JP2000508165A

JP2000508165A - Ｄｎａの分析

Info

Publication number: JP2000508165A
Application number: JP9535960A
Authority: JP
Inventors: スー，ウェイミング
Original assignee: メディカル・リサーチ・カウンシル
Priority date: 1996-04-10
Filing date: 1997-04-04
Publication date: 2000-07-04
Also published as: AU716094B2; CA2252030A1; GB9607440D0; EP0892857A1; US6197509B1; AU2301897A; WO1997038130A1

Abstract

(57)【要約】ペンタヌクレオチド反復（ＣＣＴＴＴ／ＧＧＡＡＡ）ｎに基づく新規な高度に多形性のＤＮＡ標識が、ヒトの誘導酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）遺伝子内で同定された。７個から１８個の間の隣接する反復を有する１２の異なった対立遺伝子が同定された。この反復はヒトの集団において高度に多形性であり、したがって、たとえば法医学、集団調査、家系調査および病気の診断などにおける使用などマイクロサテライト標識として使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】ＤＮＡの分析発明の分野この発明は、例として法医学、集団調査、家系調査および病気の診断に役立つ、特に遺伝標識形質を検査するためのＤＮＡの分析に関する。発明の背景ヒトのゲノムには、異なる個体において種々の繰返し数で生じ得る単純なヌクレオチド配列があり、それは、ある範囲で異なる長さの異なる対立遺伝子または変異型を生じさせており、これを遺伝標識形質として用いて個体のＤＮＡを類型化できることがわかっている。脊椎動物のＤＮＡにおける縦列反復ミニサテライトおよびマイクロサテライト領域は、反復単位数において高レベルの対立遺伝子の変異性を示すことが多い。こうした情報量の非常に多い遺伝標識形質は、集団遺伝学、法科学、医学およびその他の自然科学の研究において応用範囲が広いことがわかってきた。たとえば、このような標識を、遺伝的連関の分析、父系の血縁関係の確定、および移民論争、ならびに法医学における身元確認に使用することができる。ミニサテライトシステムでは、コアＤＮＡ配列単位は通常１５以上の塩基対である。今までは、このようなシステムのほとんどの研究および応用は、少なくとも５０ｎｇの相対的に減成していないＤＮＡを必要とする、対立遺伝子長のサザンブロット評価に頼ってきた。血液および精液のしみなどの多くの法的試料からこのような大量のＤＮＡを抽出するのは非常に困難なことが多い。他方、マイクロサテライトは、最も一般的には（ｄＣ−ｄＡ）ｎなどのジヌクレオチド反復の形式の、短くタンデムに繰返される（ＳＴＲ）多形性ＤＮＡ配列であるが、トリヌクレオチドおよびテトラヌクレオチド反復の場合もあり得る。詳細については、Pena,S.D.J.、Chakraborty，R．（１９９４）、Paternity testing in DNA era、Trends in Genetics、Vol．１０、２０４−２０９を参照されたい。マイクロサテライトをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅させることができ、生成するアンプリコンは通常長さが８０−８００塩基対（ｂｐｓ）にわたり、そのため、現在遺伝子の調査および分類のために広範囲にわたって用いられている自動配列決定装置における処理に非常に適している。（Reed， P.W.他、（１９９４）、Chromosome-specific microsatellite sets for fluorescence based,semiautomatic genome mapping）No．ture Genet.、７,３９０−３９５参照。）今まではほとんどのマイクロサテライト多形性はジヌクレオチド反復に基づいてきた。