JP2000510332A - インチミンを単独で、または１以上の他の抗原との融合タンパク質として発現する宿主生物の投与による、免疫応答を刺激する方法 - Google Patents

インチミンを単独で、または１以上の他の抗原との融合タンパク質として発現する宿主生物の投与による、免疫応答を刺激する方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、トランスジェニック植物により発現される腸管出血性大腸菌(EHEC)の接着性タンパク質であるインチミン(intimin)を単独でまたは１以上の他の抗原との融合タンパク質として提供することにより、また、EHECおよび１以上の他の抗原に対する防御免疫応答を刺激するためのビヒクルとして前記植物を使用することにより、当技術分野におけるニーズを満たすものである。EHECから、インチミン様タンパク質を発現する病原体から、またはインチミンと融合され得る１以上の他の抗原のいずれかを発現する病原体から、様々な動物種およびヒトをも防御するために、様々な植物種を形質転換する。インチミンをコードするeae遺伝子、その機能性部分、または融合タンパク質をコードする組換え体をプラスミド中の構成的植物プロモーターの制御下に置き、このプラスミドを個々の植物種に適したタイプの形質転換により植物に導入する。次に、インチミンまたはインチミン融合タンパク質を発現する遺伝子工学的に作出した植物を動物および／またはヒトに投与して、EHECによるコロニー化および感染から、または該１以上の他の抗原および交差反応性抗原を発現する病原体から、動物／ヒトを防御する抗体の産生を引き出す。本発明はまた、細菌、酵母、真菌などの他の宿主生物においてインチミンまたはインチミン融合タンパク質を発現させることによっても実施することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 インチミンを単独で、または１以上の他の抗原との融合タンパク質として 発現する宿主生物の投与による、免疫応答を刺激する方法 政府の利権 本明細書に記載される発明は、政府が使用する上では、それに対するいかなる 使用料をも本発明者らに支払うことなく、製造し、認可を与え、かつ用いること ができる。 関連出願に対する相互参照 本願は、1996年4月19日および1996年4月22日に出願された、発明者Marian McK ee、Alison O’Brien、およびMarian Wachtelの、ヒスチジンタグ付きインチミ ン（intimin）およびインチミンを免疫応答の刺激に用い、かつ標的化能力を有 する抗原坦体として用いる方法（HISTIDINE-TAGGED INTIMIN AND METHODS OF US ING INTIMIN TO STIMULATE AN IMMUNE RESPONSE AND AS AN ANTIGEN CARRIER WI TH TARGETING CAPABILITY）と題する仮出願に関連し、この出願は引用により本 明細書中に組み込まれる。 発明の分野 本発明は、インチミンを単独で、または１以上の他の抗原との融合タンパク質 として発現するように植物を遺伝子工学的に作出するためのプラスミド、および そのプラスミドで形質転換した宿主生物を投与することによって防御免疫応答を 促進する方法に関する。この防御免疫応答は、インチミン、またはその一部およ び／または１以上の抗原に対するものである。前記宿主生物には、細菌、酵母、 真菌、および植物が含まれる。 発明の背景 病原性形態(virulent form)の出血性下痢は腸管出血性大腸菌（EHEC）によっ て引き起こされる。この病原体は、合衆国における出血性下痢（出血性大腸炎[H C］とも呼ばれる）の最も一般的な感染性要因である（疾患管理および予防セン ター（Centers for Disease Control and Prevention）（運営概要）．MMWR43(N o．RR-5):1-18(1994)；Griffin，P.M.らAnnals of Internal Med．109:705(1988 )）。血清型の1つ、とりわけ0157：H7、は合衆国において最も一般的に単離され ているEHECの血清型であり、1982年に始まるHCの多数の突発に関連付けられてい る（Riley，L.W.らN．Eng．J．Med．308:681(1983)）。 主な様式のEHECの伝播は、汚染された食物、とりわけ加熱が十分でないハンバ ーガーの摂取を介して生じる（Doyle，M．P.およびSchoeni，J．L．Appl．Envir on．Mecrobiol．53:2394(1987)；Samadpour，M.らAppl．Environ．Microbiol．6 0:1038(1994)）。EHECに感染した人々のうち、5％もが溶血性尿毒症症候群（HUS ）と呼ばれる重篤な合併症に罹患し、HUSとは腎臓糸球体に存在するような血管 の内層をなす細胞（内皮細胞）を標的として破壊する志賀毒素様毒素の作用によ って引き起こされる症状である（Johnson，W.M.らLancet．i:76(1983)；O’Brie n，A．D.らLancet．i:702(1983)）。HUSは恒久的な腎臓の損傷、あるいは完全な 腎不全さえ生じることがある。 EHECは健常な成人においてさえ非常に重篤な疾患を引き起こすことがあるが、 とりわけ幼い子供はその感染によって死亡したり、恒久的な損傷を受けたりする 、より大きな危険にさらされている。この感染が特に危険なものであり得るその 他の者には、高齢者および免疫無防備状態の者が含まれる。ウシにおけるEHECの 罹患率および十分に加熱されたハンバーガーと加熱不十分なハンバーガーとを区 別する上での主観的な特質によっては、ファーストフードレストランでの、もし くは家庭でのバーベキューの時ですら、そのご都合主義の加熱終了で、家庭の悲 劇が生じ得る。 このEHECの致命的な性質についての鍵の１つは、ノトバイオート・ブタにおい て示されるような、結腸に接着性／消滅性（attaching／effacing）（A／E）腸 管病変を生成するその細菌の能力である（Tzipori，S.らInfect．Immun．57:114 2(1989)）。ブタにおいて示されるこのA／E病変は、腸管内層の粘膜細胞への細 菌の密接な付着および微絨毛の溶解を特徴とする（McKee，M．L.らInfect． Immun．63:3739(1995)；Tzipori，S.らInfect．Immun．57:1142(1989)）。同様 の病変は組織培養物中のヒト喉頭上皮（HEp-2）（ATCC＃CCL23）細胞において見 られる（McKee，M．L.らInfect．Immun．63:3739(1995)；Tzipori，S．らInfect ．Immun．57:1142(1989)）。 1990年に、Jerseらは関連する下痢性大腸菌株、腸内病原性大腸菌（EPEC）に おいて染色体遺伝子を同定した。eaeと命名されたこの遺伝子は、組織培養にお いてA／E病変を生成する上でこの細菌に必須であることが見出された（Jerse，A ．E.らProc．Natl．Acad．Sci．USA．87:7839(1990)）。このeae遺伝子は、Eae と呼ばれるEPECのインチミンである94kDa外膜タンパク質をコードしていた。類 似のタンパク質がEHEC 0157：H7株中に存在することが示された（Jerse，A．E. およびKaper，J．B．Infect．Immun．59:4302(1991)）。 近年、研究者達は、ヒト上皮喉頭（HEp-2）細胞およびヒト回腸上皮（HCT−8 ）細胞（ATCC＃CCL244）へのEHECの付着（McKee，M．L.らInfect．Immun．63:37 39(1995)）ならびに子ブタ腸管におけるA／E病変の形成（Donnenberg，M．S.らJ ．Clin．Invest．92:1418(1993)；McKee，M．L.らInfect.Immun.63:3739(1995) ）にはインチミンが必要であることを示した。EHECを用いたヒトの研究は行われ てはいないが、EPECにおいて見出されるインチミンタンパク質はヒトボランティ アにおける下痢および熱の生成に強く関連する（Donnenberg，M．S.らJ．Clin． Invest．92:1412(1993)；Levine，M．M.らJ．Infect．Dis．152:550(1985)）。 EPEC E2348／69株を抗原投与したヒトボランティア（10人中10人）では、28日 後にこの94kDaタンパク質に対する注目に値する免疫応答が高まった（LevineらJ Infect．Dis．152:550，1985）。これらのヒトでの治験において、E2348／69の 摂取の後に下痢を発症しなかった唯１人のボランティア（10人のうちの１人）は 、抗原投与前に94kDaタンパク質に対する検出可能な抗体を有していたグループ の１人であつた。 A／E病変を誘発することが可能な他の2種類の細菌種がeae遺伝子座を有するこ とが示されている：ハフニア・アルベイ（Hafnia alvei）（Albert，M．J.らJ． Med．Microbiol．37:310(1992)）およびシトロバクター・フロインディイ（Ci trobacter freundii）バイオタイプ4280（Schauer，D．B.およびFalkow，S．Inf ect．Immun．61:2486(1993)）。これらの細菌は一般にはヒトの病理に関係しな いが、それらが通常関連する動物種においては重要な疾患を引き起こすことがあ る。例えば、シトロバクター・フロインディイ・バイオタイプ4280はマウスにお ける胃腸管疾患に関連する。マウスは、しばしば、実験おける対照および被験対 象としての役目を果たす。動物飼育施設におけるこの疾患の突発により、経済的 で注意深く制御された実験が危険にさらされる可能性がある。加えて、このよう な細菌種は免疫無防備状態の患者、若年者および高齢者、に対して病原性となる 可能性がある。 インチミンを発現する細菌株に感染したウシのような動物は、他者へのその感 染の源としての役目を果たすことに加えて、それら自身が罹患する可能性がある 。抗生物質での治療を用いて動物におけるこれらのインチミン発現細菌の動物蓄 積を根絶すること、またはそれを制限することさえも、非常に高価である。加え て、ヒトまたは動物におけるこの感染の抗生物質治療が高価であるだけでなく、 これらの抗生物質自体が副作用に関連し、その副作用が危険なものである可能性 がある。EHECと同様に、これらの副作用は幼い子供および高齢者にとって特に危 険なものである可能性がある。したがって、インチミンを発現する細菌に対する 防御免疫応答の促進により、この感染の重篤性を減少させ、またはそれらを完全 に予防する別の手段が必要とされる。 さらに、抗原注射による免疫感作よりも時間を消費せず、高価ではなく、かつ 痛みが少ない免疫感作形態が必要とされる。さらにまた、感染箇所、最も頻繁に は胃腸管粘膜、に含まれる特定の組織において防御免疫応答を産生させることが 必要とされる。 胃腸管組織に感染する他の生物（これらにはサルモネラ種および赤痢菌種が含 まれるがそれらに限定されるものではない）が免疫応答を生じることが可能であ る抗原を有する。しかしながら、粘膜の免疫応答を刺激するために胃腸管粘膜を これらの抗原の標的とする手段ならびに循環抗体を刺激する手段が必要とされる 。 最後に、防御免疫応答を促進する作用因子(agents)を送達する代替手段が必要 とされる。 発明の要約 本発明は、免疫応答を刺激する方法であって、インチミン、インチミン様タン パク質、またはその一部をコードするベクターで植物を形質転換して、該植物が インチミン、インチミン様タンパク質、またはその一部を発現するようになし、 および該植物またはその一部を患者に投与することを含んでなる方法に関する。 また、本発明は、免疫応答を刺激する方法であって、インチミン、インチミン様 タンパク質、またはその一部をコードするベクターで植物を形質転換して、該植 物はインチミン、インチミン様タンパク質、またはその一部を発現するようにな し、該植物またはその一部からインチミン、インチミンの一部、またはインチミ ン様タンパク質を抽出し、抽出したインチミン、インチミンの一部、またはイン チミン様タンパク質を患者に投与することを含んでなる方法に関する。 加えて、本発明は、植物における異種ＤＮＡの発現をコードするＤＮＡ構築物 であって、該異種ＤＮＡがインチミン、インチミン様タンパク質、またはその一 部をコードするＤＮＡ構築物に関する。さらに、本発明は、異種ＤＮＡをコード し、かつ発現する異種ＤＮＡ構築物を含有する植物細胞であって、該異種ＤＮＡ がインチミン、インチミン様タンパク質、またはその一部をコードする植物細胞 に関する。 さらにまた、本発明は、再生能のある植物細胞を用意し、かつ該植物細胞を上 述のＤＮＡ構築物で形質転換することを含んでなるトランスジェニック植物細胞 の作出方法に関する。 図面の簡単な説明 図１は、RIHisEaeをコードするプラスミドpEB313を示す。このプラスミドは、 935個の推定アミノ酸のうちの900個にわたるヒスチジンタグ付きインチミンをコ ードする。 図2は、完全なEHEC933 eae遺伝子の推定タンパク質配列を示す。 図3は、Beebakhee，G.らによって配列決定された、EHEC CL8株からのＤＮＡ配 列を示す。 図4は、YuおよびKaperによって配列決定された、EHEC 933株からのＤＮＡ配列 を示す。 図5は、eaeと表示された領域においてPCR増幅によって製造されたeaeの3144bp 断片を示す。 図6は、lacプロモーターによって駆動(drive)されるEHEC 86−24eae株（全コ ーディング配列）をコードするプラスミドpEB311を示す。 図7は、PT7プロモーターによって駆動されるEHEC 86-24eae株（全コーディン グ領域）をコードするプラスミドpEB310を示す。 図8は、ヒスチジンタグ付き発現プラスミド（QIAGEN社）を示す。 図9は、リプレッサープラスミド（QIAGEN社）（多コピー）を示す。 図10は、RVHindHisをコードするプラスミドpEB312を示す。このプラスミドは 、935個の推定アミノ酸のうちの604個にわたるヒスチジンタグ付きインチミンを コードする。 図11は、his−タグ付きベクター中にクローン化されたeaeの異なる断片、およ びこれらのプラスミドの対応名を示す。 図12は、his−タグ付きベクター中にクローン化されたeaeの異なるＣ末端断片 およびこれらのプラスミドの対応名を示す。 図13は、対立遺伝子交換によるeae変異体、86−24eaeΔ10の構築を示す。 図14は、eae構造遺伝子の大部分をコードするプラスミドpEB290を示す。eaeの 3’の250bpはpEB290によってはコードされない。 図15は、eaeの1275bp内部Bcl I断片が欠失している欠失変異体の構築に用いる pEB300を示す。 図16は、クローン化遺伝子を細菌染色体に導入するための自殺ベクター(suici de vector)pAM450を示す。 図17は、相同的組換えのための、pAM450ベクターにおいて欠失しているeae遺 伝子をコードするプラスミドpEB305を示す。 図18は、N−His−IcsA−インチミン−Cを発現するプラスミドを構築するため のクローニングスキームを示す。 図19は、his−インチミンを発現するように植物を遺伝子工学的に作出するた めに設計されたプラスミドを構築するためのクローニングスキームを示す。植物 発現ベクターpKLYX71S2およびhis−インチミンをコードするプラスミドpINTも示 される。 図20は、his−インチミンを発現するように細菌宿主を遺伝子工学的に作出す るために設計されたプラスミドを構築するためのクローニングスキームを示す。 図21は、植物発現カセットを含むプラスミドpGHNC5を示す。MARはタバコ核ス カフォールド付着領域である。3’−rbcs−eae−His−35S2を含むClaI−EcoRI断 片をpINTから切り出し、pGHNC5に連結して図22に示されるpMAREAEを作製する。 図22はプラスミドpMAREAEを示す。MAR−35s2−His−eae−3’rbcs−MARを含む SacI−KpnI断片をpMAREAEから切り出し、pBIN19に連結して図23に示されるpBIN −MEを作製する。このプラスミドpBIN19はNPTII遺伝子（カナマイシン耐性を付 与する、アグレバクテリウム・ツメファシエンス（Agrebacterium tumefaciens ）に由来するノパリンシンターゼ）をコードする。NPTIIにはノパリンシンター ゼプロモーター(pNOS)およびノパリンシンターゼターミネーター（3’NOS）が隣 接する。 図23は、MAR-35S2−His−eae−3’rbcs−MARを含むプラスミドpBIN−MEを示す 。このプラスミドは、3’NOS−NPTII−pNOSカセットによって付与されたカナマ イシン耐性を有する。 発明の詳細な説明 本発明は、免疫応答を刺激する方法であって、インチミン、インチミン様タン パク質、またはその一部をコードするベクターで植物を形質転換して、該植物が インチミン、インチミン様タンパク質、またはその一部を発現するようになし、 および該植物またはその一部を患者に投与することを含んでなる方法に関する。 さらに、本発明は、インチミン、インチミン様タンパク質、またはその一部が、 該インチミン、インチミン様タンパク質、またはその一部に組換え的に融合され た少なくとも１つの抗原、少なくとも１つの薬物またはそれらの組合せ物をさら に含む上記方法に関する。 さらに、本発明は、免疫応答を刺激する方法であって、インチミン、インチミ ン様タンパク質、またはその一部をコードするベクターで植物を形質転換して、 該植物がインチミン、インチミン様タンパク質、またはその一部を発現するよう になし、該植物またはその一部からインチミン、インチミンの一部、またはイン チミン様タンパク質を抽出し、抽出したインチミン、インチミンの一部、または インチミン様タンパク質を患者に投与することを含んでなる方法に関する。また 、本発明は、インチミン、インチミン様タンパク質、またはその一部が、該イン チミン、インチミン様タンパク質、またはその一部に組換え的に融合された少な くとも１つの抗原、少なくとも１つの薬物またはそれらの組合せ物をさらに含む この方法にも関する。 上述の方法は、投与に先立ってインチミン、インチミンの一部、またはインチ ミン様タンパク質を富化する工程、または投与に先立ってインチミン、インチミ ンの一部、もしくはインチミン様タンパク質を精製する工程を含んでいてもよい 。好ましくは、上記方法において、インチミンはEHECのインチミンである。また 、インチミン、インチミン様タンパク質、またはその一部がヒスチジンタグをさ らに含むことも好ましい。 上記方法において、植物は単子葉植物または双子葉植物であり得る。このよう な植物の例は以下に詳細に記載されるが、より好ましくは、アルファルファ、ニ ンジン、カノーラ、タバコ、バナナ、およびジャガイモ植物を含む。 また、本発明は、植物における異種ＤＮＡの発現をコードするＤＮＡ構築物で あって、該異種ＤＮＡがインチミン、インチミン様タンパク質、またはその一部 をコードするＤＮＡ構築物に関する。この異種ＤＮＡは、インチミン、インチミ ン様タンパク質、またはその一部に組換え的に融合された少なくとも１つの抗原 、少なくとも１つの薬物、またはそれらの組合せ物をさらにコードしていてもよ い。 好ましくは、このＤＮＡ構築物は植物形質転換ベクターである。この植物形質 転換ベクターは、好ましくは、アグロバクテリウム（Agrobacterium）ベクター である。また、この植物の形質転換が微粒子によって行われることも好ましい。 さらに、この植物形質転換ベクターがウイルスベクターであることも好ましい。 上述の本発明によるＤＮＡ構築物において、好ましくは、このＤＮＡによって コードされるインチミン、インチミン様タンパク質、またはその一部がヒスチジ ンタグをさらに含む。また、異種ＤＮＡのコドンが植物細胞内での発現にとって 有利なコドンと置き換えられていることも好ましい。 さらにまた、本発明は、異種ＤＮＡをコードし、かつ発現する異種ＤＮＡ構築 物を含有する植物細胞であって、該異種ＤＮＡがインチミン、インチミン様タン パク質、またはその一部をコードする植物細胞にも向けられている。このような 植物細胞において、異種ＤＮＡは、インチミン、インチミン様タンパク質、また はその一部に組換え的に融合された少なくとも１つの抗原、少なくとも１つの薬 物、またはそれらの組合せ物をさらにコードしていてもよい。好ましくは、これ らの植物細胞において、このＤＮＡによってコードされるインチミン、インチミ ン様タンパク質、またはその一部がヒスチジンタグをさらに含む。 さらにまた、本発明は、再生能のある植物細胞を用意し、該植物細胞を上述の ＤＮＡ構築物で形質転換することを含んでなるトランスジェニック植物細胞の作 出方法に関する。好ましくは、この方法の形質転換工程は、植物細胞を、ＤＮＡ 構築物を移入するアグロバクテリウムベクターをこの植物細胞に感染させること により行う。また、この形質転換工程を、ＤＮＡ構築物を坦持する微粒子を植物 細胞に射入することにより行うことも好ましい。さらに、この形質転換工程をウ イルスベクターを用いる形質転換により行うことも好ましい。 上記方法にとって好ましくは、植物細胞は再生可能な植物組織中にある。