JP2000508529A - 抗真菌ポリペプチド及び植物病原性真菌を防除する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 植物に対する真菌による被害を防除する抗真菌ポリペプチド、ＡｌｙＡＦＰを提供する。該ポリペプチドをコードするＤＮＡを、植物でコロニー形成する微生物又は植物を形質転換するためのベクター中にクローン化し、それによって植物上での真菌の増殖を阻害する方法を提供し得る。該ポリペプチドは、植物又は他の場所での有害な真菌の防除に用い得る組成物中に配合し得る。

Description

【発明の詳細な説明】 抗真菌ポリペプチド及び植物病原性真菌を防除する方法 発明の背景 発明の分野 本発明は、Ａｌｙｓｓｕｍ属の植物の花から得ることができる抗真菌ポリペプ チド、ＡｌｙＡＦＰ、及び該抗真菌ポリペプチドを用いて病原性真菌を防除する 方法に関する。該抗真菌ポリペプチドは、植物に直接適用したり、該ポリペプチ ドを産生する微生物の形態で植物に適用したりすることができ、また、遺伝子操 作により該ポリペプチドを産生させるように植物自体を改変することもできる。 本発明はさらに、上記方法に有用なＤＮＡ配列、微生物、植物及び組成物に関す る。関連技術の説明 種々の植物病原性真菌に対して抗真菌活性を示す多くの植物ポリペプチド及び タンパク質が分離された〔Ｂｏｗｌｅｓ（１９９０）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏ ｃｈｅｍ．，５９：８７３−９０７；Ｂｒｅａｒｓら（１９９４）Ａｇｒｏ−Ｆ ｏｏｄ−Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｈｉ−Ｔｅｃｈ．１０−１３〕。キチナー ゼ、システインに富むキチン結合タンパク質、β−１，３−グルカナーゼ、（ゼ アマチンを含めた）ペルマチン、チオニン、リボソーム不活化タンパク質、及び 非特異的脂質輸送タンパク質を含めた種々のクラスを包含するこれらの抗真菌ポ リペプチド及びタンパク質は、真菌感染症に対する植物防御において重要な役割 を果たすと考えられる。 最近、別の植物タンパク質群が植物病原菌による感染との闘いにおいて防御物 質（defensin）としての機能を果たすことが知見された（ＰＣＴ国際公開ＷＯ９ ３／０５１５３号）。ハツカダイコンの種子から分離されたシステインに富む２ 種の小タンパク質、Ｒｓ−ＡＦＰ１及びＲｓ−ＡＦＰ２は、該純粋タンパク質を ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗真菌アッセイ媒体に加えると、多くの病原性真菌の増殖を 阻害することが知見された。Ｒｓ−ＡＦＰ２タンパク質をコードする遺伝子を含 むトランスジェニックタバコ植物は、真菌による攻撃に対して非形質転換植物よ りも耐性が高いことが知見された。 ハツカダイコンの種子に類似したタンパク質Ｒｓ−ＡＦＰ２が、他の多くの植 物の種子から分離された〔ＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／０５１５３号；Ｂｒｏｅｋ ａｅｒｔら（１９９５） Ｐｌａｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０８：１３５３−１３８５〕。この群のタンパク 質は全てそのアミノ酸配列が類似しているが、特に植物細胞中の生理的条件に極 めて近似したアッセイ媒体中の種々の一価又はニ価塩の存在下では、種々の真菌 に対してそれぞれ抗真菌活性が異なる。ある種の抗真菌タンパク質の抗真菌活性 は、１ｍＭのＣａＣｌ₂及び５０ｍＭのＫＣｌの存在下では劇的に低下する〔Ｔ ｅｒｒａｓら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５３０１−１５ ３０９〕。遺伝子操作により植物の病気耐性を得る場合の抗真菌タンパク質の有 用性は、塩濃度に対する抗真菌活性の感受性に大きく影響を受け得る。というの は、Ｋ⁺、Ｎａ⁺、Ｃａ²⁺及びＭｇ²⁺などの金属イオンは、正常な生理機能に必要 であり、従って植物細胞中に豊富に存在するからである。 植物病原菌の防除に天然タンパク質産物を用いる方法が、例えば、ヨーロッパ 特許出願第０３９２２２５号に示されている。 発明の要旨 本発明者は、植物病原性真菌及び他の真菌に対して広範な抗真菌活性を示す新 規なポリペプチド、ＡｌｙＡＦＰを見出した。本発明は、１つの態様において、 配列番号２に示されているア ミノ酸配列及びその生物学的機能同等物を含む分離抗真菌ポリペプチドを提供す る。 ＡｌｙＡＦＰ又はその生物学的機能同等物は、植物から分離することもできる し、直接化学合成や、微生物系、植物系及び動物系などの異種生物系における合 成、組織培養、細胞培養、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳法を含めた当業界で公知の 任意の適当な方法を用いて産生又は合成し得る。 さらに本発明は、本発明の抗真菌ポリペプチドをコードする分離ＤＮＡ配列、 及び遺伝子構築物、並びにそのようなＤＮＡ配列を該配列によりコードされるポ リペプチドを産生する宿主細胞中に挿入する方法も開示する。 本発明はさらに、本発明の抗真菌ポリペプチドをコードするＤＮＡヌクレオチ ド配列を用いて形質転換した微生物及び植物を提供する。 本発明は、本発明の抗真菌ポリペプチドを発現する形質転換植物、並びに該抗 真菌ポリペプチドと共に、他の抗真菌、抗細菌若しくは抗ウイルス性病因関連ペ プチド、ポリペプチド又はタンパク質：殺虫タンパク質、例えば、Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂ．ｔ．）タンパク質；及び植物 生産物若しくは植物の作物性能の品質改良に関与するタンパク質を共発現する植 物を提供する。植物中で複数種の抗真菌タンパク質を同時に共発現させることは 、真菌による被害の防除に１種以上の作用モードを利用するという点で有利であ る。該共発現により、耐性菌株が発生する可能性が最小限になり、耐性の範囲が 広まり得ると共に、相乗作用的抗真菌作用が生じて耐性レベルが向上する可能性 がある。この点に関しては、例えば、ＷＯ９２／１７５９１号を参照されたい。 Ｂ．ｔ．遺伝子を発現するように形質転換された植物の例は、１９９０年２月 １２日にＦｉｓｃｈｈｏｆｆらにより出願された米国特許出願第０７／４７６， ６６１号に対応するヨーロッパ特許公開第０３８５９６２号に開示されている。 本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡと一緒に共発現され得るＤＮＡの非 限定的例には、（１）酵素、例えば：（グルコースをグルコン酸に変換すると同 時に、植物病原菌に対する広範な耐性を付与する過酸化水素を産生する）グルコ ースオキシダーゼ；ピルビン酸オキシダーゼ；オキシラートオキシダーゼ；コレ ステロールオキシダーゼ；アミノ酸オキシダーゼ；及び一次若しくは二次基質と して分子酸素を用いて過酸化水素を 含めたペルオキシダーゼを産生する他のオキシダーゼ；（２）病因関連タンパク 質、例えば：ＳＡＲ８．２ａ及びＳＡＲＢ．２ｂタンパク質；酸性及び塩基性形 態のタバコ ＰＲ−１ａ、ＰＲ−１ｂ、ＰＲ−１ｃ、ＰＲ−１’、ＰＲ−２、Ｐ Ｒ−３、ＰＲ−４、ＰＲ−５、ＰＲ−Ｎ、ＰＲ−Ｏ、ＰＲ−Ｏ’、ＰＲ−Ｐ、Ｐ Ｒ−Ｑ及びＰＲ−Ｒタンパク質；タバコ塩基性キチナーゼ及びキュウリキチナー ゼ／リソザイムなどのキチナーゼ；キュウリ塩基性ペルオキシダーゼなどのペル オキシダーゼ；タバコ塩基性グルカナーゼなどのグルカナーゼ；オスモチン様タ ンパタ質；（３）ウイルスキャプシドタンパタ質及び植物ウイルスのレプリカー ゼ；（４）植物Ｒ−遺伝子（耐性遺伝子）、例えば：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＲＰＳ２〔Ｂｅｎｔら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１８５６−１８６ ０〕〕、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＲＰＭ１〔Ｇｒａｎｔら（１９９５）Ｓｃｉ ｅｎｃｅ ２６９：８４３−８４６〕、タバコ Ｎ−遺伝子及びＮ’−遺伝子〔 Ｗｈｉｔｍａｎら（１９９４）Ｃｅｌｌ ７８：１１０１−１１１５〕、トマト Ｃｆ−９〔Ｊｏｎｅｓら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６：７８９−７９３ 〕、アマＬ⁶〔Ｅｌｌｉｓら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：４１８５〕、及びコメ Ｘａ２１〔Ｓｏｎｇ ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１８０４−１８０６〕（これらの遺伝 子は、構成プロモーター、組織特異的プロモーター、又は真菌病原菌又は他の生 物学的若しくは化学的誘発物質により誘発され得るプロモーターを用いて発現さ せ得る）；（５）病原菌Ａｖｒ遺伝子、例えば：Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆ ｌｕｕｍ Ａｖｒ９〔Ｖａｎ ＤｅｎＡｃｋｅｒｖｅｋｅｎら（１９９２）Ｐｌ ａｎｔ Ｊ．２：３５９〕（該遺伝子は、病原菌又は化学的に誘発させ得るプロ モーターを用いて発現させ得る）；（６）安息香酸２−ヒドロキシラーゼなどの サリチル酸生合成に関与する遺伝子〔Ｌｅｏｎら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１０４１３−１０４１７〕をコードする ＤＮＡが含まれる。 多くの刊行物が、真菌などの種々の微生物に対する耐性が高められたトランス ジェニック植物を作出するために植物及び細菌のグルカナーゼ、キチナーゼ及び リソザイムを用いることを検討している。該刊行物には、ＥＰ０２９２４５３号 、ＥＰ０２９０１２３号、ＷＯ８８／００９７６号、米国特許第４，９ ４０，８４０号、ＷＯ９０／０７００１号、ＥＰ０３９２２２５号、ＥＰ０３０ ７８４１号、ＥＰ０３３２１０４号、ＥＰ０４４０３０４号、ＥＰ０４１８６９ ５号、ＥＰ０４４８５１１号及びＷＯ９１／０６３１２号が含まれる。オスモチ ン様タンパク質の使用はＷＯ９１／１９８４３号で検討されている。 上記の達成には、本発明の種々の態様に従って： 配列番号２に示されているアミノ酸配列を含む分離ポリペプチド； 該分離ポリペプチドをコードする分離ＤＮＡ分子（該分子は、配列番号１２に 示されているヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ分子であってもよいし、あるいは 、配列番号１２に示されているヌクレオチド配列の１１６〜２６９ヌクレオチド を含むｃＤＮＡ分子であってよい）; ５’→３’方向に作動可能に結合した： （ａ） 植物細胞中でＲＮＡ配列を生成させる機能を果たすプロモーター； （ｂ） 配列番号２に示されているアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードす る構造コード配列；及び （ｃ） 植物細胞中で、転写終結及び前記ＲＮＡ配列の３’末 端へのポリアデニル酸ヌクレオチドの付加を生起させる機能を果たす３’非翻訳 領域 を含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子が提供される。 上記ＤＮＡ分子の構造コード配列は、配列番号１２に示されているヌクレオチ ド配列、又は配列番号１２に示されているヌクレオチド配列の１１６〜２６９ヌ クレオチドを含むｃＤＮＡ分子であってよい。適切なプロモーター及び他の調節 配列を含む類似の組換え二本鎖ＤＮＡ分子を、動物、真菌及び細菌の細胞中に導 入して、構造コード配列を発現する形質転換細胞を得てもよい。 上記ＤＮＡ分子のプロモーターは、ＦＭＶ ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、ｓｓＲＵＢＩＳＣＯプロモーター、ＥＩＦ−４Ａプロモー ター、ＬＴＰプロモーター、アクチンプロモーター、又はユビキチンプロモータ ーであってよい。 植物に対する真菌による被害を防除する方法は、配列番号２に示されているア ミノ酸配列を含むか又は実質的に該配列からなる分離ポリペプチドを前記植物の 所在地に供給することを含む。真菌による被害は、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ属；Ａ ｓｃｏｃ ｈｙｔａ属；Ｂｏｔｒｙｔｉｓ属；Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ属；Ｃｏｌｌｅｔｏｔ ｒｉｃｈｕｍ属；Ｄｉｐｌｏｄｉａ属；Ｅｒｙｓｉｐｈｅ属；Ｆｕｓａｒｉｕｍ 属；Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ属；Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ属；Ｍ ａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ属；Ｎｅｃｔｒｉａ属；Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ属；Ｐ ｈｏｍａ属；Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ属；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ属： Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ属；Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ属；Ｐｕｃｃｉｎｉａ属；Ｐ ｕｔｈｉｕｍ属；Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ属；Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ属；Ｐｙ ｔｈｉｕｍ属；Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ属；Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ属；Ｓｃｌｅｒ ｏｔｉｎｉａ属；Ｓｅｐｔｏｒｉａ属；Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ属；Ｕｎｃ ｉｎｕｌａ属；Ｖｅｎｔｕｒｉａ属；及びＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ属からなる 群から選択される真菌によって引き起こされ得る。上記方法において、分離ポリ ペプチドは、抗真菌ポリペプチドを産生する微生物を植物でコロニー形成させる か、該分離ポリペプチドを含む組成物を適用するか、又は植物細胞内で該ポリペ プチドをコードするＤＮＡを発現させることにより植物の所在地に供給し得る。 植物に対する真菌による被害を防除する方法は： （ａ） 植物細胞のゲノム中に： （ｉ） 植物細胞中でＲＮＡ配列を生成させる機能を果たすプロモ ーター； （ii） 配列番号２に示されているアミノ酸配列を含むポリペプチ ドをコードする構造コード配列； （iii） 植物細胞中で、転写終結及びＲＮＡ配列の３’末端への ポリアデニル酸ヌクレオチドの付加を生起させる機能を果たす３’非翻訳領域 を含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子をに挿入するステップ； （ｂ） 形質転換植物細胞を得るステップ；及び （ｃ） 前記形質転換植物細胞から、細胞が抗真菌有効量の前記ポリペプチドを 発現する遺伝子操作により形質転換された植物を再生するステップ を含む。 上記方法において、構造コード配列は、配列番号１２に示されているヌクレオ チド配列、又は配列番号１２に示されているヌクレオチド配列の１１６〜２６９ ヌクレオチドを含み得る。プロモーターは、ＦＭＶ ３５Ｓプロモーター、Ｃａ ＭＶ ３５Ｓプロモーター、ｓｓＲＵＢＩＳＣＯプロモーター、ＥＩＦ− ４Ａプロモーター、ＬＴＰプロモーター、アクチンプロモーター、又はユビキチ ンプロモーターであってよい。 細胞が抗真菌有効量のポリペプチドを含む植物は、配列番号２に示されている アミノ酸配列を含む。 上記植物は： （ａ） 植物細胞のゲノム中に： （ｉ） 植物細胞中でＲＮＡ配列を生成させる機能を果たすプロモ ーター； （ii） 配列番号２に示されているアミノ酸配列を含むポリペプチ ドをコードする構造コード配列； （iii） 前記植物細胞中で、転写終結及び前記ＲＮＡ配列の３’ 末端へのポリアデニル酸ヌクレオチドの付加を生起させる機能を果たす３’非翻 訳領域 を含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子を挿入するステップ； （ｂ） 形質転換植物細胞を得るステップ；及び （ｃ） 前記形質転換植物細胞から、細胞が抗真菌有効量の前記ポリペプチドを 発現する遺伝子操作により形質転換された植物を再生するステップ を含む方法により作出し得る。 上記方法に用いられる構造コード配列は、配列番号１２に示されているヌクレ オチド配列、又は配列番号１２に示されているヌクレオチド配列の１１６〜２６ ９ヌクレオチドを含み得る。 さらに、該植物のゲノムは、抗真菌性のペプチド、ポリペプチド又はタンパク 質をコードする１種以上の他のＤＮＡ分子を含み得、該ＤＮＡ分子は形質を発現 し、該分子によりコードされる抗真菌有効量の前記ペプチド、ポリペプチド又は タンパク質を産生する。該ＤＮＡ分子はさらにＢ．ｔ．内毒素をコードするＤＮ Ａを含み得、該ＤＮＡは形質発現して、抗昆虫有効量のＢ．ｔ．内毒素を産生す る。植物は、リンゴ、オオムギ、ブロッコリ、キャベツ、カノラ、ニンジン、柑 橘類、トウモロコシ、ワタ、ニンニク、オートムギ、タマネギ、観賞植物、エン ドウ、ラッカセイ、コショウ、ジャガイモ、コメ、ライムギ、モロコシ、ダイズ 、イチゴ、テンサイ、サトウギビ、トマト、蔓植物及びコムギからなる群から選 択し得る。本発明はさらに、該植物によって生産されるジャガイモ種子（seedpi ece）を包含する。 有害な真菌と闘う方法は、有害な真菌を、配列番号１２に示されているアミノ 酸配列を含む抗真菌有効量の分離ポリペプチ ドと接触させることを含む。 抗真菌組成物は、配列番号２に示されているアミノ酸配列を含む抗真菌有効量 の分離ポリペプチドと許容し得る担体とを含む。該抗真菌組成物は、病原性真菌 の増殖の阻止や死滅化に用い得る。該組成物は、例えば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ− Ｋｕｃｈｌｅｒ（１９８６）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第４版 ，第７巻，Ｈａｎｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｍｕｎｉｃｈ；ｖａｎ Ｆａｌｋｅｎ ｂｅｒｇ（１９７２−１９７３）Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｓ，第２版，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．；及びＫ．Ｍａｒｔｅｎｓ （１９７９）Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｉｎｇ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第３版，Ｇ．Ｇｏ ｏｄｗｉｎ，Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎに記載の方法などの慣用法に従って製剤し 得る。担体、不活性物質、界面活性剤、溶媒及び他の添加剤などの必要な製剤助 剤も当業界では周知であり、例えば、Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ Ｄｕｓｔ Ｄｉｌｕｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃａｒｒｉ ｅｒｓ，第２版，Ｄａｒｌａｎｄ Ｂｏｏｋｓ，Ｃａｌｄｗｅｌｌ，Ｎ．