隣接する対立遺伝子間のサイズの相違は非常に小さいため、結果の中には解釈が困難なものもあり得る。トリおよびテトラヌクレオチド反復は使用するのがより簡単であるが、ヒトのゲノムにおいて生じることは少ない。トリヌクレオチド反復配列の拡大は、ハンチントン病、脆弱Ｘ染色体症候群および筋強直性ジストロフィーを含むいくつかの遺伝病に関係している。この発明は、ペンタヌクレオチド反復（ＣＣＴＴＴ／ＧＧＡＡＡ）ｎのヒトの誘導酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）遺伝子における発見に基づいている。この反復は１７ｑ１１．１−ｑ１１．２上のｉＮＯＳ遺伝子の上流プロモータ領域の５’末端およそ２．８ｋｂに位置する。研究により、このペンタヌクレオチド反復（便宜上Ｘｕ−１と呼ぶ）は、個体によってその数が大幅に異なることが見出され、今までに、７から１８の間の隣接するＸｕ−１反復を有する、１２の異なる変異型または対立遺伝子が発見された。異なる対立遺伝子はＡ７、Ａ８・・・Ａ１８と呼ばれる。Ｘｕ−１反復はヒトの集団では高度に多形性であるため、この反復は、たとえば法医学、集団調査、家系調査および病気の診断に有効なマイクロサテライト標識として用いられる。発明の概要この発明は１つの局面で、ＤＮＡの試料を分析してｉＮＯＳ遺伝子における配列（ＣＣＴＴＴ／ＧＧＡＡＡ）の隣接する反復の数を測定する方法を提供する。反復の数は典型的には７から１８の範囲にある。このようにしてＤＮＡを分析することにより、１つまたは複数のどの対立遺伝子（通常はＡ７からＡ１８のうち１つ以上）が存在するか、特定のＤＮＡ試料におけるＸｕ−１反復の数を測定できる。この試料はたとえば、血液、精液、唾液、頬の細胞または何らかのその他の適当な生物学的材料の試料とすることができる。Ｘｕ−１反復はペンタヌクレオチド反復であるため、より小さな反復単位の場合よりも簡単に、単にサイズをもとにして隣接する対立遺伝子が識別される。実験により、個体が異なると、２つの対立遺伝子（各染色体につき１つずつ）において変化がかなりあることが示される。ヘテロ接合性は０．８４１として計算されている。Ｘｕ−１反復はしたがって、高度に多形性であり、そのために、使用が簡単な遺伝標識（Ｘｕ−１標識）として非常に有効である。好都合には、試料はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて分析され、これは、この発明の方法が少量の試料について実施できるようにする。１対のＰＣＲプライマがこの目的のためにデザインされ、サイズの範囲が約１７０から２２５塩基対（ｂｐ）の生成物をもたらす。フォワードプライマは５’−ＡＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＡＣＡＡＣＴＧＣＡＴ−３’（Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ．１）である。リバースプライマは、５’−ＧＣＣＡＣＴＧＣＡＣＣＣＴＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＡ−３’（Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ．２）である。生成物を配列決定して、Ｘｕ−１反復の数を測定してもよい。その代わりとして、フラグメント長を、たとえば電気泳動ゲルを流してＸｕ−１反復の数の計算ができるようにし、簡単に測定できる。Ｘｕ−１標識を別の遺伝標識形質と共に用いることにより、ヘテロ接合性を大幅に高めることができる。たとえば、反復の数が５から１３にわたるニューロンの酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ１）遺伝子にある多形性トリヌクレオチド反復（ＡＴＴ／ＴＡＡ）に基づく既知のマイクロサテライト標識と共にＸｕ−１標識を用いて、よい結果が得られている。ＰＣＲプライマは、ＮＯＳ１標識と共に用いて、１１０から１３８ｂｐの範囲のもの（すなわちＸｕ−１標識物とサイズが異なる）を生成させることができるようにデザインされ、Ｘｕ−１プライマと同じＰＣＲ条件下で使用できる。