JP2000509979A - 拡散勾配バイオリアクタおよび体外肝臓装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ３次元組織を増殖させるための組織加工バイオリアクタを開示する。細胞をメッシュに接種して、細胞に２種類の培地流を供給する。それぞれは細胞の異なる側に接触する。培地流の栄養分の濃度は異なり、拡散勾配により栄養分は細胞に供給される。バイオリアクタは肝臓組織を増殖させるのに使用でき、血液や血漿を３次元肝臓組織にさらす生体外肝臓装置として設計されている。患者からの血液や血漿は肝臓組織に接して流れるよう方向付けられる。肝臓組織はさらに他方の側で栄養分とガスを供給する培地にさらされる。装置は、血液または血漿と、組織と、培地の間の多孔性境界を備えており、拡散勾配により栄養分およびたんぱく質を供給して患者の血液を透析する。

Description

【発明の詳細な説明】 拡散勾配バイオリアクタおよび体外肝臓装置 発明の分野 本発明は、３次元の哺乳類の組織、中でも肝組織を培養する方法および装置に 関する。具体的には、本発明は、拡散勾配または浸透圧勾配により培養された組 織の一方の側で活動する多機能細胞を含む３次元組織培養を増殖させ保持するこ とが可能なバイオリアクタに関する。 本発明は、生体内での移植または埋込み、生体外毒性検査、たんぱく質などの 生物化学細胞産物の継続的な生産、生体外遺伝子治療のための遺伝子の組織への 移植、および体外器官支援装置の基本要素化のために、３次元補乳類組織の培地 に適している。具体的には、本発明は、３次元肝組織を培養したり、生体外肝支 援装置としてバイオリアクタに肝組織を使用するのに適している。 発明の背景 これまでの十年にわたって、生体内で組織や器官を増殖させる分野では飛躍的 な進展があった（Langerその他、1993年、「組織工学」、サイエンス260:920-92 6（Langer et al.，1993，"Tissue Engineering,"Science 260:920-926)）。３ 次元組織を培養するこうしたシステムがNaughtonその他による米国特許第526648 0号に記載されている。Naughtonその他による培養システムには、該当の組織か ら多孔質基板への基質細胞の接種が含まれている。この環境で基質細胞が増殖す るにつれて、こうした基質細胞は細胞外マトリックスをつくりだし、３次元組織 の発展を促進する増殖因子を沈着させる。こうした静置細胞培養環境は、細胞対 細胞および細胞対マトリック連通に必要な微環境ならびに養分の注入や廃棄物の 除去にふさわしい拡散環境を提供する。基質組織が増殖し３次元組織に発達する と、該当の実質組織への接種の準備が完了したことになる。その結果できあがっ たシステムは、組織を完全に差分化する「生体内」環境を提供する。このシステ ムは骨髄組織や［Naughtonその他、１９８７年「ナイロンのメッシュ基板上の血 液生成 Ｉ．ラットの骨髄細胞の長期培養(Hematopoiesis on Nylon Mesh Templ ates I．Long Term Culture of Rat Bone Marrow Cells)」J．Med．18:219-250; Naughtonその他、１９８９年「基質支持細胞による長期間骨髄培養の調整 （Modulation of Long-Term Bone Marrow Culture by Stromal Support Cells） 、Ann．Ny Acad．Sci．554:125-140］、皮膚組織や［Landeenその他、１９９２ 年「人の皮膚の交換の特徴化(Characterization of Human Dermal Replacement) 」Wounds 4:167-175;Naughtonその他、１９８９年「生体外毒性研究のための生 理的皮膚モデル(A Physiological Skin Model for In Vitro Toxicity Studies) 」183-189,毒理学の代替方法、生体外毒理学：新指針（Alternative Methods in Toxicology．In Vitro Toxicology:New Directions）Vol．7,（A.M．Goldberg ，ed.）Mary Ann Liebert Publishers，New York;Slivkaその他、１９９３年「 生体外皮膚モデルの特徴化、防壁機能および薬代謝(Characterization，barrier Function，and Drug Metabolism of an In Vitro Skin Model)」J．Invest．De rmatol．100:40-46;米国特許第5266480号］、さらに肝臓組織［Naughtonその他 、１９９１年、「毒性評価可能な基板としての長期間肝臓細胞培養(Long Term L iver Cell Cultures as Potential Substrates for Toxicity Assessment)」193 -202、生体外毒性：機構および新技術(In vitro Toxicology:Mechanisms and Ne w Technology）（A.M．Goldberg，ed.）Mary Ann Liebert Publishers，New Yor k］を培養するのに使用されてきた。 上記の目的に合った組織を増殖させる多くの方法およびバイオリアクタが開発 されてきたが、これらのバイオリアクタは、栄養分やガスが生体外の組織細胞に 送られるメカニズムを生体内で適切にはシミュレートしてはいない。生きた組織 の細胞は拡散勾配に関して「偏向」する。毛細血管系により生体内で行われる器 官や栄養素の差分供給により、組織の細胞の相対機能だけでなく、おそらくそれ らの成熟をも制御される。したがって、生体内の供給メカニズムでこれらをシミ ュレートしてない従来のバイオリアクタは、多様な３次元組織を培養するのには 使用できない。 本発明の組織培養系およびバイオリアクタは、栄養分を３次元組織培養に送っ たり、同時にそこから代謝廃棄物を取り除くために拡散勾配を使用することで３ 次元組織を培養する従来の方法に改良を加えている。こうした拡散駆動供給メカ ニズムは栄養分の供給や廃棄物の除去を増進し、生体外で拡散メカニズムをシミ ュレートする。この拡散メカニズムでは、栄養分を生体外の哺乳類の細胞に送り 、生体外で増殖した細胞培養の増殖および差分化が最適化される。したがって、 本発明を用いると、多機能細胞をもつ広範な３次元組織が培養され維持される。 組織を増殖させる現在利用可能なバイオリアクタ技術には、一般に、中空ファ イバー技術、静的維持リアクタシステム、流動化床リアクタおよび平坦床、単一 通過潅流システムが含まれる。 最もよく使用されているバイオリアクタは中空ファイバーに関するものである 。中空ファイバーリアクタは一般に、培養中の細胞のための適切な構成と多孔性 を備えた多数の中空ファイバー膜を使用する。これらのリアクタはしばしば人工 毛細管系と呼ばれる（たとえば、Knazekその他による米国特許第4200689号を参 照のこと）。培養培地が中空ファイバーの真ん中を流れ、細胞はファイバーの外 側とファイバーの間の空間に配置されている。栄養分は中空ファイバーを介して 細胞に流れる。この種のバイオリアクタでは、細胞は中空ファイバー間の隙間で しか増殖しないので、組織を厚く増殖させることはできない。 中空ファイバーはHalberstadtその他による米国特許第5081035号にも開示され ている。この系では、細胞は毛細管の配列の隙間でも増殖する。バイオリアクタ の隙間で増殖している細胞すべてにたいして一定の栄養分勾配を維持するために 対流が利用される。この方法も、ファイバー間の小さな空間で増殖する細胞に制 限され、厚い組織には使用できない。 他の中空ファイバー装置はDelenteによる米国特許第3997396号に開示されてい る。この系では、中空ファイバーの束の隙間に細胞を取り付ける。