の一実施形態（J．Bruce Rafertら，“Monolithhic Fourier-Tra nsfrom imaging spectrometer”，Applied Optics，November 1995）において、この干渉計の受入れ角度は：ｑ＝２ｎ tan^-1（ｗ／８ａ）であるとされている。式中、ｗ／ａ＝tan ３０°であり、ｗはその干渉計の開口部幅であり、ａは各々の脚の長さであり、そしてｎはその干渉計ガラスの屈折率である。図１を参照すると、これは、約８°の最大受入れ角度となる。他のデザインでは、この受入れ角度は異なってもよいが、如何なる場合においても、この干渉計への入力ビームは平行化されることを要しない。その干渉パターン又は干渉像は、最も好ましくは、５１２×５１２絵画素又はそれより大きな容量の（Princeton InstrumentsフレームトランスファーＣＣＤカメラのような）ＣＣＤカメラで検出される。Sagnac干渉計における干渉像は角度依存性を有しているので、このＣＣＤ検出器の各々の絵画素は、小さな間隔の干渉像を生み出す。その干渉像の縞間隔は、そのＣＣＤ検出器上の絵画素がその干渉像を適切にサンプル取りできるように設定される。１つの絵画素（pixel）が干渉像を適切にサンプル取りするために跨がることができる光路差（ＯＰＤ）は、関係式：ＯＰＤ_pixel＝λ_min／４により与えられる。式中、λ_minは、その干渉計により測定されるスペクトル中の最短波長である。このＯＰＤ_pixelは、その干渉計の分解能の理論的限界を決定する。ＯＰＤがミラーを回転することにより変化するにつれて、干渉像はＣＣＤ検出器と交差して動いてゆくので、最大光路差は、関係式：ＯＰＤ_max＝Ｎ（ＯＰＤ_pixel）により与えられる。式中、Ｎは、諸絵画素におけるＣＣＤ検出器の線寸法である。次いで、干渉計ビームスプリッター上の光入射の各々の角度変位を、１又は幾つかのＯＰＤ_pixelに対応させることができる。そして、ＣＣＤ検出器の場合には、ＣＣＤデータの１つの枠が、この角度変位をサンプル取りするために必要とされる。次いで、最終的に、各々の絵画素が、その絵画素に当たる光のスペクトル、その絵画素に当たる光の強度、及びその絵画素のｘ及びｙ座標についての情報を含有する干渉像を含むことになる。この光のスペクトルは、コンピューターによるフーリエ変換アルゴニズムの使用により、その干渉像から回収することができる。実際には、典型的には約１０,０００：１である、ＣＣＤの制限された動的範囲の故に、蛍光を励起させるのに用いられる光は、その干渉計に入るのを遮断される筈である。この励起光は、サンプルから発せられる蛍光よりも、しばしば１０８〜１０１２強い。光学フィルターを使用することにより遮断しなければ、この励起光は、ＣＣＤを飽和させてしまうであろう。しかしながら、このフィルターは、その励起を遮断し、他の全ての波長を通過させるために加工されることだけを要する。一つの態様においては、紫外（ＵＶ）光が、蛍光プローブを励起させるために用いられる。ＵＶ光は、可視及び近赤外カラーが干渉計を通過するのを可能にする長路干渉フィルターで容易に遮断され得る。この態様は、現在使用されている蛍光染料の多くを励起させるという利点を有している。この態様は、可視蛍光の干渉計への９０％より良好な透過を可能にするという利点も有している。ＵＶの欠点は、それが染料を可視光よりも速く光漂白するということである。干渉計の入力及び出力レンズ両方は、非常に高効率のカメラレンズであって、画像形成の効率に有意に影響しないのが好ましい。干渉計内の画像の焦点は、ズーム接眼レンズの可変性パワーに対して一定であるように調節されるのが最も好ましいので、無限画像距離（infinite image distance）の特性を有する（オリンパスＡＸ７０顕微鏡のような）顕微鏡が好ましい。上記の干渉計は、光学フィルターに対して一定の利点を有している。１つの鍵となる利点は、蛍光により発せられる全ての光が理論的には検出に利用可能であるが、干渉フィルターの透過率は限定されているという点である。もう１つの利点は、それらフィルターを変える必要がないので、フィルターの非平行による画像シフトがないという点である。Ｅ．本発明の用途本発明のＦＩＳＨ（蛍光in situハイブリダイゼーション（Fluorescent In Si tu Hybridization））法及び試薬の、転位、逆位、重複等のような染色体異常を検出及び分析する能力を多くの用途に用いることができる。