JP2000509259A

JP2000509259A - 血管内皮増殖因子（ＶＥｇＦ／ＶＰＦ）発現のアンチセンス阻害剤

Info

Publication number: JP2000509259A
Application number: JP9537367A
Authority: JP
Inventors: チヤウダーリ，ニラブー; ラーウ，テイー・スードハーカール; レヴアンカール，ガーナーパーテイ・アール; コツサム，ポール・エイ; ラーンドウ，ロバート・エフ; パイマン，アヌーシユ; ウールマン，オイゲン
Original assignee: ヘキスト・マリオン・ルセル・ドイチユラント・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング; アロウネツクス・フアーマスーテイカルズ・インコーポレイテツド
Priority date: 1996-04-17
Filing date: 1997-04-17
Publication date: 2000-07-25
Also published as: EP0910634A2; WO1997039120A2; BR9708701A; AU2733697A; WO1997039120A3; KR20000005561A; CA2251945A1

Abstract

(57)【要約】本発明は血管内皮増殖因子の発現のオリゴヌクレオチドによる阻害に関する。本発明のオリゴヌクレオチドは標的ｍＲＮＡに配列特異的様式で結合し、それをコードする遺伝子の発現を防止するものと考えられる。オリゴヌクレオチドの安定性および結合効率を上昇させるためのオリゴヌクレオチドの化学的修飾法が開示される。これらの修飾は本発明で意図されるオリゴヌクレオチドの安定性および有効性を増大させる。オリゴヌクレオチド組成物は、マクロファージのエキソビボ療法または注射、吸入、局所処置または他の経路での投与によるインビボ療法に使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】血管内皮増殖因子（ＶＥｇＦ／ＶＰＦ）発現のアンチセンス阻害剤関連出願の引照この出願は、1996年４月17日付出願の係属中の米国特許出願第60／015,752号に基づく優先権を有する。連邦政府の援助による研究または開発に関する記述該当なし。発明の背景発明の分野本発明は、血管内皮増殖因子の発現のオリゴヌクレオチドによる細胞性阻害に関する。本発明のオリゴヌクレオチドは、配列特異的様式で標的ｍＲＮＡに結合し、コードされているＶＥＧＦ遺伝子の発現を防止するものと考えられる。これらのオリゴヌクレオチドの安定性および結合能率を増大させるためのオリゴヌクレオチドの化学修飾が開示される。このオリゴヌクレオチドの組成物はマクロファージのエキソビボ療法、または注射、吸入、局所処置もしくは他の経路での投与によるインビボ療法に使用できる。関連技術の説明血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)はまた血管透過性因子としても知られ、34〜46キロダルトンのサイズ範囲のホモダイマー性分泌糖タンパク質のファミリーを構成する。それは、低酸素症およびある種の調節因子に応答して、様々な細胞型により分泌される。ＶＥＧＦには４種のアイソタイプが知られている。それらは、単一の遺伝子から、ｍＲＮＡの異なるスプライシングによって生じる（Keckら，19 89；Leungら，1989；Connolly & Plander， 1989；Tischerら，1991）。ＶＥＧＦは、生育や分化過程および組織修復のための血管形成（血管新生）に必要である(Ferreraら，1996；Carmelietら，1996；Thomas，1996；Dvorakら，1 995a，b；Folkman，1995；Ferreraら，1992)。この増殖因子は血管透過性を誘導し、単球および骨芽細胞に対して走化性を有し、内皮細胞の選択的マイトゲンである。ＶＥＧＦ受容体タンパク質(ヒトでのKDRおよびFlt-1）は膜貫通性チロシンキナーゼファミリーに属する(Termanら，1992；de Vriesら，1992）。受容体の活性化は、血管内皮細胞の増殖および最終的には血管新生の速度の著しい上昇を招来するカスケード現象を開始させる。ＶＥＧＦは血管新生に関与する他のいずれのタンパク質因子よりも、内皮細胞の増殖の誘導に選択的である。残念ながら、ある条件下には、ＶＥＧＦの存在は健康に有害な作用を有する。ＶＥＧＦの異常な高濃度は、高度な血管新生もしくは血管透過性を特徴とする疾患に伴って認められる。このような疾患の例には糖尿病性網膜症、侵襲性癌、乾癬、慢性関節リウマチ、および他の炎症状態が包含される（D'Amore，1994；D vorakら，1995a，b；Folkman，1995）。ＶＥＧＦ誘発血管新生を低下させるためには、異常に高いＶＥＧＦ濃度を選択的に減少させる組成物および方法が必要である。これらの方法および組成物は、血管新生および血管透過性を特徴とする疾患の進行を遅延させるために使用することができる。ＶＥＧＦ濃度を減少させる一つの方法にはアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用がある(Wagner，1994)。この方法の重要な利点は阻害が選択的に達成できることである。有用なオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡの特異的配列に結合し、それによってコードされている遺伝子の発現を妨害するものと考えられる。タンパク質の発現低下は、リボソーム機能の阻害、翻訳可能な基質ｍＲＮＡ濃度の低下または他の機構によって生じるものと考えられる。さらにオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドによって誘発されるｍＲＮＡ分子の分解速度の上昇によってｍＲＮＡの濃度を低下させることができる。一般に、意図されたＲＮＡ標的への配列特異的結合を提供するためには、約15塩基程度のオリゴヌクレオチドで十分であるが、さらに短いオリゴヌクレオチドでも結合する場合がある(Uhlmann & Peyman，1990）。しかしながら、インビトロの実験でタンパク質の発現を低下させるためには、11〜30塩基を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが使用されている（Uhlmann & Peyman，1990の参照）。疾患の処置におけるアンチセンス処置戦略の可能な利点を実現する前に多くの障害を乗り越えなければならない。たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは大きな(約3,000〜10,000Ｄ)親水性化合物であるが、サイトゾルまたは核内のそれらの標的に結合する前に、疎水性の細胞膜を通過しなければならない（Uhlm ann & Peyman，1990；Milliganら，1993）。すなわち、ＶＥＧＦアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞膜貫通輸送を容易にする方法が必要である。治療用オリゴヌクレオチドはまた、非毒性でなければならず、正常な細胞代謝を妨害するものであってはならない。これらの非特異的作用を最小限にするため、それらは高い特異性および親和性で同種配列に結合しなければならない。天然のホスホジエステル骨格をもつオリゴヌクレオチドは血清および細胞ヌクレアーゼに高い感受性を示す。ランダムな17塩基長のオリゴヌクレオチド配列の血清内半減期は３分未満である(Bishopら，1996)。オリゴヌクレオチドの安定性を増大させることが、血管新生疾患の処置における治療剤としての使用を可能にする前に必要である。ホスホジエステル基のホスホロチオテートによる置換はオリゴヌクレオチドの半減期を増大させる。それらは化学的に不活性で、様々な化学的環境においてヌクレアーゼ耐性でなければならない。しかしながら、このようなオリゴヌクレオチドが選択的様式でＶＥＧＦの発現を阻害することは、これまで示されていない。従来知られているホスホロチオテートーオリゴヌクレオチドの一つの欠点は、それらがＶＥＧＦの発現を低下させるために１マイクロモル(μＭ)以上の濃度を要求することである(Nomuraら，1995；Robinsonら，1996)。これらの濃度では上記オリゴヌクレオチドは毒性を示し(Woolfら，1992；Stein & Cheng，1993；Ste in & Kreig，1994；Wagner，1994；Fennewaldら，1996)、観察される作用は多分、この非特異的な毒性の結果と考えられる(Fennewaldら，1995)。非毒性濃度でＶＥＧＦの発現を阻害することによる真のアンチセンス作用を表す新規なオリゴヌクレオチド阻害剤が必要である。これらのオリゴヌクレオチドは従来のＶＥＧＦアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも、それらの標的ｍＲＮＡ配列に高い会合定数および／または高い特異性を有するものと思われる。従来のＶＥＧＦアンチセンスオリゴヌクレオチドの限られた有効性についてはいくつかの説明が可能である。一つの可能性は、標的ＲＮＡ配列がオリゴヌクレオチドの結合を立体的に遮断する巨大分子構造を限定することである。たとえば、ＲＮＡ結合タンパク質およびタンパク質翻訳複合体がオリゴヌクレオチドの結合を遮断する可能性がある。また、オリゴヌクレオチドがｍＲＮＡの好ましくないコンフォーメーションに結合できない可能性もある。さらに、効率的な標的配列の位置が可変性である場合もある。有効な標的配列は標的ｍＲＮＡ転写体上のどの位置に存在してもよいが、翻訳開始コドンまたはその5'非翻訳領域に標的化されたオリゴヌクレオチドが必ずしも有効であるとは限らない(Wagnerら，1993 ；Fensterら，1994)。オリゴヌクレオチドと他分子たとえばタンパク質の間の非特異的な相互作用もまた可変性の生物活性を招く可能性がある(Woolfら,1992；Stein & Chengら，1993)。さらに、オリゴヌクレオチドはそれ自体が、期待されない位置においてＤＮＡに結合する期待されない三次または四次構造を採用する可能性もある。このような異常な結合は、望ましくない生物学的作用を生じる可能性を有する（Chaudharyら、1995）。効率的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの探索に際しては他の困難にも遭遇した。オリゴヌクレオチドのそれらのＲＮＡ標的に対する親和性は、長さおよびＧ−Ｃ含量の増大とともに上昇する。さらにオリゴヌクレオチドが長くなるほどＲＮＡ配列とオリゴヌクレオチドが非特異的に結合しやすくなる。しかも、高Ｇ含量のオリゴヌクレオチドは、Ｇ-カルテットを形成しやすく、アンチセンスの結合に要求されると思われるオリゴヌクレオチドのフリーコイル型の量を減少させる(Bishopら，1996)。すなわち、短く、それらの標的配列に対して高い親和性を有し、高Ｇ含量を有するにもかかわらずＧ−カルテットを形成しないオリゴヌクレオチドが必要である。上述のように、オリゴヌクレオチドは、サイトゾルまたは核内におけるそれらの標的に結合できる前に疎水性の細胞膜を横切らなければならない大きな親水性化合物である(Uhlmann & Peyman、1990；Milliganら，1993)。しかしながらそれらの大きなサイズ、それらの親水性の本質および陰性の電荷により、オリゴヌクレオチドは効率的に細胞膜を貫通しない。細胞取り込み促進剤の非存在下には、オリゴヌクレオチドは処理した細胞の核周辺エンドソームのコンパートメント内に蓄積する傾向がある(Fisherら，1993；Guy-Caffeyら，1995)。場合によっては、細胞質膜またはエンドソームコンパートメントの膜を通過するオリゴヌクレオチドの輸送がそれらのインターナリゼーション速度およびそれらの活性を制限する。したがって、脂質二重層を横切るオリゴヌクレオチドの速度を上昇させる新しい組成物および方法が必要である。脂質の取り込みの促進剤の一つのクラスには、核酸に結合する陽性に荷電した頭部の基、および膜成分と相互作用すると考えられる膜相互作用性の尾部が包含される。これらの組成物は、多分、細胞膜を一時的に破壊することにより、オリゴヌクレオチドの細胞への侵入を容易にするものと思われる。残念ながら多くの陽イオン性脂質調製物、たとえば、Lipofectin(登録商標)、陽イオン性脂質ＤＯＴＭＡおよび融合誘導脂質ジオレオイルホスホチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)の１：１(質量比)リポソーム混合物（Life Technologies Inc.，Gaithersbur g，MD）の活性は核酸の組成および量、標的細胞型ならびに細胞増殖培地中の血清濃度のような因子に著しく感受性である。さらに一部の調製物は、それ自体、細胞毒性を示す。これらは、動物システムにおける治療的使用のためのオリゴヌクレオチド送達物質としてのこれらの化合物の多くの有用性に厳しい制限を要求する。オリゴヌクレオチドに適合する改良された送達システムが同定されなければならない。要約すると、多くの疾患の進行はＶＥＧＦの過剰発現によって生じる血管新生および血管透過性の増大に関連する。ＶＥＧＦの発現を特異的に低下させる新しい組成物および方法がこれらの疾患の処置に有用であろうと考えられる。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置はその選択性の可能性により魅力的なアプローチである。多くの既知のＶＥＧＦアンチセンスオリゴヌクレオチドは、残念ながら、細胞に対して毒性で、非特異的作用のみを示す濃度でしか作用しない。さらに、従来のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、化学的および生物学的に不安定で、安定なほどそれらの標的配列に対する親和性は許容できないまでに低下し、それらは細胞膜を容易に透過せず、したがってそれらの生物学的標的に到達し難い。最後に、高Ｇ含量のオリゴヌクレオチドはＧ−カルテットを形成する傾向がある。非毒性であり、それらのｍＲＮＡ標的配列に対する親和性の増大した新しいアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物が要求される。これらの組成物は、ヌクレアーゼによる分解に対する耐性の増大を含めて改良された生物学的安定性を有する必要がある。さらに、有用なオリゴヌクレオチドはそれらの配列とは無関係に凝集してはならない。