細胞が栄養培 地で培養されている間、酸素担体がファイバーの中心を通過するようになる。前 述までの中空ファイバー装置を用いても、この方法では厚い組織を培養できない し、栄養分を栄養培地から細胞に供給するために浸透圧差を利用することはでき ない。 さらに他の中空ファイバー装置がTolbertその他によるWO90/13639に記載され ている。しかし、このシステムは、栄養分を培養組織に送るために浸透圧差を利 用していない。 単一通過潅流バイオリアクタシステムがHalberstadtその他による1994年の「 単一潅流システムを用いた３次元人体皮膚置換の生体外増殖(The In Vitro Gro wth of aT hree-Dimensional Human Dermal Replacement Using a Single-PassP erfusion System)」バイオ技術およびバイオ工学（Biotechnology and Bioengin eering）43:740-746に記載されている。このシステムでは、組織がテフロンバッ グ内のメッシュ上に培養される。栄養分を含む培地が蠕動ポンプにより培地を介 してくみ出される。培地内の栄養分が組織に拡散し、培地に分泌れた廃棄物は外 に出される。比較的厚い皮膚の組織を培養するのにこのシステムが使用される場 合、この方法では、拡散または浸透圧勾配により栄養分が供給されない。 一般に、従来技術は、多様な３次元組織を培養する方法を示してはいない。上 記のように、従来技術のバイオリアクタは生体内での栄養分の供給メカニズムを シミュレートしておらず、したがって、こうしたバイオリアクタは多様な組織を 培養するのには使用できない。 移植を待っている患者への肝機能支援または肝臓の限られた機能を提供するシ ステムはながらく求められていた。基本的にはろ過機能でしかない腎臓や、純粋 に機構的機能でしかない心臓とは異なり、肝臓の機能は複雑で、多数の化学物質 の除去や、化学変換や、血液への追加や、こうした機能の組合せから成る。人工 肝臓を提供するこれまでの方法は、人の肝臓と同等の機能をもち、広範な肝臓の 障害を抱えた患者が使用できる装置を提供できなかった。これまで使用された様 々な方法は、たとえば、Takahashiその他、１９９１年９月 消化系病および科 学(Digestive Diseases and Sciences)36(9)に記載されている。 よく使われる方法に木炭血液潅流がある。この方法は、重症の肝臓障害の治療 に使用される。木炭は、患者の血から分子重量の重い大型の分子を取り除くのに 使用される。しかし、木炭血液潅流は血液をろ過する機能しかなく、アンモニア を尿に変換する化学変換や、肝臓の主解毒活動であるシトクロムP450活動などの 他の複雑な肝機能とは代替できない。さらに、肝臓が健康な場合に血液に追加さ れる化学要素をこの方法で供給することはできない。 他の評判のよい方法は、微孔性膜を利用して血液全体から血漿をろ過するもの である。毒素は多吸着剤により分離された血漿から取り除かれ、浄化された血漿 は、血液に吸着剤の分子を戻さない微フィルタを介して再注入される。炭素潅流 同様、この方法では、肝臓が健康な場合には供給されることになる化学要素を血 液に追加できない。 哺乳類の肝臓の体外潅流が他の方法として試みられている。理論的にはこの方 法は健康な肝臓の複雑な機能の中の多血症を治療できるが、この方法では、獲得 困難なドナー器官を当てにすることは難しい。 使用中の他の治療モダリティーには、血漿の交換、ハイブリッド人工肝臓およ びその変更が含まれる。血漿交換方法では、患者の血漿は、新鮮な凍結血漿と交 換される。この方法は、患者の血から必要不可欠な成分を取り除く危険性があり 、多量の通常の血漿が必要になる。これは高くつくことになり、肝臓障害への永 続的な解決方法にはならない。 ハイブリッド人工肝臓では、哺乳類の肝臓細胞を使用して肝臓の機能が実行さ れる。これらの肝機能は、おそらく肝臓の機能を完全に理解してないために従来 の合成システムでは実行不可能であった。肝臓片、肝臓群ならびに単独肝細胞な ど様々な種類の肝臓細胞が使用されてきた。この方法による実験には、培養中の 肝細胞が短期間にわたって代謝活動を失うという事実が足かせになっていた。 他の従来技術の人工肝臓は通常、膜に接種された肝細胞の培養単分子層を使用 してきた。こうした方法は、Matumaによる米国特許第3734851号に記載されてい る。要約すると、生きている動物からの血液流が、肝臓の細胞の融合性単分子層 に接触する半透膜を通る。透析物は、第１の半透膜に隣接し、細胞の融合性単分 子層にも接触している他の半透膜上を流れる。血液中の廃棄物は第１膜を通過し 、細胞層に作用し、第２膜を通過して外に出て、透析流体により吸収されて、放 出される。同時に、望ましい代謝物が血流に溶ける。こうした方法は肝臓組織片 でも使用されているが、使用される組織層の厚さは２０ないし１００μｍ（Mats umaによる米国特許第3734851号）に制限される。厚みが制限されているので、こ の方法により浄化される血液の量は厳しく制限されることになる。 他の従来技術の肝臓支援装置は、半透膜から成る小さな管を含む人工毛細管を 使用している。肝臓の細胞は管の外側に接種され、培地は毛細管状の管を介して 流れる。この管の壁は薄い（１００μｍ）。管への肝細胞の取り付けを支援する のにコラーゲンがしばしば使用される。再び、こうした装置では、血液に影響を 及ぼす肝臓の細胞が足りないので効果的に浄化可能な血液の量が制限される。 中空ファイバーは、Jauregulの米国特許第5043260号に記載された潅流装置で 使用される。この特許では、多孔性膜が潅流区画を肝細胞区画から分離する。こ の多孔性膜は中空ファイバーにより形成される。この中空ファイバーは、装置の 潅流入口および出口や、ファイバーの外表面に取り付けられた肝細胞と連通する 。廃棄物の出入口と連通する中空ファイバーの第２の集まりもある。 Barkerその他によるPCT出願WO93/16171では、肝細胞を捕捉し潅流を可能にす る複数の管または膜の代りに、ガラスビーズがマトリックスとして利用される。 しかし、一般には、従来技術では、維持可能な細胞の量に適合するように肝細 胞を増長させたり、生体内の肝臓によく似た細胞対細胞の相互作用を形成する方 法が見いだせない。従来のシステムの問題は肝臓の他機能細胞を維持する機能の 欠如である。その様々な機能は少なくとも部分的には組織の細胞構成と栄養分の 供給に対する相対的な空間関係により制御される。したがって、開示された装置 はどれも、効果的な生体外肝臓装置として使用可能な厚い組織を増殖させること はできない。 本発明の要約 本発明の目的は、３次元組織の増殖を可能にするバイオリアクタおよび方法を 提供することにある。 本発明の他の目的は、多機能細胞を含む３次元組織培養を増殖させ維持するバ イオリアクタおよび方法を提供することにある。 本発明のさらに他の目的は、バイオリアクタにおいて３次元肝臓組織を増殖さ せ維持させることにある。 本発明のさらに他の目的は、装置自体または個別バイオリアクタ内で培養され る３次元肝臓組織を利用する生体外肝臓支援装置を提供することにある。 上記および他の目的は、生体外３次元組織を維持し培養するシステムを提供す る本発明により達成される。本発明の例示実施例によると、本システムは、組織 を２つの培地流間に配置したバイオリアクタを備えている。組織は多孔性基板上 で培養される。第１濃度の溶質の第１培地流が組織の一方の側に接触し、第２濃 度の溶質の第２培地流が組織の他方の側に接触する。第１濃度の溶質は第２濃度 の溶質とは異なり、組織を通して栄養分を含む溶質を移動させる拡散勾配または 浸透圧勾配が生み出される。培地流は、培養中の特定の組織の必要性に応じて、 濃度を変えながらガスや増殖要因を細胞に供給するのにも使用できる。二酸化炭 素を含む代謝廃棄物が培地流に分泌されて、放出される。 他の実施例では、半透膜が組織と２つの培地流それぞれの間に配置できる。望 ましい溶質と廃棄物を通過させる膜を利用すべきである。 