【発明の詳細な説明】
新規タンパク質-ＴＲＡＦ6本発明の分野
本発明の分野は、転写及び免疫調節に関連するヒトタンパク質のクラスに関す
る。背景
核因子κＢ(ＮＦ-κＢ)は、多数のサイトカイン、サイトカインレセプター、
主要組織適合性抗原、血清アミロイドＡタンパク質等を含む広範囲の重要な細胞
性遺伝子及びＨＩＶ、ＳＶ40、サイトメガロウイルス等の遺伝子を含む多数のウ
イルス遺伝子の誘導性発現に関連する転写活性化因子Ｒｅｌファミリーメンバー
のホモ-又はヘテロダイマーである。
数種類の腫瘍壊死因子レセプター関連因子(ＴＲＡＦ)タンパク質が確認され、
細胞毒性、抗ウイルス活性、免疫調節活性及び多数の遺伝子の転写調節を含む様
々な細胞性応答のシグナル伝達に関連することが示された。
従って、ＮＦ-ＫＢおよび／またはＴＲＡＦタンパク質の活性を外因的にモジ
ュレートする能力は、多数の臨床的徴候に対する治療的適用を可能とする。さら
に、このような経路の成分は、自動化され、費用効果がよい、高処理量の薬剤ス
クリーニングアッセイのための有効なターゲット薬剤を提供し、そのため、国内
及び国際的な薬学的かつバイオテクノロジーによる薬剤開発プログラムにおいて
迅速に適用することができる。本発明はＮＦ-κＢ発現を調節する新規なＴＲＡ
Ｆタンパク質、薬剤スクリーニングにおけるその使用、及びこれをコードする核
酸を提供する。関連文献
Rothe et al.(1994)Cell 78,681-692は、ＮＦ-κＢ発現は75-80ｋＤＡ ＴＮＦ
レセプター(ＴＮＦ-Ｒ2)により仲介されること、ＴＮＦ-Ｒ2の細胞質ドメインの
Ｃ-末端における78アミノ酸の短鎖がＮＦ-κＢ活性化のシグナル伝達に必要であ
ること、及びこの領域は密接に関連する推定上のエフェクター、ＴＲＡＦ1及び
ＴＲＡＦ2に結合すること
を報告している。また、Hsu et al.(1995)Cell 81,495及びRothe et al.,出願中
のＵＳ特許出願継続No:08/446,915も参照できる。第3の別種のＴＲＡＦであるＴ
ＲＡＦ3は、Huet al(1994)J.Biol Chem 269,30069;Cheng et al.(1995)Science
267,1494-1498;Mosialos et al.(1995)Cell180,389;及びSato et al.(1995)ＦＥ
ＢＳ Letters,358,113により報告されている。Rothe et al.(1995)Science 269
,1424-1427はＴＮＦ-Ｒ2及びＣＤ40によるＴＲＡＦ2-(ＴＲＡＦ1-又は3-ではな
い)仲介ＮＦ-κＢ活性化について報告している。
本発明の要約
本発明は新規な腫瘍壊死因子レセプター関連因子ナンバー6(ＴＲＡＦ6)タンパ
ク質及び遺伝子に関連する方法及び組成物を提供する。本発明のＴＲＡＦ6タン
パク質は、配列番号:1と高緊縮条件においてハイブリダイズするｃＤＮＡにより
コードされており;天然の細胞内ＴＲＡＦ6結合ターゲットに特異的に結合し、天
然の細胞内ＴＲＡＦ6結合ターゲットに特異的に結合する能力を有する配列番号:
2のアミノ配列又はそのフラグメントを含む。
本発明はまた、記載されたＴＲＡＦ6ｃＤＮＡにハイブリダイズ可能な単離さ
れたＴＲＡＦ6ハイブリダイゼーションプローブ及びプライマー、本発明のＴＲ
ＡＦ6タンパク質をコードする核酸、本発明のＴＲＡＦ6タンパク質の作製方法及
び本発明の組成物を診断(例えば、ＴＲＡＦ6遺伝子変異体の遺伝子ハイブリダイ
ゼーションスクリーニング)及び生物薬剤工業(例えば、免疫調節に関する疾病の