Ｊ．及 びＷｉｎｎａｃｋｅｒ−Ｋｕｃｈｌｅｒ（１９８６）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ， 第４版，第７巻、Ｈａｎｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｍｕｎｉｃｈに記載されている 。これらの製剤を用いて、本発明の抗真菌ポリペプチドと、他の農薬活性物質、 肥料及び／又は生長調節剤などとの混合物を完成製剤又はタンクミックスの形態 で製造することも可能である。 本発明で企図されている抗真菌組成物には、本発明の抗真菌ポリペプチドを産 生し得且つ植物の根及び／又は葉でコロニー形成し得る細菌細胞や真菌細胞など の宿主細胞形態のものも含まれる。この方法で用い得る細菌細胞の例には、Ａｇ ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｓｐｙｒｉｌｌｕ ｍ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａ ｓ、Ｒｈｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍなどの菌株が含まれる。 本発明の抗真菌ポリペプチドと組み合わせ得る多くの慣用の真菌抗生物質及び 化学殺真菌剤が当業界で公知であり、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ及びＷａｌｋｅｒ （１９８３）Ｔｈｅ Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｍａｎｕａｌ，第７版，Ｂｒｉｔｉ ｓｈ Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｃｉｌに記載されている。該 物質には、例えば、ポリオキシン、ニコマイシン、カル ボキシアミド、芳香族炭水化物、カルボキシン、モルホリン、ステロール生合成 阻害剤及び有機リン化合物が含まれる。本発明の抗真菌ポリペプチドと組み合わ せて製剤し得る他の有効成分には、例えば、殺虫剤、誘引剤、殺菌剤、殺ダニ剤 、殺線虫剤及び除草剤が含まれる。米国特許第５，４２１，８３９号には、本発 明の抗真菌ポリペプチドなどの物質と組み合わせて製剤し得る多くの活性物質に ついての包括的概説が記載されている。 本発明の抗真菌ポリペプチドは、単独で用いる場合でも、他の活性物質と組み 合わせて用いる場合でも、約０．１μｇ／ｍ１〜約１００ｍｇ／ｍｌの範囲、好 ましくは、約５μｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度、約３．０〜約９．０ の範囲のｐＨで適用するのが望ましい。そのような組成物は、例えば、約１ｍＭ 〜１Ｍ、好ましくは、約１０ｍＭ〜１００ｍＭ、より好ましくは、約１５ｍＭ〜 ５０ｍＭのリン酸緩衝液を用いて緩衝し得る。低緩衝液濃度の場合、イオン強度 を増大させるために、塩、好ましくはＮａＣｌを、約１ｍＭ〜約１Ｍの範囲、よ り好ましくは約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲で添加するのが望ましい。 本発明の他の適用範囲は、以下の詳細な説明及び添付図面を参照すれば明らか になろう。しかし、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の好ましい実施態様 を示すものであり、例として記載されているに過ぎないことを理解されたい。と いうのは、当業者が該詳細な説明を読めば、本発明の精神及び範囲内で種々の修 正及び改変が明らかになると考えられるからである。 図面の簡単な説明 本発明の上記及び他の目的並びに利点は、添付図面を参照して記載されている 以下の詳細な説明からより良く理解されよう。これらは全て例として記載されて いるに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。 図面に示されているプラスミドマップに共通のＤＮＡフラグメントは：ＡＭＰ ：アンピシリン耐性；ｏｒｉ−ｐＵＣ：ｐＵＣプラスミド由来の複製起源；ＬＡ Ｃ：Ｌａｃ Ｚ遺伝子の部分配列；ｐ−ｅ３５Ｓ：プロモーター ｅ３５Ｓ；Ｈ ＳＰ７０イントロン：トウモロコシ由来の熱ショックタンパク質７０のイントロ ン；ＮＯＳ３’：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｉプラスミドのノパリン合成 （ｎｏｓ）遺伝子の３’非翻訳領域；ｏｒｉ−Ｍ１３：Ｍ１３ファージ複製起源 ；Ｓｐｃ／ Ｓｔｒ：細菌スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性遺伝子；ｐ−ＦＭＶ ：ゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター；ＥＰＳＰＳ／ＣＴＰ２： Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸シンター ゼ遺伝子（ＥＰＳＰＳ）由来の葉緑体転移ペプチド；ＣＰ４ ｓｙｎ：合成細菌 グリホス酸耐性ＣＰ４ ５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸シンターゼ （ＥＰＳＰＳ）遺伝子；Ｅ９３’：エンドウ ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ Ｅ９遺伝子 の３’非翻訳領域；ＰｅｔＨＳＰ７０−リーダー：ペチュニア熱ショックタンパ タ質７０遺伝子の５’非翻訳リーダー配列；ｏｒｉ−３２２：ｐＵＣ３２２複製 起源である。 図１は、ＡｌｙＡＦＰのｃＤＮＡヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示 している。三角形は成熟ＡｌｙＡＦＰポリペプチドの開始部分を示している。下 線を付したアミノ酸配列はシグナルペプチドを示している。二重下線を付した配 列は、予想ｐｏｌｙＡシグナル配列を示している。アスタリスクは停止コドンを 示す。 図２は、ＡｌｙＡＦＰ、Ｒｓ−ＡＦＰ１及びＲｓ−ＡＦＰ２のアミノ酸配列の 多重比較である。三角形は、成熟ＡｌｙＡＦ Ｐ及びＲｓ−ＡＦＰ１ポリペプチドの開始部分を示している。下線を付したアミ ノ酸配列はシグナルペプチド（Ｒｓ−ＡＦＰ２のシグナルペプチドは決定されて いない）を示しており、アスタリスクは３種のペプチド間の相違部分を示してい る。 図３はｐＭＯＮ２３３１７の物理マップである。 図４はｐＭＯＮ２２６５２の物理マップである。 図５はｐＭＯＮ２２５７５の物理マップである。 図６はｐＭＯＮ２２６５５の物理マップである。 図７はｐＭＯＮ１７２２７の物理マップである。 図８はｐＭＯＮ２２６５７の物理マップである。 図９はｐＭＯＮ２２６３４の物理マップである。 図１０はｐＭＯＮ２２６３５の物理マップである。 図１１は、表３のデータに対応する棒グラフであり、ＡｌｙＡＦＰ ｃＤＮＡ を発現するトランスジェニックジャガイモ植物について行ったＶｅｒｔｉｃｉｌ ｌｉｕｍ立ち枯れ病テストの結果を示している。 発明の詳細な説明 以下の発明の詳細な説明は、本発明の実施に際して当業者を支援するために提 供されている。例えそうであっても、本明細 書に記載されている実施態様の変更や変異形は本発明の精神又は範囲から逸脱せ ずに当業者が実施し得るものであるから、以下の詳細な説明は本発明を不適当に 限定するものと解釈してはならない。 本明細書に引用されている参考文献を含めた本明細書に記載の各参考文献の内 容は、その全体を参照として本明細書に組み込むものとする。定義 本明細書に用いられている用語「抗真菌ポリペプチド」とは、抗真菌特性を有 する、即ち、真菌細胞の増殖を阻害するか、真菌細胞を死滅化させるか、又は胞 子の生長、胞子形成及び交配などの真菌生活環の段階を乱したり、遅らせたりす るポリペプチドを指す。 農業的文脈において、語句「真菌による被害と闘う、又は該被害を防除する」 とは、真菌病原菌による感染に起因する作物に対する被害を減少させることを指 す。より一般的な意味では、該語句は、任意の特定の場所において有害な真菌の 存在によって引き起こされる有害作用を減少させることを指す。 用語「構造コード配列」とは、細胞によって産生されるペプ チド、ポリペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡ配列を指し、該構造コー ド配列はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写され、次いで、該ｍＲＮＡが 目的のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質産物に翻訳される。 本発明の方法は、種々の態様で実施し得る。上記方法のいずれかに従って産生 された本発明の抗真菌ポリペプチドは、担体又は当業界で公知の他の抗真菌物質 を含めた他の添加物と混合して植物に直接適用し得る。あるいは、該ポリペプチ ドを、植物に適用し得る細菌又は酵母細胞により発現させることもできる。慣用 法を用い、抗真菌ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むように植物細胞を形質 転換してもよい。該ポリペプチドは、構造的に、組織特異的に、又は真菌病原菌 に対して植物を暴露することにより発現し得る。 本発明は、特定の態様において、種々の異なる植物病原性真菌に対して強力な 抗真菌活性を示す、配列番号２に示されている配列を有するポリペプチドの使用 を包含する。 抗真菌ポリペプチドのアミノ酸配列は、直接配列決定、及びそのクローン化ｃ ＤＮＡの翻訳により決定された。該抗真菌ポリペプチドは、他の植物防御物質と 部分的に相同である、即ち、 部分配列同一性を有するが、そのアミノ酸残基の１０％以上は他のどの植物防御 物質とも異なっている。さらに、該ポリペプチドの抗真菌活性は、特に生理的濃 度の無機カチオンの存在下にアッセイした場合、最も緊密な関連を有する植物防 御物質（Ｒｓ−ＡＦＰ１及びＲｓ−ＡＦＰ２）よりも著しく高い。ＡｌｙＡＦＰ のアミノ酸配列とＲｓ−ＡＦＰ１及びＲｓ−ＡＦＰ２のアミノ酸配列を比較する 多重図が図２に示されている。 本発明はさらに、真菌病原菌に対する耐性を植物細胞に付与する関連ＤＮＡ配 列の同定に有用な組換えプラスミド、形質転換微生物、プローブ及びプライマー を製造するため、及びそのそのような真菌病原菌に対して耐性を有するトランス ジェニック植物を作出するための、本明細書に開示のＤＮＡ配列又はその生物学 的機能同等物のいずれかの使用を包含する。 さらに本発明は、本明細書に開示されているＤＮＡ配列又はその生物学的機能 同等物を用いて、植物細胞及び植物に真菌病原菌に対する耐性を付与する方法を 包含する。 上述のように、本発明の抗真菌ポリペプチドは、広範な活性を提供するように 、即ち、他の病原体の防除及び／又は同一真菌病原菌の防除に対して多重作用モ ードを提供するように、抗 真菌活性を示す他のペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を含めた他の抗真菌 物質と組み合わせて用い得る。そのような他の抗真菌物質の例としては、キチナ ーゼ、システインに富むキチン結合タンパク質、β−１，３−グルカナーゼ、（ ゼアマチンを含む）ペルマチン、チオニン、リボソーム不活化タンパク質及び非 特異的脂質輸送タンパク質が挙げられる。 そのような抗真菌ポリペプチド及びタンパク質源には、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ ｓ、オオムギ、ブロッコリ、キャベツ、カノラ、ニンジン、トウモロコシ、ニン ニク、タマネギ、エンドウ、コショウ、ジャガイモ、コメ、ダイズ、テンサイ、 タバコ、トマト及びコムギなどの植物；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｐｅｎｉｃｉ ｌｌｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ（Ａｌｔｅｒｎａ ｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｏｌａ；Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ）；Ａｓ ｃｏｃｈｙｔａ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ ｐｉｓｉ）；Ｂｏｔｒｙｔｉｓ（Ｂｏｔ ｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）；Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｋｉｋｕｃｈｉｉ；Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｚａｅａ−ｍａｙｄｉｓ）；Ｃｏ ｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌｉｎｄｅｒｍａ ｃｈｉａｎｕ ｍ）；Ｄｉｐｌｏｄｉａ（Ｄｉｐｌｏｄｉａ ｍａｙｄｉｓ）；Ｅｒｙｓｉｐｈ ｅ（Ｅｒｉｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ．ｇｒａｍｉｎｉｓ；Ｅｒ ｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ．ｈｏｒｄｅｉ）；Ｆｕｓａｒｉｕ ｍ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｉｖａｌｅ：Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ；Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ；Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏ ｒｕｍ；Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ；Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｉｉｆ ｏｒｍｅ；Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）；Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ（ Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ．ｔｒｉｔｉｃｉ） ；Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｔ ｕｒｃｉｃｕｍ；Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｒｂｏｎｕｍ；Ｈｅ ｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍａｙｄｉｓ）；Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ（ Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ；Ｍａｇａｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）；Ｎｅｃｔｒｉａ（Ｎｅｃｔｒｉａ ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃ ａ）；Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｍａｎｓｈｕｒｉｃ ａ；Ｐｅｒｎｏｓｐｏｒａ ｔａｂａｃｉｎａ）；Ｐｈｏｍａ（Ｐｈｏｍ ａ ｂｅｔａｅ）；Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈ ｕｍ ｏｍｎｉｖｏｒｕｍ）；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈ ｏｒａ ｃｉｎｎａｍｏｍｉ；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ ｃａｃｔｒｕｍ；Ｐｈ ｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐｈａｓｅｏｌｉ；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｐａｒａ ｓｉｔｉｃａ；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃｉｔｒｏｐｈｔｈｏｒａ；Ｐｈｙ ｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ ｆ．ｓｐ．ｓｏｊａｅ；Ｐｈｙｔ ｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）；Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ（Ｐｌａｓｍ ｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａ）；Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ（Ｐｏｄｏｓｐｈａ ｅｒａ ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａ）；Ｐｕｃｃｉｎｉａ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓ ｏｒｇｈｉ；Ｐｕｃｃｉｎｉａｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ；Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｇ ｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ．ｔｒｉｔｉｃｉ；Ｐｕｃｃｉｎｉａ ａｓｐａｒｒ ａｇｉ；Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｒｅｃｏｎｄｉｔａ；Ｐｕｃｃｉｎｉａ ａｒａｃ ｈｉｄｉｓ）；Ｐｕｔｈｉｕｍ（Ｐｕｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕ ｍ）；Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｔｒｉｔｉｃｉｒｅ ｐｅｎｔｅｎｓ）；Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉ ａ ｏｒｙｚａｅ）；Ｐｙｔｈｉｕｍ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ）；Ｒ ｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ；Ｒｈｉｚｏｃ ｔｏｎｉａ ｃｅｒａｌｉｓ）；Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ ｒ ｏｌｆｓｉｉ）；Ｓｃｉｅｒｏｔｉｎｉａ（Ｓｃｉｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｉｅ ｒｏｔｉｏｒｕｍ）；Ｓｅｐｔｏｒｉａ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｌｙｃｏｐｅｒｓ ｉｃｉ；Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ；Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｎｏｄｏｒ ｕｍ；Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉ）；Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ（Ｔ ｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｂａｓｉｃｏｌａ）；Ｕｎｃｉｎｕｌａ（Ｕｎｓｉ ｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒ）；Ｖｅｎｔｕｒｉａ（Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎａｅ ｑｕａｌｉｓ）；及びＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ；Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｌｂｏ−ａｔｒｕｍ）などの微 生物；並びに他の非植物有機体が含まれる。 