本発明の他の例示実施例によると、システムは、多孔性膜上に培養された組織 をハウジング内に配置したバイオリアクタを備え、組織とハウジングの頂部分の 間に第１空間を備え、組織の反対側とハウジングの底部分の間に第２空間を備え 、第１空間に第１培地流を供給し、第２空間に第２培地流を供給する培地入口を 備え、さらに少なくとも１つの培地出口を備えている。上記のように、溶質、栄 養分、増殖因子および／またはガスが拡散勾配または浸透圧勾配により組織を通 して移動するように、栄養分を含む溶質の濃度、増殖要因およびガスが第１およ び第２培地流で異なる。 本発明の他の例示実施例によると、システムは、多孔性膜上に培養され、円筒 形ハウジングの内周面に配置される組織をもつバイオリアクタを備え、組織と円 筒形ハウジング間に第１空間を備え、組織の対抗端と結合した円筒形ハウジング 内に第２空間を備え、第１培地流を第１空間に供給し第２培地流を第２空間に供 給する培地入口を備え、少なくとも１つの培地出口を備えている。上記のように 、第１および第２培地流では、栄養分、増殖因子およびガスを含む溶質の濃度は 異なっている。 使用時には、組織を増殖させる方法は、構造支持細胞と実質細胞をメッシュな どの多孔性基板に接種して、生体外で組織を生成する共役培養を形成する。好ま しくは、メッシュはナイロンまたは生物分解性材料から形成され、培地流の各端 部に開口部を備えた好ましくは無菌の容器に配置される。様々な栄養分、ガスお よび増殖因子などの所定の濃度レベルの溶質を備えた第１培地流は、メッシュ部 分の一方の側の細胞に直接接触して流れる。栄養分、ガスおよび増殖因子などの 代表的な様々な濃度レベルの溶質を備えた第２培地流は、前記メッシュ部分の反 対側に直接接触して流れる。それぞれの培地流の様々な溶質の濃度は、組織の層 を介して細胞を増殖させる様々な要件を拡散させる拡散または浸透圧勾配を生み 出す。同様に、代謝廃棄物は培地流に拡散され、外に出される。 他の使用方式では、１つの培地流に圧力がかけられて、浸透圧を妨げる静水圧 力差を生み出して、栄養分の供給がさらに制御される。 本発明は、栄養分の供給が２つの対抗面から内包に向けられ、一層厚い組織基 層が作成可能になり、その生育が維持されるという点において以前の組織培養シ ステムよりも有益である。したがって、本発明の拡散勾配バイオリアクタは生体 外メカニズムをシミュレートする。このメカニズムにより栄養分が組織に送られ て、廃棄物が生体組織から取り除かれ、多様な３次元組織が培養可能である。 バイオリアクタおよびそれによる培養は、バイオリアクタで増殖した組織の生 体内移植または埋込みから、生体外での生物材料の継続作成、器官に障害のある 患者の生体外器官支援装置としてまで多様な適用分野にわたる。さらに、リアク タでの組織の増殖は、静置環境への移動後や、薬の代謝または拡散勾配バイオリ アクタシステムからの流出流への基本たんぱく質の解放など他の手段による評価 時に、生体毒性検査に使用できる。 バイオリアクタは、単一クローン抗体、ウイルスワクチン、ホルモン、リンフ ォカイン、酵素、腫瘍特異抗原、およびウイルス性殺虫剤などを含む多様な生物 材料および薬を生産するための３次元組織を増殖させるのに使用できる。組織を 増殖させるためには、構造支持細胞はメッシュに接種されると共に、必要な栄養 分を送り同時に細胞により生み出された廃棄物を取り除くための培地流を備えて いる。構造支持細胞が確立すると、たとえば、構造支持細胞が合流して増殖する と、組織特異性または実質性細胞がメッシュに追加される。培地流の１方または 両方の内容がこの時点で変更されて、組織特異性細胞の必要性を満たすことにな る。 細胞が３次元組織に増殖すると、培地流が止められ、将来のために組織が使用 または維持される。この組織を維持するために、低温保存が追加され、好ましく はバイオリアクタに組織を保持した同じ容器内で組織が冷凍される。組織はその 後解凍され、バイオリアクタとして使用され、生物材料を作成する。 組織を使用するために、栄養分、増殖因子ならびにガスなどの所定の濃度の溶 質を備えた第１培地流は、組織の１方の側に接触して流れる。様々な濃度の溶質 を備えた第２培地流は、組織の反対側に接触して流れる。バイオリアクタ内の転 送は拡散勾配により達成される。２次元組織が望ましい生物産物を生み出すこと ができるほどの濃度の溶質および栄養分が供給される。産物は第１または第２培 地流または両培地を介してバイオリアクタから取り出される。 バイオリアクタは３次元肝組織を増殖させるのにも使用できる。この組織は生 体外肝臓支援装置として使用することもできる。代りに、肝組織は、肝性基質お よび好酸性細胞の共役培養により増殖される。 ３次元組織は、上記のように将来のために使用または低温保存可能である。組 織はその後解凍され、生体外肝臓装置として使用できる。組織を使用するために 、肝機能の弱った患者から血液を引きだす。血漿は、望ましければ、血液から分 離できる。次に、血液または血漿が、組織の１方の側に接触する肝組織を備えた 容器を通過するが、培地流は組織の反対側を通りすぎる。組織は血液または血漿 に対して肝臓として作用する。その後、血液または血漿は患者に戻される。 図面の簡単な説明 図１は、本発明によるバイオリアクタの分解側面図である。 図２は、複数の膜を含む本発明によるバイオリアクタの代替実施例である。 図３は、図１および図２に示すバイオリアクタの上面図である。 図４は、生体外肝臓装置としても動作可能なバイオリアクタの代替実施例の横 断面図である。 図５は、線Ａ−Ａに沿った図４の装置の横断面図である。 図６は、生体外肝臓装置としても動作する好ましいバイオリアクタの分解図で ある。 図７は、図６の装置の長手方向横断面図である。 図８は、表面面積が増加したメッシュ上の培養を示す図７の装置の線Ａ−Ａ’ に沿った横断面図である。 図９は、本発明による生体外肝臓装置としてのバイオリアクタの使用を例示す る構成図である。 図１０は、本発明のバイオリアクタで培養された肝組織により、培地に解放さ れたアルブミンの濃度を示すグラフである。 図１１は、本発明のバイオリアクタで培養された肝組織により、培地に解放さ れたフィブリノゲンの濃度を示すグラフである。 図１２は、本発明のバイオリアクタで培養された組織の取り付けられた平均細 胞の計数を示すグラフである。 図１３は、生体外肝臓支援装置としての本発明のバイオリアクタを用いたガン （Gunn）ラットの非結合および結合ビリルビン水準を示すグラフである。 好ましい実施例の詳細な説明 図１に示すように、本発明によるバイオリアクタ１０の実施例は、真ん中のメ ッシュ部分１２に接種された組織４０と、頂部１４と、底部１６とを含む。本用 途の組織は、基質および実質性および／または好酸性細胞の単一層細胞培養と単 一層共役培養、多機能細胞を備えた３次元組織、ならびに培養処理中に達成され る組織の増殖のすべての中間段階を含む。 頂部１４と底部１６は互いに密封係合する。頂部および底部それぞれは培地流 の開口部を備えている。頂部は第１培地入口１８と第１培地出口２０を備えてい る。底部は第２培地入口２２と第２培地出口２４を備えている。培地供給管が２ つの入口１８と２２に備えられている。戻し管が出口２０と２４に備えられてい る。培地供給管は蠕動ポンプまたは他の型のポンプに接続可能で、ポンプはバイ オリアクタを介して培地を供給する。 頂部１４と底部１６は、哺乳類の細胞を培養するのにふさわしい材料ならいか なる材料からも形成可能である。プラスチックなど容易に滅菌可能な材料が好ま しい。 メッシュ部分１２は、細胞および／または組織が取り付け可能で（または細胞 および／または組織が取り付けできるように修正可能で）、細胞および／または 組織が２層以上で３次元組織に増殖可能な任意の材料から、および／または任意 の形状に形成可能である。多数の様々な材料はメッシュ部分１２を形成するのに 使用できる。