JP2000509724A

JP2000509724A - ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドホスホロアミダイトの合成方法

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Publication number: JP2000509724A
Application number: JP10530084A
Authority: JP
Inventors: グリフィー，リチャード・エイチ; コール，ダグラス・エル; ラヴィクマー，ヴァスリンガ
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-12-27
Filing date: 1997-12-16
Publication date: 2000-08-02
Anticipated expiration: 2017-12-16
Also published as: WO1998029429A1; EP0948514A4; DE69733150T2; AU5529398A; EP0948514A1; ATE294186T1; JP3675847B2; DE69733150D1; US5955600A; EP0948514B1

Abstract

(57)【要約】この発明は、ホスホロアミダイト合成の廃棄物質からホスホロアミダイトを回収するための新規な方法を提示する。その方法は、トリブロモフェノキシジクロロホスホランをアミンの存在下でＨ−ホスホネートと反応させることを含む。

Description

【発明の詳細な説明】ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドホスホロアミダイトの合成方法発明の分野本発明は、ホスホロアミダイト及びオリゴホスホロアミダイトの新規な製法に向けられている。本法は、なかんずく、オリゴヌクレオチド診断試薬、研究試薬及び治療剤の合成に有用なホスホロアミダイトの調製に有用である。発明の背景哺乳動物における殆どの疾患状態を包含する殆どの身体的状態がタンパク質による影響を受けていることは周知である。直接に又はそれらの酵素機能を介して作用するそのようなタンパク質は、哺乳動物及びヒトにおける多くの疾患に大きな割合で寄与している。古典的な医薬品は、概して、そのようなタンパク質の疾患惹起機能又は増強機能を調節しようと、それらとの相互作用に焦点を置いてきた。しかしながら、最近、細胞内ＲＮＡのような、そのようなタンパク質の合成を指揮する分子との相互作用により、それらの現実の産生を調節する試みがなされている。タンパク質の産生に干渉することにより、最大の効果と最小の副作用で、治療結果に影響を及ぼすことが期待されている。望ましくないタンパク質形成を招く遺伝子発現に干渉するか又は他の方法で調節することが、そのような治療的アプローチの一般的目的である。特定の遺伝子発現を阻害する１つの方法は、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体を“アンチセンス”剤として使用することである。特定の標的であるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列に相補的なオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体が使用される。アンチセンス方法論は、しばしば、比較的短いオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体を一本鎖ｍＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡに相補的にハイブリダイゼーションさせて、これら細胞内核酸の正常な本質的機能を崩壊させることに向けられる。ハイブリダイゼーションは、ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡのワトソン−クリック塩基対へのオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体の配列特異的水素結合である。そのような塩基対は、互いに相補的であると言われる。アンチセンス治療でのこれまでの試みは、ハイブリダイゼーションにより特定のｍＲＮＡに特異的様式で結合するようにデザインされたオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体（即ち、標的ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド）を提供してきた。そのようなオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体は、多くのメカニズムのいずれかにより、選択されたｍＲＮＡの活性を阻害する（即ち、そのｍＲＮＡによりコードされるタンパク質を産生する翻訳反応に干渉する）ように意図されている。干渉されたｍＲＮＡ配列によりコードされる特定のタンパク質の形成の阻害は、治療的恩恵をもたらすと考えられてきたが、解決されるべき課題が依然として存在している。一般的には、Cook，P.D．Anti-Cancer Drug Design 1991，6，585；Cook，P.D．Medicina l Chemistry Strategies for Antisense Research，in Antisense Research & A pplications，Crookeら，CRC Press，Inc．;Boca Raton，FL，1993；Uhlmannら，A Chem．Rev．1990，90，543を参照のこと。オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体は、今日、治療法及び診断法に大きな見込みのある治療剤として受け入れられている。しかし、治療目的、診断目的、及び研究試薬用にオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体をアンチセンス剤として適用することは、それらオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体が大量に合成されること、細胞膜を横切って輸送されるか又は細胞により吸収されること、標的ＲＮＡ又はＤＮＡと大まかにハイブリダイズすること、及びその後に核酸機能を終結させるか又は崩壊させることがしばしば要求される。