JP2000507814A - 増殖細胞破壊用酵素コンビネーション - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞の破壊、特に増殖細胞の破壊に有用な酵素コンビネーションに関する。本発明はまた、これらの酵素コンビネーションを細胞内に導入し細胞内で発現させ得るベクター、及び、治療、特に癌の遺伝子治療におけるそれらの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 増殖細胞破壊用酵素コンビネーション 本発明は細胞の遺伝子治療の分野に関する。より詳細には本発明は、細胞の破 壊、特に増殖細胞の破壊に有効な酵素コンビネーションに関する。本発明はまた 、これらの酵素コンビネーションを細胞内に導入し細胞内で発現させるベクター 、治療におけるそれらの使用、特に癌の遺伝子治療におけるそれらの使用に関す る。 生物または細胞に遺伝情報を導入する遺伝子治療は近年になって飛躍的に発展 した。特に、病理に関与する遺伝子が同定されたこと、遺伝子導入用ベクターが 作製されたこと、コントロール発現系または組織特異的発現系が開発されたこと などが、これらの新しい治療方法の開発に貢献した。例えば、過去５年間に、欧 州及び米国では、一遺伝子疾患（血友病、膵嚢胞性線維症）、癌、心血管疾患ま たは神経系障害などの分野で細胞遺伝子治療の臨床試験が数多く実施された。 細胞の異常増殖に関連する疾病（癌、再発狭窄症、など）の分野では種々の方 法が開発されている。いくつかの方法は腫瘍 のサプレッサー遺伝子（ｐ５３、Ｒｂ）を使用し、別の方法は癌遺伝子（ｍｙｃ 、Ｒａｓ）に対して誘導されたアンチセンスを使用し、更に別の方法では免疫治 療（腫瘍抗原または特異的免疫細胞などの投与）を使用している。別の１つの方 法では、細胞の破壊を誘発し得る毒性遺伝子即ち自殺遺伝子を対象細胞に導入す る。導入される遺伝子としては例えば細胞を医薬感受性にし得る遺伝子が使用さ れる。一般にこれらの遺伝子は、哺乳類由来でない無毒性酵素をコードする遺伝 子であり、哺乳類細胞に導入されて発現したときに初期状態では殆どまたは全く 無毒であったプロドラッグを高い毒性の物質に変換する遺伝子である。このよう なプロドラッグの活性化メカニズムはいくつかの利点を有している。即ち、プロ ドラッグの濃度または酵素の発現を調節することによって最適な治療指数が得ら れる、プロドラッグの投与を中止することによって毒性を遮断し得る、また、致 死率を算定できる、などの利点がある。更に、これらの自殺遺伝子の利点は、特 定種類の腫瘍に特異的でなく普遍的なことである。即ち、例えば腫瘍サプレッサ ー遺伝子または癌遺伝子拮抗性アンチセンスの使用に基づく戦略は、該サプレッ サー遺伝子中に欠損を有しているかまたは該癌遺伝子の過剰発 現を生じている腫瘍にしか使用できない。また、免疫治療に基づく方法は、免疫 的制限及び免疫適格性を考慮しながら個々の患者毎に治療方法を開発しなければ ならない。これに反して、自殺遺伝子の使用に基づく戦略は、全ての種類の腫瘍 、より普遍的には全ての種類の細胞に実際に使用できる。 文献には多数の自殺遺伝子が記載されており、例えば、シトシンデアミナーゼ をコードする遺伝子、プリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードする遺伝子、 水痘ウィルスまたは１型単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼのようなチミ ジンキナーゼをコードする遺伝子が知られている。 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のシトシンデアミナーゼは、シト シンの脱アミノ反応を触媒してウラシルに変換する。従って、大腸菌の遺伝子を 発現する細胞は５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルに変換し得る。５ −フルオロウラシルは毒性代謝物質である（Ｍｕｌｌｅｎら，１９９２Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ ８９ ｐ３３）。 大腸菌のプリンヌクレオシドホスホリラーゼは無毒性のデオキシアデノシン類 似体を強い毒性のアデニン類似体に変換し得る。真核生物の酵素はこの活性を有 していないが、哺乳類細胞 に細菌遺伝子を発現させることができれば、６−メチル−プリン−２’−デオキ シリボヌクレオシドのようなデオキシアデニン類似体はこれらの細胞に毒性の物 質に変換される（Ｓｏｒｓｃｈｅｒら，１９９４ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １ ｐ２３３）。 水痘ウィルスのチミジンキナーゼは６−メトキシプリンアラビノシドを一リン 酸化し得る。哺乳類細胞がこのウィルス遺伝子を発現するならば、モノホスフェ ートが産生され、このモノホスフェートは次に細胞性酵素によって代謝されて毒 性化合物を生じる（Ｈｕｂｅｒら，１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． ＵＳＡ ８８ ｐ８０３９）。 これらの遺伝子のうちでも、治療の見地からはチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコ ードする遺伝子が特に重要である。何故なら、他の自殺遺伝子と違ってこの遺伝 子の場合には、プロドラッグはＤＮＡの合成を阻害する非拡散性物質に変換され るので、分裂中の細胞を特異的に除去し得る酵素が産生されるからである。ウィ ルスのチミジンキナーゼ、特に水痘ウィルスまたは１型単純ヘルペスウィルスの チミジンキナーゼは細胞性酵素とは異なる基質特異性を有しており、アシクロビ ルまたはガンシクロ ビルのようなグアノシン類似体の標的であることが判明した（Ｍｏｏｌｔｅｎ １９８６ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６ ｐ５２７６）。即ち、ガンシクロビル は、哺乳類細胞が酵素ＨＳＶ１−ＴＫを産生するときにだけリン酸化されてガン シクロビルモノホスフェートを産生し、次いで細胞性キナーゼがガンシクロビル モノホスフェートを代謝してジホスフェート、次いでトリホスフェートを産生し 、これがＤＮＡ合成を阻止して細胞を致死させる（Ｍｏｏｌｔｅｎ １９８６， ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４６ ｐ５２７６；Ｍｕｌｌｅｎ １９９４ Ｐｈａｒｍ ａｃ．Ｔｈｅｒ．６３ ｐ１９９）。他のチミジンキナーゼ及び他のグアノシン 類似体の場合にも同様のメカニズムが発生する。 更に、チミジンキナーゼを使用したときには伝播的毒性効果（バイスタンダー 効果）が観察された。この効果は、ＴＫ遺伝子を取込んだ細胞だけの破壊にとど まらず隣接細胞も破壊されることによって証明される。このプロセスのメカニズ ムには３通りの解釈が考えられる。（ｉ）致死細胞に由来のリン酸化ガンシクロ ビルまたはチミジンキナーゼを含有するアポトーシス小胞（apoptotic vesicle ）が形成され、次いでこれらの小胞が食作用によって隣接細胞に取込まれる。（ ｉｉ）チミジンキ ナーゼによって代謝されたプロドラッグが自殺遺伝子を含有する細胞の代謝協同 プロセスによって自殺遺伝子非含有の細胞に移行する。及び／または、（ｉｉｉ ）腫瘍の退行に関連して免疫応答が生じる（Ｍａｒｉｎｉら，１９９５ Ｇｅｎ ｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２ ｐ６５５）。 ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼをコードする自殺遺伝子の使用は当業者 の間で広く知られている。特に、神経膠腫をもつネズミに関する初期のｉｎ ｖ ｉｖｏ試験では、ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子が発現されたとき及びガンシクロビルを １５０ｍｇ／ｋｇの用量で注射したときに、腫瘍の退行が生じた（Ｋ．Ｃｕｌｖ ｅｒら，１９９２ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６ ｐ１５５０）。しかしながら、こ れらの用量はマウス体内で極度に毒性であり（Ｔ．Ｏｓａｋｉら，１９９４ Ｃ ａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ５４ ｐ５２５８）、従ってヒトの遺伝子治療か ら完全に排除された。 また、ヒトに対するいくつかの治験が進行中であり、これらの試験では、特に レトロウィルスベクターまたはアデノウィルスベクターのような種々のベクター を用いてＴＫ遺伝子を細胞に配送している。ヒトの遺伝子治療の臨床試験では、 有効投与 量よりもはるかに少ない５ｍｇ／ｋｇ程度の用量を投与しまた治療期間（１４日 ）も短縮している（Ｅ．Ｏｌｄｆｉｅｌｄら，１９９５ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６ ｐ５５）。もっと多い用量を投与し治療期間を延長した 場合には、望ましくない毒性副作用が実際に観察されている。 これらの欠点を是正するために、グアノシン類似体のリン酸化における特異性 及び活性を改善したチミジンキナーゼ誘導体の合成が提案された。例えば、誘導 的突然変異誘発によって得られた誘導体が記載されている。しかしながら、純粋 な酵素に関する正確な生化学的キャラクタリゼーションが行われたこともなく、 これらの突然変異体を用いた細胞試験が発表されたこともなく、機能的改善が報 告されたこといない（国際特許ＷＯ９５／３０００７；Ｂｌａｃｋら，１９９３ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２ ｐ１１６１８）。更に、最初の４５個のコ ドンが欠失したＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子を真核細胞中で誘導発現させる試験は行わ れたが、使用されたプロドラッグの用量は文献に発表されたすべての試験に記載 された用量と同程度でしかない（Ｂ．Ｓａｌｏｍｏｎら，１９９５ Ｍｏｌ．Ｃ ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５ ｐ５３２２）。従って、今日までに記載された変異体 は いずれもチミジンまたはガンシクロビルに対して改善された活性を有していない 。 本発明は、自殺遺伝子による遺伝子治療の改良方法を提案する。本発明は特に 、チミジンキナーゼによるグアノシン類似体のリン酸化効率を改善し、その結果 としてこのような処置による治療効果を改善し得る方法を記載している。本発明 は特に、ガンシクロビルまたはアシクロビルのようなヌクレオシド類似体の三リ ン酸化方法を提案する。方法は、ガンシクロビル（またはアシクロビル）を、（ ｉ）有意に少ない用量、または、（ｉｉ）より顕著なバイスタンダー効果を惹起 し得る用量、または、（ｉｉｉ）野生型チミジンキナーゼが過剰発現したときに 生じ得る細胞毒性に達しない用量、で投与したときにこれらの類似体の三リン酸 化を極めて有意に増進することを目的としている。 この方法は、癌、心血管疾患に使用でき、また、ウィルス感染細胞のようなあ る種の細胞の致死を要する任意の用途に使用できる。細胞に感染したウィルスの 例は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウィルス）、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）、Ｒ ＳＶ（呼吸器合胞体ウィルス）のようなウィルスである。 本発明は特に、ヌクレオシド類似体のリン酸化反応をｉｎ ｖｉｖｏで改善し 得る酵素コンビネーションの使用に基づく。 本発明の第一の目的は、 −ヌクレオシド類似体をリン酸化してモノホスフェート類似体を産生し得る酵 素と、 −モノホスフェート類似体をリン酸化してジホスフェート類似体を産生し得る 酵素と、 −ジホスフェート類似体をリン酸化して毒性のトリホスフェート類似体を産生 し得る酵素と、から成る組成物を提供することである。 より特定的には、ヌクレオシド類似体をリン酸化してモノホスフェート類似性 を産生し得る酵素はチミジンキナーゼであり、モノホスフェート類似体をリン酸 化してジホスフェート類似体を産生し得る酵素はグアニレートキナーゼであり、 ジホスフェート類似体をリン酸化してトリホスフェート類似体を産生し得る酵素 はヌクレオシドジホスフェートキナーゼ（ヌクレオシド二リン酸キナーゼ）であ る。更に、本発明の組成物は、酵素を直接含むだけでなく、酵素をコードする核 酸を含んでもよい。この観点から、本発明の目的はまた、 −ヌクレオシド類似体をリン酸化してモノホスフェート類似体を産生し得る酵 素をコードする第一の核酸と、 −モノホスフェート類似体をリン酸化してジホスフェート類似体を産生し得る 酵素をコードする第二の核酸と、 −ジホスフェート類似体をリン酸化して毒性のトリホスフェート類似体を産生 し得る酵素をコードする第三の核酸と、から成る酵素コンビネーションをｉｎ ｖｉｖｏで配送及び産生するために有用な組成物を提供することである。 好ましくは、第一の核酸はチミジンキナーゼをコードしており、第二の核酸は グアニレートキナーゼをコードしており、第三の核酸はヌクレオシドジホスフェ ートキナーゼをコードしている。 ヌクレオシド類似体は一般に、例えばガンシクロビル、アシクロビルまたはペ ンシクロビルのようなグアノシン類似体である。ヌクレオシド類似体のその他の 例としては、トリフルオロチミジン、１−〔２−デオキシ、２−フルオロ、ベー ターＤ−アラビノフラノシル〕−５−ヨードウラシル、ａｒａ−Ａ、１−ベータ ーＤ−アラビノフラノシルチミジン（ａｒａＴ）、５−エチル−２’−デオキシ ウリジン、ヨードウリジン、ＡＺＴ、 ＡＩＵ、ジデオキシシチジン、Ａｒａ−Ｃ及びブロモビニルデオキシウリジン（ ＢＶＤＵ）がある。