JP2000510331A - 前立腺癌のモニター観察および診断にて用いられる前立腺特異的抗原の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 前立腺特異的抗原に特異的なプライマーおよびこれらプライマーを用いて前立腺癌をモニター観察および診断するための方法が提供される。これらプライマーを有する前立腺癌診断用キットも提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 前立腺癌のモニター観察および診断にて用いられる前立腺特異的抗原の 検出方法 関連出願 本願は１９９６年４月１６日出願の米国仮特許出願６０／０１５７６５の利益 を主張するものである。 発明の背景 前立腺癌は、皮膚癌を除き、成人男性における最も一般的な悪性腫瘍であり、 合衆国においてますます大きくなっていく健康上の問題である。１９９４年には 、３８０００人の死者がこの疾患に由来し、前立腺癌が同一集団における最も一 般的な死亡原因として、肺癌に次ぐものと推定された。癌がまだ前立腺に限定さ れていると早期に診断されたならば、治癒の機会は著しく高くなる。従って、器 官限定（organ−confine）の前立腺癌を検出するために感度のよい方法が大いに 必要となる。 近年、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびその変法を用いて悪性細胞を検 出し、種々の悪性腫瘍が診断およびモニター観察されている。例えば、逆転写酵 素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、他の数千のｍＲＮＡ種の複雑な混合物中の特定の ｍＲＮＡ集団の存在を検出するのに用いることができる有力な技法である。ＲＴ −ＰＣＲにおいては、まずｍＲＮＡ種を逆転写酵素を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤ ＮＡ）に逆転写し、ついでそのｃＤＮＡを標準的ＰＣＲ反応にて増幅させる。こ のようにＲＴ−ＰＣＲは増幅によりｍＲＮＡの単一の種類の存在を明らかにする ことができる。したがって、ｍＲＮＡがそれを産生する細胞に対して極めて特異 的であるならば、特定の型の細胞の存在を同定するのにＲＴ−ＰＣＲを用いるこ とができる。 ３３ｋＤａタンパク質の前立腺特異的抗原（Prostate−specific antigen；Ｐ ＳＡ）は、最初、前立腺上皮細胞により産生されると考えられ、かくして前立腺 癌の検出およびモニター観察を助成するための腫瘍マーカーとして用いられた。 最近の研究はＰＳＡが前立腺組織に特異的でないことを明らかにしている。例え ば、DiamandisおよびYuは、女性肺癌の３０％に、他の腫瘍ではさらに稀に、正 常な肺組織に、および母乳などの生物学的流体にあるＰＳＡを報告している。Cl in.Chem．1995，41(2):177-179。ＰＳＡはまた内皮組織でも検出された。 ＰＳＡをコードするｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲが前立腺癌細胞の同定にて用いら れてきた。例えば、Deguchiらは、前立腺癌がリンパ系に転移した患者の局所的 リンパ節にてＰＳＡ ｍＲＮＡを検出した。Cancer Res．1993，53:5350-4。前進 性前立腺癌の患者の全身性循環にて前立腺癌細胞を検出するＲＴ−ＰＣＲ法も開 示されている。Morenoら、Cancer Res．1992，53:6110-2;Jaakkolaら、Clin．Ch em．1995，41(2):182-186。しかしながら、初期の前立腺癌および／または完全 に分化するかまたは局所疾患の患者では、ＰＣＲによるＰＳＡ ｍＲＮＡが陰性 であることが判明した。