新しい組成物はまた、細胞膜を貫通するオリゴヌクレオチドの輸送を促進するものでなければならない。発明の概要本発明は、血管新生および血管透過性の上昇を伴う疾患の進行を遅延させる組成物および方法を提供する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物は産生細胞によるＶＥＧＦの発現を選択的に阻害する点で従来のオリゴヌクレオチドよりも著しく優れていて、それらは上述のような疾患の処置における使用が意図される。本発明の選択性はＶＥＧＦｍＲＮＡ分子に特異的に結合してＶＥＧＦの発現を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって提供される。本発明は、標的ｍＲＮＡ配列に対するそれらの親和性および特異性が増大するように化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドおよびそれらの製造および使用方法を提供する。本発明のオリゴヌクレオチドは改良された生物学的安定性およびそれらの標的配列に対する高い親和性を有する。これらのオリゴヌクレオチドは疎水性および親水性環境のいずれにおいても化学的および生物学的攻撃に比較的不活性であり、それらの配列には無関係に凝集に対して抵抗する。本発明は、有効でありかつ非毒性のＶＥＧＦアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。とくに、本発明は、１マイクロモル以下の濃度で細胞の処置に使用した場合、ＶＥＧＦの細胞産生の低下を生じる新しいオリゴヌクレオチド組成物に関する。これらの濃度において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは非毒性であり、細胞の代謝を妨害しない。本発明はまた、細胞膜を容易に透過してオリゴヌクレオチドをそれらの生物学的標的に到達させる組成物および方法を提供する。これはアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞取り込み増強剤とともに製造し、使用する方法を提供することによって達成される。細胞取り込み促進剤は、非毒性で、ＶＥＧＦアンチセンスオリゴヌクレオチドと適合性であり、細胞膜を貫通するオリゴヌクレオチドの効率的な浸透を促進する。本発明の目的では、「オリゴヌクレオチド」なる用語は、核酸ポリマーおよび核酸ポリマーに類似する化学構造を包含する。リボースもしくはデオキシリボースの均等物も、その構造に付着する塩基部分がそれらの標的配列への特異的結合に必要な水素結合を維持できる限り、その構造を置換させることができる。同様に、オリゴヌクレオチドはホスホジエステル骨格の化学的均等物たとえばホスホチオエステル結合を含有していてもよい。さらに、オリゴヌクレオチドは、化学的に修飾された塩基残基を包含してもよい。とくに、オリゴヌクレオチドには、それらに限定されるものではないが、C5−(プロピニルまたはヘキシニル)ウリジンまたはシチジン残基、6-アザーウリジンまたはシチジン残基ならびにＣ5-および6-アザの両修飾を有するピリミジンが包含される。「ＶＥＧＦ」なる用語は血管内皮増殖因子として知られたクラスのすべてのタンパク質を包含する意味である。ＶＥＧＦなる用語は、ｍＲＮＡの別個のスプライシングによって生じると考えられる少なくとも４種の既知のヒトアイソタイプ、および類似の生物学的機能を有する同族タンパク質を包含する。既知のタンパク質には本技術分野においてVEGF 206、VEGF 185、VEGF 165 およびVEGF 121として知られるｍＲＮＡ種によってコードされるタンパク質が包含される。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下のようにして調製される。約15〜30ヌクレオチド、好ましくは約19ヌクレオチドの配列がＶＥＧＦをコードするｍＲＮＡ上に同定される。ＶＥＧＦｍＲＮＡ分子の配列は、本技術分野において既知である。ＲＮＡ配列は、ＶＥＧＦタンパク質ファミリー中の任意のタンパク質をコードする任意のｍＲＮＡの任意の位置に存在することができる。ヒト VEGF 206、VEGF 185、VEGF 165、VEGF 121をコードするｍＲＮＡに相補性のアンチセンスオリゴヌクレオチドがより好ましい。ＶＥＧＦｍＲＮＡのすべてに見出される配列に結合するオリゴヌクレオチドが最も好ましい（表１参照）。一連の相補性または「アンチセンス」オリゴヌクレオチドを調製する。本発明の目的では「アンチセンス」とは、オリゴヌクレオチドがｍＲＮＡ配列に相補性の配列を有し、それらが特異的な水素結合パターンによってその配列に結合することを意味する。しかしながら、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドが１マイクロモル以下の濃度で抗ＶＥＧＦ活性を有する限りミスマッチまたは不完全な水素結合パターンをもっていてもよい。本発明において意図されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらの生物学的安定性を改良する修飾を包含する意図である。生物学的安定性は様々なまたはすべてのヌクレオチド残基の間にヌクレアーゼ耐性結合たとえばホスホロチオエート結合を導入することによって改良される。本発明のオリゴヌクレオチドはまた様々なまたはすべてのピリミジン位置に、化学的に修飾された塩基を包含する。これらの修飾された塩基は、C5−プロピニルピリミジン、C5−ヘキシニルピリミジンもしくは６−アザピリミジンまたは複合Ｃ5および６−アザピリミジン誘導体を包含し、さらに本発明のオリゴヌクレオチドを安定化できる。本発明において意図されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらの標的配列に対する結合親和性を改良する修飾を包含する。結合親和性はピリミジン塩基に様々な化学残基を導入することによって改良される。本発明のオリゴヌクレオチドには、様々なまたはすべてのピリミジン位置において化学的に修飾された塩基が包含される。これらの修飾塩基にはC5−プロピニルピリミジン、C5−ヘキシニルピリミジンまたは複合C5および６−アザピリミジン誘導体が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合は、ＶＥＧＦｍＲＮＡ上に見出される配列と同一の現実のｍＲＮＡまたは化学的に合成されたＲＮＡ配列への結合であることができる。この結合は様々な方法で証明することができる。結合を観察するための一方法を実施例IIIに記載する。この方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを同じ長さの化学的に合成されたＲＮＡ配列と混合し、アンチセンスオリゴヌクレオチドを最初の加熱および冷却工程でアニーリングさせ、加熱時の260nmにおける混合物の吸収の変化を観察することを包含する。結合はまた、他の方法たとえばヌクレアーゼ保護実験、オリゴヌクレオチド伸長実験、ＮＭＲ、ゲル電気泳動または本技術分野の熟練者によく知られた他の方法で測定することができる。本発明の目的では、「改良された結合親和性」または「安定性」はそのオリゴヌクレオチドがその標的ＲＮＡ配列でアッセイした場合、修飾のないオリゴヌクレオチドよりも高い融点（T_m）を有することを意味する。この測定には実施例・に記載するように、融点アッセイが使用される。アンチセンスオリゴヌクレオチド／ｍＲＮＡ標的配列二重鎖の結合親和性を増大させる化学修飾は、本発明による使用が意図されるものである。一般には、上述のアッセイにおいて45℃以上の T_mを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが意図される。50℃以上のT_mを有するオリゴヌクレオチドがさらに好ましい。本発明のある種のオリゴヌクレオチドは、従来知られているＶＥＧＦアンチセンスオリゴヌクレオチドに比してそれらの活性が改良された化学的修飾を包含する。改良された活性とは、インビボにおいてＶＥＧＦの発現を阻害するのに低濃度のオリゴヌクレオチドでよいことを意味する。本発明はこれらの修飾の作用様式によって限定されるものではないが、結合親和性および生物学的安定性の増大の少なくとも一部は意図された本発明のオリゴヌクレオチドの活性の増大によるものと考えられる。上に掲げた特定の化学的修飾が本発明のオリゴヌクレオチドの活性を増大させるために用いられる。本発明によって意図されるアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、約１μＭ以下の濃度で非毒性である。毒性は実施例Ｖに示す方法によって測定される。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは処置細胞におけるＶＥＧＦの産生を低下させる。一方法においては、オリゴヌクレオチドが細胞にインターナライズされ、その標的ｍＲＮＡ配列に到達できるように、細胞をオリゴヌクレオチド組成物と直接接触させることにより処置する。処置前に、オリゴヌクレオチドは液体中に溶解もしくは懸濁させるかまたは固体中に導入する。適当な液体および固体処方は本技術分野において既知であり、よく知られた方法により選択することができる。処方されたオリゴヌクレオチドを細胞と直接接触させる。他の方法では、オリゴヌクレオチドが拡散、分散または類似の様式によってそれらの標的細胞に到達できるように、処方されたオリゴヌクレオチドを配置する。本発明は、オリゴヌクレオチド処方が標的細胞と直接接触することを必ずしも要求するものではない。本発明は、オリゴヌクレオチドが標的細胞に到達することを要求するのみである。たとえば、オリゴヌクレオチドは、血流中に導入して血液から拡散させたのち、標的細胞、関節炎細胞等に到達させることができる。別法として、オリゴヌクレオチドを粉末と混合して直接皮膚に適用し、基底層の細胞に拡散させることもできる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置された細胞は、同一条件下の非処置細胞が産生するＶＥＧＦのせいぜい90％しか産生しない。この作用はオリゴヌクレオチド溶液の濃度約１マイクロモル（μＭ）以下で観察される。細胞のＶＥＧＦ産生の低下を測定する一方法を実施例VIに記載する。しかしながら、ＶＥＧＦ産生の低下の検出には、他の方法も、それらが実施例Ｖに記載の方法と同様に高感度である限り使用できる。処置細胞により産生されるＶＥＧＦの百分率は非処置細胞および処置細胞によって産生されるＶＥＧＦの量を測定することにより決定される。百分率は処置細胞によって産生される量を非処置細胞によって産生される量で除し、100倍した値に等しい。非処置細胞および処置細胞は、オリゴヌクレオチド処方の存在または不存在に関する以外はすべての点でほぼ同一に設定される。すなわち、アッセイに用いられる細胞は、同じタイプ、継代数、表現型であり、同一の増殖段階にある。細胞は、同一の培地（オリゴヌクレオチド処方自体の存在または不存在による相違を除く）、温度および気圧を含む同一の条件下で増殖させる。これらの条件下に、本発明で意図されたアンチセンスオリゴヌクレオチドによって処置された細胞は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを溶液中１μＭまでの濃度または固体処方中に使用する場合も同様のモル％で用いると、同一の非処置細胞によって産生されるＶＥＧＦのせいぜい約90％しか産生しない。好ましいオリゴヌクレオチドには、核酸分解に対するそれらの耐性を上昇させるある種の化学的修飾が導入される。これらの実施態様において意図される化学的修飾は、オリゴヌクレオチドに見出される共通の天然に起こる化学的修飾である。本発明において意図される化学部分にはホスホロチオエート結合が包含される。これらは一部またはすべてのヌクレオシド残基間に配置させることができる。最も好ましいオリゴヌクレオチドは10個のホスホロチオエートおよび８個のホスホジエステル結合を含有する。ヌクレオチド結合に加えて、塩基部分に対する化学的修飾もヌクレアーゼ分解に対する耐性を増大させる。さらに特定すれば、 C5−プロピニルまたはヘキシニル基、および／または６−アザピリジン修飾を含むピリジン環に対する修飾が意図される。ヌクレアーゼ耐性を測定する一方法には、血清中でのオリゴヌクレオチドの半減期の測定がある。これは本技術分野でよく知られた標準方法によって行われる。本発明の目的では、ある化学部分を有するオリゴヌクレオチドがその部分をもたない場合よりも長い血清中半減期を示すならば、その化学部分はヌクレアーゼによるアンチセンスオリゴヌクレオチドの分解速度を低下させる。ホスホロチオエート含有オリゴヌクレオチドは優に24時間を越える半減期を有するが、ホスホジエステル結合しか含まないそれらの同等物での血清中半減期は３時間未満である。ピリミジン環に化学的修飾を含むオリゴヌクレオチドが意図される。好ましいオリゴヌクレオチドはＣ5-プロピニルピリミジン、Ｃ5-ヘキシニルピリミジンおよび／または６−アザピリミジンを含有する。これらの修飾は、それらのT_m、生物学的安定性およびそれらの活性を増大させる。これらの修飾を含有するヌクレオチド前駆体の合成は実施例１に記載する。これらおよび他の保護ヌクレオチドからのオリゴヌクレオチドの合成は本技術分野でよく知られた標準ホスホロアミダイト化学によって行われる。本発明の一部の実施態様は、オリゴヌクレオチドの活性を改良する細胞取り込み促進組成物に関する。一般的に、これらの組成物は脂質二重層を横切る液体の輸送を促進させる。一部の実施態様においては、オリゴマーを親油性分子に共有結合で接合させる。これは、オリゴヌクレオチドの膜会合および透過性を、コレステロール、脂肪酸または他の親油性結合鎖のように改良する。これらの分子は本技術分野でよく知られた標準方法によってオリゴヌクレオチドに化学的に連結させることができる。他の実施態様においては、取り込み促進剤たとえば陽イオン性脂質またはリポソーム調製物を使用できる。これらの促進剤はその多能性により魅力的である。これらの実施態様はオリゴヌクレオチドの混合物の投与に同一の送達ビヒクルを使用できる利点がある。一実施態様はとくに、リポソーム調製物、 Cellfectin(登録商標)の使用を意図する。他の実施態様には、たとえばスペルミジン-コレステロール(SpdC)のようなポリアミノ脂質取り込み促進剤のクラスが包含される。後記化合物は、血清の存在下にもとくに良好に機能するという利点がある。細胞取り込み促進剤を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの組成物および製造方法は実施例IV、VI、およびVIIに記載する。