好ましい類似体はガンシクロビル、アシクロビル、ペンシク ロビル及びＢＶＤＵであり、ガンシクロビル及びアシクロビルが特に好ましい。 三リン酸化形態は細胞致死を直接または間接に惹起するという意味で毒性である 。 チミジンキナーゼ（例えばＨＳＶ１−ＴＫ）を発現させるように修飾された哺 乳類細胞がヌクレオシド類似体（例えばガンシクロビル）の存在下に維持される と、これらの細胞はガンシクロビルをリン酸化してガンシクロビルモノホスフェ ートを産生し得る。その後、細胞性キナーゼはこのガンシクロビルモノホスフェ ートをジホスフェート、次いでトリホスフェートに順次に代謝させ得る。このよ うにして産生されたガンシクロビルトリホスフェートはＤＮＡに取込まれること によって毒性効果を発揮し、細胞性アルフアＤＮＡポリメラーゼを部分的に阻害 し、ＤＮＡ合成を停止させる。従って、細胞が死に至る。このメカニズムにおい て、ヌクレオシド類似体のモノリン酸化段階は制限要因的段階と考えられる。チ ミジンキナーゼの固有特性の改善を試みた種々の方法（ＴＫの突然変異体の作製 、より高 い性能の発現系及び投与系の研究）が従来技術に記載されている理由はここにあ る。 本発明は、チミジンキナーゼと、ヌクレオシド類似体のリン酸化に関与する別 の酵素とを同時に投与することによって治療効果を改善できることを証明する。 従って本発明の目的は、ヌクレオシド類似体を三リン酸化する最適な細胞内反応 を惹起する種々の酵素コンビネーションを提供することである。本発明の別の目 的は、これらの酵素コンビネーションを細胞内に導入し細胞内で発現させるベク ターを提供することである。より詳細にはベクターは、各々が１つの酵素を産生 し得る複数のベクターでもよく、または、各々が複数の酵素もしくは全部の酵素 を産生し得る１つもしくは複数のベクターでもよい。本発明はまた、対応する遺 伝子の発現によって任意にその場で産生される酵素コンビネーションの存在下の ヌクレオシド類似体の三リン酸化方法に関する。本発明はまた、増殖細胞の破壊 方法に関する。 ｉｎ ｖｉｔｒｏで行ったヌクレオシドモノホスフェートからヌクレオシドジ ホスフェート、次いでトリホスフェートへのリン酸化は文献に記載されている。 これらのリン酸化を、（ｉ） ガンシクロビルを用いてヒト赤血球溶解物の存在下で行った場合（Ｃｈｅｎｇら ，１９８３ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８ ｐ１２４６０）、または、（ｉ ｉ）ガンシクロビル及びアシクロビルを用いてヒト赤血球のグアニレートキナー ゼ及びヌクレオシドジホスフェートキナーゼの酵素調製物の存在下で行った場合 （Ｍｉｌｌｅｒら，１９８０ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５ ｐ７２０；Ｓ ｍｅｅら，１９８５ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃ．３４ ｐ１０４９）、 は報告されている。哺乳類細胞中のヌクレオシドモノホスフェートからヌクレオ シドジホスフェート次いでヌクレオシドトリホスフェートへのリン酸化は証明さ れていたが、ガンシクロビルモノホスフェートまたはアシクロビルモノホスフェ ートの場合にはこれらの変換が完全ではないと考えられる（Ａｇｂａｒｉａら， １９９４ Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５ ｐ７７７；Ｃａｒｕｓｏら，１ ９９５ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０６ ｐ４９５；Ｓａｌｏｍｏｎら，１９９５ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５ ｐ５３２２）。 本出願はここに、チミジンキナーゼのｉｎ ｖｉｖｏの治療効率を改善し得る 組成物を記載する。 ヌクレオシド類似体をリン酸化してモノホスフェート類似体を産生し得る本発 明の組成物及び方法に使用される第一の酵素は好ましくは、哺乳類に由来しない チミジンキナーゼである。ウィルス由来、特にヘルペスウィルス由来のチミジン キナーゼが特に好ましい。ヘルペスのチミジンキナーゼとしては、１型単純ヘル ペスウィルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）、２型単純ヘルペスウィル スのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ２−ＴＫ）、水痘ウィルスのチミジンキナーゼ（ ＶＺＶ−ＴＫ）、エプスタイン・バールウィルスのチミジンキナーゼ（ＥＢＶ− ＴＫ）があり、また、ウシ由来のヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（Ｍｉｔ ｔａｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７０（１９８９）２９０１）、ウマ由来のヘルペス ウィルスのチミジンキナーゼ（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら，ＮＡＲ １６（１９８８ ）１１３０３）、ネコ由来のヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（Ｎｕｎｂｅ ｒｇら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３（１９８９）３２４０）またはサル由来のヘルペ スウィルスのチミジンキナーゼ（Ｏｔｓｕｋａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １３５（ １９８４）３１６）、がある。 １型単純ヘルペスウィルスの酵素チミジンキナーゼをコードする遺伝子の配列 は文献に記載されている（特に、ＭｃＫｎｉｇｈｔ １９８０ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８ ｐ５９３１参照）。この配列に は、チミジンまたはガンシクロビルに対して同等の酵素活性を有しているタンパ ク質を産生する天然変異体が存在する（Ｍ．Ｍｉｃｈａｅｌら，１９９５ Ｂｉ ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ ２０９ ｐ９６６）。２ 型単純ヘルペスウィルスの酵素チミジンキナーゼをコードする遺伝子の配列も記 載されている（Ｓｗａｉｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６（１９８３）１０４５）。 本発明に使用されるチミジンキナーゼは天然型チミジンキナーゼ（酵素の天然 形態もしくは天然変異体の１つ）でもよく、または、誘導形態、即ち、天然型形 態に（１つまたは複数の）構造的修飾を加えることによって生じた形態でもよい 。上述のように、種々の突然変異体または誘導体が文献に記載されている。これ らの固有の特性は有意に修飾されないと考えられるが、これらの分子は本発明の 範囲内で使用され得る。その例として、ヌクレオシドの相互作用部位のＤＲＨ領 域の近傍に１つの修飾を有する突然変異体がある（国際特許ＷＯ９５／３０００ ７）。ＤＲＨ領域はＴＫの１６３位、１６４位及び１６５位のアスパラギン残基 、アルギニン残基及びヒスチジン残基に対応する。 これらの３つの位置は種々のヘルペスＴＫ中でよく保存されている。１６０−１ ６２位及び１６８−１７０位の種々の突然変異体が記載されている（国際特許Ｗ Ｏ９５／３００Ｏ７）。他の人工変異体はＡＴＰ結合部位の処に修飾を有してい る（フランス特許ＦＲ９６ ０１６０３）。更に、分子生物学の慣用の技術に従 って他のＴＫ誘導体を調製し本発明コンビネーションに使用し得る。これらの突 然変異体は例えば、好ましくはヘルペ又の天然型チミジンキナーゼ、またはその 変異体の１つをコードする核酸に突然変異を誘発することによって作製し得る。 誘導的または無作為な突然変異を生じさせる多数の方法が当業者に公知であり、 その例としては、ＰＣＲもしくはオリゴヌクレオチドによる誘導的突然変異誘発 、あるいは、ヒドロキシルアミンのような化学物質によるｉｎ ｖｉｔｒｏの無 作為突然変異誘発、または、大腸菌の突然変異株中でのｉｎ ｖｉｖｏの無作為 突然変異誘発がある（Ｍｉｌｌｅｒ“Ａ ｓｈｏｒｔ ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ ｂ ａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ． ，１９９２）。このようにして生じた突然変異配列を、細胞系または非細胞系 において発現させ、その発現産物中のチミジンキナーゼ型活性の存在を特に実施 例に記載の条件下で試験する。この方法によって得られた酵素はいずれも、ヌク レオシド類似体をリン酸化してモノホスフェート類似体を産生する能力を有して いるので本発明で使用され得る。 本発明の範囲内では好ましくは、１型単純ヘルペスウィルスのチミジンキナー ゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）に由来のＴＫまたは対応するコーディング核酸を使用する 。より詳細には、ＨＳＶ１−ＴＫまたはその変異体の１つ、例えば天然変異体も しくは人工変異体を使用する。人工変異体としては、特に、Ｐ１５５Ａ／Ｆ１６ １Ｖ及びＦ１６１Ｉ変異体（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３２（１９９３）ｐ１１ ６１８）、Ａ１６８Ｓ変異体（Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎ．７（１９９４）ｐ．８３ ）、または、ＡＴＰ結合部位の処に修飾を有する変異体、例えばＭ６０Ｉ変異体 が挙げられる。更に好ましくは、１型単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ （ＨＳＶ１−ＴＫ）をコードする核酸を使用する。 本発明の組成物及び方法に使用される第二の酵素、即ち、モノホスフェートヌ クレオシド類似体をリン酸化してジホスフェート類似体を産生し得る酵素は好ま しくはグアニレートキナー である。グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）は種々の生物（ヒト、ラット、ウシ 、酵母）から精製されている。また、ＧＭＰＫをコードする遺伝子も様々な種類 の細胞中でクローニングされており、特にＧＵＫ１遺伝子が酵母Ｓａｃｃｈａｒ ｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でクローニングされている（Ｍ．Ｋｏｎｒ ａｄ １９９２ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７ ｐ２５６５２）。この遺伝 子から２０ｋＤａの酵素ＧＭＰＫも精製されている。また、ｇｍｋと命名された ＧＭＰＫの遺伝子も単離され大腸菌中で過剰発現した（Ｄ．Ｇｅｎｔｒｙら，１ ９９３ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８ ｐ１４３１６）。この酵素は協同性 及びオリゴマー形成性についてはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの酵素とは違ってい るが、配列は、４６．２％という高い割合の一致を示す１８２残基の領域を有し ている。潜在的造血細胞増殖活性を有する因子をコードしていることが確認され た配列Ａ１１０４２（欧州特許ＥＰ０２７４５６０）は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅのＧＵＫ１遺伝子に５１．９％の一致を示す１８０残基を有しており、生化 学的データは全く発表されていないがＧＭＰＫのヒト同族体を構成すると考えら れる。 本発明の組成物及び方法に使用される第三の酵素、即ち、ヌ クレオシドジホスフェート類似体をリン酸化してトリホスフェート類似体を産生 し得る酵素は好ましくはヌクレオシドジホスフェートキナーゼである。ヌクレオ シドジホスフェートキナーゼ（ＮＤＰＫ）は広い基質特異性をもつ酵素であり、 種々のソースから精製された（Ｍ．Ｉｎｏｕｙｅら，１９９１ Ｇｅｎｅ １０ ５ ｐ３１）。種々の生物（ミクソコッカス・キサンツス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕ ｓ ｘａｎｔｈｕｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅ ｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、タマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉ ｓｃｏｉｄｅｕｍ）、ラット、ウシ、ヒト、大腸菌及びパン酵母（Ｓ．ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅ））のＮＤＰＫをコードする遺伝子がクローニングされ、対応する 酵素は極めて相同性が高いことが判明した（Ｋ．Ｗａｔａｎａｂｅら，１９９３ Ｇｅｎｅ ２９ ｐ．１４１）。しかしながら、“ロイシンジッパー”配列を 有しているのは高等真核生物の酵素だけである。文献に記載されたＮＤＰＫ活性 をコードするヒト遺伝子は特にｎｍ２３−Ｈ１及びｎｍ２３−Ｈ２である。ｎｍ ２３−Ｈ２ 遺伝子はＮＤＰＫ活性と転写因子という独立の２つの機能をもつ二官 能タンパク質をコードしていると示唆されている（Ｅ．