これら重要な機能は、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体のヌクレアーゼ分解に対する初期の安定性に依存している。これら目的、特にアンチセンス療法のための未修飾オリゴヌクレオチドの深刻な欠陥は、種々の細胞内及び細胞外の至る所に存在する核酸分解酵素により、投与されたオリゴヌクレオチドが酵素的に分解されることである。アンチセンス剤（即ち、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体）の治療活性を高めるために多くの化学修飾がアンチセンス剤に導入されている。そのような修飾は、アンチセンス剤の細胞透過を高めるように、体内におけるアンチセンス剤の構造又は活性を劣化又はそれに干渉するヌクレアーゼ又は他の酵素からそれらを安定化させるように、標的ＲＮＡへのアンチセンス剤の結合を増進させるように、一旦アンチセンス剤が配列特異的に標的ＲＮＡに結合したなら、崩壊（終結）の様式を提供するように、及びアンチセンス剤の薬物動態的及び薬力学的特性を向上させるようにデザインされる。未修飾、つまり“野生型”のオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼにより急速に分解されるので、有用な治療剤であるということはできない。これらオリゴヌクレオチド及びそれらの修飾された誘導体の薬剤としての用途の潜在性が、これら化合物の大規模合成に新たな挑戦を創り出している。オリゴヌクレオチドの固相合成は、反応を完結せるために１当量を越えるヌクレオシドのホスホロアミダイトシントンが使用される点で、本来的に浪費的である。大量のオリゴヌクレオチド合成を研究用途のため及び臨床試験に向けた大規模製造のために行われるとすると、高価なヌクレオシドホスホロアミダイトの浪費は大きな経済的及び環境的問題になる。この問題は、修飾した糖又はヌクレオベース含有シントンがオリゴヌクレオチド治療剤に使用される場合のように、ホスホロアミダイト段階に到達する前に多工程合成を介してそのモノマーを合成しなければならないとすると、より深刻になる。従って、大量のホスホロアミダイト試薬の犠牲を必要としない合成法の必要性が当該技術分野に存在している。本発明は、これらだけでなく他の必要性にも対処するものである。発明の要旨本発明は、伝統的ホスホロアミダイト合成の廃棄物質からホスホロアミダイトを回収するための新規な方法に向けられている。好ましい態様においては、ホスホロアミダイトを製造する方法であって：式：〔式中：Ｚは、ヌクレオシド間連結であり；Ｒ₁は、ヒドロキシル保護基であり；Ｒ₂は、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアルコキシ、式（Ｏ−アルキル）_mのポリエーテル（式中、ｍは１〜約１０である）、又は保護されたヒドロキシル基であり；Ｒ₃は、ホスホリル保護基であり；Ｂは、ヌクレオベースであり；そしてｎは、０〜約１００である。〕の化合物を式：〔式中：Ｘ₁は、Ｂｒ又はＣｌであり；Ｘ₂及びＸ₃は、各々独立に、Ｈ、Ｂｒ又はＣｌであり；ｘ及びｙは、各々独立に、２又は３であり、そしてｘとｙの合計が５である。〕の化合物と反応させる工程；及び該反応の生成物を式ＨＮ(Ｑ)₂の化合物と接触させて、式：のホスホロアミダイトを生成させる工程を含んでなる方法が提供される。幾つかの好ましい態様においては、Ｑはアルキル、好ましくはイソプロピルである。Ｒ₂は、好ましくは、Ｈ、保護されたヒドロキシル基、Ｏ−アルキル又はＯ− アルキルアルコキシである。より好ましい態様においては、Ｒ₂はメトキシエトキシである。幾つかの好ましい態様においては、Ｒ₃は、シアノエチル、４−シアノ−２− ブテニル、又はジフェニルメチルシリルエチルである。好ましくは、ｘは３でありｙは２である。好ましい態様においては、この反応は溶媒中で行われ、好ましくはアセトニトリル中で行われる。幾つかの好ましい態様においては、ヌクレオベースは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、５−メチルシトシン又はそれらの保護された誘導体である。更に好ましい態様においては、Ｚは、ホスホジエステル連結、ホスホロチオエート連結、ホスホロジチオエート連結、又はホスホネート連結である。特に好ましい態様においては、Ｚは、ホスホジエステル連結又はホスホロチオエート連結である。好ましい態様の詳細な説明本発明は、ホスホロアミダイトの新規な製造方法を提示する。これら方法は、オリゴヌクレオチド合成において廃棄物質として生成する多種多様な種の回収に有用である。好ましい態様においては、式：〔式中、Ｚは、ヌクレオシド間連結であり；Ｒ₁は、ヒドロキシル保護基であり；Ｒ₂は、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアルコキシ、式（Ｏ−アルキル）_mのポリエーテル（式中、ｍは１〜約１０である）、又は保護されたヒドロキシル基であり；Ｒ₃は、ホスホリル保護基であり；Ｂは、ヌクレオベースであり；ｎは、０〜約１００であり、そして各々のＱは、独立に１〜１５の炭素を有するアルキル又は６〜１４の炭素を有するアリールであるか、又は（Ｑ）₂が、該ホスホロアミダイト窒素と一緒に２〜１０の炭素を有する複素環を形成することができる。〕のホスホロアミダイトを製造する方法が提供される。これら方法は、式Ｉ又はII：の化合物を式III：〔式中：Ｘ₁は、Ｂｒ又はＣｌであり；Ｘ₂及びＸ₃は、独立に、Ｈ、Ｂｒ又はＣｌであり；ｘ及びｙは、独立に、２又は３で、ｘとｙの合計が５である。〕の化合物と反応させる工程；及び該反応の生成物を式ＨＮ(Ｑ)₂の化合物と接触させる工程を含んでなる。式Ｉ又はIIの化合物は、例えば、Oligonucleotides and Analogues:A Practic al Approach，Eckstein，F.，編，IRL Press，Oxford，U.K．1991に記載されているような、伝統的なオリゴヌクレオチド合成に使用される過剰の廃ホスホロアミダイト試薬から誘導できる。なお、この文献は、参照によりそっくりそのまま本明細書中に組み入れられるものとする。典型的なオリゴヌクレオチド合成手法では、生長しているオリゴヌクレオチド鎖のフリーの５'−ヒドロキシルが、過剰のテトラゾールの存在下で、数倍モル過剰のヌクレオシドＮ,Ｎ−ジアルキルホスホロアミダイトと反応させられる。テトラゾール触媒は、まず、ホスホロアミダイトの第２アミノ基と置き換わって、テトラゾリド付加物を形成すると考えられる。次いで、そのテトラゾリドが生長している鎖のフリーの５'−ヒドロキシルと反応してホスファイトを形成し、これがその後に、例えば、酸化により、望まれる連結に変換される。