本発明において意図される一部のオリゴヌクレオチドは塩の形態とする。塩の形態とは、オリゴヌクレオチドが陽性に荷電した（陽イオン性）原子または分子と会合している形態である。適当な陽イオンには、それらに限定されるものではないが、ナトリウム、カリウム、アンモニア、スペルミジンまたはポリアミノ脂質たとえばスペルミジン−コレステロール等が包含される。本発明において意図される一部に実施態様はリポソームを包含する。適当なリポソームは本技術分野においてよく知られている。本発明でとくに意図される一部のリポソーム組成物はCellfectin(登録商標)を包含する。他の組成物はＤＯＰＥと混合したスペルミジン−コレステロールを包含する。リポソーム調製物は本技術分野でよく知られた方法によって調製される。本発明の一部の実施態様はそのオリゴヌクレオチド組成物の持続送達システムによる送達を意図する。これは、それらに限定されるものではないが、ポリマー放出デバイスたとえばポリカプロラクトンまたはポリカプロラクトンとメトキシポリエチレングリコールの配合物が包含される。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを持続送達システムに導入するための方法および組成物は本技術分野においてよく知られている。図面の簡単な説明図１．アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成に際し、天然の塩基に代えて使用される本発明の代表的な修飾塩基。図２．５−(１−ヘキシニルまたはプロピニル)−６−アザ−2'−デオキシウリジンホスホロアミダイトの調製のための合成スキーム(図１も参照)。図３．正常ヒト培養角質細胞のＶＥＧＦ産生に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの影響。図４．角質細胞によるＶＥＧＦの発現に対してCellfectin(登録商標)とともにまたはそれを用いないで投与されたオリゴヌクレオチド（配列番号：２）の影響。図５．角質細胞によるＶＥＧＦの発現に対してCellfectin(登録商標)とともにまたはそれを用いないで投与されたオリゴヌクレオチド（配列番号：27）の影響。図６．角質細胞におけるＴ30639の活性に対する様々な細胞取り込み促進剤の影響。図７．本発明のオリゴヌクレオチド処方への細胞の短時間暴露とＥＧＦ発現の長期阻害。図８．本発明のオリゴヌクレオチド処方への細胞の短時間暴露とＶＥＧＦ発現の長期阻害。図９．本発明のオリゴヌクレオチド処方への細胞の短時間暴露とＶＥＧＦ発現の長期阻害。図10．末端修飾キメラＶＥＧＦアンチセンスオリゴヌクレオチドの、取り込み促進剤の存在または不存在下におけるＶＥＧＦ発現に対する影響。図11．ＶＥＧＦ産生におけるオリゴヌクレオチドCellfectin(１：３)処方物の影響。図12．４時間のオリゴヌクレオチド＋ｃＦ処置と、次いで通常の培地での置換の結果。図13．TO639アンチセンスのフェロセンー接合変種の協力なアンチセンス効果。図14．虹彩ベッセル濃度差異を示す。図15．低酸素チャンバー中のラット網膜のＶＥＧＦｍＲＮＡレベルを示す。好ましい実施態様の説明好ましい実施態様には、多重ＶＥＧＦコードｍＲＮＡ分子に共通な配列に結合し、インビボにおいてＶＥＧＦの発現を防止するアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。好ましいオリゴヌクレオチドは数個のホスホジエステル結合に代えてホスホロチオエート結合、およびその標的ｍＲＮＡ配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増大させる他の化学的修飾を含有する。好ましい組成物においては、オリゴヌクレオチドはそれらが細胞膜を横切る能力を改良する細胞取り込み促進剤とともに処方される。本発明のオリゴヌクレオチドの長さは約17残基〜約30残基の範囲である。好ましいオリゴヌクレオチドの長さは19個のヌクレオチドである。それらの配列はＶＥＧＦ遺伝子をコードするｍＲＮＡ分子に対するそれらの相補性に基づいて選択される。オリゴヌクレオチドに相補性のｍＲＮＡ分子の領域は標的配列と呼ばれる。好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドはVEGF 206、VEGF 185、VEGF 165 、およびVEGF 121を含む４種の既知ＶＥＧＦｍＲＮＡ分子それぞれに見出される標的配列に相補性である。標的ｍＲＮＡに対するそれらの結合親和性を改良する化学的修飾を含有するオリゴヌクレオチドが意図される。好ましいオリゴヌクレオチドはC5−プロピニルピリミジン、C5−ヘキシニルピリミジンおよび／または６−アザピリミジンを含有する。好ましい修飾は、オリゴヌクレオチドがその標的配列から解離する温度を上昇させる。これらの修飾を含有するヌクレオチド前駆体の合成は実施例Ｉに記載する。保護ヌクレオチドからのオリゴヌクレオチドの合成は標準ホスホロアミダイト化学によって行われ、本技術分野においてはよく知られている。好ましいオリゴヌクレオチドには、核酸分解に対するそれらの耐性を増大させるある種の化学的修飾が導入される。本発明はこの耐性の機構によって限定されるものではないが、化学的に修飾されたヌクレオチドはヌクレアーゼの基質結合ポケットにおけるオリゴヌクレオチド結合との干渉によってヌクレアーゼ消化に抵抗するものと考えられる。好ましいヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは少なくとも一部のヌクレオチド残基の間にホスホロチオエート結合を含有する。最も好ましいオリゴヌクレオチドは10個のホスホロチオエートおよび８個のホスホジエステル結合を含有する。好ましい組成物においては、本発明のオリゴヌクレオチドは、それらの細胞膜を通過する能力を増大させる細胞取り込み促進剤とともに処方するかにまたはそれらと混合する。本発明における使用が意図される細胞取り込み促進剤にはジオレオイルホスホチジルエタノールアミン、Cellfectin(登録商標)、スペルミジン −コレステロール等が包含される。スペルミジン−コレステロールとジオレオイルホスホチジルエタノールアミンの質量での１：１混合物が最も好ましい。この処方では、本技術分野でよく知られた標準方法に従って１マイクロモル濃度のオリゴヌクレオチドに対して 10ナノモルが混合される。本発明によって意図されるオリゴヌクレオチド組成物はそれらのインビボ活性に基づいて選択される。好ましい組成物は１マイクロモルまでのオリゴヌクレオチド濃度で実質的に細胞毒性を示さない。この測定には、実施例Ｉに記載の標準細胞毒性アッセイを用いる。この組成物はまた、１マイクロモル以下の濃度で、細胞のＶＥＧＦ産生を低下させる能力も示さなければない。本発明を以上、本発明の実施に好ましい方法からなることが見出され提案される特定の実施態様について説明した。これらの開示により、本発明で意図される範囲から逸脱することなく、例示された特定の実施態様に多くの修飾および改変が可能であることは本技術分野の熟練者には自明の通りである。このような修飾はすべて添付の請求の範囲内に包含されるものである。実施例実施例Ｉ：合成オリゴヌクレオチド中に導入するための修飾塩基の製造方法：合成オリゴヌクレオチドの結合親和性および／または特異性を増大させる修飾塩基は図１に示す。５−(１−ヘキシニルまたはプロピニル)−６−アザ−2'−デオキシウリジンホスホロアミダイトの製造のための合成スキームを図２に示す。この合成では6-アザ−Ｕを包含するアンチセンスオリゴヌクレオチドの製造用ブロックの構築が提供される。同様のスキームが６−アザ-Ｃの合成にも使用された。５−(１−ヘキシニル)−６−アザ−2'−デオキシウリジンホスホロアミダイトの製造のための詳細な合成方法を以下に記載する。５−ヨード誘導体７に出発し、同様の様式で５−プロピニル誘導体も製造された。3',5' −ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−５−ヨード-6-アザ−2'−デオキシウリジン（ 7a）：５−ヨード-6-アザウラシル(5.8ｇ、33.47mmol)の1,1,1,3,3,3−ヘキサメチルジシラザン(ＨＭＤＳ、80ml)中懸濁液に0.5mlのクロロトリメチルシランを加え、混合物を還流下に６時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、真空中でＨＭＤＳを蒸発させた。残留物を高真空下に４時間乾燥した。乾燥したシリル誘導体をジクロロメタン(60ml)に溶解した。１−クロロ−２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ −ｐ−トルオイル−ｂ−Ｄ−エリスローペントフラノース（６;16.3g、42mmol）および塩化亜鉛（0.46g、3.35mmol）を上記溶液に加え、混合物をアルゴン雰囲気下に24時間撹拌した。反応混合物をジクロロメタン(250ml)で希釈し、ジクロロメタン溶液を飽和NaHCO₃水溶液(100ml)で洗浄した。水層をジクロロメタン(４ ×100ml)で抽出し、有機層を合わせて乾燥し(Na₂SO₄)、蒸発させた。残留物をシリカゲルカラム(４×15cm)クロマトグラフィーにより精製し、生成物を０〜５％メタノール含有ジクロロメタンに溶出した。乾燥したアノマー生成物の重量は15 ｇである。純粋なｂ−アノマーはジクロロメタンとメタノールの混合物(４：１、200ml)と磨砕すると得られた。固体をろ過し、ついで蒸発させて集めた。この磨砕過程を繰り返すと純粋なｂ−アノマー10.5 3',5' −ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−５−(１−ヘキシニル)−６−アザ−2' −デオキシウリジン（8a）： 3',5'−ジトルオイル−５−ヨード−６−アザ−2'−デオキシウリジン(7、3.8 4ｇ、6.5mmol)を乾燥ＤＭＦ(25ml)と共蒸発させて乾燥し、ＤＭＦ（30ml）に溶解し、これにCuI(0.25ｇ、1.3mmol)、トリエチルアミン(1.82ml、1.3mmol)、1- ヘキシン(2.23ml、19.5mmol)およびテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0.75ｇ、0.65mmol)をアルゴン雰囲気下に加えた。反応混合物を室温で18時間撹拌し、さらに0.5ｇのテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウムを添加した。48時間後に溶媒を蒸発させ、残留物をトルエンとともに共蒸発させた。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、生成物を０〜５％酢酸エチル含有ジクロロメタンに溶出すると、標記化合物0.9ｇが生成した。融点：198〜６−アザ−５−(１−ヘキシニル)−2'−デオキシウリジン（9a）： 3',5'−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−５−(１−ヘキシニル)−2'−デオキシウリジン(8a、0.8ｇ、1.47mmol)、メタノール(55ml)およびナトリウムメトキシド（メタノール中25％溶液、1.28ml）の混合物を室温で２時間撹拌した。Dowex 50X8 （H⁺）樹脂の添加により反応を鎮めた。樹脂をろ過して除去し、ろ液を蒸発させた。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、溶出液として０〜４％メタノール含有ジクロロメタンを用いて精製すると、標記化合物0.38ｇ（84％）が著しく吸湿性の固体として生 5' −Ｏ−(4,4'−ジメトキシトリチル)−６−アザ−５−(１−ヘキシニル)−2'− デオキシウリジン（10a）：５−(１−ヘキシニル)−６−アザ−2'−デオキシウリジン（0.38g、1.24mmol ）の乾燥ピリジン（10ml）中溶液に、4,4'−ジメトキシトリチルクロリド（0.51 ｇ、1.5ml）を加えた。６時間撹拌したのち、さらに0.5ｇのDMT−Clを加え、反応混合物を一夜撹拌した。反応混合物をジクロロメタン(100ml)に希釈し、有機溶液を水(20ml)で洗浄した。水層をジクロロメタンで抽出し、有機層を合わせて乾燥し（Na₂SO₄）、蒸発させた。残留物をトルエン（10ml）と共蒸発させ、シリカゲルカラム（２×10cm）上クロマトグラフィーにより精製した。生成物は０〜 1.5％メタノール含有 5' −Ｏ−(4,4'−ジメトキシトリチル)−６−アザ−５−(１−ヘキシニル)−2'− デオキシウリジン−3'−Ｏ−(２−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルホスホロアミダイト（11a）： 5'−Ｏ−(4,4'−ジメトキシトリチル)−６−アザ−５−(１−ヘキシニル)−2'−デオキシウリジン（10a）をジクロロメタン中N,N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下に２−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトとよく知られた方法で反応させると、ホスホロアミダイト（11a）が得られた。実施例II ：オリゴヌクレオチドの設計および合成：ＶＥＧＦｍＲＮＡのすべてのスプライス変異体に共通する相補性ｍＲＮＡ標的配列に結合できるアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を選択した。合成オリゴヌクレオチド配列の例を表１に示す。ｍＲＮＡ標的に対するそれらの結合親和性を改良するために、図１に示すようなC5−プロピニルまたはC5−ヘキシニル基を有するピリミジンでオリゴヌクレオチドを合成した(Wagnerら、1993)。他の修飾塩基たとえば６−アザ−dＵおよび６−アザ−dＣも意図された（図２）。これらの修飾の組み合わせも意図された。アンチセンスオリゴヌクレオチドＴ30639(配列番号：２)に相補性のオリゴヌクレオチドＴ30691(配列番号：27)を以下の実験では対照として用いた。それはＴ30639(配列番号：２)と同一のサイズで同一の骨格および塩基修飾を含有した。実施例III ：アンチセンスオリゴヌクレオチド−ＲＮＡヘテロ二重鎖相互作用のT_m分析：アンチセンスオリゴヌクレオチドＲＮＡ二重鎖の温度（T_m）を結合親和性の評価に使用した。