JP2000509253A - 不死化させたトリ細胞株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、特にトリの組織、すなわち、血球および造血細胞以外の、特に繊維芽細胞および上皮細胞、例えば胚由来の非形質転換不死化トリ細胞を特徴とする。トリ細胞はＭＴＩプロモータに依存するＳＶ４０Ｔ＋ｔ遺伝子で不死化される。特に、ｐＤＡＭＴベクターが組込まれている。

Description

【発明の詳細な説明】 不死化させたトリ細胞株 本発明はトリ細胞株およびその誘導体に関する。 哺乳類由来の一部の臓器で実施できるように、烏類から取り出した臓器から自 然に細胞株を樹立することは不可能である。 現在利用できる細胞株は、トリの白血病群のレトロウイルスまたはマレック病 ウイルスなどの発がん特性を有するある種のトリウイルス、またはメチルコラン トレンおよびジエチルニトロソアミンなどのある種の化学分子の形質転換特性を 使用して得られたもののみである。 これらの細胞株は大部分はかなり形質転換されており、そのため、ワクチンウ イルスの増殖には不適である。 著者らは、発がん性は示さないが、不死化誘導能により選択された遺伝子を細 胞に組込むことのできるベクターをこれらの細胞に導入することからなる新しい 方法を採用している。 ｅｒｂＡおよびｅｒｂＢなどのトリレトロウイルス遺伝子を組込むベクターを 使用して、最初の試験を実施した。 仏国特許出願第ＦＲ−Ａ−２５９６７７０は、トリまたは哺 乳類細胞の培養物をベクター、または、これらの細胞に対して発かん性ではない が、ｖ−ｍｙｂ、ｖ−ｅｔｓおよびｖ−ｅｒｂＡから選択した遺伝子をこれらの 細胞に組込むことができる系に感染させる不死化法を提起している。ＡＭＶ、Ｅ ２６およびＸＪ１２ウイルスが適当なベクターでありうる。このＸＪ１２ウイル スは発がん性ｖ−ｅｒＢ遺伝子が欠失したＡＥＶウイルスのウイルス誘導体であ る。 実際に、これらの試験により造血細胞株の細胞から樹立細胞株を得ることがで きたが、繊維芽細胞または上皮細胞などの付着培養中のニワトリ肝細胞では期待 した結果が得られなかった。 がん遺伝子ｍｙｂを使用して骨髄芽球様型の（血球）のトリの非形質転換細胞 株が得られた（国際特許出願第ＷＯ９１／１８９７１）。 同時に、著者らは、種々の哺乳類組織由来の細胞を不死化するためにサルウイ ルスＳＶ４０の初期ｔ遺伝子および初期Ｔ遺伝子を使用することを提起した（D. S．Neufeld他、Molecular and Cellular Biology、1987年８月、2794-2802、O.K ellermannおよびF．Kelly、Differentiation 1986、32:74-81および仏国特許出 願第ＦＲ−Ａ−２６４９７２１号）。 一つの態様として、仏国特許出願ＦＲ−Ａ−２６４９７２１号は、従来の方法 の特異性が高いという欠点（特別な種および／または特別の細胞の種類に限定さ れる）を解消することを目的として、すべての種類の細胞およびすべての種に使 用できる条件的不死化法を提起しており、これをクレームに記載している。従来 の方法には、形質転換ウイルス（アデノウイルス、エプスタイン・バーウイルス 、ＳＶ４０またはポリオーマウイルスなどのある種のパポーバウイルス、例えば 、ＳＶ４０ウイルスは齧歯類およびヒトの細胞のみを形質転換させる形質転換ウ イルスであることが示されている）による細胞の形質転換、ウイルスのプロモー タと結合する形質転換遺伝子を有する構築体によるトランスフェクション、細胞 のプロモータと結合する形質転換遺伝子によるトランスフェクションがある。こ の特許出願では、ビメンチンの調節配列からのＤＮＡ断片と不死化遺伝子をコー ドするＤＮＡ断片を合わせた構築体を選択しており、この構築体はビメンチンの 誘導可能なプロモータの支配下にあるＳＶ４０ウイルスのＴ抗原でありうる。