本発明は、以下の説明的、非限定的実施例からより良く理解されるであろう。実施例１ ＡｌｙＡＦＰの分子量 ゲル電気泳動 最初に、Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５（１９７０ 年）の方法により電気泳動でＡｌｙＡＦＰの分子量を測定した。４５０ｍＭＴｒ ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４５）、１２％グリセロール、４％ＳＤＳ、０．０６％ Ｃｏｏｍａｓｉｅ ＢｌｕｅＧおよび０．００２５％フェノールレッド（カリフ ォルニア州、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のＮｏｖｅｘ）を含有 する変性サンプル緩衝液にポリペプチドを溶解させ、１０分間煮沸して、そして １２５Ｖ定電圧で、２時間、１００ｍＭＴｒｉｓ、１００ｍＭトリシンおよび１ ％ＳＤＳを含有する電気泳動緩衝液中の１６％Ｔｒｉｃｉｎｅゲル（カリフォル ニア州、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のＮｏｖｅｘ）中で電気泳 動を行った。銀染色（マサチューセッツ州、ナティック（Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ） のＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、およそ ６ｋＤａの分子量を示すバンドを示した。陽性イオンエレクトロスプレイ質量分析法による質量分析 Ｓｃｏｂｌｅらによる、「マイタロシーケンスのためのタンパク質およびペプ チド精製についての実施指針（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐ ｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」、Ｐ．Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ編、Ａｃａｄ ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、１２ ５−１５３頁（１９９３年）に記載のとおり、陽性イオンエレクトロスプレイ質 量分析法により、ＡｌｙＡＦＰを質量分析した。 観察された天然ポリペプチドの分子量は、５，６５７ダルトンであった。トリプシン断片の分析 ＳｔｏｎｅおよびＷｉｌｌｉａｍｓ（「マイクロシーケンスのためのタンパク 質およびペプチド精製についての実施指針（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄ ｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ ｎ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」、Ｐ．Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ 編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、サ ンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、４３−６９頁（１９９３年））の方法によ り、抗菌ポリペプチドを還元し、カルボキシメチル化し、そしてトリプシンで消 化した。 そのタンパク質のアミノ酸配列を決定するために、トリプシン断片の分子量を 測定するキャピラリー液体クロマトグラフィー／質量分析法によって、トリプシ ンの消化物を分析した。 ポリペプチドのトリプシン断片の１つは、ＰＣＴ出願第ＷＯ９３／０５１５３ 号に開示されたＲｓ−ＡＦＰ１のＣ末端トリプシン断片と同じ分子量と同じ溶出 時間を示し、２つのポリペプチドが同じＣ末端を共有することを示した。他のポ リペプチドトリプシン断片ペプチドの分子量で、Ｒｓ−ＡＦＰ１のものに一致す るものはなく、これによって、本発明のペプチドはＲｓ−ＡＦＰ１とは異なるこ とを示す。この点について図２を注目されたい。 実施例２ ＡｌｙＡＦＰのアミノ酸配列 ＡｌｙＡＦＰのアミノ酸配列を決定するために、精製ポリペプチド（質量分析 データに基づいて９８％より高い純度）を、８ｍＭジチオスレイトールを含有す る８Ｍ尿素中で変性させた。 Ｓｔｏｎｅら、「マイクロシーケンスのためのタンパク質およびペプチド精製に ついての実施指針（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉ ｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」、Ｐ．Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、５５−５６頁（ １９９３年）に記載のＳ−カルボキシメチル化によって、システイン残基を修飾 した。１０００の分子量排除を示す膜を用いて、蒸留水で透析することによって 、試薬を除去した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのモデル４７０Ａタ ンパクシーケネーター（コネチカット州、ノールウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃ Ｔ）のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、自動化エドマン分解を行っ た。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル１２０ＰＴＨ分析機を使用し て、オンライン形態での逆相分析によってそれぞれのＰＴＨ−アミノ酸誘導体を 同定した。 ポリペプチドのＮ−末端シーケンスは、位置１０、４４、４５および４６にア ンビギュアスコールを示す、配列番号：１に示される４９アミノ酸を同定した。 トリプシン断片の質量分析 から得られた情報（実施例１）は、これらの未決定のアミノ酸残基は、位置１０ ではトリプトファン、位置４４−４５−４６ではシステイン−イソロイシン−シ ステイン、そして５０番目と最終の位置ではシステインにちがいないことを示し た。 成熟ＡｌｙＡＦＰポリペプチドの完全なアミノ酸配列は、配列番号：２に示さ れる。 実施例３ ＡｌｙＡＦＰの生物利用能 ＡｌｙＡＦＰの抗菌活性は、菌類の菌糸成長の５０％阻害（ＩＣ₅₀）を起こす ために必要とされるμｇ／ｍｌでの濃度として表現することができる。菌の菌糸 成長阻害百分率は、ポリペプチドサンプルの代わりに緩衝液が添加された対照培 養基での平均菌糸長で割った試験サンプル培養基での平均菌糸長の比を１００％ として定義される。 ＡｌｙＡＦＰの抗菌活性は、倒立顕微鏡下、このポリペプチドの存在下で、多 くの異なる菌類の菌糸長の阻害を測定することによって決定される。二倍強度の 試験培養基５０μｌ中で、試験に使用された菌類により、５から１５時間、菌類 の胞子（２ラ１０⁴胞子／ｍｌ）を発芽させた。最終一次強度アッセイ培養 基は、Ｋ₂ＨＰＯ₄（２．５ｍＭ）、ＭｇＳＯ₄（５０μＭ）、ＣａＣｌ₂（５０μ Ｍ）、ＦｅＳＯ₄（５μＭ）、ＣｏＣｌ₂（０．１μＭ）、ＣｕＳＯ₄（０．１μ Ｍ）、Ｎａ₂ＭｏＯ₄（２μＭ）、Ｈ₃ＢＯ₃（０．５μＭ）、ＫＩ（０．１μＭ） 、ＺｎＳＯ₄（０．５μＭ）、ＭｎＳＯ₄（０．１μＭ）、グルコース（１０ｇ／ ｌ）、アスパラギン（１ｇ／ｌ）、メチオニン（２０ｍｇ／ｌ）、ミオ−イノシ トール（２ｍｇ／ｌ）、ビオチン（０．２ｍｇ／ｌ）、チアミン−ＨＣｌ（１ｍ ｇ／ｌ）、およびピリドキシン−ＨＣｌ（０．２ｍｇ／ｌ）を含有した。陽イオ ンの拮抗効果での試験については、ＣａＣｌ₂およびＫＣｌを、それそれ、１ｍ Ｍと５０ｍＭの最終濃度まで添加した。この塩補足培養基は、「高塩培養基」に 該当し、そして元の培養基は、「低塩培養基」に該当する。胞子を発芽させた後 、蒸留水中のポリペプチド５０μｌの濾過殺菌溶液を、発芽胞子を含有する試験 ウエルに添加し、その混合液を１５から２４時間、２４℃でインキュベートした 。ＡｌｙＡＦＰは、０から８０μｇ／ｍｌの範囲の濃度で試験して、ＩＣ₅₀値を 測定した。ポリペプチド濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ（イリノイ州、ロックフォード（ Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ））から入手のＢＣＡタンパク質アッセイキットを用い て測定した。 表１は、小麦ヘッドスカブ（ｓｃａｂ）の原因病原体であるＦｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ（フサリウム・クルモラム）およびジャガイモでの初期死の 原因病原体であるＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ（ベルチシリウム ・ダヒリアエ）に対するＡｌｙＡＦＰの抗菌活性を示す。 表１ ＡｌｙＡＦＰの抗菌活性 表１のデータは、ＡｌｙＡＦＰが、大麦、トウモロコシ、綿、エンバク、ジャ ガイモ、大豆、トマト、および小麦を含む多くの作物植物に疾病を起こすＦｕｓ ａｒｉｕｍ（フサリウム）およびＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ（ベルチシリウム） に対する強力な抗菌活性を示すことを例示する。このポリペプチドの抗菌活性は 、ＰＣＴ出願第ＷＯ９３／０５１５３号で開示された他の抗菌ペプチドでの活性 に比較して、アッセイ培養基に存在する塩の拮抗効果にそれほど感受性を示さな い。菌類の菌糸成長 の５０％阻害（ＩＣ₅₀）を起こすのに必要とされるμｌ／ｍｌでの濃度は、Ａｌ ｙＡＦＰをコードするＤＮＡを用いて形質転換された植物で実際に達成できる。 これらのＩＣ₅₀値は、多くの市販殺菌剤の値の範囲に入り、そして植物の感染部 位でこの抗菌ペプチドを使用する利用性を示す。 表２でのデータは、本発明のポリペプチドの抗菌活性を、ＰＣＴ出願第ＷＯ９ ３／０５１５５３号で開示されたＲｓ−ＡＦＰ１およびＲｓ−ＡＦＰ２と比較す る。 表２ ＡｌｙＡＦＰ、Ｒｓ−ＡＦＰ１ およびＲｓ−ＡＦＰ２の抗菌活性の比較 これらのデータは、低塩および高塩条件下でのＦ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ（エフ． クルモラム）のＡｌｙＡＦＰの活性が、Ｒｓ−ＡＦＰ１およびＲｓ−ＡＦＰ２の 活性と類似することを例示する。一方、Ｖ．ｄａｈｌｉａｅ（ブイ．ダヒリアエ ）におけるこのポリペプチドの活性は、高塩条件下でのＲｓ−ＡＦＰ１およびＲ ｓ−ＡＦＰ２の活性より際立って大きい。 ＡｌｙＡＦＰおよびその生物学的に機能性の同等なものは、以下の属および種 から選択される菌の制御に使用することかできる： Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ（アルターナリア）（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓ ｉｃｏｌａ（アルターナリア・ブラシコラ）； Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ（アルターナリア・ソラニ））、 Ａｓｃｏｃｈｙｔａ（アスコキタ）（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ ｐｉｓｉ（アスコキ タ・ピシ））； Ｂｏｔｒｙｔｉｓ（ボトリチス）（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ（ボトリ チス・シネレア））、 Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ（セルコスポラ）（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｋｉｋｕｃｈ ｉｉ（セルコスポラ・キクチイ）；Ｃｅｒｃ ｏｓｐｏｒａ ｚａｅａ−ｍａｙｄｉｓ（セルコスポラ・ザエアーマイジス）） 、 Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ（コレトトリチュム）（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃ ｈｕｍ ｌｉｎｄｅｍｕｔｈｉａｎｕｍ（コレトトリチュム・リンデムチアヌム ））、 Ｄｉｐｌｏｄｉａ（ディプロディア）（Ｄｉｐｌｏｄｉａ ｍａｙｄｉｓ（ディ プロディア・マイジス））、 Ｅｒｙｓｉｐｈｅ（エリシフェ）（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ． ｓｐ．ｇｒａｍｉｎｉｓ（エリシフェ・グラミニス・エフ．エスピー．グラミニ ス）、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ．ｈｏｒｄｅｉ（エリシ フェ・グラミニス・エフ．エスピー．ホルデイ））、 Ｆｕｓａｒｉｕｍ（フサリウム）（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｉｖａｌｅ（フサリウ ム・ニバレ）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ（フサリウム・オキシス ポラム）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ（フサリウム・グラミネ アラム）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ（フサリウム・クルモラム）、 Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ（フサリウム・ソラニ）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ（フサリウム・モ ニリフォルム）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ（フサリウム・ロゼウム）） 、 Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ（ガエウマノマイセス）（Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃ ｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ．ｔｒｉｔｉｃｉ（ガエウマノマイセス・グ ラミニス・エフ．エスピトリチシ））、 Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ（ヘルミントスポリウム）（Ｈｅｌｍｉｎｔ ｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｔｕｒｃｉｃｕｍ（ヘルミントスポリウム・ツルシカム） 、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｒｂｏｎｕｍ（ヘルミントスポリウ ム・カルボナム）、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍａｙｄｉｓ（ヘルミ ントスポリウム・マイジス））、 Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ（マクロフォミナ）（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐ ｈａｓｅｏｌｉｎａ（マクロフォミナ・ファセオリナ）、Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉ ｎａ ｇｒｉｓｅａ（マクロフォミナ・グリセア））、 Ｎｅｃｔｒｉａ（ネクトリア）（Ｎｅｃｔｒｉａ ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃａ（ ネクトリア・ヘマトコッカ））、 Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ（ペロノスポラ）（Ｐｅｒｏｎｏｓｐ ｏｒａ ｍａｎｓｈｕｒｉｃａ（ペロノスポラ・マンシュリカ）、Ｐｅｒｏｎｏ ｓｐｏｒａ ｔａｂａｃｉｎａ（ペロノスポラ・タバシナ））、 Ｐｈｏｍａ（フォーマ）（Ｐｈｏｍａ ｂｅｔａｅ（フォーマ・ベタエ））、 Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ（フィマトトリクム）（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃ ｈｕｍ ｏｍｎｉｖｏｒｕｍ（フィマトトリクム・オムニボラム））、 Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ（フィトフソラ）（ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃｉ ｎｎａｍｏｍｉ（フィトフソラ・シナモミ）、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａ ｃｔｏｒｕｍ（フィトフソラ・カクトラム）、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐｈ ａｓｅｏｌｉ（フィトフソラ・ファセオリ）、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａ ｒａｓｉｔｉｃａ（フィトフソラ・パラシチカ）、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃｉｔｒｏｐｈｔｈｏｒａ（フィトフソラ・シトロフソラ）、ｐｈｙｔｏｐｈｔ ｈｏｒａ ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ ｆ．ｓｐ．ｓｏｊａｅ（フィトフソラ・メガ スペルマ・エフ．エスピー．ソジャエ）、ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅ ｓｔａｎｓ（フィトフソラ・インフェスタ ンス））、 Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ（プラスモパラ）（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏ ｌａ（プラスモパラ・ビチコラ））、 Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ（ポドスファエラ）（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ｌｅｕ ｃｏｔｒｉｃｈａ（ポドスファエラ・リュコトリカ））、 Ｐｕｃｃｉｎｉａ（プキニア）（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｏｒｇｈｉ（プキニア・ ソルギ）、Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ（プキニア・ストリフォ ルミス）、Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ．ｔｒｉｔｉｃｉ（ プキニア・グラミニス・エフ．エスピー．トリチシ）、Ｐｕｃｃｉｎｉａ ａｓ ｐａｒａｇｉ（プキニア・アスパラギ）、Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｒｅｃｏｎｄｉｔ ａ（プキニア・レコンジタ）、Ｐｕｃｃｉｎｉａ ａｒａｃｈｉｄｉｓ（プキニ ア・アラキジス））、 Ｐｕｔｈｉｕｍ（プチウム）（Ｐｕｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ （プチウム・アファニデルマツム））、 Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ（ピレノフオラ） (Pｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｔｒｉｔ ｉｃｉ−ｒｅｐｅｎｔｅｎｓ（ピレノフォ ラ・トリチシ−レペンテンス））、 Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ（ピリタラリア）（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚ ａｅ（ピリクラリア・オリザエ））、 Ｐｙｔｈｉｕｍ（ピチウム）（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ（ピチウム・ウ ルチマム））、 Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ（リゾクトニア）（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａ ｎｉ（リゾクトニア・ソラニ）、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｅｒｅａｌｉｓ（ リゾクトニア・セレアリス））、 Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ（セロチウム）（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉ（セ ロチウム・ロルフシ））、 Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ（スクレロチニア）（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌ ｅｒｏｔｉｏｒｕｍ（スクレロチニア・スクレロチオルム））、 Ｓｅｐｔｏｒｉａ（セプトリア）（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ （セプトリア・リコペルシチ）、Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ（セプト リア・グリシネス）、Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ（セプトリア・ノドル ム）、Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉ（セプトリア・トリチシ））、 Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ（チエラビオプシス）（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉ ｓ ｂａｓｉｃｏｌａ（チエラビオプシス・バシコラ）、 Ｕｎｃｉｎｕｌａ（ウンシヌラ）（Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒ（ウンシ ヌラ・ネカトル））、 Ｖｅｎｔｕｒｉａ（ベンツリア）（Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ（ ベンツリア・イナエクアリス））、 Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ（ベルチシリウム）（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄ ａｈｌｉａｅ（ベルチシリウム・ダヒリアエ）、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ａ ｌｂｏ−ａｔｒｕｍ（ベルチシリウム・アルボ−アツルム））。 実施例４ ＡｌｙＡＦＰをコードするｃＤＮＡのクローニング ｍＲＮＡ単離 Ｂｉｏ１０１Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、ラホラ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ））から入手のＲＮａｉｄｅプラスキットを用い、製造業者により示唆されたプ ロトコールにしたがって、地域苗床で購入したＡｌｙｓｓｕｍ（アリスム）植物 の花から総ＲＮＡを製造した。Ｃｅｌａｎｏら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ ｅｓ １５巻：２７−２８頁（１９９３年）に記載のとおり、オリゴ（ｄｔ）セ ルロース（メリーランド州、ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍ Ｄ）のＧＩＢＣＯ ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して 、ポリアデニル化ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡクローニング ５ＲＡＣＥキット（メリーランド州、ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ ｕｒｇ，ＭＤ）のＧＩＢＣＯ ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） を使用して、ポリペプチドｃＤＮＡの５領域をクローニングした。オリゴ−ｄＴ プライマーを使用して、逆転写によって、ポリアデニル化ＲＮＡから第一鎖ｃＤ ＮＡを発生させた。ＲＮａｓｅＨ１消化およびスピンカートリッジ分離によって ｍＲＮＡ鎖を除去した後、製造業者によって推奨される条件下で、末端デオキシ ヌタレオチドトランスフェラーゼを使用して、ポリ−Ｃ尾部を、一本鎖ｃＤＮＡ に付加した。ＧｅｎｅＡｍｐ ＤＮＡ増幅試薬キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅ ｒ Ｃｅｔｕｓ）、および製造業者によって推奨される反応条件を用いたＰＣＲ によって、ポリペプチドｃＤＮＡの５領域を増幅した。増幅のために使用された ２つのプ ライマーは、１）アンチセンス配向で、ポリペプチド配列のＣ末端でアミノ酸に 作られた混合オリゴヌクレオチド３５−マー（２４の縮重、クローニング部位と して１４ヌクレオチド、および遺伝子特異性として２１ヌクレオチド。配列番号 ：３）および２）ｃＤＮＡのポリ−Ｃ尾部にアニールするオリゴ−ｄＧプライマ ー（配列番号：４）であった。アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ反応産物を 分析し、そして約２５０ｂｐの単一バンドが、完全反応混合物に存在したが、１ つのプライマーのみを含む対照反応混合物には存在しなかった。このバンドをゲ ルから切り取り、そしてＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ遠心分離濾過ユニット（マサ チューセッツ州、ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のＭｉｌｌｉｐｏｒ ｅ）を使用してＤＮＡを単離した。ＤＮＡ断片をＢａｍＨ１で消化し、プラスミ ドｐＧＥＭ１１Ｚｆ（＋）（ウィスコンシン州、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ、 ＷＩ）のｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、そしてＰＲＩＳＭ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＤｙｅＤｅｏｘｙターミネーターサイクルシーケンスキット （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓから入手の３７３ＤＮＡシーケンサー収縮モデル で、挿入物をシーケンスした。配列は、配列番号：５に示される。 以下のとおり、ポリペプチドｃＤＮＡの３領域をクローニングした。Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）、お よび製造業者によって推奨される反応条件を用いたＰＣＲによるポリペプチドｃ ＤＮＡの３部分の増幅のためのテンプレートとして５ＲＡＣＥについて生成され た第一鎖ｃＤＮＡを使用した。増幅のために使用された２つのプライマーは、１ ）ポリペプチド配列のアミノ酸位置１３から１９に作られた混合オリゴヌクレオ チド３４−マー（クローニング部位として１４ヌクレオチド、および遺伝子特異 性として２０ヌクレオチド、１６の縮重、配列番号：６）、および２）ｃＤＮＡ のポリ−（Ａ＋）尾部にアニールするオリゴ−ｄＴプライマー（配列番号：７） であった。アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ反応産物を分析し、約３００ｂ ｐの単一バンドが、完全反応混合物に存在したが、１つのプライマーのみを含む 対照反応混合物には存在しなかった。このバンドをゲルから切り取り、Ｕｌｔｒ ａｆｒｅｅ−ＭＣ遠心分離濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＤＮ Ａを単離した。 ＤＮＡ断片をＢａｍＨ１で消化し、プラスミドｐＧＥＭ１１Ｚｆ（＋）にクロー ニングし、ＰＲＩＳＭ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＤｙｅＤｅｏｘｙター ミネーターサイクルシーケンスキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ）を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手の３７３ＤＮＡシ ーケンサー収縮モデルで、挿入配列をシーケンスした。配列は、配列番号：８に 示される。 ポリペプチドｃＤＮＡの５領域及び３領域は、１１４ヌクレオチドで重なり、 これら２つの領域の組合せは、全長ポリペプチドｃＤＮＡの配列（配列番号：９ ）を提供する。 図１に示されるとおり、抗菌ポリペプチドｃＤＮＡは、５２ｂｐの５リーダー 配列、７９アミノ酸ポリペプチドのための２４０ｂｐ開放読取り枠コーディング 、および１７０ｂｐからポリ（Ａ＋）尾部までの３猪「翻訳領域をコードする。 推論ポリペプチド（図１）は、２９アミノ酸の推定シグナルペプチド（図１で下 線）および５０アミノ酸の成熟ポリペプチドから構成され、質量分析法および直 接アミノ酸シーケンスにより、決定される配列に一致する（実施例１および２） 。検出シグナルペプチド切断部位の付近でのアミノ酸配列は、Ｒｓ−ＡＦＰ１の も のと類似し（図２参照）、そして実際の切断は、アラニンとアルギニンの間、す なわち図１での矢印で起こる。生じる未封鎖Ｎ−末端は、Ｒｓ−ＡＦＰ１のもの と比較して本発明のポリペプチドの優れた抗菌活性が観察されることの一因とな りうる。 クローニングの簡便さのため、ポリペプチドｃＤＮＡのコーディング領域を含 むｃＤＮＡ断片の末端にＰＣＲによって、制限部位を遺伝子操作した。収められ たＥｃｏ Ｒ１およびＢａｍ ＨＩ制限部位を有するポリペプチドの開始コドン （ＡＴＧ）の上流の５遺伝子特定プライマー１４ｂｐ（配列番号：１０）、およ び収められたＥｃｏ Ｒ１およびＢａｍ ＨＴ制限部位を有する終結コドン（Ｔ ＡＡ）後の３遺伝子特定プライマー（配列番号：１１）を使用して、上述のとお り、ｍＲＮＡｓの逆転写によって作られたｃＤＮＡからｃＤＮＡ断片を増幅した 。ＰＣＲ増幅断片は、配列番号：１２に示される。 このＰＣＲ産物を、２６４ｂｐＢａｍＨＩ断片として、トウモロコシの実のＨ ｓｐ７０イントロンを有するＥ３５Ｓプロモーターを含有する先に構築したＥ． ｃｏｌｉ（イー．コリ）カセットベクターｐＭＯＮ２３３１７（図３）のＢａｍ ＨＩ部位にサブクローニングして、ｐＭＯＮ２２６５２を作った（図４）。 ｎｏｓ遺伝子の３非翻訳ポリアデニル化配列は、ターミネーターとして供された 。ベクターも、イントロンとターミネーター配列の間の多重リンカー部位、プロ モーターおよびターミネーター配列の前後のＮＯｔＩ部位、およびアンピシリン 制限遺伝子を含む。ＢａｍＨＩクローニング部位の５０ｂｐ上流のＨＳＰ７０イ ントロンの配列に作られたプライマー（配列番号：１３）を使用して、ｐＭＯＮ ２２６５２中のｃＤＮＡ挿入物をシーケンスした。このｃＤＮＡ挿入物の配列は 、配列番号：１４で示され、正しい転写配向にあり、その推論アミノ酸配列（配 列番号：１５）は、直接アミノ酸配列分析によって得られるポリペプチドのもの （配列番号：２と比較）に一致する。 天然に生じる突然変異タンパク質およびその変異体を含めたＡｌｙＡＦＰをコ ードする遺伝子は、おそらく様々な植物種のゲノムに存在する。これらの遺伝子 は、従来の分子生物学的方法により、これらの植物種の染色体ＤＮＡから単離す ることができる。例えば、染色体ＤＮＡライブラリーは、当業者に公知の方法（ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー（ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）、（１９８９年））を用い て、バクテリオファージベクターλＥＭＢＬ３およびλｇｔ１０、コスミド、ま たはプラスミドのようなベクターで構築することができる。ＡｌｙＡＦＰのもの と同じかまたは類似の抗菌活性を示すポリペプチドをコードする遺伝子は、染色 体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーで行われるＰＣＲによって、またはゲ ノムＤＮＡライブラリーのプローブ・ハイブリダイゼーションによって単離でき る。ＰＣＲのためのプライマーおよびハイブリダイゼーションスクリーニングの ためのプローブは、配列番号：１２で示されたポリペプチドｃＤＮＡのヌクレオ チド配列に基づいて設計することができる。プライマーは、プライマー−ダイマ ー形成を避けるために、それらの３末端に自己相補配列も、相補的な配列も有す べきでない。プライマーは、制限部位を含むことができる。プライマーは、ＤＮ Ａにアニールされ、そして十分なサイクルのＰＣＲが行われて、ゲル電気泳動お よび染色によって十分に視覚化された産物を生じる。プライマーは、一般に少な くとも１６ヌクレオチド長で、特に少なくとも２０ヌクレオチド長、 好ましくは少なくとも２４ヌクレオチド長、そしてより好ましくは少なくとも２ ８ヌクレオチド長である。このようなプライマーは、抗菌ポリペプチド、または ＡｌｙＡＦＰと同じかまたは類似の抗菌活性を示すタンパク質をコードする遺伝 子を特異的にプライミングする能力がある。増幅断片を精製し、適切なベクター に挿入し、そして当業者に公知の従来の手段によって繁殖できる。 実施例５ ＡｌＡＦＰに生物学的に、機能的に同等なペプチド、ポリペプチド、およびタン パク質 本発明は、酸性または塩基性塩の形態でまたは中性の形態でありうる、配列番 号：２で示されるアミノ酸配列を示すポリペプチドのみならず、生物学的に機能 性の同等なペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質も包含する。語句「生物学 的に機能性の同等なペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質」は、ＡｌｙＡＦ Ｐに配列類似性を示す配列または部分を含むペプチド、ポリペプチドおよびタン パク質を示し、本明細書に記載されるとおり、このポリペプチドのものと同じか または類似の抗菌活性を示す。基礎ポリペプチド配列中の保存アミノ酸改変を含むペプチド、ポリペプチドおよ びタンパク質 生物学的に、機能的にＡｌｙＡＦＰに同等なペプチド、ポリペプチドおよびタ ンパク質は、配列番号：２に示される基礎配列に保存アミノ酸改変を含むアミノ 酸配列を包含する。このようなアミノ酸配列で、基礎配列中の１つまたはそれ以 上のアミノ酸は、別のアミノ酸に置換えられ、すなわち、その負荷および極性は 天然のアミノ酸のものに類似し、結果として、保存アミノ酸置換はサイレント改 変になる。 基礎ポリペプチド配列内のアミノ酸の置換は、天然に生じるアミノ酸が属する クラスの他の構成物から選択できる。アミノ酸は、以下の４つの群：（１）酸性 アミノ酸；（２）塩基性アミノ酸；（３）中性の極性アミノ酸；および（４）中 性の非極性アミノ酸に分けることができる。これらの種々の群の代表的アミノ酸 としては、それに限定されないが、（１）アスパラギン酸およびグルタミン酸の ような酸性（陰性に荷電された）アミノ酸；（２）アルギニン、ヒスチジンおよ びリシンのような塩基性（陽性に荷電された）アミノ酸；（３）グリシン、セリ ン、スレオニン、シテイン、シスチン、チロシン、アスパラギ ン、およびグルタミンのような中性の極性アミノ酸；（４）アラニン、ロイシン 、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およ びメチオニンのような中性の非極性（疎水性）アミノ酸が挙げられる。 基礎ポリペプチド配列内の保存アミノ酸改変は、これらの基１つ中の１つのア ミノ酸を、同じ基内の他のアミノ酸に置換することによって作ることができる。 生物学的に機能性の同等なＡｌｙＡＦＰは、１０またはそれより少ない保存アミ ノ酸改変、さらに好ましくは７またはそれより少ない保存アミノ酸改変、そして 最も好ましくは５またはそれより少ない保存アミノ酸改変を示すことができる。 したがって、コーディングヌクレオチド配列（遺伝子、プラスミドＤＮＡ、ｃＤ ＮＡまたは合成ＤＮＡ）は、対応の塩基置換が、ＡｌｙＡＦＰの生物学的に機能 性の同等な形態についてコードするのを可能にさせる。 ここに熟慮され、生物学的に機能性の同等なペプチド、ポリペプチドおよびタ ンパク質は、基礎ＡｌｙＡＦＰアミノ酸配列内の配列または対応の部分に、約７ ０％またはそれより多くの配列類似性、好ましくは約８０％またはそれより多く の配列類似性、そして最も好ましくは約９０％またはそれより多くの配 列類似性を保有する。ＡｌｙＡＦＰの断片および変異体 本発明の抗菌ポリペプチドは、好ましくは配列番号：２に示されるアミノ酸配 列を包含する一方で、抗菌ポリペプチドのものと同じかまたは類似する抗菌活性 を保有するこの配列の断片および変異体も、本発明に包含される。ＡｌｙＡＦＰの断片 ＡｌｙＡＦＰの断片は、１つまたはそれ以上のアミノ酸がＮ末端、Ｃ末端、ペ プチドの中央、またはそれらの組合せから欠失される不完全な形態でありうる。 これらの断片は、ＡｌｙＡＦＰの天然に生じるかまたは合成の突然変異体であり 、ＡｌｙＡＦＰの抗菌活性を保持する。ＡｌｙＡＦＰの変異体 ＡｌｙＡＦＰの変異体は、１つまたはそれ以上のアミノ酸が、天然配列に挿入 された形態を包含する。これらの変異体は、ＡｌｙＡＦＰの天然に生じるかまた は合成の突然変異体であることもでき、ＡｌｙＡＦＰの抗菌活性を保持する。 前述の、すなわちアミノ酸欠失および付加の両方を含む抗菌ペプチドの形態の 組合せも、本発明に包含される。アミノ酸置 換も、同様にそこに存在しうる。 本発明により包含されるＡｌｙＡＦＰの断片および変異体は、配列番号：２： に示されるアミノ酸配列を有する天然に生じるＡｌｙＡＦＰの対応領域に対して 、好ましくは約７０％またはそれより多くの配列類似性、さらに好ましくは約８ ０％またはそれより多くの配列類似性、そして最も好ましくは約９０％またはそ れより多くの配列類似性を保有する。