過剰の（即ち、未反応の）テトラゾリド付加物は、反応チャンバーから洗われてから、周囲の水と反応して式Ｉにより表されるＨ− ホスホネート種を形成し、式IIにより表されるその互変異性体と共に平衡して存在する。かくして、１つの側面において、本発明は、オリゴヌクレオチド合成の廃棄物質からホスホロアミダイトシントンを回収する便利な方法を提供する。本発明の方法は、オリゴヌクレオチド合成において有意な経済的及び環境的恩恵を提供する。特定の理論に拘束されることを望まないが、ホスホネート種（式Ｉ）及びそのホスファイト互変異性体（II）は、ホスホネート種が優勢であるが、溶液中で平衡して存在すると考えられる。ハロフェノキシクロロホスホラン、好ましくはトリス（２,４,６−トリブロモフェノキシ）ジクロロホスホラン又はビス（２,４,６−トリブロモフェノキシ）トリクロロホスホランは、このホスファイト種と優先的に反応してハライド付加物を形成し、次いでそれが第２アミンと反応するとホスホロアミダイト生成物が形成されると考えられる。従って、本発明の方法は、好都合にも、単一の反応容器内でも、数段階でも行うことができる。式Ｉ又はIIのシントンは、ホスホロアミダイトオリゴマー合成に用いられ得る多種多様などのようなホスホロアミダイト種からも誘導される。従って、それらシントンは、単量体、二量体又はそれより高いオーダーのシントン（即ち、オリゴホスホロアミダイト）であってもよく、多種多様なあらゆるヌクレオシド間連結、糖、ヌクレオベース、及び当該技術分野で公知のそれらの修飾された誘導体を含むことができる。式Ｉ又はIIのシントン中に存在することができるヌクレオシド間連結の例には、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、及びホスホネート連結が含まれる。更なる代表的ヌクレオシド間連結には、Waldnerら，Syn lett．1，57-61(1994)、De Mesmaekerら，Synlett．10，733-736(1993)、Lebret onら，Synlett．2，137-140(1994)、De Mesmaekerら，Bioorg．Medic.Chem．Let t．4，395-398(1994)、De Mesmaekerら，Bioorg．Medic．Chem．Lett．4，873-8 78(1994)、Lebretonら，Tet．Letters 34，6383-6386(1993)、Lebretonら，Tet ．Letters 35，5225-5228(1994)、Waldnerら，Bioorg．Medic．Chem．Lett．4， 405-408(1994)に記載されたもののような、アミド又は置換アミド連結、及び米国特許第５,４８９,６７７号、１９９４年１０月３日に出願された米国特許出願第０８／３１７,２８９号、１９９５年２月２７日に出願された米国特許出願第０８／３９５,１６８号に記載された連結が含まれる。本発明の文脈において、“オリゴヌクレオチド”という用語は、特定の配列に形成された複数の繋がったヌクレオチド単位のことを言う。ヌクレオチドという用語は、ヌクレオシドのホスホリルエステルとしての慣用された意味を有する。 “ヌクレオシド”という用語も、ヌクレオシド塩基（即ち、窒素複素環塩基又は “ヌクレオベース”）に結合したペントフラノシル糖としての慣用された意味を有する。本発明の方法が、天然に存在するものと天然に存在しないものの両方の、構成糖、ヌクレオシド間連結及び／又はヌクレオベース（即ち、ヌクレオシド塩基）を有するホスホロアミダイトの合成に使用できることが分かるであろう。天然に存在しない糖、ヌクレオシド間連結及びヌクレオベースは、典型的には、天然に存在する糖（例えば、リボース及びデオキシリボース）、ヌクレオシド間連結（即ち、ホスホジエステル連結）、及びヌクレオシド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン）と機能的に互換可能であるが、構造的に区別可能な形態である。かくして、天然に存在しない部分には、天然に存在する部分の構造及び／又は機能を真似る全ての構造体、及びオリゴヌクレオチド類似体の標的への結合を助けるか又は他の方法でホスホロチオエートオリゴマーの特性に有益に寄与する全ての構造体が含まれる。天然に存在しない糖の代表例には、２'位に結合した種々の置換基を有する糖が含まれる。これらには、例えば、ハライド、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアルコキシ、保護されたＯ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアミノアルキル、Ｏ−アルキルイミダゾール、及び式（Ｏ−アルキル）_mのポリエーテル（式中、ｍは１〜約１０である）が含まれる。これらポリエーテルの中で好ましいのは、線状及び環状のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び、クラウンエーテル及びOuchiら，Drug Design and Discovery 1992，9，93、Ravasioら，J．Org．Chem．1991，56，4329及びDelgardoら，Critical Reviews in Therap eutic Drug Carrier Systems 1992，9，249により開示されたもののようなＰＥＧ含有基である。更なる糖修飾が、前掲のCook，P.D．に開示されている。フルオロ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルイミダゾール、Ｏ−アルキルアミノアルキル、及びアルキルアミノ置換基が、Oligomeric Compounds h aving Pyrimidine Nucleotide(s)with 2’and 5’Substitutionsと題された１９９５年３月６日出願の米国特許出願第０８／３９８,９０１号に記載されている。なお、この出願は、参照により本明細書中に組み入れられるものとする。リボシル環上にＯ−置換を有する糖も本発明に服するものである。環上のＯの代表的置換には、Ｓ、ＣＨ₂、ＣＨＦ、及びＣＦ₂が含まれる。例えば、Secrist ら，Abstract 21，Program & Abstracts，Tenth International Roundtable，Nu cleosides，Nucleosides and their Biological Applications，Park City， Utah，Sept．16-20，1992を参照のこと。