こ の文献は鳥類については何も述べていない。 鳥類におけるこれらのウイルスがん遺伝子の実際の使用につ いては、ヒトアデノウイルス５の１２Ｓ型のＥ１Ａタンパク質を使用してウズラ の上皮細胞を不死化できたこと（Guilhot他(1993)、Oncogene 8:619-624）以外 には、これまで記載されていない。 すべての期待に反して、本発明者は不死化非形質転換トリ細胞株の産生に成功 した。 一般的には、本発明者らは、トリの組織すなわち循環血細胞または造血細胞以 外の細胞からでも不死化非形質転換トリ細胞株を作製することはできることを発 見した。 従って、本発明は、特に、トリ組織すなわち循環血細胞または造血細胞以外の 細胞、特に繊維芽細胞および上皮細胞、例えば、胚由来の不死化非形質転換トリ 細胞株に関する。 より詳細には、本発明は、ＭＴＩ（ネズミメタロチオネインＩ）プロモータの 支配下にあるＳＶ４０Ｔ＋ｔ遺伝子をゲノムに組込んだ不死化非形質転換トリ細 胞株に関する。 好ましくは、細胞はＳＶ４０プロモータも組込んでおり、このプロモータはネ オマイシン耐性の遺伝子に機能的に結合する。 好ましくは、細胞は少なくとも一つのＬＴＲ配列を組込んでいる。ＬＴＲ配列 は実施例に記載のように欠失させることがで きる。 細胞は好ましくは、第１図に示すように、ベクターｐＤＡＭＴを組込んでいる 。 細胞はトリ起源のものであるが、特にバリケン由来のものであってよい。 本発明は、特に、ＣＮＣＭ(Collection Nationale deCultures de Microorgan ismes de l'Institut Pasteur(Pasteur Institute National Collection of Mic roorganism Cultures))に参照番号Ｉ−１７１２として寄託されている不死化非 形質転換トリ細胞株ＴＤＦ−２Ａに関する。 本発明は当然、これらの細胞株由来の細胞も包含する。これにより、記載した 参照番号でＣＮＣＭに寄託した細胞だけではなく、これらの寄託した細胞の子孫 を構成する細胞、すなわち、単純な増殖で得られたものおよび増殖の間に突然変 異する可能性のあるもの、ならびに故意の修飾後に得られる誘導細胞と呼ばれる もの、および、もちろん、２種の修飾を受けたものも包含する。 従って、本発明は、上記細胞の修飾により得られる誘導細胞も包含する。これ らの修飾には以下のものが含まれる。 − 各々が産業上重要な分子をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列を 含む一つまたは複数の発現カセットであって、本発明の細胞に挿入した後で上記 分子を産生できる発現カセットの挿入。当業者はこの手法に十分精通している。 特に挙げられる産業上重要な分子は、特にワクチンまたは診断試薬に使用するペ プチド、タンパク質または糖タンパク質の型のウイルスサブユニット、ホルモン などのタンパク質分子である。 − ウイルスに対する感受性を予め変化させまたは変化させずに、ウイルスまた はワクチン製造の目的での、細胞内で増殖可能なウイルスによる慢性的な感染。 感染は慢性でなくてもよく、ウイルス増殖のために選択されたバッチの細胞につ いて実施することもできる。 （下記の修飾とは、好ましくおよび好都合に、上記二つの型の修飾を組み合わせ たものと理解されたい。） − 特に、集密性を維持するために、これらの細胞株に培養条件に対するより強 い耐性を付与するための、ヒトアデノウィスルｐ１９Ｅ１Ｂ（Rao他(1992)、Pro c．Natl．Acad．Sci．