また 、上記方法は、形質転換した植物細胞からシュート、根、または植物体を再生さ せる工程を含んでいてもよい。この方法において、植物は好ましくは単子葉植物 または双子葉植物である。また、この方法にとっては、ＤＮＡによってコードさ れるインチミン、インチミン様タンパク質、またはその一部がヒスチジンタグを さらに含むことも好ましい。 本発明の目的は宿主生物においてインチミンを発現させることであり、この宿 主は、インチミンに対する免疫応答を刺激するため、直接もしくは加工した後、 動物またはヒトに投与または給餌される。このような免疫応答は、EHECおよびEH ECによって発現される特定のインチミンとある程度の相同性を有するタンパク質 を介して上皮細胞を結合する能力を有する他の病原体によって引き起こされる病 気、疾患および関連後遺症から動物またはヒトを防御する。 この目的は、インチミンに対する免疫応答を刺激し、それにより上皮細胞に付 着するEHECの能力を遮断することにより達成される。したがって、免疫感作とい う用語が本明細書において用いられる。防御の程度は、インチミンとの相同性の 程度および患者固有の特質に応じて、特に異なる種を治療する場合に変化する。 防御の正確な程度は、あらゆる特定の病原体に対して本発明を実施する上で、定 量化に重要なものではない。加えて、本発明は、宿主生物における１以上の抗原 との融合タンパク質としてのインチミンの発現並びにインチミンおよび１以上の 抗原に対する防御免疫応答を促進するための宿主生物の投与を記載する。 患者が感染を完全に回避することを可能にする免疫応答を刺激することに加え て、本明細書中で用いられる免疫感作とは、以下の指標：死亡率、HUS、または 恒久的な腎臓の損傷の減少；毒素レベルの低下；流体喪失(fluid loss)の減少； または当業者が正規に用いる病気の他の指標のいずれかによる測定で、胃腸管で コロニーを形成する病原体の能力を低下させ、かつ感染の重篤性を減少させるこ とも意味する。したがって、免疫防御量は、上記指標による測定で、胃腸管でコ ロニーを形成する病原体の能力を低下させ、感染の重篤性を減少させるのに十分 な量である。 本発明の好ましい宿主は植物細胞である。 植物細胞は、細菌起源のもののような異種遺伝子を発現するようにうまく遺伝 子工学的に作出されている。全てのタイプの作物が細菌起源の遺伝子で遺伝子工 学的に作出されている。これらの例の幾つかは、通常用いられる抗生物質耐性遺 伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（NPTII）およびハイグ ロマイシンホスホトランスフェラーゼ（HPII）の評点可能なマーカー遺伝子であ る。これらの遺伝子は細菌である大腸菌から単離された（Fraley，R．T.ら，Pro c．Natl．Acad．Sci．USA 80:4803(1983)；Vandenbergheら，Plant Mol．Bio1． 5:299(1985)）。植物の形質転換研究において定型的に用いられる別の一般的な 評点可能なマーカー遺伝子も大腸菌から得られる：ベータグルクロニダーゼ（GU S）（Jefferson Plant Mol．Biol．Rep．5:387-405(1988)）。これらの遺伝子は 全て有用であり、トランスジェニック植物、すなわち、異種ＤＮＡを含む植物に よりそれら本来の形態で高度に発現されている。したがって、これらはそ れらのコーディング領域における修飾を必要としない。 しかしながら、細菌からの他の遺伝子は、遺伝子工学的な作出により植物に組 み込まれた場合、不十分にしか発現していない。その一例は大腸菌からの水銀イ オンレダクターゼ遺伝子である（Wildeら，修飾された細菌のmerA遺伝子を発現 するトランスジェニック・アラビドプシス・タリアナ植物における水銀イオンの 還元および耐性（Mercuric ion reduction and resistance in transgenic Arab idopsis thaliana plants expressing a modified bacterial merA gene）Proc ．Natl．Acad．Sci．USA印刷中）。これは、そのコーディング配列を修飾しなけ れば発現することができない。おそらく、最も公知の例は、バチルス・ツリンギ エシス（Bacilus thuringiesis）からの殺虫性cry遺伝子である。これらは全て 、植物における発現ために“再構築”、すなわちコドン最適化されるまでは、発 現が少ないか、全く発現しない（Perlakら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:33 24-3328(1991)；Adangら，Plant Mol．Biol．21:1131-1145(1993)）。これらの 研究において、研究者らは、アミノ酸配列を変化させることなく、それらの植物 種にとって優先的なコドンをコードするオリゴヌクレオチドを合成して連結する ことにより遺伝子を再構築した。新しい遺伝子のコドンの用法を植物に好ましい コドンと整合させることにより、導入された遺伝子が高度に発現することが可能 となる（例えば、Stewartら，Insect control and dosage effects in transgen ic canola，Brassica napus L．(Brassicaceae)，containing a synthetic Baci lus thuringiensis Cryla(c)gene．Plant Physiology，112:115-120(1996)）。 したがって、植物細胞による細菌遺伝子の発現は達成されている。 外来遺伝子を用いて遺伝子工学的に作出された植物は、経ロワクチン用の成功 した送達剤である。最近の総説（MasonおよびArntzen，Tibtech 13:388-392(199 5)）において説明されるように、当該技術分野ではこのような遺伝子工学的に作 出された植物の使用が認められている。多数の研究には、ウイルス性および細菌 性病原体の抗原をコードする遺伝子が植物において発現する場合、該抗原がそれ らの免疫原性を保持するという最近の実証が含まれている（MasonおよびArntzen ，Tibtech 13:388-392(1995)）。Masonら（Masonら，Proc．Natl．Acad．Sci．U SA 89:11745-11749(1992)）はワクチン用のビヒクル送達系として植物を 遺伝子工学的に作出するという概念を導入し、それ以来、これらの系がＢ型肝炎 （Thanavalaら，Proc．Natl．Acad．Sci．92:3358-3361(1995)）、大腸菌エンテ ロトキシンBサブユニット、およびコレラ毒素Bサブユニット（Haqら，Science 2 68:714-716(1995)）に有効であることが示されている。この方策の有効性の基礎 の１つは、それらの抗原が粘膜の免疫を刺激するという事実にある。 本発明の実施においては、インチミン遺伝子の断片、eae（これは、例えば、p EB313のXhoI−HindIII断片のようなhisタグを有していてもよい）を適切なベク ターにおいて植物プロモーターに連結する。このベクターを適切な方法で、例え ば、タバコ植物に導入することにより、該タバコ植物によるhis−インチミンの ようなインチミンの発現が生じる。一旦タバコ植物が増殖したら、それらをホモ ジナイズして“タバコスープ”（タンパク質抽出物）を作製する。次に、標準的 な方法論を用いて、このスープをELISAの吸着剤として用いてインチミンの存在 を検出する。あるいは、この抽出物をウェスタンブロット分析のためにSDS-PAGE ゲルにかける。このようなアッセイのために、インチミンに対するポリクローナ ル抗血清、または、ヒスチジンタグの存在を検出するため、hisタグに対する抗 体（QIAGENから入手可能）を用いることができる。植物が発現するインチミンの 量は、ELISAまたはウェスタンブロットを用いて定量することができる。 同様のアプローチを用いて、熟練技術者はインチミン、または、例えば、１以 上の他の抗原との融合タンパク質としてのインチミンを、他の植物も本発明の範 囲内にあるものの、タバコ植物または他の植物、例えば、ニンジン、バナナ、カ ノーラ、およびアルファルファにおいて発現させることができる。このような形 質転換植物をウシのような動物に給餌すると、この形質転換植物がインチミンタ ンパク質または融合タンパク質を発現し、それにより免疫応答を刺激するために これらの抗原を該動物に送達する。このような方法は、動物を防御し、さらには EHECのようなヒト病原体によるこれらの動物の将来的なコロニー化を防御してヒ トへの感染の危険性を低減するための安価かつ効率的な方法であって、望ましい ものである。 形質転換手順の１つにおいては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ag robacterium tumefaciens）バイナリーベクターにおいてeae遺伝子を構成植物 プロモーターの制御下に配置し、該植物をアグロバクテリウム介在形質転換によ って遺伝子工学的に作出する。 宿主生物において発現するインチミンは結合機能を保持するサイズのものであ り、ヒスチジンタグが付与されているインチミンを含んでいてもよい。加えて、 インチミンは、宿主において１以上の他の抗原との融合タンパク質として発現し てもよい。この宿主を動物を含む患者に投与することにより、前記インチミンお よび１以上の前記抗原に対する免疫応答が刺激される。 当業者は、用いられるhis−タグ付きインチミンのサイズがそのインチミンを 投与する特定の目的に従って変化し得ることも理解するであろう。例えば、his −タグ付きインチミンを１以上の抗原と結合させようとする場合、決して大きい 断片の使用を除外するものではないが、結合した融合産物の安定性を高めるため により小さい断片を選択することができる。他の抗原のサイズまたは立体配座(c onformation)およびその重要なエピトープの位置は、his−タグ付きインチミン の特定の長さがそのエピトープを粘膜に近づけることを示すことがある。望まし いサイズも、当業者に公知の材料および方法に照らして、利用可能な制限部位の 至便性に応じて変化する。したがって、本明細書中で用いられるhis−インチミ ンおよびhis−タグ付きインチミンという用語は、ヒスチジンタグを有するイン チミン（完全長インチミン）の935個の推定Ｃ末端アミノ酸のうちの少なくとも9 00個を含むポリペプチドおよび結合機能を保持するこのhis−タグ付きタンパク 質のより小さな部分を意味する。 インチミンの一部および少なくとも１つの追加タンパク質抗原または薬物を含 む融合タンパク質を生成するため、組換え技術によって結合体(conjugate)を生 成させることができる。加えて、当業者に公知の方法により、インチミンを薬物 、タンパク質、ペプチド、炭水化物および他の抗原に化学的または物理的に結合 させることができる。化学的結合方法は当業者に公知であり、これには、部分的 に、利用可能な官能基（例えば、アミノ、カルボキシル、チオおよびアルデヒド 基）によるカップリングが含まれる。S．S．Wong，Chemistry of Protein Conju gate and Crosslinking CRC Press(1991)；およびBrenkeleyらBrief Survey of Methods for Preparing Protein Conjugates With Dyes，Haptens and Cross-l inking Agents，Bioconjugate Chemistry 3#1（1992年1月号）を参照。 結合機能の保持は、インチミン、インチミン様タンパク質、および／またはそ の一部が上皮細胞もしくはHEp−2およびHCT−8のような細胞株に結合する能力を 保持することを意味する。このような結合は、微小コロニーアッセイ（Frankel ら，Infect．Immun．62(5):1835-1842(1994)）、FAS（蛍光アクチン染色）、ま たはその両者（McKeeおよびO’Brien，Infect．Immun．63(5):2070-2074(1995) 、その開示は引用により本明細書中に組み込まれる）により細菌性微小コロニー として可視化することができる。加えて、結合は、細菌の毒性または病原性の機 能としてのin vivo測定を含む当該技術分野において標準的なあらゆる方法、ま たは死後の組織学的検査により測定することができる。結合機能を決定するため の上記方法の各々の例は、実施例IVに説明される接着アッセイを含めて下記実施 例において詳述される。 他に指定されていない限り、本明細書中に示される使用および方法はヒトおよ び動物に一般的に適用することができる。患者という用語は、本明細書中では、 ヒトおよび動物の両者を意味するものとして用いられ、動物は家畜に限定される ものではなく野生動物および実験動物をも含み得る。 His−タグ付きインチミンの単離および精製 分子のＮ末端側1／3が欠失しているHis−インチミン融合体（RVHindHis）が非 接着性EHEC eae変異体の接着性を補完することが可能であったこと、すなわち、 インチミンの発現を妨げる遺伝的変更の後にその結合能力を喪失したEHECの株に 結合能力を回復させたことが示されている。この回復した結合において示される 接着のパターンは野生型86−24株において観察されるものと区別することができ なかった（McKee，M．L.およびO’Brien，A．D．Infect．Immun．印刷中（1996 ））。上述の微小コロニーアッセイで測定した場合、野生型の活性は強く染色さ れた局在化領域を有する点状パターンとして同定された。 しかしながら、部分的にはインチミンが常にEHECの外膜と会合しているため、 インチミンタンパク質の精製は困難であった。過剰発現した組換えインチミンの 大部分は、宿主細菌の超音波破壊および抽出バッファーへの穏やかな界面活性剤 の添加の後であっても細菌の膜画分と会合したままであった。97kDa範囲の他の 多くの未変性大腸菌タンパク質と結合したインチミンタンパク質の不溶性が未変 性タンパク質の精製を困難なものとした。 インチミン−マルトース結合タンパク質融合体（MBP）を作製しようとする試 みもまた、推定されるタンパク質産物が欠失および再構成を有していたため、不 成功であった。他の研究者による試みはインチミンＣ末端の280個のアミノ酸へ のMBP融合体の構築を示していたが、この融合体はEHEC様の結合機能をもたらさ なかった。このMBP−インチミン融合タンパク質によって付与される接着性の拡 散パターンはHEp−2細胞へのEHECの結合のパターンとは明らかに異なるものであ った（Frankel，G.らInfect．Immun．62:1835(1994)）。 280個のアミノ酸よりも大きい機能的MBP−インチミン融合体を得ることができ ないことについての可能性のある説明の１つは、最後の280個のアミノ酸よりも 大きいEaeの断片の過剰発現が不安定であり、したがって再構成する傾向がある 、すなわち、そのクローンを単離することは、それが発現した際に細胞にとって 致命的であるかまたは有害であるために、不可能である可能性がある。あるいは 、280個のアミノ酸より大きいMBP−インチミン融合体の断片の過剰発現が細菌の 膜を塞ぎ(plug up)、それがその細胞にとって致命的である可能性がある。 MBPを用いてインチミンを精製しようとする試みが失敗した後、そのタンパク 質にヒスチジンタグを結合することを包含するQIAGEN社のQIA expressionist Ki t）を用いて融合体を作製した。このヒスチジンタグはニッケルアフィニティー マトリックスにしっかりと結合し、これがさらなる研究のために多量の物質を精 製することを容易にした。加えて、この発現系により、His融合タンパク質の発 現の厳重な制御を維持して、このタンパク質の過剰発現の結果としての大腸菌宿 主株に対するこの組換えタンパク質の可能性のあるあらゆる致命的効果を防止す ることを可能となる。実施例Iではこのような融合タンパク質の作製について説 明する。 実施例Ｉ A．935個の推定アミノ酸（図2）のうちの900個を含むHis−タグ付きインチミン をコードするプラスミド、pEB313（図１）の構築。 eae遺伝子を、Griffin，P．M.ら，Ann．Intern．Med.109:705-712(1988)また はPhil Tarr（小児科病院および医療センター（Children’s Hospital and Medi cal Center）、4800サンド・ポイント・ウェイNE、シアトル、WA 98105、206− 526−2521）から容易に入手可能なEHEC 86−24株（血清型O157:H7）からクロー ン化する。そのＤＮＡを標準染色体プレップ技術(Current Protocols in Molecu lar Biology，Ausubel，F．M.ら（編）第１:2.4.1巻におけるWilson，K．“Prep aration of Genomic DNA from Bacteria”)に従って抽出する。 この遺伝子を、2つの既知のEHEC eae配列の複合体から設計されたプライマー を用いる、当該技術分野における標準技術であるポリメラーゼ連鎖反応（PCR） を用いてクローン化する。2種類のプライマーを構築する：Beebakhee，G.らFEMS Microbiology．91:63(1992)によって配列決定されたCL8株に由来する配列の塩 基20−41にわたる、Sn20−CGTTGTTAAGTCAATGGAAAC、5 ’プライマー（図3）；お よびYu，J.およびKaper，J．B．Mol．Microbiol．6:411(1992)によって配列決定 された933株に由来する配列の塩基3061−3082にわたる、MM2−TCTAGAGAGAAAACGT GAATGTTGTCTCT、3 ’プライマー（図4）。MM2は、さらに、3’末端にXbaI部位を 含むように設計した。 PCR反応を、AmpliTaq Kitを用いて、製造者であるパーキン・エルマー（Perki n Elmer）の指示に従って行う。このPCR増幅はeaeのオープンリーディングフレ ーム（0RF）全体をコードする3144bp断片（図5、eaeと示された領域）を生成し 、かつ186bp上流を含む。このPCR産物を平滑末端が生じるように処理し、ベクタ ーpBRKS（Schmittら，J．Bacteriol．176:368-377(1994)）のEcoRV部位に連結す る。 この遺伝子を、適切な条件下において、P1acpEB311（図6）およびPT7pEB310（ 図7）のいずれかからの転写が可能になるように両方向にクローン化する。この プラスミドで宿主株XL1BlueF’Tn5lacIQ(QIAGEN社、9600デソト・アベニュー（D eSoto Ave.）、チャッツワース、CA．91311、1−800−362−7737から入手可能） を形質転換する。この組換え体をlacリプレッサーの構造的制御の下に維持する 。これは、従来のeaeをクローン化しようとする試みの失敗がeaeの過剰発現 が宿主大腸菌株にとって致命的であり得ることを示唆していたためである。lac リプレッサーによってもたらされる制御と共に、低コピー数のpBRKSベクターに よりこれらの問題が排除される。 pEB310をEcoRIで消化し、クレノウ断片で充填(fill in)し、HindIIIで消化し 、かつ生じる2895bpの断片を単離することによりhis−タグ付きインチミンプラ スミドを構築する。このDNA断片はジーンクリーン・キット（Geneclean kit）Bi o101（1070ジョシュア・ウェイ（Joshua Way）、ビスタ、CA．92083、1−800−4 24−61010）を用いて単離する。his−タグ発現プラスミドpQE32（図8）（QIAGEN 社から入手可能）をSmaIおよびHindIIIで消化する。その後、2895bp断片をpQE32 に連結してpEB313（図1）を作製する。 このプラスミドpEB313はRIHisEaeと呼ばれる101kDaのhis−タグ付きEae断片を コードし、これは935個の推定アミノ酸のうちの900個をコードする。このhis− インチミン融合体は、潜在的なシグナル配列を除去するために、N末端の35個の アミノ酸が欠失するように構築される。シグナル配列は膜を標的としてこの融合 タンパク質を移動させ、またはコードされたインチミンからのHisタグの開裂を 導く可能性がある。 pEB313を構築した後、これを用いて、lacリプレッサー（lacIQ）、例えばM15p REP4（QIAGEN社によって供給される、多コピープラスミドpREP4に含まれるリプ レッサー）（図9）またはXL1BlueF’Tn5lacIQ（同様にQIAGEN社から入手可能な 、単一コピーF’プラスミドに含まれるリプレッサー）を含む大腸菌のlab株を形 質転換する。形質転換された大腸菌は、pEB313によってコードされるhis−イン チミン融合タンパク質を発現する。このタンパク質の精製は実施例IIIに説明さ れる通りに行う。 B．His−タグ付き偽結核菌インベイシン（invasin）をコードするプラスミド、p His−InvIの構築、およびＮ末端の40個のアミノ酸が欠失しているHis−タグ付き 偽結核菌インベイシンをコードするプラスミド、pHis−Inv２の構築。 