本発明の方法に使用するのに適する代表的ヌクレオベースには、アデニン、グアニン、シトシン、ウリジン及びチミン、並びに、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンとグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニンとグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、５−ハロウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、オキサ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル類及びシトシン類、７−メチルグアニンのような、他の天然に存在しない及び天然に存在するヌクレオベースが含まれる。更なる天然に存在する及び天然に存在しないヌクレオベースには、米国特許第３,６８７,８０８号１（Meriganら）に、Sanghvi，Y．によりAntisense Resea rch and Applications，CrookeとB．Lebleu編，CRC Press，1993の１５章に、En glischら，Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613-722（特に622頁と623頁を参照のこと）に、Concise Encyclopedia of Polymer Scienc e and Engineering，J.I．Kroschwitz編，John Wiley & Sons，1990，pp.858-85 9に、そしてCook，P.D．Anti-Cancer Drug Design 1991，6，585-607に開示されているものが含まれる。前述の各々の開示内容は、参照によりそっくりそのまま本明細書中に組み入れられるものとする。“ヌクレオシド塩基”及び“ヌクレオベース”という用語は、最も古典的な意味ではヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基と同じように機能する一定の“万能塩基”を包含する、ヌクレオシド塩基として役立つことができる複素環化合物を更に包含することが意図される。そのような万能塩基の代表例の１つは３−ニトロピロールである。本発明の幾つかの好ましい態様においては、Ｒ₁はヒドロキシル保護基である。多種多様なヒドロキシル保護基を本発明の方法に用いることができる。好ましくは、この保護基は塩基性条件下で安定であるが、酸性条件下では除去できるものである。代表的なヒドロキシル保護基は、Beaucageら，Tetrahedron 1992，48 ，2223-2311に開示されており、例えば、GreenとWuts，Protective Groups in O rganic Synthesis，2d edition，John Wiley & Sons，New York，1991の第２章にも開示されている。Ｒ₁に使用される好ましい保護基には、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、モノメトキシトリチル、９−フェニルキサンテン−９−イル（Ｐｉｘｙ１）及び９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンテン−９−イル（Ｍｏｘ）が含まれる。このＲ₁基は、本発明のオリゴマー化合物から、フリーのヒドロキシルを形成させるのに当該技術分野でよく知られている技術により除去することができる。例えば、ジメトキシトリチル保護基は、ギ酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸のようなプロトン酸により又は例えば臭化亜鉛のようなルイス酸で除去することができる。本発明の幾つかの好ましい態様においては、Ｒ₃はホスホリル保護基である。このホスホリル保護基はリン結合酸素に結合し、オリゴヌクレオチド合成の間のリンを保護する役目を果たす。前掲のOligonucleotides and Analogues:A Pract ical Approachを参照のこと。１つの代表的なホスホリル保護基は、シアノエチル基である。他の代表的なホスホリル保護基には、４−シアノ−２−ブテニル基、メチル基、及びジフェニルメチルシリルエチル（ＤＰＳＥ）基が含まれる。一般に、保護基は、本発明のオリゴヌクレオチド合成法において、幾つかの異なるタイプの官能基の保護に使用される。一般に、保護基は、化学官能基を特定の反応条件に対して不活性にし、そして分子中のそのような官能基に付いたりそれから外れたりすることができ、その際にその分子の残りの部分を実質的に損なうことがない。ホスホロチオエート合成の間にヌクレオチドを保護するのに有用な代表的保護基には、塩基不安定保護基及び酸不安定保護基が含まれる。塩基不安定保護基は、複素環ヌクレオベースの環外アミノ基を保護するのに用いられる。このタイプの保護は、一般にアシル化により成される。２つの広く使用されるアシル化剤は、塩化ベンゾイル及び塩化イソブチリルである。これら保護基は、本発明の方法に用いられる反応条件に対して安定で、かつオリゴヌクレオチド合成の間も安定で、オリゴヌクレオチド合成の終わりの塩基処理の間に凡そ等速で開裂される。本発明の合成方法にやはり用いられる第２のタイプの保護は、酸不安定保護基であり、これは合成中のヌクレオチドの５'−ヒドロキシルを保護するために用いられる。トリス（２,４,６−トリブロモフェノキシ）ジクロロホスホラン又はビス（２ ,４,６−トリブロモフェノキシ）トリクロロホスホランは、Hotodaら，Tetrahed ron Letters 1987，28（15）1681-1684の方法に従って合成され得る。本発明の方法においては、式Ｉ又はIIの化合物とトリブロモフェノキシクロロホスホランとの間の反応の生成物が、第２アミンと反応してホスホロアミダイト生成物を形成する。第２アミンの置換基は、ホスホロアミダイト窒素置換基として機能することが知られている多くの種の中から選ぶことができる。代表例には、低級アルキル基、アリール基、及びホスホロアミダイト窒素がＮ−モルホリン環系の一部を形成するような環状構造体が含まれる。特に好ましい態様においては、これら置換基は、低級アルキル基、特にイソプロピル基である。他の適するアミンの例は、種々の米国特許に、主にM．Caruthersらへの米国特許に記載されている。これらには、米国特許第４,６６８,７７７号；４,４５８,０６６号；４ ,４１５,７３２号；及び４,５００,７０７号が含まれ、これら全ては、参照により本明細書中に組み入れられるものとする。