USA 89:7742-7746）、エプスタイン・バーウイルスＬＭＰ −１（Gregory他(1991)、Nature 349:612-614）およびＢＨＲＦ１ （Pearson他(1987)、Virology 160:151-161)、単純疱疹ウイルスＩＣＰ３４．５ (ChouおよびRoizman(1992)、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:3266-3270)、バキ ュロウイルスｐ３５(Clem他(1991)、Science 254:1388-1390）タンパク質をコー ドする遺伝子などの、ｂｃｌ−２以外の生存遺伝子または抗アポトーシス遺伝子 の導入。 − 増殖速度を上昇させるのに適したベクターを使用する細胞周期の調整に関与 する遺伝子の過剰発現。サイクリンをコードする遺伝子の過剰発現により細胞周 期を短縮し、その結果、増殖速度を上昇させることがあることが示されている(R osenberg他(1995)、Oncogene 10:1501-1509;Quelle他(1993)、Genes and Dev．7 :1559-1571)。 − ウイルスを増殖させるための、当該の受容体をコードする遺伝子を組込むこ とによる細胞株のウイルス感受性スペクトルの変更。 哺乳類を参照できるが、通常は麻疹ウイルス（ＣＤ４６）を許容しないネズミ の細胞によるこのウイルスの受容体の発現により、これらの細胞がこのウイルス に感受性となり、ウイルスを複製できるようになる（Naniche他（1993）、J．Vi rol．67: 6025-6032）。細胞でウイルスを製造するために、これらの細胞をそのウイルス に対して感受性とすることが特に重要である。 − 細胞の成長を促進しうるがん遺伝子の組込み。 本発明により誘導された細胞が上記修飾の一つまたは複数を含みうることは自 明である。 本発明はまた、産業上重要な分子またはウイルスを製造する方法に関し、この 方法は上記細胞を培養することを含む。 本発明は、特に、診断用試薬またはワクチンを創製するための分子またはウイ ルスの製造または治療上重要な分子の製造を目的とする。 本発明を以下に、非限定実施例により示す実施形態および第１図を参照してよ り詳細に記載する。第１図は、細胞株ＴＤＦ−２Ａの作製に使用されるベクター ｐＤＡＭＴの構造を示しており、図中、 ＬＴＲは直接繰り返し配列（長い末端繰り返し復配列）であり、 ＬＴＲはＬＴＲの欠失であり、 ＭＴＩはネズミメタロチオネインＩプロモータであり、 ＳＶ４０Ｔ＋ｔはＳＶ４０の初期領域であり、 ＳＶ４０はＳＶ４０プロモータである。 実施例１＝ＴＤＦ−２Ａ細胞株の作製 Ｉ．起源および特徴の説明 １．１ 使用したベクターｐＤＡＭＴの説明 ベクターｐＤＡＭＴは、マウスメタロチオネインＩプロモータ(ＢｇＩＩＩ部 位がＨｉｎｄＩＩＩ部位にトランスフォームされたＥｃｏＲＩ／ＢｇＢＩＩ断片 )(Durnam他(1980)、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 77:6511-6515;Brinster他(198 2)、Nature 296:39-42)の支配下にあるＳＶウイルスの初期領域(Ｔ抗原およびｔ 抗原をコードする)（ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ断片）（Fiers他(1978)、Natu re 273:113-120）を含む。 ベクターｐＭＴＳＶｎｅｏ（Peden他(1989)、Exp．Cell．Res．185:60-72）由 来のこの転写ユニットを含むＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ断片をベクターｐＤＡ１(A ubert他(1991)、J．Cell．Biol．