中でも、その主要な用途は、出産前及び出産後の疾患のような遺伝病の細胞遺伝学的診断、複合腫瘍核型分析、隠性転位の分析である。それは、自動化された染色体同定及び分析のための新規な方法を提供する。多くの疾患（出産前の疾患、癌（特にＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２関連乳癌）、白血病、ダウン症等）は、本発明の方法を用いて識別され得るところの再配列及び他の染色体異常により特徴付けられる。慣用的な細胞遺伝学的バンド法による染色体の核型分析は、時間浪費的でコストが嵩み、かつ容易には自動化することができない。核型分析による中実腫瘍組織内での遺伝的変化の再発の検出は、バンドパターンに基づくだけのマーカー染色体同定を極端に難しくするところの、十分な質及び量の中期スプレッドを定型的に調製することの困難性及び多くの染色体変化の複雑性の故に、特に問題がある。実際、過去２０年間にわたる核型分析を自動化する試み（例えば、パターン一致法、固有分析(eigen analysis)）は、複雑なバンドパターン、特に広範に再配列された染色体のバンドパターンを信頼性をもって解読するようには、強健なコンピューターが開発されなかったので失敗した。細胞遺伝学的技術の次世代は、それぞれが異なるカラーで標識されたプローブ又はプローブの組のハイブリダイゼーションにより分子的に定義されたバンドを用いることによって、遙に優れたものとなることが提案された（Nederlof，P.M. ら，Cytometry 11:126-131(1990)；Nederlof，P.M.ら，Cytometry 13:839-845(1 992)；Lengauer，C.ら，Hum Mol Genet 2:505-812(1993)）。これは、高い可転性を有しかつ染色体バンド法及び前中期における染色体の高分解分析の導入に十分に匹敵する躍進を構成するであろう。ＦＩＳＨ核型の利点は、マーカー染色体の染色体起源、ダブルーミニッツ（double-minutes）及び相同性染色領域（ＨＲＳ）の瞬時の同定である。“貧弱な質”の染色体スプレッドでも評価され得る。望ましければ、特定の用途又は特定の臨床的用途、例えば、血液学的疾患、出産前又は出産後の診断用にプローブの組を設計することができよう。隠性転位の同定のために染色体の特定領域（例えば、末端小粒領域）を染色する具体的なプローブの組の開発は、全体染色体着色プローブの限界を克服するであろう。同じく、そのようなプローブは、個々の染色体上にマルチカラー“バーコード”を生じさせるのに用いられ、それによって自動核型分析が容易になろう。染色体の特定のアームに特異的であるプローブを設計することもでき、それによって、転位中断点、組換えのホットスポット等の分子的特徴付けが可能になる。他の用途には、迅速な進化論的研究が含まれる。但し、ヒト染色体へのマルチカラーＦＩＳＨの手順を、予期されるように、他の種への応用のために調節してもよい。本発明の方法は、病原菌（梅毒トレポモーマ、リケッチア、ボレリア、肝炎ウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ヘルペス、グループＢストレプトコッカス、下痢原因物質、急性髄膜炎を起こす病原菌等）の組織中、又は血液若しくは血液産物中での存在又は不存在を評価するのにも用いることができる。これは、そのような物質に特異的な標識プローブを用いることによって達成することができる。さらには、血清型特異性プローブを用いることによって、本発明の方法は、そのような物質の迅速な血清型での分類、又はどの物質が薬剤耐性決定基を有しているかの確認を可能にする。本発明の方法は、放射線に曝されたことにより起こる（原子力発電プラントで放射能に曝された職員などの）染色体異常を評価するのに用いることができる。本発明の方法は、増殖させるのが難しい微生物（歯周疾患に関連する嫌気性微生物など）を定量するのに用いることができる。本発明の方法は、急性細菌性髄膜炎の迅速な診断のための手段を提供する。血清学的分析を行なうために血清型特異性プローブを用いることができるので、特定の薬剤耐性決定基に特異的であるプローブを用いることができ、それによって、病原菌の存在及び同一性だけでなく、特定の抗生物質に対するその感受性又は耐性も迅速に確認することができる。本発明の方法は、更に、多くの異なるＤＮＡプローブの同時マッピングを可能にする。この技術で、個々の無傷細胞内の染色体数及び構築の分析にアクセス可能になる。中間期細胞遺伝学は、小領域特異性プローブ、例えば、ＹＡＣクローンで既に可能になっている。