フォワードプライマは、５’−ＧＡＡＡＴＴＧＧＴＣＡＴＡＧＴＧＧＧＡＡＴＧ−３’（Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ．３）である。リバースプライマは、５’−ＧＴＧＴＴＧＧＴＧＡＡＣＣＡＡＣＣＣＴＣＣＴＡＡ−３ ’（Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ．４）である。このようにして２つの標識に対するＰＣＲ反応をともに行なうことができ、プライマに対し異なるラベル（たとえばグリーンおよびブルー）を用いることにより、ＰＣＲ生成物を同じゲル上で同時に検出できる。これら２つの標識をともに用いることにより、ヘテロ接合性は約９９％まで増大する。実験により、民族のグループが異なるとＸｕ−１反復の数が異なる対立遺伝子の分布に顕著な差が現われることがわかった。したがってＸｕ−１標識は、集団調査、移民論争、父系の確定、および法医学研究において有用性がある。さらに、Ｘｕ−１標識は、アルツハイマー病、高血圧、糖尿病、および癌などのヒトに共通するいくつかの病気に関係している、ヒトのｉＮＯＳ遺伝子の５’ 末端に位置しているため、この標識を上記の病気についての対立遺伝子結合の研究および突然変異分析に使用することができる。たとえば、反復数と、アルツハイマー病の全症例の約４分の１に相当する、アルツハイマー病の老人性痴呆Lewy body（ＳＤＬＴ）変異型との間に強い対立遺伝子結合があることが早くも検出された。大腸癌のいくつかの症例においては、フランキング配列における突然変異も検出された。ｉＮＯＳ遺伝子はまた組織移植に関係づけられる。この発明において述べられる多形性標識は、組織移植のための遺伝子型の分類にも使用できる。この発明はさらに、以下の例において添付の図面を参照することにより例示として説明される。図１Ａは、Ｘｕ−１反復領域を含む、ヒトの誘導酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）遺伝子の５’末端上流領域の制限地図である。図１Ｂは、図１に含まれる３８３塩基対Ｐｓｔ１フラグメント（その上の鎖はＳｅｑ．ＩＤＮｏ．５である）の配列を示し、Ｐｓｔ１部位は下線が付され、４１１の隣接するＸｕ−１反復は枠で囲まれている。図２は、異なる個体からの、異なるＸｕ−１対立遺伝子を示す電気泳動ゲルを示す。図３は、家系樹、および異なる家族構成員からの異なるＸｕ−１対立遺伝子を示す電気泳動ゲルを示す。図４は、種々の家系樹をＸｕ−１対立遺伝子データとともに示す。図５は、異なるＸｕ−１対立遺伝子を示す電気泳動ゲルで、異なる個体に対する別のマイクロサテライト標識と組合せたものを示す。図６は、正常な個体、アルツハイマー病の老人性痴呆症Lewy body（ＳＤＬＴ）変異体であった患者の剖検および非Lewy body型アルツハイマーの患者（ＡＤ）の幾らかについて、異なるＸｕ−１対立遺伝子の分布（Ａ８からＡ１５）を示すグラフであり、ｘ軸は染色体の％を示し、ｙ軸は対立遺伝子の数を示す。図７は、図６と同様のグラフであり、カフカス人、黒人、中国人およびグジャラート系アジア人の集団における異なるＸｕ−１対立遺伝子の分布（Ａ８からＡ１８）を示す。実施例１本発明の基礎をなす新規なペンタヌクレオチド反復（ＣＣＴＴＴ/ＧＧＡＡＡ）ｎは、コスミドクローンｐＣＯＳ４から同定されたものであり（ヒトの誘導および内皮酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ２およびＮＯＳ３）をコードする遺伝子をそれぞれ染色体１７および染色体７の中心周囲領域に対してマッピングした際に、Xu，W.，Charles，I.，Moncada,S．，Gorman，P.，Sheer,D.，Liu,L.,およびE mson，P.C.（199４）によって記載され説明された。Genomics 21,419-422）、これは３５ｋｂのヒトゲノム挿入物を含んでおり、さらには、ヒトの誘導酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）遺伝子コード領域およびそのプロモーター領域を含むことが示された。