診断及び治療において有用な薬剤のためのリード化合物をケミカルライブラリー
からスクリーニングするための試薬)において使用する方法を提供する。
図面の簡単な説明
図1は、ＴＲＡＦ6によるＮＦ-κＢ依存レポーター遺伝子活性化におけるＴＲ
ＡＦ6欠失変異体の共発現の効果を示す。
図2は、ＴＲＡＦタンパク質によるＮＦ-κＢ依存レポーター遺伝子活性化を示
す。
本発明の詳細な説明
ヒトＴＲＡＦ6をコードする天然ｃＤＮＡの核酸配列は、配列番号:1に示され
る通り
であり、及び完全な概念的(conceptual)翻訳は配列番号:2に示される通りである
。本発明のＴＲＡＦ6タンパク質は、配列番号:1の不完全な翻訳体及び配列番号:
2の欠失変異体を含み、これらの翻訳体及び欠失変異体はＴＲＡＦ6特異的活性を
有する。
ヒトＴＲＡＦ6ポリペプチドをコードする天然ｃＤＮＡの核酸配列は配列番号:
1に示される通りであり、またその完全な概念的翻訳は配列番号:2に示される通
りである。本発明のＴＲＡＦ6ポリペプチドは、配列番号:1の不完全な翻訳体及
び配列番号:2の欠失変異体を含み、これらの翻訳体及び欠失変異体はＴＲＡＦ6
特異的アミノ酸配列及び結合特異性又は機能を有する。従って、本発明のＴＲＡ
Ｆ6ポリペプチドは、配列番号:2及びそのＴＲＡＦ6ドメインを含むポリペプチド
を含む。そのようなＴＲＡＦ6ドメインは、配列番号:2の少なくとも10、好まし
くは約12、より好ましくは少なくとも約14の連続した残基を有し、かつＴＲＡＦ
1-5とは区別されるＴＲＡＦ6、ＴＲＡＦ2および／またはＴＲＡＦ3に特異的に結
合するようなＴＲＡＦ6特異的活性又は機能を提供する。
ＴＲＡＦ6特異的活性又は機能は、インビトロ、細胞を用いて(cell-based)、
又はインビボアッセイにおいて簡便に決定されてもよい。すなわち、インビトロ
結合アッセイ、細胞培養アッセイ、動物(すなわち、遺伝子治療、遺伝子組換え
等)による方法である。結合アッセイは、ＴＲＡＦ6ポリペプチドと結合ターゲッ
トとの分子間相互作用を評価できるいずれのアッセイをも包含する。結合ターゲ
ットはＴＲＡＦ6活性又はその局在化を直接モジュレートするＴＲＡＦ6(二量化)
又は他のＴＲＡＦ6調節タンパク質のような天然の細胞内結合ターゲットであっ
てもよく;又は抗体を例とする特異的免疫タンパク質のような非天然結合ターゲ
ット、又は以下に述べるようなクリニングアッセイにおいて同定されるようなも
のと同様のＴＲＡＦ6特異的薬剤であってもよい。ＴＲＡＦ6結合特性は、結合平
衡定数(通常少なくとも約107Ｍ-1、好ましくは少なくとも約108Ｍ-1、より好ま
しくは約109Ｍ-1)、本発明のポリペプチドのＴＲＡＦ6発現細胞におけるネガテ
ィブ変異体として機能する能力、異種宿主(ネズミ又はラビット)におけるＴＲＡ
Ｆ6特異的抗体を顕在化する能力等によりアッセイを行ってもよい。いずれにせ
よ、本発明のＴＲＡＦ6ポリペプチドのＴＲＡＦ6結合特異性は、ＴＲＡＦ1-5と
必然的に区別するものである。
本発明のＴＲＡＦ6ポリペプチドは単離されているか又は純粋なものである:“
単
離された”ポリペプチドは、その自然な状態において伴う少なくとも幾つかの物
質を伴わず、試料中に好ましくは少なくとも約0.5重量％、及びより好ましくは
約5重量％の全ポリペプチドを含み、及び純粋なポリペプチドは試料中に少なく
とも約90重量％及び好ましくは少なくとも約99重量％の全ポリペプチドを含む。
ＴＲＡＦ6ポリペプチド及びポリペプチドドメインは合成してもよく、組換え技
術により生産してもよく又は哺乳類、好ましくはヒト細胞から精製してもよい。