Ｐｏｓｔｅｌら， １９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９ ｐ８６２７）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅのＹＮＫ遺伝子は酵母の必須遺伝子ではなく、１９ｋＤａの単量体分子 量をもつ四量体タンパク質であると考えられるＮＤＰＫをコードしている（Ａ． Ｊｏｎｇら，１９９１ Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２９１ ｐ２４１）。 本発明の範囲内で使用されるＧＭＰＫまたはＮＤＰＫをコードする核酸配列の 起原はヒト、動物、ウィルス、合成または半合成のいずれでもよい。 一般的に、本発明の核酸配列は当業者に公知の任意の技術に従って調製され得 る。これらの技術の代表例としては特に、 −文献に記載された配列及び例えば核酸シンセサイザーを用いる化学合成、 −特に文献に記載されているような特異的プローブを用いるライブラリースク リーニング、または、 −ライブラリーからスクリーニングした配列の化学的修飾（伸長、欠失、置換 、など）を含む混成技術、が挙げられる。 好ましくは本発明で使用される核酸配列はｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ配列である 。ｃＤＮＡ配列は、ＲＮＡから得られたイ ントロンのない配列である。ｇＤＮＡ配列は染色体領域である。真核生物では、 この配列は１つまたは複数のイントロンを含む。本発明の範囲内で使用されるｇ ＤＮＡ配列は、天然遺伝子中に存在するイントロンの全部もしくは一部、または 、例えば哺乳類細胞中の発現効率を高めるためにｃＤＮＡに人為的に導入された １つまたは複数のイントロンを含み得る。核酸は、天然型酵素をコードしてもよ く、または、同種類の活性を有している変異体もしくは誘導体をコードしてもよ い。これらの核酸類似体は、当業者に公知の分子生物学の慣用技術によって得ら れる。例えば、誘導的または非誘導的な突然変異誘発、ライブラリーからのハイ ブリダイゼーション、欠失もしくは挿入、ハイブリッド分子の構築、などによっ て得られる。一般には、核酸の塩基の２０％未満が修飾される。核酸類似体の機 能性は実施例に記載したように発現産物の酵素活性の定量によって決定される。 本発明の特徴をもつ組成物は、チミジンキナーゼをコードする第一の核酸と、 ヌクレオシドジホスフェートキナーゼをコードする第二の核酸とを含む。この実 施態様において、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼはヒト以外の真核生物起 原である のが好ましい。ヒト由来でない酵素とは、ヒト細胞中に自然には存在しない酵素 を意味する。即ち、ウィルス、動物または下等真核生物（例えば酵母）に由来の 酵素を意味する。また、１つまたは複数の構造的修飾を有するヒト酵素の自然に は存在しない誘導体を意味する。より好ましくは、本発明で使用されるＮＤＰＫ は酵母またはウシのＮＤＰＫから選択される。これらの組成物は更に、例えば酵 母のグアニレートキナーゼのようなグアニレートキナーゼをコードする核酸を含 み得る。 本発明の特徴をもつ別の組成物は、チミジンキナーゼをコードする第一の核酸 と、ヒト由来でないグアニレートキナーゼをコードする第二の核酸とを含む。ヒ ト由来でないＧＭＰＫは、ラット、ウシ、酵母、細菌のＧＭＰＫまたはそれらの 誘導体から選択できる。好ましくは、ＧＭＰＫは下等真核生物、特に酵母に由来 する。 特に有利な実施態様によれば、本発明の範囲内で使用されるヌクレオシドジホ スフェートキナーゼの起原は真核生物または動物である。より好ましくは、酵母 またはウシのヌクレオシドジホスフェートキナーゼである。出願人は実際、酵母 特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのヌクレ オシドジホスフェートキナーゼまたはウシのヌクレオシドジホスフェートキナー ゼがガンシクロビルジホスフェートまたはアシクロビルジホスフェートのような ヌクレオシドジホスフェート類似体をリン酸化しヌクレオシドトリホスフェート を産生できるという意外な事実を証明した。更に、実施例に示した結果は、これ らの酵素が夫々の基質に対してヒト酵素よりも卓越した活性を有することをはっ きりと示している。即ち、０．６７５μｇのヒト酵素の存在下で得られるＧＣＶ トリホスフェートの割合は１．５％であるが、０．７５μｇの酵母酵素の存在下 では８２．９％である。また、６．７５μｇのヒト酵素の存在下で得られるＧＣ Ｖトリホスフェートの割合は２４％であるが、１．５μｇの酵母酵素の存在下で は９１．１％であり、５μｇのウシ酵素の存在下では９２％である。別のヌクレ オシド類似体、例えばアシクロビルに関しても同様の結果が得られる。即ち、６ ．７５μｇのヒト酵素の存在下で得られるＡＣＶトリホスフェートの割合は０． ４％未満であるが、１．５μｇの酵母酵素の存在下では８％であり、１５μｇの 酵母酵素の存在下では８１％であり、５μｇのウシ酵素の存在下では１．３％で ある。これらの結果は、本発明のコンビネーション中で酵母また はウシのヌクレオシドジホスフェートキナーゼの使用が有利であることをはっき りと証明する。これらの結果はまた、モノホスフェート類似体を産生する第一の リン酸化段階が必ずしも方法の限定要因的段階でないこと、及び、本発明の酵素 コンビネーションを使用した治療方法によって治療効果が増進されることを証明 する。 更に、出願人はまた、酵母、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅのグアニレートキナーゼがガンシクロビルモノホスフェートまたはアシ クロビルモノホスフェートのようなヌクレオシドモノホスフェート類似体をリン 酸化して有効な活性をもつヌクレオシドジホスフェートを産生し得ることを証明 した。例えば、２．５μｇの酵母酵素の存在下で得られたＧＣＶジホスフェート の割合は９２％を上回り、７４μｇの酵母酵素の存在下で得られたＡＣＶジホス フェートの割合は５４％である。更に、これらの結果は、酵母のグアニレートキ ナーゼがヒト酵素の２倍のＧＣＶＭＰリン酸化速度を有することを示す。また、 ＧＣＶＭＰに対する親和性も、同じ基質に対してヒト酵素が有する親和性の２倍 以上である。結局、ＧＣＶＭＰに対する酵母酵素のＶｍａｘ／Ｋｍの値はヒト酵 素が有する 値の４．４倍である。ＡＣＶＭＰに対しては、酵母酵素のＶｍａｘ／Ｋｍの値は 、同じ基質に対してヒト酵素が有する値の７〜９倍である。 出願人はまた、これらの２つのヒト由来でない酵素と、チミジンキナーゼ、例 えば１型ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼとを組合わせることによって、ガ ンシクロビルまたはアシクロビルのようなヌクレオシド類似体のリン酸化による トリホスフェート誘導体の産生が極めて高い効率で得られることを証明した。 好ましい実施態様によれば、本発明の組成物は、酵母のグアニレートキナーゼ （ＥＣ−２．７．４．８）及び／またはヌクレオシドジホスフェートキナーゼ（ ＥＣ−２．７．４．６）をコードする配列を含む。より好ましくは、これらの配 列は酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの酵素をコードしている。これらの配列は、 ガンシクロビルまたはアシクロビルのようなヌクレオシド類似体を三リン酸化す るために、１型単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ（ＥＣ−２．７．１． ２１）をコードする配列（ＨＳＶ１−ＴＫ）と一緒に使用される。 上述のように、本発明の組成物は、酵素コンビネーション、 または、酵素をｉｎ ｖｉｖｏ産生し得る核酸コンビネーションを含み得る。核 酸コンビネーションのほうが好ましい。その理由は、酵素を高いレベルでｉｎ ｖｉｖｏ産生でき、従って治療効果が極めて大きいからである。 第一の実施態様によれば、本発明の組成物中で核酸は同一の発現ベクターによ って担持されている。この実施態様が特に有利であるが、その理由は、単一のベ クターを哺乳類細胞に導入するだけで所望の治療効果が得られるからである。こ の実施態様においては、互いに異なる核酸が同一発現ベクターの内部で個別の３ つの発現カセットを構成し得る。従って、互いに異なる核酸の各々が、夫々に異 なる転写プロモーター、転写終結因子及び翻訳シグナルのコントロール下に維持 される。また、複数の核酸を、単一のプロモーターと単一の転写終結因子とによ ってその発現が誘導されるポリシストロンの形態で導入することも可能である。 特に、核酸配列間に配置された配列ＩＲＥＳ（“内部リボソーム結合配列（Ｉｎ ｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）”）の使用によって 上記のようなポリシストロン形態が得られる。この観点から、本発明の発現ベク ターは、２つの核酸の発現を誘導するバイシストロン性ユニッ トと任意に第三の酵素をコードする別の１つの核酸とを含み得る。本発明のベク ターはまた、３つの核酸の発現を誘導するトリシストロン性ユニットを含み得る 。これらの種々の実施態様を実施例に示す。 本発明の好ましい発現ベクターとしては特に、 −チミジンキナーゼをコードする第一の核酸と、ヒト由来でないグアニレート キナーゼ、好ましくは酵母のグアニレートキナーゼをコードする第二の核酸と、 を含むベクター、 −チミジンキナーゼをコードする第一の核酸と、ヌクレオシドジホスフェート キナーゼ、好ましくはヒト以外の真核生物のヌクレオシドジホスフェートキナー ゼ、特に好ましくはウシまたは酵母起原のＮＤＰＫをコードする第二の核酸と、 を含むベクター、 がある。 本発明のベクターは更に、グアニレートキナーゼをコードする核酸を含んでい るのが有利である。 本発明のベクター中で使用されるチミジンキナーゼは好ましくはウィルス起原 であり、特にヘルペスウィルスのチミジンキナーゼが有利である。ＨＳＶ−１ま たはＨＳＶ−２ウィルスに 由来のチミジンキナーゼが特に好ましい。 上述のように、本発明のベクターの内部で種々の核酸は、個別のプロモーター のコントロール下に維持されているか、または、単一プロモーターのコントロー ル下のポリシストロン性ユニットを構成している。この観点から、上述したよう な種々の酵素活性を含む１つのタンパク質を産生するように種々の核酸が結合し 、酵素が結合形態で産生されてもよい。本発明のベクターの特定実施態様の特徴 は、ベクターの内部でウィルス起原のチミジンキナーゼをコードする核酸とヒト 由来でないグアニレートキナーゼをコードする核酸とが結合し、ＴＫ活性とＧＵ Ｋ活性との双方を含む１つのタンパク質をコードしていることである。本発明の ベクターの別の実施態様の特徴は、ベクターの内部でウィルス起原のチミジンキ ナーゼをコードする核酸とヌクレオシドジホスフェートキナーゼをコードする核 酸とが結合し、ＴＫ活性とＮＤＰＫ活性との双方を含む１つのタンパク質をコー ドしていることである。酵素間の結合としては、例えば（Ｇ４Ｓ）ｎ構造をもつ ペプチドリンカーを用いて行われる結合を例示し得る。 別の実施態様によれば、本発明の組成物の内部で、核酸は複 数の発現ベクターによって担持されている。 後述するように、発現ベクターはプラスミド起原でもウィルス起原でもよい。 ウィルス起原のベクターの場合、レトロウィルスまたはアデノウィルスが有利で ある。 本発明の範囲内で種々のプロモーターを使用し得る。プロモーターは、哺乳類 細胞中で核酸を発現させ得る配列である。プロモーターは、ヒト細胞内部の機能 性プロモーターから選択されるのが有利である。より好ましいプロモーターは、 異常増殖細胞（癌、再発狭窄症、など）中で核酸配列を発現させ得るプロモータ ーである。この観点から、種々のプロモーターを使用し得る。プロモーターは例 えば、考察中の遺伝子（ＴＫ、ＧＭＰＫ）ＮＤＰＫ）の固有プロモーターでもよ い。また、異なる起原の領域（別のタンパク質の発現を担当する領域、または、 合成領域）でもよい。従って、遺伝子の転写を特異的または非特異的に、誘導的 または非誘導的に、強くまたは弱く刺激するかまたは抑制する任意のプロモータ ーまたは誘導された配列でよい。特に、真核生物遺伝子またはウィルス遺伝子の プロモーター配列を挙げることができる。例えば、標的細胞のゲノムに由来のプ ロモーター配列でもよい。真核生物のプロモーターとしては 特に、遍在性プロモーター（ＨＰＲＴ、ＰＧＫ、ａ−アクチン、チューブリン、 ＤＨＦＲ、などの遺伝子のプロモーター）、中間フィラメントプロモーター（Ｇ ＦＡＰＮデスミン、ビメンチン、ニューロフィラメント、ケラチン、などの遺伝 子のプロモーター）、治療用遺伝子のプロモーター（例えば、ＭＤＲ、ＣＦＴＲ 、ＶＩＩＩ因子、アポＡＩ、などの遺伝子のプロモーター）、組織特異的プロモ ーター（ピルビン酸キナーゼ、ビリン、腸内の脂肪酸結合タンパク質、平滑筋の アルファ−アクチン、などの遺伝子のプロモーター）、癌細胞のような分裂細胞 型の細胞特異的プロモーター、あるいは、誘導プロモーターとも呼ばれる刺激反 応性プロモーター（ステロイドホルモンのレセプター、レチノール酸のレセプタ ー、グルココルチコイドのレセプター、など）が挙げられる。また、アデノウィ ルスのＥ１Ａ遺伝子及びＭＬＰ遺伝子のプロモーター、ＣＭＶの初期プロモータ ーまたはＲＳＶのＬＴＲ（末端反復配列）のプロモーターなどのようなウィルス のゲノムに由来のプロモーター配列でもよい。更に、これらのプロモーター領域 が、活性化配列、調節配列または組織特異的、もしくは優位的発現を可能にする 配列の付加によって修飾されてもよい。 本発明の別の目的は、グアノシン類似体を三リン酸化し得る酵素コンビネーシ ョンと該グアノシン類似体とを含み、両者を同時投与、個別投与、または一定期 間の継続投与によって使用できる製品を提供することである。 