ＡｌｙＡＦＰに対して生じた抗体と反応するペプチド、ポリペプチドおよびタン パク質 生物学的に機能性の同等な形態のＡｌｙＡＦＰも、ＡｌｙＡＦＰに対して生じ た抗体と反応、すなわち特異的に結合するペプチド、ポリペプチドおよびタンパ ク質を包含し、そしてこのポリペプチドと同じかまたは類似する抗菌活性を示す 。このような抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体でありうる。ＡｌｙＡＦＰの生物学的に機能性の同等の他の形態 本発明に有用な生物学的に機能性の同等のその他の形態は、配列番号：２に示 されるアミノ酸配列を示すＡｌｙＡＦＰのものと比較して、同じ、類似またはそ れより大きい抗菌活性を示 す融合産物を形成する他のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質とともに 、このポリペプチドの接合体、または上記のそれらの生物学的に機能性の同等物 を包含する。このようなペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の例は、「発 明の要旨」で検討された。 実施例６ ＡｌｙＡＦＰをコードするｃＤＮＡ配列に生物学的に機能性の同等なヌクレオチ ド配列 本発明は、配列番号：１２に示されるｃＤＮＡ配列のみならず、生物学的に機 能性の同等なヌタレオチド配列をも包含する。語句「生物学的に機能性の同等な ヌクレオチド配列」は、ＡｌｙＡＦＰと同じかまたは類似する抗菌活性を示すペ プチド、ポリペプチドおよびタンパク質をコードする、ゲノムＤＮＡ、プラスミ ドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびｍＲＮＡヌクレオチド配列を含めたＤＮ ＡｓおよびＲＮＡｓを示す。すなわち、それらが発現されるために、機能的に監 視できる方法で宿主細胞に導入されるとき、それらが、そのような細胞に菌類病 原体に耐性を付与するのに十分なレベルで抗菌活性を示すペプチド、ポリペプチ ド、またはタンパク質を生成する。ＡｌｙＡＦＰでアミノ酸改変をコードするヌクレオチド配列 本発明の生物学的に機能性の同等なヌクレオチド配列は、基礎ＡｌｙＡＦＰア ミノ酸配列内の保存アミノ酸改変をコードし、そこにサイレント改変を生じるヌ クレオチド配列を包含する。このようなヌクレオチド配列は、野生型ＡｌｙＡＦ Ｐをコードするヌクレオチド配列と比較した対応の塩基置換を含む。塩基置換、付加または欠失を含むヌクレオチド配列 基礎ＡｌｙＡＦＰペプチド配列内の保存アミノ酸改変をコードするヌクレオチ ド配列に付加して、本発明の生物学的に機能性の同等なヌタレオチド配列は、他 の塩基置換、付加または欠失を含むヌクレオチド配列を包含する。これらは、配 列番号：１２のｃＤＮＡに含まれたものと同じ遺伝的遺伝子情報を有する核酸を 包含し、宿主細胞および植物に対して、ＡｌｙＡＦＰと同じかまたは類似の抗菌 耐性を付与するペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。この ようなヌクレオチド配列は、配列番号：１２に示されるｃＤＮＡの「遺伝的に同 等な修飾形態」であり、そして本明細書に記載される方法によって同定できる。 ＡｌｙＡＦＰをコードするｃＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ゲ ノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または他の核酸で作られる突然変異は、好ましくはコ ーディング配列の読取り枠を保存する。さらに、これらの突然変異は、好ましく はハイブリダイズして、ｍＲＮＡ翻訳に逆効果を及ぼすループまたはヘヤピンの ような二次ｍＲＮＡ構造を生成する可能性のある相補領域を作り出さない。 突然変異部位は、予め決定できるが、本質的に突然変異の特性を予め決定する 必要はない。例えば、所定の部位での突然変異体の最適な特徴について選択する ために、標的コドンで、ランダム突然変異誘発を行うことができる。 代わりに、突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって特 定の位置に、突然変異を導入し、天然のＡｌｙＡＦＰ ｃＤＮＡ配列の断片にラ イゲーションする能力のある制限部位によって隣接できる。ライゲーションに続 いて、生じた再構築ヌクレオチド配列は、所望のアミノ酸挿入、置換または欠失 を示すＡｌｙＡＦＰの誘導体形態をコードする。 いずれの場合にも、発現突然変異体は、例えば、実施例３で記載された方法に よって、所望の抗菌活性についてスクリーニングできる。 配列番号：１２のｃＤＮＡの有用な遺伝的に同等な修飾形態の特定の実施例と しては、配列番号：１２のｃＤＮＡに、高レベルの相同性、すなわち配列同一性 を示すヌクレオチド配列を示すＤＮＡｓが挙げられる。これは、約７０％または それより多くの配列同一性、さらに好ましくは約８０％またはそれより多くの配 列同一性、そして最も好ましくは約９０％またはそれより多くの配列同一性から 、配列番号：１２のｃＤＮＡまたはその対応部分までの範囲にありうる。 このような遺伝的に同等な修飾形態は、従来のＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ− ＲＮＡハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング： 実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐ ｒｅｓｓ、ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）、（１９８９年））を使用して、またはポリ メラーゼ連鎖反応(PＣＲ)法を使用した増幅によって十分に単離できる。これら の形態は、そのような病原体に通常は感受性のある植物細胞に従来の形質転換技 術術によって誘導されるときの菌類病原体に対 する耐性を付与する能力を保有する。ＡｌｙＡＦＰの断片および変異体をコードするヌクレオチド配列 実施例５で検討されたＡｌｙＡＦＰの断片および変異体は、ｃＤＮＡ、プラス ミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはｍＲＮＡによってコードすること ができる。これらの核酸は、ＡｌｙＡＦＰをコードする配列番号：1２に示され るヌクレオチド配列を示すｃＤＮＡの対応の領域または部分に、またはそれらに 対応するｍＲＮＡ対して、約７０％またはそれより大きい配列類似性、好ましく は約８０％またはそれより大きい配列類似性、そして最も好ましくは約９０％ま たはそれより大きい配列類似性を保有する。 本発明で、配列番号：１２に示される核酸ヌクレオチド配列を示すＡｌｙＡＦ ＰのｃＤＮＡに生物学的に機能性の同等な核酸としては： （１）部分的ヌクレオチド欠失、挿入、付加等のような天然または人工的な突然 変異のいずれかによって改変された長さを示し、したがって配列番号：１２の全 長を、１００％としたとき、生物学的に機能性の同等な配列は、配列番号：１２ の６０ −１２０％、好ましくはその８０−１１０％の長さを有するＤＮＡｓ、または （２）部分的な（通常全長の２０％またはそれより小さな、好ましくは１０％ま たはそれより小さな、さらに好ましくは５％またはそれより小さな）天然または 人工突然変異を含み、したがって、そのような配列は様々なアミノ酸をコードす るが、生じたポリペプチドは、ＡｌｙＡＦＰの抗菌活性を保持するヌクレオチド 配列、が挙げられる。この方法で作製された突然変異ＤＮＡｓは、通常、配列番 号：１２のヌクレオチド配列によってコードされたＡｌｙＡＦＰのアミノ酸配列 （配列番号：２）に対して、約７０％またはそれより大きい、好ましくは約８０ ％またはそれより大きい、そしてさらに好ましくは約９０％またはそれより大き い配列同一性を示すポリペプチドをコードする。 本発明では、人工的突然変異を作り出すために使用される方法は、特に限定さ れず、そのような突然変異は、当業者に公知のあらゆる方法によって製造するこ とができる。 例えば、ＡｌｙＡＦＰのｃＤＮＡまたは遺伝子は、適切なＤＮＡ断片を挿入ま たは欠失させるために適切な制限酵素で処理し、適切なアミノ酸読取り枠を保存 することができる。制限エ ンドヌクレアーゼ処理に続いて、消化ＤＮＡを処理して、あらゆるオーバーハン グを満たし、そしてＤＮＡを再ライゲートすることができる。 天然ＡｌｙＡＦＰｃＤＮＡまたはゲノム配列の断片をライゲーションすること ができる制限部位に隣接した突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成する ことによって、突然変異も特定の位置に導入できる。ライゲーションに続いて、 生じた再構築配列は、所望のアミノ酸挿入、置換または欠失を示す誘導体をコー ドする。 代わりに、オリゴヌタレオチドー部位特異的またはセグメント特異的突然変異 誘発手段は、所望される置換、欠失または挿入によって改変された特定コドンを 示す改変ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列を生成するのに使用できる。 上で記載された改変を作製する実施方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら、「分子生物学 における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．（１９９５年）；Ｂａｕｅｒら、Ｇｅｎｅ ３７：７３（１９８５年） ；Ｃｒａｉｋ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｉｅｓ３：１２− １９（１９８５年）；Ｆｒｉｔｓ Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ ｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０：６４８ ７−６４９７（１９８２年）；Ｓａ ｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、Ｃｏｌ ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、コールド・スプ リング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）、（１ ９８９年）；Ｓｍｉｔｈら、「遺伝子操作での：原理および方法（Ｉｎ Ｇｅｎ ｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈ ｏｄｓ）」、Ｓｅｔｏｗら編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１− ３２頁（１９８１年）；Ｏｓｕｎａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙにおける重要 な検討（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ）、２０：１０７−１１６（１９９ ４年）；およびＷａｌｄｅｒら、Ｇｅｎｅ４２：１３３（１９８６年）。これら の方法のいずれかによって製造されたここで開示されたｃＤＮＡ配列に対する生 物学的に機能性の同等な物は、コードされたペプチド、ポリペプチド、またはタ ンパク質をアッセイすることにより、そのために実施例３に記載され る技術を使用して、選択することができる。ＡｌｙＡＦＰに対して生じた抗体と反応するペプチド、ポリペプチド、およびタ ンパク質をコードするヌクレオチド配列 ＡｌｙＡＦＰをコードする生物学的に機能性の同等な形態のｃＤＮＡは、Ａｌ ｙＡＦＰに対して生じた抗体と反応、つまり特異的に結合し、そしてこのポリペ プチドと同じか、類似の抗菌抗体を示すペプチド、ポリペプチド、およびタンパ ク質をコードするヌクレオチド配列を包含する。このような抗体は、ポリクロー ナルまたはモノクローナル抗体でありうる。遺伝的に縮重したヌクレオチド配列 遺伝子コードの縮重、すなわちタンパク質に天然に生じるアミノ酸のほとんど は１つ以上のコドンが存在するために、本発明のｃＤＮＡと基本的に同じ遺伝子 情報を含み、そして配列番号：１２のヌクレオチド配列によってコードされたも のと実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ（およびＲＮＡ）配列は 、本発明を実行するのに使用できる。この原理は、ここで検討された他のヌクレ オチド配列のいずれとも同様に使用する。特定の宿主細胞で発現を増強するために設計された合成ＤＮＡ配列 本発明の生物学的に機能性の同等な形態のｃＤＮＡとしては、特定の宿主細胞 での発現を増強するために設計された合成ＤＮＡｓも挙げられる。宿主細胞は、 しばしば好ましいパターンのコドン使用を示す（Ｍｕｒｒａｙら、Ｎｕｃｌ．Ａ ｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８（１９８９年））。したがって、特定 の宿主での発現を増強するために設計された合成ＤＮＡｓは、宿主細胞でのコド ン使用のパターンに反映を及ぼす。 本発明で、配列の類似性または同一性は、配列分析ソフトウエアーパッケージ （Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ．Ｉｎｃ．、ＷＩ ５３７ １１、ＭａｄｉｓｏｎのＵｎｉＶｅｒＳｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ）の「ＢｅｓｔＦｉｔ」または「Ｇａ ｐ」プログラムを使用して測定できる。融合形態のＡｌｙＡＦＰをコードするヌクレオチド配列 本発明に有用な配列番号：１２の、他の生物学的に機能性のある同等な形態の ｃＤＮＡとしては、「発明の要約」で検討されたものおよび実施例５にあるもの のような、修飾して、他の ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質との複合体をコードし、そのによりこ れと融合産物をコードするものが挙げられる。ハイブリダイゼーションにより検出される生物学的に機能性のある同等な形態の ＡｌｙＡＦＰｃＤＮＡ ＡｌｙＡＦＰをコードするヌクレオチド配列の具体例は、配列番号：１２に示 されるが、本発明は、配列番号：１２の配列にハイブリダイズするヌクレオチド 配列、およびその相補的配列、およびＡｌｙＡＦＰのものと同じかまたは類似の 抗菌活性を示すペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質についての発現でコー ドするものをも包含すると解釈すべきである。このようなヌクレオチド配列は、 好ましくは、高緊縮性に促進する条件下で配列番号：１２またはその相補的配列 にハイブリダイズする（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニ ュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ ａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ 、ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）、（１９８９年）を参照の事）。実施条件としては、 ハイブリダイゼーションを可能にする十分な時間（例え ば、数時間から一晩）、５５℃で、６×ＳＳＣ、５×デンハート溶液、１００μ ｌ／ｍｌ新鮮精子ＤＮＡ、０．１％ＳＤＳ中での初期ハイブリダイゼーション、 続いて室温で、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、各々１５分間２回、そして５５ ℃で、０．５−１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、各々１５分間２回洗浄し、続い て自動ラジオグラフィーにかけることが挙げられる。一般的に、核酸分子は、５ ５℃で、好ましくは６０℃で、そしてより好ましくは６５℃で、ハイブリダイゼ ーション混合液を、少なくとも１回、０．１×ＳＳＣで洗浄したときにハイブリ ダイズする能力がある。 本発明は、上述のものに同等な塩および温度条件で、配列番号：１２のｃＤＮ Ａにハイブリダイズするヌクレオチド配列、そしてここに開示されたＡｌｙＡＦ Ｐのものと同じかまたは類似の抗菌活性を示すペプチド、ポリペプチドまたはタ ンパク質についての発現でコードするものをも包含する。 上で記述されたヌクレオチド配列は、それらが、約±２５％まで、またはそれ より少なくＡｌｙＡＦＰのものと異なる抗菌効果を示すペプチド、ポリペプチド またはタンパク質をコードする場合、ＡｌｙＡＦＰをコードする配列番号：１２ のものに 生物学的機能性の実質的に同等なものを保有すると見なされる。ゲノムプローブおよびＰＣＲプライマー ゲノムプローブ もう一つの態様で、本発明は、ＡｌｙＡＦＰのものと同じかまたは類似する抗 菌活性を示すペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質をコードするＤＮＡ配列 に関してゲノムおよび他の核酸ライブラリーをスクリーニングするのに有用なオ リゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーションプローブを提供し、そのプローブは 、ここに供された配列に基づいて設計することができる。このようなプローブは 、長さ約１６から約２８ヌクレオチド、一般に長さ約１６ヌクレオチド、さらに 典型的には長さ約２０ヌクレオチド、好ましくは長さ約２４ヌクレオチド、そし てさらに好ましくは長さ約２８ヌクレオチドの範囲でありうる。好ましくは、こ れらのプローブは、ＡｌｙＡＦＰのものと同じかまたは類似の抗菌活性を示すペ プチド、ポリペプチドおよびタンパク質をコードするゲノムＤＮＡまたは他のＤ ＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする。このようなオリゴヌクレオチドプロー ブは、自動合成によって合成でき、そして放射性ヌクレオチド、例えば³²Ｐまた はビオチンのようなレポーター分子で ５’末端に首尾よく標識できる。ライブラリーは、使用されるベクターによって 、コロニーまたはファージとして培養し、そして組換えＤＮＡを、ナイロンまた はニトロセルロース膜に移すことかできる。ＤＮＡの変性、中和および膜への固 定に続いて、その膜を標識プローブとハイブリダイズする。これに続いて、膜を 洗浄し、そしてレポーター分子を検出する。その後、ハイブリダイジングＤＮＡ を含むコロニーまたはファージを単離し、増殖させる。候補クローンまたはＰＣ Ｒ増幅断片は、ＡｌｙＡＦＰをコードするＤＮＡ、または多様な手段により、Ａ ｌｙＡＦＰのものと同じかまたは類似する抗菌活性を示す関連ペプチド、ポリペ プチドまたはタンパク質を比較することによって確認できる。例えば、候補クロ ーンは、第二の非重なりプローブとハイブリダイズするか、またはＤＮＡ配列分 析にかけることができる。それにより、コードされたペプチド、ポリペプチドま たはタンパク質の抗菌活性は、クローニングにより評価し、そして酵母、または 大腸菌のような適切な宿主中でＤＮＡの発現をさせ、続いてペプチド、ポリペプ チドまたはタンパク質を単離し、そして上で実施例３に記述された方法によって それの抗菌活性のアッセイを行うことができる。このような手 段により、不都合な菌類を制御し、そして菌の病原体から植物を保護するのに有 用であるＡｌｙＡＦＰをコードする植物核酸、またはそれに生物学的に機能性の 同等なペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を単離できる。ＰＣＲプライマー 生物学的に機能性の同等なゲノムＤＮＡｓおよびｃＤＮＡは、ＡｌｙＡＦＰの アミノ酸配列（配列番号：２）に基づいて縮重オリゴヌクレオチドプライマーを 使用して、高等植物を含めた生物から単離できる（Ｔ．