プラスミドpRI203は、inv遺伝子およびそれを取り巻くヌクレオチド配列を含 む、偽結核菌染色体ＤＮＡの4.6kb断片を含み、Ralph Isberg博士（分子生物学 および微生物学部（Dept．Of Molecular Biology and Microbiology）、タフツ 大学医学校（Tufts University School of Medicine）、ボストン、マース．021 11；参考文献R．R．Isberg，D．L．Voorhis，およびS．Falkow．Cell．50:769(1 987)）から容易に入手することができる。pRI203ＤＮＡを、供給された細菌株か らQIAGENＤＮＡ抽出キット（QIAGEN、チャッツワース、CA）を用いて製造者に指 示に従って抽出する。 pHis−Inv1を構築するため、2種類のプライマー、Inv1（＝5’GTACGGATCCATGA TGGTTTTCCAGCCAATCAGTGAG 3’およびInv3（＝5’GTACGGTACCTTATATTGACAGCGCACA GAGCGGG 3’）を（上記パートAに説明される）PCR反応において用いて所望のinv 配列をpRI203から増幅する。生じた2960bpのinv断片をBamHIおよびKpnIで消化し 、アガロースゲルに流し、カミソリで切り出し、かつジーンクリーン（バイオ10 1、LaJolla、CA）を用いて精製する。精製したinv断片を、BamHIおよびKpnlで消 化した、増幅したinv配列に対応する適切なリーディングフレームを含むHis−タ グ付きQIAGENベクター（pQE30、31または32、QIAGEN、チャッツワース、CA）に 連結する。その後、連結したプラスミドでDH5αF’Tn5lacIQを形質転換し、形質 転換体を適切なサイズの挿入物の存在についてチェックする。 pHis−Inv1より発現したタンパク質からシグナル配列（したがって、それに隣 接するHisタグ）を開裂させる場合には、プラスミドpHis−Inv2を構築する。pHi s−Inv2を構築するため、2種類のプライマー、Inv2（＝5’GTACGGATCCATATGTGGA ATGTTCATGGCTGGGG 3’）およびInv3（＝5’GTACGGTACCTTATATTGACAGCGCACAGAGCG GG 3’）を（上記パートAに説明される）PCR反応において用いてpRI203から所望 のinv配列を増幅させる。生じた2840bpのinv断片を上述の通りに精製し、His− タグQIAGENベクターに上述の通りに連結して、同様の細菌宿主株を形質転換する 。 あるいは、pRI203を制限酵素消化し、次いでインベイシン断片の5’末端に対 する適切なリーディングフレームを含むQIAGENHis−タグベクター（pQE30、31ま たは32）に連結することにより同様のプラスミドを構築する。前述の例は、偽結 核菌からのヒスチジンータグ付きインベイシンをコードするプラスミドの構築を 説明しようとするものである。当業者は、代替ベクターおよび／または他のイン チミン様タンパク質を用いて設計された類似構築体を当該技術分野における標準 法に従って構築することができることを理解する。また、当業者は、上記his− タグ付きインベイシンおよび他のhis−タグ付きインチミン様タンパク質が本明 細書の他の箇所に開示される方法に適用可能であることも理解する。 C．935個の推定アミノ酸のうちの604個を含むHis−タグ付きインチミンをコード するプラスミド（pEB312）（図10）の構築 （パートAに説明される通りにして得た）プラスミドpEB310をEcoRVおよびHind IIIで消化し、1971bp断片を単離して、その断片をSmaIおよびHindIIIで消化した pQE32に連結する。プロトコルで用いられる制限酵素、リガーゼ、クレノウ断片 は、New England BioLabs(32トザー・ロード（TozerRd.）、ベヴァリー、MA．01 915−55991、1−800−NEB−LABS)またはGibco BRL（P．O．Box 681グランド・ア イランド、N．Y．14072−0068、1−800−828−8686）からのものである。得られ るプラスミドをpEB312と呼ぶ。 このプラスミドpEB312はRVHindHisと呼ばれるhis−タグ付きEae断片をコード し、これは約65kDaであって935個の推定アミノ酸のうちの604個をコードする。 この構築体は野生型インチミンタンパク質のＣ末端の2／3を含む。 pEB310が発現するインチミンと同様に、この融合タンパク質は、宿主大腸菌の 超音波破壊の後に主として不溶性ペレット中に留まる。したがって、このタンパ ク質の不溶性ペレットからの抽出を可能にする尿素およびグアニジンHClを精製 プロトコルに含める。 D．eaeの異なる断片を発現する追加プラスミドの構築。 これらのプラスミドの各々を接着アッセイを用いて試験し、タンパク質断片が 完全な結合機能を有することを確実なものとする。（下記実施例IVを参照）。加 えて、インチミンのサイズの選択は、そのタンパク質が単独で発現するのかどう か、および既知のアミノ酸配列を有するインチミン様タンパク質との交差免疫性 を所望するかどうかに応じて変化する。EHECおよびEPECから発現するインチミン に加えて、インチミン様タンパク質の例にはシトロバクター・ロデンチウム（Ci trobacter rodentium）、ハフィナ・アルベイイ（Hafina alveii）のインチミン 様タンパク質並びにエンテロコリチカ菌および偽結核菌のインベイシンが含まれ るが、これらに限定されるものではない。 例えば、偽結核菌との交差免疫性に対する要望が高まった場合には、EHECイン チミンがインベイシンとして知られる偽結核菌タンパク質と31％の同一アミノ酸 および51％の類似アミノ酸を共有する（Yu，J.およびKaper，J．B．Mol．Microb iol．6:411(1992)）ため、900aaを上回るインチミンが選択される。より大きな 程度の相同性がそれぞれのタンパク質のアミノ末端の2／3に存在する。 インベイシンは、培養上皮細胞への細菌の侵入（Isberg，R．R.らCell．60:76 9(1987)）およびin vivoでの腸管上皮への効率的な侵入（Pepe．J．C.およびV． L．Miller．Proc．Natl Acad．Sci．USA．90:6473(1993)）を可能にする、103kD aの外膜タンパク質である。インテグリンとして同定されている腸管上皮上の細 胞接着受容体は、細菌の内部移行に先立ってインベイシンを結合する（Isberg， R．R.およびJ．M．Leong．Cell．50:861(1990)）。インベイシンの中心部分は外 膜へのタンパク質の局在化に寄与し、これに対してＣ末端は受容体結合に必要で ある（Isberg，R．R．Mol．Microbiol．3:1449(1989)）。 同様に、腸管病原性大腸菌（EPEC）、シトロバクター・ロデンチウム、または ハフニア・アルベイ(Hafnia alvei)との交差免疫性に対する要望が高まった場合 にはより大きな900aaインチミンが選択される。EPECインチミンはタンパク質の 全長にわたって83％の同一性をEHECと共有する；これらのタンパク質のＮ末端側 の75％が94％の同一性を共有し、これに対してタンパク質のＣ末端側の25％が49 ％の同一性を共有する（Yu，J.およびKaper，J．B．Mol．Microbiol．6:411(199 2)）。シトロバクター・フロインディ(Citrobacter freundi)のインチミンは、E HEC eaeに対して、最初の2106bpに関しては84％のヌクレオチド同一性を、3’の 702bpに対しては57％の同一性を共有する（Schauer，D．B.およびFalkow，S．In fect．Immun．61:2486(1993)）。 eaeの異なる断片を発現するプラスミドは、以下の技術のうちの１つを用いて 構築することができる：（1）eae内の都合のよい制限部位、例えば、SalIおよび HindIIIで消化したpEB313の使用、1298bp断片の単離、およびSmaIおよびHindIII で消化したpQE30（QIAGEN社）への連結。得られるプラスミドはEaeのＣ末端の最 後の432アミノ酸を発現する；（2）ヌクレアーゼBAL−31、エクソヌクレアーゼI II、またはリョクトウ(Mung bean)ヌクレアーゼ（全て、ニュー・イングランド ・バイオラブス、32トザー・ロード、ベヴァリー、MA 01915から入手可能）を用 いる所望の断片の5’または3’領域の欠失；（3）同様に上記技術を用いた、非 隣接eae断片を用いたプラスミドの構築；および（4）以下により詳細に説明され るような、所望の特定の配列をコードするプラスミドの、それらの配列の5’お よび3’末端に特異的なPCRプライマーを用いた構築。 第3の技術に関しては、His−タグ付き中間部1／3インチミン欠失変異体プラス ミドを構築する（pMW114）。プラスミドpMW106（以下に説明される）でdam DM1F ’Tn5lacIQ株を形質転換する。QIAGENキット（QIAGEN社）を用いてＤＮＡを作製 し、BclIで消化する。このＤＮＡをアガロースゲルに流す。5178bpのバンドを切 り出し、ジーンクリーン（バイオ101）を用いて精製し、連結した後、それでDH5 αF’Tn5lacIQ（または、XL1BlueもしくはM15pREP4のような他の適切な株）を形 質転換する。形質転換体を、ＤＮＡの制限消化によりチェックする。この説明は 、非隣接eae配列をコードする他のプラスミドの構築を排除するものではない。 第4の技術に関しては、eaeの特定の断片の増幅にPCRを用いることができる； これらの断片を制限酵素消化により単離し、アガロースゲル電気泳動を行い、適 切なHis−タグ発現ベクター（すなわち、pQE30、31または32；QIAGEN社）に連結 する。 例えば、eaeの様々な領域をコードするクローンを構築する（図11および12を 参照）。これらのクローンの接着機能を保持する能力を、（1）eae変異体を形質 転換、次いでHEp−2細胞を用いて接着アッセイ（実施例III、第C節を参照）する か、または（2）細菌への外来性タンパク質の添加（実施例III、第D節を参照） のいずれかによりアッセイを行なう。選択された断片が完全な、または完全に近 い野生型の結合活性を保持することが重要である。 最も高い結合活性を有するクローンはこのタンパク質のＣ末端側1／3（第3の1 ／3）、おそらくは多くとも150個のＣ末端アミノ酸を含むという仮説を立てる。 この仮説は、例えば、Frankelら，Infection & Immunity，62:1835(1994)、Fr ankelら，Infection & Immunity，63:4323(1995)、およびFrankelら，J．Biol． Chem.，271:20359(1996)によって支持される。タンパク質はアミノ酸の直線的な 整列と考えることはできず、これらは、むしろ、三次元構造で存在する。タンパ ク質の１個のアミノ酸の変化またはその一部の欠失がこの構造を混乱させる可能 性があることを心に留めることが重要である。したがって、十分な細胞の結合活 性は、追加の非隣接配列の存在を、この第3の1／3推定結合ドメインと共に必要 とする可能性がある。 さらに、高い結合活性を有するクローンは、仮定のジスルフィド結合の形成お よびその結果生じるループの形成のための2つのＣ末端Cys（bp2780およびbp3002 でコードされるもの、Beebakhee G.，J．DeAzavedo，およびJ．Brunton，FEMS M icrobiology Letters 91:63(1992)を参照した番号付け）を含むという仮説を立 てる。加えて、高い結合活性を有するクローンは１つまたは両者のアスパラギン 酸（bp2819および2828でコードされるもの、Beebakheeを参照した番号付け）を 必要とする可能性があるという仮説を立てる。この仮説は、例えば、Leong，J． M.，Embo．J．14:422(1995)に記述されるようなインベイシンに対する類似性に よって支持される。 全てのクローンは同様の方法で構築する。所望のeae断片の5’および3’領域 を特定するPCRプライマーを設計する。pQE31へのクローン化を容易にするため、 5’プライマー（MW1、MW3、MW5、MW7、MW8、MW9、MW10）の各々は5’BamHI部位 を含み、3’プライマー（MW2、MW4、MW6、MW11、MW12）の各々は5’KpnI部位を 含む。各々のPCRプライマーは、指定されたeae配列のリーディングフレームがpQ E31への挿入に適するように設計する。以下のHis−タグ付き構築物を示されるPC Rプライマーを用いてクローン化する。 （1） pMW101−EaeのＮ末端側1／3をコードする；27kDaタンパク質（PCR プライマー：MW1（5’PCRプライマー）＝5’GTACGGATCCGAATTCATTTGCAAAT GGTG 3’；MW2（3’PCRプライマー）＝5’GTACGGTACCTGATCAATGAAGACGTTA TAG 3’）； （2） pMW102−Eaeの中間部1／3をコードする；42kDaタンパク質（PCRプ ライマーMW3（5’PCRプライマー）＝5’GTACGGATCCTGATCAGGATTTTTCTGGTG 3’；MW4（3’ＰＣＲプライマー）＝5’GTACGGTACCTGATCAAAAAATATAACCGC 3’）； （3） pMW103−EaeのＣ末端側1／3（282個のアミノ酸）をコードする；32k Daタンパク質（PCRプライマー：MW5（5’PCRプライマー）＝5’GTACGGATC CTGATCAAACCAAGGCCAGCATTAC 3’；MW6（3’PCRプライマー）＝5’GTACGGT ACCTTATTCTACACAAACCGCATAG 3’）； （4） pMW4−EaeのＮ末端側の2／3をコードする；69kDaタンパク質（PCRプ ライマー：MW1およびMW4）； （5） pMW105−EaeのＣ末端側の2／3をコードする；73kDaタンパク質（PC Rプライマー：MW3およびMW6）； （6） pMW106−Ｎ末端側に35個のアミノ酸の小さな欠失を有するEaeをコー ドする；100kDaタンパク質（PCRプライマー；MW1およびMW6）； （7） pMW108−EaeのＣ末端側の150個のアミノ酸をコードする（PCRプライ マー：MW7（5’PCRプライマー）＝5’GTACGGATCCACTGAAAGCAAGCGGTGGTGAT g 3’；MW6）； （8） pMW109−EaeのＣ末端側の140個のアミノ酸をコードする（PCRプライ マー：MW8（5’PCRプライマー）＝5’GTACGGATCCTTCATGGTATTCAGAAAATAC 3’；MW6）； （9） pMW110−EaeのＣ末端側の130個のアミノ酸をコードする（PCRプライ マー：MW9（5’PCRプライマー）＝5’GTACGGATCCGACTGTCGATGCATCAGGGAAA G3’；MW6）； （10）pMW111−EaeのＣ末端側の120個のアミノ酸をコードする（PCRプライ マー：MW10（5’PCRプライマー）＝5’GTACGGATCCGAATGGTAAAGGCAGTGTCG 3’；MW6）； （11）pMW112−bp＃2560-2923（番号付けはCL8株のeae配列を参照する、参 考文献Beebakhee G.，J．DeAzavedo，およびJ．Brunton，FEMS Microbiolo gy Letters 91:63）にわたるＣ末端を有する、Eaeの120個のアミノ酸をコ ードする。（PCRプライマー：MW7；MW11（3’PCRプライマー）＝5’GTACG GTACCTCCAGAACGCTGCTCACTAG 3’）； （12）pMW113−PCRプライマーMW12を用いてbp3002のCysがSerに変更されて いる、EaeのＣ末端側の282個のアミノ酸をコードする（番号付けはCL8株の eae配列を参照する、参考文献Beebakhee G.，J．DeAzavedo，およびJ．Bru nton,FEMS Microbiology Letters 91:63(1992)）（PCRプライマー：MW5； MW12（3’PCRプライマー）＝5’GTACGGTACCTTATTCTACAGAAACCGCATAG 3’）。 全てのクローンは、まず凍結乾燥したプライマーをdH2Oで10μＭに希釈するこ とにより構築する。（全eae遺伝子をコードする）XL1blue pEB310株からQIAGENp rep（QIAGEN社）を用いて鋳型ＤＮＡを作製し、これをコーディング領域内また はその近傍を切断しない制限酵素、例えばHindIII、で消化することにより直線 化し、分光光度計を用いて定量する。10μｌの10×Taqバッファー（パーキン・ エルマー／ロッシュ（Perkin Elmer/Roche）、ブランチブルク、N．J.）、10μ ｌの2mM dNTPミックス（ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）、 インディアナポリス、IN）、10μｌの10μＭ 5’PCRプライマー、10μｌの10μ Ｍ3’PCRプライマー、６μｌの25mM MgCl2（パーキン・エルマー／ロッシュ）、 52μｌのdH2O、および1μｌ（1−10ng）の直線状鋳型ＤＮＡを合わせることによ りPCR反応を行う。この混合物に鉱物油2滴を適用し、100℃で5分間加熱して鋳型 を変性させる。１μｌ（5U）のAmpliTaqポリメラーゼ（パーキン・エルマー／ロ ッシュ）を添加し、PCR反応を開始させる：95℃／1分、50℃／1分、72℃／3分を 30サイクル、次いで72℃／10分、および4℃で保持。PCR反応が完了した後、ＤＮ ＡをウィザードPCRクリーンアップ・キット（Wizard PCR clean-up kit）（プロ メガ（Promega）、マジソン、Wis）に適用し、50μｌのTEバッファーに再懸濁す る。PCR増幅したＤＮＡをBamHIおよびKpnIで消化し、アガロースゲルで電気泳動 して適切なサイズのバンドを切り出し、ジーンクリーン（バイオ101、LaJolla、 CA）で精製する。次に、消化したPCR断片をBamHIおよびKpnIで消化したpQE31に 連結し、それでDH5αF’Tn5lacIQ（または他の適切な株、例えば、M15pREP4もし くはXL1Blue）を形質転換し、形質転換体を適切なサイズの挿入物の存在につい てチェックする。 上に挙げられる技術のいずれに関しても、精製したタンパク質から後でヒスチ ジンタグを除去する必要がある場合には、6XHis配列とそのタンパク質のＮ末端 （Ｎ末端タグ）またはＣ末端（Ｃ末端タグ）との間にプロテアーゼ開裂部位を挿 入することができる。例えば、エンテロキナーゼは配列“DDDK”（Asp4−Lys） を認識し、リジンの後ろで開裂する。この配列をコードするPCRプライマーを設 計し、これを用いて所望の遺伝子断片の部位特異的突然変異誘発を行う。あるい は、カルボキシペプチダーゼAをＣ末端Hisタグの除去に用いることができる。こ の酵素は塩基性残基に出会うまで効率的に芳香族Ｃ末端残基を除去し（Hoculi、 E．Chemische Industrie．12:69(1989)）、その位置で除去が停止する。加えて 、PCRを用いて、コードされるタンパク質のN−もしくはＣ末端にプロテアーゼ部 位がコードされるようにプライマーを設計することが可能であり；またはPCRを 用いてこれらの部位を含むベクターを設計することができ、かつ上述の技術を用 いて前述のベクターにクローン化することができる。 インチミンの大規模な精製のため、pEB312または他の構築物から発現されるイ ンチミンの全ての断片を実施例IIに詳述されるプロトコルに類似するプロトコル を用いて精製する。当業者が、本発明の範囲および精神に留まりながら、さらな る制限部位を選択し、またはプロトコルを変更することができることは明らかで ある。 実施例II ヒスチジンタグ付きインチミンの大規模な富化 大規模な発現培養物の増殖 100μｇ／mlのアンピシリンおよび40μｇ／mlのカナマイシンを含むLB（ルリ アーバータイニ（Luria-Bertaini））ブロス20mlに白金耳一杯の（上記実施例I に説明されるように調製した）M15 pREP4 pEB313を接種する。激しく振盪しなが ら、37℃で一晩（15−18時間）増殖させる。この一晩培養物20mlを、100μｇ／m lのアンピシリンおよび40μｇ／mlのカナマイシンを含むLBブロスに接種する。 激しく振盪しながら、OD600＝0.7−0.9になるまで（約3時間）37℃で増殖させる 。IPTG（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド、シグマ・ケミカル社（ Sigma Chemical Co.）、P．O．Box 14508、セントルイス、MO．63178、1-800-32 5−3010）を最終濃度1mM（.476g）まで添加し、さらに3時間培養物の増殖を継続 する。上清を500ml瓶（予め秤量）に分け、4000×gで10分間遠心分離にかける。 上清を廃棄して細胞ペレットを秤量し、−７０℃で保存するか、または直ちに処 理する。 細胞を15分間解凍し、渦撹拌(vortex)して5ml／湿重量gでバッファーA［6M Gu HCl、0.1M NaH2PO4、0.01Ｍトリス−HCl、pH8.0］に再懸濁する。