したがって、ＰＳＡ ｍＲＮＡに関するＲＴ−ＰＣＲは 、前立腺癌を診断するにしても、あるいはモニター観察するにしても有用な手段 ではないと結論づけられた。Diamandis，E.P.およYu，H．Clin．Chem．1995，41 (2):177-179。 本発明は、前立腺癌の患者をモニター観察および診断するための新規なプライ マーを用いる新規ＲＴ−ＰＣＲ法を提供するものである。この方法は血流中のＰ ＳＡについてのｍＲＮＡの存在を測定するように設計されており、それで前立腺 細胞が血液中を循環している証拠を得、癌の診断を立証するものである。さらに 、前立腺細胞の循環は患者が二次腫瘍または骨転移アンカーの危険性のあること を示す。前立腺切除術または放射線照射治療の後に摂取した試料が反応性であれ ば、それは前立腺癌が広がっており、手術／照射が効果的でなかった危険性を示 すものである。 発明の要約 本発明の目的は、前立腺癌の患者をモニター観察および診断するのに、前立腺 特異的抗原を検出するＲＴ−ＰＣＲ法にて使用するためのプライマーを提供する ことである。 本発明のもう一つ別の目的は、前立腺癌の進行をモニター観察する方法であっ て、これらのプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲで患者の前立腺特異的抗原を検出 することからなる方法を提供することである。 本発明のもう一つ別の目的は、これらのプライマーを有してなる、前立腺癌を モニター観察および診断するためのキットを提供することである。 図面の簡単な記載 図１は前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）についてのヒトＤＮＡ（配列番号１、８、 ９および１０）を示す。簡潔にするためイントロンは省略する。エクソンを太文 字で示す。当該分野にて以前に開示されているプライマーを下線を付して示す。 本発明のプライマー、すなわち、ＤＲ ＰＳＡ−Up（配列番号２）、ＤＲ ＰＳＡ −Down（配列番号３）およびＤＲ１２mer（配列番号４）は大文字で下線を付し たイタリック体で示す。 発明の詳細な記載 末梢血液中にてある種の組織に特異的なｍＲＮＡが発現していることは、癌細 胞の循環があり、この細胞を起源とする腫瘍の転移があるものと考えられる。末 梢血液中におけるＰＳＡ ｍＲＮＡの検出は、転移前立腺癌に付随するものであ るが、ＰＳＡ ｍＲＮＡは臨床上限定された前立腺癌の患者の血液中でも検出さ れた。したがって、前立腺癌を段階付ける臨床的方法は患者を下位に段階付け、 転移の危険性を過少評価することがしばしばである。 逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応により前立腺特異的抗原を検出する方法であ って、患者の前立腺癌をモニター観察するのに用いることのできる新規な方法が 開発された。本発明の方法にて用いるプライマーとして、ＤＲ ＰＳＡ−Up： 5'-GTTGTCTTCCTCACCCTGTCCG-3’（配列番号２）、ＤＲ ＰＳＡ-Down： 5'-TCCAGCACACAGCATGAACTTG-3’（配列番号３）およびＤＲ１２mer： 5'-GAATCACCCGAG-3’（配列番号４）が挙げられる。本発明の方法は、バフィー コート細胞を単離および洗浄し、全ＲＮＡをバフィーコート細胞から単離し、Ｐ ＳＡについて逆転写（ＲＴ）反応に付し、ＰＳＡについてＰＣＲに付し、ＤＮＡ シークエンサー上でＰＳＡ産物の有無を検出することからなる。該方法はさらに 、ハウスキーピング遺伝子ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｇ:Israeliら、 Cancer Research 1994 54:6306-6310）についてＲＴ反応およびＰＣＲに付し、 単離されたＲＮＡの量をモニター観察することからなる。 