広範囲の種類の分子学的及び生物化学的方法を、生物化学的合成、分子発現及び
本発明の組成物の精製において使用することができる。例えば、以下の文献が参
照される。Molecular Cloning,A Laboratory Manual(Sambrook,et al.Cold Spri
ng Harbor Laboratory),Current Protocols in Molecular Biology(Eds.Ausubel
,et al.,Greene Publ.Assoc.,Wiley-Interscience,ＮＹ）又は当業分野において
既知の他の文献。
本発明は天然及び非天然ＴＲＡＦ6特異的結合薬剤、該薬剤の同定及び製造方
法、及び診断、治療及び薬剤開発におけるその使用を提供する。例えば、ＴＲＡ
Ｆ6特異的薬剤は、様々な診断及び治療における適用、特に疾病又は疾病予知が
、ＴＲＡＦ6を含む経路、すなわちＮＦ-κＢ活性化の不適切な利用に関連する場
合には、非常に有用である。新規なＴＲＡＦ6特異的結合薬剤としては、特異的
抗体又はＴ細胞抗原レセプターのような体細胞性組換えポリペプチドレセプター
(Harlow and Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor
Laboratory)、及び1-、2-及び3-ハイブリッドスクリーニングのようなアッセイ
により同定された他の天然細胞内結合薬剤、以下に述べるような化学的ライブラ
リーのスクリーニングにより同定された非天然細胞内結合薬剤等が挙げられる。
診断のための使用においては、該結合薬剤はしばしば、蛍光、放射性、化学ルミ
ネセンス又は他の簡単に検出できる分子によりラベル化されており、結合薬剤に
直接結合しているか又は結合薬剤に特異的なプローブに結合している。特に興味
深い薬剤はＴＲＡＦ6機能、例えば、ＴＲＡＦ6-依存シグナル伝達をモジュレー
トする；例えば、単離された細胞、全組織、又は個体をＴＲＡＦ6結合薬剤によ
り処理を行って、ＴＲＡＦ6-依存細胞内シグナル伝達プロセスを活性化、抑制又
は変化させてもよい。
記載されるＴＲＡＦ6ポリペプチドのアミノ酸配列は、選択的発現のために最
適化されたＴＲＡＦ6ポリペプチドをコードする核酸を逆翻訳(backtranslate)す
るために
使用されるか(Holler et al.(1993)Gene 136,323-328;Martin et al.(1995)Gene
154,150-166)、又は天然ＴＲＡＦ6をコードする核酸配列の単離において使用す
る変性(degenerate)オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを作製するため
に使用される(“ＧＣＧ”ソフトウェア、Genetic Computer Group,Inc,Madison
WI)。ＴＲＡＦ6をコードする核酸配列はＴＲＡＦ6発現ベクターにおいて使用さ
れ、かつ組換え宿主細胞(例えば、発現及びスクリーニング用)、遺伝子組換え動
物(例えば、ＴＲＡＦ6-モジュレートシグナル伝達に伴う疾病のための候補薬剤
の効果などの機能的研究用)に組み込まれる。
本発明はまた配列番号:1に含まれるＴＲＡＦ6ｃＤＮＡ特異的配列を含み、か
つこれに対する特異的ハイブリダイゼーションを行うのに十分な核酸ハイブリダ
イゼーションプローブ及び複製/増幅プライマーを提供する(すなわち、ヒト臍静
脈内皮細胞ｃＤＮＡ存在下、好ましくはＴＲＡＦ1-5ｃＤＮＡ存在下に配列番号:
1と特異的にハイブリダイズする)。そのようなプライマー又はプローブは少なく
とも12、好ましくは少なくとも24、より好ましくは少なくとも36、及び最も好ま
しくは少なくとも96塩基の長さである。特異的ハイブリダイゼーションの証明は
、一般的に緊縮条件が要求される。例えば、5×ＳＳＰＥ(0.18Ｍ ＮａＣｌ,0.01
Ｍ ＮａＰＯ4,pH7.7,0.001ＭＥＤＴＡ)バッファー中30％ホルムアミドを含むバ
ッファー中において42℃の温度でハイブリダイズし、及び42℃において0.2×Ｓ
ＳＰＥにより洗浄した際に結合して残る;好ましくは、5×ＳＳＰＥバッファー中
50％ホルムアミドを含むバッファー中において42℃の温度でハイブリダイズし、
及び42℃において0.2×ＳＳＰＥバッファーにより洗浄した際に結合して残る条
件である。ＴＲＡＦ6ｃＤＮＡ同族体はまた、ＢＬＡＳＴＸ(Altschul et al.(19
90)Basic Local Alignment Scarch Tool,J.Mol.Biol.215,403-410)を例とする調
節アルゴリズム(alignment alogrithm)を用いて他のポリペプチドと区別するこ
とができる。
本発明の核酸は、合成／非天然配列であああり、および／または単離されてお
り(すなわち少なくともその自然な状態において伴う幾つかの物質を含まず、所
定のフラクション中に好ましくは少なくとも約0.5重量％、好ましくは少なくと
も約5重量％の全核酸を含む)、及び通常組換え型であり、これは天然のクロモソ
ーム上に結合するもの以外のヌクレオチドに結合する非天然又は天然配列を含
むことを意味する。配列番号:1のヌクレオチド配列又はそのフラグメントを含む
核酸は、そのような配列又はフラグメントを末端に含み、天然のクロモソーム上
に結合するもの以外の配列が直接隣接するか、又は末端に存在するか又は天然の
クロモソーム上に結合するもの以外の配列が直接隣接する、1０kb、好ましくは2
kbより小さい天然のフランキング領域が隣接している。核酸は通常ＲＮＡ又はＤ
ＮＡであるが、しばしば他の塩基又はヌクレオチド誘導体を含む核酸を使用する
ことは改良された安定性等を与え、有利である。
本発明の核酸は、翻訳可能な転写物、ハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣ
Ｒプライマー、診断用核酸等としての使用;ＴＲＡＦ6遺伝子及び遺伝転写の存在
の検出及びさらなるＴＲＡＦ6同族体及び構造類似体をコードする核酸の検出又
は増幅における使用を含む広範囲に適用することができる。診断において、ＴＲ
ＡＦ6ハイブリダイゼーションプローブは、臨床及び研究室試料中の野生型及び
変異体ＴＲＡＦ6対立遺伝子の同定における使用を提供する。変異体対立遺伝子
は、高処理量の臨床診断のための対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)
プローブを産生するのに使用される。治療において、治療学的ＴＲＡＦ6核酸を
細胞性発現又は活性ＴＲＡＦ6の細胞内濃度又は利用可能性をモジュレートする
のに使用される。
本発明は、ＴＲＡＦ6モジュレート可能細胞性機能のレベルにおいて活性な薬
剤のための薬剤、化合物又はリード化合物を同定する効果的な方法を提供する。
一般に、これらのスクリーニング方法はＴＲＡＦ6と天然ＴＲＡＦ6結合ターゲッ
トとの相互作用をモジュレートする化合物をアッセイする方法を含む。様々な結
合薬剤のアッセイ方法が提供され、ラベル化したインビトロタンパク質-タンパ