本発明はまた、毒性のヌクレオシドトリホスフェート類似体をｉｎ ｖｉｖｏ で産生させる組成物に関する。 本発明の組成物は、 −ヌクレオシド類似体と、 −チミジンキナーゼをコードする核酸と、 −グアニレートキナーゼをコードする核酸と、 −ヌクレオシドジホスフェートキナーゼをコードする核酸と を、個別包装状態または集合包装状態で含む。 本発明は更に、核酸配列の発現によって必要に応じてその場で産生され得るヌ クレオシドリン酸化酵素のコンビネーションを含む組成物を提供する。これらの 酵素の少なくとも１つはヒト以外の真核生物起原である。酵素コンビネーション は特に、ＴＫとＮＤＰＫ、ＴＫとＧＭＰＫまたはＴＫとＧＭＰＫとＮＤＰＫと、 の組合わせから成る。 本発明はまた、ＴＫとＮＤＰＫとを含む酵素コンビネーショ ンを増殖細胞に投与する増殖細胞の破壊方法に関する。好ましくは、コンビネー ションが更にグアニレートキナーゼを含む。本発明はまた、ＴＫとＧＭＰＫとを 含む酵素コンビネーションを増殖細胞に投与する増殖細胞の破壊方法に関する。 この方法によれば、細胞をヌクレオシド類似体、好ましくはグアノシン類似体 と接触させる。ヌクレオシド類似体は酵素コンビネーションを発現させる細胞中 で毒性化合物に変換される。 本発明によれば、酵素をコードする核酸の投与によって酵素を細胞に投与し得 る。 本発明はまた、増殖細胞破壊用医薬組成物を調製するためにヌクレオシドジホ スフェートキナーゼまたはヌクレオシドジホスフェートキナーゼをコードする核 酸を、チミジンキナーゼまたはチミジンキナーゼをコードする核酸と共に使用す る方法に関する。 本発明はまた、ヌクレオシド類似体を酵素コンビネーションと共存させるヌク レオシド類似体の三リン酸化方法に関する。酵素の少なくとも１つはヒト以外の 真核生物起原である。 本発明はここに、多くの細胞性機能障害を抑制し得る新規な治療薬を提供する 。この目的では、本発明の核酸またはカセッ トを治療すべき部位にそのままで注入してもよく、または、破壊もしくは治療す べき細胞と共に直接インキュベートしてもよい。ヌード核酸が特定ベクターを要 せずに細胞に侵入できることは実際に記載されている。しかしながら、本発明の 範囲では、（ｉ）細胞侵入効率、（ｉｉ）標的細胞への命中率、（ｉｉｉ）細胞 外及び細胞内の安定性、を改善できるような投与ベクターを使用するのが好まし い。本発明の特に好ましい実施態様では、核酸配列を運搬ベクターに組込む。使 用されるベクターは、化学的ベクター、プラスミド起原もしくはウイルス起原の ベクターのいずれでもよい。 本文中で使用された化学的ベクターなる用語は、真核細胞に対して核酸配列の 導入及び発現を促進し得る任意の非ウィルス性物質を意味すると理解されたい。 合成または天然のこれらの化学的または生化学的ベクターは、特に、利便性及び 安全性の面、並びに、トランスフェクトすべきＤＮＡの大きさに関する理論的制 約が存在しないという理由で天然ウィルスの重要な代替物となり得る。これらの 合成ベクターは主要な２つの機能、即ち、トランスフェクトすべき核酸を圧縮す る機能と、核酸の細胞定着と原形質膜透過及び場合によっては２つの核膜の透過 とを促進する機能とを有している。核酸のポリアニオン性を緩和するために、非 ウィルス性ベクターはいずれもポリカチオン性電荷を有している。遺伝情報を導 入するために実際に開発されたこの種の非ウィルス性トランスフェクション技術 の代表例としては、ＤＮＡとＤＥＡＥ−デキストランとの複合体を用いる技術（ Ｐａｇａｎｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１（１９６７）８９１）、ＤＮＡと核タンパ ク質との複合体を用いる技術（Ｋａｎｅｄａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３（１９ ８９）３７５）、ＤＮＡと脂質との複合体を用いる技術（Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐ ＮＡＳ ８４（１９８７）７４１３）、リポソームを使用する技術（Ｆｒａｌｅ ｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（１９８０）１０４３１）、などがある 。 遺伝子導入ベクターとしてウィルスを使用する技術は、物理的トランスフェク ション技術に対する有望な代替手段として出現した。この観点から、いくつかの 細胞集団に対するウィルスの感染能力を種々のウィルスで試験した。特に、レト ロウィルス（ＲＳＶ、ＨＭＳ、ＭＭＳ、など）、ＨＳＶウィルス、アデノ関連ウ ィルス、アデノウィルスを試験した。 本発明に使用される核酸またはベクターは、局所的、経口的、 非経口的、鼻孔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮、などの経路で投与され る製剤の形態に調製できる。好ましくは、核酸配列またはベクターが注射可能な 形態で使用される。従って、注射可能な製剤を得るため、特に治療部位の処に直 接注入できる製剤を得るために、医薬として許容される任意のビヒクルと混合し 得る。ビヒクルは特に、等張性の無菌溶液であるか、または、必要に応じて滅菌 水もしくは生理的血清を添加して注射可能な溶質を復元し得る乾燥組成物、特に 凍結乾燥組成物である。患者の腫瘍に核酸配列を直接注入することは、病気に冒 された組織の処に治療効果を集中できるので極めて重要である。使用される核酸 配列の用量は、種々のパラメーター、特に、ベクターの種類、使用される投与モ ード、対象となる疾病または所望の治療期間に適応するように調整し得る。 本発明はまた、上記のような酵素コンビネーションを含む任意の医薬組成物に 関する。 本発明はまた、上記のようなベクターを少なくとも１つ含む任意の医薬組成物 に関する。 本発明はまた、ヌクレオシド類似体をｉｎ ｖｉｖｏでリン酸化するための酵 母起原のＮＤＰＫまたは酵母起原のＧＭＰＫ の使用に関する。 本発明の医薬組成物は、抗増殖性を有するので、特に癌及び再発狭窄症のよう な異常増殖性疾患の治療に特に好適である。従って本発明は、細胞、特に異常増 殖細胞を破壊するための特に有効な方法を提供する。従ってこの方法は、腫瘍細 胞または血管壁の平滑筋細胞（再発狭窄症）の破壊に使用できる。方法は癌の治 療に特に好適である。本発明方法を使用できる癌としては例えば、結腸腺癌、甲 状腺癌、肺癌、骨髄性白血病、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、Ｂリン パ腫、卵巣癌、膀胱癌、膠芽腫、肝癌、骨癌、皮膚癌、膵臓癌または腎臓癌、前 立腺癌、食道癌、喉頭癌、子宮体癌、子宮頚癌、ＨＰＶ陽性非生殖器癌（ｃａｎ ｃｅｒｓ ａｎｏ−ｇｅｎｉｔａｕｘ ＨＰＶ ｐｏｓｉｔｉｆｓ）、ＥＢＶ陽 性上咽頭癌、などがある。 本発明方法はｉｎ ｖｉｔｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで使用できる。ｅｘ ｖｉ ｖｏで使用される方法は本質的に、核酸配列の存在下（またはベクター、カセッ トまたは誘導体直接の存在下）で細胞をインキュベートする処理から成る。ｉｎ ｖｉｖｏで使用される方法は、考察されるプロドラッグ、即ちガンシクロビル またはヌクレオシド類似体の注入前、注入時及び／また は注入後に、有効量の本発明のベクター（またカセット）を生物に、好ましくは 生物の治療すべき部位の処（特に腫瘍）に、直接投与する処理から成る。この観 点から、異常増殖細胞またはその一部をヌクレオシド類似体の存在下で上記のよ うな酵素コンビネーションまたは核酸配列コンビネーションと接触させることか ら成る異常増殖細胞の破壊方法も本発明の目的の１つである。 以下の実施例及び図面に基づいて本発明をより詳細に説明する。これらの実施 例及び図面は本発明の非限定代表例であることを理解されたい。図面の簡単な説明 図１は、ベクターｐｃＤＮＡ３−ＴＫの概略図である。 図２は、ベクターｐＸＬ２８５４の概略図である。 図３は、ベクターｐＸＬ２９６７の概略図である。 図４は、ベクターｐＸＬ３０８１の概略図である。 図５は、タンパク質ＧＭＰＫ及びＮＤＰＫの発現を示す。 図６は、ベクターｐＸＬ３０９８の概略図である。 表１は、ＧＣＶＭＰ及びＡＣＶＭＰに対する酵母のＧＭＰＫ及びヒト赤血球の ＧＭＰＫの反応速度定数である。ａ、ｂ、ｃ は文献に公表された値であり、ａは、〔Ｄ．Ｆ．Ｓｍｅｅら（１９８５）Ｂｉｏ ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３４：１０４９−１０５６〕、ｂは、〔Ｒ．Ｅ ．Ｂｏｅｈｍｅ（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１２３４６−１ ２３４９〕、Ｃは、〔Ｗ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｒ．Ｌ．Ｍｉｌｌｅｒ（１９ ８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：７２０４−７２０７〕に発表されたも のである。 表２は、ＴＫ−ＧＭＰＫ−ＮＤＰＫの結合を用いた場合に形成された産生物中 のヌクレオシドのリン酸型の割合（％）を示す。材料及び方法 略号 ＡＣＶ：アシクロビル ＧＣＶ：ガンシクロビル ＧＭＰＫ：グアニレートキナーゼ ＨＳＶ１−ＴＫ；１型単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ ＮＤＰＫ：ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ分子生物学の汎用技術 プラスミドＤＮＡの分離用抽出、塩化セシウム勾配によるプ ラスミドＤＮＡの遠心、アガロースゲルまたはアクリルアミドゲルにおける電気 泳動、電気溶出によるＤＮＡフラグメントの精製、タンパク質のフェノールクロ ロホルム抽出、塩媒体中のエタノールまたはイソプロパノールによるＤＮＡの沈 殿、大腸菌の形質転換、のような分子生物学で慣用の技術は当業者に公知であり 、文献にも十分に記載されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓ ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら，“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）。 ｐＵＣタイプのプラスミド及びＭ１３シリーズのファージは市販品（Ｂｅｔｈ ｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）であり、プラスミド ｐＢＳＫまたはｐＢＫＳはｓｔｒａｔａｇｅｎから入手する。 いわゆるＰＣＲ（ポリメラーゼ触媒連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒ ａｓｅ−ｃａ ｔａｌｙｚｅｄ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）） 技術によるＤＮＡフラグメントの酵素的増幅は、“ＤＮＡサーマルサイクラー” （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を製造業者の指示通りに用いて行う 。 大腸菌細胞中にプラスミドＤＮＡを電気穿孔によって導入するためには、エレ クトロポレーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を製造業者の指示通りに用いる。 ヌクレオチド配列の確認は、Ｓａｎｇｅｒらが開発した方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａ ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４（１９７７）５４６３−５４６７）に従 い、Ａｍｅｒｓｈａｍから販売されているキットまたはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ ｓｙ ｓｔｅｍｓから販売されているキットを用いて行う。実施例１ 酵素コンビネーションの発現ベクターの構築 この実施例は、本発明の核酸配列をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで 発現及び導入するベクターを構築するための種々の方法を記載する。 １．１ プラスミドベクターの構築 プラスミドベクターを構築するために、様々な種類の発現ベクターを使用し得 る。以下の２つのベクターが特に好ましい。 −ベクターｐＳＶ２。このベクターは、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｐｒａ ｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ Ｖｏｌ．２，Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ（Ｅｄ） ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ，１９８５ に記載されている。このベクターは真核生物の発現ベクターである。本発明の酵 素コンビネーションをコードする核酸をこのベクターのＨｐａＩ−ＥｃｏＲＶ部 位に挿入し得る。従ってこれらの核酸はＳＶ４０ウィルスのエンハンサーのブロ モーターのコントロール下に維持されている。 −ベクターｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。このベクターも真核生物 の発現ベクターである。このベクターにおいては、本発明の酵素または酵素コン ビネーションをコードする核酸配列はＣＭＶの初期プロモーターのコントロール 下に維持されている。 １．２ ウィルスベクターの構築 本発明の特定実施態様では、上記に定義の核酸をｉｎ ｖｉｖｏで導入及び発 現させ得るウィルスベクターを構築及び使用する。 