細胞を室温で1 時間撹拌する。溶解物を10,000×gで15分間遠心分離し、上清を集める。予めバ ッファーAで平衡化したNi−NTA樹脂（QIAGEN社からのNi-NTAスラリー）の50％ス ラリー5mlを添加する。室温で45分間撹拌し、スラリーを沈殿させ、上清を除去 し、5mlのバッファーAを添加し、スラリーを沈殿させ、上清を除去し、5mlのバ ッファーAを添加し、この樹脂をカラムに充填する。このカラムを10カラム容量 のバッファーA、次いでOD280≦0.01（少なくとも5カラム容量）までバッファーB ［8Ｍ尿素、0.1M NaH2PO4、0.01Ｍトリス−HCl、PH8.0］で洗浄する。カラムを 、OD280≦0.01まで、バッファ−C［8Ｍ尿素、0.1M NaH2PO4、0.01ＭトリスーHCl 、PH6.3］で洗浄する。バッファーCに加えて0.25mMのイミダゾールでタンパク質 を溶離し、30の1ml画分を集める。 各々の画分のOD280を記録する。精製したタンパク質のアリコートを透析管（ スペクトラ／ポール・セルロース・エステル・メンブラン（Spectra/Por Cellul ose Ester Membrane）MWカットオフ＝8000；スペクトラム・メディカル・インダ ストリーズ（Spectrum Medical Industries）、1100ランキン・ロード、ヒュー ストン、TX．77073−4716）にプールし、冷（4℃）バッファーCで平衡化する。 これらのアリコートの濃度を、標準市販タンパク質定量キット（バイオ−ラッド ・マイクロアッセイ（Bio-Rad Microassay）、バイオ−ラッド・ラブス（Bio-Ra d Labs）、2000アルフレッド・ノーベル・ドライブ、ハーキュルス、CA．94547 、1−800−4BIORAD）を用い、バッファーCで希釈したBSAを標準として用いて≦1 mg／mlに調整する。冷却下（4℃）において、バッファーCで開始して尿素のモル 濃度の減少が整数値で増加するタンパク質の段階透析を行う。各溶液中で１時間 透析し、1×PBSで終了させる。ウェル当たり約2μｌのタンパク質を流す（10％ ）SDS−PAGEによりタンパク質を分析してタンパク質のサイズおよび品質を確 認する。RIHisEaeの分子量は101kDaである。 あるいは、タンパク質を透析管に添加し、直に1×PBSで透析する。タンパク質 を標準市販タンパク質定量キット（ピアスBCAプロテイン・アッセイ・キット（P ierce BCA Protein Assay Kit）、ピアス(Pierce)、P．O．Box 117、ロックフォ ード、III．61105）を用いて定量し、等分して−20℃で保存する。第１の代替法 と同様に、ウェル当たり約2μｌのタンパク質を流す（10％）SDS-PAGEによりタ ンパク質を分析してタンパク質のサイズおよび品質を確認する。 his−タグ付きインチミンの富化に際して、誘導された物質を純度の水準につ いてSDS−PAGEにより分析する。10％SDS−PAGEゲルに富化したhis−タグ付きイ ンチミンのサンプル2μｌを流し、200Vで１時間電気泳動する。サイズの比較の ため、分子量マーカーをゲル上に含める。このゲルをコロイド状クーマシー染色 （シグマ、セントルイス、ＭＯ）で染色すると、最も目立つものが約101kDa位に 現れる。幾つかの他の顕著性に劣る高分子量バンドも現れる。このゲルを銀染色 （バイオラッド、リッチモンド、CA）で製造者の指示に従って染色すると、非常 にかすかな高分子量バンドが幾つかのより目立つ低分子量バンドに加えて出現し 、最も目立つバンドは29kDa周辺に現れる。この富化生成物は、好ましくは、約7 0−80％の完全長（すなわち、935個の推定アミノ酸のうちの900個）のインチミ ンを含む。好ましくは、この富化生成物は25％を超える汚染物質（すなわち、非 インチミン関連分子）を含まず、より好ましくは20％を超える汚染物質を含まず 、さらにより好ましくは10％を超える汚染物質を含まない。 実施例III 富化したヒスチジン−タグ付きインチミンの精製 上記実施例IIにおいて説明される通りに作製したhis−タグ付きインチミンの 富化調製品を当業者に公知の技術により精製する。これらの技術には高速液体ク ロマトグラフィー（HPLC）、ゲルカラムクロマトグラフィー、およびSDS−PAGE が含まれるが、これらに限定されるものではない。 SDS−PAGE法を用いて、his−タグ付きインチミンの富化調製品を10％ポリアク リルアミドゲルで分離し、例えば分析レーンをコロイド状クーマシー染色（シグ マ、セントルイス、ＭＯ）で染色することにより、可視化する。高分子量完全長 インチミンバンドをこの分離用ゲルからカミソリで切り出し、免疫感作に先立っ て4℃で保存することができる。インチミンの完全長より短い断片、すなわちイ ンチミンの一部、および／または１以上の抗原に結合するインチミンを同様にゲ ルから切り出すことができる。 インチミンまたはその一部の精製に用いられる方法に関わりなく、本明細書中 で用いられる精製タンパク質は、任意にヒスチジンがタグ付けされている、イン チミンまたはその一部だけからなるポリペプチドの集団を指す。インチミン（お よびインチミン様タンパク質）をコードする１つのオープンリーディングフレー ムのみを含むＤＮＡの断片から発現されたポリペプチドの集団が、SDS−PAGEゲ ル上で複数のバンドに分離し得ることは当該技術分野において認識されている。 McKeeら，Infection & Immunity，64(6):2225-2233(1996)、Jerseら，Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 87:7839-7843(1990)およびIsberg，Cell 50:769-778(1987) 。したがって、精製インチミンは、インチミンの一部および１以上の抗原と結合 したインチミンと同様に、SDS−PAGEゲル上で複数のバンドとして可視化するこ とができる。 実施例IV A．接着アッセイ。 HEp−2またはHCT−8細胞のいずれかに対する大腸菌の接着を、Carviotoら，Cu rr．Microbiol．3:95-99(1979)の方法の改変法により評価した。具体的には、LB ブロス中の試験しようとする細菌の一晩培養物20μｌ／ml（v／v）を含む接着ア ッセイ培地（0.4％重炭酸ナトリウムおよび1％マンノースを補足したEMEM、すな わちイーグル最少必須培地）と共に、HEp−2細胞の半集密(semiconfluent)単層 を24ウェル組織培養皿または8ウェルのパーマノックス・チャンバー・スライド （Permanox Chamber Slides）（ヌンク（Nunc）、ネイパービル、III）内のカバ ーガラス上にのせる。 接種物の各々は≧107個の（以下に説明される）細菌を含み、これはおおよそ1 00：１の感染多重度を生じる。感染した単層を5％CO2雰囲気内において37℃でイ ンキュベートする。3時間後、非接着細胞を含む培地を吸引し、単層を無菌の10m Mリン酸緩衝生理食塩水、pH7.4（PBS：塩化ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリ ウム、および一塩基性リン酸カリウム）で１回洗浄する。 これらの細菌が接着した細胞に新鮮な接着アッセイ培地を添加した後、感染細 胞をさらに3時間インキュベートする。次いで、単層をPBSで6回洗浄して非接着 細菌を除去する。各々の洗浄液は単層の攪乱の回避を試みながら吸引により穏や かに除去する。各々のアッセイを2回以上行い、結合および関連後遺症(associat ed sequelae)を可視化するためのギムザおよびFITC−ファロイジン（FAS）染色 が可能となるように2つのスライドを調製する。 ギムザ染色については、HEp−2細胞および接着細菌を70％（v／v）メタノール （カバーガラス）または段階的なアセトン洗浄（チャンバースライド）で固定し 、１：10ギムザ（シグマ）で20分間染色する。FAS表現型を評価するには、Knutt onら，Infect．Immun．57:1290-1298(1989)のFITC−ファロイジン（シグマ）染 色法を用いる。ファロイジンは、球状ではなく繊維状のアクチンに特異的に結合 するキノコ・ファロトキシンである。FITC−ファロイジン染色標品を、位相差顕 微鏡検査およびモデルBH2−RFL反射型蛍光アタッチメント（オリンパス光学株式 会社（Olympus Optical Co.，Ltd.）、東京、日本）を備えたオリンパス・モデ ルGHS顕微鏡を用いる蛍光顕微鏡検査により検査する。 HCT−8細胞を用いる接着アッセイをHEp−2細胞について上述される手順により 行うが、最初の洗浄の前に2.5時間、アッセイを終了する前にさらに2.5時間細菌 をHCT−8細胞と相互作用させる。HCT−8細胞を用いるアッセイは、全て、8ウェ ル・パーマノックス・チャンバー・スライドにおいて行う。 B．アッセイで用いる細菌の構築：EHEC eae変異体。 EHECの特定の株、86−24株においてeae遺伝子の染色体コピーにインフレーム( in-frame)欠失を作製するため、この遺伝子の野生型コピーをeaeの内部欠失コピ ーを用いる二重相同的組換えにより置換する（図13）。プラスミドpEB290（図14 ）はeae構造遺伝子の大部分を封入するもので、86−24染色体からプライマーMM1 （MMI＝ATAACATGAGTACTCATGGTTG；eae構造遺伝子の第2コドンから出発し、Sca I制限部位を含む）をプライマーMM2（MM2＝TCTAGAGAGAAAACGTGAATGTTGTCTCT）と の組み合わせで用いて増幅されたPCR産物から構築される。PCRによって誘導され る生じた2,953塩基対の断片をScaIおよびXbaIで消化し、SmaIおよびXbaIで制限 消化したpBluescript SK+（ストラタジーン（Stratagene））に連結する。このp EB290挿入物の末端のＤＮＡ配列決定により、3’の250塩基対が失われているこ とが明らかになる。 プラスミドpEB290で大腸菌GM119株［dam−6、dcm−3、［Arraj，J．A.およびM arinus，M．G．J．Bacteriol．153:562-565(1983)］を形質転換し、制限エンド ヌクレアーゼBclIに感受性である非メチル化ＤＮＡを得る。プラスミドＤＮＡを 単離し（Maniatisら，分子クローニング：実験マニュアル（Molecular cloning: a laboratory manual）Cold Spring Harbor(1982)）、BclIで制限消化して内部1 125bp断片をこの遺伝子から除去する。生じた粘着末端を互いに連結してpEB300 を作製する（図15）。 pEB300をXbaIおよびHindIIIで消化することにより欠失eae遺伝子を切り出し、 eae配列を含む断片を自殺ベクターpAM450（図16）のBamHI部位に連結してpEB305 を形成する。プラスミドpAM450はpMAK705（Hamiltonら，J．Bacteriol.，171:46 17-4622(1989)）の3つの特徴を有する誘導体である。第1に、これは温度感受性 （ts）複製起点を有する。第2に、このプラスミドは枯草菌に由来するsacB／R遺 伝子座を坦持し、これは宿主株をショ糖に対して感受性にする（Gayら，J．Bact erioil 164:918-921(1985)；Lepesantら，Marburg．Mol．Gen．Genet．118:135- 160(1972)）。第3に、このプラスミドはアンピシリン耐性をコードする。これら の特徴は相同的組換え、およびベクター配列の回復および喪失を生じる第2の組 換えに対する陽性選択を可能にする。（pEB300からの）欠失eae遺伝子を自殺ベ クター（pAM450）に挿入することにより、pEB305と呼ばれるプラスミドが生じる （図17）。 この自殺eae構築物、pEB305を用いて、電気穿孔法（Sizemoreら，Microb．Pat hog．10:493-499(1991)）により野生型EHEC 86−24株を形質転換する。ベクター 配列が矯正されている二重組換え体をショ糖を含む培地での増殖により選択した 後、アンピシリン感受性についてスクリーニングする（Blomfieldら，Mol． Microbiol.，5:1447-1457(1991)）。自殺ベクター配列が矯正されている形質転 換体はショ糖に耐性であり、アンピシリンに感受性であり、かつ30℃および42℃ で等しく増殖可能である。染色体eae配列の欠失を、（i）プライマーMM1およびM M2を用いるPCR増幅の後のeae断片のサイズの減少；（ii）変異染色体ＤＮＡのサ ザンブロット分析；（iii）eae遺伝子の欠失領域内の制限部位の喪失；および（ iv）内部プローブの変異染色体の認識不能により確認する。 得られたEHEC 86−24株のインフレーム欠失変異体を86−24eaeΔ10と命名する 。86−24eaeΔ10からのPCR誘導産物のin vitro転写および翻訳分析により、変異 がフレーム内にあることを確認する。予想されたサイズ、約68,000Daの末端切断 された(truncated)タンパク質産物を、翻訳産物の［35S］メチオニン標識により 同定する。eae変異株は全ての特徴において野生型86−24と同一であり、これら の特徴にはLBブロスにおける増殖、O157およびH7抗血清との凝集、ソルビトール を発酵させることが不可能であること、および37℃でのマッコンキー（MacConke y）寒天上での増殖が含まれる。 当業者は、eaeにおいて突然変異により生じ、かつ結合活性を保持しないEHEC の株を作製する他の方法が可能であり、代替可能であることを認めるであろう。 C．in vitroでのEHECの接着におけるeaeの役割。 同質遺伝子型(isogenic)の株、86−24、86-24eaeΔ10およびpEB310を坦持する 86−24eaeΔ10をHEp−2およびHCT−8細胞への接着性について試験する。野生型8 6−24は、それらの細菌がHEp−2またはHCT−8細胞と相互作用すると微小コロニ ーを形成する。M．L．McKee & A．D．O’Brien，Infection & immunity 63:2070 (1995)。この局在化した接着はFAS（蛍光アクチン染色）陽性であり、これは細 菌接着部位でのF−アクチンの重合（すなわち、期待される結果）を示す。変異 体86−24eaeΔ10はHEp−2細胞に接着することができない。pEB310またはpEB311 のいずれかでeaeを86−24eaeΔ10に導入した場合、LA／FAS（LA＝局在化接着、 すなわち微小コロニー形成）表現型は完全に回復し、その観察はインチミンが単 独でeaeの突然変異を補完することを示す。これらのクローンの両者がeae変異体 を補完することから、eaeの本来のプロモーターはPCR増幅配列中に存在する。 D．外来性His−インチミン融合タンパク質の添加の効果 接着アッセイは、86−24eaeΔ10の結合能および野生型86−24株の結合能に対 する外部から添加されたHis−インチミン融合タンパク質の効果の評価にも用い ることができる。この場合、各実験において示されるように、細菌を添加する前 に精製His−インチミン融合タンパク質を上皮細胞単層に添加する。 86−24を単層に添加する前に、HEp−2細胞を20ng−20μｇのRIHisEaeと共に30 分間インキュベートする。その後、感染した単層を丁寧に洗浄し、FITC−ファロ イジンで染色して顕微鏡で観察する。これらの融合体は86−24の野生株のHEp−2 細胞への結合を強化する。86−24の微小コロニーの大きさは、微小コロニーが接 着したHEp−2細胞の総数と同様に、RIHisEaeの濃度の増加に伴って増加する。高 用量（20μｇ）では、この融合タンパク質により、HEp−2細胞は異常な付加物お よび処理を示すようになる。このため、1−2μｇがさらなる研究に最も好ましい 用量である。 HEp−2細胞に外部から添加した場合、RIHisEaeは86−24eaeΔ10のHEp−2細胞 結合欠陥を補完する（すなわち、結合能を回復させる）。より短い融合タンパク 質、RVHdHisEaeも接着性を補完する。マウス・ジヒドロ葉酸レダクターゼへのヒ スチジン残基のアミノ末端融合（His−DHFR）は86−24の接着性を増強すること はない。さらに、インチミン融合タンパク質をコードするプラスミド、pEB312お よびpEB313は、in vitroでの接着について86−24eaeΔ10を補完することが可能 である。したがって、このような研究は、pEB312およびpEB313によってコードさ れるタンパク質が接着性を付与するのに十分であることを示す。 上記実施例Iにおいて述べられるように、これらの融合タンパク質は宿主株の 超音波破壊の後の不溶性ペレット画分に局在し、これは、これらのタンパク質が 膜に局在することを示す。His−DHFR融合体をコードするプラスミドpQE16は86− 24eaeΔ10を補完することはない（データは示さない）。この不適切なヒスチジ ン残基との融合タンパク質がeae変異体にHEp−2細胞への接着性を付与しないこ とは、インチミンに付加されたヒスチジン残基が外部から添加されたHis−イン チミン融合体で観察される活性の原因ではないことを示す。外来性RIHisEaeおよ びRVHdHisEaeで観察されるHEp−2細胞へのEHECの結合の強化または補完は、イン チミンが細菌および上皮細胞の両者と相互作用することを示す。 実施例Ｖ in vivoでのeaeの役割−ノトバイオート・子ブタ感染モデル ノトバイオート・子ブタの腸管コロニー形成、Ａ／Ｅ病変形成、ならびにＥＨ ＥＣ介在大腸炎および下痢におけるインチミンの役割を、Francisらの方法（Fra ncisら，Infect．Immun．51:953-956(1986)）により評価する。野生型親株、86 −24を接種した子ブタの対の両者は下痢を発症し、剖検時にらせん状結腸の腸間 膜に浮腫を有している。 組織学的には、86−24株は主として盲腸およびらせん状結腸にコロニーを形成 する。組織学的に、および培養によっては、肝臓、腎臓、肺または脳への細菌の 蔓延の証拠は検出されない。ＥＰＥＣについてStaley（Staleyら，Vet．Pathol ．56:371-392(1969)）およびMoon（Moonら，Infect．Immun．41:1340-1351(1983 )）によって記述されるような密接な細菌の接着およびＡ／Ｅ病変が、86−24に 感染した子ブタの盲腸および結腸の光およびＥＭ検査の両者によって立証される 。Ａ／Ｅ病変は接着部位での高電子密度の物質の集積を含む。幾つかの領域では 、腸管内腔内では脱落した腸細胞断片および細菌が接着した微絨毛が認められた 。86−24に感染した子ブタの盲腸およびらせん状結腸の組織切片においては、炎 症性の浸潤が見られる。炎症は、固有層内に散乱した好中球、ならびに粘膜下組 織における漿液および血管周囲リンパ球およびマクロファージの中程度の拡散集 積を特徴とする。 変異体株、86−24eaeΔ10を接種した子ブタの両者が、剖検時に形作られた糞 便を有する。組織学的に、およびＥＭ検査では、86−24eaeΔ10株が子ブタの腸 管にコロニーを形成し、Ａ／Ｅ病変を引き起こすことが可能である証拠はない。 光およびＥＭ検査によって盲腸およびらせん状結腸の粘膜上皮を覆う粘膜中に観 察される細菌はほとんどない。86−24eaeΔ10を接種した2匹の子ブタのうちの１ 匹には僅かな結腸間膜の浮腫があるが、他の著しい病変または顕微鏡的な病変は いずれの子ブタにも見られない。 86−２4eaeΔ10（pEB310）を接種した子ブタは、剖検時にペースト状の糞便お よび結腸間膜浮腫を有する。86−24eaeΔ10（pEB310）株は粘膜腸細胞に密接に 接着し、盲腸およびらせん状結腸にＡ／Ｅ病変を引き起こす。組織学的には、野 生型86−24によって引き起こされるものに類似する血管周囲リンパ組織球増多性 盲腸大腸炎（typhlocolitis）も見られる。 同様の実験が初乳欠乏新生子ウシモデルにおいて行われ、これは、インチミン が大腸菌O157：H7 86−24株介在性の下痢の他に腸内のＡ／Ｅ病変の誘発に必要 であることを示す（A．D．O’Brien、M．R．Wachtel、M．L．McKee、H．W Moon 、B．T．Bosworth、C．Neal Stewart、Jr.、およびE．A．Dean-Nystrom．「イン チミン：大腸菌O157：H7抗伝播ワクチンの候補（Intimin:Candidate for an Esc herichia coli O157:H7 Anti-Transmission Vaccine）」第32回コレラおよび関 連下痢疾患に関する共同会議（the 32nd Joint Conference on Cholera and Rel ated Diarrheal Diseases）の抄録、長崎、日本、1996年11月14−16日、この開 示は本明細書に参考として援用する）。また、これらの実験は、感染後2日で、 下部腸における感染性生物の数が、野生型または補完クローンを有するeae変異 体を給餌された子ウシよりもeae変異体または非病原性大腸菌株を給餌された動 物において大きく低下することも示す。 