ク質結合アッセイ、免疫アッセイ、細胞ベースのアッセイ等を含む。該方法は、
自動化され、費用効果のよい高処理量の、化学ライブラリーからのリード化合物
のスクリーニングに従う。同定された試薬類は、製薬工業において動物及び人の
試験のための使用を提供する。例えば、医薬開発のために試薬を誘導化し、イン
ビトロ及びインビボアッセイにおいて再スクリーニングして、活性を最適化し、
かつ毒性を最小にしてもよい。ターゲットの適応症として、感染症、遺伝学的疾
病、異常増殖(neoplasia)、炎症、過敏症等の細胞成長及び調節の機能不全を含
むものであってもよい。
インビトロ結合アッセイは、ＴＲＡＦ6ポリペプチドを含む成分の混合物を使
用するが、これは他のペプチド又はポリペプチドとの融合生産物の一部であって
もよい(例えば、検出又は固着等のための標識断片)。アッセイ混合物は天然の細
胞内ＴＲＡＦ6結合ターゲット(例えばＴＲＡＦ2、ＴＲＡＦ3又はＴＲＡＦ6ポリ
ペプチド)を含む。天然結合ターゲットを使用してもよいが、しばしば、アッセ
イにおいて簡便に測定可能な本発明のＴＲＡＦ6ポリペプチドに対する結合親和
性及び結合活性を断片(例えばペプチド)が与える限り、そのような断片を使用す
ることが好ましい。アッセイ混合物はまた、薬理学的薬剤の候補を含む。候補薬
剤は多数の化学的クラスを包含するが、典型的にはこれらは有機化合物である;
好ましくは低分子の有機化合物であり、これらは合成又は天然化合物のライブラ
リーを含む広範囲な源から得られる。また、様々な他の薬剤が混合物に含まれて
いてもよい。これらは、塩、バッファー、中性タンパク質(例、アルブミン)、洗
浄剤、プロテアーゼ抑制剤、ヌクレアーゼ抑制剤、抗菌剤等を含んでいてもよい
。
得られた混合物は、ＴＲＡＦ6ポリペプチドが規準の結合親和性をもって特異
的に細胞性結合ターゲット、部分又は誘導体に結合するような条件下で、しかし
候補薬理学的薬剤が存在する条件下で、インキュベートされる。混合成分を、必
要な結合を行うようないずれのオーダーで添加することができ、インキュベーシ
ョンは最適結合を容易にするいずれの温度で行ってもよい。インキュベーション
の時間は同様に最適結合となるように選択するが、しかし、迅速かつ抗処理量の
スクリーニングが可能となるように最短化する。
インキュベーション後、ＴＲＡＦ6ポリペプチドと一種以上の結合ターゲット
との間の薬剤偏向結合(agent-biased binding)をいずれかの適切な方法により検
出する。細胞を使用しない(cell-free)結合タイプのアッセイにおいては、分離
ステップをしばしば使用して非結合成分から結合物を分離する。分離は沈殿(例
、ＴＣＡ沈殿、免疫沈降等)、固定化(例、固形物質上)等により行ってもよく、
その後、例えば、膜濾過、ゲルクロマトグラフィー(ゲル濾過、アフィニティー
等)により洗浄を行う。
検出は適切などのような方法により行ってもよい。細胞を使用しない結合アッ
セイにおいて、成分の一種は通常ラベルを含むか、又はラベルに結合される。
ラベルは放射線活性、ルミネセンス、光学濃度又は電子濃度等として直接検出を
行えるものでもよく、又はエピトープ断片、酵素等の間接検出を行えるものでも
よい。様々な方法を使用して、ラベルの性質及び他のアッセイ成分(例えば、光
学又は電子濃度、放射性発光、非放射性エネルギートランスファー等)によりラ
ベルを検出してもよく、又は間接的に抗体結合体等を使用して検出してもよい。
薬剤不存在下におけるＴＲＡＦ6ポリペプチドのターゲットに対する結合親和
性と、薬剤存在下における結合親和性との差異は、該薬剤がＴＲＡＦ6ポリペプ