そのような分析の精度は、レーザー走査顕微鏡を使用する三次元分析により向上するであろう。加えて、レーザー走査顕微鏡の使用は、遂には、中間期核内の全ての全体染色体着色プローブを見えるようにするであろうし、そして発育状態、細胞周期又は疾患状態の関数としての核内染色体構成に関する疑問が取り扱われるであろう。中間期核内の核内染色体構成についての異なるモデルが最終的に探索されよう。現時点では、慣用的なレーザー走査顕微鏡は、用いられる幾つかのフルオロポア（fluorophores）の励起を可能にしないが、他のより適切なフルオル（fluors）又は装置を用いることができる。非有糸分裂細胞にまで拡げると、本発明の方法は、染色体構築を試験することを可能にするか又は１回のハイブリダイゼーション実験において核の染色体含有量を定量することを可能にする。従って、発育状態、細胞周期又は疾患状態の関数としての核内染色体構成に関する疑問を取り扱うことができる。加えて、単一の細胞内の複数のｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルを定量的に評価するか又はそれらが異なる細胞内分布を示すかどうかを確認する能力が、無数の興味ある生物学的疑問を取り扱うのに極端に有用であることを明らかにするだろう。本発明のマルチパラメーター画像化は、情報の処理量を単に増加させるのではなく、生物学的材料の使用をより効率的にもする。かくして、それは、空間的及び時間的相互関係だけでなく、他の方法では信頼性を確立するのが難しいかも知れない組織モザイク（mosaicisms）を明らかにできる。ｍＲＮＡ及びタンパク質の細胞内分布は、核内染色体ドメインについての場合のように、空間的に明確な順位が分かっていないので、組み合わせ標識戦略をこれら実験に用いることは可能ではないであろう。しかしながら、多くのｍＲＮＡ及びタンパク質抗原は、スペクトル的に分解可能でありかつ検出可能である。かくして、発癌タンパク質又は腫瘍サプレッサータンパク質の細胞内分布を初めて同じ細胞内で同時に測定することができる。Ｆ．自動核型分析本発明の一側面は、自動化された、好ましくはコンピューターで容易化された核型分析に関する。上記のように、本発明の一態様においては、特定の核型の染色体は偽着色され（pseudo-colored）、それによって染色体の帰属、又は転位、欠失等の認識が容易となる。その一つの下位の態様においては、染色体のデジタル化された画像がコンピューター解読可能な保存装置（磁気ディスク又は光学ディスク）内に保存され、他の染色体画像との比較又はそれらの伝送及び研究が容易になる。この点において、偽着色過程がバンド化されたか又は裸にされた染色体画像を遅延させられるように、転位特異的プローブ又は下位染色体要素若しくは領域に特異的なプローブを用いることができる。その染色体の画像をコンピューターに保存できるように、個々のバンドの位置及び大きさは好ましくはデジタル化されて保存される。同じく、あらゆる転位の正確な位置又は他の核型異常を認識して保存することができる。かくして、本発明の方法は、核型分析を、これまでに実施可能であった分析よりも広範かつ正確に行なわれるようにする。かくして、本発明は、核型異常を疾患又は状態と系統的に関連付けるのに用いることができる。例えば、患者の核型とその個体素因との間に作られる相関関係を他の疾患又は状態に相関させるのを可能にするために、無症候性個体の核型を得てから、後の何らかの疾病（例えば、癌、アルツハイマー病等）又は状態（例えば、高血圧、アテローム硬化症等）に照らして評価することができる。同じく、特定の核型と疾患又は状態の将来の経過とを相関させるのを可能にするために、診断された疾患又は状態を有する個体の核型を得てから、後のその疾患又は状態の進行又は回復の程度に照らして評価することができる。更なる下位の態様においては、コンピューター又は他のデジタル信号アナライザーを用いて、染色体画像の方向を定めたり変えたりできると共に、その核型の染色体を割当てたり同定したりすることもできる。かくして、コンピューター又は他のデーター処理機は、特定の染色体を特定の登録済みのものに割り当てるに際して（例えば、特定の染色体画像が、評価される核型の染色体７の画像であると割り当てるに際して）、プリンター、モニター、又は他の出力手段を介して、その割り当てられた染色体をその相同体（例えば、患者の核型の第２染色体７）及び発生体（generate）と共に、各々の常染色体がその相同体と対になっておりかつ性染色体Ｘ及びＹが一緒に対になっている染色体画像の順序立ったアレイにグループ分けするであろう。