本明細書で使用される“アルキル”という用語には、直鎖、分枝鎖、及び脂環式炭化水素基が含まれるが、これらに限定されない。本発明のアルキル基は置換されていてもよい。代表的なアルキル置換基は、米国特許第５,２１２,２９５号の第１２欄４１〜５０行に開示されている。本明細書において使用される“アラルキル”という用語は、アリール基を有するアルキル基、例えば、ベンジル基を表す。“アルカリール”という用語は、アルキル基を有するアリール基、例えば、メチルフェニル基を表す。“アリール” 基は、フェニル、ナフチル、アントラシル、フェナントリル、ピレニル、及びキシリルを包含するがこれらに限定されない、芳香族環状化合物である。本発明の幾つかの好ましい態様においては、アミノ基が、アルキル、又は例えば２'−アルコキシ基（即ち、Ｒ₂がアルコキシの場合）のような他の基に付く。そのようなアミノ基は、天然に存在するヌクレオベース及び天然に存在しないヌクレオベース中にも広く存在している。本発明のオリゴマー化合物の合成の間はこれらアミノ基が保護された形態にあるのが一般に好ましい。これら目的に適する代表的アミノ保護基は、前掲のGreenとWutsの第７章に説明されている。一般に、本明細書に使用される“ヌクレオベース”という用語には、それらの保護された誘導体が含まれる。本発明の方法により製造されるオリゴマーホスホロアミダイトは、好ましくは、約１〜約１００のモノマーサブユニットを含むであろう。そのような化合物が約１〜約３０のモノマーサブユニットを含むのがより好ましく、１〜１０のモノマーサブユニットがより好ましく、そして１〜５のモノマーサブユニットを含むのが特に好ましい。この発明の追加の利点及び新規な特徴は、以下に示す本発明の実施例を参照すれば当業者に明らかになるであろう。これら実施例は、添付の請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。実施例１トリス（２,４,６−トリブロモフェノキシ）ジクロロホスホランの調製 Hotodaら，Tetrahedron Letters 1987，Vol.28，1681-1684の方法に従ってこの化合物を合成した。実施例２５'−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）チミジン−３'−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルＮ,Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の調製マグネチックスターラー、アルゴンガス導入管、及び隔壁を装備した２５０ｍＬ２頸フラスコをアルゴン雰囲気下で組み立てる。全てのガラス部分を１２０℃ で１時間乾燥する。そのフラスコに５'−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）チミジン−３'−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルホスホネート）（０．０１５モル）及びジイソプロピルアミン（０．１２モル）を仕込む。無水アセトニトリル（２００ｍＬ）を加える。アルゴン気流下で室温で攪拌されたこの混合液に、トリス（２,４,６−トリブロモフェノキシ）ジクロロホスホラン（０. ２２５モル）を加える。３時間攪拌した後、この反応混合液を濾過して、減圧濃縮する。粗生成物をシリカゲルを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して目的生成物を得る。トリエチルアミン（１％）をこの精製の全体を通して用いる。³¹ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）１４５.５、１４６.１。実施例３Ｎ²−イソブチリル−５'−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）−２'−デオキシグアノシン−３'−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルＮ,Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の調製マグネチックスターラー、アルゴンガス導入管、及び隔壁を装備した２５０ｍＬ２頸フラスコをアルゴン雰囲気下で組み立てる。全てのガラス部分を１２０℃ で１時間乾燥する。そのフラスコにＮ²−イソブチリル−５'−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）−２'−デオキシグアノシン−３'−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルホスホネート）（０.０１５モル）及びジイソプロピルアミン（０.１２モル）を仕込む。無水アセトニトリル（２００ｍＬ）を加える。アルゴン気流下で室温で攪拌されたこの混合液に、トリス（２,４,６−トリブロモフェノキシ）ジクロロホスホラン（０.２２５モル）を加える。３時間攪拌した後、この反応混合液を濾過して、減圧濃縮する。粗生成物をシリカゲルを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して目的生成物を得る。トリエチルアミン（１％）をこの精製の全体を通して用いる。実施例４Ｎ⁶−ベンゾイル−５'−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）−２'−デオキシアデノシン−３'−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルＮ,Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の調製マグネチックスターラー、アルゴンガス導入管、及び隔壁を装備した２５０ｍＬ２頸フラスコをアルゴン雰囲気下で組み立てる。全てのガラス部分を１２０℃ で１時間乾燥する。そのフラスコにＮ⁶−ベンゾイル−５'−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）−２'−デオキシアデノシン−３'−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルホスホネート）（０.０１５モル）及びジイソプロピルアミン（０.１２モル）を仕込む。無水アセトニトリル（２００ｍＬ）を加える。アルゴン気流下で室温で攪拌されたこの混合液に、トリス（２,４,６−トリブロモフェノキシ）ジクロロホスホラン（０.２２５モル）を加える。