実施例VI ＨＣ患者血清によるＥＨＥＣタンパク質の認識。 出血性大腸炎患者からの試験済みの回復期免疫血清（疾患管理および予防セン ター、アトランタ、ＧＡのT．Barrett、ら快く提供されたもの）をウェスタン免 疫ブロットにおいてＰT7−発現インチミン標品（すなわち、pEB310およびpEB311 によって発現されるhis−インチミン）と反応させる。出血性大腸炎患者血清と 発現系における大腸菌タンパク質との反応性を低下させるため、血清サンプルを pGP1−2およびpBRKS-（発現ベクター）で形質転換したＤＨ５αの全細胞抽出物 に吸着させる。吸着後、正常な血清対照はインチミン標品の硫酸アンモニウム濃 縮画分中のタンパク質のみを認識するが、pEB310、すなわちベクター対照から発 現されるタンパク質とはそれ以上反応しない。吸着後、ＨＣ患者の血清は 依然として多くの大腸菌タンパク質を認識するが、インチミンとの反応は強いま まである。 実施例VII 患者へのHis−インチミンの投与 以下の例は、防御免疫応答を刺激するための患者へのhis−インチミンの投与 を提供する。防御免疫応答は、患者が感染を回避するのを可能とするに十分な抗 体を誘発し、感染の重大性もしくは重篤性を減少させ、または胃腸管にコロニー を形成する細菌の能力を低下させるものである。 his−インチミンの投与方法には、his−インチミンを患者に直接注射（腹腔内 、静脈内、皮下、および筋肉内を含むが、これらに限定されるものではない）し て免疫応答を誘発すること、his−インチミンの単独もしくは食物との摂取また は強制給餌、および上咽頭における上皮細胞の受容体へのインチミンの結合を促 進する、his−インチミンを用いる鼻腔内接種が含まれるが、これらに限定され るものではない。 his−インチミンを接種する場合、このタンパク質をゲルカプセルもしくはリ ポソーム内に納めるか、または不活性物質に結合させて接種物が胃を通過するの を助ける。この融合タンパク質は酸安定性であるため、それ自体でも摂取され、 または食物製品に混合してもよい。好ましい投与方法は、his−インチミンおよ びＳＬＴ（志賀毒素様毒素）の融合タンパク質でのものである。his−インチミ ン−ＳＬＴ融合タンパク質は、ＳＬＴの受容体を有するＳＹＮＳＯＲＢ（シンソ ーブ・バイオテック社（SynSorb Biotech，Inc.）、1204ケンジントン・ロード 、Ｎ．Ｗ.、カルガリー、アルバータ、カナダ、T2N3P5）にＳＬＴ−受容体相互 作用により結合する。このＳＹＮＳＯＲＢ構築物をチョコレートプディングと混 合し、子供に与える。 精製RiHisEae（His−タグ付きEae、900／935アミノ酸）は、（pMW103によって コードされる）インチミンの第3の1／3部分と同様に、ｐＨ2.0、37℃で24時間の インキュベーションの後でも安定である。これは、His−Eae融合体が無傷で、ま たは分解されることなく胃を通過することが可能であることを示す。さ らに、自然状態においては、Eaeは細菌の外膜上に発現し、かつ胃を通過した後 であっても依然としてインチミンの接着を促進するが、これは酸性環境に対する その耐性を示す。 摂取または鼻腔内接種は局部的な免疫を刺激し、これはＥＨＥＣおよびＥＰＥ Ｃによる将来的なコロニー形成を妨げる。相同性による交差免疫は、ハフィナ・ アルベイ(Hafnia alvei)およびシトロバクター・ロデンチウム(Citrobacter rod entium)、エルシニア種(Yersinia sp.)およびインチミン様タンパク質を有する 他の細菌種に対して刺激される。インチミン関連タンパク質を発現するＥＨＥＣ 以外の細菌による感染に対する防御免疫応答から利益を得るためにインチミンの 投与によってもたらされる交差免疫の程度を定量する必要はないが、そのような 防御のアッセイは実施例IXに説明している。このアッセイは、インチミン様の結 合タンパク質を有することが知られる病原体による上皮細胞との相互作用の遮断 に対するインチミン抗体の効力の評価を可能にする。 別の態様においては、雌ウシの乳房へhis−インチミンを注射することにより 雌ウシの免疫応答が生じる。このタンパク質に対する抗体はその雌ウシの乳中に 存在する。この乳を飲む子ウシは、それらを選り抜きの方法で能動的に免疫感作 できるようになるまで受動的に免疫感作される。あるいは、his−インチミンを 雌ウシに給餌、または雌ウシの餌に導入することができる。このように導入され るhis−インチミンの存在により雌ウシにおける抗体応答が刺激され、それによ り抗体が産生されてその雌ウシの乳中に現れる。 別の態様は核酸ワクチンの投与を包含する。His−インチミンを裸のeae ＤＮ Ａとして患者に注射し、またはそのＤＮＡをレトロウイルス、アデノウイルス、 もしくは当該技術分野において公知の他の坦体等の坦体系により身体に送達する 。投与の後、患者は一時的に発現する外来抗原に対する免疫応答を高める。 現在、一般に、核酸ワクチンは臨床試験に近づいている。このワクチンへのア プローチは、所望の抗原をコードするＤＮＡを、この遺伝子を非複製プラスミド ベクターに挿入することによって宿主に送達することを包含する（Marwick，C． JAMA 273:1403(1995)；Vogel，F．R.およびN．Sarver．Clin．Microbiol．Rev． 8:406(1995)に略述されている）。 このようなワクチンの防御効力の最初に公開された例証は、インフルエンザＡ ウイルス（Ａ／ＰＲ／8／34）核タンパク質（ＮＰ）をコードするプラスミドＤ ＮＡの筋肉内注射がＢＡＬＢ／cマウスにおいてインフルエンザウイルスの異種 株（Ａ／ＨＫ／68）に対する防御免疫応答を誘発することを示している（Ulmer ，J．B．ら，Science 259:1745(1993)）。免疫感作された動物は、抗原投与され た対照マウスと比較して、それらの肺におけるウイルス力価が減少し、体重の喪 失が低下し、かつ生存率が増加していた。ＮＰ−特異的細胞毒性Ｔリンパ球（Ｃ ＴＬ）およびＮＰ抗体の両者が生成した。ＮＰ抗体は防御の付与では無効であっ たが、ＣＴＬはウイルス感染細胞および割り当てられた主要組織適合複合体クラ スI制限ペプチドエピトープでパルス処理された細胞を殺した。 別の研究は、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／8／34血球凝集素をコードす るプラスミドＤＮＡの筋肉内注射が、異種致死的インフルエンザウイルスの抗原 投与に対してマウスを防御する中和抗体の産生を生じることを示している（Mont gomery，D．L.らDNA Cell Biol．12:777(1993)）。 この方法による本発明の実施は、本明細書に参考として援用する前述の文献、 特にMontgomery，D．L.らDNA Cell Biol．12:777(1993)を参照することにより達 成することができる。eae遺伝子座は、制限部位に基づいて、およびＣＬ８株に ついては図3におけるその配列に基づき、かつ図4に示される933株におけるその 配列に基づいて、図5に示される。 実施例VIII Ａ．Eaeおよび結合した抗原の両者に対する免疫応答を誘発するための、His−イ ンチミンへの様々な病原体に由来する抗原の結合。 様々な病原体に由来する抗原（Ag）およびハプテンを、ヒスチジン−タグ付き インチミン分子に結合する。この融合タンパク質を、インチミンが腸上皮細胞へ の結合を標的とする坦体として機能する接種物として用いる。この結合体タンパ ク質は以下の配置のいずれかで設計することができる：N−His−インチミン−Ag −C、N−Ag−インチミン−His−C、N−His−Ag−インチミン−C、N−インチミン −Ag−His−C、N−インチミン−His−Ag−C、またはN−Ag−His −インチミン−C。 当業者によって認識されるように、インチミンのサイズは融合させようとする 抗原のサイズおよびインチミンが融合する抗原の数に応じて変化する。このよう な融合タンパク質の設計において考慮される可変要素は：（1）外来抗原；（2） 用いられるインチミンのサイズ、これは、上述のように、結合機能を保持するい かなるサイズであってもよい；（3）融合順序Ｎ→Ｃ；および（4）結合方法、例 えば、さらなる方法が当業者に容易に明らかではあるが、融合タンパク質のクロ ーン化および発現におけるもののような遺伝的方法、および化学的方法である。 （D.V．Goeddel，「異種遺伝子発現のための系（Systems for Heterologous Gen e Expression）」，Meth．Enzymol.，第185巻，Academic Press，New York，199 0；K．Itakura，「大腸菌におけるホルモン・ソマトスタチンの化学的に合成さ れた遺伝子の発現（Expression in E．coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin）」，Science，198:1056-1063(1977)；およびD .V．Goeddelら，「ヒトインシュリンの化学的に合成された遺伝子の発現（Expre ssion of chemically synthesized genes for human insulin）」，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA，281:544-548(1979)）。 この結合抗原の送達は、上記実施例VIIで説明するヒスチジン−タグ付きイン チミン単独でのものと同じ機構を用いてなされる。 ハプテンおよび抗原は、細菌、リケッチア、真菌、ウイルス、寄生虫、薬物、 または化学物質から誘導することができるが、これらに限定されるものではない 。これらには、例えば、ペプチド、オリゴ糖、および毒素のような小分子が含ま れる。粘膜表面に吸収される能力を有する特定の抗菌剤、化学療法剤もインチミ ンに結合させることができる。インチミンに結合し、防御免疫応答を刺激するた めに投与することができる抗原および多糖には、下記表1に示されるものが含ま れ得る。 表 １ 以下のものに由来する抗原および／または多糖： 百日咳菌 ボレリア・ブルグドルフェリ（Borellia burgdorferi） カンピロバクター種(C．ジェジュニ（C．jejuni）を含む) カンジダ・アルビカンス、他のカンジダ トラコーマクラミジアおよびクラミジア・ニューモニア（Chlamydi pneumonia e）（ＴＷＡＲ） シトロバクター・ロデンチウム クロストリジウム種(ボツリヌス菌、C．ヂフィシレ（C．difficile）、C．ペ ルフリンゲンス（C．perfringens）、破傷風菌（破傷風トキソイドを含む）を含 む） コロナウイルス ジフテリア菌（ジフテリアトキソイドワクチンを含む） クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans） 赤痢アメーバ 大腸菌種、以下のものを含む ＥＴＥＣ（腸内毒素原性大腸菌） EAggEC（腸内集合性大腸菌） ＥＰＥＣ（腸内病原性大腸菌） ＥＨＥＣ（腸管出血性大腸菌）、ＥＨＥＣ ＳＬＴサブユニットまたはト キソイド ＥＩＥＣ（侵入性大腸菌） ＵＰＥＣ（尿路疾患性大腸菌）（大腸菌内毒素を含む） Ｊ５抗原（ＬＰＳ、リピッドＡ、ゲンタビオース） Ｏ多糖（血清型特異的） ＥＨＥＣ インフルエンザ菌（ｂ型インフルエンザ菌（ポリリボースリン酸塩）を含む） ハフニア・アルベイ ピロリ菌 Ａ型、Ｂ型、Ａ型、および他の肝炎 ヒト免疫不全ウイルスIおよびII（GP120、GP41、GP160、p24、その他） ヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum） クレブシエラ種（多糖（血清型特異的）を含む） レジュネラ種（L．ミクダデイ（L．micdadei）、L．ニューモフィラ（L.pneum ophila）を含む） リステリア菌 ミコバクテリウム種（鳥結核菌、M．カンサシイ（M．kansasii）、結核菌を含 む） マイコプラズマ ナイセリア種（淋菌、髄膜炎菌（血清型特異的またはタンパク質抗原を含む） を含む） ノカルジア・アステロイデス（Nocardia asteroides） プラスモジウム種 ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii） ポリオウイルス 緑膿菌（血清型特異的多糖を含む） 狂犬病ウイルス ライノウイルス リケッチア ロタウイルス サルモネラ種（ブタコレラ菌、腸炎菌、チフス菌、ネズミチフス菌を含む） 赤痢菌種（フレクスナー赤痢菌、ソネ赤痢菌、ボイド赤痢菌、志賀赤痢菌を含 む） スタフィロコッカス種（黄色ブドウ球菌、5型および8型に由来する多糖（血清 型特異的および共通防御抗体）、表皮ブドウ球菌、血清型多糖I、IIおよびIII（ および共通防御抗体）を含む） 連鎖球菌種、肺炎連鎖球菌（全ての血清型）、Ａ群、Ｂ群（血清型Ia、Ib、II 、およびIII）を含む化膿連鎖球菌を含む全ての血清型 梅毒トレポネーマ バリセラ・ゾスター（Varicella zoster） コレラ菌 エルシニア種（ペスト菌、偽結核菌、エンテロコリチカ菌を含む） 表1に見られる抗原に結合させることができるhis−インチミンのサイズには、 上記実施例Iに示されるように、RIHisEae（900／935aa、pEB313のEcoRI−HindII I断片）およびRVHindHis（604／935aa、pEB313のEcoRV-HindIII断片）が含まれ る。当業者は、本発明の思想および範囲内で接着活性を有する様々な長さの断片 をさらに選択することができることを認めるであろう。選択対象となる断片の効 力は実施例IVに説明する手順に従って評価することができる。 Ｂ．N−His−IcsA−インチミン−Cを発現するプラスミドの構築 フレクスナー赤痢(Shigella flexneri)は、ヒトの結腸粘膜の上皮細胞に侵入 することにより桿菌性赤痢を引き起こす（LabrecらJ．Becteriol．88:1503-1518 ，(1964)）。IcsAと呼ばれる120ｋＤａ外膜タンパク質がこの微生物の細胞内お よび細胞間伝播に必要である（BernardiniらProc．Natl．Acad．Sci．USA．86:3 867-3871(1989)；LettらJ．Bacteriol．171:353-359，(1989)）。経口感染した マカクザルはiscA変異体（ＳＣ560）に適度に十分寛容であり、この変異体は相 同抗原投与に対する防御を誘発した（SansonettiらVaccine 9:416-422,1991）。 以下のプロトコルを用いることができる（図18）： pEB313でdam宿主、例えばＤＭ１（Gibco BRL、P．O．Box 68、グランドアイラ ンド、Ｎ.Ｙ．14072、1−800−828−6686）を形質転換する。pEB313／Clal／Hin dIIIを消化し、1796bpの断片を単離する（この断片はインチミンの最後の547ア ミノ酸をコードする）。pBluescriptSK＋／ClaI／HindIII（pBluescriptSK＋は ストラタジーン、11011Nトレイ・パインス・ロード、ラヨラ、ＣＡ.92037、1−8 00−424-5444）に連結する。これをプラスミドpEae1と呼ぶ。pHS3192をAvaIで消 化し、その末端をクレノウ断片で充填し、ClaIで消化し、2490bpの断片を単離す る［この断片は塩基対＃706−3629の2923bp、すなわち974aaをコードする；icsA のＯＲＦはbp＃574-3880にわたり、これは3306bpで1102aaをコードする；icsAの 配列についての参考文献はLettら，J.Bacteriol.171:353(1989)である］（pHS31 92はP.Sansonetti（参考文献Bernardini,M．L.ら Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86:3876(1989)）から入手可能である）。2490bp断片を ClaIおよびHincIIで消化したpEae1に連結して、pEae2と呼ばれるプラスミドを生 成する。これらの制限酵素を用いると、icsAのリーディングフレームおよびeae がフレーム内に残る。pEae2をXhoIおよびHindIIIで消化し、4286bpの断片を単離 する；SmaIおよびHindIIIで消化したpQE32（ＱＩＡＧＥＮ）に連結する。この連 結は両遺伝子の適切なリーディングフレームをプロモーターと共に維持する。生 じるプラスミドをpIcsA−Eaeと呼ぶ。 あるいは、ＰＣＲを用いるクローン化により2つの遺伝子をフレーム内で融合 した後、適切なpQEベクターに連結することができる。この技術は当業者に公知 である。 Ｃ．His-インチミンをタンパク質坦体として用いる結合ワクチンの調製。 いかなる多糖をも用いることができるが、このワクチンにおいてはチフス菌の カプセル状Vi多糖を用いる。His−インチミンを実施例IIと同様に精製する；こ れをVi（確立された手順（SzuらJ．Exp．Med．166:1510(1987)）に従ってチフス 菌から精製したもの）に結合させる。この結合は、当業者に公知の標準タンパク 質−多糖結合技術を用いて処理する。結合方法は当業者に公知であり、Brunswic k，M.ら，J．Immunol．140:3364，1988のヘテロ連結（heteroligation）技術が 含まれる。タンパク質結合体の化学および架橋ＣＲＣ Press，ボストン（1991） も参照のこと。 分子の一部を一次もしくは二次坦体に結合する技術は当業者に公知であり、部 分的には、利用可能な官能基（例えば、アミノ、カルボキシル、チオおよびアル デヒド基）を介したカップリングが含まれる。S．S．Wong，タンパク質結合体の 化学および架橋ＣＲＣ Press,ボストン(1991)；およびBrenkeleyら，染料との タンパク質結合体を調製する方法の概略的な調査、ハプテンおよび架橋剤，Bioc onjugate Chemistry 3＃1（1992年1月号）を参照。 本実施例に説明するもののようなワクチンは、インチミン（またはインチミン 様タンパク質）を発現する生物、およびViを発現する下痢病原体の両者を含む下 痢病原体の予防をもたらす。 インチミンと、他の下痢病原体からの他の抗原とのいかなる組み合わせも合わ せることができる。加えて、他の疾患を生じる生物に由来する多糖、例えば肺炎 球菌多糖、が用いられた場合、そのインチミン−多糖ワクチンは複数の疾患の予 防に有用である。呼吸器病原体に対するワクチンは、好ましくは、気道に直接送 達される；摂取された病原体は摂取による。 実施例IX 接着遮断抗−インチミン抗体の産生および試験：ポリクローナルおよびモノクロ ーナル RIHisEaeを、マウス、ウサギ、およびヤギに腹腔内注射することで高力価ポリ クローナル抗−インチミン抗血清が誘発される。抗体力価の試験および抗体の有 効性のアッセイを示す。また、モノクローナル抗体の産生も説明する。 Ａ．ポリクローナル抗体の産生 様々な動物における全長インチミンまたはそれらの様々な部分に対する抗体の 調製に様々な技術を用いることができる。これらの技術のうちの幾つかを以下に 説明する。当業者によって認識されるように、ボリクローナル抗体は、インチミ ンおよびhis−タグ付けされていないインチミンの一部から、ならびにインチミ ン様タンパク質およびそれらの一部から産生することができる。 1．マウス抗−RIHisEaeポリクローナル抗体の産生 Harlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアル（Antibodies-a Labora tory Manual） Cold Spring Harbor，New York(1988)の技術に従うことができる 。一般的な手順は本明細書に略述されている。免疫感作するマウスの各々から予 備採血する：尾の静脈からエッペンドルフ管に出血させる。37℃で30分間インキ ュベートし、（血塊をほぐすために）無菌の爪楊枝で穏やかに撹拌し、4℃で一 晩保存する。その朝、微量遠心管中で10分／10,000rpm回転させ、血清（すなわ ち、上清：赤血球はペレットである）を集める。この血清を−20℃で保存する。 得られた血清は、マウスを免疫感作した後の陰性対照として用いる。 ＢＡＬＢ／ｃマウスに、25μｇのRIHisEaeを腹腔内注射する（タイタマックス （Titremax）アジュバントを、製造元（シトリックス社(CytRyx Corp.)、15 ４テクノロジー・パークウェイ、ノークロス、ＧＡ.30092、800−345−2987）の 指示に従って用いる）。2週間待って同一の注射で追加免疫感作し、7日待って尾 の静脈からエッペンドルフ管に出血させる。37℃で30分間インキュベートし、（ 血塊をほぐすため）無菌の爪楊枝で穏やかに撹拌して4℃で一晩保存する。その 朝、微量遠心管中で10分／10,000rpm回転させ、血清を回収する。この血清を−2 0℃で保存する。 2．マウス抗−インチミンポリクローナル血清第3の1／3部分の産生： 上述の実施例IX、パートＡに説明するように、マウスを尾の静脈から予備採血 する。上記実施例IIに説明するように、インチミンの第3の1／3部分を富化して 透析する。実施例IX、パートＡに説明するように、タイタマックスアジュバント と混合したインチミンの第3の1／3部分をマウスに注射する。