１つの下位の態様においては、そのようなアレイの染色体画像は、上記の偽着色された画像となろう。また、そのような偽着色は、染色体の同一性を割り当てる本法の内部的なものであってもよいので、コンピューター又はデジタル信号アナライザーの出力に表示されなくてもよい。むしろ、この下位の態様においては、発せられる出力は、核型が評価される患者の中期染色体の光顕微鏡可視バンドパターンとなろう。更なる下位の態様においては、あるスケール（Morgan又は他の適当な単位）が染色体画像の上に重ねられるであろう。ここまで本発明を一般的に説明してきたが、以下の実施例を参照することにより、同様な事柄がより容易に理解されるであろう。この実施例は、説明のために付されたものであって、特に断らない限り、本発明を限定することを意図したものではない。実施例１染色体のコンビナトリアルラベリング 24色を生み出す実行可能性を検査する目的で、22本の常染色体と２本の性染色体とを表わす染色体彩色用プローブを用いた。用いられたDNAプローブは顕微手術により作製された。顕微手術により作製されたプローブ（National Center for Human Genome Res easch,Bethesda，MD）により標的領域の非常に均一なラベル化が実施される。顕微手術およびPCR増幅のための詳細なプロトコールはTeleniusら(Telenius,H.et al.,Genes,Chromosomes & Cancer 4:257-263(1992);Telenius,H.et al.,Genomic s 13:718.725(1992);Meltzer,P.S.et al.,Nature Genetics 1:24-28(1992);Guan ,X.Y.et al.,Hum Mol Genet 2:1117-1121(1993);Guan,X.Y.et al.,Genomics 22: 101-107(1994):Guan,X.Y.et al.,Hum Genetics 95:637-640(1995)、これら全ては引用により本明細書に取り込まれる）により記載されている。幾つかの染色体については、p-腕とq-腕について異なるDNAプローブが利用可能であり、それらはすなわち、第2、4、5、10、11、16、18およびＹ染色体である。他の全ての染色体については、顕微手術により作製され、染色体全体を彩色するプローブを用いた。好ましい蛍光体のセットの最初のメンバーであるDAPIを一般的なDNA対比染色として用いた。残りの蛍光体は：フルオレセイン、Cy3、Cy3.5(発光スペクトルと励起スペクトルはCy3とCy5との間にある)、Cy5(Mujumdar,R.B.et al.,Cytomet ry 10:11-19(1989)、およびCy7（Cy5の赤色に対して発光する）(Ernst,L.A.,et al.,Cytometry 10:3-10(1989))、を異なるプローブにコンビナトリアルラベルを施すのに用いた（表３）。これらの染料の際だった特色は、高い励振係数、量子収量、および光安定度である。フルオレセインは励振係数が約70,000Ｌ/モルおよび至適緩衝液中での量子収量が約0.7のキサンチン染料である。シアニン類についての各値は１-200,000および0.3である(Waggoner,A.,Methods in Enzymolog y 246:362-373(1995))。顕微手術の後にはこれらのプローブをPCR増幅に供し、そしてニックトランスレーションによりラベルした。フルオレセイン(Wiegant,J.et al.,Nuc Acids Res 19:3237．3241(1991))、Cy3およびCy5を直接ラベル化のためにDUTPに直接連結させた。Cy3.5およびCy7は、ビオチニル化させたか、もしくはジゴキシニン化させた（digoxinigated）プローブの二次検出のためのアビジンもしくは抗ジゴキシン複合体として利用することができた。これらのプローブは通常のＮ-スクシンイミドエステルのカップリング化学法を用いて合成した。各プローブについては、1〜3回の個別のニックトランスレーション反応が必要であり、各反応について単一ラベル化を施した蛍光体ラベル化三リン酸、またはビオチンもしくはジゴキシゲニンを用いた（表３）。予想どうり、等量の異なる蛍光体でラベル化したプローブは各蛍光体について同等なシグナル強度を示さなかったが、これはフィルターセットが、光子処理量よりもむしろスペクトルの識別を最大限にするよう選択されたという事実を反映していた。