３時間攪拌した後、この反応混合液を濾過して、減圧濃縮する。粗生成物をシリカゲルを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して目的生成物を得る。トリエチルアミン（１％）をこの精製の全体を通して用いる。実施例５Ｎ⁴−ベンゾイル−５'−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）−２'−デオキシシチジン−３'−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルＮ,Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の調製マグネチックスターラー、アルゴンガス導入管、及び隔壁を装備した２５０ｍＬ２頸フラスコをアルゴン雰囲気下で組み立てる。全てのガラス部分を１２０℃ で１時間乾燥する。そのフラスコにＮ⁴−ベンゾイル−５'−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）−２'−デオキシシチジン−３'−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルホスホネート）（０.０１５モル）及びジイソプロピルアミン（０. １２モル）を仕込む。無水アセトニトリル（２００ｍＬ）を加える。アルゴン気流下で室温で攪拌されたこの混合液に、トリス（２,４,６−トリブロモフェノキシ）ジクロロホスホラン（０.２２５モル）を加える。３時間攪拌した後、この反応混合液を濾過して、減圧濃縮する。粗生成物をシリカゲルを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して目的生成物を得る。トリエチルアミン（１％）をこの精製の全体を通して用いる。実施例６２−ジフェニルメチルシリルエチル−５'−（Ｏ−４,４'−ジメトキシトリチル）チミジニル−チミジン二量体アミダイトマグネチックスターラー、アルゴンガス導入管、及び隔壁を装備した２５０ｍＬ２頸フラスコをアルゴン雰囲気下で組み立てる。全てのガラス部分を１２０℃ で１時間乾燥する。そのフラスコに２−ジフェニルメチルシリルエチル−５'− （Ｏ−４,４'−ジメトキシトリチル）チミジニル−チミジン二量体ホスホネート（０.０１５モル）及びジイソプロピルアミン（０.１２モル）を仕込む。無水アセトニトリル（２００ｍＬ）を加える。アルゴン気流下で室温で攪拌されたこの混合液に、トリス（２,４,６−トリブロモフェノキシ）ジクロロホスホラン（０ .２２５モル）を加える。３時間攪拌した後、この反応混合液を濾過して、減圧濃縮する。粗生成物をシリカゲルを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して目的生成物を得る。トリエチルアミン（１％）をこの精製の全体を通して用いる。実施例７２−ジフェニルメチルシリルエチル−５'−（Ｏ−４,４'−ジメトキシトリチル）−Ｎ⁴−ベンゾイル−２'−デオキシシチジニル−チミジン二量体アミダイトマグネチックスターラー、アルゴンガス導入管、及び隔壁を装備した２５０ｍＬ２頸フラスコをアルゴン雰囲気下で組み立てる。全てのガラス部分を１２０℃ で１時間乾燥する。そのフラスコに２−ジフェニルメチルシリルエチル−５'− （Ｏ−４,４'−ジメトキシトリチル）−Ｎ⁴−ベンゾイル−２'−デオキシシチジニル−チミジン二量体ホスホネート（０.０１５モル）及びジイソプロピルアミン（０.１２モル）を仕込む。無水アセトニトリル（２００ｍＬ）を加える。アルゴン気流下で室温で攪拌されたこの混合液に、トリス（２,４,６−トリブロモフェノキシ）ジクロロホスホラン（０.２２５モル）を加える。３時間攪拌した後、この反応混合液を濾過して、減圧濃縮する。粗生成物をシリカゲルを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して目的生成物を得る。トリエチルアミン（１％）をこの精製の全体を通して用いる。実施例８２−ジフェニルメチルシリルエチル−５'−（Ｏ−４,４'−ジメトキシトリチル）−Ｎ²−イソブチリル−２'−デオキシグアノシニル−チミジン二量体アミダイトマグネチックスターラー、アルゴンガス導入管、及び隔壁を装備した２５０ｍＬ２頸フラスコをアルゴン雰囲気下で組み立てる。全てのガラス部分を１２０℃ で１時間乾燥する。そのフラスコに２−ジフェニルメチルシリルエチル−５'− （Ｏ−４,４'−ジメトキシトリチル）−Ｎ²−イソブチリル−２'−デオキシグアノシニル−チミジン二量体ホスホネート（０.０１５モル）及びジイソプロピルアミン（０.１２モル）を仕込む。無水アセトニトリル（２００ｍＬ）を加える。アルゴン気流下で室温で攪拌されたこの混合液に、トリス（２,４,６−トリブロモフェノキシ）ジクロロホスホラン（０.２２５モル）を加える。３時間攪拌した後、この反応混合液を濾過して、減圧濃縮する。粗生成物をシリカゲルを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して目的生成物を得る。トリエチルアミン（１％）をこの精製の全体を通して用いる。実施例９２−ジフェニルメチルシリルエチル−５'−（Ｏ−４,４'−ジメトキシトリチル）−Ｎ⁶−ベンゾイル−２'−デオキシアデノシニル−チミジン二量体アミダイトマグネチックスターラー、アルゴンガス導入管、及び隔壁を装備した２５０ｍＬ２頸フラスコをアルゴン雰囲気下で組み立てる。全てのガラス部分を１２０℃ で１時間乾燥する。そのフラスコに２−ジフェニルメチルシリルエチル−５'− （Ｏ−４,４'−ジメトキシトリチル）−Ｎ⁶−ベンゾイル−２'−デオキシアデノシニル−チミジン二量体ホスホネート（０.０１５モル）及びジイソプロピルアミン（０.１２モル）を仕込む。無水アセトニトリル（２００ｍＬ）を加える。アルゴン気流下で室温で攪拌されたこの混合液に、トリス（２,４,６−トリブロモフェノキシ）ジクロロホスホラン（０.２２５モル）を加える。３時間攪拌した後、この反応混合液を濾過して、減圧濃縮する。粗生成物をシリカゲルを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して目的生成物を得る。トリエチルアミン（１％）をこの精製の全体を通して用いる。実施例１０２−ジフェニルメチルシリルエチル−５'−（Ｏ−４,４'−ジメトキシトリチル）−Ｎ²−イソブチリル−２’−デオキシグアノシニル−Ｎ⁶−ベンゾイル−２' −デオキシアデノシニル二量体アミダイトマグネチックスターラー、アルゴンガス導入管、及び隔壁を装備した２５０ｍＬ２頸フラスコをアルゴン雰囲気下で組み立てる。