この方法において、バクタイナー細胞調製管（Vacutainer Cell Preparation Tubes（CPT）（Becton Dickinson Vacutainer Systemsカタログ番号362761、ク エン酸ナトリウム抗凝血物質含有、８ｍｌ抜出、San Jose，CA）を用いて前立腺 癌であると思われる患者から血液試料を採集する。ついで、これらの試料を製造 業者の指示に従って遠心分離に付し、バフィーコートを他の血液成分と分離する 。ついで、バフィーコート細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離でペレット状にする 。そのペレット細胞を細胞溶解緩衝液に溶かす。細胞をQiagen QIAシュレッダー マイクロスピンカラムを通してホモジネートする。ついでQiagen RNeasyカラム にさっと通してＲＮＡを結合させる。試料を洗浄してＤＮＡおよび他の成分を除 去し、そのＲＮＡをＤＥＰＣ処理水で溶出する。溶出した試料のＲＮＡをＲＴ反 応における基質として用いる。ＰＳＡ反応についてのＲＴ反応プライマーは、Ｐ ＳＡ標的に特異的なＤＲ１２mer（配列番号４）である。ついで、ＲＴ反応のア リコートを、プライマーＤＲＰＳＡ Up（配列番号２）およびＤＲ ＰＳＡ Down （配列番号３）を用いてＰＳＡについてのＰＣＲ反応に用いる。さらにＢ２Ｇに ついてのＲＴ反応およびＰＣＲからなり、単離されたＲＮＡの性質をモニター観 察する好ましい具体例において、ＲＴ反応のプライマーは、５'−AGCTTTGAGTGC −３’（配列番号５）であり、ＰＣＲ反応のプライマーは、５'−AGCAGAGAATGGA AAGTCAAA−３’（配列番号６）および５'−TGT TGATGTTGGATAAGAGAAT−３’（配 列番号７）である。各患者の反応から由来の生成物の大きさをＡＢＩ３７３ＤＮ Ａアナライザーを用いてＡＢＩ ＧＥＮＥＳＣＡＮソフトウェアと比較する。こ の組み合わせにより、白血球（ＷＢＣ）百万個当たり１個またはそれ以下のＬＮ ＣａＰ（ＰＳＡを産生する前立腺癌組織培養）細胞の高い希釈度での存在を測定 するのに要求される感度が得られる。平均８ｍｌの血液試料はおよそ４千万個の ＷＢＣを含有するであろう。ＡＢＩ６７２ＧＥＮＥＳＣＡ Ｎソフトウェアは産物の各々の塩基の大きさを測定し、各産物を限定的に同定す ることができる。 前立腺癌の検出における本発明の方法の特異性を測定した。正常な患者ならび に良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、前立腺炎および種々の段階の前立腺癌の患者から の血液試料中のＰＳＡレベルを測定した。これら実験の結果を以下の表１に示す 。 正常なドナーには３５歳以下の男性および女性が含まれる。ＢＰＨドナーには癌 ではないがＢＰＨと診断された患者が含まれる。前立腺癌症状は患者の顧問医が 決定した。 これらの結果に示されるように、本発明の方法は、転移前立腺癌、特に進行段 階にある前立腺癌および安定状態が５年に満たない前立腺癌の測定に特異的であ る。「進行状態」とは、骨または他の部位への転移が同定されている癌、最後の 検査の際よりも転移が拡大および／または増えている癌を意味する。安定状態が ５年に満たない患者は、経験的に５年になる前に略６６％の再発率で罹患する。 表１に示す結果はこの再発率と一致する。本発明のアッセイによる試験では、こ の群の６人のうち２人の非反応性患者が５年経過後も安定状態を保持するが、６ 人のうち４人の反応性患者は再発する可能性が高いと予想される。Ｂ期の癌また は転移していない器官限定された癌の患者からの試料は本発明の方法にて非反応 性であった。