T_mは温度制御セルホルダー（Hewlett Packard 8452型）を装着したダイオードアレイスペクトロホトメーターで測定した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを同じサイズの合成ＲＮＡ標的（それぞれ１μＭ）と２ｍＭリン酸ナトリウム、pH7.0、18mM NaCl、および１mM ＥＤＴＡからなる緩衝液中で混合した。スペクトロホトメーターのセル中で調製した溶液を90℃に10分間加熱し、10分を要して20℃に冷却し、ついで10分間平衡化して二重鎖を形成させた。二重鎖の融点（T_m）の測定には、セルを１℃／分の速度で20℃から80℃に徐々に加熱し、260nmにおける吸収を温度の関数として測定した。吸収における増大は二重鎖の融解もしくは一本鎖オリゴマーへの分離のシグナルである。二重鎖形成のT_mは融解曲線のデータから、標準方法で記載される式（Puglisi & Tinoco，1989）を用いて得られた。T_mのデータは表２に示す。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドへのC5−プロピン修飾塩基またはC5−ヘキシニル修飾塩基の導入は、非修飾オリゴヌクレオチドに比べてT_m値の著しい上昇を招来した。これはアンチセンスオリゴヌクレオチドのその標的配列に対する親和性の有意な改良を指示した。実施例IV：取り込み促進剤の調製：補助剤を用いない場合のアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞による取り込みは低かった（Fisher，1993；Guy-Caffeyら，1995）。細胞への浸透を改良するためには、多くの市販の取り込み促進剤ならびに本発明者らによって合成された新規なポリアミノ脂質の処方物が使用される(Gaoら，1989；Guy-Caffeyら，1995 )。実施例Ｖ：細胞毒性アッセイ：細胞を96ウエルプレートに500細胞/ウエルの密度で接種した。１日プレーティングしたのち、細胞を系列希釈したオリゴヌクレオチド処方物（各希釈あたり４ウエル）に暴露した。１〜４日間の暴露ののち、細胞の生存能に対する作用を非放射性アッセイ系（Cell Titer 96水性細胞増殖アッセイ、Promega Corp.）によって測定した。本発明のオリゴヌクレオチドは１μＭ以下の濃度の場合に、毒性を示さないことが観察された。実施例VI ：オリゴヌクレオチドの細胞試験：アンチセンスオリゴヌクレオチド、それらの修飾等価物、および様々な処方物の活性を、正常培養条件下にＶＥＧＦを分泌する一次細胞系の培養ヒト角質細胞を用いて評価した（Ballaunら，1995；Frankら，1995）。細胞を48−ウエルプレートに50〜100,000細胞／ウエル/0.5ml ＫＧＭ培地(Clonetics)の密度でプレーティングした。細胞上清におけるＶＥＧＦタンパク質レベルの測定には、感受性ＥＬＩＳＡ-ベースのタンパク質アッセイ系（R & Ｄ Systems）を使用した。予備的な測定によって、ＮＨＥＫ細胞を推薦培地中で増殖させた場合に、0.5mlの培地中にプレーティングした50,000細胞が15時間内にＶＥＧＦ約150〜200pg(すなわち、非処置対照ウエルの上清における300〜400pg／ml)を産生することが示された。細胞はまた、オリゴヌクレオチド処方物とともに15時間インキュベートした。４種の抗-ＶＥＧＦオリゴヌクレオチド中の３種が10μｇ／mlのCel1fectin(登録商標)の存在下に、0.2μＭの範囲で活性を示す。対照のセンスオリゴヌクレオチドは作用を示さなかった（示していない）。結果は図３に示す。アンチセンス作用の評価のためには、オリゴヌクレオチドを取り込み促進剤の存在下または不存在下に細胞に投与した。予備実験では、塩基修飾のないホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが１μＭ以下の濃度で有効であり、担体の不存在下には有意な作用は観察されなかった（データは示していない）。１μＭ以上の濃度では、オリゴヌクレオチドはＶＥＧＦの発現を非特異的に阻害する傾向を示した（データは示していない）。これらの非特異的作用は本技術分野において知られている(Steinら，1993；Wagner，1994）。これらの非特異的作用を回避するため、オリゴヌクレオチドを取り込み促進剤と混合した。Cellfectin(登録商標)、テトラパルミチルスペルミン（Ｔ_M−ＴＰＳ）とジオレオイルホスホチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のリポソーム調製物（Ｔ_M−ＴＰＳ/ＤＯＰＥ、質量比１：1.5、Life Technologies，Inc.）は試験した他の市販送達物質よりも有効で、毒性が低かった。ポリアミノ脂質ＳｐｄＣのリポソーム調製物（Guy-Caff eyら，1995；ＳｐｄＣ／ＤＯＰＥ、質量比１：１）と処方したオリゴヌクレオチドはより有効であった。典型的な細胞培養実験では、オリゴヌクレオチド（１μ Ｍに10nM）を取り込み促進剤の水溶液約20〜40μｌの水に室温で溶解し、約10分間インキュベートした。その溶液を温い増殖培地0.5mlと混合し、細胞に加えた。細胞をオリゴヌクレオチドの存在下に15時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を集め、直ちにＥＬＩＳＡに使用するかまたは以後の分析まで−80℃に保存した（凍結しなかった上清サンプルと凍結解凍した上清サンプルの間にＶＥＧＦレベルの有意な差は認められなかった）。図４に示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドＴ30639 （配列番号：２）は、Cellfectin(登録商標)の存在下さらに高い活性を示したが、対照の「センス」オリゴヌクレオチドＴ30691(配列番号：27)は図５に示すように、用いた最高濃度を除いてほとんど作用はなかった。図６は、0.1μＭまたは0.2μＭのオリゴヌクレオチド(配列番号：２)を様々の陽イオン性脂質処方物SpdC、スペルミジンーコレステロール（Guy-Caffeyら，19 95）；ＤＣ-Chol（Gao & Huang，1991）；ＣＳすなわちコール酸−スペルミジン；ＤＣＳ、デオキシコーレート−スペルミジン；cＦ、Cellfectin(登録商標、Li fe Technologies，Inc.）とともに投与した場合の効果を示す。各陽イオン性脂質のリポソーム調製物は融合誘導脂質ＤＯＰＥ（質量比１：１）と混合して調製し、使用時まで凍結乾燥して保存した。リポソームは使用前に５％デキストロースに再懸濁し（ｌmg／mlまで）４℃で保存し、２週間以内に使用した。オリゴヌクレオチドは上述のように、細胞処置の直前に陽イオン性リポソーム調製物と混合した。図７〜９は、様々な濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドＴ30639（配列番号：２）またはそのキメラホスホジエステル-ホスホロチオエート変異体Ｔ30848 （配列番号：６、表１参照）との細胞インキュベーションの結果を示す。図７は 0.1μＭオリゴヌクレオチドの作用を、図８は0.2μＭオリゴヌクレオチドの作用を、図９は0.4μＭオリゴヌクレオチドの作用を示す。いずれの実験でも、細胞は、予めＳｐｄＣ／ＤＯＰＥと混合したアンチセンスオリゴヌクレオチドを補充した培地中で４時間処置した。ついで培地を新鮮な非補充培地で置換した。グラフ１は、培養液からオリゴヌクレオチド組成物を洗い流したのち16時間のＶＥＧＦ産生の％阻害率、グラフ２はオリゴヌクレオチドを洗い流したのち40時間、グラフ３はオリゴヌクレオチドを洗い流したのち64時間の阻害率を示す。次に、収穫された培地中のＶＥＧＦレベルの量を測定した。約３日間のインキュベーションの終了時における細胞の形態は正常であった。ＶＥＧＦ産生に対するオリゴヌクレオチドの長期間作用を図７〜９に掲げる。グラフ中、記号(Δ)は0.1μＭのＴ30848(配列番号：６)を示す。記号（）は0.1μＭのＴ30639（配列番号：２）についてのものである。図10は親油性の基で誘導体化したオリゴヌクレオチドによる同様の実験の結果を示す。Ｓ96-5296（配列番号：20）は3'末端をＣ−16脂質基で修飾し、８個のホスホジエステルおよび11個のホスホロチオエート結合を含有する。Ｓ96−5297 （配列番号：21）は同一の骨格を有し、3'−ピレン部分で末端修飾されている。これらの疎水性部分は、Cellfectin（登録商標）と混合した場合に、オリゴヌクレオチドの取り込みおよび活性を補助し、ホスホジエステル結合はオリゴヌクレオチドの活性を増大させる。記号（）はＳ96-5296（配列番号：20）を、記号（）はＳ96-5296（配列番号：20）と10μｇ／mlのCellfectin（登録商標）、記号（○）はＳ96-5297（配列番号：21）、記号（●）はＳ96-5297（配列番号：21）と10μｇ／mlのCellfectin(登録商標)、記号（□）は0.2μＭのＴ30639（配列番号：２）と10μｇ／mlのCellfectin（登録商標）を示す。実施例VII ：アンチセンスオリゴヌクレオチドの抗-ＶＥＧＦ活性：塩基修飾のないホスホロチオエート含有アンチセンスオリゴヌクレオチドは、濃度１μＭ以上における配列非依存性非特異的阻害（データは示していない）を除いて、細胞のＶＥＧＦの産生には有意な影響は与えないように思われた。これらの結果は、単純なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの低い、マイクロモル以下の用量が阻害剤としては無効であり、高レベルにおいては同一のオリゴヌクレオチドが細胞代謝に非特異的な作用を発揮することを示す他の研究の結果と一致した（Stein & Cheng，1993;Wagner、1994参照）。しかしながら、C5−プロピン含有ピリミジンを含むホスホロチオエート含有オリゴヌクレオチドは、ＶＥＧＦの細胞産生を特異的に阻害する（Wagner，1993）。図３参照。これらの修飾オリゴヌクレオチドは、それらの非修飾等価物よりも約15℃高い融点を有する。表２参照。これは、修飾オリゴヌクレオチドがそれらの標的に、非修飾型よりも高い親和性で結合することを示唆する。オリゴヌクレオチドとCellfectin(登録商標)の至適比：オリゴヌクレオチド− 陽イオン性脂質混合物の細胞取り込みを一部は処方物中の各成分の化学的性質により、一部はそれらの濃度および相対質量比により、また標的細胞のエンドサイトーシスの性質により測定した。ＮＨＥＫ細胞にオリゴヌクレオチドＴ30639(配列番号：２)をオリゴヌクレオチドとＴＭＴＰＳ１：３(質量比)の比で共投与すると至適な活性を生じた。関連実験では、オリゴヌクレオチドの濃度は変化させたが、オリゴヌクレオチドと陽イオン性脂質の比は維持して、ＶＥＧＦ発現に対する作用を「センス」対照Ｔ30691(配列番号：27)と比較して測定した。オリゴヌクレオチドＴ30639(配列番号：２)は特異的抗-ＶＥＧＦ活性を示したが、対照オリゴヌクレオチドは全く作用を示さなかった（図４、５参照）。スペルミジンーコレステロール＋ＤＯＰＥもしくはＤＣ-chol＋ＤＯＰＥ（リポソーム調製物；１：１重量比）の処方物のオリゴヌクレオチドの効率に対する作用：多数の取り込み促進剤が核酸治療剤とともに使用されている（Behr，1994；Guy-Caffeyら，1995；Lewisら，1996）。これらの化合物の１つは、スペルミジン−コレステロール接合体（ＳｐｄＣ）であった（Guy-Caff eyら，1995）。この化合物は、本発明により要求されるよりもはるかに高い濃度で細胞に非毒性であり、１週間までの処置では囓歯類に非毒性であった。他の陽イオン性脂質、ＤＣ−Chol（Gao & Huang，1991）は遺伝子療法における治療的使用が承認され、細胞系で比較的に非毒性であった。ＳｐｄＣ／ＤＯＰＥおよびＤＣ−Chol／ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスホチジルコリンとＳｐｄＣまたはＤＣ −Chol）の質量比１：0,5、１：１、１：1.5および１：２の範囲内でのリポソーム調製物の試験では、１：１の比がＮＨＥＫ細胞での抗−ＶＥＧＦアッセイにおいて最も有効であるようにみえる。図５参照。陽イオン性試薬との組成物は、Ce llfectin（登録商標）との組成物よりも20〜40％活性であるようにみえる（図６）。オリゴヌクレオチド処方物への短期間暴露するとＶＥＧＦ産生に対する長期阻害作用を観察するのに十分である：ＶＥＧＦの発現は本発明において開示された組成物への比較的短期間の暴露で低下した。たとえば４時間のインキュベーションで、オリゴヌクレオチドに一夜暴露した場合に観察されたよりも、高い抗−ＶＥＧＦ活性を示した。図７〜９参照。他の実験では、混合ホスホロチオエートーホスホジエステルキメラ骨格を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドがＶＥＧＦ発現の強力な阻害剤であることが示された。とくに、10個のホスホロチオエートおよび８個のホスホジエステル結合を含有するキメラ変異体、Ｔ30639(配列番号：２)、ならびに脂質末端修飾Ｓ9 6-5296(配列番号：20)とＳ96-5297(配列番号：21)は、ＳｐｄＣ/ＤＯＰＥの存在下に優れた活性を示した（図７）。ＶＥＧＦの阻害は４時間のみのインキュベーション後にも３日間にわたって持続した（図７）。ＳｐｄＣの不存在下にはキメラオリゴヌクレオチド骨格はＶＥＧＦの発現に影響しない。すなわち、ホスホロチオエート結合の少ないほど、オリゴヌクレオチドでは効果が改良され、非特異的作用は低下するものと思われる。オリゴヌクレオチドの効率には取り込みが重要であるように思われる。実施例VIII ：インビボＶＥＧＦ阻害：Ａ．特定の目的血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現の増大は、増殖性糖尿病網膜症、血管新生緑内障、および他の多くの失明状態に伴う眼内血管新生の進行と関連づけられてきた。網膜の虚血は血管新生促進タンパク質、ＶＥＧＦ合成の増大を招来し、これが血管内皮細胞の増殖を誘導し、網膜、視神経および虹彩内に異常に多数の血管の形成を生じる。しかしながら、この状態の承認された治療的処置はまだない。本発明者らの総合的な目的は、ヒトにおける網膜虚血に伴う血管新生の処置の目的で、ＶＥＧＦ発現の新規で強力な治療的アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤を同定するための合理的な設計および試験操作を適用することにある。