3回の追加免疫感作 の後、後眼窩洞（retro-orbital sinus）を介してマウスから採血し、実施例IX 、パートＡに説明する通りに血清を調製する。血清を、下記第4節においてヤギ ポリクローナル血清について説明する通りに、ウェスタンブロット分析により試 験する。上記実施例IX、パートＣに説明するように、HEp−2細胞へのＥＨＥＣの 接着を遮断する能力について血清をアッセイする。 3．ウサギポリクローナル抗−インチミン抗体の産生 ウサギポリクローナル血清を、インチミンの（1）第１の1／3、（2）第2の1／ 3、および（3）第3の1／3部分に対して産生させる。各々の特異的血清を、HEp− 2接着性アッセイにおいて、HEp−2細胞へのＥＨＥＣの接着を遮断する能力につ いて別々にアッセイする。ウサギの免疫感作のための、インチミンの第１の1／3部分の調製 クローンpMW101でＤＨ5αF’lacIQ株を形質転換する。タンパク質の発現の誘 発、およびNi−NTAアフィニティー樹脂でのHis-タグ付きインチミン断片の精製 を、ＱＩＡエクスプレッショニストＮｉ−ＮＴＡ樹脂精製キット（ＱＩＡＧＥＮ 社、チャッツワース、ＣＡ）に付属するＱＩＡＧＥＮマニュアルに記述される通 りに行う。溶出した画分を、Ａ280、およびバイオ−ラッド（エルキュール(Herc ules)、ＣＡ）からの染料試薬を用いるブラッドフォード分析により、タンパク 質含量についてモニターする。Ｎｉ−ＮＴＡカラム（250ｍＭイミダゾールを含 む）から溶出したピ ーク画分を、分析および精製のため、ＳＤＳを含む15％ポリアクリルアミドゲル で電気泳動する。分析のためにゲル上のタンパク質を可視化するのに、銀（バイ オ−ラッド）およびクーマシーブルーG−250（シグマ）染色の両者を用いる。 動物の免疫感作用のタンパク質を精製して抗血清を得るため、ピークカラム画 分を分離用ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに流し、タンパク質を銅染色（バイオ −ラッド）で可視化する。インチミン断片に相当するタンパク質のバンドを清浄 なカミソリの刃でゲルから切り出し、そのゲル薄片を銅染色試薬と共に提供され る指示に従って脱染する。その後、エレクトローエリューター（Electro-Eluter ）モデル422（バイオ−ラッド）を製造元の指示に従って用いてタンパク質をゲ ル薄片から溶出する。次いで、このタンパク質を、アミコン（Amicon）（ベヴァ リー、ＭＡ）からのセントリコン−10（Centricon-10）濃縮器を用いて濃縮する 。溶出したタンパク質サンプル中のＳＤＳの大部分を2つの方法のうちの一方で 除去する。第1の方法はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をタンパク質サンプル に添加することを包含し、これはＳＤＳの沈殿を引き起こす。タンパク質の大部 分は沈殿せず、どのイオンが同様に沈殿し得たのかを決定するためにこの沈殿を 分析することはない。ＳＤＳを遠心によりペレット化し；大部分のタンパク質お よび、おそらくは、幾らかの残留ＳＤＳを含む上清を除去し、アミコン（ベヴァ リー、ＭＡ）からのセントリコン−10濃縮器を用いて濃縮する。 ＳＤＳを除去するための第2の方法は、ピアス（ロックフォード、IL）から購 入したエクストラクティーゲルRＤデタージェント・リムービング・ゲル（Extra cti-GelRD Detergent Removing Gel）のカラムを調製することを包含する。この エクストラクティーゲルRＤデタージェント・リムービング・ゲルは製造元の指 示に従って用いる。精製したタンパク質を上述の通りに濃縮する。タンパク質の 濃度を、バイオ−ラッドから購入した染料試薬を用いるブラッドフォード分析に より、および様々な量の元のカラム画分のアリコートに隣接したゲル上で異なる 容量の精製タンパク質を流し、タンパク質の量を視覚的に比較することによって も決定する。この精製タンパク質の画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、銀および クーマシー染色の両者を用いて分析する。ウサギの免疫感作のための、インチミンの第2の1／3部分の調製 クローンpMW102から発現されたインチミンタンパク質のHis−タグ付き中間部1 ／3断片の精製を、Ｎ末端1／3に用いられるものと同じ方法を用いて、以下の指 示に従って行う。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、12.5％アクリルアミドゲルを用いて 行う。タンパク質のゲル精製および電気溶出（electrolution）のため、この分 離用ゲルの大部分を上述のように銅染色で染色し；ゲルの1つは、Harlow，E.お よびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988) に記述されるように水に溶解したクーマシーブリリアントブルーで染色した。Ｐ ＢＳバッファを添加することにより、電気溶出タンパク質画分中の多量のＳＤＳ を沈殿させる。タンパク質を濃縮するには、アミコン・セントリコン−30濃縮器 を用いる（アミコン）。ウサギの免疫感作のための、インチミンの第3の1／3部分の調製 上記実施例IIに説明するように、第3の1／3インチミンタンパク質を富化して 透析する。１mgのタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、４つのバイオラッ ド・ミニプロテアンII（BioRad MiniProtean II）ゲル上に流す。タンパク質を 、銅染色（バイオラッド、カタログ番号161−0470、リッチモンド、ＣＡ）を用 いて、製造元の指示に従って以下のように負に染色する：ゲルをdH2Oで45秒間す すぎ、1×銅染色で5分間染色してdH2Oで3分間すすぐ。このゲルを黒色背景で可 視化し、約37ｋＤａのタンパク質バンドをゲルからカミソリで切断する。その後 、精製したゲル薄片をバッファ（25ｍＭトリス塩基、192ｍＭグリシン、3×／10 分）で脱染し、プラスチックラップに包み、免疫感作に先立って−20℃で保存す る。ウサギの免疫感作 ニュージーランド白色雌ウサギ（5ないし6ポンド）を、上述の通りに調製した 抗原を用いて、当業者が容易に決定することができるスケジュールに従って別々 に免疫感作する。このようなスケジュールの例は以下のようなものである： 日 手順 0 予備採血／初回接種、完全フロイントアジュバントと混合した100μｇAg 14 追加免疫感作、50μｇ、不完全フロイントアジュバントと混合 21 追加免疫感作、50μｇ、不完全フロイントアジュバントと混合 35 試験採血 45 追加免疫感作、50μｇ、不完全フロイントアジュバントと混合 56 試験採血 注射経路は、複数の部位の皮下および／または筋内であり得る。試験採血から 誘導される血清を、下記第4節においてヤギポリクローナル血清について説明す るように、ウェスタンブロット分析により抗原の特異的認識について試験する。 抗原の高力価認識が達成された場合、当業者によって認められるように、ウサギ から全血を採取して抗体を回収する。多量の血液サンプルをウェスタンブロット 分析により抗原の特異的認識について実証する。ウェスタンブロットによるウサギ抗−インチミンポリクローナル血清のアフィニ ティ精製 ウサギ抗−インチミンポリクローナル血清をアフィニティー精製し、インチミ ンまたはインチミン様タンパク質に特異的ではない交差反応性抗体をその血清か ら除去する。（Harlowe，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spr ing Harbor，New York(1988),498頁またはS.H.LillieおよびS.S.Brown.Yeast.3: 63(1987)）。RIHisEae（0.250ｍｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（サイズ：バイオラッ ド・ミニプロテアンIIミニゲル、バイオラッド、リッチモンド、ＣＡ）により電 気泳動し、ニトロセルロースに移してポンソーＳ（Ponceau Ｓ）（シグマ、セン トルイス、ＭＯ）で染色する。完全長His−インチミンバンド（約100ｋＤａ）を 含むニトロセルロース細片をカミソリで切り出し、そのタンパク質を含むニトロ セルロース細片を2％乳／ＴＢＳ−0.2％Tween中において4℃で一晩、穏やかに振 盪しながらインキュベートする。このニトロセルロース細片をＴＢＳ−Tweenで 簡単に洗浄し、容器内のパラフィルム（Parafilm）（アメリカン・ナショナル・ キャン（American National Can）、グリニツチ、Conn.）断片の上に置く。ウサ ギ血清をこのミニ−ウェスタンブロット上にピペットでのせ（適した量だけ、約 400−500μｌ）、湿ったペーパータオルを収容されるニトロセルロース細片上に 接触しないようにかけ、続いてプラスチックラップをかける。このブロットを穏 やかに5時間振盪した後、血清（この時点で「欠乏血清」と呼ばれ る）を取り出して分析用に保存する。細片をＰＢＳで１０分間、3回洗浄し、グ リシンバッファ（150ｍＭ NaCl、ｐＨ2.3−HClを含む）を（この細片上に適した 量だけ）添加して30分間おく。アフィニティー精製抗体をピペットで取り出し、 1／10容量のトリス−HCl、ｐＨ8.0を添加する。その後、このようにして回収さ れた抗体を1N NaOHで中和し、以下に説明するようにウェスタンブロット分析に よって試験する。抗原アフィニティカラムによるウサギ抗−インチミンポリクローナル血清のアフ ィニティ精製 ウサギ抗−インチミンポリクローナル血清をアフィニティー精製して、インチ ミンに特異的ではない交差反応性抗体を血清から除去する。インチミンまたはそ れらの様々な部分に対して生じた抗血清を、抗原アフィニティーカラムを用い、 当業者に公知の技術、例えば、Harlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニ ュアル Cold Spring Harbor，New York(1988)に記述されるようなものを用いて精 製する。 抗原（インチミンまたはインチミンの一部）を上記実施例IIに説明するように 富化する。抗原を、下記パート4に説明するように、アクリルアミドゲル上での 電気泳動、続いてそのタンパク質を含むゲル薄片からの電気溶出によりさらに精 製することができる。Ni−ＮＴＡ樹脂から溶出した後にそのタンパク質をさらに 精製するために、ゲル精製および電気溶出の代わりに他の方法を用いることがで きる。これらの方法には、イオン交換カラムクロマトグラフィーおよびゲル濾過 クロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されるものではない。精製後、 活性化ビーズにカップリングして抗血清精製用のアフィニティー樹脂を形成する ため、インチミンタンパク質を適切なバッファに透析することが必要となること がある。 抗原へのカップリングに適した活性化ビーズは、（Harlow，E.およびD．Lane （編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に挙げられて いる）幾つかの特性(カップリング試薬、結合性基またはマトリックス、リガン ドの結合、および最終マトリックスの安定性)に基づいて選択する。例えば、精 製インチミン（またはインチミンの一部）タンパク質抗原を、製造元の指示に 従ってアフィゲル（Affigel）ビーズ（バイオ−ラッド、リッチモンド、ＣＡ） にカップリングさせる。この抗原に結合した活性化ビーズのカラムを調製し、ビ ーズの製造元の指示に従って洗浄する。その後、このカラムをHarlow,E．および D．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に記 述される方法に従って洗浄する。 硫酸アンモニウム沈殿を用いて、このアフィニティーカラム用の調製中の血清 を部分的に精製する。硫酸アンモニウム沈殿、そのタンパク質ペレットのＰＢＳ への再懸濁、ＰＢＳに対するその溶液の透析、およびその溶液を清澄化するため の遠心はHarlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Har bor，New York(1988)に記述される通りに行う。 硫酸アンモニウム沈殿およびＰＢＳに対する透析によって部分的に精製されて いる抗血清を、Harlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spri ng Harbor，New York(1988)に記述されるように抗原アフィニティーカラムに通 す。抗血清をこのカラムに複数回通すことで、抗体がカラムへより完全に結合し 得る。その後、Harlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spri ng Harbor，New York(1988)に記述されるようにカラムを洗浄し、アフィニティ ー精製抗体を溶出させてＰＢＳに対して透析する。接着性アッセイ アフィニティー精製ポリクローナル血清を、HEp−2細胞接着性アッセイにおい て、HEp−2細胞への細菌結合を遮断する能力について、下記実施例IX、パートＣ に説明する方法を用いてアッセイする。 4．ヤギ抗−RIHisEaeポリクローナル抗体の産生 免疫感作しようとする可能性のあるヤギから予備採血する。間接真空を用いて 、頚静脈から血液を集める。上記実施例IX、第Ａ節に説明するように全血から血 清を分離し、（下記実施例IX、第Ｂ節でＥＬＩＳＡについて、および上記実施例 IIでRIHisEaeの富化について説明するように）RIHisEaeを吸着剤として用いるＥ ＬＩＳＡにより、または以下に説明するようなウェスタンブロット分析により試 験する。免疫感作のために選択されるヤギは、（a）ウェスタンブロット分析に よる最低のインチミン認識および（b）ＥＬＩＳＡによるインチミンに対する最 低力価の両者 を備える予備免疫血清を有し、放牧地を飛び出す習性のないヤギである。ヤギ抗−RIHisEaeポリクローナル血清のウェスタンブロット分析 a．全細胞溶解物の生成 所望の株（例えば、86-24、86-24eaeΔ10、DH5α、M15pREP4pEB313）を、適切 な抗生物質を含むＬＢ中で、37℃で一晩、振盪しながら増殖させる。細胞（4.5 ｍｌ）をエッペンドルフ管内でペレット化し、500μｌの超音波処理バッファ（5 0ｍＭ Na−リン酸ｐＨ7.8、300ｍＭ NaCl）を添加する。細胞を氷上において15 秒パルスで超音波処理し、等分して−20℃で凍結する。 b．ウェスタンブロット分析 上述の通りに生成した全細胞溶解物（2−5μｌ）または精製RIHisEae（2μｌ ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロースに移し、ヤギ血清のウェスタン ブロット分析に用いる。この目的のため、血清（一次抗体）を典型的には1：500 または1：1000に希釈する。用いられる二次抗体は、1：2000に希釈した、セイヨ ウワサビペルオキシダーゼに結合したブタ抗−ヤギIgG（ベーリンガー・マンハ イム、インディアナポリス、IN）である。予備採血のヤギ血清は通常数種類の交 差反応性バンドを含んでおり、これらは後にアフィニティー精製によって除去す る。ヤギを免疫感作するための精製RIHisEae（抗原）の調製 上記実施例IIに説明する通りに産生させたRIHisEae 1mgを、分離用ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥにかける。小さな分析レーンをコロイド状クーマシー染色（シグマ、セン トルイス、ＭＯ）で染色し、残りの分離用ゲルとの比較に用いる。（染色されて おらず、約100ｋＤａに達する）高分子量の完全長インチミンバンドを分離用ゲ ルからカミソリで切り出し、免疫感作に先立って4℃で保存する。抗原でのヤギの免疫感作 雌ヤギ（約1歳半、サーナン（Saanan）純血種またはサーナンX LaMANCHA）を 、上述の通りに調製した抗原を用いて、当業者が容易に決定することができるス ケジュールに従って別々に免疫感作する。例えば、完全フロイントアジュバント と混合した調製RIHisEae 500μｇの一次免疫感作をヤギに行う。2週間隔で、不 完全フロイントアジュバントと混合したAg 250μｇでヤギに追加免疫感作 する。ヤギを1ヶ月間免疫感作した後に試験採血を開始し、上述のウェスタンブ ロット分析による決定で高抗−インチミン力価が達成されるまで継続する。血清 がウェスタンブロットによりインチミンを認識する場合、2週間間隔で各セッシ ョン毎に多量の血液サンプルを採取する（500ｍｌ、これから約250ｍｌの血清が 生じる）。得られる大量血清サンプルを、上述のように、ウェスタンブロット分 析により、インチミン認識について立証する。ウェスタンブロットによるヤギ抗−インチミンポリクローナル血清のアフィニテ ィ精製 ヤギ抗−インチミンポリクローナル血清をアフィニティー精製し、インチミン に特異的ではない交差反応性抗体を血清から除去する（Harlowe，E.およびD．La ne（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)，498頁ま たはS．H．LillieおよびS．S．Brown．Yeast．3:63(1987)）。RIHisEae（0.250 ｍｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（サイズ：バイオラッド・ミニプロテアンIIミニゲル 、バイオラッド、リッチモンド、ＣＡ）により電気泳動し、ニトロセルロースに 移し、ポンソ−Ｓ（シグマ、セントルイス、ＭＯ）で染色する。完全長His−イ ンチミンバンド（約100ｋＤａ）を含むニトロセルロース細片をカミソリで切り 出し、そのタンパク質を含むニトロセルロース細片を2％乳／ＴＢＳ−0.2％Twee n中において4℃で一晩、穏やかに振盪しながらインキュベートする。このニトロ セルロース細片をＴＢＳ−Tween中で簡単に洗浄し、容器内のパラフィルム（ア メリカン・ナショナル・キャン、グリニッチ、Conn.）断片の上に置く。ヤギ血 清をこのミニ−ウェスタンブロット上にピペットでのせ（適量だけ、約400−500 μｌ）、湿ったペーパータオルを収容されるニトロセルロース細片上に接触しな いようにかけ、続いてプラスチックラップをかける。このブロットを穏やかに5 時間振盪した後、血清（この時点で「欠乏血清」と呼ばれる）を取り出して分析 用に保存する。細片をＰＢＳ中で10分間、3回洗浄し、グリシンバッファ（150ｍ Ｍ NaCl、ｐＨ2.3−HClを含む）を（この細片上に適した量だけ）添加して30分 間おく。アフィニティー精製抗体をピペットで取り出し、1／10容量のトリス−H Cl、ｐＨ8.0を添加する。その後、抗体を1N NaOHで中和し、上述のようにウェス タンブロット分析によって試験する。抗原アフィニティカラムによるウサギ抗−インチミンポリクローナル血清のアフ ィニティ精製 ウサギ抗−インチミンポリクローナル血清をアフィニティー精製してインチミ ンに特異的ではない交差反応性抗体を血清から除去する。インチミンまたはそれ らの様々な部分に対して生じた抗血清を、抗原アフィニティーカラムを用い、当 業者に公知の技術、例えば、Harlow,Ｅ.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュ アル Cold Spring Harbor，New York(1988)に記述されるような技術を用いて精製 する。 抗原（インチミンまたはインチミンの一部）を上記実施例IIに説明するように 富化する。抗原を、下記パート4に説明するように、アクリルアミドゲル上での 電気泳動、続いてそのタンパク質を含むゲル薄片からの電気溶出によりさらに精 製することができる。Ni−ＮＴＡ樹脂から溶出した後にそのタンパク質をさらに 精製するために、ゲル精製および電気溶出の代わりに他の方法を用いることがで きる。これらの方法には、イオン交換カラムクロマトグラフィーおよびゲル濾過 クロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されるものではない。精製後に 、活性化ビーズにカップリングして抗血清精製用のアフィニティー樹脂を形成す るため、インチミンタンパク質を適切なバッファに透析することが必要となるこ とがある。 抗原へのカップリングに適した活性化ビーズは、（Harlow，E.およびD．Lane （編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に挙げられて いる）幾つかの特性(カップリング試薬、結合性基またはマトリックス、リガン ドの結合、および最終マトリックスの安定性)に基づいて選択する。例えば、精 製インチミン（またはインチミンの一部）タンパク質抗原を製造元の指示に従っ てアフィゲルビーズ（バイオ−ラッド、リッチモンド、ＣＡ）にカップリングさ せる。この抗原に結合した活性化ビーズのカラムを調製し、ビーズの製造元の指 示に従って洗浄する。その後、このカラムをHarlow，E.およびD．