113:497-506)のＸｂａＩ部位に挿入した。この 後者のベクターは本質的に、ラウス肉腫関連ウイルス２（ＲＡＶ−２）のゲノム から３’側ＬＴＲの修飾後に得られるものである。従って、ＲＡＶ−２の３’側 ＬＴＲのＵ３領域が欠失し、ラウス肉腫関連ウイルス１（ＲＡＶ−１）ＬＴＲか ら単離されたＲ領域およびＵ５領域に結合している。このベクターは、ベクター ｐＳＶ２ｎｅｏ（SouthernおよびBerg(1982)、J．Mol．Appl．Genet．1:327-341 ）由来のＳＶ４０プロモータの支配下にあるネオマイシン耐性遺伝子を含む転写 ユニットも含んでいる。第１図参照。 １．２ 細胞株の樹立と不死化の提示 KawaiおよびNishizawa(1984)，Mol．Cell．Biol．4:1172-1174に記載のジメチ ルスルホキシド（ＤＭＳＯ）法を使用して、バリケン１４日胚由来の細胞にベク ターｐＤＡＭＴをトランスフェクトした。次いで、ゲネチシンＧ４１８（１５０ μｇ／ｍｌ）を使用して、１５日間、トランスフェクトされた細胞を選択した。 耐性クローンを１週間に１回から２回継代する割合で定期的に継代培養する。こ の３ヶ月間の活性増殖期の後、細胞は危機期に入り、この期間に細胞の大部分が 死滅する。ほぼ２ヶ月続くこの期間の後、いくつかのクローンが活性増殖を再開 し、これらが不死化されたことが示唆される。 ＴＤＦ−２Ａ細胞株はこのように二つの培養から得られる。 これをより詳細に検討した。 ＴＤＦ−２Ａ細胞は２００回継代し、ほぼ４６０世代となり、６００日より長 期間持続的に培養中に維持された。比較すると、 ＳＶ４０ウイルス初期領域を発現していない対照細胞では２０回を超える継代で は培養中に維持することはできない。 １．３ 増殖特性 不死化した細胞を回転瓶中、１０Ｘ ＨＡＭ Ｆ−１０を６％で、１０Ｘ １ ９９ＨＡＮＫＳを４％で、トリプトース・ブロス・ホスフェートを２．９５％〜 ４％、重炭酸ナトリウムを５．６％〜２．５％、１００Ｘ ビタミンＢＭＥを０ ．１％で、ウシ胎児血清を３％、カナマイシンを５％〜１％およびバンコマイシ ンを０．５％〜１％含有する培地中、３８℃で培養した。 これらの条件下では、２４時間で倍加する。 １．４ Ｔ抗原の発現 Ｔ抗原に特異的な抗体を使用する間接免疫蛍光法または間接免疫ホスファター ゼ法(Pab 101:Santa Cruz Biotechnology ref．sc147)により、すべての細胞が 核内でＴ抗原を発現することが証明され、細胞すべてにベクターが組込まれてい ることが示された。 この組込みはサザンブロット法でも示された。不死化した繊維芽細胞のゲノム ＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩおよびＢＳｔＸＩ で消化した。Ｔ抗原に特異的なプローブ（１０１８ｂｐのＮｄｅＩ／ＮｄｅＩ断 片）とハイブリダイゼーションすると、不死化遺伝子を発現し、ＴＤＦ−２Ａ細 胞に挿入された転写ユニットでは大きな転位は起こっていないことが明らかとな った。このことは、得られたハイブリダイゼーション断片の大きさが予測された 大きさと一致することから示された。 １．５ 腫瘍化能の欠如 不死化された細胞は腫瘍化能を全く示さない。これらの細胞は半固体培地でコ ロニーを形成することはできず、またニワトリおよびアヒルの卵の漿尿膜で腫瘍 を形成することもできない。また、ヌードマウスおよび１日齢のＳＰＦ（病原体 フリー）のアヒルおよびニワトリの雛で腫瘍を形成することもできない。 １．６ 核型 ＴＤＦ−２Ａ細胞の核型を１１４回目および１３５回目の継代の際に検討した 。この結果、細胞は実際にトリ起源であり、この種に特徴的なミクロ染色体が存 在することが明らかとなった。