このメッシュ部分１２は、以下の物質に限られているわけではない が、Goretex（商標）、ナイロン（ポリアミド樹脂）、デクロン（ポリエステル ）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル化合物（た とえば、ポリ塩化ビニル）、ポリカーボネート(PVC)、ポリテトラフルオロエチ レン(PTFE)、テフロン、サーマノックス(thermanox)(TPX)、ニトロセルロース、 綿、ポリグリコール酸(PGA)、腸線縫合糸、セルロース、デキストラン、ゼラチ ンなどを含む。たとえば、こうした材料の任意のものがメッシュに織り込まれて 、３次元組織の支持基部を形成する。 ナイロンやポリスチレンなど、材料の中には細胞および／または組織を取り付 けさせる基板としては有効性が低いものもある。こうした材料がメッシュ部分と して使用されるときは、基質細胞を接種する前にメッシュを事前処理して、メッ シュへの基質細胞の取り付け力を高めるのが望ましい。たとえば、基質細胞を接 種する前に、ナイロン製のメッシュを０．１Ｍの酢酸で処理して、ナイロンに被 覆するためにポリリシン、FBS、および／またはコラーゲン中で保温する。ポリ スチレンは硫酸を用いて同様に処理することができる。 ３次元組織が生体内に移植される場合には、ポリグリコール酸、腸線縫合糸材 料、コラーゲン、多乳酸またはヒアルロン酸などの生物分解性メッシュを使用す るのが好ましい。組織が長時間維持されたり低温保存される場合には、ナイロン 、デクロン、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリビニル、テフロン、綿など の非生物分解性材料が好ましい。本発明に応じて使用可能な便利のよいナイロン メッシュはNitex、孔の平均サイズが２１０μｍでナイロン繊維の平均直径が９ ０μｍのナイロン製ろ過メッシュである（#3-200/36,Tetko，Inc.，NY）。 バイオリアクタで組織を増殖させた後で、バイオリアクタ容器内で凍結させ保 持する。低温保存液を培地入口から追加し、出入り口を密封し、閉鎖環境を形成 する。次いで、組織を容器内で凍結させ、必要なら解凍することもできる。 組織を低温保存する方法は、保存する組織の種類により異なるが、当技術では 周知である。たとえば、事前に計算された温度と時間曲線に応じて骨髄および生 物材料を凍結する方法は、米国特許第4107937号および第4117881号に開示されて いる。 本発明の組織およびバイオリアクタは多様な適用分野で使用できる。こうした 適用分野には、以下に制限されているわけではないが、生体内で培養された組織 の移植または埋込み、生体外における毒性化合物、アレルゲン、増殖／調節性因 子および医薬化合物などの検査、さらに、いくつかの病気のメカニズムの解明、 薬および／または増殖因子の作用のメカニズムの研究、患者のガンの診断と監視 、遺伝子治療、生物産物の生産、生体外器官支援装置の主生理要素として、など が挙げられる。上記および他の適用分野は当技術分野では周知であり、たとえば 、Naughtonその他による米国特許第5266480号に記載されている。バイオリアク タは多機能細胞をもつ３次元組織を培養できるので、本発明のバイオリアクタに より培養された組織は、上記の適用分野にとくにふさわしい。したがって、これ らの組織は生体内で増殖した組織を効果的にシミュレートしている。 本発明の実施例では、本発明のバイオリアクタを使用して、生物細胞産物を高 歩留りで生産する。たとえば、多量の特定の生物産物（たとえば、増殖因子、調 節性因子、ペプチドホルモン、抗体など）を自然に作り出す細胞または外部遺伝 子産物を作りだすように遺伝子に工夫が加えられたホスト細胞が、生体外の本発 明のバイオリアクタを用いて培養可能になる。組織が１００μｍ−−少なくとも １ｍｍが好ましい−−の厚さに増殖すると、バイオリアクタに配置された組織を 使用して、高歩留りで生物産物を作りだすことができる。 バイオリアクタを使用して生物産物を作りだすためには、栄養分、増殖因子お よびガスなどの第１濃度の溶質の第１培地流が入口１８に流れ込み、メッシュ１ ２に接種された組４０の１方の表面上を流れ、出口２０から流れ出る。第２濃度 の溶質の第２培地流が入口２２に流れ込み、組織の反対面に接触しながら、出口 ２４から流れ出る。組織層が、望ましい生物産物を生み出すように溶質や栄養分 の濃度を定める。次いで、産物が培地流内に排出され、当技術分野で周知の技術 を用いて流出流から収集することができる。 図２および図３は、バイオリアクタ１０Ａがメッシュ部分１２に接種された組 織（図示せず）を備えている本発明の代替実施例を示している。メッシュ部分１ ２は、２枚の半透膜２８の間に配置されている。図２に示してあるように、空の メッシュ２６（組織を接種していないメッシュ）を使用して２つ以上の組織を分 離する。バイオリアクタ１０には、適切な培地流の出入り口が備えられている。 半透膜２８の孔のサイズは、培養中の組織の種類や組織を維持するのに必要な 栄養分、増殖因子などに左右される。肝組織を増殖させるためには、使用する膜 の孔のサイズは約200,000ないし400,000ダルトン(Dalton)、好ましくは約400,00 0ダルトンが適切であるが、どの場合でも、使用する膜は、培養産物の拡散流出 や組織を培養するのに必要な栄養分やガスの流入を可能にしなければならない。 さらに、孔の大きさは細胞が膜を通過しない程度なのが好ましい。 生体外肝臓支援装置として使用される場合には、膜２８の孔のサイズは、免疫 グロブリンＧ（IgG）が排除できるほど小さいのが望ましい。通常は、約90,000 ないし140,000ダルトン、好ましくは約120,000ダルトンである。 バイオリアクタが生物材料を連続して作り出すのに使用されているときには、 ３次元組織の各側に配置された膜の孔のサイズは、培地が組織を通して潅流して いるときに、流れに分泌された細胞産物が培地流の１方に拡散するように多様に することもできる。組織を維持するのに必要な栄養分に加えて、選択された膜の 孔のサイズの遮断範囲は望ましい細胞産物のサイズに左右され、当技術分野の技 術者には明らかであろう。 図４と図５は、本発明によるバイオリアクタの他の実施例を示す。この実施例 は、体外装置としても組織を増殖させるためにも使用できる。他のバイオリアク タ３０は複数の同心円状の円筒として設計されている。最外方円筒領域には、好 ましくはプラスチックなどの固くて不浸透性の材料で形成された外方円筒４２が 結合されている。組織４０は外方円筒の隣に配置されている。組織４０は上記の ようにメッシュ部分（図４と図５には図示せず）に培養されている。入口３２か ら培地が流れ込み、組織４０と外方円筒４２の間の空間４１に入る。培地は出口 ３４から出ていく。追加入口３６は中央領域４４に続き、出口３８が出口となる 。中央領域４４は、空間４１に接触する側と反対の組織の側に露呈されている。 他の実施例では、上記のように、３次元組織が２枚の膜（図４と５に図示せず ）の間に配置されている。 図６と図７は、円筒形バイオリアクタ３０Ａの好ましい実施例を示す。最外方 円筒領域には、内外径および２つの端キャップ７０を備えた外方円筒４２が結合 ている。外方円筒４２の寸法は、特定の適用分野および／または培養中の組織 により左右される。たとえば、ラット用の体外肝臓支援装置として使用する場合 には、外方円筒４２の直径は約０．７５ないし１インチで、長さは約６インチで ある。当技術分野の技術者には容易に理解されるであろうが、上記の寸法は特定 の適用分野に応じて容易に適応可能である。 外方円筒４２は、組織４０を培養するのに使用される条件を満たす材料ならど んなものからも形成可能である。好ましくは、外方円筒４２は、ポリスルホンな どの固く、容易に滅菌可能な材料からつくれる。 端キャップ７０は、第１体部分７２と、第２中間体部分７４と第３下方体部分 ７６から形成され、第１体部分７２の第１直径は第２中間体部分７４の第２直径 よりも小さく、第３下方体部分の第３直径は第２直径より小さい。端キャップ７ ０の第１体部分７２の第１直径は外方円筒４２に密封係合する。