Lane（編）抗 体−実験マニュアル Cold Spring Harbor，New York(1988)に記述される方法に従 って洗浄する。 硫酸アンモニウム沈殿を用いて、このアフィニティーカラム用の調製中の血清 を部分的に精製する。硫酸アンモニウム沈殿、そのタンパク質ペレットのＰＢＳ への再懸濁、およびＰＢＳに対するその溶液の透析、ならびにその溶液を清澄化 するための遠心はHarlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Sp ring Harbor，New York(1988)に記述される通りに行う。 硫酸アンモニウム沈殿およびPBSに対する透析によって部分的に精製されてい る抗血清を、Harlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に記述されるように抗原アフィニティーカラムに通す 。抗血清をカラムに複数回通すことで、抗体がカラムへより完全に結合し得る。 その後、Harlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Har bor，New York(1988)に記述されるようにカラムを洗浄し、アフィニティー精製 抗体を溶出させてＰＢＳに対して透析する。接着性アッセイ アフィニティー精製ポリクローナル血清を、HEp−2細胞接着性アッセイにおい て、HEp−2細胞への細菌結合を遮断する能力について、下記実施例IX、パートＣ に説明する方法を用いてアッセイする。 Ｂ．抗体の力価を試験するためのＥＬＩＳＡ Harlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，N ew York(1988)の技術に従うことができる。一般的な手順を以下に略述する： （1）RIHisEaeを、プラスチックマイクロタイタープレートに、ＰＢＳ中50ng／ ウェルで結合させる。2時間／ＲＴ（室温）、または4℃で一晩インキュベートす る。 （2）プレートをＰＢＳで２回洗浄する。 （3）100μｌのブロッキング溶液［ＰＢＳ中の3％ウシ血清アルブミン（シグマ ・ケミカル、セントルイス、ＭＯ）、0.02％ナトリウムアジド（シグマ）、4℃ で貯蔵］を用いてＲＴで1−2時間ウェルをブロックする。 （4）プレートをＰＢＳで２回洗浄する。 （5）一次Ab=ブロッキング溶液で、例えば、1：50から出発して1：2希釈を11回 、または1：50から出発して1：10希釈を11回行って希釈した50μｌ試験血清）、 2時間／ＲＴでインキュベートする。 （6）ＰＢＳで4回洗浄する。 （7）二次Ag＝アフィニティー精製したヤギセイヨウワサビ結合抗−マウスIg（ ベーリンガー・マンハイム社、9115ハーグ・ロード、P．O．Box 50414、インデ ィアナポリス、IN．46250、800−262−1640）。アジドを含まないブロッキング 溶液で1：500に希釈した二次Abを添加する。1時間／ＲＴでインキュベートする 。 （8）PBSで4回洗浄する。 （9）各ウェルに100μｌのＴＭＢペルオキシダーゼ基質（製造元のバイオラッド ・ラブス、3300レガッタ・ブルバード、リッチモンド、ＣＡ.94804の指示に従っ て調製）を添加する。青色を発色させる（10分以下）。100μｌのH2SO4で反応を 停止させる。プレートを450nmで読みとる。 力価を、吸光値≧マウス予備免疫血清について得られるものを0.2単位以上上 回るものと定義する。 抗−インチミン抗体を投与して、受動免疫防御を必要とする患者にそれらをも たらすことができる。さらに、動物から得られた抗−インチミン抗体をヒトに対 して臨床的に用いることができる。このような場合、その抗体をヒト化すること が好ましい。そのような技術は当業者に公知である。G．Winterら，「人造抗体 （Man-made antibodies）,」Nature，349:293-299(1991)；P．T.Jonesら，「ヒ ト抗体における相補性決定領域のマウス由来のものでの置換（Replacing the co mplementarity-determing regions in a human antibody with those from a mo use）,」Nature，321:522-525(1986)；P．Carterら，「ヒト癌治療のための抗-p 185HER2抗体のヒト化（Humanization of an anti-p185HER2antibody for human cancer therapy）,」Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:4285-4289(1992)。この ような抗体を感染患者の兄弟に投与して兄弟の感染の危険を減らすことができる 。 Ｃ．抗−RIHisEaeポリクローナル血清のウェスタンブロット分析 ポリクローナル血清をウェスタンブロット分析によってアッセイしてインチミ ン認識を立証する。 1．全細胞溶解物の産生 所望の株（例えば、86−24、86−24eaeΔ10、ＤＨ5α、Ｍ15 pREP4 pEB313） を適切な抗生物質を含むＬＢ中において、37℃で一晩、振盪しながら増殖させる 。細胞（4.5ｍｌ）をエッペンドルフ管内でペレット化し、500μｌの超音波処理 バッファ（50ｍＭ Na−リン酸pH7.8、300ｍＭ NaCl）を添加する。細胞を氷上に おいて15秒パルスで超音波処理し、等分して−20℃で凍結する。 2．ウェスタンブロット分析 上述の通りに生成した全細胞溶解物（2−5μｌ）または精製RIHisEae（2μｌ ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロースに移し、血清のウェスタンブロ ット分析に用いる。この目的のため、血清（一次抗体）を典型的には1：500また は1：1000に希釈する。二次抗体は一次抗体の源である動物に特異的であり、か つセイヨウワサビペルオキシダーゼに結合している。予備採血の血清は数種類の 交差反応性バンドを含んでいることがあり、これらは後にアフィニティー精製に よって除去する。 Ｄ．ウェスタンブロットによる抗−インチミンポリクローナル血清のアフィニテ ィー精製 抗−インチミンポリクローナル血清をアフィニティー精製し、インチミンに特 異的ではない交差反応性抗体を血清から除去する（Harlowe，E.およびD．Lane（ 編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988),498頁またはS ．H．LillieおよびS．S．Brown.Yeast．3:63(1987)）。RIHisEae（0.250ｍｇ） をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（サイズ：バイオラッド・ミニプロテアンIIミニゲル、バイ オラッド、リッチモンド、ＣＡ）により電気泳動し、ニトロセルロースに移して ポンソーＳ（シグマ、セントルイス、ＭＯ）で染色する。完全長His−インチミ ンバンド（約100ｋＤａ）を含むニトロセルロース細片をカミソリで切り出し、 そのタンパク質を含むニトロセルロース細片を2％乳／ＴＢＳ−0.2％Tween中に おいて4℃で一晩、穏やかに振盪しながらインキュベートする。このニトロセル ロース細片をＴＢＳ−Tween中で簡単に洗浄し、容器内のパラフィルム（アメリ カン・ナショナル・キャン、グリニッチ、Conn.）断片の上に置く。血清をこの ミニ−ウェスタンブロット上にピペットでのせ（適量だけ、約400-500μｌ）、 湿 ったペーパータオルを収容されるニトロセルロース細片上に接触しないようにか け、続いてプラスチックラップをかける。このブロットを穏やかに5時間振盪し た後、血清（この時点で「欠乏血清」と呼ばれる）を取り出して分析用に保存す る。細片をＰＢＳで10分間、3回洗浄し、グリシンバッファ（150ｍＭ NaCl）ｐ Ｈ2.3−HClを含む）を（この細片上に適した量だけ）添加して30分問おく。アフ ィニティー精製抗体をピペットで取り出し、1／10容量のトリス−HCl、ｐＨ8.0 を添加する。その後、抗体を1N NaOHで中和し、上述のようにウェスタンブロッ ト分析によって試験する。 Ｅ．抗原アフィニティーカラムによる抗−インチミンポリクローナル血清のアフ ィニティー精製 ウサギ抗−インチミンポリクローナル血清をアフィニティー精製してインチミ ンに特異的ではない交差反応性抗体を血清から除去する。インチミンまたはそれ らの様々な部分に対して生じた抗血清を、抗原アフィニティーカラムを用い、当 業者に公知の技術、例えば、Harlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュ アル Cold Spring Harbor，New York(1988)に記述される技術を用いて精製する。 抗原（インチミンまたはインチミンの一部）を上記実施例IIに説明するように 富化する。抗原を、下記パート4に説明するように、アクリルアミドゲル上での 電気泳動、続いてそのタンパク質を含むゲル薄片からの電気溶出によりさらに精 製することができる。Ni−ＮＴＡ樹脂から溶出した後にそのタンパク質をさらに 精製するために、ゲル精製および電気溶出の代わりに他の方法を用いることがで きる。これらの方法には、イオン交換カラムクロマトグラフィーおよびゲル濾過 クロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されるものではない。精製後、 活性化ビーズにカップリングして抗血清精製用のアフィニティー樹脂を形成する ため、インチミンタンパク質を適切なバッファに透析することが必要となること がある。 抗原へのカップリングに適する活性化ビーズは、（Harlow，E.およびD．Lane （編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に挙げられて いる）幾つかの特性（カップリング試薬、結合性基またはマトリックス、リ ガンドの結合、および最終マトリックスの安定性)に基づいて選択する。例えば 、精製インチミン（またはインチミンの一部）タンパク質抗原を製造元の指示に 従ってアフィゲルビーズ（バイオ−ラッド、リッチモンド、ＣＡ）にカップリン グさせる。この抗原に結合した活性化ビーズのカラムを調製し、ビーズの製造元 の指示に従って洗浄する。その後、このカラムをHarlow，E.およびD．Lane（編 ）抗体−実験マニュアル Cold Spring Harbor，New York(1988)に記述される方 法に従って洗浄する。 硫酸アンモニウム沈殿を用いて、このアフィニティーカラム用の調製中の血清 を部分的に精製する。硫酸アンモニウム沈殿、そのタンパク質ペレットのＰＢＳ への再懸濁、およびＰＢＳに対するその溶液の透析、ならびにその溶液を清澄化 するための遠心はHarlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアル Cold S pring Harbor，New York(1988)に記述されるように行う。 硫酸アンモニウム沈殿およびＰＢＳに対する透析によって部分的に精製されて いる抗血清を、Harlow，E.およびD.Lane（編）抗体−実験マニュアル Cold Spri ng Harbor，New York(1988)に記述されるように抗原アフィニティーカラムに通 す。抗血清をカラムに複数回通すことで、抗体がカラムへより完全に結合し得る 。その後、Harlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアル Cold Spring Harbor，New York(1988)に記述されるようにカラムを洗浄し、アフィニティー精 製抗体を溶出させてＰＢＳに対して透析する。 Ｆ．インチミンに対する抗体による細菌結合の遮断についてのアッセイ ＥＨＥＣ接着に対する抗−インチミン抗体の効果を評価するため、マウス、ウ サギ、またはヤギ抗−インチミン抗血清（または対照として正常血清）を接着培 地に懸濁したＥＨＥＣ細菌に添加し、その細菌−抗血清混合液をHEp−2細胞の感 染に先立って37℃で30分間インキュベートする。抗血清はアッセイを通してその 接着培地中に維持する。接着および関連後遺症を、上述のようにギムザ(ＧＩＥ ＭＳＡ)およびＦＩＴＣ−ファロイジン（ＦＡＳ）を用いて顕微鏡で観察する。 インチミン様タンパク質を有する他の細菌の接着に対する抗−インチミン抗体 の効果を評価するため、マウス、ウサギ、またはヤギ抗−インチミン抗血清（ま たは対照として正常血清）を接着培地に懸濁したＥＨＥＣ細菌に添加し、その細 菌 −抗血清混合液をHEp−2細胞の感染に先立って37℃で30分間インキュベートする 。 本発明の他の態様は、本明細書およびここに開示される本発明の実施を考慮す ることにより当業者には明らかであろう。本明細書および例は例示するだけのも のであると見なされ、本発明の真の範囲および思想は以下の請求の範囲によって 示されるものであることが意図されている。 Ｇ．インチミンに特異的なモノクローナル抗体の産生 インチミンに対するモノクローナル抗体を、ＥＨＥＣ（またはインチミン様タ ンパク質を発現する細菌）によるコロニー形成に対する患者の受動防御に用いる 。モノクローナル抗体をマウス細胞から産生させ、これらの抗体の特異性をヒト において用いるために変更する。G．Winterら，「人造抗体,」Nature，349:293- 299(1991)；P．T．Jonesら，「ヒト抗体における相補性決定領域のマウス由来の ものでの置換,」Nature，321:522-525(1986)；P．Carterら，「ヒト癌治療のた めの抗−p185HER2抗体のヒト化,」Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:4285-4289( 1992)。モノクローナルAbは患者に投与するためのより「純粋な」抗体を表す。 1．抗−Eaeモノクローナル抗体の産生 抗−インチミンモノクローナル抗体の産生方法の2つの例を以下に説明する。 a．方法1抗−Eae mAbの産生 Harlow，E.およびD．Lane，抗体，実験マニュアル Cold Spring Harbor，New York(1988)に略述される手順を修正してそれに従う。9週齢雌BALB／c（ハーラン ・スプラークードーリー（Harlan Spraque-Dawley）、インディアナポリス、IN ）をモノクローナル抗体の作製に用いる。免疫感作に先立ち、各々のマウスから 後眼窩洞を介して血清サンプルを得る。この全血を微量遠心管に入れて4℃で4な いし16時間冷却する。全血を1000−1200×gで15分間、10−15℃で遠心すること により血清を調製する。この血清をマイクロピペッタおよび無菌のピペットチッ プを用いて新たな微量遠心管に移す。血清を使用時まで−20℃で保存する。 上記実施例IIに説明するように得たRIHisEaeのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから抗原 を得る。上記実施例IX、Ａ節、パート4に説明するように、高分子量インチミン バンドをカミソリで切り出す。この目的のため、1ｍｇのRIHisEaeを４つのミニ プロテアンIIゲル（バイオラッド、リッチモンド、ＣＡ）上に流す。これらのゲ ルから切り出したタンパク質を、乳鉢および乳棒を用いて、約8mlのリン酸緩衝 生理食塩水（ＰＢＳ）中のスラリーとする。実験日第０日に、このスラリーの0. 8ｍｌを1.2ｍｌの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と混合し、0.2ｍｌア リコートを4匹のマウスの各々に皮下注射する。このスラリーの0.5mlを0.5ｍｌ のＲＩＢＩ Ｔ−700アジュバント（ＲＩＢＩイムノケム（ＲＩＢＩ Immunochem ）、ハミルトン、モンタナ州）と混合し、0.2ｍｌを4匹のさらなるマウスの各々 に注射する。 実験日第21日および42日に、マウスに追加免疫感作注射を施す。ＣＦＡの代わ りに不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を用いることを除いて、上述の通 りに抗原を調製する。 実験日第14日、第35日および第49日に、上述の通りに血清サンプルを得る。 血清サンプルを（以下に説明する）イムノアッセイにより試験し、当業者に認 識されるように、Eaeに対して最も強く応答する血清を産生するマウスを同定す る。上記実施例IX、Ａ節、パート4に説明するように、血清サンプルの反応性を ウェスタンブロット分析により立証する。融合の3日前（実験日第59日）に、融 合のために選択されたマウスを、ＰＢＳ中のインチミンスラリーからの上清の50 ％混合物で免疫感作する。合計で0.1ｍｌのこのスラリーを尾の静脈を介して静 脈注射する。 選択されたマウスからの脾臓細胞をＳＰ2／0ミエローマ細胞（カタログ＃ＣＲ Ｌ1581アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（AmericanType Culture Collection）、ロックビル、ＭＤ 20850、301−881−2600）と融合させる。こ の融合のためには、脾臓細胞10個に対してミエローマ1個の割合を用いる。融合 はポリエチレングリコール（カタログ＃783 641 ベーリンガー−マンハイム社 、9115ハーグ・ロード、ＰＯ Box 50414、インディアナポリス、ＩＮ．46250、8 00−262−1640）を用いることにより達成する。融合した細胞を増殖させるため に96ウェル組織培養皿に分配する。この培養物をヒポキサンチン、アミノプ テリンおよびチミジンを含む培地において10日間増殖させることによりハイブリ ドーマを選択する。以下に説明するように、イムノアッセイにより、抗−インチ ミン特異的抗体を分泌するハイブリドーマを96ウェル組織培養皿から同定する。 Eaeと反応する抗体について陽性である培養物を24ウェル皿に移すことにより増 大させ、イムノアッセイによりEaeとの反応性について再試験して、限界希釈に より2回クローン化する。マウスポリクローナル抗−インチミン血清およびハイブリドーマ上清（抗−イン チミンモノクローナル抗体）のイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ） 免疫感作に用いたインチミンスラリー3ｍｌ部分を約1000×gで15分間、室温で 遠心する。得られた清澄化上清のサンプルを用いてイムノアッセイプレートをコ ートする。簡単に述べると、このインチミン含有上清をＰＢＳ中に1：300に希釈 し、コーティング抗体として用いる。ヌンク・マキシソープ・ストリップウェル （Nunc Maxisorp Stripwell）を、室温で2−24時間100μｌ／ウェルの希釈上清 でコートする。 0.5％Tween−20を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で4回洗浄して、未結合物質をウ ェルから洗浄する。血清サンプルのアッセイについては、各サンプルのＰＢＳ− Ｔ中での複数の希釈液を調製し、複製ウェルに加える。96ウェル皿培養物からの 培養上清のアッセイについては、各上清をＰＢＳ−Ｔ中で1：2に希釈し、1つの ウェルに加える。24ウェル皿培養物からの上清もＰＢＳ−Ｔ中で1：2に希釈し、 二通り試験する。血清サンプルのアッセイには、バッファ対照、培地対照および 既知のポリクローナル抗−インチミン対照が含まれる。上清のアッセイには、バ ッファ対照、培地対照、および既知のポリクローナル抗-インチミン対照が含ま れる。 血清および上清を通気のない環境において、室温で30−60分間、インチミンで コートされたウェル上でインキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで4回洗浄して未結合抗 体および（血清タンパク質等の）外来性物質をウェルから洗浄する。その後、各 ウェルに、ＰＢＳ−Ｔ中で1：4000に希釈したウサギ抗−マウスIgG（ガンマ特異 的）−ＨＲＰ（ジムド（Zymed）、サウスサンフランシスコ、ＣＡ）100μｌを加 える。 プレートを、再度、通気のない環境において室温で30−60分間インキュベー トする。その後、各ウェルに100μｌの1成分ＴＭＢ基質溶液（カークガードおよ びペリー・ラブス（Kirkegaard and Perry Labs）、ゲーサーズバーグ、ＭＤ208 78、301−948-7755）を加える。反応を暗所において15分間進行させた後、80μ ｌ／ウェルのＴＭＢ停止試薬（カークガードおよびペリー・ラブス、ゲーサーズ バーグ、ＭＤ20878、301−948−7755）を添加することにより停止させる。 b．方法2 Harlow，E.およびD．Lane，抗体、実験マニュアル Cold Spring Harbor，New York(1988)に略述される手順に従う：5匹の4ないし5週齢雌ＢＡＬＢ／ｃＪマウ スを予備採血し、100μｌのタイタマックス（TiterMax）に懸濁したRIHisEae 25 μｇを腹腔内投与して免疫感作する。2週間隔で2回、100μｌのタイタマックス に懸濁したRIHisEae 25μｇを腹腔内投与することでマウスを追加免疫感作する 。各追加免疫感作の7日後、血液（約300−500μｌ）を尾の静脈から採取する。 ＥＬＩＳＡにより、抗−RIHisEae抗体の存在について血清をアッセイする（上述 の通り）。 