さらには、安定状態の患者とは、過去に転移したことがあるが、５ 年またはそれ以上の期間進行しておらず、治瘉していると考えられる患者を意味 し、彼らも非反応性であった。 最近の研究により、前立腺細胞の循環はさらに前立腺切除術の結果として起こ り得ることが明らかにされている。0efe1einら、J．Urol．1996 155:238-242。 もし癌細胞であるならば、その手術により引き起こされるこれらの細胞の循環は 転 移を生じさせる。本発明の方法は、手術前ならびに手術後に患者が非反応性であ ることを確認するためにこれらの手術をモニターするのに用いることができる。 本発明はまた、ＤＲ ＰＳＡ-Up（配列番号２）、ＤＲ ＰＳＡ-Down（配列番号 ３）およびＤＲ１２mer（配列番号４）のプライマーを有してなる、前立腺癌の 進行をモニター観察するためのキットを提供するものである。好ましい具体例に おいて、これらのキットはまた、配列番号５、６および７などのＢ２ＧをＲＴお よびＰＣＲ検出するためのプライマーを有する。さらには、本発明のキットは、 バクタイナー細胞調製管などのバフィーコートを他の血液成分から分離すること のできる、血液試料を採集するための管を有していてもよい。本発明のキットは また、ＲＮＡを単離するための手段を有していてもよい。例えば、一の具体例に おいて、該キットは、細胞溶解緩衝液と、細胞を均質にするためのQiagen QIAシ ュレッダーマイクロスピンカラム（カタログ番号７９６５５）と、ＲＮＡを結合 させるためのQiagen RNeasyカラム（カタログ番号７４１０６）とからなってい てもよい。該キットはまた、ベーターメルカプトエタノール（Beta−Mercaptoet hanol；ＢＭＥ）、ピロ炭酸ジエチル（Diethyl Pyrocarbonate；ＤＥＰC）、ス ーパースクリプトII ＲＮase H−逆転写酵素（SuperScript II ＲＮase H−Reve rse Transcriptase（Gibco BRL，Gaithersburg，MD））、エタノール（２００プ ルーフ）、１００ｍＭ ｄＮＴＰ、AmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer カタログ番号Ｎ808−0153）、６%（６%Ｔ、５％Ｃ）変性アクリルアミドゲルGib co／BRL）６%シークエンシング溶液（Gel−Mix６；カタログ番号5543UA）、１０ %過硫酸アンモニウム、ブルーデキストラン（Blue dextran（５０ｍｇ／ｍｌ） および２００ｍｌのホルムアミドおよび２０ｍｌの１００ｍＭ ＥＤＴＡを含有 する変性負荷緩衝液、シークエンサー・ギブコ／ＢＲＬウルトラピュアー・ゲル −ミックス・ランニングメート（Sequencer Gibco/BRL UltraPure Gel−Mixrunn ing mate）用の１Ｘ ＴＢＥ（カタログ番号15546−013）およびBrij35（Sigma C hemical Co．St．Louis，MO、カタログ番号430AG−6）を含め、以上の試薬を有 していてもよいが、これに限定されるものではない。さらに、標品および対照を 本発明のキットに含めることもできる。一例として、Genescan ROX−2500 標品（Perkin Elmer／ABIカタログ番号401100）、ＡＴＣＣセルラインCRL−1435 PC−3（ヒト前立腺アデノカルシノーマ）またはHTB−22 MCF7（ヒト胸膜滲出液 、肺アデノカルシノーマ）からのＲＮＡおよびＡＴＣＣセルラインCRL−1740 LN CaP（ヒト転移前立腺アデノカルシノーマ）からのＲＮＡが挙げられるが、これ に限定されない。 本発明を以下の実施例を用いてさらに説明するが、これに限定されるものでは ない。 