さらに、観察された染色体はアヒル一次胚細胞で 認められる染色体に代表的なものであり、従って、細胞株の起源が確認された。 ＩＩ．特徴 ＴＤＦ−２Ａ細胞は特に、アヒル一次胚細胞で通常複製されるアデノウイルス 、パルボウイルスおよびレオウイルスなどのアヒルに特異的なウイルスに対する 感受性を示す。従って、これらのウイルスはこの細胞株で製造できる。 実施例２：組込み部位の同定によるＴＤＦ−２Ａ細胞系の特徴付け １１４回目および１３５回目の継代培養由来の細胞から調製したＴＤＦ−２Ａ 細胞のゲノムＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＫｐｎＩで消化した。このよう に処理したＤＮＡを次いでゲル電気泳動にかけてから、ナイロン膜に移した。こ れを次いで、Ｔ抗原に特異的なプローブ（１０１８ｂｐのＮｄｅＩ／ＮｄｅＩ断 片）とハイブリダイゼーションさせた。例えば、Ｂｇ１ＩＩで消化すると、二つ の大きなハイブリダイゼーションバンド（約１５ｋｂおよび２３ｋｂ）が得られ 、二つの組込部位か存在することを示唆した。ＫｐｎＩで消化すると一つの大き なバンド（約２０ｋｂ）と少なくとも一つの小さなバンドが生じ、少なくとも二 つの組込部位が存在することが確認された。 実施例３：ＴＤＦ−２Ａ細胞でのアデノウイルスＶ１２７の増殖 ＴＤＦ−２Ａ細胞を回転瓶に播種した。軟殻卵病アデノウイルスＶ１２７株を 細胞培養に接種した。６日後、振とうして付着した細胞を剥がすことにより回収 した。従って、回収された混合物は付着した細胞と培養上清を含んでいる。細胞 粉砕器またＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘなどのホモジナイザーを使用し、１３，５０ ０ｒｐｍ（Ｔ２５型ＩＫＡアプライアンス）で１分間処理して、全体を均質にす る。 感染ウイルス価を９６ウェルプレート上で実施するマイクロ法で測定する。ウ イルスの希釈物を二次バリケン胚細胞から調製した付着した細胞に接種する。各 ウイルス希釈物を６つのウェルに接種する。プレートをＣＯ₂インキュベータ内 で８日間インキュベートする。ウェル中のウイルスの存在は、顕微鏡下で特徴的 細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察して調べた。感染価はＫＡＲＢＥＲ法で計算し、 ５０％ＣＰＥを提供するウイルス希釈の逆数の対数「価＝ｄ＋ｒ／Ｎｘ（ｎ＋Ｎ ／２）」で表す。ここで、ｄは全てのウェルが陽性となるときの希釈を対数で表 したものであり、ｒは希釈比であり、Ｎは希釈毎のウェルの数であり、ｎは０〜 １００％の間の陽性のウェルの数である。 ウイルスの存在は、ニワトリ赤血球縣濁液を使用するウイルス上清の血球凝集 活性を調べることによっても確認する。この場合、上記ウェルからの上清５０μ ｌをＤｙｎａｔｅｃｈマイクロタイトレーションプレートに入れ、各ウェルに１ ５×１０⁶細胞／ｍｌを含有するニワトリ赤血球縣濁液２５μｌを加える。マイ クロタイトレーションプレートを周囲温度で４５分間振とうし、インキュベート した後、血球凝集が可視的にはっきりと認められたウェルすべてを陽性とみなす 。同様にして、価をＫＡＲＢＥＲ法で計算する。 結果：得られたウイルス価はアヒル一次胚細胞で得られたものと等しい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 エコール・ノルマン・シユーペリユール・ ドウ・リヨン フランス国、エフ―69364・リヨン・セデ クス・07、アレ・デイタリー、46 (71)出願人 メリアル フランス国、エフ―69002・リヨン、リ ユ・ブルジユラ、17 (72)発明者 ブケ，ジヤン―フランソワ フランス国、エフ―69280・サント・コン