本発明者らの最近のヒト細胞培養系におけるインビトロデータは、マイクロモル以下の濃度範囲でＶＥＧＦの細胞性発現を50％以上阻害する特異的なオリゴヌクレオチドを調製できることを指示している。この提案での本発明者らの最終目的は本発明者らのインビトロ所見をＶＥＧＦに伴う血管新生のラットモデルに拡大させることである。本発明者らの特定の目的は：１．ラットＶＥＧＦｍＲＮＡに対して向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの「ライブラリー」を合成する。ＶＥＧＦには、３種の主要なおよび１種の副次的なスプライシング変異体がある。10個のオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡの共通領域における配列に標的化される。それらはまたヌクレアーゼ耐性骨格と標的ｍＲＮＡに対する結合親和性を改良する修飾塩基を含有する。２．アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそれらの処方物の活性および毒性を評価するためのラット細胞単層および球状モデルを確立する。C6グリオーマ細胞系は、ＶＥＧＦ機能の研究に広く用いられてきたことから、このために使用される。球状モデル（細胞塊）は本発明のオリゴヌクレオチドが細胞層を透過するか否かの評価に有用である。３．様々な細胞取り込み促進剤を用いオリゴヌクレオチドの効率を評価する。 Aronexで開発された化合物は市販品に匹敵する。４．アンチセンスの機構を支持するデータを得るための概念証明アッセイを開発する。このインビトロ実験は、本発明のオリゴヌクレオチドが実際に予測された様式で作用するか否かの疑問に答えるため、ＶＥＧＦのただ１種のアイソタイプを特異的に標的にできるかどうかを試験するために設計される。これはアンチセンスオリゴヌクレオチドの将来の設計の補助になる。５．最も有望なアンチセンス化合物の試験のための、虹彩血管新生のインビボラットモデルを使用する。これらの研究はHarvardのAnthony Adamis博士との共同で実施される。提案された研究が完了すると、１〜２オリゴヌクレオチドのインビボ効果について、定量的情報が得られるものと期待される。用量、可能性のある作用機構、細胞の利用性、および毒性の可能性についての一部の情報も得られると考えられる。オリゴヌクレオチドのいずれかが、血管新生および／またはＶＥＧＦ発現をインビボで20％低下させた場合、これをプラスの展開とみなし、研究の相11の時点での動物モデルにおけるさらに詳細な試験を進める。オリゴヌクレオチドの選択により、他のＲＮＡへの非特異的結合の危険が容認できない程高くなり、高Ｇ含量の配列の選択が望ましくないＧカルテットの形成を招来して、それが結合に用いられるフリーコイル型の利用性を低下させることになる(Bishopら，1996)。本発明者らがその採用を提案する別個のアプローチでは、C5−プロピニルピリミジンを含有する修飾オリゴヌクレオチド、すなわち有意な毒性を示さずに極めて効率的な結合を導く修飾を選択的に使用する（Wagner ら，1993；Fensterら，1994）。本発明者らは最近、プロピニル修飾がとくに良好に作用すると思われることを示した（予備試験結果を参照）。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を改良するアプローチ：天然のホスホジエステル骨格を有するオリゴヌクレオチドは血清および細胞ヌクレアーゼに極めて感受性である。本発明者らは、ランダム配列の17塩基オリゴヌクレオチドが血清中では、３分未満の半減期しかもたないことを示した（Bishopら，1996）。ホスホロチオエート骨格をもつオリゴマーを用いた別のアプローチでは(Steinら，1991)、修飾はオリゴヌクレオチドの血清半減期を１日またはそれ以上に著しく改良する。ホスホロチオエート結合の使用は高レベルでのある非特異的作用を招くと考えられているが、以下に述べるように、本発明者らは極めて低濃度で作用し、したがって、非特異的相互作用の危険が低下した特異的に修飾されたオリゴヌクレオチドの合成を提案する。別の骨格を有するオリゴヌクレオチドについても試験したが、すべて、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドよりも、はるかに高い非特異的作用をもっていた。オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを改良するアプローチ：細胞下分布の研究では、蛍光で処置した細胞で、オリゴヌクレオチドが核周辺のエンドソームコンパートメントに蓄積することを示している（Guy-Caffeyら， 1995）。インターナリゼーション過程における律速工程は原形質膜もしくはエンドソームコンパートメントの膜を通過するオリゴヌクレオチドの輸送であるように思われる。膜の脂質二重層を横切るオリゴヌクレオチドの輸送を増強するには２つの方法の可能性がある。第１のアプローチでは、オリゴマーをその膜への会合および透過性を改良する化合物に共有結合で接合させる、たとえばコレステロールに接合させる(Letsingerら,1989)。本発明者らは最近、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効率を著しく改善すると考えられる新規な特有の修飾、親油性フェロセン結合鎖を同定した（実験的設計の項参照）。別の取り込み促進剤たとえば陽イオン性脂質またはリポソーム調製物も使用できる。これらの剤はその多様性により魅力的であり、すなわち同一の送達ビヒクルが、様々なオリゴヌクレオチドと共投与できる。これらの陽イオン性脂質の設計には、核酸に結合する陽性に荷電した頭部基、ならびに融合誘導脂質との相互作用および／または細胞膜の不安定化を与える膜相互作用を有する尾部を導入する。多くの陽イオン性脂質調製物（たとえばLipofectin）の活性は、核酸の組成および量、細胞型、および細胞増殖培地中の血清濃度のような因子によって影響される。さらに、一部の調製物は細胞毒性を示す。これらは動物システムにおける治療用オリゴヌクレオチドの送達剤としての上記化合物の有用性に著しい制限を付与し、有効な取り込み促進剤に対する多大な要求がされている。本発明者らは、血清の存在下でもオリゴヌクレオチドの細胞取り込みならびに膜透過性を改良する新規な送達ビヒクル、スペルミジン−コレステロール(ＳｐｄＣ)を合成した(Guy-Caffeyら、1995)。この化合物を用いた処方物は提案された研究の一部として評価される。本発明者らの目的は眼の細胞によるＶＥＧＦの発現を阻害し、同時に疾患関連血管新生を低下させるアンチセンス処方物を同定することである。この研究は化学的に修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドがマイクロモル以下の用量で、強力な阻害活性をもつことができるとの最近の本発明者らの発見によって促進された。さらに、Adamis博士によるＶＥＧＦ関連血管新生の動物モデルの開発がインビボで最も有効な化合物の試験を可能にする。予備的結果：要約：本発明者らの予備的な進行中の一連の実験の目的はＶＥＧＦ発現の細胞ベースのモデルにおいてアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性を改良するための一般的原理およびアプローチの発見および／または試験であった。まず第１に本発明者らの目的は：・ＶＥＧＦタンパク質レベルに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用を測定するための、定量的な細胞ベースのスクリーニングアッセイの開発、・標的ｍＲＮＡに対する改良された結合親和性、ヌクレアーゼ耐性の増大および特異性の増大をもたらす構造修飾を含有するオリゴヌクレオチドの合成、・投与されたオリゴヌクレオチドの細胞インターナリゼーションおよび膜透過性を増大させる新規な取り込み促進剤（一部はAronexで開発された）を用いた処方物の試験であった。オリゴヌクレオチドの設計：本発明の化合物は、最終的にはヒトで試験されることを期待したので、この作業はヒトＶＥＧＦｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて開始した。発現の最大阻害を達成するために、本発明者らは４種すべてのＶＥＧＦｍＲＮＡによって共有される配列に相補性のアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択した（表３）。表３：ヒトＶＥＧＦに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドアンチセンスオリゴヌクレオチド：（ｍＲＮＡ配列：57における開始ＡＵＧコドン）ヌクレアーゼ耐性を付与する総ホスホロチオエート（^*）骨格ＲＮＡ標的に対する結合親和性を改良するＣ-5プロピニルピリミジン初期の報告（Wagnerら，1993）と一致して、本発明者らは、Ｃ−５プロピニルピリミジンの塩基置換が鎖相互の親和性のインディケーターである二重鎖形成の T_mを非修飾オリゴヌクレオチドの−60℃から80℃以上に上昇させることを見出した。対照として用いるために、本発明者らは、同一のサイズおよび修飾を有する「センス」オリゴヌクレオチド、Ｔ30691を合成した。オリゴヌクレオチドの細胞試験：アンチセンスオリゴヌクレオチド、それらの修飾同価物および様々な処方物の活性を、ＶＥＧＦを分泌する一次細胞系の培養ヒト角質細胞を用いて評価した。細胞は0.5mlのＫＧＭ培地（Clonetics）中46ウエルプレートに50,000細胞／ウエルの密度でプレーティングした。増殖培地中に分泌されたＶＥＧＦのレベルを固相酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)によって測定した（R & D Systems）。アッセイは５〜1000pg／mlの範囲にわたり直線性を示した。本発明者らの測定ではＮＨＥＫ細胞を推薦培地中で増殖させた場合、0.5ml の培地中にプレーティングした100、000細胞から15時間で約150pgのＶＥＧＦが産生した（非処置対照の上清では約300pg/ml）。大部分の細胞ベースのアッセイは細胞への遺伝子送達用のトランスフェクション剤として市販されている市販の陽イオン性リポソーム処方物（Cellfectin、Li feTechnologies）を用いて行った。他の市販トランスフェクション剤調製物は毒性を示すかまたは比較的に効果がなかった（７種について試験した）。Cellfect inは対照として単独で細胞に投与した場合、実際にＶＥＧＦの産生を上昇させるという奇妙な作用が認められた。この理由は不明である。さらに最近では本発明者らはスペルミジン−コレステロールの処方物（Guy-Caffeyら、1995）を使用し始めた。極めて初期の実験では、C5−プロピニル修飾のないホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ＶＥＧＦレベルには全く作用がないことを観察した（取り込み促進剤の存在下または不存在下に細胞外濃度５μＭまで）。さらに高い濃度では、非特異的阻害と思われる阻害が軽度に認められた（データは示していない）。シトシンおよびチミジンをC5−プロピン含有ピリミジンで置換した場合には（Wagnerら，1993）、インビボで測定したＴmに20℃の改善が認められ、そのオリゴヌクレオチドが非修飾変異体（データは示していない）に比し、はるかに高い親和性でその合成ＲＮＡ標的に結合できることを指示した。本発明者らは至適な処方物の同定を目指し、これらのオリゴヌクレオチドの作用を取り込み促進剤の存在下または不存在下に、また取り込み促進剤とオリゴヌクレオチドの比を様々に変動させて試験した。本発明者らはオリゴヌクレオチドが異なるとＶＥＧＦレベルに対する作用も異なることを観察した。図３は、４種のオリゴヌクレオチド中の３種が、10μｇ/mlのCellfectinの存在下に0.2μＭの範囲において活性を有することを示す。対照のセンスオリゴヌクレオチドは作用を示さなかった（示していない）。最も強力な試験オリゴヌクレオチドのＴ30639を以後の至適化試験に使用した。オリゴヌクレオチドと取り込み促進剤の至適比：追跡実験において、本発明者らはオリゴヌクレオチド（Ｔ30639アンチセンスおよびＴ30691センス対照）とｃＦの陽イオン性脂質成分の比を１：３質量比に維持し、ＶＥＧＦ産生に対する作用を測定した。この場合も、Ｔ30639＋ｃＦは特異的な抗-ＶＥＧＦ活性を示したが、対照オリゴヌクレオチドは作用を示さなかった（図11）。高濃度では、非特異的作用が現れた（示していない）。本発明者らは結合物質から遊離の取り込み促進剤を分離する試みは行わなかったことに注目することが重要である。これは互いの相対比を変化させた場合に多分、実際に起こっているものと思われる。オリゴヌクレオチドのサイズの影響：次の実験では、特異的な抗−ＶＥＧＦ活性を維持しながらオリゴヌクレオチドのサイズを低下させることが可能か否かを調べた。オリゴマーが短くなるほど合成もより安価になる。しかしながら、同じＮＨＥＫアッセイを用い、すべてのオリゴヌクレオチドを10μｇ／mlのCellfect inとともに投与して、19−塩基のオリゴヌクレオチドが16または14塩基の誘導体よりも効率的であることを見出した。Cellfectinとオリゴヌクレオチドの比の変化は比活性を変えなかった（示していない）。スペルミジン-コレステロール＋ＤＯＰＥもしくはＤＣ-chol＋ＤＯＰＥ（リポソーム調製物；重量比1:1）の処方物のオリゴヌクレオチド効率に対する作用：最近、本発明者らは、長時間の暴露後に、細胞にある程度の毒性を示すCellfect inの代替物の探索を開始した。１種の取り込み促進剤、スペルミジン-コレステロール接合体（ＳｐｄＣ；Guy-Caffeyら，1995）は使用されるレベルで細胞に毒性を示さないことが見出され、１週間まで処置された囓歯類に毒性は検出されなかった。陽イオン性脂質ＤＣ-Chol （Gaoら、1991）は遺伝子治療の臨床試験用に承認され、細胞系で毒性は極めて低かった。予備的試験のデータはこれらの新規な脂質の処方物が、平行した実験において、Cellfectin（登録商標）の場合よりも20〜40％強力であることを指示した。オリゴヌクレオチド処方物への短期間暴露するとＶＥＧＦ産生に対する長期阻害作用を観察するのに十分である：上記実験のすべてで、本発明者らは細胞をオリゴヌクレオチド十取り込み促進剤と一夜インキュベートした。そして、細胞のさらに短時間のオリゴヌクレオチドへの暴露でも、同レベルの抗−ＶＥＧＦ活性が達成されるかどうかを調べた。実際、４時間後に洗浄して新鮮な非補充培地に戻した場合、抗−ＶＥＧＦ活性が低下することはなかった（図12）。