シグナル強度-微分値（signal intensity-differentials）を減少させる目的では、ハイブリダイゼーションミックスについてのプローブ濃度を多数の回数の対照実験において注意深く確立する必要があった。ハイブリダイゼーション条件はこれらのマルティプレックスプローブ（multiplex probes）について至適化させた。従って、プローブを変性させ、そして2〜3晩の間37℃で通常の50 ％ホルムアミドハイブリダイゼーションカクテル中の分裂中期染色体スプレッド（spread）に対してハィブリダイズさせた。このスライドを45℃下、50％ホルムアミド１/2×SSC中で３度洗浄し、次いで60℃下、0.1×SSC中で３度洗浄して余剰なプローブを除去した。４×SSC/3%ウシ血清アルブミン中での30分間、37℃下での遮断段階の後に、ビオチニル化させたプローブはアビジンCy3.5で、dig-ラベル化されたプローブは抗-dig-Cy7で検出した。フルオレセイン-dUTP、Cy3-dUT P、およびCy5-dUTPはいずれかの免疫学的検出段階をも必要としなかった。45℃ 下での４×SSC/0.1% Tween20での３度の最終洗浄の後にはマウント用培地およびカバーガラスを適用させ、そして各蛍光体からのハイブリダイゼーションシグナルを表３に列挙されるフィルターセットを用いて画像化させた。図１は、本方法に従って用いられるCCDカメラおよび顕微鏡の概略図を提供する。図２は、骨髄患者（BM2486）からの染色体の核型分析からの生データを示す。源の各像に近接するものはソフトウエアープログラムにより作製された染色体「マスク」である。図２においては、パネルＡおよびＢはDAPI像およびマスクであり；パネルＣおよびＤはFITC像およびマスクであり；パネルＥおよびＦはCy3像およびマスクであり；パネルＧおよびＨはCy3.5像およびマスクであり；パネルＩおよびＪはCy5像およびマスクであり；そしてパネルＫおよびＬはCy7像およびマスクである。図３Aおよび3Bはスペクトル標識（spectral signature）による個々の染色体の同定を示している。図３Aは図２と同一の写真であるが、例外は図３Aが無彩色スケールで偽着色されていることである。図３Bはその染色体の核型配列を示す。本発明の方法の例外的パワーは、この方法により、通常の非染色体特異的核型分析と比較すると（relative to）、染色体５および８の転座が図３Aおよび３B では容易に同定されることにより説明される。先の実験は、５つの蛍光体をスペクトルにより識別して少なくとも24の異なる色を生み出すことができるということを示している。このコンビナトリアルラベル化スキームは以前に考えられていたように複雑である必要はないが、なぜなら５つの蛍光体をプローブのラベル化のために用いることにより僅か９の彩色用プローブを多くとも３つの蛍光体でラベル化することが必要であるに過ぎないためである。プローブのラベル化のための６番目の蛍光体により最高でも63の可能な蛍光体の組合せが使えるようになるであろう。このような多数の異なる標的は大抵の適用法には必要ではないであろうが、最高のスペクトル標識（spectral s ignature）での組合せ物の選択が可能になる。これらの既述のプロトコールにより、高信頼性でかつ再現性のある多色FISHが可能となる。本発明はその具体的態様と関連させて記載されてきたが、更に別の改変物が可能であること、およびこの適用法は、一般的には本発明の理念に従い、かつ本発明に付属し、そして本明細書のこれまでの部分およびこれ以降に記載される主な特徴に適用することができてよい当該技術分野内に含まれる知られているもしくは通常の慣習で実現される本開示からの逸脱物の様なものを含む本発明のいずれかの変法、使用、もしくは応用法を添付される請求の範囲の範囲内に包含することが意図されることが理解されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者バラード，スティーブン・ジーアメリカ合衆国コネチカット州06517，ハムデン，ハートフォード・ターンパイク 459

Claims