好ましくは、端 キャップ７０の第１体部分７２は、外方円筒４２と端キャップ７０の間を密封す る密封手段７８を備えている。密封手段７８はＯリングまたは環状ビーズである のが好ましく、Ｏリングの方が一層好ましい。特に好ましい実施例では、密封手 段７８はブナＮから構成されたＯリングである。 組立を一層容易にし端キャップ７０上に外方円筒を適切に配置するために、端 キャップ７０は、端キャップ７０の第１体部分７２の頂部に付着された少なくと もｌつの停止手段８０を備えている。外方円筒４２が端キャップ７０に密封係合 しているときには、停止手段８０は外方円筒４２の外径を越えて延びている。停 止手段８０は、プラスチックなどの硬質材料から構成されるのが好ましい。特に 好ましい実施例では、停止手段８０はポリスルホンから構成され、停止手段８０ を介してネジ孔８４にねじ込まれるネジ８１により端キャップ７０に付着されて いる。ネジ８１はナイロンから構成されるのが好ましい。 図７を参照すると、円筒に合うように形成されたメッシュ部分１２は、半透膜 ２８内に配置されている。この膜２８も円筒に合うように形成できる。メッシュ 部分１２に接種された組織４０（組織４０はメッシュ１２の隙間で培養されるの で、メッシュ１２と組織４０は同じ要素として図７と図８に示されている）は、 円筒形膜２８の内表面の周囲に配置されている。代りに、図示されてない実施例 では、円筒形膜２８の外表面の周囲がメッシュ部分１２（および組織４０）で包 まれている。 図８を参照すると、メッシュ部分１２（および組織４０）は、複数の層を備え た円筒に巻かれて、メッシュの表面積を増加させて、同時にメッシュ１２に接種 された組織の表面積を増加させる。その後、メッシュ部分１２を円筒形膜２８内 に挿入する。 図７を参照すると、膜２８と、端キャップ７０と、円筒形挿入部１００と、円 筒形クランプ１１０とを利用して好ましい円筒形バイオリアクタ３０Ａ内に組織 ４０を配置する。円筒形挿入部１００は、端キャップ７０に密封係合するように 端キャップ７０の第３体部分７６の円周上に装着される。好ましい実施例では、 端キャップ７０の第３体部分７６は、円筒形挿入部１００と端キャップ７０間を 密封する密封手段７９を備えている。密封手段７９はＯリングまたは環状ビーズ であるのが好ましく。Ｏリングの方が一層好ましい。特に好ましい実施例では、 密封手段７９はブナＮから形成されるＯリングである。 上記のように、メッシュ１２に接種された組織４０は円筒形膜２８の内表面に 配置される。円筒形膜２８は組織４０よりも長い。円筒形膜２８の１端は挿入部 １００上の円周面に装着される。膜２８は円筒形クランプ１１０により挿入部１ ００に密封係合される。この円筒形クランプ１１０は、膜２８と挿入部１００上 の円周上に装着される。 上記のように、膜２８の他の端部は第２端キャップ７０に付着されている。 支柱１２０ａと１２０ｂ（集合的に支柱１２０）により好ましい円筒形バイオ リアクタ３０Ａに構造支持部が追加される。各支柱１２０の横断面は、図６に示 すように、半円形であり、両方の支柱が対になると、支柱１２０は、端キャップ ７０の第２体部分７４の直径にほぼ等しい内径の円筒形を形成する。外径は端キ ャップ７０の第１体部分７２の直径より短い。バイオリアクタ３０Ａが組み立て られると、支柱１２０は第２体部分７４に密封係合する。 各支柱１２０は、バイオリアクタが組み立てられたときに端キャップ７０のネ ジ穴８５に全体的に整合した２つのネジ穴１２０を備えている。支柱１２０は４ つのネジ１２４により端キャップ７０に取り付けられる。各ネジ１２４は支柱の ネジ穴１２２にねじ込まれ、端キャップネジ穴８５に入る。ネジ１２４はナイロ ンから作るのが好ましく、外方円筒４２を遮らないように頭をさら穴に埋められ る。 図６に示された円筒形支柱組立体は組立が容易だが、単一の円筒も構造支持部 の支柱として使用可能であることを理解すべきである。 半透膜２８は支柱１２０内に同軸状に配置され、支柱と膜の間に空間４１が空 いている。入口３２は培地を供給し、培地は、入口通路２８を介して半透膜２８ と支柱１２０の間の空間４１に流入する。培地は出口通路８８を介して流れ、出 口３４から出る。培地が中心領域４４に流れ込み、出口通路９２を介して出口か ら流出するように入口３６と出口通路９０が追加される。 入口３２と３６および出口３４と３８が、端キャップ７０の穴９４と９６に係 合する管状取付け具またはアダプタを含むのが好ましい。管状取付け具またはア ダプタはルーアー取付け具またはネジなどにより穴９４と９６に係合する。管状 取付け具またはアダプタは、細胞を培養するための栄養分や培地を供給するのに 適切ならどのような材料からでも形成可能である。こうした管状取付け具および アダプタはカラムクロマトグラフィー、中でも高性能液体クロマトグラフィー(H PLC)の技術分野では周知であり、たとえば、Rainin Instrument Co．(Emeryvill e，CA)，Pharmacia Biotech Inc．(Uppsala，Sweden)および／またはBioRad Lab oratories(Richmond，CA)の製品カタログに見いだせる。 通常、入口３２と３６および出口３４と３８は、内径が約１／３２ないし１／ ４インチ、好ましくは約１／１６ないし１／８インチの菅を受け入れる管状取付 け具またはアダプタを備えている。特に好ましい実施例では、入口３２と出口３ ４は、直径が約１／８インチの菅を受け入れる管状取付け具またはアダプタを備 えており、入口３６と出口３８は、内径が約１／１６インチの菅を受け入れる管 状取付け具またはアダプタを備えている。 細胞、中でも肝臓細胞を、多機能細胞を含む３次元組織に増殖させるためには 、組織増殖を保持し拡大するのに必要な溶質を含む培地を、入口３６を介して入 口通路９０を介して中央領域４４に供給する。本用途での溶質は、たんばく質、 炭水化物、脂質などの栄養分だけでなく、酸素、増殖因子ならびに細胞および／ または組織の増殖と機能に貢献する他の物質を包含している。 中央領域４４を流れる培地は、外空間４１を流れて、多機能細胞の発達を容易 にする溶質の拡散または浸透圧勾配を組織に応じて生み出せるほど多様な溶質濃 度を備えている。 組織の実質的な細胞の機能の異質性は、輸入血液供給にある栄養分と酸素にそ れらの細胞をさらすことである程度制御される。栄養分が毛細系を介して組織に 供給されると、栄養分と酸素の拡散勾配は、血液から組織にこれらの物質を運ぶ ように定められる。窒素性二酸化炭素と他の廃棄物の同様の勾配は、血液を介し てこれらを除去するために、こうした物質を静脈性毛細血管に向ける。 肝臓では、こうした供給方式ははるかに複雑である、というのは肝臓は（酸素 が豊富で栄養分が少ない）肝動脈や（消化器官から到来する栄養分やインシュリ ンなどのホルモンが豊富だが酸素が少ない）肝門静脈からのほとんどの血液を受 け取るからである。 肝臓の機能単位は小胞と呼ばれている(Rapoport，1958，Anat．Rec．130:637- 643)。小胞は肝門細静脈と、肝臓細動脈および胆小管の終末房から成る(Traber その他、1988，Gastroenterology 95:1130-1143)。小胞は肝臓細動脈の終末房と 結合している。小胞の機能を図示するために、小胞を含む細胞が３つの区分帯に 分類される（小胞とその各帯部の図は、Traberその他、1988，Gastroenterology 95:1130-1143を参照のこと）。肝門細静脈と、肝臓細動脈と、胆小管の端末房 に最も近い細胞がゾーン１にあるように定められている。終末肝臓細動脈の知覚 の細胞はゾーン３にあるように定められている。ゾーン１と３の間の細胞はゾー ン２にある。 周知のように、肝門細静脈または肝臓細動脈を介して小胞に血液が流入する。 ゾーン１の実質の細胞はこの血液に直接さらされている。このゾーンの細胞には 、動脈流を受け取るものもあるし、静脈流を受け取るものもある。こうしたソー ス両方からの血液はゾーン３の終末肝臓静脈に向けて方向性なしに流れる。これ によりゾーン１からの酸素や栄養分の勾配が作られる。 