しかも、この作用は３日間まで（実験期間）持続した。図12は４時間のオリゴヌクレオチド＋ｃＦ処置、ついで通常の培地での置換の結果である。阻害はほぼ３日間続いた。対照のセンスヌクレオチドによる有意な阻害は認められなかった（示していない）。実際、対照（オリゴヌクレオチドなし）についての阻害のレベルは従来観察されている阻害よりも現実にはるかに大であった。この理由の一つは、単一のインキュベーション実験では、前から存在した（センスオリゴマーによってまだ阻害されていない）ｍＲＮＡからＶＥＧＦタンパク質が合成され培地中に蓄積が続くことである。培地を４時間の時点で置換することにより、この起源になる「バックグランド」ＶＥＧＦを消失させた。これらのデータは長期間のアンチセンス作用が薬剤の頻繁な投与を要しないことを示唆するので、インビボ試験系では重要な意味がある。この局面は、提案されたインビトロおよびインビボアッセイにおいてチェックされることになる。フェロセン-接合オリゴヌクレオチド：本発明者らは最近、メタロセンで修飾されたオリゴヌクレオチドの取り込み促進剤との処方物が本発明のインビトロアッセイにおいて最も有効なＶＥＧＦ阻害剤であり、使用される濃度範囲でほとんど毒性はないことを発見した（図13）。Cellfectinと処方されたオリゴヌクレオチドは抗-ＶＥＧＦ比活性20μＭ濃度を有する。フェロセン結合鎖はオリゴヌクレオチドの膜会合を改良するために設計された(D．Mulvey，Aronex，私信)。さらに本発明者らは親油性の鉄部分が多分、細胞の活性輸送系を利用することにより、オリゴヌクレオチドの細胞標的化および膜貫通移動を助ける可能性を考慮した。修飾が本明細書の記載の範囲を越える機構についての更なる研究は別個の研究の課題である。しかしながら、フェロセン修飾オリゴヌクレオチドで高い活性を観察した事実は、オリゴヌクレオチドをインビボモデルで試験する場合、このルートを調査すべきであることを示唆している。実験的設計の項において詳述したように、虹彩の血管新生の成熟ラットモデルはアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性を定量的様式で試験する手段を提供する。このアッセイでは、ラットを低酸素チャンバー内に１〜21日間入れ、虹彩の血管新生をデジタルイメージングによって定量する。データ（図14）から明らかなように、インキュベーション時間の延長とともに血管形成の程度は明瞭に進行する。網膜のＲＮＡのレベルも上昇するが、その程度は同じではない（図15）。本発明者らの予備的データおよびラットモデルの利用性のデータに勇気づけられて、本発明者らは現在、血管新生のインビボモデルにおいて同様な概念の証明を得ることを計画している。Ｃ．関連する経験主任研究者であるNilabh Chaudhary博士は、細胞分子生物学における広範な基本的経験を有する。彼はWestern Ontario大学(London，Canada)から生化学の学位を受けた。その後、彼はDamon Runyon-Walter Winchell Cancer Fund Fellowshipの助成を得てThe Rockefeller大学（New York）のGunter Blobel博士の研究室で細胞生物学の彼の博士課程終了後の研究を継続した。1986年同じ研究室でThe Howard Hughes Medical InstituteのAssociateに任命された。1992年に、Chaudhary博士はResearch ScientistとしてTriplex（最近Aronexと改称）に参加し、核酸治療剤の細胞および核への取り込みを改善するための技術の開発を目指した細胞生物学のプログラムに着手した。彼は有機化学のチームと密接に共同して、新規なオリゴヌクレオチド修飾および取り込み促進試薬の設計、合成および試験を進めた。Chaudhary博士は、可能性のある治療用オリゴヌクレオチドの構造-機能相関に関する科学論文の共著者であり、それらの細胞内インターナリゼーションおよび効果を促進するアプローチを考案した。彼は、細胞ベースのアッセイ系の設計、免疫化学技術、タンパク質の微量定量、核酸の精製および分子クローニング技術、細胞下分画化、膜タンパク質および脂質の単離、ならびに蛍光顕微鏡学に経験を有する。 Anthony P．Adamis医学博士はこのプロジェクトの共同研究者およびコンサルタントである。彼はHarvard Medical School，Departmennt of Ophthalmologyの Assistant ProfessorおよびChildren's Hospital，BostonのDepartmennt of Sur geryのAssistant Professorである。1994年、Adamis博士および彼の共同研究者は、眼内ＶＥＧＦレベルの上昇、血管新生、および増殖性糖尿病網膜症の進行、失明の一次的原因の間の病因的関連をはじめて証明した。その後の指導研究において彼は、ＶＥＧＦの発現を刺激し、眼の血管新生を招来する低酸素の生理学的役割を確認した。彼の研究経験の広がりは、患者での臨床試験、疾患の囓歯類モデルの開発、細胞ベースの概念証明アッセイの設計、ならびに分子生物学およびクローニング技術の活用に及んでいる。彼は20報を越える論文を発表しているが、その10報は血管新生の分野のものである。Ｄ．実験の設計および方法アプローチの要約：この提案における本発明者らの目的は、血管新生の動物モデルにおいて、抗-ＶＥＧＦアンチセンス化合物の効果を証明することにある。この準備段階で、本発明者らはインビボ試験に最も有望なアンチセンス処方に本発明者らを導くような一連のインビトロ実験を実施することを提案する。本発明者らは、ラットＶＥＧＦｍＲＮＡに標的化された10種のアンチセンスオリゴヌクレオチド（19塩基）候補の「ライブラリー」のスクリーニングにより開始した。オリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに対する結合親和性を改良するためにC5− プロピニルピリミジンおよびヌクレアーゼ耐性を付与するためにヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含有する。細胞試験では多量のＶＥＧＦｍＲＮＡおよびタンパク質を産生することにより低酸素に応答するラットC6（グリオーマ）細胞の使用を計画する。96−ウエルのフォーマットで行うアッセイを用いて様々なアンチセンスまたは対照オリゴヌクレオチドプレパレーションの活性をスクリーニングする。細胞外培地に分泌されるＶＥＧＦレベルに対するそれらの作用の時間経過をＥＬＩＳＡによりモニターする。細胞の取り込みを改良するため、オリゴヌクレオチドは新規な取り込み促進剤と共投与する。核酸と脂質の異なる比率を試験する。さらにアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内への侵入に寄与する修飾、3'−親油性フェロセン結合鎖への接合のために２つの「最良」のアンチセンス配列を選択する。また、２つの最良のオリゴヌクレオチド（またはそれらの処方）のＶＥＧＦｍＲＮＡレベルに対する効果はノーザンブロッティングによって測定する（適当な対照の作用と比較する）。アンチセンスの機構の証明を得るために別個の一連のインビトロ実験を計画する。Ｃ6細胞を、ＶＥＧＦアイソタイプ特異的に、すなわち１種または２種のＶＥＧＦｍＲＮＡ（ラットにおける３種の主要および１種の副次的ＶＥＧＦ）のみを標的とするように特異的に設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置する。ＶＥＧＦｍＲＮＡのそれぞれの種の相対レベルの測定には、ＲＮアーゼ保護アッセイを使用する。原理的には、アンチセンス作用が真に配列特異的であれば標的化されたアイソタイプの発現のみが下方調整されるはずである。配列の異なるオリゴヌクレオチドは無効のはずである。大部分の有効なアンチセンス化合物の細胞毒性は２つの異なる細胞系においてアッセイし、２種の最も毒性の低い処方について、オリゴヌクレオチドが細胞層を横切って浸透できるかどうかを決定するために設計されたC6細胞球状モデルで試験する。球状モデルの細胞連続層におけるＶＥＧＦｍＲＮＡレベルは、インシトゥハイブリダイゼーションによって測定する。取り込み促進剤および結合鎖の有用性もこのモデルでチェックする。大部分の有効な抗-ＶＥＧＦオリゴヌクレオチドの抗-血管新生活性はついで、虹彩血管新生のラット眼モデルを用い、動物で評価する。アルビノラットを低酸素チャンバー内に入れ（２週間まで）、虹彩における血管新生を非侵襲的、定量的デジタルイメージング操作によりモニターする。このモデルでは、低酸素に１〜２日間置いただけで血管新生の増大が明白である。試験オリゴヌクレオチド（または処方物）はラットの一方の眼に直接導入し、他方の眼は非処置対照として観察する。１週間の暴露後までは、血管の増殖は定量されない。ＶＥＧＦタンパク質のレベル（可能ならばガラス体中）の変化および網膜内のｍＲＮＡレベルをそれぞれＥＬＩＳＡおよびノーザンブロッティングによってチェックする。副作用があれば記録する。初期の結果により多重用量実験を試みる。対照オリゴヌクレオチドの作用についてもチェックする。最も毒性が低く最も有効な処方（血管新生の＞20％阻害）をついで、これらの試験の相IIの一部として、拡張した一連の動物試験でテストする。アンチセンスおよび対照オリゴヌクレオチドの選択：ＶＥＧＦの発現の最大の遮断を達成するためには、ラットのすべてのＶＥＧＦアイソタイプの共通領域に結合する10種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成する（Connら，1990）。明らかなヘアピンモチーフまたはＧに富む鎖を有さないほぼ無作為に選択した10種のオリゴヌクレオチドを第１ラウンドのスクリーニングでの試験のために合成する。５種はラット特異的であり、５種の配列はヒトｍＲＮＡに同様に結合するように選択する。進化的に保存された部位が「良い」もしくは「悪い」アンチセンス標的のいずれであるのかは明らかではないが、アンチセンス標的化に、予測可能な好ましい位置はないことが最も最近の結果では示唆されている。すべての合成オリゴヌクレオチドはC5−プロピニルピリミジン（標的に対する結合親和性の改善のため）およびホスホロチオエート結合（ヌクレアーゼ耐性）を含有する(Wagnerら，1993；Fensterら，1994)。本発明者らは既に対照として用いる数種の「無関係な」オリゴヌクレオチドをもっていたが、必要な場合には、アンチセンス配列と同じサイズおよび塩基組成の対照オリゴヌクレオチドを合成する。オリゴヌクレオチドを合成し、精製し(＞90％、ＨＰＬＣによる)、ronexのオリゴヌクレオチド合成グループにより特徴が調べられた。作用機構の研究のためのオリゴヌクレオチド：アンチセンスの作用機構を支持するデータを得るためには、数種（約４種、効果による）の20−マーアイソタイプ特異的オリゴヌクレオチドを調製する。ＶＥＧＦ-165ｍＲＮＡにのみ見出される配列に対して向けられたオリゴヌクレオチドはＶＥＧＦ-120ｍＲＮＡには結合しない。同様に、ＶＥＧＦ-120のスプライス接合部に相補性の20-塩基オリゴヌクレオチド（すなわち、エキソン１個あたり10塩基）はＶＥＧＦ-165には良く結合できない。対照として使用するためには、逆配列を有するオリゴヌクレオチドを合成する（２つの半分が逆転している）。これらのオリゴヌクレオチドのＶＥＧＦの発現に対する作用は様々なｍＲＮＡの相対レベルを比較することによって決定する。それぞれのｍＲＮＡの相対レベルを定量するためにはＲＮアーゼ保護アッセイを用いる（Ambion、Austin、TX）。これを実施するためのプローブ（約 150〜250塩基長の範囲）はラットｍＲＮＡ配列特異的プライマーおよびＲＴ-ＰＣＲ技術を用いて調製された（Perkin Elmer）。細胞培養：生物学的スクリーニングはラットグリオーマ由来のC6グリア細胞において実施した。この細胞系において優勢なＶＥＧＦのアイソフォームは、ＶＥＧＦ-165（アミノ酸）およびＶＥＧＦ-120（それぞれ46％）であるが、ＶＥＧＦ -188の含量は約８％にすぎない（Bacicら，1995）。この細胞系はＶＥＧＦの構造および機能の研究に広く用いられている。低酸素での刺激によりＶＥＧＦ合成を誘導するためには細胞を低酸素チャンバー（GasPak Plus，嫌気培養チャンバー、BBLMicrobiology Systems）中に取り、水素およびパラジウム触媒ですべての酸素を除去する（Steinら，1995）。典型的なインキュベーション時間は６〜1 8時間の範囲である。別法として、培養液をヘム依存性の低酸素応答システムを妨害する100〜300μＭ塩化コバルトに暴露し、ＶＥＧＦｍＲＮＡの転写を誘導する低酸素応答因子を活性化する。インビトロにおけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの評価：単層に増殖させたＣ6細胞を５％ウシ胎児血清および抗体を含むダルベッコの培地に維持する。抗−ＶＥＧＦオリゴヌクレオチドの予備試験には細胞を96ウエルの皿に10,000〜 20,000細胞／ウエルの密度でプレーティングする。１日後に回収して細胞をオリゴヌクレオチド（0.25mlの培地中）で処置する。２種類の培地、通常の血清を含有するC6培地、またはOptimen（Life Technologies社製）、血清成分による妨害を減少させて転写効率を改良するために頻繁に用いられる血清減少培地を試験する。低酸素チャンバー内で様々な時間インキュベートしたのち、上清を新たなプレートに移し、ＥＬＩＳＡでさらに分析する。一般的に、新しい処方をテストする場合には、本発明者らは、異常な変化または毒性の明白な兆候を見出すために顕微鏡によって細胞の形態を調べた。ＲＮＡ分析には、多数の細胞（Ｔ75フラスコ中、＞2×10⁶〜10⁷細胞）を選択した数の処方で処置する。オリゴヌクレオチド処置（および低酸素への暴露等）ののち、上清を再びＥＬＩＳＡ用に保存し、ＲＮＡを単離し、以下に記述する方法を用いて分析する。ＶＥＧＦＥＬＩＳＡアッセイ：囓歯類に対し使用できる市販キットはまだない。したがって本発明者らはラットＶＥＧＦと良好に反応することが知られている抗体を用いてシステムを考案する(Research Diagnostics，Inc.製のＲＤＩ-10 20またはＲＤＩ-4060およびR & D Systems社製の他のシステム)。ＶＥＧＦに対する抗血清も利用可能で、したがって最良の組合わせを選択する。ＥＬＩＳＡ試薬（酵素結合二次抗体、基質）はPierce社から購入した。