チドのＴＲＡＦ6結合ターゲットへの結合をモジュレートすることを示している
。同様に、以下に述べる細胞ベースのアッセイにおいて、薬剤の存在下及び不存
在下におけるＴＲＡＦ6-依存クロマチン劣化(degradation)又は不安定性の差異
は、該薬剤がＴＲＡＦ6機能をモジュレートすることを示している。ここで使用
される差異とは、静的に有意であり、好ましくは少なくとも50％、より好ましく
は90％の差異を意味する。
以下に説明のために、実施例及び実験を示すが、これらにより限定されるもの
ではない。
実施例
配列番号:1のヒトＴＲＡＦ6ｃＤＮＡをヒト脾臓細胞及びヒト臍静脈内皮細胞
ｃＤＮＡライブラリーから、高厳密(ストリンジェント)ハイブリダイゼーション
によりクローン化した:40％ホルムアミド、5％デキストランサルフェート、0.5
％ＳＤＳ、5×ＳＳＰＥ、42℃においてハイブリダイゼーションを行い、2×ＳＳ
ＰＥ、0.1％ＳＤＳ、25℃及び0.1×ＳＳＰＥ、0.1％ＳＤＳ、42℃において洗浄
した;ＴＲＡＦオリゴヌクレオチドプローブを使用した。
得られたｃＤＮＡ(配列番号:1)はヒトＴＲＡＦ6(配列番号:2)をコードする。
同時形質移入実験において、ＴＲＡＦ6はＮＦ-κＢ依存レポーター遺伝子を活性
化することを示した(図1)。
酵母2-ハイブリッドシステムを使用してＴＲＡＦ2、ＴＲＡＦ3及びＴＲＡＦ6
を配列番号:2のＴＲＡＦ6タンパク質の細胞内結合ターゲットとして同定した。
また形質移入ベースの共免疫沈降アッセイを、配列番号:2のＴＲＡＦ6タンパク
質の細胞内結合タ
ーゲットを同定するために使用した。簡単に述べると、ＦＬＡＧ-断片標識化Ｔ
ＲＡＦ1、2、3、4及び6はＨＡ-断片標識化ＴＲＡＦ6と共に同時形質移入した。
ライセートは抗ＨＡ抗体及びタンパク質Ａガラスビーズと共に免疫沈降を行った
。抗ＦＬＡＧ抗体を使用したウェスタンブロット分析により、ＴＲＡＦ6-ＴＲＡ
Ｆ6及びＴＲＡＦ6-ＴＲＡＦ3複合体が明らかになった。
ＴＲＡＦ6の欠失変異体は、残基115-522がＮＦ-κＢの活性化を仲介するのに
十分であることを示している(図2)。これに対して、5'欠失を第2のＺｎフィンガ
ードメインまで継続すると活性が失活する;全ての5つのＺｎフィンガードメイン
を通じて5'欠失を行った場合及びＣドメインを通じて欠失を行った場合と同様で
ある。同様に、Ｚｎフィンガードメインの内部欠失は活性を失活する。
実施例
1.高処理量ヒトＴＲＡＦ6-ＴＲＡＦ6結合アッセイのプロトコール
Ａ.試薬
-中性化アビジン:20μｇ/ml(ＰＢＳ中)
-ブロッキングバッファー:5％ＢＳＡ、0.5％Tween20(ＰＢＳ中);室温で1時間
。
-アッセイバッファー:100ｍＭ ＫＣｌ、20ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ7.6、0.25ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、1％グリセロール、0.5％ NP-40、50ｍＭβ-メルカプトエタノー
ル、1mg/ml ＢＳＡ、プロテアーゼ抑制剤のカクテル。
-33ＰヒトＴＲＡＦ6(配列番号:2、残基1-522)10×ストック:200,000-250,000c
pmのラベル化ヒトＴＲＡＦ6(ベックマンカウンター)が追加されている、10-8-
10-6Ｍ非ラベル化ヒトＴＲＡＦ6。スクリーニング中は4℃のマイクロフリッジ
(microfridge)中に置いた。
-プロテアーゼ抑制剤カクテル(1000×):10mlのＰＢＳ中に、10mgトリプシン抑