こうした勾配は実質的な細胞代謝を動かし、肝臓の細胞の機能の異質性に貢献 する。たとえば、ゾーン１の細胞は高度な酸素吸上げ機能を備え、乳酸塩からグ リコーゲンを合成紙、グリコーゲンをグルコースに解体し、脂肪とたんぱく質（ グルコネオゲネシス）からグルコースを形成するが、酸素が少ないゾーン３の細 胞は、解糖やグルコースからグリコーゲンの形成など嫌気性の代謝に関する機能 を示す(Jungermannその他、1982，Eur．J．Biochem．123:429-436)。 血液流の方向が変わると（逆行性潅流）、機能ゾーンが反転する。ゾーン３の 肝細胞は多量の酸素を利用するが、ゾーン１の肝細胞は解糖を行う（Thurmanお よびKaufmann，1985，Hepatology 5:144-151）。このゾーンの他の異質性は尿素 サイクルである。通常の状態では、アンモニアがゾーン１の肝細胞により取り出 され、尿に変換される。（血液が終端肝臓静脈から小房に流れるように）肝臓の 血流が反転すると、代りに、アンモニアはグルタミンに変換される（Haussinger ，1986，In:肝臓代謝の調節、細胞間および細胞内区画化(Regulation Of Hepati c Metabolism．Intra-And Intercellular Compartmentation)，Thurman RG，Kau fman FC，Jungermann K，eds.，New York，Plenum，253-191)。 上記の発見では、肝臓の微構成が連続する代謝処理のために設計され、これは 血液の内容および流れの方向に関連することが示されている。通常は、たんぱく 質の異化作用により発生するアンモニアが肝臓の小胞に入り、そこでゾーン１お よびゾーン２の肝細胞により尿に変換される。次いで、尿は「下流に」流れ、ゾ ーン３の肝細胞が尿をグルタミンに変換する。 本発明の拡散勾配バイオリアクタは、生体内状態を生体外で模倣する極性を生 み出すことで培養された組織の細胞の微環境を一層よく制御できるよう設計され ている。培養された組織は、２つの培地流間の境界を形成している。たとえば、 グルコース濃度と酸素容量の差により、肝臓の小胞を横切って現れる組織と同様 の培養組織の極性が確立される（すなわち、肝臓小動脈と肝門小静脈から終端肝 臓静脈に向かう）。同様に、連続する代謝変換は、本発明の拡散勾配バイオリア クタで可能になるが、肝臓細胞を培養する他の方法では不可能である。 たとえば、培地流の１つにアンモニアを追加すると、アンモニアが培養組織中 で「方向付けられる」拡散勾配が定められる。適切な酸素勾配がさらに定められ る場合、実質性肝細胞がこのアンモニアを尿に変換し、次いで、「下流」肝細胞 が尿をグルタミンに変換し、グルタミンは組織の他方の側を流れる培地流内に拡 散する。ラットの体外肝臓支援装置として使用された本発明の円筒形バイオリア クタによる実験では、上記のことが確認された（例７を参照）。 したがって、本発明のバイオリアクタは、２つの培地流間および組織上の拡散 または浸透圧勾配を生成することで、栄養分、代謝産物、調節性分子などの生体 外供給および生体内で組織に発生する廃棄物の除去をシミュレートする。 各培地流の特定の溶質および濃度は、培養中の組織の種類およびその意図され た目的により異なる。一般に、静置培養での特定の種類の組織を培養する増殖条 件は当技術分野では周知である。（たとえば、Naughtonその他による米国特許第 5266480号およびその特許に引用されている文献を参照のこと。肝組織を培養す る条件はNaughtonその他による米国特許第5510254号に示されている。） 本発明のバイオリアクタは、組織上の拡散または浸透圧勾配により静的増殖条 件を改良できる。すなわち、静置培養条件を本発明の方法において旨く利用すれ ば、生体内環境をより正確にシミュレートすることで、拡散勾配バイオリアクタ 培養は、静置組織培養に必要とされるより濃度の低い栄養分を利用できると考え られている。一般に、特定の種類の組織の生体内環境は、各培地流における適切 な溶質濃度と浸透性を識別する指針として使用できる。 生体外で特定の組織を培養するのに適切な濃度勾配を定めるためには、組織に 出入りする血液の溶質とガス濃度ならびに組織内の血液の潅流率も指針として利 用できる。これらの値は周知であったり、標準的な当分野で知られた技術を用い れば測定可能であったりする。これにより、培養系において適合する組織の代謝 速度に関する情報が得られる。組織に特定の栄養分の利用およびパラメータを監 視して、適切な培地溶質濃度が選択されているかどうかを判定する。 たとえば、肝臓に対しては、アルブミンやフィブリノゲンなどのたんぱく質の 合成を測定したり、アンモニアの消失や尿および／またはグルタミンへの変換を 測定することで尿サイクルが機能していることを確かめたり、生体異物などのシ トクロームP450酵素媒介変換を測定するのが望ましい。次に、培養条件は適切な 機能に応じて調整可能である。肝臓輸送速度論を定める流れのモデルを詳細に分 析するためには、Goreskyその他、1993年、「器官溶質の肝臓輸送の速度論モデ ル（Kinetic Models of Hepatic Transport of Organic Solutes）」、11-53、 Ｉｎ:肝臓輸送および胆汁分泌：生理学および異常生理学(Hepatic Transport and Bile Secretioon:Physiology and Pathophysiology)、Tavvoloni NおよびBe rk PD、eds.，Raven Press，NYを参照のこと。 肝臓の場合には、栄養分は豊富だが酸素が少ない培地流や、比較的栄養分は少 ないが酸素が豊富な培地流があり（表１を参照）、肝臓細胞への栄養分の生体内 供給がシミュレートされる。 ＦＢＳはウシの胎児の漿液である。ＥＳはウマの漿液である。 ＊ は初期溶質濃度が高い培地を示す。 ＊＊ は溶質が培地の一方にだけあることを示す。 ＝ は両培地の溶質の濃度が同じであることを示す。 ＋ は、漿液のない培地が使用されていることを示す。この例ではウマ の漿液アルブミンや、表皮性増殖因子、プロラクチン、成長ホルモ ンや他のホルモンなどの因子が追加されて、臨界漿液要素を置換す る。 拡散は、本発明のバイオリアクタシステムを支える主なメカニズムである。異 なる濃度の溶質をもつ２つの培地流を定めるうえに、１つの培地流に圧力を加え て、静水圧の差を生み出して浸透圧を中和したり栄養分の供給の制御を高める。 バイオリアクタ内の圧力は、蠕動性ポンプ率と静水圧を制御することで調整でき る。バイオリアクタの位置および／または培地溜めの位置を変えることで差圧を 生み出すことができる。拡散への差圧の影響は文献において定義されている。 通常は、潅流の最初には総圧力の最小の差が使用される。組織内の溶質の分子 の移動は、グルコースや酸素などの主分子の培地濃度の差により生成された浸透 圧の差により左右される。組織が生体外で発達すると、両培地の流量と一方の静 止圧を変えることで拡散を拡大できる。 本発明のバイオリアクタ内の培地の流量は、バイオリアクタの大きさ、組織の 表面積、組織の種類、特定の適用分野など様々な因子に応じて異なる。上記のよ うに、組織の一方の側の複数の培地流の流量は異なっている。一般に、肝臓組織 を培養するには、約０．５mL/分ないし１mL/分の培地流量が良好な結果を生み出 すことが出願人により発見されている。当分野の技術者なら、特定の適用分野に 適合するように流量を調整することができる。 本発明の１つの利点は培養された組織が好適に３次元であることであり、これ により細胞を生体内環境をシミュレートする位置にある組織層に位置させること ができる。その結果、多機能細胞を有する多様な組織が本発明のバイオリアクタ を用いて培養される。 図４を参照すると、肝臓細胞が少なくとも約１００μｍ、好ましくは約１mmの 厚さまで組織を発展させると、バイオリアクタに配置された肝臓組織は、生体外 肝臓装置として使用できる。