ソルス、シユマン・ドウ・ロピタル、40 (72)発明者 ベンシヤイビ，ミル フランス、エフ―67000・ストラスブール、 リユ・デ・ボンヌ・シヤン、４ (72)発明者 サマリユ，ジヤツク フランス国、エフ―69100・ビルユルバン ヌ、ルート・ドウ・ジユナ、169・ビス (72)発明者 デメツトル，フイリツプ フランス国、エフ―69130・エキユリー、 シユマン・ドウ・ラ・ベルニク、35、ル・ トルイユ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．不死化されたが形質転換されていないトリ細胞。 ２．トリの組織由来の細胞から得られることを特徴とする請求の範囲第１項に記 載のトリ細胞。 ３．繊維芽細胞または上皮細胞由来であることを特徴とする請求の範囲第２項に 記載のトリ細胞。 ４．そのゲノムに組込まれたＭＴＩプロモータの支配下にあるＳｖ４０Ｔ＋ｔ遺 伝子を含有することを特徴とする請求の範囲第１項から第３項のいずれか一項に 記載の不死化非形質転換トリ細胞。 ５．ネオマイシン耐性の遺伝子と機能的に結合したＳＶ４０プロモータも組込ん だことを特徴とする請求の範囲第４項に記載の細胞。 ６．少なくとも一つのＬＴＲ配列も組込んだことを特徴とする請求の範囲第４項 または第５項に記載の細胞。 ７．ベクターｐＤＡＭＴを組込んだことを特徴とする請求の範囲第４項に記載の 細胞。 ８．ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur(パスツール インスティテュート ナ ショナル コレクション オブ マイクロオーガニズム カルチャーズ：Pasteu r Institute National Collection of Microorganism Cultures)）に参照番号Ｉ −１７１２として寄託されている不死化非形質転換トリ細胞株ＴＤＦ−２Ａ。 ９．請求の範囲第８項に記載の細胞株由来の不死化トリ細胞。 １０．産業上利用できる分子をコードする核酸配列を少なくとも一つ含む発現カ セットを少なくとも一つ含むことを特徴とする請求の範囲第１項から第７項およ び第９項のいずれか一項に記載の細胞。 １１．核酸配列がペプチド、タンパク質または糖タンパク質型のウイルスサブユ ニットをコードするまたはホルモンなどのタンパク質分子をコードすることを特 徴とする請求の範囲第１０項に記載の細胞。 １２．細胞内で増殖できるウイルスで好ましくは慢性的に感染させたことを特徴 とする請求の範囲第１項から第７項および第９項のいずれか一項に記載の細胞。 １３．好ましくは、ヒトアデノウイルス由来のｐ１９Ｅ１Ｂ、 エプスタイン・バーウイルス由来のＬＭＰ−１、エプスタイン・バーウイルス由 来のＢＨＲＦ１、単純疱疹ウイルス由来のＩＣＰ３４．５およびバキュロウイル ス由来のｐ３５からなる群から選択した、ｂｃｌ−２以外の生存遺伝子または抗 アポトーシス遺伝子を含むことを特徴とする請求の範囲第１項から第７項および 第９項から第１２項のいずれか一項に記載の細胞。 １４．増殖速度を上昇させるために、細胞周期の調整に関与する一つまたは複数 の遺伝子を過剰発現させうるベクターを組込んだことを特徴とする請求の範囲第 １項から第７項および第９項から第１３項のいずれか一項に記載の細胞。 １５．ウイルス受容体をコードする遺伝子を組込んだことを特徴とする請求の範 囲第１項から第７項および第９項から第１４項のいずれか一項に記載の細胞。 １６．細胞増殖を促進できるがん遺伝子を組込んだことを特徴とする請求の範囲 第１項から第７項および第９項から第１５項のいずれか一項に記載の細胞。 １７．請求の範囲第１項から第７項および第９項から第１６項のいずれか一項に 記載の細胞を培養することを含む産業上利用できる分子またはウイルスを製造す る方法。