制剤(ＢＭＢ#109894)、10mgアプロチニン(ＢＭＢ#236624)、25mgベンズアミジ
ン（Sigma♯Ｂ-6506）、25mgロイペプチン（ＢＭＢ #1017128）、10mg
ＡＰＭＳＦ(ＢＭＢ♯917575)及び2ｍＭ ＮａＶｏ3(Sigma♯S6508)を含む。
-ΔＴＲＡＦ6:10-8-10-5Ｍビオチン標識化切断ΔＴＲＡＦ6(配列番号:2、残基
115-522)、ＰＢＳ中。
Ｂ.アッセイプレートの作製
-1ウェルにつき、120μｌのストックＮ-アビジンにより、4℃で一晩コートす
る。
-200μｌＰＢＳで2回洗浄する。
-150μｌのブロッキングバッファーでブロックする。
-200μｌＰＢＳで2回洗浄する。
Ｃ．アッセイ
-40μｌ/ウェルのアッセイバッファーを添加する。
-10μｌの化合物を添加又は抽出する。
-10μｌの33Ｐ-ヒトＴＲＡＦ6(20,000-25,000cpm/0.1-10pmole/ウェル=10-9-1
0-7Ｍ最終濃度)を加える。
-25℃において15分間振る。
-さらに25℃で45分間インキュベートする。
-40μｌのビオチン標識化切断ΔＴＲＡＦ6(0.1-10pmole/40μｌ(アッセイバッ
ファー中))を加える。
-室温で1時間インキュベートする。
-200μｌＰＢＳで4回洗浄を行い反応を停止する。
-150μｌのシンチレーションカクテルを加える。
-トップカウントで計測する。
Ｄ.全アッセイのコントロール(各プレート上に設置する)
a.非特異的結合
b.80％抑制において可溶性(非ビオチン標識化切断ΔＴＲＡＦ６)
2.ＮＦ-κＢ依存レポーター遺伝子アッセイのプロトコール
-293細胞をＥ-セレクチン-ルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミド
(Schindler et al.(1994)Mol Cell Biol 14,5820)及びＴＲＡＦ1、2及び3につ
いてRothe et al(1995)Science269,1424に記載されているように生産したＴＲ
ＡＦ6コード領域を含むＴＲＡＦ6発現ベクター(配列番号:1)と共に同時形質移
入を過渡的に行う。
-コントロール細胞を過渡的にＣＭＶプロモータールシフェラーゼレポーター
遺伝子プラスミドおよび／または上述したのと同様なＴＲＡＦ2発現ベクター
と
共に同時形質移入を行う。
-Rothe et al(1995)Science269,1424の図3に記載されているように、形質移入
を行った細胞を候補化合物又は抽出物存在下に24時間インキュベートを行い、
次に細胞を採取してルシフェラーゼ活性を決定し、β-ガラクトシダーゼ発現
をベースとして規準化した。
本明細書中で引用した全ての文献及び特許出願を、各文献及び特許出願が明確
に詳細に記載されていると同様に、ここにその内容を全て引用する。明確な理解
のために図示及び実施例という形で前述する発明について詳細に述べたが、本発
明の記載に照らし合わせて本特許請求の範囲の精神又は意図するところから逸脱
することなく、これらについて適当に変更及び修正を行ってもよいことは当業者
に明らかである。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ
33/566 33/566
(72)発明者 シオン ジェシー
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
94080 サウス サン フランシスコ ト
ゥー コーポレイト ドライヴ（番地な
し)