全てのガラス部分を１２０℃ で１時間乾燥する。そのフラスコに２−ジフェニルメチルシリルエチル−５'− （Ｏ−４,４'−ジメトキシトリチル）−Ｎ²−イソブチリル−２'−デオキシグアノシニル−Ｎ⁶−ベンゾイル−２'−デオキシアデノシニル二量体ホスホネート（０.０１５モル）及びジイソプロピルアミン（０.１２モル）を仕込む。無水アセトニトリル（２００ｍＬ）を加える。アルゴン気流下で室温で攪拌されたこの混合液に、トリス（２,４,６−トリブロモフェノキシ）ジクロロホスホラン（０. ２２５モル）を加える。３時間攪拌した後、この反応混合液を濾過して、減圧濃縮する。粗生成物をシリカゲルを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して目的生成物を得る。トリエチルアミン（１％）をこの精製の全体を通して用いる。実施例１１５'−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）ウリジン−２'−Ｏ−メトキシエチル −３'−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルＮ,Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の調製マグネチックスターラー、アルゴンガス導入管、及び隔壁を装備した２５０ｍＬ２頸フラスコをアルゴン雰囲気下で組み立てる。全てのガラス部分を１２０℃ で１時間乾燥する。そのフラスコに５'−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）ウリジン−２'−Ｏ−メトキシエチル−３'−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルホスホネート）（０.０１５モル）及びジイソプロピルアミン（０.１２モル）を仕込む。無水アセトニトリル（２００ｍＬ）を加える。アルゴン気流下で室温で攪拌されたこの混合液に、トリス（２,４,６−トリブロモフェノキシ）ジクロロホスホラン（０.２２５モル）を加える。３時間攪拌した後、この反応混合液を濾過して、減圧濃縮する。粗生成物をシリカゲルを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して目的生成物を得る。トリエチルアミン（１％）をこの精製の全体を通して用いる。³¹ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）１４５.５、１４６１。実施例１２Ｎ²−イソブチリル−５'−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）−２'−Ｏ−メトキシエチルグアノシン−３'−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルＮ,Ｎ −ジイソプロピルホスホロアミダイト）の調製マグネチックスターラー、アルゴンガス導入管、及び隔壁を装備した２５０ｍＬ２頸フラスコをアルゴン雰囲気下で組み立てる。全てのガラス部分を１２０℃ で１時間乾燥する。そのフラスコにＮ²−イソブチリル−５'−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）−２'−Ｏ−メトキシエチルグアノシン−３'−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルホスホネート）（０.０１５モル）及びジイソプロピルアミン（０.１２モル）を仕込む。無水アセトニトリル（２００ｍＬ）を加える。アルゴン気流下で室温で攪拌されたこの混合液に、トリス（２,４,６−トリブロモフェノキシ）ジクロロホスホラン（０.２２５モル）を加える。３時間攪拌した後、この反応混合液を濾過して、減圧濃縮する。粗生成物をシリカゲルを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して目的生成物を得る。トリエチルアミン（１％）をこの精製の全体を通して用いる。実施例１３Ｎ⁶−ベンゾイル−５'−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）−２'−Ｏ−メトキシエチルアデノシン−３'−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルＮ,Ｎ− ジイソプロピルホスホロアミダイト）の調製マグネチックスターラー、アルゴンガス導入管、及び隔壁を装備した２５０ｍＬ２頸フラスコをアルゴン雰囲気下で組み立てる。全てのガラス部分を１２０℃ で１時間乾燥する。そのフラスコにＮ⁶−ベンゾイル−５'−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）−２'−Ｏ−メトキシエチルアデノシン−３'−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルホスホネート）（０.０１５モル）及びジイソプロピルアミン（０.１２モル）を仕込む。無水アセトニトリル（２００ｍＬ）を加える。アルゴン気流下で室温で攪拌されたこの混合液に、トリス（２,４,６−トリブロモフェノキシ）ジクロロホスホラン（０.２２５モル）を加える。３時間攪拌した後、この反応混合液を濾過して、減圧濃縮する。粗生成物をシリカゲルを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して目的生成物を得る。トリエチルアミン（１％）をこの精製の全体を通して用いる。実施例１４Ｎ⁴−ベンゾイル−５'−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）−２'−Ｏ−メトキシエチルシチジン−３'−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルＮ,Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の調製マグネチックスターラー、アルゴンガス導入管、及び隔壁を装備した２５０ｍＬ２頸フラスコをアルゴン雰囲気下で組み立てる。全てのガラス部分を１２０℃ で１時間乾燥する。そのフラスコにＮ⁴−ベンゾイル−５'−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）−２'−Ｏ−メトキシエチルシチジン−３'−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルホスホネート）（０.０１５モル）及びジイソプロピルアミン（０.１２モル）を仕込む。無水アセトニトリル（２００ｍＬ）を加える。アルゴン気流下で室温で攪拌されたこの混合液に、トリス（２,４,６−トリブロモフェノキシ）ジクロロホスホラン（０.２２５モル）を加える。３時間攪拌した後、この反応混合液を濾過して、減圧濃縮する。粗生成物をシリカゲルを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して目的生成物を得る。トリエチルアミン（１％）をこの精製の全体を通して用いる。この明細書中に挙げられ又は言及された各々の特許、特許出願、印刷された刊行物、及び他の刊行書類は、参照によりそっくりそのまま本明細書中に組み入れられるものとする。当業者は、本発明の精神から逸脱しないで本発明の好ましい態様に多数の変更及び修飾を行い得ることを理解するであろう。そのような全ての変更は、本発明の範囲内に入るものである。