特に、アデノウィルスに関しては、構造及び特性に多少の違いを有している種 々の血清型が特性決定されている。これらの 血清型のうちで、本発明の範囲では、２型もしくは５型のヒトアデノウィルス（ Ａｄ２もしくはＡｄ５）または動物起原のアデノウィルス（国際特許ＷＯ９４／ ２６９１４参照）の使用が好ましい。本発明の範囲で使用できる動物起原のアデ ノウィルスの例としては、イヌ、ウシ、ネズミ（例えばＭａｖ１、Ｂｅａｒｄら ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５（１９９０）８１）、ヒツジ、ブタ、トリまたはサル （例えばＳＡＶ）起原のアデノウィルスが挙げられる。動物起原のアデノウィル スとしてはイヌのアデノウィルスが好ましく、アデノウィルスＣＡＶ２（例えば 、マンハッタン株またはＡ２６／６１（ＡＴＣＣ ＶＲ−８００）が特に好まし い。本発明の範囲では、ヒトもしくはイヌ起原のアデノウィルスまたは双方の混 合アデノウィルスの使用も好ましい。 好ましくは、本発明の欠陥アデノウィルスは、ＩＴＲ（逆方向末端反復配列） とキャプシド形成配列と本発明の核酸とを含む。より好ましくは、本発明のアデ ノウィルスのゲノム中の少なくともＥ１領域が非機能性である。考察中のウィル ス遺伝子は当業者に公知の任意の技術、特に考察中の１つまたは複数の遺伝子の 完全削除、置換、部分欠失または１つもしくは複数の 塩基の付加によって非機能性にできる。このような修飾は、遺伝子工学の技術を 用いるかまたは突然変異誘発物質で処理することによって、（単離ＤＮＡに対し て）ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたはその場で得られる。他の領域、特にＥ３領域（国 際特許ＷＯ９５／０２６９７）、Ｅ２領域（国際特許ＷＯ９４／２８９３８）、 Ｅ４領域（国際特許ＷＯ／９４／２８１５２、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９５ ／０２６９７）、Ｌ５領域（国際特許ＷＯ９５／０２６９７）も修飾できる。１ つの好ましい実施態様によれば、本発明のアデノウィルスは、Ｅ１領域及びＥ４ 領域に欠失を有している。別の好ましい実施態様によれば、本発明のアデノウィ ルスはＥ１領域の、領域Ｅ４と本発明の核酸配列とが挿入される処に欠失を有し ている（フランス特許ＦＲ９４１３３５５参照）。本発明のウィルス中のＥ１領 域の欠失は、好ましくはアデノウィルスＡｄ５の配列のヌクレオチド４５５−３ ３２９の部分である。 本発明の組換え欠陥アデノウィルスは当業者に公知の任意の技術によって作製 できる（Ｌｅｖｒｅｒｏら，Ｇｅｎｅ １０１（１９９１）１９５；欧州特許Ｅ Ｐ１８５５７３；Ｇｒａｈａｍ，ＥＭＢＯ Ｊ．３（１９８４）２９１７）。本 発明の組換えア デノウィルスは特に、アデノウィルスと、特に本発明の核酸配列または核酸配列 コンビネーションを含むプラスミドとの相同組換えによって作製できる。この相 同組換えは、アデノウィルスとプラスミドとを適当な細胞系にコトランスフェク ションした後に生じる。使用される細胞系は好ましくは、（ｉ）上記の因子によ って形質転換され得る細胞系であり、（ｉｉ）欠陥アデノウィルスのゲノムの一 部を補完し得る配列を、好ましくは組換えの危険を避けるために組込み形態で含 んでいる細胞系でなければならない。細胞系の例としては、特にアデノウィルス Ａｄ５のゲノムの左側部分（１２％）がそのゲノムに組込まれたヒト胚腎臓細胞 系２９３（Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９） 、または、特に国際特許Ｗ０９４／２６９１４及びＷＯ９５／０２６９７並びに Ｙｅｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（１９９６）５５９に記載されているようなＥ １機能及びＥ４機能を補完し得る細胞系が挙げられる。 次に、増殖したアデノウィルスを実施例に記載するような分子生物学で慣用の 技術によって回収し精製する。 アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）に関して説明すると、これらは、比較的小さい 寸法のＤＮＡを有しており、感染した細胞の ゲノムに安定にかつ部位特異的に組込まれるウィルスである。アデノ関連ウィル スは細胞の増殖、形態または分化に影響を及ぼすことなく広いスペクトルの細胞 に感染できる。更に、アデノ関連ウィルスはヒトの病理に関与しないと考えられ る。ＡＡＶのゲノムはクローニングされ、配列決定され、特性決定されている。 このゲノムは、約４，７００塩基を含み、各末端に約１４５塩基から成りウィル スの複製起点として機能する逆方向末端反復領域（ＩＴＲ）を含む。ゲノムの残 りの部分はキャプシド形成機能をもつ２つの本質的な領域に分割される。ゲノム の左側部分はウィルスの複製及びウィルス遺伝子の発現に関与するｒｅｐ遺伝子 を含み、ゲノムの右側部分はウィルスのキャプシドタンパク質をコードするｃａ ｐ遺伝子を含む。 Ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子導入のためにＡＡＶに由来のベ クターを使用することは文献に記載されている（特に、国際特許ＷＯ９１／１８ ０８８；ＷＯ９３／０９２３９；米国特許ＵＳ４，７９７，３６８；ＵＳ５，１ ３９，９４１及び欧州特許ＥＰ４８８５２８）。これらの特許出願は、ｒｅｐ遺 伝子及び／またはｃａｐ遺伝子が欠失して有益な遺伝子によって置換されたＡＡ Ｖに由来の種々の構築物、及び、（培養細 胞に対する）ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは（生物体内直接の）ｉｎｖｉｖｏで有益な 遺伝子を導入するためのこれらの構築物の使用を記載している。本発明の組換え 欠陥ＡＡＶは、ヒト補助ウィルス（例えばアデノウィルス）に感染した細胞系に 、ＡＡＶの２つの逆方向末端反復領域（ＩＴＲ）に挟まれた本発明の核酸配列ま たは核酸配列コンビネーションと、ＡＡＶのキャプシド形成遺伝子（ｒｅｐ遺伝 子及びｃａｐ遺伝子）を担持するプラスミドとをコトランスフェクションするこ とによって作製できる。使用できる細胞系の例は、２９３細胞系である。他の産 生系は例えば国際特許ＷＯ９５／１４７７１；ＷＯ９５／１３３６５；ＷＯ９５ ／１３３９２またはＷＯ９５／０６７４３に記載されている。産生された組換え ＡＡＶを次に慣用の技術で精製する。 ヘルペスウィルス及びレトロウィルスに関する組換えベクターの構築は多くの 文献に記載されている。特にＢｒｅａｋｆｉｅｌｄら，Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉ ｓｔ ３（１９９１）２０３；欧州特許ＥＰ４５３２４２及びＥＰ１７８２２０ ；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．７（１９８５）２３５；ＭｃＣ ｏｒｍｉｃｋ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３（１９８５） ６８９、など参照。特にレトロウィルスは、分裂細胞に選択的に感染する融合性 ウィルスである。従ってレトロウィルスは、癌に使用するための有益なベクター である。レトロウィルスのゲノムは本質的に、２つのＬＴＲと１つのキャプシド 形成配列と３つのコーディング領域（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）とを含む。レ トロウィルスに由来の組換えベクターにおいては一般にｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎ ｖ遺伝子の全部または一部が欠失して、有益な異種核酸配列によって置換されて いる。これらのベクターは、様々な種類のレトロウィルス、特にＭｏＭｕＬＶ（ “マウスモロニー白血病ウィルス”、ＭｏＭＬＶとも呼ばれる）、ＭＳＶ（“マ ウスモロニー肉腫ウィルス”）、ＨａＳＶ（“ハーベイ肉腫ウィルス”）、ＳＮ Ｖ（“脾臓壊死ウィルス”）、ＲＳＶ（“ラウス肉腫ウィルス”）、あるいはフ レンド・ウィルスから作製できる。 本発明の核酸配列または核酸配列コンビネーションを含む本発明の組換えレト ロウィルスを構築するために、特にＬＴＲとキャプシド形成配列と上記核酸配列 とを含むプラスミドを構築し、プラスミドに欠損しているレトロウィルス機能を トランス配置で付与し得るいわゆるキャプシド形成細胞系にこのプラス ミドをトランスフェクトする。従ってキャプシド形成細胞系は一般に、ｇａｇ、 ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を発現し得る。このようなキャプシド形成細胞系は従来 技術にも記載されており、特にＰＡ３１７系（米国特許ＵＳ４，８６１，７１９ ）、Ｐｓｉ ＣＲＩＰ系（国際特許ＷＯ９０／０２８０６）及びＧＰ＋ｅｎｖＡ ｍ−１２系（国際特許ＷＯ８９／０７１５０）がある。更に、組換えレトロウィ ルスはＬＴＲの処に転写活性を削除する修飾を含むことができ、また、ｇａｇ遺 伝子の一部を含む伸長したキャプシド形成配列を含むことができる（Ｂｅｎｄｅ ｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１（１９８７）１６３９）。産生された組換えレトロ ウィルスを次に慣用の技術によって精製する。 本発明を実施するためには、アデノウィルスまたは組換え欠陥レトロウィルス の使用が特に有利である。これらのベクターは実際、腫瘍細胞に自殺遺伝子を導 入するために特に有利な特性を有している。 １．３ 化学的ベクター この実施例の項（１．１）及び実施例２に記載の核酸またはプラスミド発現ベ クターはそのままでｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏに投与できる。ヌード 核酸が細胞にトランスフ ェクトできることも実際に証明された。しかしながら、導入効率を改善するため に本発明の範囲内では導入用ベクターを使用するのが好ましい。これはウィルス ベクター（実施例１．２）または合成トランスフェクション剤である。 開発された合成ベクターのうちで、本発明の範囲内ではポリリシン、（ＬＫＬ Ｋ）ｎ、（ＬＫＫＬ）ｎ、（国際特許ＰＣＴ／フランス特許ＦＲ／０００９８） 、ポリエチレンイミン（国際特許ＷＯ９６／０２６５５）及びＤＥＡＥデキスト ラン型のカチオン性ポリマー、または、カチオン性脂質もしくはリポフェクタン トの使用が好ましい。これらのベクターは、ＤＮＡを圧縮し、細胞膜との会合を 促進する特性を有している。これらのベクターとしては特に、リポポリアミン（ リポフェクトアミン、トランスフェクタム、など）、カチオン性または中性の種 々の脂質（ＤＯＴＭＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＰＥ、など）、並びに、核酸起原のペプ チドが挙げられる。更に、レセプターを介してターゲッティングされるトランス フェクションの構想が開発されたが、これは、ＤＮＡを組込む細胞の表面に存在 する膜レセプターのリガンドとカチオン性ポリマーとの化学結合によって複合体 の膜定着を誘導しながらカチオン性ポリマーによって ＤＮＡを圧縮するという原理を利用したものである。トランスフェリンレセプタ ー、インスリンレセプターまたは肝細胞のアシアログリコプロテインのレセプタ ーのターゲッティングが記載されている。このような化学的ベクターを用いる本 発明の組成物の調製は当業者に公知の任意の技術によって行うことができ、通常 は種々の構成成分の単なる接触によって実現する。実施例２ 真核生物発現ベクター中のＨＳＶ１−ＴＫ及びまたはグアニレートキナーゼ及び ／またはヌクレオシドジホスフェートキナーゼのクローニング この実施例は、本発明の酵素コンビネーションをｉｎ ｓｉｔｕで産生するた めにプラスミド発現ベクター系を使用する本発明の特定実施態様を記載する。 哺乳類細胞中で原核生物または真核生物の遺伝子を発現させる技術は当業者に 公知である。最適な発現を得るために、以下に記載の本発明のベクターは以下の シグナル、即ち、（ｉ）ヒト細胞中で十分に発現されるＣＭＶプロモーターのよ うなプロモーター／エンハンサー、（ｉｉ）（Ｇ／Ａ）ＮＮＡＵＧ（Ｇ／Ａ）と いうコンセンサス配列をもつＫｏｚａｋ配列、（ｉｉｉ） 発現すべき遺伝子、及び、（ｉｖ）その下流のポリアデニル化配列を含む（Ｖ． Ｃｈｉｓｈｏｌｍ １９９５ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｏｌ．４，ｅｄ．Ｄ ．Ｇｌｏｖｅｒ ＆ Ｂ．Ｈａｍｅｓ ｐ１）。このような構築物の作製は、ベ クターｐＺｅｏＳＶ、ｐｃＤＮＡ３のような市販のベクターによって可能であり 、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨＳＶ１−ＴＫ、ＧＭＰＫ及びＮＤＫをコードす る遺伝子によって実現した。 ２．１ ＨＳＶ１−ＴＫの発現ベクター プラスミドｐＨＳＶ−１０６（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）に由来の１型単純ヘルペ スウィルスのチミジンキナーゼをコードするＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子を真核生物発 現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でクローニングした。６９ ３６ｂｐのこのプラスミドｐｃＤＮＡ３−ＴＫを構築するために、ｐＢＴＫ１に 由来の１．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩインサートをｐｃＤＮＡ３のＥｃｏＲ Ｉ部位とＮｏｔＩ部位との間に導入した（図１参照）。