ＲＮＡ抽出、ノーザンブロット、ＮＡアーゼ保護アッセイ、およびハイブリダイゼーションプローブ：ＶＥＧＦｍＲＮＡのサイズは、主として長い非翻訳領域のために、3.8〜４キロダルトンの範囲である。ＲＮＡ分析には、総ＲＮＡを処置または非処置細胞からＲＮＡゾール法（Tel-Test，Inc.製Friendswood ，TX）によって単離する。プローブとしての使用には、共通領域に相当するＶＥＧＦ−特異的セグメントおよびアイソタイプ特異的プローブは既に、C6 ＲＮＡおよびＶＥＧＦ-特異的プライマーを用い、ついで異なるｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡのサイズ選択、およびアイソタイプ特異的プライマーを用いる選択的増幅による逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲキット、Perkin Elmer 社製）の組合わせによって発生させた。これらのプローブは、ＰＣＲIIプラスミドクローニングベクター（Invitrogen）にクローニングし、配列は配列決定によって確認する（Sequenase，USB）。ＰＣＲIIベクターは、ＲＮアーゼ保護アッセイ(Ambion，Austin，TXからのキット)に使用する放射標識ＲＮＡプローブのＲＮＡポリメラーゼ依存性産生を可能にする。ＲＮＡレベルの正規化にはβ−アクチンプローブが使用される。ノーザンブロットには、ＲＮＡ(20μｇまで)をホルムアミドゲル上で分画化し、ナイロンに移し、標準操作により放射標識プローブで調べ、β−アクチンでＲＮＡレベルを正規化する。ＲＮＡアッセイではすべて、放射能の相対レベルの定量にリンイメージング（Fuji Phosphorimager）を用いた。アンチセンスの作用機構を支持する実験：本研究におけるアンチセンス−オリゴヌクレオチドはＶＥＧＦｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡ配列に相補性である。しかしながら、生物系におけるそれらの阻害作用はアンチセンスの作用機構を必ずしも証明しない。実際、最近の分析では、多くのオリゴヌクレオチドがとくに１μＭ以上の濃度で細胞代謝を非特異的に妨害することが示されている（Stein & Cheng，1993）。アンチセンスの機構の証明は疑問が多く困難であり、状況証拠を除いて実際には何も明らかにされていない。本発明者らの最近の実験では間接的ではあるが、アンチセンス機構の証拠が得られるように設計された。略述すれば、単一のＶＥＧＦ変異体の発現を選択的に阻害するためラット細胞ベースのアッセイに用いる「アイソタイプ−特異的」アンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。ラットＣ6細胞（グリオーマ起源）はＶＥＧＦアイソタイプの主要な３種を産生する。ＲＮアーゼ保護アッセイではC6細胞系におけるＶＥＧＦの約45％は120アミノ酸変異体であり、45％は1 65aa変異体であり、残りは188aa変異体であることが示された（Bacicら，1995）。細胞を１種または２種以上のアイソタイプに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、ついで、低酸素または低酸素を模倣する200μＭの塩化コバルトの添加のいずれかによって、ｍＲＮＡの転写を刺激する。９時間暴露したのちＶＥＧＦｍＲＮＡの細胞レベルをＲＮアーゼ保護アッセイによってモニターする（Ambion，Austin，TX）。本発明者らがＲＴ-ＰＣＲ技術により発生させた極めて重要なアイソタイプ特異的プローブ(約100〜200塩基長)を用いてそれぞれのＶＥＧＦｍＲＮＡ種のレベルを定量し、レベルをβ−アクチンに対して正規化する。アンチセンスの機構が働き、単一のアイソタイプ特異的オリゴヌクレオチドを使用すれば、ＶＥＧＦの１種の発現のみが他に比べて減少するはずである。他方、すべてのＶＥＧＦの共通領域に相補性のオリゴヌクレオチドはすべてのＶＥＧＦの発現を低下させる。フェロセン接合オリゴヌクレオチドの合成：最初の数ラウンドのスクリーニング後に、ほとんど副作用のない最も活性なオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドの取り込みおよび特異的活性がさらに増大することを期待して３末端を介してフェロセン結合鎖に結合させる［予備的結果参照；Ｔ30781（＋フェロセン）対Ｔ30639（非修飾）］。有効であれば、このオリゴヌクレオチドの活性を同じ結合鎖を有するランダム配列対照の活性と比較する。フェロセン部分がオリゴヌクレオチドによる細胞の能動輸送または透過システム（鉄？）の利用を可能にすると考えられるが、その機構はまだ研究されていない。取り込み促進剤の使用：大部分の場合、細胞への侵入を容易にするため、陽イオン性脂質試薬の存在下にオリゴヌクレオチドを細胞に投与する。遺伝子送達のためのトランスフェクション試薬として開発された多くの陽イオン性脂質が現在は市販されているがCellfectin（Life Technologies社製）のみが本発明のアッセイにおいて一貫して有効であることが見出された（試験した７つの主要脂質中）。Cellfectinはポリアミノ脂質テトラパルミチル−スペルミンとリン脂質ジオレオイルホスホチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の1:1。5（wt/wt）リポソーム混合物である。本発明で用いられる他の脂質は、Leaf Huangによって開発され(Gao & Huang，1991)、遺伝子療法の臨床試験で承認されたＤＣ−chol（Rgene Therapeu-tics、The Woodlands，TX）である。さらに、本発明者らは、血清の存在下にもオリゴヌクレオチドの細胞取り込みを著しく増大させて、有意な毒性を伴わない一連の新規なポリアミノ脂質取り込み促進剤を設計し、合成した（Gu y-Caffeyら，1995）。これらの中でＳｐｄＣ（スペルミジン−コレステロール）が最も有効である。マウスに静脈内注射した場合、ＳｐｄＣはオリゴヌクレオチドの多くの組織への送達を増大させ、ＳｐｄＣ 100mg／kg／日までの濃度で１週間マウスに注射しても毒性は観察されなかった（データは示していない）。本発明者らはＳｐｄＣ/ＤＯＰＥおよびＤＣ−chol／ＤＯＰＥ（ＳｐｄＣもしくはＤＣ−cholとジオレオイルホスホチジルコリン）の質量比１：0.5、１：１、１：1 .5および１：２の範囲のリポソームプレパレーションを調製した。ＮＨＥＫ細胞での初期の抗−ＶＥＧＦアッセイにおいて最も有効に作用した比は、いずれの陽イオン性脂質についても1:1であった。Ｃ6細胞系、Ｃ6球状体、および最終的には眼モデルにおける抗- ＶＥＧＦオリゴヌクレオチドの活性を増大させるこれらのプレパレーションの有用性の検討を進めている。これらの取り込み方法が働く正確な機構にはまだ議論がある。陽イオン性脂質の核酸との混合物はほとんど常に、細胞に効率的に侵入する微小沈殿を生じる。一貫性を維持するため、多分また基底にある原理を発見するため、Coulterの粒子サイズ測定装置を用いて粒子サイズをモニターする。インビボ注射のための処方：この提案では、処方の語は薬物送達のための多重成分混合物の使用の情報を大ざっぱに提供するものである。しかしながら、インビボ試験段階に近づくに従い、とくに取り込み促進剤を包含する場合、眼への注射に至適な処方を考案することが重要である。考慮すべき他のパラメーターには、アンチセンスの量および濃度、塩度、粒子サイズ、pH、およびビヒクルがある。Joe Wyse博士から至適処方の選択および調製に助力を受けた。細胞毒性アッセイ：細胞は96ウエルプレート中に500細胞／ウエルの密度で接種する。１日プレーティングしたのち、細胞を段階的に希釈したオリゴヌクレオチド処方物に暴露する（各希釈あたり４ウエル）。１日または４日間の暴露後、非放射性アッセイシステム（Cell Titer 96 Aqueous細胞増殖アッセイ、Promega Corp.製）を用いて細胞の生存能に対する作用をモニターする。最も強力なオリゴヌクレオチドについては、３種の別の細胞系（C6，ＮＨＥＫおよび線維芽細胞系を含む）でこのアッセイを実施する。球状細胞におけるアンチセンス活性の評価：通常は単層に増殖させるC6 細胞（4.5ｇグルコース／リットル、DMEM、５％ＦＣＳ＋抗体）は約0.4〜0.8mm の細胞の球状体または凝集体への増殖を誘導することができる。脂質とまたは他の方法で処方した本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが球状の細胞層を横切ることができるかまた依然として生物活性を有するかの情報を知ることは重要である。球状体の調製にはSteinら（1995）によって記載された方法を使用する。C6細胞を集密的な培養液から非接着微生物用皿に移し、48時間増殖させる。発生したスフェロブラストを回転フラスコに移し、さらに10日間増殖させ（80rpm ）、球状体を10mlのピペットを通して沈降させて均一サイズに分ける。１日置きに培地を交換して、さらに６週間増殖を続ける。フラスコは毎日95％の空気＋５％CO₂で洗浄して適当な酸素の供給とpHを保証する。球状体をアンチセンス処方もしくは適当な対照により処置し、１日まで低酸素に暴露してＶＥＧＦの合成を誘導し、ついで球状体分画のＶＥＧＦｍＲＮＡのレベルをインシツゥハイブリダイゼーションによって検査する。このためには、球状体を４％パラホルムアルデヒドで固定し、凍結し、10μｍ厚の切片に切断し、前述のように、発生したＶＥＧＦを³⁵Ｓ-標識ＤＮＡまたはＲＮＡプローブによりインシツゥハイブリダイゼーション処理する。処理した切片は、ヘマトキシリンおよびコシン染料で対比染色する。数日間のオーロラジオグラフィー後（Guy-Caffeyら）、スライドを明野および暗野イルミネーションによって調べる（撮影）。ＶＥＧＦＲＮＡの分布はアンチセンスオリゴヌクレオチドによって達成される阻害の程度を示す。すべての層が低レベルのＶＲＧＦｍＲＮＡを示すことが理想的である。薬物が細胞層に浸透しなかったか、または細胞が中央部ほど低酸素で多くのＶＥＧＦを産生したため、上層ではＶＥＧＦは少ない場合が多い。送達が上層にのみ行われた場合には、新しい送達方法の考慮を試みる。インビボにおけるＶＥＧＦアンチセンスオリゴヌクレオチドの抗−血管新生活性の評価：ＶＥＧＦ−関連の虹彩血管新生の成熟囓歯類モデル：低酸素雰囲気内の成熟ラットでは、虹彩に新しい血管の増殖が刺激される。血管新生は網膜内のＶＥＧＦｍＲＮＡの上方調整と時間的に相関する。眼内における現象の順序は、糖尿病性虹彩潮紅のサルでのモデルおよびヒト虹彩の血管新生に見られる順序を正確に再現し、虚血性網膜ＶＥＧＦが虹彩の血管新生の発症の原因であることが知られている。これが、血管新生を減弱できるアンチセンス化合物の活性の試験にこのモデルを使用する意図である。Adamisの実験室で行われた動物実験には動物の処置および手術、撮影、コンピューターによる定量化、ならびにＶＥＧＦｍＲＮＡのノーザン分析が包含される。 350〜400ｇの成熟Kingston ColonyアルビノSprague-Dawleyラット（雌）を低酸素チャンバー（１％酸素）内に１〜21日間置く。インキュベーション期間の前後に生物顕微鏡試験および標準化スリットカメラ撮影を実施する。進行性の虹彩血管の拡大および蛇行の兆候ならびに血管密度の上昇が低酸素雰囲気内で発症する。虹彩血管はこれらのアルビノラットでは明瞭に観察できる。虹彩の標準化写真をコンピュータープログラム（NIH Image，1.54Ｄソフトウエア）中に走査分解し、画像分析によって遮蔽様式で血管新生領域を定量化する。虹彩における血管の増殖は14日間にわたって漸次増大を示す。増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）および第VIII因子の免疫染色により２日目から内皮細胞の増殖が確認され、血管の増殖は血管新生を示すことが証明された。ノーザンブロッティングのために調製された単離網膜は低酸素動物における網膜内の定常的ＶＥＧＦｍＲＮＡレベルの上昇を示す。要約すれば、低酸素下の成熟ラットでは、虹彩における新しい血管の増殖が刺激される。抗−ＶＥＧＦ処方物候補の作用の試験にこのモデルを用いる意図である。低酸素の中断の血管新生に対する作用の決定実験：上述のラットモデルは低酸素への連続的暴露のためにのみ使用した。たとえば薬物の反復投与のため低酸素を中断できれば、このモデルはさらに有用であると思われたので、動物を１日のベースで短時間低酸素から取り出し、虹彩の血管新生の程度の特徴が解明する。このような方法で処置した新生児ラットは一定の酸素下に置いた動物に比較し大きな血管新生応答を示すことから、低酸素から取り出すと血管新生に相乗的に働くものと推測される（Reynaud & Dorey，1994）。低酸素下の網膜に酸素を再び供給すると、網膜のＶＥＧＦｍＲＮＡタンパク質を上昇させることが知られている反応性酸素中間体が生じる（Kurokiら，1995）。ラットを低酸素チャンバー（10％酸素）内に１、３、５、７、14および21日間置く（各時点毎にｎ＝３、計18）。それらを１日につき１時間取り出し、正常の室内酸素（21％）に暴露する。インキュベーション時間の終了時に、標準化した虹彩の写真を撮影する。動物を屠殺し、眼の前方半分をＰＣＮＡ染色および光学顕微鏡検査用に調製する。網膜は単離し、³²P−標識558bp ＶＥＧＦｃＤＮＡランダムプライム標識プローブとのノーザンブロッティング用に調製する。網膜のＶＥＧＦｍＲＮＡ上方調整は、21日の期間にわたり、虹彩の血管新生の写真および免疫組織化学情報と相関する。血管増殖領域を標準化写真から定量化し、中断しないで低酸素下に置いた動物の場合と比較する。この実験から、低酸素効果が弱められることなく動物を低酸素チャンバーから取り出し投与する最大の回数および長さを評価することがでる。インビボにおけるアンチセンス作用の評価：開始日にベースラインの写真を撮影する。麻酔動物の眼の無作為な一方にＶＥＧＦアンチセンス化合物のガラス体への単回注射を行う。他方の眼は非処置のまま放置する。用量はインビボ研究を参考にしたが、20μｌまたはそれ以下の投与とする。動物は７日間、中断せずに低酸素状態に置く。最初のこのようなアッセイでは、各処方物あたり（４処方物：オリゴのみ；オリゴ十結合鎖；およびそれぞれに取り込み促進剤）６例の動物を処置する。目的はこれらの化合物が何らかの急性作用をもつかどうかを見ることである。かなりの血管新生の低下があったならば、多数の動物を使用する。以下の表は、どの位の数が必要かについての上の解釈をまとめる。全体として、各処置あたり20匹の動物の使用が期待される。