この遺伝子の５’上流末端の制限地図を図ＩＡに示す。誘導酸化窒素シンターゼ遺伝子のヒトプロモーター領域をクローン化するために、ＰｓｔｌおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を用いて、コスミドをpBluescripI-SKベクターにショットガンクローニングした。次いで、Ｍ１３ユニバーサルおよびリバースプライマーを伴うＡＢＩ自動シークエンサーを用いてサブクローンを配列決定した。配列決定研究により、ＰｓｔＩサブクローンの１つであるクローン番号５１２が、ヒト誘導酸化窒素シンターゼ遺伝子の主要な転写開始部位の５’末端の２．８ｋｂに位置する、ヒトゲノムの５５塩基対の伸長物である、１１の完全な隣接するペンタヌクレオチド反復（ＣＣＴＴＴ／ＧＧＡＡＡ）１１を含むことが示された。この３８３塩基対フラグメントの配列（Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ．５）を、図１Ｂにおいて、１１のペンタヌクレオチド配列が箱の中に示された状態で示す。これらの反復およびフランキング領域は１本鎖のポリプリンを構成することがわかり、ポリピリミジンは１３０の塩基対にわたる他の鎖であり、このことは、そのような配列の不安定さから、マイクロサテライトにおいては非常に稀なことである。実施例２ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を直接用いて、ある範囲のヒトのＤＮＡ試料からのゲノムＤＮＡから多形性ペンタヌクレオチド反復を増幅するために、特定のオリゴヌクレオチドプライマーの対を設計した。ＤＮＡは、血液、頬の細胞、唾液、または核を含む他の任意の生物学的な源のいずれかから分離され得る。ＤＮＡ抽出物は、標準的なＳＤＳ−プロテイテーゼＫ−フェノール法を用いて、すべての例において行ない得る。(Sambrook，J.， Fritsch，E.F．& Maniatis，Ｔ(1989)．Molecular cloning．Laboratory manual Cold _Spring Harbor Laboratory Press,NewYork.) ヒトの血液のゲノムＤＮＡからそのゲノムＤＮＡを増幅するよう設計されるフランキングＰＣＲプライマーの対は以下のとおりである：フォワードプライマーは５’ −ＡＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＡＣＡＡＣＴＧＣＡ’Γ−３’ （Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ．１）である。リバースプライマーは５’−ＧＣＣＡＣＴＧＣＡＣＣＣＴＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＡ−３’ （Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ．２）である。これらのプライマーは図ＩＢにおいて二重下線で示されている。フォワードプライマーは、蛍光染料６−カルボキシフルオレイセン（６−Ｆａｍ）（Oswel DN A1 ＤＮＡService，University ofS outhampton，Southampton SO16 7PX）またはＸｅｘホスホルアミダイト（Applied Biosystems)を用いて５’末端標識される。プライマーは、標準的な方法を用いて、合成され、標識され、ＨＰＬＣで精製された（Oswel DNA Service，Southampton）ＰＣＲプロトコルは以下のとおりである： i ）試薬混合物標識された０．５ｍｌの二重スナップキャップマイクロ遠心チューブにおいて、以下の試薬を混合した：試薬量テンプレート 1μ150-200ngゲノムDNA 10xPCR緩衝液II（Cerus,N808-0010，E8064） 5μl dNTP Mix（各2.5mM，Pharmacia，27-2035-01） 5μl 25mM MgCl₂(Cerus,N808-0010，EO843) 3μl フォワードプライマー（200μg/ml．