プラスミドｐＢＴＫ１は 以下の手順で得られた。平滑末端の形成後、ＭｃＫｎｉｇｈｔ １９８０ Ｎｕ ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８ ｐ５９３１に発表された配列をもつＨＳＶ１− ＴＫ遺伝子を含むｐＨＳＶ−１０６に由 来の１．５ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＮｃｏＩインサートを、ｐＢＳＫのＳｍａＩ部位 にクローニングした。 プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＴＫのインサートは、（ｉ）Ｋｏｚａｋ配列（ＣＧ ＴＡＴＧＧ）を含むＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子の上流の６０ｂｐと、（ｉｉ）ＭｃＫ ｎｉｇｈｔ １９８０ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８ ｐ５９３１に発表 された配列に等しい遺伝子の配列（１．１３ｋｂ）と、（ｉｉｉ）同じくＭｃＫ ｎｉｇｈｔによって記載された遺伝子の３’配列（０．３ｋｂ）とを含む。 ２．２ グアニレートキナーゼの発現ベクター ｐＧＵＫ−１に由来のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのグアニレートキナーゼをコ ードする５６１ｂｐのＧＵＫ１遺伝子（実施例３参照）を、Ｋｏｚａｋコンセン サス配列を導入した後の真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ ｅｎ）にクローニングした。このプラスミドｐＸＬ２８５４は以下の手順で得ら れた。ＧＵＫ１遺伝子を含むｐＧＵＫ−１のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩインサートを プラスミドｐＳＬ３０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＸｂａＩ部位とＢａｍＨＩ 部位との間にクローニングし、ＧＵＫ１遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩ酵素とＢａｍＨ Ｉ酵素とによって切除し、ｐｃＤＮＡ３のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＢａｍＨＩ部位 との間にクローニングし、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＧＵＫＩを作製した。この プラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ部位とＰｆｌＭＩ部位との間に、Ｋｏｚａｋコンセ ンサス配列とＧＵＫ１の５’領域とを含む１５０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｐｆｌ ＭＩフラグメントをクローニングして、６００１ｂｐのプラスミドｐＸＬ２８５ ４を形成した。図２参照。１５０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｆｌＭＩフラグメン トは、プラスミドｐＧＵＫ−１とセンスオリゴヌクレオチド６９１５ ５’（Ｇ ＡＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＣＣ ＣＧＴ ＣＣＴ ＡＴＣ Ｇ ＴＡ Ａ）３’（配列１）及びアンチセンスオリゴヌクレオチド６９１６ ５’ （ＧＡＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＴＴ ＧＡＣ ＧＧＡ ＡＧＣ ＧＡＣ ＡＧＴ Ａ）３’（配列２）とを用いてＰＣＲによって増幅し、４５℃でハイブリダー ゼションを行って得られた２８０ｂｐのフラグメントから単離されたものである （Ｋｏｚａｋコンセンサス配列はオリゴヌクレオド６９１５の下線部分である） 。ＰＣＲによって増幅した核酸配列を配列決定すると、この配列は発表された配 列（Ｍ．Ｋｏｎｒａｄ １９９２ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７ ｐ ２５６５２）に比べて、Ｓ２Ａ変化（２位のセリンにアラニンが置換）及びＶ３ ４Ａ変化（３４位のバリンにアラニンが置換）に対応する２つの違いを有してい た。 ２．３ ヌクレオシドジホスフェートキナーゼの発現ベクター プラスミドｐＡＤ１−ＹＮＫ（Ｋ．Ｗａｔａｎａｂｅら，１９９３ Ｇｅｎｅ ２９ ｐ１４１）に由来のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのヌクレオシドジホスフ ェートキナーゼをコードするＹＮＫ遺伝子を、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列導入 後の真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニン グした。このプラスミドｐＸＬ２９６７は以下の手順で作製した。テンプレート となるプラスミドｐＡＤ１−ＹＮＫと、センスオリゴヌクレオチド７０１７ ５ ’（ＡＡＧ ＧＡＴ ＣＣＡ ＣＣＡ ＴＧＧ ＣＴＡ ＧＴＣ ＡＡＡ ＣＡ Ｇ ＡＡＡ）３’（配列３）及びアンチセンスオリゴヌクレオチド ７０３８ ５’（ＡＡＧ ＡＡＴ ＴＣＡ ＧＡＴ ＣＴＴ ＣＡＴ ＴＣＡ ＴＡＡ Ａ ＴＣ ＣＡ）３’（配列４）とを、４０℃のハイブリダイゼーション温度でＰＣ Ｒ増幅した（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列はオリゴヌクレオド７０１７の下線部 分である）。４７７ｂｐの増幅フラグメントをＢａｍＨＩ 及びＥｃｏＲＩによって消化し、次いでｐｃＤＮＡ３のＢａｍＨＩ部位とＥｃｏ ＲＩ部位との間にクローニングして、５８６１ｂｐのプラスミドｐＸＬ２９６７ を作製した。図３参照。ＰＣＲ増幅フラグメントの配列は、４位以外はＹＮＫ遺 伝子の発表された配列に等しい。４位の変化はタンパク質ＮＤＰＫのＳ２Ａ変化 （２位のセリンがアラニンによって置換されている）に対応する（Ｋ．Ｗａｔａ ｎａｂｅら，１９９３ Ｇｅｎｅ ２９ｐ１４）。 ２．４ ２つの遺伝子を同時発現させるベクター 当業者には遺伝子を同時発現させる複数の方法が公知である。好ましい実施態 様では、発現させるべき配列間に、内部リポソーム結合部位を発現させる配列Ｉ ＲＥＳ（Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄら，ＴＩＧ １１（１９９５）１７９）を導入する 。 ＧＵＫ１とＹＮＫとをバイシストロン性ユニットの形態で同時発現させ得るベ クター（ベクターｐＧＵＫ１−ＹＮＫ）を作製するために、ｐｃＤＮＡ３にクロ ーニングされたＧＵＫ１遺伝子の３’に配列ＩＲＥＳとＹＮＫ遺伝子とを導入す る。より詳細には、プラスミドｐＣＩＴＥ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に由来のＥＭＣＶ （脳心筋炎ウィルス）のＩＲＥＳ（内部リポソーム結 合部位）の配列をＰＣＲによってＥｃｏＲＩ部位とＮｃｏＩ部位との間に再クロ ーニングし、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥ ｃｏ ＲＩ部位及びＥｃｏＲＶ部位に導入して、プラスミドｐＸＬ３０６５を作製 する。プラスミドｐＸＬ２９６７に由来のＹＮＫ遺伝子を含む４７７ｂｐのＮｃ ｏ Ｉ−ＥｃｏＲＶフラグメントをｐＸＬ３０６５のＮｃｏＩ部位とＥｃｏＲＶと の間にクローニングして、プラスミドｐＸＬ３０７９を作製する。次にプラスミ ドｐＸＬ３０７９のＩＲＥＳとＹＮＫ遺伝子とを含む１ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｅｃ ｏ ＲＶフラグメントをプラスミドｐＸＬ２８５４のＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＶ 部位との間にクローニングして、プラスミドｐＸＬ３０８１を作製する。このプ ラスミドは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのグアニレートキナーゼをコードするＧ ＵＫ１ 遺伝子の上流にＣＭＶプロモーター及びＴ７プロモーターを含む。ＧＵＫ １ 遺伝子の下流にはＩＲＥＳ及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのヌクレオシドジホ スフェートキナーゼをコードするＹＮＫ遺伝子が続いている。図４参照。Ｐｒｏ ｍｅｇａから入手した網状赤血球の転写／翻訳系中でプラスミドｐＸＬ２８５４ 、ｐＸＬ２９６７及びｐＸＬ３０８１を用いてタンパク質ＧＭＰ Ｋ及びＮＤＰＫの発現を試験した。図５参照。得られた結果は、タンパク質ＧＭ ＰＫ及びＮＤＰＫがプラスミドｐＸＬ３０８１によって同時発現されることを示 す。 同じ方法を使用して、ＴＫとＹＮＫとを同時発現させるベクター（ベクターｐ ＴＫ−ＹＮＫ）またはＴＫとＧＵＫ１とを同時発現させるベクター（ベクターｐ ＴＫ−ＧＵＫ１）を作製する。 ２．５ ３つの遺伝子を同時発現させるベクター ＴＫをコードする配列を前項の実施例２．４のベクターｐＧＵＫ１−ＹＮＫに 挿入して、３つの酵素活性を発現させ得るベクター（ベクターｐＴＫ−ＧＵＫ１ −ＹＮＫ）を作製する。 ２．６ 融合タンパク質ＨＳＶ１−ＴＫ／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＭＰＫ を発現させるベクター 融合タンパク質の構築は当業者に公知であり、一方のタンパク質のＣ末端と他 方のタンパク質のＮ末端との間にペプチドリンカーを形成することによって行わ れる（１９８９ Ｎａｔｕｒｅ ３３９ ｐ３９４）。このようなタンパク質は 複数の酵素を細胞中に共存的に局在させることができ、また基質に対する“侵入 作用”を促進する（Ｌｊｕｎｇｃｒａｎｔｚら，１９８９ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８ ｐ８７８６）。 ＨＳＶ１−ＴＫのＣ末端配列（Ａｓｎ３７６）とＳ．ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅの ＧＭＰＫのＮ末端配列（Ｓｅｒ２）とをリンカー−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ−（Ｇ ｌｙ）４−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４（配列９）を用いて結合させることによって融 合タンパク質を作製した。この融合タンパク質を作製し得るプラスミドｐＸＬ３ ０９８を以下の手順で構築した。センスオリゴヌクレオチド５’（ＣＣＧ ＧＧ Ａ ＧＡＴ ＧＧＧ ＧＧＡ ＧＧＣ ＴＡＡ ＣＧＧ ＡＧＧ ＴＧＧ ＣＧ Ｇ ＴＴＣ ＴＧＧ ＴＧＧ ＣＧＧ ＡＧＧ ＣＴＣ ＣＧ）３’（配列５） とアンチセンスオリゴヌクレオチド ５’（ＧＡＴ ＣＣＧ ＧＡＧＣＣＴ Ｃ ＣＧ ＣＣＡ ＣＣＡ ＧＡＡ ＣＣＧ ＣＣＡＣＣＴ ＣＣＧ ＴＴＡ ＧＣ Ｃ ＴＣＣ ＣＣＣ ＡＴＣＴＣ）３’（配列６）とのハイブリダイゼーション によって、ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子の３’配列（１１０８−１１２８位）をクロー ニングし、ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子のＡｓｎコドン（１１２８位）の下流に、アミ ノ酸（（Ｇｌｙ）₄Ｓｅｒ）₂Ｇｌｙをコードするコドンが存在するようにする。 ５８ｂｐのフラグメントをｐＮＥＢ１９３（Ｂｉｏｌａｂｓ）のＸｍａＩ部位とＢａｍ ＨＩ部位との間にクローニングして、プラスミドｐＴＫＬ＋を作製する。 ｐＸＬ２８５４テンプレートとセンスオリゴヌクレオチド５’（ＧＡＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＧＧＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＧＧＣ ＴＣＣ ＣＧＴ ＣＣＴ ＡＴＣ ＧＴＡ）３’（配列７）及びアンチセンスオリゴヌクレオチド５’（ＧＡＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＴＴ ＧＡＣ ＧＧＡ ＡＧＣ ＧＡＣ ＡＧＴ Ａ）３’ （配列８）とを用いて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＵＫ１遺伝子の５’配列 をＰＣＲ増幅し、ＧＭＰＫの２位のＳｅｒコドンの上流にコドン（Ｇｌｙ）₃Ｓ ｅｒが存在するようにする。０．２７ｋｂのこのフラグメントを、ｐＵＣ１９（ Ｂｉｏｌａｂｓ）のＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間にクローニングして プラスミドを形成し、このプラスミドをＰｆｌＭＩとＢａｍＨＩとによって切断 し、切断箇所にＧＵＫ１の３’配列を含むｐＸＬ２８５４の０．４４ｋｂのＰｆ ｌ ＭＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを導入してプラスミドｐＧＵＫＬ−を作製する 。ｐＧＵＫＬ−の０．５８ｋｂのＢｓｐＥＩ−ＸｂａＩフラグメントをｐＴＫＬ ＋のＢｓｐＥＩ部位とＸｂａＩ部位との間に挿入して、ｐＴＫＬＧＵＫを作製す る。ｐＴＫＬＧＵＫの０．６３ｋｂのＸｍａＩ−ＢａｍＨＩインサー トを発現ベクターｐＥＴ１１ａのＸｍａＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間にクロー ニングしてプラスミドｐＸＬ３０９８を作製する。