【手続補正書】【提出日】平成１１年８月２６日（１９９９．８．２６）【補正内容】（１）請求の範囲を別紙の通り補正する。（２）明細書第４頁の上段に記載のに補正する。（３）明細書第５頁及び第６頁に記載のに補正する。（４）明細書第７頁に記載のに補正する。請求の範囲１．ホスホロアミダイトを製造する方法であって：式：〔式中：Ｚは、ヌクレオシド間連結であり；Ｒ₁は、ヒドロキシル保護基であり；Ｒ₂は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアルコキシ、式（Ｏ−アルキル）_mのポリエーテル（式中、ｍは１〜約１０である）、又は保護されたヒドロキシル基であり；Ｒ₃は、ホスホリル保護基であり；Ｂは、ヌクレオベースであり；そしてｎは、０〜約１００である。〕の化合物を式：〔式中：Ｘ₁は、Ｂｒ又はＣｌであり；Ｘ₂及びＸ₃は、独立に、Ｈ、Ｂｒ又はＣｌであり；ｘ及びｙは、各々独立に、２又は３であり、そしてｘとｙの合計が５である。〕の化合物と反応させる工程；及び該反応の生成物を式ＨＮ(Ｑ)₂の化合物と接触させて、式：〔式中、各々のＱは、独立に１〜１５の炭素を有するアルキル、６〜１４の炭素を有するアリールであるか、又は該ホスホロアミダイト窒素と２〜１０の炭素を有する複素環を形成することができる。〕のホスホロアミダイトを生成させる工程を含んでなる方法。２．Ｑがイソプロピルである、請求項１記載の方法。３．Ｒ₂がＨである、請求項１記載の方法。４．Ｒ₂が保護されたヒドロキシル基である、請求項１記載の方法。５．Ｒ₂がＯ−アルキル又はＯ−アルキルアルコキシである、請求項１記載の方法。６．Ｒ₂がＯ−アルキルアルコキシである、請求項１記載の方法。７．Ｒ₂が２−メトキシエトキシである、請求項１記載の方法。８．Ｒ₃が、シアノエチル、４−シアノ−２−ブテニル、又はジフェニルメチルシリルエチルである、請求項１記載の方法。９．ｘが２でありｙが３である、請求項１記載の方法。１０．ｘが３でありｙが２である、請求項１記載の方法。１１．反応が溶媒の存在下で行われる、請求項１記載の方法。１２．溶媒がアセトニトリルである、請求項１１記載の方法。１３．ヌクレオベースが、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、５−メチルシトシン又はそれらの保護された誘導体である、請求項１記載の方法。１４．Ｚが、ホスホジエステル連結、ホスホロチオエート連結、ホスホロジチオエート連結、又はホスホネート連結である、請求項１記載の方法。１５．Ｚがホスホジエステル連結又はホスホロチオエート連結である、請求項１４記載の方法。１６．Ｒ₃がシアノエチルである、請求項１記載の方法。１７．Ｒ₃が４−シアノ−２−ブテニルである、請求項１記載の方法。１８．Ｘ₁、Ｘ₂及びＸ₃がフェニル環の２、４及び６位に位置しているＢｒである、請求項１記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ラヴィクマー，ヴァスリンガアメリカ合衆国カリフォルニア州92009, カールズバッド，ヴィレオ・コート 6606

Claims

【特許請求の範囲】１．ホスホロアミダイトを製造する方法であって：式：〔式中：Ｚは、ヌクレオシド間連結であり；Ｒ₁は、ヒドロキシル保護基であり；Ｒ₂は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアルコキシ、式（Ｏ−アルキル）_mのポリエーテル（式中、ｍは１〜約１０である）、又は保護されたヒドロキシル基であり；Ｒ₃は、ホスホリル保護基であり；Ｂは、ヌクレオベースであり；そしてｎは、０〜約１００である。〕の化合物を式：〔式中：Ｘ₁は、Ｂｒ又はＣｌであり；Ｘ₂及びＸ₃は、独立に、Ｈ、Ｂｒ又はＣｌであり；ｘ及びｙは、各々独立に、２又は３であり、そしてｘとｙの合計が５である。〕の化合物と反応させる工程；及び該反応の生成物を式ＨＮ(Ｑ)₂の化合物と接触させて、式：〔式中、各々のＱは、独立に１〜１５の炭素を有するアルキル、６〜１４の炭素を有するアリールであるか、又は該ホスホロアミダイト窒素と２〜１０の炭素を有する複素環を形成することができる。〕のホスホロアミダイトを生成させる工程を含んでなる方法。２．Ｑがイソプロピルである、請求項１記載の方法。３．Ｒ₂がＨである、請求項１記載の方法。４．Ｒ₂が保護されたヒドロキシル基である、請求項１記載の方法。５．Ｒ₂がＯ−アルキル又はＯ−アルキルアルコキシである、請求項１記載の方法。６．Ｒ₂がＯ−アルキルアルコキシである、請求項１記載の方法。７．Ｒ₂が２−メトキシエトキシである、請求項１記載の方法。８．Ｒ₃が、シアノエチル、４−シアノ−２−ブテニル、又はジフェニルメチルシリルエチルである、請求項１記載の方法。９．ｘが２でありｙが３である、請求項１記載の方法。１０．ｘが３でありｙが２である、請求項１記載の方法。１１．反応が溶媒の存在下で行われる、請求項１記載の方法。１２．溶媒がアセトニトリルである、請求項１１記載の方法。１３．ヌクレオベースが、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、５−メチルシトシン又はそれらの保護された誘導体である、請求項１記載の方法。１４．Ｚが、ホスホジエステル連結、ホスホロチオエート連結、ホスホロジチオエート連結、又はホスホネート連結である、請求項１記載の方法。１５．Ｚがホスホジエステル連結又はホスホロチオエート連結である、請求項１４記載の方法。１６．Ｒ₃がシアノエチルである、請求項１記載の方法。１７．Ｒ₃が４−シアノ−２−ブテニルである、請求項１記載の方法。１８．Ｘ₁、Ｘ₂及びＸ₃がフェニル環の２、４及び６位に位置しているＢｒである、請求項１記載の方法。