【特許請求の範囲】１．コンビナトリアル的に標識されたオリゴヌクレオチドプローブの組であって、その各メンバーは、（ｉ）前記組の別のメンバーの標識と区別可能な予め決定された標識を有し；かつ（ｉｉ）ヒト核型の１つの予め決定された常染色体または性染色体に特異的にハイブリダイズすることができ；前記組は、前記ヒト核型の各常染色体または性染色体が少なくとも１つのメンバーに特異的にハイブリダイズすることができるのに十分なメンバーを有することを特徴とする組。２．前記組が、前記ヒト核型の各常染色体または性染色体の準染色体フラグメントに特異的な少なくとも１つのメンバープローブを含む、請求項１記載のコンビナトリアル的に標識されたオリゴヌクレオチドプローブの組。３．前記プローブがビオチン成分により標識されたヌクレオチド残基を含む、請求項１記載のコンビナトリアル的に標識されたオリゴヌクレオチドプローブの組。４．前記プローブが、標識されたビオチン結合リガンドによりさらに標識されている、請求項３記載のコンビナトリアル的に標識されたオリゴヌクレオチドプローブの組。５．前記プローブの少なくとも１つが、１つまたはそれ以上の蛍光団を含むビオチン結合リガンドにより標識されている、請求項４記載のコンビナトリアル的に標識されたオリゴヌクレオチドプローブの組。６．少なくとも１つの前記蛍光団が、蛍光団ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７からなる群より選択される、請求項５記載のコンビナトリアル的に標識されたオリゴヌクレオチドプローブの組。７．前記プローブの少なくとも１つが２以上の蛍光団を含むビオチン結合リガンドにより標識されている、請求項５記載のコンビナトリアル的に標識されたオリゴヌクレオチドプローブの組。８．２以上の蛍光団を含む前記ビオチン結合リガンドの１つの蛍光団が、蛍光団ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７からなる前記群より選択される、請求項７記載のコンビナトリアル的に標識されたオリゴヌクレオチドプローブの組。９．２以上の蛍光団を含む前記ビオチン結合リガンドのすべての蛍光団が、蛍光団ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７からなる前記群より選択される、請求項８記載のコンビナトリアル的に標識されたオリゴヌクレオチドプローブの組。１０．前記組の少なくとも１つのメンバーが、蛍光団ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７からなる群より選択される２以上の蛍光団により標識されており、前記組の各メンバーが前記蛍光団の群より選択される少なくとも１つの蛍光団により標識されている、請求項５記載のコンビナトリアル的に標識されたオリゴヌクレオチドプローブの組。１１．前記組の少なくとも１つのメンバーが、蛍光団ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７からなる群よりそれぞれ選択される２つの蛍光団により標識されており、前記組の各メンバーが前記蛍光団の群より選択される少なくとも１つの蛍光団により標識されている、請求項１０記載のコンビナトリアル的に標識されたオリゴヌクレオチドプローブの組。１２．前記組の少なくとも１つのメンバーが、蛍光団ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７からなる群よりそれぞれ選択される３つの蛍光団により標識されており、前記組の各メンバーが前記蛍光団の群より選択される少なくとも１つの蛍光団により標識されている、請求項１０記載のコンビナトリアル的に標識されたオリゴヌクレオチドプローブの組。１３．ヒト核型の個々の常染色体または性染色体を同時に同定しかつ区別する方法であって、（ａ）前記染色体の調製物を、一本鎖形態で、コンビナトリアル的に標識されたオリゴヌクレオチドプローブの組と核酸ハイブリダイゼーションが生ずる条件下で接触させ、その組の各メンバーは、（ｉ）前記組の別のメンバーの標識と区別可能な予め決定された標識を有し；かつ（ｉｉ）ヒト核型の１つの予め決定された常染色体または性染色体に特異的にハイブリダイズすることができ；前記組は、前記ヒト核型の各常染色体または性染色体が少なくとも１つのメンバーに特異的にハイブリダイズすることができるのに十分なメンバーを有しており；前記接触により前記調製物中の各常染色体または性染色体の少なくとも１つが前記プローブの組の少なくとも１つのメンバーとハイブリダイズし；（ｂ）前記プローブの組のメンバーにハイブリダイズした前記調製物の各染色体について、そのメンバーの予め決定された標識を検出し同定し、そのメンバーの標識の同一性と、そのメンバーが特異的にハイブリダイズした前記ヒト核型の常染色体または性染色体の同一性とを相関させ、このことにより前記メンバーにハイブリダイズした染色体を同定し；そして（ｃ）前記ヒト核型の各常染色体または性染色体が前記調製物中で同定されるまで工程（ｂ）を繰り返す、の各工程を含む方法。