図６参照。次に、このプラス ミドをＢＬ２１ＤＥ３ｍｅｔ−菌株に導入して、タンパク質ＴＫ−（（Ｇｌｙ）₄ Ｓｅｒ）₃−ＧＭＰＫを産生させる。 次に、融合タンパク質を均質になるまで精製し、この酵素のＧＣＶ及びＡＣＶ のリン酸化反応の速度パラメーターをタンパク質ＨＳＶ１−ＴＫ及びＳ．ｃｅｒ ｅｖｉｓｉａｅのＧＭＰＫによって得られる速度パラメーターに比較する。 ２．７ ｉｎ ｖｉｖｏの導入及び発現 本発明の酵素コンビネーションをｉｎ ｖｉｖｏで導入及び発現させるために 実施例２．１〜２．６に記載のベクターを使用する。このために、これらのベク ターを含む種々の組成物を調製する。 −ベクターｐｃＤＮＡ３−ＴＫと、ベクターｐＸＬ２８５４と、リボフェクト アミンとを含む組成物、 −ベクターｐｃＤＮＡ３−ＴＫと、ベクターｐＸＬ２９６７と、リポフェクト アミンとを含む組成物、 −ベクターｐｃＤＮＡ３−ＴＫと、ベクターｐＸＬ２８５４ と、ベクターｐＸＬ２９６７と、リポフェクトアミンとを含む組成物、 −ベクターｐＴＫ−ＧＵＫ１と、リポフェクトアミンとを、任意にベクターｐ ＸＬ２９６７と共に含む組成物、 −ベクターｐＴＫ−ＹＮＫと、リポフェクトアミンとを、任意にベクターｐＸ Ｌ２８５４と共に含む組成物、 −ベクターｐＴＫ−ＧＵＫ１−ＹＮＫと、リポフェクトアミンとを含む組成物 。 リポフェクトアミンに代えて、実施例１．３に記載のような別の化学的ベクタ ーを使用してもよい。 本発明の酵素コンビネーションを細胞内で導入及び発現させるためにこれらの 種々の組成物をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏで使用する。これらの組成物 はまた、細胞培養物、例えば、繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３の培養物またはヒト結腸 癌細胞ＨＣＴ１１６の培養物に使用できる。ベクターの導入後、ヌクレオシド類 似体を投与し、細胞破壊を観察する。実施例３ グアニレートキナーゼの精製 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＭＰＫを過剰発現している大 脳菌株の非細胞性抽出物は種々の方法で調製できる。例えば、ＥＤＴＡの存在下 のリゾチームによる溶菌、Ｍｅｎｔｏｎ−Ｇｏｌｉｎ、フレンチプレス、Ｘ−プ レス型の粉砕装置の使用、または、超音波処理がある。より特定的には、Ｓ．ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＭＰＫを過剰発現している大腸菌株の非細胞性抽出物を 以下の手順で調製した。 Ｍ．ＫｏｎｒａｄがＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７ ｐ２５６５２，１９９ ２に記載した手順で大胸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＧＵＫ−１株を培養した。遠心 （５，０００×ｇ；２０分）した後、１リットルの培養物から得られた細胞を、 １ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍｌのトリス／ＨＣｌバッファ，２０ｍＭ，ｐＨ７ ．５，に再浮遊させ、４℃で４分間超音波処理する。遠心（５０，０００×ｇ； １時間）後の上清を、トリス／ＨＣ１バッファ，２０ｍＭ，ｐＨ７．５，で平衡 させたＭＯＮＯＱ ＨＲ １０／１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に注入する 。トリス／ＨＣｌバッファ，２０ｍＭ，ｐＨ７．５，中の０−５００ｍＭのＮａ Ｃｌの直線勾配でタンパク質を溶出させる。ＧＭＰＫ活性を含む画分を集めて濃 縮し、次いでＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＨＲ１６／１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ）を用い １５０ｍＭのＮａＣｌを含むトリス／ＨＣｌバッファ，５０ｍＭ，ｐＨ７．５， で溶出させることによってクロマトグラフィー処理する。ＧＵＫ活性を含む画分 を集める。この段階で得られた調製物は、クーマシーブルーで染色した後にＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥ中で単一の可視バンドを生じ、このバンドは見掛け分子量約２１０ ００で泳動する。 文献、Ａｇａｒｗａｌら，１９７８ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．ｖｏｌ．Ｌ Ｉ ｐ４８３に記載のアッセイプロトコルを使用してＧＭＰＫの活性を従来通り に定量する。実施例４ Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのグアニレートキナーゼの反応速度定数の測定 実施例３の手順で精製した酵母のＧＭＰキナーゼの反応速度定数を以下の酵素 アッセイ条件で測定する。 ４ｍＭのＡＴＰと１０ｍＭのＭｇＣｌ₂と１００ｍＭのＫＣｌと１ｍｇ／ｍｌ のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）と５〜１００μＭの〔８−３Ｈ〕ＧＣＶＭＰ（ ４０ｎＣｉ／ナノモル）または２００〜３２００μＭの〔８−３Ｈ〕ＡＣＶＭＰ （４０ｎＣｉ／ナノモル）とを含む１００μｌのトリス／ＨＣｌバッファ， ５０ｍＭ，ｐＨ７．８，中で、酵母のＧＭＰキナーゼを３０℃で１０分間インキ ュベートする。反応混合物を８０℃で３分間加熱することによって反応を停止さ せ、５０μｌの１０ｍＭリン酸カリウムバッファ，ｐＨ３．５，を添加し、１０ ，０００×ｇで２分間遠心後、１００μｌの上清を以下の系中の高性能液体クロ マトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析する。固定相 ：Ｐａｒｔｉｓｐｈｅｒｅ ＳＡＸ（ＷＨＡＴＭＡＮ） −粒径：５μｍ−寸法４．６×１２５ｍｍ。移動相 ： バッファＡ：ＫＨ₂ＰＯ₄，０．０１Ｍ，ｐＨ３．５（ｐＨは濃Ｈ₃ＰＯ₄によって 調整） バッファＢ：ＫＨ₂ＰＯ₄，０．７５Ｍ，ｐＨ３．５（ｐＨは濃Ｈ₃ＰＯ₄によって 調整）。流速 ：１ｍｌ／分。勾配 ： 検出： ＵＶ：２６５ｎｍ 放射化学分析：トリチウムの検出 シンチラント（Ｏｐｔｉｓａｆｅ １，Ｂｅｒ ｔｈｏｌｄ）の流速 １ｍｌ／分 反応速度定数を計算するために、酵素反応に導入する酵母のＧＭＰキナーゼの 量を、最初に導入された基質が最大で１０％形質転換されるように調整する。Ｇ ｒａｆｉｔソフトウェア（Ｓｉｇｍａ）を用いてミカエリスの曲線を実験点に調 整する。結果を表１に示す。これらの結果は、酵母のＧＭＰキナーゼがＧＣＶＭ Ｐ及びＡＣＶＭＰをリン酸化し得ることを示す。更に、酵母のＧＭＰキナーゼは 、ヒト酵素の２倍のＧＣＶＭＰリン酸化速度を有している。また、酵母のＧＭＰ キナーゼのＧＣＶＭＰに対する親和性はこの基質に対するヒト酵素の親和性に少 なくとも等しい値から２倍までの範囲である。結局、ＧＣＶＭＰに対する酵母の 酵素のＶｍａｘ／Ｋｍの値はヒト酵素が有する値の４．４倍である。競合的基質 が存在する場合、定数Ｖｍａｘ／Ｋｍは、これらの基質に対する酵素の特異性を 決定する。この値は”特異性定数”という名で知られている（Ａ．Ｆｅｒｓｈｔ ， Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，１９８５， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｌｏｎｄｏｎ）。 同様に、ＡＣＶＭＰをリン酸化する能力に関しても酵母のＧＭＰキナーゼはヒ ト酵素よりもはるかに優れている。ＡＣＶＭＰに対する酵母の酵素のＶｍａｘ／ Ｋｍの値はこの基質に対してヒト酵素が有している値の７〜９倍である。実施例５ ＴＫ、ＧＭＰＫ及びＮＤＫの酵素活性の組合わせ 組合わせの好ましい実施態様では、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ウシ血清アルブミ ン）と５ｍＭのＡＴＰと４ｍＭのＭｇＣｌ₂と１２ｍＭのＫＣｌと２ｍＭのＤＴ Ｔと６００μＭのＥＤＴＡと１００μＭの〔８−３Ｈ〕−ＧＣＶ（４０ｎＣｉ／ ナノモル）または１００μＭの〔２−３Ｈ〕−ＡＣＶ（４０ｎＣｉ／ナノモル） と種々の量のＴＫ、ＧｕＫ及びＮＤＰＫ（表２参照）とを含む１００μｌのトリ ス／ＨＣｌバッファ，５０ｍＭ，ｐＨ７．８，の中でインキュベーションを実施 する。表２に示すように３つの生物のＮＤＰＫ（ＳＩＧＭＡから市販の酵素）を 使用した。 酵素ＨＳＶ１−ＴＫとＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＭＰＫとの組合わせは、 ガンシクロビルを９０％リン酸化してガンシクロビルジホスフェートを産生し得 る。また、酵素ＨＳＶ１−ＴＫ及びＧＭＰＫに組合わせたパン酵母、即ちＳ．ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅのヌクレオシドジホスフェートキナーゼは、ヒト赤血球のヌ クレオシドジホスフェートキナーゼよりも優れたリン酸化活性でガンシクロビル トリホスフェートを産生し得る。アシクロビルの場合にも同等の結果が得られる 。これらの結果は、（ａ）本発明の酵素コンビネーションがリン酸化を有意に促 進し、従ってＴＫの修飾だけでは系の特性が十分に改善されないこと、（ｂ）本 発明の系は自殺遺伝子ＴＫによる治療効率を向上させること、（ｃ）ヒト由来で ないいくつかの酵素はヌクレオシド類似体に対して優れた活性を有しており、こ れらの酵素の利用が特に有利であること、をはっきりと証明する。実施例６ ＨＳＶ１−ＴＫ／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＭＰＫの融合タンパク質の精製 融合タンパク質を過剰発現している大腸菌株の非細胞性抽出物は種々の方法で 調製できる。例えば、ＥＤＴＡの存在下のリ ゾチームによる溶菌、Ｍｅｎｔｏｎ−Ｇｏｌｉｎ型の粉砕装置、フレンチプレス 、Ｘ−プレスの使用、または、超音波処理がある。より特定的には、融合タンパ ク質を過剰発現している大腸菌株の非細胞性抽出物を以下の手順で調製した。 大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３ ｐＸＬ３０９８株をＬＢ培地中で培養する。遠心（ ５，０００×ｇ；２０分）した後、１リットルの培養物から得られた細胞を、５ ｍＭのＤＴＴと、４ｍＭのＭｇＣｌ₂と、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロールと、 ２ｍＭのベンズアミジンと、５０μｌ／リットルのＥ６４（１００μｇ／リット ルのＮ−〔Ｎ−（Ｌ−３−トランス−カルボキシオキシラン−２−カルボニル） −Ｌ−ロイシル〕−４−アミノブチルグアニジン溶液）と、０．２ｍＭのＰｅｆ ａｂｌｏｃと、ＳＴＩ（ダイズトリプシン阻害物質）と、２ｍｇ／ｍｌのロイペ プチンとを含む２０ｍｌのバッファＡ；トリス／ＨＣｌ，５０ｍＭ，ｐＨ７．８ ，に再浮遊させ、４℃で４分間超音波処理する。遠心（５０，０００×ｇ；１時 間）後の上清を、バッファＡで平衡させたＭＯＮＯ Ｑ ＨＲ １０／１０カラ ム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に注入する。トリス／ＨＣｌバッファ，２０ｍＭ，ｐ Ｈ７．５，中の０−４００ｍＭのＮａＣｌの直線勾配 でタンパク質を溶出させる。ＴＫ活性及びＧＭＰＫ活性を含む画分を集めて濃縮 し、次いでＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＩＬｏａｄ ２６／６０カラム（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ）を用い１５０ｍＭのＮａＣｌを含むバッファＡで溶出させるこ とによってクロマトグラフィー処理する。ＴＫ活性及びＧＭＰＫ活性を含む画分 を集める。この段階で得られた調製物は、クーマシーブルーで染色後にＳＤＳ− ＰＡＧＥ中で単一の可視バンドを生じ、このバンドは見掛け分子量約６１，００ ０で泳動する。実施例７ 融合タンパク質ＨＳＶ１−ＴＫ／ＧＭＰＫによるリン酸化の試験 この実施例は、融合タンパク質によるＧＣＶ及びＡＣＶのリン酸化の速度パラ メーターを、タンパク質ＨＳＶ１−ＴＫ及びＳ．ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅのＧＭＰ Ｋによって得られた速度パラメーターとの比較によって研究する。 ７．１ ＴＫ活性の定量 ＴＫの活性を以下の手順で定量する。約０．１単位のＴＫを含む酵素抽出物を 、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）と５ｍＭのＡＴＰと４ｍＭのＭ ｇＣｌ₂と１２ｍＭのＫＣｌと２ｍＭのＤＴＴと６００μＭのＥＤＴＡと１００ μＭのＧＣ Ｖ＋〔８−３Ｈ〕−ＧＣＶ（４０ｎＣｉ／ナノモル）とを含む１００μｌのトリ ス／ＨＣｌバッファ，５０ｍＭ，ｐＨ７．８，中で３７℃で１５分間インキュベ ートする。１ｍＭの非放射性チミジンを含む１０μｌのトリス／ＨＣｌバッファ ，５０ｍＭ，ｐＨ７．８，を添加することによって反応を停止させる。リン酸化 した種をＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム（４００μｌのゲル）に固定し、次 いでカラムの洗浄後、これらの種を２ｍｌの１ＭのＨＣｌによって溶出させる。 次に、サンプル中の放射能を液体シンチレーションによってカウントする。 ７．２ ＧＭＰＫ活性の定量 Ｋ．Ｃ．