６Fam標識） 1μl リバースプライマー（200μg/ml） 1μl ｄＨ₂Ｏ（蒸留または脱イオン水） 33.5μl AmpliTaq DNAポリメラーゼ（Cerus，N801-0060） 0.5μl（2.5単位）最終反応容積 50μl （AmpliTaqはRoche Molecular System，Incの商標である）（ｄＮＴＰ＝デオキシヌクレオチドトリホスフェート。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ＝サーマス・アクアチクス（Thermus aquaticus）から分離されたＤＮＡポリメラーゼ）この反応混合物上に１滴の鉱油（Sigma No.M5904）（約４０μl分）が落された。 ii ）ＰＣＲ反応 Perkin Elmer Cetus Model 480（またはそれに均等な装置）を用いて以下のようにＰＣＲを行なう。１．チューブを熱サイクラーに置く。２．チューブを熱サイクラーに置いた直後に、熱サイクルを以下のように開始する：ａ）９６℃に予備加熱ｂ）９０℃で３０秒間ｃ）次を３０回：９４℃で１分間、アニールを５０℃で１分間、および重合化を７２℃で１分間ｄ）７２℃で１０分間３．４℃まで急速熱ランプして保持ＰＣＲ生成物のサイズはペンタヌクレオチド反復単位の数に依って、約１７０ｂｐ〜２２５ｂｐの範囲である。 iii ）電気泳動次に、６％尿素ポリアクリルアミドゲルを用いて、これらＰＣＲ生成物を Applied Biosystems Model 373A DNA Sequencerに直接かける。泳動条件は、２０００Ｖ、２６ワットで４〜１２時間である。Genescanオプションを用いてゲルの泳動を開始させる（GenescanはApplied Biosystems,Inc.の商標である）。以下のようにして、試料を調製しＤＮＡシークエンサーにかけた：１．以下の試薬の混合物を調製する：脱イオンホルムアミド５μｌＲｏｘ標識ＤＮＡマーカー（GENESCAN-2500）０．５μｌ２．この混合物４μｌを各チューブに加えて激しく攪拌する。その溶液を軽く遠心分離する。３．ゲルをＤＮＡシークエンサーにかける準備ができると、試料を９０℃で２分間加熱して変性させ、次いでそれらを即座に氷の上に移す。４．ユーザマニュアルの指示に従って、試料をApplied Biosystems Model 373A DNA Sequencerにかける。 iv ）遺伝子スキャンおよび分析 GENESCAN672ソフトウェアを用いてデータを自動的に収集し分析する。このソフトウェアは、２４または３６のレーンすべてにわたる電気泳動データを収集するのみならず、異なるレーンのフラグメントを正確に同定し認識するのにも用いることができる。内部標準Rox-GENESCAN 2500は、正確かつ精密な塩基同定およびフラグメントの正確なサイズ決定を可能にする。自動ＤＮＡシークエンサが利用可能でない場合には、放射性標識の使用など、他の方法を代わりに用いてＰＣＲ生成物を検出することもできる。ｖ）配列分析ＰＣＲ生成物は、さらに、Ｔ−ベクタークローニングシステム（Stratagene， Cambridge,英国）を用いてBluescripts pKSベクターにクローン化し、ユニバーサルプライマーおよびリバースプライマーを用いてApplied Biosystems Model 373A DNA SequencerでTagDyeDeoxyターミネーターサイクル配列決定法により配列決定することができる。生成物は、OiegenからのＰＣＲＤＮＡゲル精製システムを用い、製造者の説明書に従い、プライマーＡまたはＢの３ピコモルを用いて直接配列決定することもできる。実施例３実施例２に記載されたプライマーおよび方法を用いて、３６の関係のない個体のＤＮＡを検査した。選られた電気泳動ゲルを図２に示す。図の左側に示されるように、一連の（赤い）バンド（図では見えない）は内部ＤＮＡサイズマーカー（Genescan2500,Rox）を示す。