表４．必要なラット数：このモデルラットの90％は血管新生を発症する。有意レベルを0.05（α＝0.05）、検定力0.8（１−β＝0.80）と仮定すると処置群あたりの眼の数は血管新生遮断剤の有効性の変動に応じて決定できる。対照群処置群必要な眼の数 90 40 38 90 50 24 90 60 17 90 70 12 これらの実験における血管新生の阻害は、処置された眼の血管新生面積の対照群に比べて20％減少と定義される。特定の試薬の推定有効率が高い場合には処置群における虹彩血管新生を発症する眼の百分率が低く、統計的有意差に必要な眼の数は劇的に減少する。７日目に動物を撮影し屠殺する。網膜を収穫しノーザンブロッティング用に調製する（個々に）。ＶＥＧＦ定常状態ｍＲＮＡはリンイメージャー（Mole cular Dynamics社製）を用い285リボソームＲＮＡシグナルに正規化して定量する。虹彩の血管増殖を定量化して、処置した眼と対照群の間で比較する。Ｆ．脊椎動物の処理操作：動物の操作はすべて、研究動物の使用に関するtheAss ociation for Research in Vision and Ophthalmology Resolutionによって決定された指針およびthe Massachusetts Eye and Ear Infir-mary Animal CareComm itteeの決定による指針に従って、Children's Hospital，Harvard Medical Scho olで行われる。計120匹のアルビノ雌性Kingston Colony Sprague-Dawleyラットが使用される。それらは麻酔し、30ゲージの注射針を用いて、20μｌのオリゴヌクレオチドまたは対照処方物をガラス体内に注射される。注射後には硫酸ゲンタマイシンを適用する。動物は３週間まで10％酸素雰囲気下に保持する。処置終了後、動物はCO₂の吸入によって屠殺する。すべての実験がＯＰＲＲの指針に合致している。Ｉ．引用文献参考文献以下の文献は本明細書の記載された操作にさらに詳細を補充する限りにおいてとくに引用により本明細書に導入される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者チヤウダーリ，ニラブーアメリカ合衆国コロラド州80027．ルイスビル．サウスマカズリンブールバード228. アパートメント100 (72)発明者ラーウ，テイー・スードハーカールアメリカ合衆国テキサス州77381．ザウツドランズ．ラツシユメドウプレイス46 (72)発明者レヴアンカール，ガーナーパーテイ・アールアメリカ合衆国テキサス州77381．ザウツドランズ．ノースミルトレイスドライブ 180 (72)発明者コツサム，ポール・エイアメリカ合衆国テキサス州77381．ザウツドランズ．サウスウインドサールプレイス 27 (72)発明者ラーンドウ，ロバート・エフアメリカ合衆国テキサス州77380．ザウツドランズ．ダヴテイルプレイス35 (72)発明者パイマン，アヌーシユドイツ連邦共和国デー―65779 ケルクハイム．ツアイルスハイマーシュトラーセ46 (72)発明者ウールマン，オイゲンドイツ連邦共和国デー―61479 グラースヒユツテン．ツムタールブリツク31

Claims

【特許請求の範囲】１．約１μＭ未満の濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置された細胞の細胞ＶＥＧＦ産生が非処置細胞において産生されるＶＥＧＦの約90％以下に低下する上記アンチセンスオリゴヌクレオチド。２．アンチセンスオリゴヌクレオチドはＶＥＧＦをコードするｍＲＮＡ上に見出されるＲＮＡ配列に結合する請求項１記載の上記アンチセンスオリゴヌクレオチド。３．アンチセンスオリゴヌクレオチドはＶＥＧＦをコードする少なくとも２種のｍＲＮＡ上に見出されるＲＮＡ配列に結合する請求項１記載の上記アンチセンスオリゴヌクレオチド。４．アンチセンスオリゴヌクレオチドはmRNA VEGF 206上に見出されるＲＮＡ配列に結合する請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。５．アンチセンスオリゴヌクレオチドはmRNA VEGF 185上に見出されるＲＮＡ配列に結合する請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。６．アンチセンスオリゴヌクレオチドはmRNA VEGF 165上に見出されるＲＮＡ配列に結合する請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。７．アンチセンスオリゴヌクレオチドはmRNA VEGF 121上に見出されるＲＮＡ配列に結合する請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。８．アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼによる分解速度を低下させる化学部分からなる請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。９．オリゴヌクレオチドはホスホロチオエート基およびホスホジエステル基からなる請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 10．隣接する１対の残基がヌクレアーゼによる分解に抵抗する化学部分によって連結されている請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 11．アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼによる分解速度を低下させる化学部分はホスホロチオエート基である請求項８記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 12．オリゴヌクレオチドのそれぞれの残基はホスホロチオエート基によって連結されている請求項８記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 13．ヌクレオチド残基はＣ5-プロピニルウリジン、C5−プロピニルシチジン、C5 −ヘキシニルウリジン、C5−ヘキシニルシチジン、６−アザ−ウリジンおよび６ −アザ−シチジンからなる群より選択されるヌクレオチド残基を包含する請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 14．オリゴヌクレオチドはホスホロチオエート基、ならびにＣ5-プロピニルウリジン、C5−プロピニルシチジン、C5−ヘキシニルウリジン、C5−ヘキシニルシチジン、６−アザ−ウリジンおよび６−アザ−シチジンからなる群より選択されるヌクレオチド残基を包含する請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 15．C5−プロピニルウリジン残基からなる請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 16．C5−プロピニルウリジン残基およびホスホロチオエート基からなる請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 17．C5−プロピニルシチジン残基からなる請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 18．C5−プロピニルシチジン残基およびホスホロチオエート基からなる請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 19．C5−ヘキシニルウリジン残基およびホスホロチオエート基からなる請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 20．C5−ヘキシニルシチジン残基からなる請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 21．C5−ヘキシニルシチジン残基およびホスホロチオエート基からなる請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 22．６−アザ−デオキシウリジン残基からなる請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 23．６−アザ−デオキシウリジン残基およびホスホロチオエート基からなる請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 24．６−アザ−デオキシシチジン残基からなる請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 25．６−アザ−デオキシシチジン残基およびホスホロチオエート基からなる請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 26．約１μＭ未満の濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置された細胞でのＶＥＧＦ産生を非処置細胞において産生されるＶＥＧＦの約90％以下に低下させるアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる組成物であり、さらに細胞取り込み促進剤を含有する組成物。 27．細胞取り込み促進剤は親油性部分である請求項26記載の組成物。 28．親油性部分はコレステロールからなる請求項27記載の組成物。 29．オリゴヌクレオチドはさらに陽イオンへのイオン結合からなり塩を形成する請求項１記載の組成物。 30．陽イオンは陽イオン性脂質である請求項29記載の組成物。 31．陽イオン性脂質はポリアミノ脂質である請求項30記載の組成物。 32．ポリアミノ脂質はスペルミジン-コレステロールである請求項31記載の組成物。 33．細胞取り込み促進剤はリポソームからなる請求項26記載の組成物。 34．リポソームはCellfectin（登録商標）からなる請求項33記載の組成物。 35．リポソームはＤＯＰＥと混合したスペルミジン-コレステロールからなる請求項33記載の組成物。 36．ＶＥＧＦｍＲＮＡを結合し、ホスホロチオエート基、ならびにC5−プロピニルウリジン、C5−プロピニルシチジン、C5−ヘキシニルウリジン、C5−ヘキシニルシチジン、６−アザ−デオキシウリジンおよび６−アザ−デオキシシチジンからなる群より選択されるヌクレオチド残基で構成されるアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、化学的に修飾されたピリミジン残基を欠く同一のアンチセンスオリゴヌクレオチドの融点より少なくとも約５℃高い二重鎖融点を有し、約１μ Ｍ未満の濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置された細胞でのＶＥＧＦ産生を非処置細胞で産生されるＶＥＧＦの約90％以下に低下させるアンチセンスオリゴヌクレオチド。 37．ＶＥＧＦｍＲＮＡに結合し、ホスホロチオエート基、ならびにC5−プロピニルウリジン、C5−プロピニルシチジン、C5−ヘキシニルウリジン、C5−ヘキシニルシチジン、６−アザーデオキシウリジンおよび６−アザ−デオキシシチジンからなる群より選択されるヌクレオチド残基で構成されるアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる組成物であり、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは化学的に修飾されたピリミジン残基を欠く同一のアンチセンスオリゴヌクレオチドの融点より少なくとも約５ ℃高い二重鎖融点を有し、約１μＭ未満の濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置された細胞でのＶＥＧＦ産生を非処置細胞で産生されるＶＥＧＦの約90 ％以下に低下させるアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる組成物。 38．ホスホロチオエート結合を含有し、ＶＥＧＦをコードするｍＲＮＡに結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、アンチセンスオリゴヌクレオチド中にC5−プロピニルウリジン、C5−プロピニルシチジン、C5−ヘキシニルウリジン、C5−ヘキシニルシチジン、６−アザ−デオキシウリジンおよび６−アザ−デオキシシチジンからなる群より選択されるヌクレオチド残基を包含することからなり、かつアンチセンスオリゴヌクレオチドの二重鎖融点が少なくとも約５℃上昇していることからなる改良。 39．細胞を請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることからなる細胞における細胞ＶＥＧＦの産生を低下させる方法において、細胞は非接触細胞によって産生されるＶＥＧＦの約90％以下のＶＥＧＦを産生し、そして上記オリゴヌクレオチドの濃度が約１μＭ未満である上記の方法。 40．配列番号：２〜22からなる群より選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチド。 41．配列番号：２を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる組成物。 42．配列番号：３を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる組成物。 43．配列番号：４を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる組成物。 44．配列番号：６を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる組成物。 45．配列番号：10を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる組成物。 46．配列番号：20を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる組成物。 47．配列番号：21を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる組成物。 48．配列番号：22を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる組成物。