Ａｇａｒｗａｌらの文献（Ｍｅｔｈｏｄｓ ＩｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇ ｙ（１９７８）Ｖｏｌ．ＬＩ ４８３−４９０）に記載のアッセイプロトコルを 用いてＧＭＰＫの活性を常法で定量する。 ７．３ 酵素ＴＫとＧＭＰＫとの融合タンパク質及びコインキュベーションの活 性の定量 ＧＣＶまたはＡＣＶをＧＣＶＤＰまたはＡＣＶＤＰに変換する融合タンパク質 ＴＫ−ＧＭＰＫの能力をＴＫとＧＭＰＫとの合成混合物との比較によって以下の 手順で測定する。１ｍｇ／ ｍｌのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）と５ｍＭのＡＴＰと４ｍＭのＭｇＣｌ₂と １２ｍＭのＫＣｌと２ｍＭのＤＴＴと６００μＭのＥＤＴＡと１〜１００μＭの ＧＣＶ＋〔８−３Ｈ〕ＧＣＶ（４０ｎＣｉ／ナノモル）または１〜１００μＭの ＡＣＶ＋〔２−３Ｈ〕ＡＣＶ（４０ｎＣｉ／ナノモル）と、種々の量のＴＫ、Ｇ ＭＰＫ及び均等な量の融合タンパク質を含む２００μ１のトリス／ＨＣｌバッフ ァ，５０ｍＭ，ｐＨ７．８，中でインキュベーションを行う。８０℃で３分間加 熱することによって反応を停止させ、遠心した後、１００μｌのインキュベーシ ョン産物を以下の系で分析する。固定相 ：Ｐａｒｔｉｓｐｈｅｒｅ ＳＡＸ（ＷＨＡＴＭＡＮ） −粒径：５μｍ−寸法４．６×１２５ｍｍ。移動相 ： バッファＡ：ＫＨ₂ＰＯ₄，０．０１Ｍ，ｐＨ３．５（ｐＨは濃Ｈ₃ＰＯ₄によって 調整） バッファＢ：ＫＨ₂ＰＯ₄，０．７５Ｍ，ｐＨ３．５（ｐＨは濃Ｈ₃ＰＯ₄によって 調整）。流速 ：１ｍｌ／分。勾配 ： 検出： ＵＶ：２６５ｎｍ 放射化学分析：トリチウムの検出 シンチラント（Ｏｐｔｉｓａｆｅ １，Ｂｅｒ ｔｈｏｌｄ）の流速 １ｍｌ／分 酵素ＨＳＶ１−ＴＫとＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＭＰＫとの結合及びコン ビネーションはガンシクロビルをリン酸化してガンシクロビルジホスフェートを 産生し得る（表３参照）。アシクロビルの場合にも同等の結果が得られる（表３ 参照）。 これらの結果は、融合タンパク質ＴＫ−ＧＭＰＫが２つの出発酵素の特性を維 持していることをはっきりと示す。更に、処理条件次第では、融合タンパク質Ｔ Ｋ−ＧＭＰＫは、野生型酵素ＴＫとＧＭＰＫとのコインキュベーションに比べて 、（ａ） ＧＣＶの場合は１．８、倍まで、（ｂ）ＡＣＶの場合は１．２倍まで、リン酸化 を有意に増進する。 融合タンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏで酵素活性を細胞内に共存的に局在させ得 る。別々の酵素であるとき、ＨＳＶ１−ＴＫは核、ＧＭＰＫは細胞質ゾルに夫々 分散する。従って本発明の構築物は自殺遺伝子による治療効率を増進し得る。 これらの結果は、最終的にヌクレオシド及び酵素の投与量を減らし、薬理学的 に重要な利益を得るという本発明の治療上の利点をはっきりと示す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９８年４月３日（１９９８．４．３） 【補正内容】 ２８．個別包装または集合包装された状態の、 ヌクレオシド類似体と、 チミジンキナーゼをコードする核酸と、 グアニレートキナーゼをコードする核酸と、 ヌクレオシドジホスフェートキナーゼをコードする核酸と、 から成ることを特徴とするヌクレオシドトリホスフェート類似体の生体内産生用 組成物。 ２９．個別包装または集合包装された状態の、 ヌクレオシド類似体と、 チミジンキナーゼをコードする核酸と、 ヌクレオシドジホスフェートキナーゼをコードする核酸と から成ることを特徴とするヌクレオシドトリホスフェート類似体の生体内産生用 組成物。 ３０．ヌクレオシド類似体がグアノシン類似体であることを特徴とする請求項２ ７から２９のいずれか一項に記載の組成物。 ３１．グアノシン類似体がガンシクロビル、アシクロビル及びペンシクロビルか ら選択されることを特徴とする請求項３０に記載の組成物。 ３２．ヌクレオシド類似体を三リン酸化し得る少なくとも２つ の酵素のコンビネーションを含んでおり、前記酵素の少なくとも１つがヒト以外 の真核生物起原であることを特徴とする組成物。 ３３．ＴＫとＮＤＰＫとを含む酵素コンビネーションとヌクレオシド類似体とを 増殖細胞に投与することを特徴とする増殖細胞の破壊方法。 ３４．前記コンビネーションが更にグアニレートキナーゼを含むことを特徴とす る請求項３３に記載の方法。 ３５．ＴＫとヒト由来でないＧＭＰＫとを含む酵素コンビネーションとヌクレオ シド類似体とを増殖細胞に投与することを特徴とする増殖細胞の破壊方法。 ３６．ヌクレオシド類似体がグアノシン類似体であることを特徴とする請求項３ ３から３５のいずれか一項に記載の方法。 ３７．グアノシン類似体がガンシクロビル、アシクロビル及びペンシクロビルか ら選択されることを特徴とする請求項３６に記載の方法。 ３８．酵素が、当該酵素をコードする核酸の投与によって細胞に投与されること を特徴とする請求項３３から３７のいずれか一項に記載の方法。 ３９．ヌクレオシド類似体を酵素コンビネーションと共存させるヌクレオシド類 似体の三リン酸化方法であって、前記酵素の少なくとも１つが酵母起原であるこ とを特徴とする方法。 ４０．増殖細胞を破壊する医薬組成物を調製するために、チミジンキナーゼまた はチミジンキナーゼをコードする核酸とヌクレオシド類似体と共に使用されるこ とを特徴とするヌクレオシドジホスフェートキナーゼまたはヌクレオシドジホス フェートキナーゼをコードする核酸の使用方法。 ４１．ウィルス起原のチミジンキナーゼとグアニレートキナーゼとの融合タンパ ク質をコードしている核酸。 ４２．グアニレートキナーゼが酵母起原であることを特徴とする請求項４１に記 載の核酸。 ４３．ウィルス起原のチミジンキナーゼとヌクレオシドジホスフェートキナーゼ との融合タンパク質をコードしている核酸。 ４４．請求項４１から４３のいずれか一項に記載の核酸によってコードされたタ ンパク質。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｎ 9/12 Ａ６１Ｋ 37/54 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ， ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 クルゼ，ジヨエル フランス国、エフ―92330・ソー、リユ・ ミツシエル―ボワザン、12

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヌクレオシド類似体をリン酸化してモノホスフェート類似体を産生し得る酵 素をコードしている第一の核酸と、 前記モノホスフェート類似体をリン酸化してジホスフェート類似体を産生し得 る酵素をコードしている第二の核酸と、 前記ジホスフェート類似体をリン酸化して毒性のトリホスフェート類似体を産 生し得る酵素をコードしている第三の核酸と、 から成る酵素コンビネーションを生体内で配送及び産生させる組成物。 ２．第一の核酸がチミジンキナーゼをコードしていることを特徴とする請求項１ に記載の組成物。 ３．第二の核酸がグアニレートキナーゼをコードしていることを特徴とする請求 項１に記載の組成物。 ４．第三の核酸がヌクレオシドジホスフェートキナーゼをコードしていることを 特徴とする請求項１に記載の組成物。 ５．核酸が同一ベクターによって担持されていることを特徴とする請求項１に記 載の組成物。 ６．核酸が複数のベクターによって担持されていることを特徴 とする請求項１に記載の組成物。 ７．ベクターがプラスミドベクターまたはウィルスベクターであることを特徴と する請求項５または６に記載の組成物。 ８．チミジンキナーゼをコードする核酸とヌクレオシドジホスフェートキナーゼ をコードする第二の核酸とを含む組成物。 ９．ヌクレオシドジホスフェートキナーゼがヒト以外の真核生物起原であること を特徴とする請求項８に記載の組成物。 １０．ヌクレオシドジホスフェートキナーゼが酵母のＮＤＰＫ及びウシのＮＤＰ Ｋから選択されることを特徴とする請求項９に記載の組成物。 １１．チミジンキナーゼをコードする核酸とヌクレオシドジホスフェートキナー ゼをコードする核酸とが結合して、ＴＫ活性とＮＤＰＫ活性との双方を含む１つ のタンパク質をコードしていることを特徴とする請求項１０に記載の組成物。 １２．更に、グアニレートキナーゼをコードする核酸を含むことを特徴とする請 求項８に記載の組成物。 １３．核酸が酵母のグアニレートキナーゼをコードしていることを特徴とする請 求項１２に記載の組成物。 １４．チミジンキナーゼをコードする核酸とヒト由来でないグ アニレートキナーゼをコードする第二の核酸とを含む組成物。 １５．グアニレートキナーゼが酵母起原であることを特徴とする請求項１４に記 載の組成物。 １６．チミジンキナーゼをコードする核酸とグアニレートキナーゼをコードする 核酸とが結合して、ＴＫ活性とＧＵＫ活性との双方を含むタンパク質をコードし ていることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。 １７．チミジンキナーゼがウィルス起原であることを特徴とする請求項１から１ ６のいずれか一項に記載の組成物。 １８．チミジンキナーゼをコードしている第一の核酸と、 ヒト由来でないグアニレートキナーゼをコードしている第二の核酸とを含むベ クター。 １９．チミジンキナーゼをコードしている第一の核酸と、 ヌクレオシドジホスフェートキナーゼをコードしている第二の核酸とを含むベ クター。 ２０．ヌクレオシドジホスフェートキナーゼがヒト以外の真核生物起原、好まし くはウシまたは酵母起原であることを特徴とする請求項１９に記載のベクター。 ２１．更に、グアニレートキナーゼをコードする核酸を含むこ とを特徴とする請求項１９または２０に記載のベクター。 ２２．チミジンキナーゼがウィルス起原であることを特徴とする請求項１８から ２１のいずれか一項に記載のベクター。 ２３．種々の核酸が別々のプロモーターのコントロール下に維持されていること を特徴とする請求項１８から２２のいずれか一項に記載のベクター。 ２４．種々の核酸が単一プロモーターのコントロール下のポリシストロン性ユニ ットを形成していることを特徴とする請求項１８から２２のいずれか一項に記載 のベクター。 ２５．ウィルス起原のチミジンキナーゼをコードする第一の核酸と、ヒト由来で ないグアニレートキナーゼをコードする第二の核酸とを含み、これらの核酸が結 合して、ＴＫ活性とＧＵＫ活性との双方を含む１つのタンパク質をコードしてい ることを特徴とする請求項１８および２２から２４のいずれか一項に記載のベク ター。 ２６．プラスミドベクターまたはウィルスベクターであることを特徴とする請求 項１８から２５のいずれか一項に記載のベクター。 ２７．ヌクレオシド類似体を三リン酸化し得る酵素コンビネー ションと、前記ヌクレオシド類似体とから成ることを特徴とする、同時投与、個 別投与または一定期間の継続的投与によって使用される組成物。 ２８．個別包装または集合包装された状態の、 ヌクレオシド類似体と、 チミジンキナーゼをコードする核酸と、 グアニレートキナーゼをコードする核酸と、 ヌクレオシドジホスフェートキナーゼをコードする核酸と、 から成ることを特徴とするヌクレオシドトリホスフェート類似体の生体内産生用 組成物。 ２９．個別包装または集合包装された状態の、 ヌクレオシド類似体と、 チミジンキナーゼをコードする核酸と、 ヌクレオシドジホスフェートキナーゼをコードする核酸と から成ることを特徴とするヌクレオシドトリホスフェート類似体の生体内産生用 組成物。 ３０．ヌクレオシド類似体がグアノシン類似体であることを特徴とする請求項２ ７から２９のいずれか一項に記載の組成物。 ３１．グアノシン類似体がガンシクロビル、アシクロビル及び ペンシクロビルから選択されることを特徴とする請求項３０に記載の組成物。 ３２．ヌクレオシドのリン酸化に関与する酵素コンビネーションを含んでおり、 前記酵素の少なくとも１つがヒト以外の真核生物起原であることを特徴とする組 成物。 ３３．ＴＫとＮＤＰＫとを含む酵素コンビネーションとヌクレオシド類似体とを 増殖細胞に投与することを特徴とする増殖細胞の破壊方法。 ３４．前記コンビネーションが更にグアニレートキナーゼを含むことを特徴とす る請求項３３に記載の方法。 ３５．ＴＫとヒト由来でないＧＭＰＫとを含む酵素コンビネーションとヌクレオ シド類似体とを増殖細胞に投与することを特徴とする増殖細胞の破壊方法。 ３６．ヌクレオシド類似体がグアノシン類似体であることを特徴とする請求項３ ３から３５のいずれか一項に記載の方法。 ３７．グアノシン類似体がガンシクロビル、アシクロビル及びペンシクロビルか ら選択されることを特徴とする請求項３６に記載の方法。 ３８．酵素が、当該酵素をコードする核酸の投与によって細胞 に投与されることを特徴とする請求項３３から３７のいずれか一項に記載の方法 。 ３９．ヌクレオシド類似体を酵素コンビネーションと共存させるヌクレオシド類 似体の三リン酸化方法であって、前記酵素の少なくとも１つが酵母起原であるこ とを特徴とする方法。 ４０．増殖細胞を破壊する医薬組成物を調製するために、チミジンキナーゼまた はチミジンキナーゼをコードする核酸とヌクレオシド類似体と共に使用されるこ とを特徴とするヌクレオシドジホスフェートキナーゼまたはヌクレオシドジホス フェートキナーゼをコードする核酸の使用方法。 ４１．ウィルス起原のチミジンキナーゼとグアニレートキナーゼとの結合タンパ ク質をコードしている核酸。 ４２．グアニレートキナーゼが酵母起原であることを特徴とする請求項４１に記 載の核酸。 ４３．ウィルス起原のチミジンキナーゼとヌクレオシドジホスフェートキナーゼ との結合タンパク質をコードしている核酸。 ４４．請求項４１から４３のいずれか一項に記載の核酸によってコードされたタ ンパク質。