ゲルの中間にわたるより明るい（青い）バンドは６−Ｆａｍ蛍光標識されたプライマーＡによって生成されたものであり、これらは、異なる反復長の存在を示し、多形性を明らかにしている。実施例４同様の態様にて、カフカス人（ＣＥＰＨ（Centre Etude Polymorpisme Humain）/Amish）家系（血統８８４）の３世代からデータを得た。この結果を、図３において、家系樹およびＸｕ−１対立遺伝子データを示すゲルデータの形式で示す。これらの結果は、十分に整合性があり、メンデルの共優性遺伝を示す。他の家系群も同様に分析され、すべてがこの遺伝子座の同じメンデル共優性遺伝の態様を示す。たとえば、図４は４つの大きなＣＥＰＨファミリーの遺伝子型を示す（血統８８４，１４２４，１３４１および１３４９）。実施例５別の遺伝マーカーに対するプローブと共にＸｕ-１反復に対するプローブを用いることにより、より詳細な特定の遺伝情報を個体について得ることができ、すなわち、より詳細な「遺伝的フィンガープリント」を得ることができ、それにより、ヘテロ接合性は増加し、したがってそれらの結果の有用性も増す。５〜１３の範囲にある反復数のニューロン酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ１）遺伝子に存在する公知のトリヌクレオチド反復（ＡＴＴ/ＴＡＡ）に対するプローブと共に、上述のようにＸｕ-１反復に対するプローブを用いて実験を行なった。このＮＯＳ１反復は、Am．J．Hum．Genet.58,363-370の、乳児幽門狭窄症に対する感染性としてのニューロン酸化窒素シンターゼ遺伝子に対する遺伝的証拠（genetic ev idence for the nenronal nitric oxide synthade gene as a susceptibility f or infantile pyloric stenosis）においてChung，E.，Curtis D.，Chen，G.，M arsden P.A.，Twells，R.，Xu，W.およびGardener M．（1996）により記載されている。この目的のために、１１０〜１３８ｂｐの範囲にある生成物をもたらすよう、ＮＯＳ１標識とともに用いるためのＰＣＲプライマーを設計し、5-Xedyeで緑色に蛍光標識した。フォワードプライマーは５’−ＧＡＡＡＴＴＧＧＴＣＡＴＡＧＴＧＧＧＡＡＴＧ−３’（Ｓｕｑ．ＩＤＮｏ．３）である。リバースプライマーは、５’−ＧＴＧＴＴＧＧＴＧＡＡＣＣＡＡＣＣＣＴＣＣＴＡ−３ｄ’（Ｓｕｑ．ＩＤＮｏ．４）である。このプライマーの対は、Famdyeで標識されるＸｕ −１反復に対するプライマーと全く同じＰＣＲ条件下で用いることができ、したがって２つのＰＣＲ反応を同じ時間で行なうことができる。図５はこの方法で得られたGenescanゲルを示し、上側（青色）バンドはＸｕ− １反復を示し、下側（緑色）バンドはＮＯＳ１反復を示し、結果はサンプルごとに配列されている。組合されたヘテロ接合性は約９９％である。実施例６この発明のＸｕ−１反復は、アルツハイマー病を含む所定の病気に関係するヒトｉＮＯＳ遺伝子の５’末端に位置しているため、アルツハイマー病の老人性痴呆症Lewy body（ＳＤＬＴ）変異型（２２人の患者）および非Lewy body型（ＡＤ）（９０人の患者）の両者の、アルツハイマー病であると剖検により診断された１１２人の死亡した痴呆患者について実験を行なった。比較のため、１０１人の正常なカフカス人それぞれからの結果も得た。全被験者のＤＮＡはCambridge Br ain Bankから得、地元の倫理委員会に承認された。実験はほぼ実施例２で説明したように行なった。この結果を図６にグラフで示す。この結果は、ほとんどの対立遺伝子が、アルツハイマー病の患者においても痴呆ではない対照においても同様の頻度を有することを示している。しかし、ＳＤＬＴの患者からの試料においては、２つのより小さい対立遺伝子（それぞれ８ペンタヌクレオチド反復および９ペンタヌクレオチド反復を有する）Ａ８およびＡ９が過剰に示され（通常の３％およびＡＤの４％と比較して１６％）かつＡ１１対立遺伝子は過小に示された（通常の１９％と比較して２％）。Linkage Utilityの計数プログラムを使用して、p値は０．