実施例 実施例１：試薬の調製 本質的にRNase不含の、滅菌処理した使い捨てプラスチックウェアに、少なく とも８時間１８０℃で焼結したガラスウェアに、あるいはクロロホルムでリンス したボリプロピレン製プラスチックウェアにて、試薬を調製する。 ＲＮＡおよび逆転写操作に用いる溶液を、ＲNase不含ガラスウェア、オートク レーブ処理した水および焼結スパテラで処理したＲＮＡ操作用の化学物質を用い て調製する。溶液用の水を３７℃で少なくとも１２時間０．１％ＤＥＰＣで処理 し、ついで１００℃に１５分間加熱するかまたは液体サイクルで１５ポンド／平 方インチで１５分間オートクレーブ処理する。 本発明の方法に用いるリン酸緩衝セイライン（ＰＢＳ）は、ＮａＣｌ（８ｇ） 、ＫＣＩ（０.２ｇ）、Ｎａ₂ＨＰＯ₄（１．４４ｇ）およびＫＨ₂ＰＯ₄（０．２ ４ｇ）を蒸留水（８００ｍｌ）に溶かすことで調製する。その緩衝液のｐＨをＨ Ｃｌで７．４に調節する。ついで、その容量をＨ₂Ｏで１リットルに調節する。 使用前に、その緩衝液を液体サイクルで１５ポンド／平方インチで２０分間オー トクレーブ処理して滅菌し、室温で貯蔵する。 溶菌緩衝液（ＢＭＥ）を、QIAGEN RNeasyキット溶菌緩衝液ＲＬＴ（１０ｍｌ ）当たり１００μｌのＢＭＥより調製する。得られた溶菌緩衝液／ＢＭＥは１ヶ 月間安定状態である。 洗浄緩衝液ＲＰＥは、４倍容量の９６−１００％エタノールをQiagenより入手 したその濃縮物に添加することにより調製する。 ７００ｍｌのエタノール（２００プルーフ）をＤＥＰＣ処理水（３００ｍｌ） に添加することにより７０％エタノールを調製する。該溶液を室温で貯蔵する。 実施例２：白血球の単離操作 血液試料をクエン酸ナトリウムを含むバクタイナーＣＰＴ管中に得る。ついで 該試料を室温（２０−２５℃）で水平振動式ヘッドローター中、１５００−１８ ００ＲＣＦ（相対遠心力）で３０分間遠心分離に付す。遠心分離に付した後、バ フィーコートが血漿層のすぐ下に白色がかった層として表れる。細胞層をかき乱 すことなく、約半分の血漿を吸引する。ついで、細胞層を滅菌ピペットで収集し 、１５ｍｌの円錐形遠心管に移す。 ＰＢＳをその円錐形遠心管に加え、容量を１５ｍｌにする。ついで、該管に栓 をし、該管を５回反転させることで細胞とＰＢＳを混合する。ついで、該管を３ ００ＲＣＦで１５分間遠心分離に付し、上澄みを細胞ペレットを乱すことなく吸 引する。ＰＢＳを再び該細胞に加え、その容量を１０ｍｌにする。該管に栓をし 、その管を５回反転させることにより細胞とＰＢＳを混合する。ついで、該管を ３００ＲＣＦで１０分間遠心分離に付す。出来るだけ多くの上澄みを細胞ペレッ トをかき乱すことなく吸引する。溶菌緩衝液／ＢＭＥ（４００ｍｌ）を該ペレッ トに加え、細胞を緩やかに攪拌することにより懸濁させる。この段階で、試料を −７０℃で凍結させるか、または直ちにＲＮＡを単離するために用いる。 実施例３：ＲＮＡの単離操作 細胞／溶菌緩衝液／ＢＭＥ懸濁液を、ピペットで直接、QIAGEN QIAシュレッダ ーカラムに移し、マイクロ遠心分離器で１分間十分な速度で遠心分離に付す。液 体がそのカラム上に残っているならば、遠心分離の時間を延長することもできる 。ある容量（４００μｌ）の７０％エタノールをその均質溶菌に加えて混合する 。ついで、その試料をRNeasyスピンカラムに加え、８０００ｘｇ（１００００ｒ ｐｍ）で１５秒間遠心分離に付す。フロースルーを捨てる。ついで、洗浄緩衝液 ＲＷ１（７００μｌ）をピペットでスピンカラム上に移す。該カラムを再び遠心 分離に付し、フロースルーを捨てる。この洗浄の後、そのスピンカラムを新 たな２ｍｌの収集管に置く。洗浄緩衝液ＲＰＥ（５００μｌ）をピペットでスピ ンカラム上に移し、前記のように遠心分離に付す。フロースルーを捨てる。