Ｃｏｍｐｔｏｎ、Ｉｎｎ ｉｓら編、「ＰＣＲプロトコール、方法および使用の指針（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏ ｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔ ｉｏｎｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、３９−４ ５頁（１９９０年））。このような縮重オリゴヌクレオチドプライマーは、生物 学的に機能性に同等なｃＤＮＡ（Ｅ．Ｓ．Ｋａｗａｓａｋｉ、Ｉｎｎｉｓら編、 「ＰＣＲプロトコール、方法および使用の指針（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ） 」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、２１− ２７頁（１９９０年））を増幅する逆転写酵素を使用したＰＣＲ技術に関連して 使用できた。その後、これらのｃＤＮＡｓは、適切な形質転換／発現ベクター中 で簡便にクローニングし、そして単子葉植物と双子葉植物に導入することができ 、そしてこれらのベクターでＤＮＡを発現する形質転換植物は、以下検討される とおり確立された手段を使用して単離できる。 縮重オリゴヌクレオチドは、ゲノムライブラリーに直接使用でき、そして単離 コーディング配列は、作物植物のための形質転換／発現ベクターに移すことがで きる。 代わりに、縮重オリゴヌクレオチドは、プローブとして使用して、例えば、λ ＺａｐＩＩ（ＣＡ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ）のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）のようなλフ ァージベクター中で植物からのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすること ができる。この手段で単離されたｃＤＮＡは、以下に記載されるとおり単子葉植 物または双子葉植物に導入するのに適切な形質転換／発現ベクターに移行させる ことができる。 実施例６ トランスジェニック植物でのＡｌｙＡＦＰの発現のためのＤＮＡ構築物 上で示したとおり、本発明は、高等植物および様々な微生物で、ここで検討さ れたＤＮＡ配列の発現を促進するＤＮＡ構築物または発現ベクターを提供する。 ここに使用されるとき、語句「ベクター構築物」または「発現ベクター」は、目 的の全ての付加の配列または遺伝子と同様に、ここに検討したＤＮＡ配列の発現 を指示する機能的手段に操作可能に連結されたＤＮＡ断片のアセンブリーに該当 する。 二本鎖ＤＮＡ形態を示す植物構造のコーディング配列（遺伝子、ｃＤＮＡ、合 成ＤＮＡまたは他のＤＮＡ）の発現は、ＲＮＡポリメラーゼ酵素によって、一本 鎖のＤＮＡからメッセンジャ−ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を転写すること、および続い て核酸の内側でｍＲＮＡプライマー転写を行うことを包含する。この工程は、ｍ ＲＮＡの３’末端にポリアデニル化ヌクレオチドを付加する３’非翻訳領域を包 含する。 ＤＮＡをｍＲＮＡに転写することは、「プロモーター」と言われるＤＮＡの領 域によって行われる。プロモーター領域は、ＤＮＡと連結するＲＮＡポリメラー ゼを信号化する塩基の配列、およびテンプレートとしてＤＮＡ鎖の１つを使用し て、ｍＲＮＡを初期転写して、対応のＲＮＡの鎖を作ることを含む。 したがって、本発明に有用なベクターは、目的のコーディング配列に操作可能 に連結したプロモーター要素を包含し、そして５’非翻訳リーダー配列、３’非 翻訳領域、および１つまたはそれより多い選択マーカーも包含できる。このよう なマーカーの多様性は、当業界でよく知られている。プロモーター 植物細胞中でＡｌｙＡＦＰをコードするＤＮＡの発現は、自然に生じる相同な プロモーターまたは多様な異種プロモーターの制御下に置くことができる。植物 細胞で活性な多数のプロモーターは、文献に記載されている。これらには、例え ばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（アグロバクテリウム ・ツメファセイエンス）の腫瘍誘導プラスミドで行われるノパリンシンターゼ（ ｎｏｓ）、マンノピンシンターゼ（ｍａｓ）、およびオクトピンシンターゼ（ｏ ｃｓ）プロモーター；カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）および３５Ｓ プロモーター；増強ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター；コマノハグサモザイクウイル ス（ＦＭＶ）３５Ｓプロモーター；リブロース−１，５−ビスホスフェートカル ボキシラーゼ（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）の小さなサブユニットから得た光誘導プロ モーター、タ バコから得たＥＩＦ−４Ａプロモーター（Ｍａｎｄｅｌら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ ．Ｂｉｏｌ．２９：９９５−１００４（１９９５年））；Ａｒｂｉｄｏｐｓｉｓ （アルビドプシス）から得たキチナーゼプロモーター（Ｓａｍａｃら、Ｐｌａｎ ｔ Ｃｅｌｌ ３：１０６３−１０７２（１９９１年））；ブロッコリーから得 たＬＴＰ（脂質移行タンパク質（Ｌｉｐｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐｒｏｔｅｉ ｎ））プロモーター（Ｐｙｅｅら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．７：４９−５９、（１９９ ５年））；トウモロコシの実から得たユビキチンプロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｅ ｎｓｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９（１９９２ 年））；およびコメから得たアクチンプロモーター(ＭｃＥｌｒｏｙら、Ｐｌａ ｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１６３−１７１（１９９０年）)が挙げられる。これらの プロモーターの全ては、植物中で発現されたＤＮＡ構築物を創造するのに使用さ れた。例えば、この点について、ＰＣＴ出願第ＷＯ８４／０２９１３号参照。 本発明の二本鎖ＤＮＡ構築物に有用なプロモーターは、菌類感染に関してコー ディング配列の特異的発現を付与するそれらの能力に基づいて選択できる。菌類 病原体による植物の感染は、 防御関連または病原関連（ＰＲ）タンパク質（Ｂｏｗｌｅｓ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：８７３−９０７（１９９０年）；Ｂｏｌら、Ａｎｎ．Ｒ ｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．２８：１１３−１３８（１９９０年）；Ｌｉｎ ｔｈｏｒｓｔ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１０：１２３−１５０ （１９９１年））と称される広範な列のタンパク質の導入を引き起こす。このよ うな防御関連またはＰＲ遺伝子は、フェニルプロパノイド代謝に含まれる酵素（ 例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、カルコンシンターゼ）、植物細 胞壁を修飾するタンパク質（例えば、ヒドロキシプロリン富糖タンパク質、グリ シン富タンパク質、ペルオキシダーゼ）、菌類細胞壁を分解する酵素（例えば、 キチナーゼ、グルカナーゼ）、タウマチン様タンパク質、またはいまだに機能が 知られていないタンパク質をコードする。防御関連またはＰＲ遺伝子は、単離さ れ、そして多数の植物種から特徴づけをされた。これらの遺伝子のプロモーター は、菌類病原体で攻撃したトランスジェニック植物中で、ＡｌｙＡＦＰおよびそ の生物学的に機能性の同等なもの発現を誘導するのに使用できる。例えば、この ようなプロモーターは、トマト植物から単離された防御関連または ＰＲ遺伝子から誘導された（Ｆｒｉｔｚｅｍｅｉｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ ｉｏｌ．８５：３４−４１（１９８７年））；Ｃｕｙｐｅｒｓら、Ｍｏｌ．Ｐｌ ａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．１：１５７−１６０（１９８８年 ）；Ｌｏｇｅｍａｎｎら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：１５１−１５８（１９８ ９年）；Ｍａｔｔｏｎら、Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａ ｃｔ．２：３２５−３３１(１９８９年)；Ｓｃｈｒｏｄｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｊ ．２：１６１−１７２（１９９２年）。代わりに、タバコから得られるＰＲＰ１ プロモーターのような病原体誘導性プロモーターが使用できる（Ｍａｒｔｉｎｉ ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６３：１７９（１９９３年））。 本発明の二本鎖ＤＮＡ構築物に有用なプロモーターは、ＡｌｙＡＦＰタンパク 質が、植物の開花部分でのように最も効果的である組織中で特異的な発現を供す る能力に基づいて選択することもできる（Ｗｅｉｇｅｌ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇ ｅｎｅｔｉｃｓ２９：１９−３９（１９９５年））。 どのような場合でも、トランスジェニック植物中でＡｌｙＡＦＰの発現を誘導 するのに選択される特定のプロモーターは、 このポリペプチドコーディング配列の十分な発現を起こして、植物組織に、抗菌 有効量のＡｌｙＡＦＰを産生する能力がある。そのような発現を誘導する能力の ある構築プロモーターの例は、ｅ３５Ｓ、ＦＭＶ３５Ｓ、米アクチン、トウモロ コシの実のユビキチン、およびｅＴＦ−４Ａプロモーターである。 本発明のＤＮＡ構築物に使用されるプロモーターは、所望により修飾して、そ れらの制御特徴に影響を及ぼすことができる。例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモー ターは、光の不在下でｓｓＲＵＢＩＳＣＯの発現を抑制するｓｓＲＵＢＩＳＣＯ 遺伝子の一部にライゲートでき、それによって葉で活性であるか根で活性でない プロモーターを作ることができる。本発明の目的のため、語句「ＣａＭＶ３５Ｓ 」プロモーターは、多様なＣａＭＶ３５ｓプロモーター、例えばオペレーター領 域、ランダムまたは制御突然変異誘発等を用いたライゲーションの手段によって 誘導されるプロモーターを包含する。さらに、本発明に有用なプロモーターは、 遺伝子発生のレベルを評価する上で助けとなる多数のエンハンサー配列を含むよ うに改変することができる。このようなエンハンサー配列の例は、Ｋａｙら（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ２３６：１２９９（１９８７年））により報告された。５’非翻訳リーダー配列 本発明のＤＮＡ構築物によって生成されるＲＮＡは、５’非翻訳リーダー配列 をも含むことが好ましい。この配列は、遺伝子を発現する選択されたプロモータ ーから誘導することができ、そしてｍＲＮＡの翻訳を増すために特異的に修飾で きる。５’非翻訳領域は、適切な真核生物の遺伝子からまたは合成遺伝子配列か ら得たウイルスＲＮＡｓから得ることもできる。しかし、本発明は、５’非翻訳 領域が、プロモーター配列を伴う５’非翻訳配列から誘導される構築物に限定さ れない。むしろ、非翻訳リーダー配列は、無関係のプロモーターまたはコーディ ング配列から誘導されうる。例えば、ペチュニアのヒートショックタンパク質７ ０（Ｈｓｐ７０）は、このようなリーダーを含有する（Ｗｉｎｔｅｒ、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２１：３１５−３１９（１９８８年））。３’非翻訳領域 上で記載のとおり、本発明のキメラ構築物の３’非翻訳領域は、転写ターミネ ーター、または同等の機能を示す要素、および植物中で機能して、ｍＲＮＡの３ ’末端にアデニル化ヌクレオチドを付加させるポリアデニルシグナルを含有する 。このよ うな３’領域の例としては、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子のようなＡｇ ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（アグロバクテリウム）腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺 伝子のポリアデニル化シグナルを含む３’翻訳、非翻訳領域、および大豆の７ｓ 保存タンパク質遺伝子およびエンドウのｓｓＲＵＢＩＳＣＯ Ｅ９遺伝子のよう な植物遺伝子が挙げられる（Ｆｉｓｃｈｏｆｆら、欧州特許出願第０３８５９６ ２号）。 全ての前述の要素は、組合わさって、組換え二本鎖ＤＮＡ分子を提供し、それ により５’から３’方向に操作的に連結された： ａ）植物細胞内で機能して、ＲＮＡ配列の生成を起こすプロモーター、 ｂ）ＡｌｙＡＦＰをコードするＤＮＡコーディング配列、および ｃ）植物細胞内で機能して、該ＲＮＡ配列の転写終止および３’末端にポリアデ ニル化ヌクレオチドの付加を起こす３’非翻訳領域 を包含する。 ＡｌｙＡＦＰＤＮＡコーディング配列は、配列番号：１２に 示される全ヌクレオチド配列を包含できるか、または配列番号：１２のヌクレオ チド１１６から２６９を包含できる。前、者の場合には、ＡｌｙＡＦＰは、細胞 外空間に移送され、後者の場合には、植物の細胞内に蓄積する。いずれの場合に も、ＡｌｙＡＦＰは、菌損傷を制御する上で有効である。 実施例７ ＡｌｙＡＦＰを発現するトランスジェニック・ジャガイモ植物の生成およびＶｅ ｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ（ベルチシリウム）立ち枯れ病の制御についての疾病試験 の結果 ここに記載された研究は、植物に、菌類の病原体に対する耐性を付与すること ができるｃＤＮＡｓおよび他の核酸を同定した。農業、園芸、鑑賞および他の経 済的または商業的に有用な植物は、機能的に操作可能な手段でそこに、これらの ＤＮＡｓを導入して、それによりそれらが、これらの植物に、菌類の病原体に対 して耐性を付与するのに有効なレベルで発現されることによって、菌類の病原体 に対して耐性にすることができる。 抗菌有効量のＡｌｙＡＦＰおよびそれらの生物学的に機能性の同等なものを発 現するトランスジェニック植物は： （ａ）５’から３’方向に配列に操作的に連結される （ｉ）植物における遺伝子の転写を指示するプロモーター領域、 （ｉｉ）ＡｌｙＡＦＰをコードするＲＮＡ配列をコードするＤＮＡコーディング 配列またはＡｌｙＡＦＰのものと同じかまたは類似の抗菌活性を示すそれらの生 物学的に機能性の同等なもの、および （ｉｉｉ）植物細胞内で機能して、該ＲＮＡ配列の転写終止および３’末端にポ リアデニル化ヌクレオチドの付加を起こすポリアデニル化シグナルをコードする ３’非翻訳領域 を包含する組換えＤＮＡ分子で植物細胞を形質転換させ、 （ｂ）形質転換された植物細胞を選択し、 （ｃ）形質転換された植物細胞を再生して、分化植物を生成し、そして （ｄ）形質転換植物を選択し、その細胞が該ＤＮＡコーディング配列を発現し、 そして抗菌有効量のＡｌｙＡＦＰまたはそれの該生物学的に機能性の同等なもの を生成すること によって製造できる。 ＡｌｙＡＦＰが最初に単離されたＡｌｙｓｓｕｍ（アリスム）は、双子葉植物 である。Ｃａｍｂｅｌｌら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１−１１（１ ９９０年）によって検討さ れるとおり、コドン使用パターンでの明らかな差異が、単子葉植物および双子葉 植物の間に存在する一方で、単子葉植物は、双子葉植物で発見されるものに似て いる遺伝子を発現することが知られている。この観察に基づいて、双子葉植物の 遺伝子でのコドン使用が、単子葉植物での双子葉遺伝子の発現に対する大きな障 壁は存在しないことは明らかである。あらゆる場合に、当業者は、適切な宿主植 物にコドン使用を適合させることを統轄する原理に慣れていて（Ｍｕｒｒａｙら 、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８（１９８９年）参照） 、ＤＮＡ構築物の発現は、当業界では現在通常のことである。 トランスジェニック単子葉植物および双子葉植物を製造することを報告する文 献の要旨は、以下のとおりである。単子葉植物形質転換 単子葉植物の中でトランスジェニック植物を製造する方法は、現在入手可能で ある。成功した形質転換および植物再生は、アスパラガス(Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ（アスパラガス・オフィシナリス）；Ｂｙｔｅｂｉｅ ｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：５３４５（１９８ ７年）)；オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｕｕｌｇａ ｒｅ（ホルデウム・ウルガレ）；ＷａｎおよびＬｅｍａｕｘ、Ｐｌａｎｔ Ｐｈ ｙｓｉｏｌ．１０４：３７（１９９４年）；トオモロコシの実（Ｚｅａ ｍａｙ ｓ（ゼア・メイズ）；Ｒｈｏｄｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：２０４（１９ ８８年）；Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：６０３（１ ９９０年）；Ｆｒｏｍｍら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：８３３（１９９ ０年）；Ｋｏｚｉｅｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１：１９４（１９９ ３年））；エンバク（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ（アベナ・サチバ）；Ｓｏｍｅ ｒｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１５８９（１９９２年））；カモ ガヤ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ ｇｌｏｍｅｒａｔａ（ダクチィリス・グロメラタ）； Ｈｏｒｎら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．７：４６９（１９８８年））；コ メ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（オリザ・サチバ）、インディカおよびジャポニ カ変種を含めて；Ｔｏｒｉｙａｍａら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１ ０（１９８８年）；Ｚｈａｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．