この用途では、血液または血漿が入口３６を介して 装置に入り、肝臓組織の隣を流れる。 生体外肝臓装置では、血液または血漿および肝臓組織間に膜を使用できる。膜 を使用する場合には、遮断穴サイズを、通常約90,000ないし140,000ダルトン、 好ましくは約120,000ダルトンのＩｇＧを排除できる範囲にするのが望ましい。 生体外肝臓装置は、全血、血小板の少ない血液、または血漿を使用できる。血液 または血漿は、肝臓組織の表面上に接しながら空間４４を通過し、基本栄養素を 含む人工培地は、入口３２から組織の反対表面に接しながら空間４１を通過する 。上記のように、栄養素や廃棄物の交換は拡散により実行される。 生体外肝臓装置としてのバイオリアクタの使用が図９に図解されている。血液 が患者４６から取り出される。随意に、血漿搬出遠心器４８で血漿を血液細胞か ら分離可能である。血液を患者に戻す前に、血液細胞は後で血漿と再結合するた めに保存される。次いで、血漿または血液はバイオリアクタ３０に供給される。 できるだけ緊密に人の体の機能を模倣するために、肝臓による廃棄物を取り除く 必要のある血液または血漿は装置４４の真ん中を流れる。通路４４と４１の培地 間の拡散勾配により、アンモニアや他の廃棄物が肝臓組織４０に拡散する。肝臓 組織はアンモニアを尿に変換し、除去される。代りに、血液を患者に戻した後で 尿を患者の体で除去することもできる。血液から失われることのあるたんぱく質 は、血液を患者に戻す前に、追加される。 培地は、ソース５０とポンプ５２から供給される。使われた培地は受取り容器 ５４に引き込まれる。血液または血漿が出口３８からバイオリアクタを出ると、 必要なら喪失したたんぱく質と血液細胞とミキサ５６で再結合されて、患者４６ に戻される。 代替実施例では、本発明の複数のバイオリアクタが接続されて、急性または慢 性肝臓障害の継続的な処置を実行する。本発明の複数のバイオリアクタ３０は並 列に接続されている。患者の血液は、バイオリアクタが代謝負荷を処理できなく なるようになるまで、１台のバイオリアクタに潅流される。次いで、患者の血液 は第２のバイオリアクタに向けられて、第１のバイオリアクタは清浄されて、そ の代謝機能を回復する。並列に使用されたバイオリアクタの数は、各バイオリア クタのリサイクル時間に準じる。たとえば、清浄時間が速い場合には使用される 装置は２、３台になる。 本発明は、その基本要素が体外で増殖した３次元組織であるという点でなかん ずく新規性がある。３次元組織は本発明のバイオリアクタで培養可能であるし、 または他の場所でも培養して本発明のバイオリアクタに挿入してもよい。好まし い実施例では、基本要素は３次元組織である。組織は肝臓の実質細胞だけでなく 基質要素も含む。基質要素とは、マクロファージ、脂肪貯蔵細胞、血管および胆 管皮質細胞、線維芽細胞などである。こうした多機能細胞は、本発明による固有 の拡散勾配栄養分供給により体外組織培養を一度すれば可能になる。肝臓の全機 能を備え管外で実質細胞を増殖させるためには、こうした追加基質要素が必要で あることが判明している。 本発明の拡散勾配バイオリアクタは、液体と気体の境界面を必要としない任意 の組織を実際に増殖させるのにふさわしい。この組織には、肝臓だけでなく、内 分泌および外分泌膵臓、腎臓、腸、血管、骨、軟骨、皮膚、肺なども当てはまる 。さらに、図４と５に示してある同心円状バイオリアクタが好ましい実施例であ る一方、図１と２に示す平坦なリアクタも体外肝臓支援装置として使用できる。 本発明を使用している様々な例を以下に示す。本発明のバイオリアクタは肝臓 組織を培養しガン(Gunn)ラットの体外肝臓支援装置として示されているが、これ は例示に過ぎず、発明を制限するものではない。当然のことながら、本発明のバ イオリアクタは多様な組織を培養するために使用でき、体外肝臓として、または 人を含む他の動物の他の器官の支援装置としても使用できる。 例：肝臓組織の培養 ３次元機能肝臓組織は本発明のバイオリアクタで培養されたものである。 培養条件 ３次元管状組織は、Naughtonその他による米国特許第5510254号に記載された 共役培養方法を全体的に用いて本発明の平坦なバイオリアクタで培養される。肝 実質細胞の初期接種レベルは１０８個の細胞である。培地流量は約０．５mL/分 である。各培地流の構成は以下の表２に示す。 ＦＥＳ＝ウシの胎児の漿液、ＥＳ＝ウマの漿液 ＋ は以下の水化塩を含む。括弧はmg／Ｌの濃度の範囲を示している。 ＫＣｌ（４００）、ＭｇＳＯ₄（５０−２００）、ＮａＣＬ（ ６０００−６４００）、ＮａＨＣＯ３（２０００−３７００）、 ＮａＨＰＯ₄（１４０−８００） ＋＋ 培地Ｂの差分は＋（５−１０％）である。 ＋＋＋ 容積で１０ないし１５％にほぼ等しい濃度。漿液のない培地も使用 できる。この例では、ウシの血漿アルブミンと、表皮増殖因子、プ ロラクチン、成長ホルモンならびに他のホルモンなどの因子とを追 加して、臨界血漿要素を置換する。 ＊ は初期溶質濃度が高い培地を示す。 ＝ は両培地の溶質の濃度が同じであることを示す。 培地に解放されたアルブミンとフィブリノーゲンの濃度と総平均取り付け細胞 数は、Naughtonその他の米国特許第5510254号に記載されたように定められてい る。 結果 拡散勾配バイオリアクタで培養された組織の細胞は、静的に培養された肝臓組 織よりもはるかに厚く密度が濃い。組織は、活性プロテイン合成（図１０と図１ １）ならびに８日間に渡って細胞の数の一定の増加を示した。これらの結果から 、本発明のバイオリアクタは厚くて十分な機能を保持した組織を提供することが 実証される。 例：生体外肝臓支援組織としての使用 本発明のバイオリアクタはガンラットに効果的な生体外肝臓支援装置として使 用されている。 ガンラットモデルは、人のクリグラー‐ナジャー症候群の動物モデル（Cornel iusその他、1938、Am．J．Pathology 69:369-372）であり、体外肝臓支援装置と して本発明のバイオリアクタの効力を実証する理想モデルである。ガンラットに は、ウィスターラットの常染色体の劣勢形質として継承された欠点がある（Gunn 、1938、J．of Heredity 29:137-139）。ホモ接合の劣勢動物にある欠点は、UDP -グルコロノトランスフェラーゼ（UDP-glucuronosyltransferase）−−ビリルビ ンの結合と胆管排出に必要な酵素（老化した赤血球のヘモグロビンの分解産物） を符号化する遺伝子にある。したがって、ガンラットはビリルビンを結合するこ とも排出することもできず、血漿のビリルビンのレベルが通常のラットでは１mg /dLであるのに約５ないし２０mg/dLとなり超ビリルビン化する。（Johnsonその 他、1959、「子供のＡＭＡ病（AMA Diseases in Children）」99:591-608、「ガ ンラットのビリルビン結合の欠乏(Deficiency of Bilirubin Conjugation in th e Gunn Rat)」Re:肝臓輸送および胆管排出（Hepatic Transport and Bile Sec retion）、TravoliniおよびBerk，eds.，Raven Press，NY，pp.713-719） 実験プロトコル ヘテロ接合の（表現形が通常の）ガンラットの基質および実質肝細胞の共役培 養を含む３次元組織は、前述の例に記載のように本発明の平坦なバイオリアクタ におけるナイロン製のメッシュ（3-210.36 Tetko，NJ）で培養されている。培養 された肝臓組織の厚みは約１１０ないし１３０μｍであった。肝臓組織を含む矩 形のメッシュが多層円筒に巻き込まれて、半透性PTFE菅に（120,000ダルトンの 遮断；直径約０．５インチ）に挿入され、本発明の円筒形バイオリアクタ（直径 が約０．７５インチ、長さは約６インチ）に配置される。したがって、肝臓組織 の正味の活動する「厚み」は約０．５インチであった。 ガンラットの大腿動脈からの血液（総平均血液容量は１０ないし１２mL）は、 バイオリアクタの周辺を通過して潅流され、PTFE菅（図１０に概略的に図示され ている）により肝臓組織から分離される。