洗浄 緩衝液ＲＰＥの第２アリコートをピペットでスピンカラム上に移し、２分間十分 な速度で遠心分離に付してRNeasyスピンカラムを乾燥させる。この２分間のスピ ンで、残りのエタノールが溶出にまで持ち越されないようにする。ついで、その スピンカラムを新たな１．５ｍｌ収集管に移し、ＲＮＡ試料を５０μｌのＤＥＰ Ｃ処理水で溶出し、ピペットで直接的にスピンカラム膜に移し、つづいて８００ ０ｘｇで６０秒間遠心分離に付す。ＲＮＡ試料を直ちにＲＴ反応に用いてもよく 、あるいはさらに使用するまで−７０℃で貯蔵する。 実施例４：ＲＮＡ濃度の測定 各試料のＲＮＡ濃度をＵＶ分光測光器で測定する。まず、７５μｌの蒸留水の 基底吸光度を２６０、２８０および３２０ｎｍで測定する。ついで、５μｌのＲ ＮＡ試料を添加して混合する。試料の吸光度を２６０、２８０および３２０ｎｍ で測定する。ニートなＲＮＡ濃度を次のように算定する： ａ）Ａ２６０からＡ３２０を減じ、ＲＮＡによる吸光度を得； ｂ）希釈因子（８０μ／５μｌ）を掛け合わせ；および ｃ）変換因子（０．０４ｍｇ／ｍｌ）を掛け合わせる。 実施例５：試料の逆転写操作 ２μｌの５０μＭ ＰＳＡ ＲＴプライマー（配列番号４）をピペットで各ＰＣ Ｒ反応管に加える。２μｌの５０μＭ Ｂ２Ｇ ＲＴプライマー（配列番号５）を ピペットで別のＰＣＲ反応管に加える。管を先立って調製し、−２０℃で貯蔵し てもよい。 ＲＴ反応混合物を以下の方法にて使用する直前に調製する。試験する試料反応 物（ＰＳＡおよびＢ２Ｇ）の数を、まず、変数Xとして決定する。ついで、以下 の容量の試薬を混合する：４（Ｘ＋１）μｌの５XFirst Strand Buffer；２（Ｘ ＋１）μｌの０.１Ｍ ＤＴＴ；２（Ｘ＋１）μｌの２０ｍＭ ｄＮＴＰ溶液；１ （Ｘ＋１）μｌのSuperScript 11逆転写酵素。ついで溶液を攪拌して均質にする 。 ＲＮＡ試料当たり２本の管、ＰＳＡおよびＢ２Ｇの各反応について１本の管を 調製する。１０μｌのＲＮＡ試料を各反応管に加える。ついで、すべてのＲＴ反 応管を７０℃で１０分間とプログラムされた熱サイクラーに入れる。そのプログ ラムが終えると同時に、その熱サイクラーをＰＡＵＳＥにし、各管を氷上に置く 。ついで、１０μｌのＲＴ反応混合物を各管に加え、次のプログラム：２５℃で ５分間；４２℃で１５分間；９７℃で１５秒間；つづいて４℃で少なくとも５分 間のプログラムを試験する。 実施例６：試料の増幅操作 ＰＳＡ ＰＣＲ反応混合物を次の方法にて調製する。試験するＰＳＡ試料反応 物の数を変数Ｘとして決定する。ついで、以下の容量の試薬を混合する：３１． ９５（Ｘ＋１）μｌの水；４（Ｘ＋１）の１０Ｘ ＰＣＲ Buffer II；（Ｘ＋１ ）μｌの２０ｍＭ ｄＮＴＰ；０.８（Ｘ＋１）μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂；２（ Ｘ＋１）μｌのＰＳＡプライマー（配列番号２および３）および０.２５（Ｘ＋ １）μｌのＴａｑ酵素。 Ｂ２Ｇ ＰＣＲ反応混合物を次の方法にて調製する。試験するＢ２Ｇ試料反応 物の数を変数Ｘとして決定する。ついで、以下の容量の試薬を混合する：３３． １５（Ｘ＋１）μｌの水；４（Ｘ＋１）の１０Ｘ ＰＣＲ Buffer II；（Ｘ＋１ ）μｌの２０ｍＭ ｄＮＴＰ；０.８（Ｘ＋１）μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂；０． ８（Ｘ＋１）μｌのＢ２Ｇプライマー（配列番号６および７）および０.２５（ Ｘ＋１）μｌのＴａｑ酵素。 ＲＮＡ試料当たり２本の管、ＰＳＡおよびＢ２Ｇの各反応について１本の管を 調製する。４０μｌの適当な反応混合物をぴペットで各管に加える。１０μｌの 各ＲＮＡ試料または対照ＲＮＡ逆転写反応体をピペットで各管に加える。負の（ 反応）対照では、１０ｍｌの水を用いる。