７：３７９ （１９８８年）；ＬｕｏおよびＷｕ、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ． ６：１６５（１９８８年）；ＺｈａｎｇおよびＷｕ、Ｔｈｅｏ ｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７６：８３５（１９８８年）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら 、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９５７（１９９１年））；ライムギ（Ｓ ｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ（セカレ・セラレ）；Ｄｅ ｌａ Ｐｅｎａら、Ｎ ａｔｕｒｅ ３２５：２７４（１９８７年））；モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂ ｉｃｏｌｏｒ（ソルガム・ビコラー）；Ｃａｓｓａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１２１２（１９９３年））；サトウキビ（ Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．（サッカラム・エスピーピー．）；Ｂｏｗｅｒお よびＢｉｒｃｈ、Ｐｌａｎｔ Ｊ．２：４０９（１９９２年））；トールフェス キュ（Ｆｅｓｔｕｃａ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ（フェスツカ・アルンジナセア ）；Ｗａｎｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：６９１(１９９２年)） ；ツルーフグラス（芝）（Ａｇｒｏｓｔｉｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（アグロスチ ス・パルストリス）；Ｚｈｏｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１３：１ （１９９３年））；コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（トリチカム ・アエスチバム）；Ｖａｓｉｌら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：６６ ７（１９９２年）；Ｔｒｏｙ Ｗｅｅｋｓら、Ｐｌａ ｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１０７７（１９９３年）；Ｂｅｃｋｅｒら、Ｐ ｌａｎｔ Ｊ．５：２９９（１９９４年））で達成された ＡｌｙＡＦＰをコードするＤＮＡまたはここで検討されるそれらの生物学的に 機能性の同等なものは、抗菌有効な量のＡｌｙＡＦＰを発現するトランスジェニ ック植物を生成するこれらの植物のいずれかに導入することができる。双子葉植物形質転換 広範に多様な様々の双子葉植物を形質転換させ、そしてトランスジェニック植 物を得る方法は、文献によく記載されている（ＧａｓｓｅｒおよびＦｒａｌｅｙ ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２９３（１９８９年）；ＦｉｓｋおよびＤａｎ ｄｅｋａｒ、Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ ５５：５−３６ （１９９３年）；Ｃｈｒ−ｉｓｔｏｕ、Ａｇｒｏ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｈｉ Ｔｅｃｈ（１９９４年３月／４月）１７頁（１９９４年）を参照し、そ してここに引用され）。 ＡｌｙＡＦＰをコードするＤＮＡｓまたはここに検討されたそれらの生物学的 に機能性の同等なものは、抗菌有効量のＡｌｙＡＦＰを発現するトランスジェニ ック植物を生成するために それらの植物のいずれかに導入できる。 限定されない実施例として、ＡｌｙＡＦＰをコードするｃＤＮＡは、ジャガイ モ植物で発現され、以下に詳細に記載されるように、それによりそれに抗菌耐性 を付与する。ジャガイモ形質転換のためのプラスミド ＡｌｙＡＦＰをコードする２９０ｂｐＢａｍＨ１／ＥｃｏＲＩ断片を、プラス ミドｐＭＯＮ２２６５２（図４）から先に構築されたＥ．ｃｏｌｉカセットベク ターｐＭＯＮ２２５７５（図５）にクローニングし、そこでｐ４６遺伝子を置換 した。ｐＭＯＮ２２６５５と示される生じたプラスミド（図６）を、ＮＯｔＩで 切断して、ポリペプチド−コードｃＤＮＡを含むＮｏｔＩ断片を単離した。この ＮｏｔＩ断片は、続いて二重周縁の植物の形質転換ベクターであるｐＭＯＮ１７ ２２７のＮｏｔＩ部位に挿入した（図７）。生じたプラスミドは、ｐＭＯＮ２２ ６５７と示され（図８）、そして以下のとおりＤＮＡ断片を含む：Ｔ−ＤＮＡの 右縁で行った細菌のスペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性遺伝子（Ｓｐ ｃ／Ｓｔｒ）（Ｆｌｉｎｇら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：７０９５ −７１０６（１９８５年））。右縁に隣接するのは、ＦＭＶプロ モーターによって誘導される合成の細菌グリホセート耐性ＣＰ４５−エノピルビ ル−３−ホスホシキメートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子である（ＰＣＴ国際 公開第ＷＯ９２／０４４４９号参照）。ＣＰ４遺伝子は、形質転換体に対するグ リホセート耐性を、そしてそれにより、形質転換体を選択するための手段として グリホセートを使用する能力を付与する。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（アラビトプ シス）５−エノピルビル−３−ホスホシキメートシンターゼ遺伝子（ＥＰＳＰＳ ）から得た葉緑体遷移ペプチドを、葉緑体に対するＣＰ４−ＥＰＳＰＳタンパク 質を標的とするＣＰ４遺伝子と融合させた。ＣＰ４遺伝子の３’末端には、転写 終止部位およびポリアデニル化シグナル配列を提供するＥ９３’末端がある。次 のキメラセグメントは、ＦＭＶプロモーター、抗菌ポリペプチドｃＤＮＡおよび ｎｏｓ３’末端を構成する。これは、Ｔ−ＤＮＡの左の縁、および複製の起点（ ｏｒｉ−３２２）に続く（Ｓｔａｌｋｅｒら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１ ８１：８−１２（１９８１年））。 ＡｌｙＡＦＰのｉｎ ｐｌａｎｔａ抗菌活性を、Ｒｓ−ＡＦＰ１およびＲｓ− ＡＦＰ２のものと比較する目的のために、Ｒｓ−ＡＦＰ１およびＲｓ−ＡＦＰ２ 合成ＤＮＡｓも、トマト植 物に形質転換した。Ｒｓ−ＡＦＰ１およびＲｓ−ＡＦＰ２合成ＤＮＡｓは、Ｍｉ ｄｌａｎｄ認証（テキサス州、ミッドランド（Ｍｉｄｌａｎｄ）ＴＸ））によっ て、２７３ｂｐＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ断片（それぞれ、配列番号：１６および 配列番号：１７）として化学的に合成され、そして先に構築されたＥ．ｃｏｌｉ （イー．コリ）カセットベクターｐＭＯＮ２２５７５に、第一にクローニングし （図５）、そこでｐ４６遺伝子を置換した。Ｒｓ−ＡＦＰ１およびＲｓ−ＡＦＰ ２ＤＮＡｓを含有するＮｏｔＩ断片を、ＡｌｙＡＦＰのｃＤＮＡをクローニング するのに使用された同じ手段によって、植物形質転換ベクターｐＭＯＮ１７２２ ７に独立にクローニングした（図７）。生じたプラスミドは、ｐＭＯＮ２２６３ ４（Ｒｓ−ＡＦＰＩ）（図９）およびｐＭＯＮ２２６３５（Ｒｓ−ＡＦＰ２）（ 図１０）と示された。三親交配手段 ｐＭＯＮ２２６５７、ｐＭＯＮ２２６３４またはｐＭＯＮ２２６３５を、それ ぞれ、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を潜伏するＥ．ｃｏｌｉ（イー．コリ ）を用いた三親交配手段によってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（アグロバクテリ ウム）Ａ ＢＩと交配させた（Ｄｉｔｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ ＳＡ ７７：７３４７（１９８０年））。ＡＢＩは、無力化ｐＴｉＣ５８プラス ミドｐＭＰ９０ＲＫを担持するＡ２０８ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ ｅｆａｃｉｅｎｓ（アグロバクテリウム・ツメファシエンス）株である（Ｋｏｎ ｃｚら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０４：３８３−３９６（１９８６年） ）。無力化Ｔｉプラスミドは、ＡＢＩ株に複合した後、ｐＭＯＮベクターの自律 複製について要求されるｔｒｆＡ遺伝子機能を提供する。植物組織は、ＡＢＩ： ：ｐＭＯＮ複合体とインキュベートしたとき、無力化ｐＭＰ９０ＲＫ Ｔｉプラ スミドにコードされたｖｉｒ画分によってベクターを植物細胞に移す。 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（アグロバクテリウム）を、３０時間、３０℃で 、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび５０ｍｇ／ｍｌカナマイシンを含 むＬＢ培養基（１リットル当たり１０ｇトリプシン、５ｇ酵母抽出物、および５ ｇＮａＣｌ）で育成した。ｐＲＫ２０１３を含むＥ．ｃｏｌｉ（イー．コリ）を 、50μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培養基中で、一晩育成した。ｐＭＯＮ２ ２６５７、ｐＭＯＮ２２６３４およ びｐＭＯＮ２２６３５を潜伏するＥ．ｃｏｌｉ（イー．コリ）を、７５μｇ／ｍ ｌスペクチノマイシンを含むＬＢ培養基中で育成した。培養基のすべてを育成し た後、４ｍｌのＬＢ培養基を、１００μｌのおのおののＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ（アグロバクテリウム）ＡＢＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ（イー．コリ）／ｐＲＫ２０ １３およびＥ．ｃｏｌｉ（イー．コリ）／ｐＭＯＮを含む試験管に加えた。この 混合液を、１分間冷蔵して遠心分離し、そして上清画分を分液した。ペレット画 分を、残りの液体（およそ１００μｌ）に懸濁し、そしてアリコート量（およそ ２５μ１）を、ＬＢ寒天（１．５％）プレートの中央にピペットで移した。一晩 ３０℃で育成後、このプレートから得たアリコート量の細胞を、７５μｇ／ｍｌ スペクチノマイシン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌクロラ ムフェニコールで補足したＬＢ寒天プレート上に縞状にのせた。 ３０℃で２４−４８時間後、コロニーを、ｐＭＯＮプラスミドを含むＥ．ｃｏ ｌｉ（イー．コリ）、ｐＲＫ２０１３を含むＥ．ｃｏｌｉ（イー．コリ）、およ びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（アグロバクテリウム）ＡＢＩの三親交配から得 られた細胞で縞状に載せたプレート上に現れた一方で、ｐＭＯＮ含有Ｅ． ｃｏｌｉ（イー．コリ）およびＡＢＩ（ｐＲＫ２０１３を含むＥ．ｃｏｌｉ（イ ー．コリ）なし、そしてプラスミド可動化が必要とされる）の交配から得られた 細胞で縞状に載せた対照プレート上に現れたコロニーはなかった。三親交配後、 ４つのコロニーを、前者のプレートから選択し、そして各々を別々に、７５μｇ ／ｍｌスペクチノマイシン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌ クロラムフェニコールで補足したＬＢの液体培養基に接種し、そして３０℃で育 成した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（アグロバクテリウム）細胞から単離され たプラスミドＤＮＡの制限分析によって、様々な抗菌ポリペプチドをコードする ＤＮＡの存在を確認した。ＡｌｙＡＦＰ、Ｒｓ−ＡＦＰｌおよびＲｓ−ＡＦＰ２ をそれぞれコードするＤＮＡｓを含有する培養基を、個々にジャガイモ植物の形 質転換に使用した。ジャガイモ植物の形質転換 ｐＭＯＮ２２６５７、ｐＭＯＮ２２６３４およびｐＭＯＮ２２６３５を含むＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（アグロバクテリウム）を、それぞれ、７５μｇ／ｍ ｌスペクチノマイシン、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび５０μｇ／ ｍｌカナ マイシンを含む２ｍｌのＬＢ培養基（ｐＨ７．０）中で一晩育成させた。次の日 に、１リットル容積中、４．４ｇＭＳ塩（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ ．、ミズーリー州（ＭＯ）、セント・ルイス（ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ））、３０ｇし ょ糖、および２ｍｌビタミンＢ５（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｇ１０１９）を含有 するＭＳＯ培養基（ｐＨ５．７）で、細菌を１：１０に、または６００ｎｍで、 ０．２−０．３３の光学密度が読み取られるまで希釈した。 １９℃の温度、１６時間明所／８時間暗所のサイクル、および１００μＥ／秒 ／ｍ²の光度を含めた無菌条件下で、１リットル当たり４．４ｇＭＳ塩(Ｓｉｇｍ ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ミズーリー州（ＭＯ）、セント・ルイス（ｓｔ ．Ｌｏｕｉｓ）)、３０ｇしょ糖、０．１７ｇＮａＨ₂ＰＯ₄．Ｈ₂Ｏ、０．４ｍｇ チアミン−ＨＣｌ、２５ｇアスコルビン酸、および０．１ｇイノシトールを含む ＰＭ培養基（ｐＨ６．０）および０．２％ゲルライト寒天で３週間、節を含む挿 木から育成したジャガイモ植物（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ｖａｒ ．Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ（ソラヌム・ツベルスム変種ルセット・バーバ ンク））の茎から葉を取った。茎を３−５ ｍｍセグメントに切った。 接種前に、３０の茎セグメントを、接種していない対照として役割を果たす同 時培養プレートに載せた。同時培養プレートは、０．９％寒天固化１／１０ＭＳ 塩（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１５：４７３（１９ ６２年）および３％しょ糖を含み、そして供給層（Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：４８０３（１９８３年））として ２ｍｌの６−７日齢タバコ懸濁細胞で寒天を第一コーディングし、そしてその後 これらの細胞を、滅菌ワットマン濾紙の８．５ｃｍディスクと重ねることによっ て作製した。 形質転換されるべき移植セグメントは、希釈細菌懸濁液を茎断片に注ぎ、そし て１５分間混合液をインキュベートさせることによって接種した。その後、細菌 懸濁液を吸引して、移植セグメントを取り、それを続いて、共培養プレート上に 均等に散布した（１プレート当たり約９０茎片）。１９℃で、１６時間明所／８ 時間暗所サイクル下で、１００μＥ／秒／ｍ²の光度で、同時培養期間２日後、 移植片を、１×ＭＳ塩、５．０ｍｇ／１ゼアチンリボサイド、１０ｍｇ／１ Ａ ｇＮＯ₃、３％し ょ糖、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン、および０．１ｍｇ／ｌナフタレン酢酸を 含有する０．９％寒天固化カルス誘導培養基に載せ、そして１６時間明所／８時 間暗所サイクルで２日間、１９℃でインキュベートした。続いて、選択のために 、０．０２５ｍＭグリフォセートで補足したカルス誘導培養基に移植片を移した 。４週間後、１×ＭＳ塩、５．０ｍｇ／ｌゼアチンリボサイド、１０ｍｇ／ｌＡ ｇＮＯ₃、３％しょ糖、５００ｍｇ／１カルベニシリン、０．３ｍｇ／ｌＧＡ３ および０．０２５ｍＭグリホスセートを含有する０．９％寒天固化茎頂誘導培養 基上に移植片を載せた。茎頂は、８週目に現れ始めた。移植片を、１２週間の期 間かけて４週毎に新鮮茎頂誘導培養基に移した。茎頂をカルスから切開し、そし て約２週間、またはそれらが、根を発生し、そして土壌に配置するのに十分大き くなるまで、０．２％ゲルライト寒天で固化されたＰＭ培養基上に載せた。いっ たん、Ｍｅｔｒｏ−Ｍｉｘ３５０（Ｈｕｍｍｅｒｔ Ｓｅｅｄ Ｃｏ．セントル イス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ））に移植すると、播種を、温室で、１４時間明所／８ 時間暗所養生法の下、６００−７００μＥ／秒／ｍ²の光度、６５−７５°Ｆの 日中温度、５５−６５°Ｆの夜間温度で、そして６０％の相対湿度で、 ２−３ヶ月間育成した。トランスジェニック・ジャガイモ植物での抗菌ポリペプチド発現の分析 葉サンプル（２０から１００ｍｇ）を、１から２インチの高さに成長したトラ ンスジェニック植物から取った。葉サンプルを、１ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、１０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ（ｐＨ７．４）、 および０．０５％ツイーン−２０を含むＰＢＳＴ緩衝液（１５μｌ／ｍｇ組織） に接地させ、そして４℃で一晩おいた。遠心分離後、１００μｌの上清をＥＬＩ ＳＡアッセイに使用した。Ｒｓ−ＡＦＰ１ポリペプチドに対するポリクローナル 抗体（配列番号：１８）を、Ｐｏｃｏｎｏ Ｒａｂｂｉｔ Ｆａｒｍ（ペンシル バニア州、ポコノ（Ｐｏｃｏｎｏ，ＰＡ））によって調製した。１リットル蒸留 水当たり１．５９ｇ Ｎａ₂ＣＯ₃および２．９３ｇＮａＨＣＯ₃を含むコーティ ング緩衝液（ｐＨ９．６）を１：２００に希釈した１００μｌの抗体（１ｍｇ ＩｇＧ／ｍｌ）を加えることによって、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉ−ｓｏｒｐ９６穴プ レート（Ｎｕｎｃ番号４−３９４５４）のウエルを、Ｒｓ−ＡＦＰ１ポリペプチ ドに対する抗体でコーティングし、そして ４℃で一晩インキュベートした。その後、コーティング溶液をウエルから取除き 、そしてその後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。１００μｌの葉の上清または、０． ２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ画分Ｖ（Ｓｉｇｍａ、セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ） ）で補足したＰＢＳＴ中の適切に希釈したポリペプチド標準を、ウエルに加えた 。トランスジェニック植物から得た抽出物中の各ペプチドの濃度を、可変量の各 自の精製ポリペプチドを使用して構築された標準曲線から決定した。ＡｌｙＡＦ Ｐ、Ｒｓ−ＡＦＰ１およびＲｓ−ＡＦＰ２は、ポリクローナル抗体標品と交差反 応した。４℃で、一晩インキュベートした後、ウエルから溶液を除去し、そして ウエルを、ＰＢＳＴで３回洗浄した。Ｂｏｏｒｓｍａら、（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈ ｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２３：２００−２０７（１９７５年））にしたがって 調製された０．５ｍｇ／ｍｌＲｓ−ＡＦＰ１抗体／アルカリ性ホスファターゼ複 合体のＰＢＳＴ中１：１０００希釈物１００μｌを各ウエルに添加した。プレー トを２２℃で４時間インキュベートし、そしてその後ウエルをＰＢＳＴで５回洗 浄した。２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ９）に溶解させた１００μｌの新たに調 製したｐ−ニトロフェニルホスフェート（１ｍｇ／ｍｌ） （Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ミズーリー州（ＭＯ）、セント・ル イス（ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ））の溶液を、各ウエルに添加し、そしてプレートを２ ２℃で１時間インキュベートした。