１４．前記オリゴヌクレオチドプローブの組が、前記ヒト核型の常染色体または性染色体の準染色体フラグメントに特異的な少なくとも１つのメンバープローブを含む、請求項１３記載の方法。１５．前記プローブが、ビオチン成分により標識されたヌクレオチド残基を含む、請求項１３記載の方法。１６．前記プローブが、標識されたビオチン結合リガンドによりさらに標識されている、請求項１５記載の方法。１７．前記プローブの少なくとも１つが、１つまたはそれ以上の蛍光団を含むビオチン結合リガンドにより標識されている、請求項１６記載の方法。１８．少なくとも１つの前記蛍光団が、蛍光団ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７からなる群より選択される、請求項１７記載の方法。１９．前記プローブの少なくとも１つが、２以上の蛍光団を含むビオチン結合リガンドにより標識されている、請求項１７記載の方法。２０．２以上の蛍光団を含む前記ビオチン結合リガンドの蛍光団の１つが、蛍光団ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７からなる群より選択される、請求項１９記載の方法。２１．２以上の蛍光団を含む前記ビオチン結合リガンドのすべての蛍光団が、蛍光団ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７からなる群より選択される、請求項２０記載の方法。２２．前記組の少なくとも１つのメンバーが、蛍光団ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７からなる群より選択される２以上の蛍光団により標識されており、前記組の各メンバーが前記蛍光団の群より選択される少なくとも１つの蛍光団により標識されている、請求項１７記載の方法。２３．前記組の少なくとも１つのメンバーが、蛍光団ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７からなる群よりそれぞれ選択される２つの蛍光団により標識されており、前記組の各メンバーが前記蛍光団の群より選択される少なくとも１つの蛍光団により標識されている、請求項２２記載の方法。２４．前記組の少なくとも１つのメンバーが、蛍光団ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７からなる群よりそれぞれ選択される３つの蛍光団により標識されており、前記組の各メンバーが前記蛍光団の群より選択される少なくとも１つの蛍光団により標識されている、請求項２２記載の方法。２５．工程（ｂ）において、前記ハイブリダイズしたプローブメンバーの予め決定された標識を検出するために光学的コームが用いられる、請求項１３記載の方法。２６．工程（ｂ）において、前記ハイブリダイズしたプローブメンバーの予め決定された標識を検出するために光学的フィルターが用いられる、請求項１３記載の方法。２７．工程（ｂ）において、前記ハイブリダイズしたプローブメンバーの予め決定された標識を検出するために複数の光学的フィルターが逐次的に用いられる、請求項２６記載の方法。２８．前記組の少なくとも１つのメンバーが、蛍光団ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７からなる群より選択される２以上の蛍光団により標識されており、前記組の各メンバーが前記蛍光団の群より選択される少なくとも１つの蛍光団により標識されている、請求項２６記載の方法。２９．前記組の少なくとも１つのメンバーが、蛍光団ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７からなる群よりそれぞれ選択される２つの蛍光団により標識されており、前記組の各メンバーが前記蛍光団の群より選択される少なくとも１つの蛍光団により標識されている、請求項２６記載の方法。３０．前記組の少なくとも１つのメンバーが、蛍光団ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７からなる群よりそれぞれ選択される３つの蛍光団により標識されており、前記組の各メンバーが前記蛍光団の群より選択される少なくとも１つの蛍光団により標識されている、請求項２６記載の方法。