管を１０秒間エッペンドルフ（Eppend orf）製マイクロ遠心分離器で遠心させ、すべての液体を管の底部で混合させる 。ついで、該管をPerkin Elmer 9600 Thermocyclerに入れ、以下のようにサイク ルを行う： サイクルの型 温度 時間 サイクルの回数 サイクル工程 ９５℃ １５秒 ３０ ５８℃ １５秒 ７２℃ ４５秒 ホールド ７２℃ ３分間 １ ホールド ４℃ 限定せず １ 実施例７：試料の検出操作 以下の方法に用いるための、２個の６ｃｍのウェル−ツ−リード（well-to-re ad）プレート（１つは刻みをつけ、１つは平坦である）を調製する。各プレート は両面とも蒸留水でリンスする。各プレートの片側だけをそのプレートの内面（ ゲル面）として選択する。ついで、この内面をメタノールで、つづいて０.５％B rijでリンスする。プレートに条痕がなくなるまでメタノールでのリンスを繰返 す。 次に、平坦なプレートのエッジに、そのプレートの短辺に平行方向にスペーサ ーを置く。刻みを入れたプレートを、プレートの内面が相互に向かい合うように その平坦なプレートの上に置く。ついでそのプレートをその底部エッジで立て、 底部とゲル面とでレベルであるようにスペーサーをラインアップする。底部で平 坦プレートがフラットであるようにゆっくりと横にし、６個の結合クリップでク ランプする。 ７５ｍｌの過硫酸アンモニウムを２０ｍｌのGel−Mix６に加え、穏やかに攪拌 して混合する。ついでその溶液をシークエンシングプレートの間に注ぐ。櫛状の 試料を挿入し、１−２時間ポリマー化させる。 ポリマー化終了後、クランプを取り外し、プレートの外面からアクリルアミド がすべて除去されるように注意して、そのプレートの外側を蒸留水できれいにす る。ついで、プレートを３７３シークエンサーに挿入し、製造業者の指示に従っ てプレートのチェックを行い、干渉についてチェックする。頂部および底部の緩 衝液リザバーを、各々、７００ｍｌおよび３００ｍｌの１X ＴＢＥで満たす。櫛 状の試料をそのプレートの間から取り出し、アクリルアミドおよび尿素を１Ｘ ＴＢＥでウェルから洗浄する。 ゲルを２８ワットで５分間予め作動させる。 ２μｌのＰＣＲ反応体をピペットで０.２ｍｌの薄壁ＰＣＲ反応管に移す。つ いで、変性試料緩衝液（２Ｘ；２．５ｍｌ）および０．３ｍｌのGenescan R0X− ２５００標品を加える。管をＰＥ９６００Thermocyc1erに入れ、９４℃で１０分 間試験する。プログラムの終了と同時に、その熱サイクラーをPAUSEにセットし 、各管を氷上に置く。ついで、４μｌの冷却試料をゲル上にローディングする。 ＡＢＩシークエンサーを２８ワット、６００ボルト、４０ミリアンペアで３．５ 時間作動するようにセットし、Genescanデータコレクションを３時間収集する。 各々のプライマーセット増幅で期待される値は以下のとおりである： マーカーサイズ（ｂｐ） 観察される範囲 Ｂ２Ｇ ５３７ ５２９−５４０ ＰＳＡ ５８６ ５８５−５８８

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ， ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．患者における前立腺癌を診断かつモニター観察する方法であって、配列番 号２、配列番号３および配列番号４のプライマーを用いる逆転写酵素−ポリメラ ーゼ連鎖反応により患者から由来の試料中の前立腺特異的抗原ｍＲＮＡを検出す ることからなる方法。 ２．配列番号２、配列番号３および配列番号４の、前立腺特異的抗原ｍＲＮＡ を検出するためのプライマー。 ３．配列番号２、配列番号３および配列番号４のプライマーを有してなる前立 腺癌をモニター観察および診断するためのキット。