Ｔｅｒｍｏ−ｍａｘマイクロプレートリーダ ー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州（ＣＡ）、メンロ ー・パーク（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ））を使用して、４０５ｎｍでの光学濃度を 測定した。様々なレベルの抗菌ポリペプチドを発現する植物を次の疾病試験に使 用した。トランスジェニック植物でのＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ（ベルチシリウム）立枯 れ病制御 病原性Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ（ベルチシリウム・ダヒリ アエ）の２−３週齢培養の分生子および菌糸体を、ＰＤＡ（ジャガイモ、２００ ｇ／ｌ；Ｂａｃｔｏデキストロース、２０ｇ／ｌ；およびＢａｃｔｏ寒天、１５ ｇ／ｌ）ペトリ皿に接種するのに使用した。この培養は、２２℃で、４−５日間 成育させた。その後、培養プレートを滅菌蒸留水で洗浄し、そして２層のチーズ クロスを通して液体を濾過することによって、分生子を回収した。細胞計数計を 用いて分生子胞子の濃度を測定し、そして、滅菌蒸留水で１×１０⁶分生子／ｍ ｌ に調整した。 トランスジェニックおよび非トランスジェニック・ジャガイモ植物を、５０ｍ ｌのＰＭ寒天培養基を含むプラスチック製カップ内で、上に記載した無菌条件下 で、茎挿木から育成した。植物が約１−２インチ高であるとき、それらを培養基 から取除き、そしてそれらの根を胞子懸濁液（Ｊｏａｑｕｉｍら、Ｐｈｙｔｏｐ ａｔｈｏｌｏｇｙ ８１：５５２−５５８（１９９１年））に浸漬した。その後 、接種した植物を、Ｍｅｔｒｏ−Ｍｉｘ３５０を含有する６インチポットに移植 した。移植後、各植物は、茎の基底の周囲の土壌表面に、さらに５ｍｌの胞子懸 濁液を受けた。ポットを、以下の条件下で、育成チャンバーに載せた：２０℃の 温度、３２０μアインシュタイン／秒／ｃｍ²の光度、１２時間日中／１２時間 夜間の光のサイクル、２回／日、水で地下灌癬、各回２０分間浸漬。インキュベ ート後４週間、０−１００％のスケールで植物を疾病重篤度について等級づけし た（Ｈｏｒｓｆａｌｌら、ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３５：６５５（１９ ４５年））。時間に対して疾病進行曲線を展開するために、少なくとも８週間、 １週に１度、植物を格付けした。結果 ＡｌｙＡＦＰ発現ジャガイモ植物中のＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ（ベルチシリウ ム）立枯れ病耐性 Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ（ベルチシリウム）立枯れ病に対する耐性について 、ＡｌｙＡＦＰを発現する１０の独立なトランスジェニックジャガイモ系統を試 験した。これらの系統の中で、５つは、５．２から１４．９μｇＡｌｙＡＦＰ／ ｇの新鮮葉組織を含み、高度の発現体である；３つは、２．６μｇＡｌｙＡＦＰ ／ｇの新鮮葉組織を含み、中程度の発現体である；そして２つは、０．９から１ ．１μｇ／ｇの新鮮葉組織を含み、低い程度の発現体である（表３）。葉での発 現レベルは、各自のコーディングＤＮＡｓの発現を操作するのに使用されるＦＭ Ｖプロモーターが、すべての組織タイプのジャガイモ植物で本質的に遺伝子発現 を引き起こすので、全植物での発現の指標である。試験では、３つの独立トラン スジェニック・系統も、陰性対照として含まれる。これらは、プラスミドｐＭＯ Ｎ１７２２７（ベクター対照；図７）を潜伏させるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ （アグロバクテリウム）を使用する形質転換から生じ、それはいかなる抗菌ポリ ペプチド−コーディングＤＮＡをも含 まない。試験に含まれる他の対照は、非トランスジェニック・ジャガイモＲｕｓ ｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ（ルセット・バーバンク）であり、それは、形質転換試 験のために宿主として使用され、非トランスジェニック・ジャガイモ変種Ｒｕｓ ｓｅｔ Ｒａｎｇｅｒ（ルセット・ランガー）、それはＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂ ａｎｋ（ルセット・バーバンク）よりＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ（ベルチシリウ ム）立枯れ病に対する耐性が高い；そして非トランスジェニック・・ジャガイモ 変種Ｎｏｒｃｈｉｐ（ノルチップ）、それはＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ（ル セット・バーバンク）よりＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ（ベルチシリウム）立枯れ 病に影響を受けやすい。 表３は、各系統でのタンパク質発現レベル、そして接種４４日後に、測定され た各個別の系統の疾病重篤格付けを要約する。疾病重篤度格付けは、３つの複製 物の平均であった。都合のために、同じ疾病のデータも、図１１の棒グラフに表 される。表３（上から下まで）および図１１（左から右まで）での各ジャガイモ 系統の外観の桁数は、同じである。 表３ ＡｌｙＡＦＰの発現およびトランスジェニックジャガイモ植物でのＶｅｒｔｉｃ ｉｌｌｉｕｍ（ベルチシリウム）立枯れ病耐性 表３および図１１に示されるように、高度そして中程度のＡｌｙＡＦＰ発現植 物での疾病重篤度は、平均して対照ベクターのものより６２％低かった。これは 、以下のように計算された：［（３つのベクター対照系統の平均）−（８系統の 高度および中程度の発現の平均）］×１００％／（３つのベクター対照系統の平 均）。系統番号１７５７５および系統番号１７５８７のような最高の発現系統は 、ベクター対照のものより８２％低い疾病重篤度を示した。低い発現系統は、ベ クター対照と比較すると、いかなる際だったレベルの疾病耐性をも示さなかった 。表３では、「＋」は、平均疾病重篤度の先の計算に含まれた系統を示す。 これらの結果は、２．６μｇ／新鮮葉組織で、またはより上でＡｌｙＡＦＰを 発現するジャガイモ植物がＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ（ベルチシリウム）立枯れ 病に対する耐性を示すことを例示する。疾病耐性のレベルは、ＡｌｙＡＦＰ発現 レベルに相関する。これらの結果は、際立った疾病耐性のために必要とされるＡ ｌｙＡＦＰの発現レベルは、実施例３で表されたｉｎ ｖｉｔｒｏ抗菌アッセイ 中で測定されたＩＣ₅₀値に近い。非トランスジェニックＲｕｓｓｅｔ Ｒａｎｇ ｅｒ（ルセット・ラ ンガー）植物が、比較的に低い疾病重篤度格付けを示したが、Ｒｕｓｓｅｔ Ｂ ｕｒｂａｎｋ（ルセット・バーバンク）植物と比較して、植物は重篤に成長を妨 げられた。この障害フェノタイプは、疾病重篤度格付けで説明されなかった。 Ｒｓ−ＡＦＰ１およびＲｓ−ＡＦＰ２発現ジャガイモ植物でのＶｅｒｔｉｃｉｌ ｌｉｕｍ（ベルチシリウム）立枯れ病耐性ＡｌｙＡＦＰ発現植物について上で記 載されたものに類似する実験でＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ（ベルチシリウム）立 枯れ病耐性について、Ｒｓ−ＡＦＰ１およびＲｓ−ＡＦＰ２を発現するトランス ジェニックジャガイモ系統を試験した。５．２から２６μｇ Ｒｓ−ＡＦＰ１／ ｇ新鮮葉組織を含むＲｓ−ＡＦＰ１発現植物の５つの独立系統、および１０．８ から２５．２μｇ Ｒｓ−ＡＦＰ２／ｇ新鮮葉組織を含むＲｓ−ＡＦＰ２発現植 物の５つの独立系統を、この実験で試験した。そしてその結果は、表４に示され る。ＡｌｙＡＦＰ発現植物の場合に、上で使用されたものと同じ対照をこれらの 実験に使用した。 この試験で、疾病症状は、接種およそ４９日後に実験および対照植物に現れた 。疾病進行は、接種４９、５８および６４日後に格付けした。これらの時点のい ずれでも、Ｒｓ−ＡＦＰ１ およびＲｓ−ＡＦＰ２発現系統と対照系統との間に差異は観察されなかった。疾 病重篤度格付けは、３つの複製の平均であった。表４は、各系統でのタンパク質 発現レベル、および５８日後に測定された各個別の系統の疾病重篤度格付けを要 約する。都合のため、同じ疾病データも、図１２で棒グラフとして表される。表 ４（上から下まで）で、および図１２（左から右へ）の各ジャガイモ系統の外観 の桁数は同じである。 表４ Ｒｓ−ＡＦＰ１およびＲｓ−ＡＦＰ２の発現およびトランスジェニックジャガイ モ植物でのＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ（ベルチシリウム）立枯れ病耐性 表４および図１２に示すとおり、高発現性Ｒｓ−ＡＦＰ１およびＲｓ−ＡＦＰ ２における平均疾病重篤度は、それそれ５９．８％および６４．０％であった。 これは、ベクター対照のもの（６０．０％）と基本的に同じであった。表４では 、「＋」は、平均疾病重篤度の計算に含まれた系統を示す。 要約すると、ＡｌｙＡＦＰ、Ｒｓ−ＡＦＰ１およびＲｓ−ＡＦＰ２を発現する トランスジェニック植物で得られる疾病試験結果は、ＡｌｙＡＦＰが２．６μｇ ／ｇ新鮮葉組織と同じくらい低い発現レベルでジャガイモ植物についてのＶｅｒ ｔｉｃｉｌｌｉｕｍ（ベルチシリウム）立枯れ病耐性を付与することを示す一方 で、Ｒｓ−ＡＦＰ１およびＲｓ−ＡＦＰ２は、２５μｇ／ｇ新鮮葉組織と同じく らい高い発現レベルで、ジャガイモ植物についてなんら際立ったレベルのＶｅｒ ｔｉｃｉｌｌｉｕｍ（ベルチシリウム）立枯れ病耐性を供しない。これらの結果 は、実施例３で測定されたＡｌｙＡＦＰについてのＩＣ₅₀値が、望まれない菌類 によって起こされた障害を制御する上で、そして植物の中の疾病耐性を遺伝的に 操作する上で、このタンパク質の有用性の信頼できる指標であることを示す。 ここに本発明が記載されるとき、様々な方法で同じものが変 化するは明白である。このような多様性は、本発明の概念および範囲から逸脱す ると見なされず、そしてこのような修飾のすべては、当業者にとって、以下の請 求項の範囲内に含まれることを意図することは明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ローゼンバーガー，シンデイ・アネツト アメリカ合衆国、ミズーリ・63021、ボー ルウイン、レツド・ブリツジ・コート・ 577

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 配列番号２に示されているアミノ酸配列を含む分離ポリペプチド。 ２． 請求項１に記載のポリペプチドをコードする分離ＤＮＡ分子。 ３． 前記分離ＤＮＡ分子がｃＤＮＡ分子であることを特徴とする、請求項２に 記載の分離ＤＮＡ分子。 ４． 配列番号１２に示されているヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、 請求項３に記載のｃＤＮＡ分子。 ５． 配列番号１２に示されているヌクレオチド配列の１１６〜２６９ヌクレオ チドを含むことを特徴とする、請求項３に記載のｃＤＮＡ分子。 ６． ５’→３’方向に作動可能に結合した： （ａ） 植物細胞中でＲＮＡ配列を産生させる機能を果たすプロモーター； （ｂ） 請求項１に記載の分離ポリペプチドをコードする構造コード配列；及び （ｃ） 植物細胞中で、転写終結及び前記ＲＮＡ配列の３’末 端へのポリアデニル酸ヌクレオチドの付加を生起ざせる機能を果たす３’非翻訳 領域 を含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子。 ７． 前記構造コード配列がｃＤＮＡ分子であることを特徴とする、請求項８に 記載のＤＮＡ分子。 ８． 前記ｃＤＮＡ分子が、配列番号１２に示されているヌクレオチド配列及び 配列番号１２に示されているヌクレオチド配列の１１６〜２６９ヌクレオチドか らなる群から選択されるメンバーであることを特徴とする、請求項７に記載のＤ ＮＡ分子。 ９． 前記プロモーターが、ＦＭＶ ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ ３５Ｓプ ロモーター、ｓｓＲＵＢＩＳＣＯプロモーター、ＥＩＦ−４Ａプロモーター、Ｌ ＴＰプロモーター、アクチンプロモーター及びユビキチンプロモーターからなる 群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載のＤＮＡ分子。 10． 前記植物の所在地に請求項１に記載の分離ポリペプチドを供給することを 含む、植物に対する真菌による被害を防除する方法。 11． 前記真菌による被害が、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ属；Ａｓｃｏｃｈｙｔａ属 ；Ｂｏｔｒｙｔｉｓ属；Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ 属；Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ属；Ｄｉｐｌｏｄｉａ属；Ｅｒｙｓｉｐｈｅ 属；Ｆｕｓａｒｉｕｍ属；Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ属；Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏ ｓｐｏｒｉｕｍ属；Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ属；Ｎｅｃｔｒｉａ属；Ｐｅｒｏ ｎｏｓｐｏｒａ属；Ｐｈｏｍａ属；Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ属；Ｐｈｙｔ ｏｐｈｔｈｏｒａ属；Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ属；Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ属；Ｐ ｕｃｃｉｎｉａ属；Ｐｕｔｈｉｕｍ属；Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ属；Ｐｙｒｉｃ ｕｌａｒｉａ属；Ｐｙｔｈｉｕｍ属；Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ属；Ｓｃｅｒｏｔ ｉｕｍ属；Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ属；Ｓｅｐｔｏｒｉａ属；Ｔｈｉeｌａｖｉ ｏｐｓｉｓ属；Ｕｎｃｉｎｕｌａ属；Ｖｅｎｔｕｒｉａ属；及びＶｅｒｔｉｃｉ ｌｌｉｕｍ属からなる群から選択される真菌によって引き起こされることを特徴 とする、請求項１０に記載の方法。 12． 前記抗真菌ポリペプチドを産生する微生物を植物でコロニー形成させるこ とにより、前記植物の所在地に前記ポリペプチドを供給することを特徴とする、 請求項１０に記載の方法。 13． 前記分離ポリペプチドを含む組成物を適用することにより、前記ポリペプ チドを前記植物の所在地に供給することを特 徴とする、請求項１０に記載の方法。 14． 前記植物細胞内で前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させること により、前記ポリペプチドを前記植物の所在地に供給することを特徴とする、請 求項１０に記載の方法。 15． 前記ポリペプチドが実質的に配列番号２に示されているアミノ酸配列から なることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。 16． 植物に対する真菌による被害を防除する方法であって： （ａ） 植物細胞のゲノム中に： （ｉ）植物細胞中でＲＮＡ配列を生成させる機能を果たすプロモーター； （ii）請求項１に記載の分離ポリペプチドをコードする構造コード配列； （iii）前記植物細胞中で、転写終結及び前記ＲＮＡ配列の３’末端への ポリアデニル酸ヌクレオチドの付加を生起させる機能を果たす３’非翻訳領域を 含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子を挿入するステップ； （ｂ） 形質転換植物細胞を得るステップ；及び （ｃ） 前記形質転換植物細胞から、細胞が抗真菌有効量の請 求項１に記載のポリペプチドを発現する遺伝子操作により形質転換された植物を 再生するステップ； を含むことを特徴とする前記方法。 17． 前記構造コード配列が、配列番号１２に示されているヌクレオチド配列及 び配列番号１２に示されているヌクレオチド配列の１１６〜２６９ヌクレオチド からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。 18． 前記プロモーターが、ＦＭＶ ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ ３５Ｓプ ロモーター、ｓｓＲＵＢＩＳＣＯプロモーター、ＥＩＦ−４Ａプロモーター、Ｌ ＴＰプロモーター、アタチンプロモーター及びユビキチンプロモーターからなる 群から選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。 19． 細胞が抗真菌有効量の請求項１に記載のポリペプチドを含む植物。 20． 前記植物が： （ａ） 植物細胞のゲノム中に： （ｉ）植物細胞中でＲＮＡ配列を生成させる機能を果たすプロモーター； （ii）配列番号２に示されているアミノ酸配列を含む分離 ポリペプチドをコードする構造コード配列； （iii）前記植物細胞中で、転写終結及び前記ＲＮＡ配列の３’末端への ポリアデニル酸ヌクレオチドの付加を生起させる機能を果たす３’非翻訳領域 を含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子を挿入するステップ； （ｂ） 形質転換植物細胞を得るステップ；及び （ｃ） 前記形質転換植物細胞から、細胞が抗真菌有効量の前記ポリペプチドを 発現する遺伝子操作により形質転換された植物を再生するステップ を含む方法によって作出されることを特徴とする、請求項１９に記載の植物。 21． 前記構造コード配列が、配列番号１２に示されているヌクレオチド配列及 び配列番号１２に示されているヌクレオチド配列んｐ１１６〜２６９ヌタレオチ ドからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２０に記載の植物。 22． 請求項１９に記載の植物であって、ゲノムが、抗真菌性のペプチド、ポリ ペプチド又はタンパク質をコードする１種以上の他のＤＮＡ分子を含み、該ＤＮ Ａ分子が形質発現し、該分子によりコードされる抗真菌有効量の前記ペプチド、 ポリペプ チド又はタンパク質を産生することを特徴とする前記植物。 23． 請求項１９に記載の植物であって、ゲノムがＢ．ｔ．内毒素をコードする ＤＮＡを含み、該ＤＮＡが形質発現して、抗昆虫有効量の前記Ｂ．ｔ．内毒素を 産生することを特徴とする前記植物。 24． 請求項１９に記載の植物であって、リンゴ、オオムギ、ブロッコリ、キャ ベツ、カノラ、ニンジン、柑橘類、トウモロコシ、ワタ、ニンニク、オートムギ 、タマネギ、観賞植物、エンドウ、ラッカセイ、コショウ、ジャガイモ、コメ、 ライムギ、モロコシ、ダイズ、イチゴ、テンサイ、サトウギビ、トマト、蔓植物 及びコムギからなる群から選択されることを特徴とする前記植物。 25． 前記植物がジャガイモ植物であることを特徴とする、請求項１９に記載の 植物。 26． 請求項２５に記載の植物によって生産されるジャガイモの種子。 27． 請求項１に記載の抗真菌有効量の分離ポリペプチドと、許容し得る担体と を含む抗真菌組成物。 28． 有害な真菌を、抗真菌有効量の請求項１に記載の分離ポ リペプチドと接触させることを含む、有害な真菌と闘う方法。