０１５１（自由度６）と計算されるが、これは必要とされる値０．０５（５％）よりもはるかに低い。この結果は、ｉＮＯＳ遺伝子プロモータ内のＸｕ−１ペンタヌクレオチド反復変異型の所定の組合せ、すなわち高度のＡ１１対立遺伝子および／または低度のＡ８およびＡ９対立遺伝子が、ＳＤＬＴの進行に関係し得ることを示唆する。この情報は、診断においてまたは予見において価値があるであろう。実施例７類似した態様でカフカス人、黒人（アフリカ系カリブ人およびアフリカ系アメリカ人）、中国人およびグジャラート系アジア人の民族的起源を有する２７１人（すなわち５４２染色体）について実験を行ない、かつ、民族集団ごとに異なった数のＸｕ−１反復の分布を分析した。その結果を表１および表２に、および図７にグラフで示す。多形性の度合は、２つの指標によって特徴付けられる。すなわちヘテロ接合性（Heter）および多形性情報内容（ＰＩＣ）である。式および説明については、ボトスタイン（Botstein）,Ｄ、ホワイト（White），Ｒ．Ｌ．，スコルニック（Skolnick），Ｍ．およびディビス（Davis），Ｒ．Ｗ．の『制限フラグメント長の多形性を使用したヒトにおける遺伝的系統地図の構築（Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms）』（Am．J．Hum．Genet．32:314-331 （1980））を参照されたい。全体のヘテロ接合性は０．８４１であった。異なった民族集団間で明らかな、対立遺伝子の分布頻度における顕著な差が存在する。したがってこれらの結果は法的に価値があるであろう。麦１＊フランキング配列および泳動条件により、サイズは２bp程度変わる。表２

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．ｉＮＯＳ遺伝子内の配列（ＣＣＴＴＴ／ＧＧＡＡＡ）の隣接する反復の数を測定する、ＤＮＡの試料を分析する方法。２．試料は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して分析される、請求項１に記載の方法。３．ＰＣＲプライマーとして、配列５’−ＡＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＡＣＡＡＣＴＧＣＡＴ−３’（Ｓｅｑ．ＩＤＮＯ．１）を有するフォワードプライマーと配列５’−ＧＣＣＡＣＴＧＣＡＣＣＣＴＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＡ−３’（Ｓｅｑ．ＩＤＮＯ．２）を有するリバースプライマーとを使用する、請求項２に記載の方法。４．ＤＮＡの試料をさらに分析してさらなる遺伝標識形質の特徴を測定する、前掲請求項のいずれか１項に記載の方法。５．さらなる遺伝標識形質は、ニューロンの酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ１）遺伝子内に存在する多形性のトリヌクレオチド反復（ＡＴＴ/ＴＡＡ）に基づく、請求項４に記載の方法。６．フォワードプライマー５’−ＧＡＡＡＴＴＧＧＴＣＡＴＡＧＴＧＧＧＡＡＴＧ−３’（Ｓｅｑ．ＩＤＮＯ．３）とリバースプライマー５’−ＧＴＧＴＴＧＧＴＧＡＡＣＣＡＡＣＣＣＴＣＣＴＡＡ−３’（Ｓｅｑ．ＩＤＮＯ．４）とを含むさらなるＰＣＲプライマーを使用する、請求項５に記載の方法。７．フォワードプライマー５’−ＡＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＡＣＡＡＣＴＧＣＡＴ−３’（Ｓｅｑ．ＩＤＮＯ．１）とリバースプライマー５’−ＧＣＣＡＣＴＧＣＡＣＣＣＴＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＡ−３’（Ｓｅｑ．ＩＤＮＯ．２）とを含むＰＣＲプライマー。８．フォワードプライマー５’−ＧＡＡＡＴＴＧＧＴＣＡＴＡＧＴＧＧＧＡＡＴＧ−３’（Ｓｅｑ．ＩＤＮＯ．３）とリバースプライマー５’−ＧＴＧＴＴＧＧＴＧＡＡＣＣＡＡＣＣＣＴＣＣＴＡＡ−３’（Ｓｅｑ．ＩＤ）ＮＯ．４）とを含むＰＣＲプライマー。