蠕動性ポンプの助けで流量は約０．６ ないし０．８mL/分である。同時に、ダルベッコの修正イーグル培地が、約０． ５mL/分の流量で組織を巻かれたバイオリアクタの中心部分を介して流れ出る。 バイオリアクタから流れでる血液はガンラットに戻されている。 バイオリアクタから出る血液の非結合および結合ビリルビンの程度は、シグマ （Sigma）（Sigma Procedure #522/553）による命令に応じたシグマ全体および 直接ビリルビン評価システムを用いて６時間に渡って判定された。 結果 図１３に示すように、ガンラットはビリルビンを結合できないので、実際は、 そのビリルビンすべてが、ラットをバイオリアクタにかける前に、非結合化され ている（時間０）。装置にかけたて後約３０ないし３５分して、ガンラットの以 前非結合であったビリルビンの大半が結合化される。しばらくして、この結合化 されたビリルビンは、動物の通常の代謝過程により除去されるので、低下する。 ２時間後には、血漿ビリルビンはやっと検出可能なレベルとなる。こうした結果 から、培養組織が完全に機能的で、本発明の拡散勾配バイオリアクタが効果的な 体外肝臓支援装置を提供していることが実証される。 本発明は特定の実施例と適用分野から記載されてきたが、当技術分野の技術者 は、この教唆に照らして、請求された発明の範囲を超えることなくその精神を逸 脱しないかぎり追加実施例を生成可能である。たとえば、バイオリアクタシステ ムの様々な要素の特定の構成要素は制限要因として解釈すべきではない。したが って、本開示の図面と説明は、本発明の理解を容易にするために示されているも ので、その範囲を制限するものと解釈すべきではないことを理解すべきである。 本開示に引用された参考文献はすべて、事実上、完全に参考のために本明細書 に統合されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハルベルスタッド，クライグ，アール. アメリカ合衆国 92109 カリフォルニア 州，サン ディエゴ，フォレスト ストリ ート 5336 (72)発明者 シバンダ，ベンソン アメリカ合衆国 92056 カリフォルニア 州，オーシャンサイド，ウォーイング ロ ード ５番 3964

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ハウジングと、 第１及び第２の側がある組織とを、備え、 前記ハウジングは、前記ハウジングと前記組織の第１の側の間の第１流空間を 画定し、前記第１流空間は第１培地流を内部に配置し、第１濃度の溶質を有し、 前記組織の第１の側に接触し、 前記ハウジングは、前記ハウジングと前記組織の第２の側の間の第２流空間を 画定し、前記第２流空間は第２培地流を内部に配置し、第２濃度の溶質を有し、 前記組織の第２の側に接触し、溶質の第１濃度は溶質の第２濃度とは異なってお り、前記溶質は拡散により前記組織を通過することを特徴とするバイオリアクタ 。 ２． 第１半透膜が前記組織と前記第１培地流の間に配置され、第２半透膜が前 記組織と前記第２培地流の間に配置され、前記第１および第２半透膜を選択され た溶質が通過できる請求項１に記載のバイオリアクタ。 ３． 前記組織は基質細胞を有する請求項１に記載のバイオリアクタ。 ４． 前記組織はさらに肝臓実質細胞を有する請求項２に記載のバイオリアクタ 。 ５． 円筒形ハウジングと、 前記ハウジングの内周面上に配置された組織と、 前記組織と前記ハウジングの間の第１空間と、 前記組織が結合した前記ハウジング内の第２中央空間と、 第１濃度の溶質の第１培地流を前記第１空間に供給する少なくとも１つの培地 入口と、 第２濃度の溶質の第２培地流を前記第２空間に供給する少なくとも１つの培地 入口と、 少なくとも１つの培地出口と、を備えることを特徴とするバイオリアクタ。 ６． 溶質の第１濃度は溶質の第２濃度とは異なっており、前記溶質は拡散勾配 により前記組織を通過する請求項５に記載のバイオリアクタ。 ７． 内径と外径をもつ円筒形ハウジングと、 前記円筒形ハウジングの内径にほぼ等しい直径の第１円筒体部分と、前記第１ 直径より小さい第２直径の第２円筒体部分と、前記第２直径より小さい第３直径 の第３円筒体部分をそれぞれ有し、各端キャップの前記第１円筒体部分は前記円 筒形ハウジングの端部に密封係合する２つの端キャップと、 内周と外周をそなえ、前記円筒形ハウジング内に同軸状に配置され、１端部が １方の端キャップの前記第３体部分上に周面装着され、他端部が他の端キャップ の前記第３体部分上に周面装着される円筒形半透膜と、 前記円筒形ハウジングと前記半透膜の間に配置され、１端が１方の端キャップ の前記第２体部分上に周面装着され、他端が他方の端キャップの前記第２体部分 上に周面装着された円筒形支柱と、 前記膜および前記支柱の間の第１空間と、 前記膜の内周面上に配置された組織と、 前記組織が結合した第２中央空間と、 第１濃度の溶質を有する第１培地流を第１空間に供給する少なくとも１つの培 地入口と、 第２濃度の溶質を有する第２培地流を第２空間に供給する少なくとも１つの培 地入口と、 前記第１培地流の溶質が前記半透膜を介して通過可能な少なくとも１つの培地 出口と、を備えることを特徴とするバイオリアクタ。 ８． 溶質の第１濃度は溶質の第２濃度とは異なっており、前記溶質は拡散によ り前記組織を通過する請求項７に記載のバイオリアクタ。 ９． 前記組織は前記半透膜の外周面上に配置され、前記第２培地流の前記溶質 が前記膜を通過可能な請求項７に記載のバイオリアクタ。 １０． ３次元組織を増殖させる方法において、 （ａ）内部にメッシュ部分を配置して前記メッシュ部分の対向両側の個々の流 空間が画定されるハウジングを備えるバイオリアクタを用意する工程と、 （ｂ）前記メッシュ部分上に細胞を接種する工程と、 （ｃ）第１濃度の溶質を有する第１培地を前記メッシュ部分の１方の側上の細 胞に接触して流す工程と、 （ｄ）第２濃度の溶質を有する第２培地を前記メッシュ部分の他方の側の上の 細胞に接触して流し、ここで溶質の第１濃度は溶質の第２濃度とは異なっており 、前記溶質は拡散により前記組織を通過するものである工程と、 （ｅ）多機能細胞を有する３次元組織を増殖させ、多機能細胞の発達は、拡散 溶質にさらすことで前記培地流に関して極性を有することになる工程と、を備え ることを特徴とする前記方法。 １１． 細胞を接種する前記工程は基質細胞を接種するものである請求項１０に 記載の方法。 １２． 前記基質細胞を形成した後で肝実質細胞を追加する工程をさらに備える 請求項１１に記載の方法。 １３． 前記３次元組織は肝臓組織であり、 （ａ）前記培地流を停止させる工程と、 （ｂ）前記３次元肝臓細胞の１方の側と接触して血液を流す工程と、 （ｃ）前記３次元肝臓組織の反対側と接触して培地を流し、拡散により前記肝 臓組織を介して血液廃棄物を通過させる工程と、をさらに備える請求項１０に記 載の方法。 １４． （ａ）肝臓が機能不全を起こした患者から血液を引き出す工程と、 （ｂ）前記血液を流す工程のために前記血液を供給する工程と、 （ｃ）前記３次元肝臓により廃棄物を取り除いた後で前記患者に前記血液を戻 す工程と、をさらに備える請求項１３に記載の方法。 １５． 患者の血液を透析する方法であって、 （ａ）内部に３次元肝臓組織を配置して前記肝臓組織の対向両側に個別の流空 間が画定されるハウジングを備えるバイオリアクタを用意する工程と、 （ｂ）肝臓が機能不全を起こした患者から血液を引き出す工程と、 （ｃ）前記肝臓組織の１方の側に前記血液を流す工程と、 （ｄ）前記肝臓組織の反対の側に培地を流して、拡散により前記肝臓組織を介 して血液廃棄物を通過させる工程と、 （ｅ）前記血液を前記患者に戻す工程と、を備えることを特徴とする前記方法 。 １６． （ａ）前記血液を血漿と血球に分離して、前記肝臓組織の１方の側に前 記血漿を流す工程と、 （ｂ）前記血液を前記患者に戻す前に前記血漿と血球を再合体する工程と、を さらに含む請求項１５に記載の方法。