高力価の抗−RIHisEaeを産生するマウスを、ＰＢＳ 100μｌ中のRIHisEae 25 μｇを静脈内および腹腔内の両者で投与することで追加免疫感作し、３日後に屠 殺して血清を回収する。脾臓細胞を単離し、Sp2／0−Agマウスミエローマ細胞（ ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ1581）にミエローマ細胞1個について脾臓細胞10個の割合で融 合させる。融合した細胞を微量希釈プレートに分配し、培養上清を3−4週間の培 養の後にＥＬＩＳＡによりRIHisEae抗体についてアッセイする。抗−RIHisEae抗 体の産生について陽性の培養物を増大させ、限界希釈により2回クローン化する 。 2．抗−RIHisEae mAbが立体配置的エピトープを認識するのか、または直線状エ ピトープを認識するのかの決定 mAbの反応性を、1）天然RIHisEaeを吸着剤として用いるＥＬＩＳＡ；および2 ）変性させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したRIHisEaeの免疫ブロットによって比較 する。mAbの幾つかのプールを得る：1）立体配置的なエピトープのみを認識し、 かつＥＬＩＳＡでは陽性反応を示すが免疫ブロット分析では示さないもの；2） 直線状エピトープを認識し、かつ両アッセイにおいて反応するもの；および3） 直線状エピトープを認識し、かつ免疫ブロット分析では陽性反応を示すがＥＬＩ ＳＡでは示 さないもの。加えて、非溶解細胞のコロニー免疫ブロットを行い、mAbが野生型8 6−24株の表面上に発現するEaeを認識するかどうかを決定する。 3．HEp−2細胞への86−24株の接着を遮断する能力についての抗−Eae mAbの試験 86−24株をHEp−2細胞に関する定量的接着性アッセイに処し、並行して、抗− RIHisEae mAbの様々な希釈液と予備インキュベートした細菌を用いて試験する。 選択された接着遮断性の立体配置的mAbをアイソタイプ決定（イムノピュアmAb タイピングキット（immunopure mAb Typing Kit）、ピアス、ロックフォード、I ll.）に処す。その後、独特の抗体を、プロテインＧセファロースカラム（ファ ルマシア、ピスカタウェイ、Ｎ．Ｊ.）でのアフィニティークロマトグラフィー によって精製する。得られたアフィニティー精製mAbをHEp−2細胞への86−24株 の接着を遮断する能力について再試験し、その抗体が精製後に機能的なままであ ることを確かなものとする。 Ｈ．診断キットにおけるポリクローナルおよびモノクローナル抗−インチミン抗 体の使用 インチミン発現性細菌、好ましくはＥＨＥＣの検出に診断キットを用いること ができる。このようなキットの調製および使用の一般的な説明は1995年3月10日 出願の同時係属米国出願番号08／412,231号に示されており、この特許出願の開 示は本明細書において参考として援用する。 実施例VIII 高力価ポリクローナル抗−インチミン抗血清を、タイタマックス・アジュバン ト（シトルクス社（CytRx Corp.）、154テクノロジー・パークウェイ、テクノロ ジー・パーク／アトランタ、ノークロス、ＧＡ.30092、800−345−2987）を用い て25μｇのRIHisEaeをマウスおよびウサギに腹腔内注射することにより誘発する 。抗体力価の試験および抗体の有効性のアッセイを示す。また、モノクローナル 抗体も説明する。 A．ポリクローナル抗体の作製 Harlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアル Cold Spring Harbor， New York(1988)の技術に従うことができる。一般的な手順は本明細書に略述され ている。免疫感作するマウスの各々から予備採血する：尾の静脈からエッペンド ルフ管に出血させる。37℃で30分間インキュベートし、（血塊をほぐすため）無 菌の爪楊枝で穏やかに撹拌し、4℃で一晩保存する。その朝、微量遠心管におい て10分／10,000rpm回転させ、血清（すなわち、上清；赤血球はペレットである ）を集める。この血清を−20℃で保存する。得られた血清を、マウスを免疫感作 した後の陰性対照として用いる。 ＢＡＬＢ／ｃマウスに、（タイタマックス・アジュバントを用いて、製造元（ シトリックス社、154テクノロジー・パークウェイ、ノークロス、ＧＡ.30092、8 00−345−2987）の指示に従って）25μｇのRIHisEaeを腹腔内注射する。2週間待 って同一の注射で追加免疫感作し、7日待って尾の静脈からエッペンドルフ管に 出血させる。37℃で30分間インキュベートし、（血塊をほぐすため）無菌の爪楊 枝で穏やかに撹拌して4℃で一晩保存する。その朝、微量遠心管において10分／1 0,000rpm回転させ、血清を集める。この血清を−20℃で保存する。 Ｂ．Abの力価を試験するためのＥＬＩＳＡ Harlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアル Cold Spring Harbor， New York(1988)の技術に従うことができる。一般的な手順を以下に略述する： （１）RIHisEaeを、ＰＢＳ中50ng／ウェルで、プラスチックマイクロタイタープ レートに結合させる。2時間／ＲＴ（室温）、または4℃で一晩インキュベートす る。 （２）プレートをＰＢＳで２回洗浄する。 （３） 100μｌのブロッキング溶液［ＰＢＳ中の3％ウシ血清アルブミン（シグ マ・ケミカル、セントルイス、ＭＯ）、0.02％ナトリウムアジド（シグマ）、4 ℃で貯蔵］を用いてＲＴで1−2時間ウェルをブロックする。 （４）プレートをＰＢＳで２回洗浄する。 （５）一次Ab＝ブロッキング溶液で、例えば、1：50から出発して1：2希釈を11 回、または1：50から出発して1：10希釈を11回行って希釈した試験血清50μｌ） 、 2時間／ＲＴでインキュベートする。 （６）ＰＢＳで4回洗浄する。 （７）二次Ag＝アフィニティー精製したヤギセイヨウワサビ結合抗−マウスIg（ ベーリンガー・マンハイム社、9115ハーグ・ロード、P．O．Box 50414、インデ ィアナポリス、ＩＮ．46250、800−262−1640）。アジドを含まないブロッキン グ溶液で1：500に希釈した二次Abを添加する。1時間／ＲＴでインキュベートす る。 （８）ＰＢＳで4回洗浄する。 （９）各ウェルに100μlのＴＭＢペルオキシダーゼ基質（製造元、バイオラッド ・ラブス、3300レガッタ・ブルバード、リッチモンド、ＣＡ．94804の指示に従 って調製）を添加する。青色を発色させる（10分以下）。100μｌのＨ2ＳＯ4で 反応を停止させる。プレートを450ｎｍで読みとる。 力価を、吸光値≧マウス予備免疫血清について得られるものを0.2単位上回る ものと定義する。 動物から得られた抗−インチミンAbを、その抗体の特異性をヒトに対して変換 すれば、臨床的に用いることができる。そのような技術は当業者に公知である。 G．Winterら，「人造抗体,」Nature，349:293-299(1991);P．T．Jonesら，「ヒ ト抗体における相補性決定領域のマウス由来のものでの置換,」Nature，321:522 -525(1986);P．Carterら，「ヒト癌治療のための抗−p185HER2抗体のヒト化,」P roc．Natl．Acad．Sci．USA，89:4285-4289(1992)。このような抗体を感染患者 の兄弟に投与して兄弟の感染の危険を減らすことができる。 Ｃ．インチミンに対する抗体による細菌結合の遮断のアッセイ ＥＨＥＣ接着に対する抗−インチミン抗体の効果を評価するため、マウスまた はウサギ抗−インチミン抗血清（または対照として正常血清）を接着培地に懸濁 したＥＨＥＣ細菌に添加し、その細菌−抗血清混合液を、HEp−2細胞の感染に先 立って37℃で30分間インキュベートする。抗血清はアッセイを通してその接着培 地中に維持する。接着および関連後遺症を、上述のようにギムザおよびＦＩＴＣ −ファロイジン（ＦＡＳ）染色を用いて顕微鏡で観察する。 インチミン様タンパク質を有する他の細菌の接着に対する抗−インチミン抗体 の効果を評価するため、マウスまたはウサギ抗−インチミン抗血清（または対照 として正常血清）を接着培地に懸濁したＥＨＥＣ細菌に添加し、その細菌−抗血 清混合液をHEp−2細胞の感染に先立って37℃で30分間インキュベートする。 本発明の他の態様は、本明細書およびここに開示される本発明の実施を考慮す ることにより当業者には明らかであろう。本明細書および例は例示するだけのも のであると見なされ、本発明の真の範囲および思想は以下の請求の範囲によって 示されることが意図されている。 Ｄ．インチミンに対するモノクローナル抗体の産生 インチミンに対するモノクローナル抗体を、ＥＨＥＣ（またはインチミン様タ ンパク質を発現する細菌）によるコロニー形成に対する患者の受動防御に用いる 。モノクローナル抗体をマウスの細胞から産生させ、これらの抗体の特異性をヒ トにおいて用いるために変換する。G.Winterら，「人造抗体,」Nature，349:293 -299(1991);P．T．Jonesら，「ヒト抗体における相補性決定領域のマウス由来の ものでの置換,」Nature，321:522-525(1986);P．Carterら，「ヒト癌治療のため の抗−p185HER2抗体のヒト化,」Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:4285-4289(19 92)。モノクローナルAbは患者に投与するためのより「純粋な」抗体を表す。 1．抗−Eae mAbの産生：Harlow，E.およびD．Lane，抗体、実験マニュアル Co ld Spring Harbor，New York(1988)に略述される手順に従う：5匹の4ないし5週 齢雌ＢＡＬＢ／ｃＪマウスを予備採血し、100μｌのタイタマックスに懸濁したR IHisEae 25μｇを腹腔内投与して免疫感作する。2週間隔で2回、100μｌのタイ タマックスに懸濁したRIHisEae 25μｇを腹腔内投与することでマウスを追加免 疫感作する。各追加免疫感作の7日後、血液（約300−500μｌ）を尾の静脈から 採取する。ＥＬＩＳＡにより（上述の通り）抗−RIHisEae抗体の存在について血 清をアッセイする。 高力価の抗−RIHisEae抗体を産生するマウスを、ＰＢＳ 100μｌ中のRIHisEae 25μｇを静脈内および腹腔内の両者で投与することで追加免疫感作し、３日後 に屠殺して血清を回収する。脾臓細胞を単離し、Sp2／0−Agマウスミエローマ細 胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ1581）にミエローマ細胞1個について脾臓細胞10個の割合 で 融合させる。融合した細胞を微量希釈プレートに分配し、培養上清を3−4週間の 培養の後にＥＬＩＳＡによりRIHisEae抗体についてアッセイする。抗−RIHisEae 抗体の産生について陽性の培養物を増大させ、限界希釈により2回クローン化す る。 2．抗−RIHisEae mAbが立体配置的エピトープを認識するのか、または直線状 エピトープを認識するのかの決定：mAbの反応性を、1）天然RIHisEaeを吸着剤と して用いるＥＬＩＳＡ；および2）変性させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したRIHis Eaeの免疫ブロットによって比較する。mAbの幾つかのプールを得る：1）立体配 置的なエピトープのみを認識し、かつＥＬＩＳＡでは陽性反応を示すが免疫ブロ ット分析では示さないもの；2）直線状エピトープを認識し、かつ両アッセイに おいて反応するもの；および3）直線状エピトープを認識し、かつ免疫ブロット 分析では陽性反応を示すがＥＬＩＳＡでは示さないもの。加えて、非溶解細胞の コロニー免疫ブロットを行い、mAbが野生型86−24株の表面上に発現するEaeを認 識するかどうかを決定する。 HEp−2細胞への86−24株の接着を遮断する能力についての抗−Eae mAbの試験 ：86−24株をHEp−2細胞に関する定量的接着性アッセイに処し、並行して、抗− RIHisEae mAbの様々な希釈液と予備インキュベートした細菌を用いて試験する。 選択された接着遮断性の立体配置的mAbをアイソタイプ決定（イムノピュアmAb タイピングキット、ピアス、ロックフォード、Ill.）に処す。その後、独自の抗 体を、プロテインＧセファロースカラム（ファルマシア、ピスカタウェイ、N．J .）でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。得られたアフィ ニティー精製mAbをHEp−2細胞への86−24株の接着を遮断する能力について再試 験し、その抗体が精製後に機能的なままであることを確かなものとする。 実施例Ｘ インチミンを発現させるための、様々な植物のアグロバクテリウム・ツメファシ ンス介在形質転換。 植物を形質転換してインチミンまたはインチミンの機能的部分を発現させ、患 者に摂取させる。当業者が認めるように、インチミンは実施例Iに説明するよう にhis−タグ付けされていてもいなくてもよい。加えて、このインチミンは、イ ンチミンおよび免疫応答の誘発が望まれる1以上の抗原を含む融合タンパク質で あってもよい。（実施例VIIを参照。） あらゆる植物組織を本発明のベクターで形質転換することができる。本明細書 中で用いる「器官形成」という用語は、シュートおよび根が成長点中心から連続 的に発生するプロセスを意味する；本明細書中で用いる「体細胞性胚形成」とい う用語は、シュートおよび根が（連続的にではなく）協調的に一緒に発生するプ ロセスを意味する。例示的な組織標的には、葉ディスク、花粉、胚、体細胞胚、 子葉、胚軸、雌性配偶体、カルス組織、既存の成長点組織（例えば、頂端分裂組 織、腋芽、および根成長点）ならびに誘導された成長点組織（例えば、子葉成長 点および胚軸成長点）が含まれる。 A．eae遺伝子を含むプラスミドの構築 この例ではベクター、pKYLX71S2（図17）を用いる。このベクターはケンタッ キー州レキシントン、ケンタッキー大学作物学部（Dep．of Crop Science）のDa vid Huntから得られるが、当業者は他の利用可能なベクターを使用もしくは構築 できることを認めるであろう。このベクターは、カナマイシンin vivo選択可能 マーカー遺伝子（NPTII）を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスバイナ リーベクターである。バイナリーベクター系は2つのプラスミドを含む。腫瘍誘 発性（Ti）プラスミドは、複数のクローニング領域に所望のコーディング領域が 挿入されているＤＮＡ（t−ＤＮＡ）を含む。他方のプラスミドは、t−ＤＮＡが 植物細胞に侵入してそのゲノムに組み込まれることを可能にする毒性遺伝子であ るvir遺伝子を含む。pKYLX71S2ベクターは所望のコーディング配列を倍加増強カ リフラワーモザイクウイルス35S（CaMV 35S、または単に35S）プロモーターの制 御下に配置する。この場合、倍加増強プロモーターは縦に並んだ2つのリボソー ムプロモーターである。 アグロバクテリウムベクターは外来性遺伝子を様々な植物種に導入するのに有 用であり、特には、双子葉植物の形質転換に有用である。様々なアグロバクテリ ウムベクターが公知である。例えば、Andersonの米国特許第4,536,475号、Schl iperoortらの米国特許第4,693,977号；Sederoffらの米国特許第4,886,937号；T ．Hallら、ＥＰＯ出願第01222791号；R．Fraleyら，Proc．Natl．Acad．Sci．US A 84，4803(1983);L．Herrera-Estrellaら，ＥＭＢＯ J．2，987(1987);G．Helm erら，Bio/Technology 2，5201(1984);N．Muraiら，Science 222，476(1983)を 参照のこと。 当業者に公知の組換え技術を用いて（上記実施例Iに説明するように得られる ）his−eae遺伝子をベクターpKYLX71S2に連結し、植物形質転換ベクターpINT（ 図17）を作製する。 （上記実施例Iに説明するように得られる）his−eae遺伝子をベクタ−pKYLX71 S2に連結し、ＤＮＡ構築物pINT（図17）を作製する。このような異種ＤＮＡを含 むベクターは当業者に周知の組換え技術を用いて構築することができる。例えば 、ＱＩＡＧＥＮＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ、チャッツワース、ＣＡ）を用 いて（上記実施例Iに説明するように）pEB313からＤＮＡを調製する。pEB313をX holおよびNheIで消化することによりhis−eae遺伝子を単離し、アガロースゲル で分離した後3174bpのeae含有バンドをカミソリで切り出す。ジーンクリーン（ バイオ101、ラヨラ）を用いてアガロースから精製ＤＮＡを抽出し、XhoIおよびX baIで消化したpKYLX71S2に連結する。連結したプラスミドでDH5αF’Tn5lacIQを 形質転換し、形質転換体を適切な制限酵素で消化することにより挿入ＤＮＡの存 在を立証する。実施例Iも参照のこと。公的に利用可能なあらゆるアグロバクテ リウム・ツメファシエンス株を用いることができるが、LBA4404、GV3805またはE HA105株（インディアナ州ウェスト・ラフェイエット、パードュー大学（Purdue University）のStanley Gelvinから入手可能）が好ましい。カルシウム−塩素イ オン、次いで凍結−解凍形質転換、電気穿孔法または当該技術分野に公知の他の 方法を用いて、pINTプラスミドをＡ．ツメファシエンスに移入する。例えば、Ha nahan，D.，J．Mol．Biol．166:577-80(1983)を参照のこと。 Ｂ．タバコの形質転換 タバコはごく一般的に植物の形質転換のモデルとして用いられる。多くの経験 的な研究によって確認されている一般的な仮定は、導入遺伝子がタバコにおいて 発現する場合には、それは他の双子葉植物においても発現するであろうというも のである。タバコが食用植物ではないことは認めるが、組換えインチミンがタバ コにおいて産生される場合、それはアブラナのような食用植物において発現可能 である。 タバコ（ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum））の栽培品種「キサン チ（Xanthi）」を、標準的かつ効率的な感染プロトコル（Schardlら，Gene 61:1 -11(1987)）を用いるアグロバクテリウム介在形質転換により形質転換する。簡 単に述べると、直径5cmのタバコの葉ディスクを傷つけ、pINTを含むアグロバク テリウム・ツメファシエンスに晒す。組織培養において、器官形成法を用い、カ ナマイシン選別（200mg／L）の下で植物を再生する。 200枚のタバコの0.5cm葉ディスクをpINTを含むアグロバクテリウム・ツメファ シエンスに晒す。組織培養および植物再生条件はSchardlら1987に従う。200mg／ Lカナマイシン選別およびアグロバクテリウムを殺すための400mg／Lチメンチン （Timentin）の下で、傷つけた葉ディスクからシュートを直接形成する。この系 は非常に効率的で漏れがない（非トランスジェニック「野生化植物」は非常に希 である）。この実験から375のシュートを作製し、そのうちの120をホルモン非含 有培地への根付けのために任意に選択する。全ての植物は形態学的に正常であり 、繁殖性を有している。これらの結果は、この系を用いる典型的な形質転換能力 内に入る。この高い形質転換頻度および植物が健常であるという事実は、インチ ミンが非毒性であり、その投与が正常な植物の発達および機能を妨げないことを 示す。 his−eaeが植物に安定に組み込まれることを決定するため、サザン（ＤＮＡ） ブロット分析（Stewartら，Plant Physiol．112:121-129(1996);Stewart，C．N. ，Jr.およびVia，L．E.，Biotechniques 13:748-751(1993)、その他）、ＰＣＲ 分析（Stewartら，Plant Physiol．112:121-129(1996)）およびウェスタン（タ ンパク質）ブロット分析（Stewartら，Plant Physiol．112:121-129(1996)）に ついて公知の方法に従って葉の組織を処理する。サザンブロット分析は葉の組織 のＤＮＡにおけるeae遺伝子の存在を立証するために行う。ＰＣＲ分析も同様にe ae遺伝子の存在を確認するために行う。用いられるプライマーには上記実施例I 、パートＤにおいて述べられたものが含まれ得る。例えば、プライマーＭＷ1（ ＝ 5’ ＧＴＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＴＴＧＣＡＡＡＴＧＧＴ G3’）お よびＭＷ2（＝5’ＧＴＡＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＴＣＡＡＴＧＡＡＧＡＣＧＴＴＡ ＴＡＧ 3’）を用いる推定eae含有植物ＤＮＡのＰＣＲ増幅により、アガロース ゲルでの分離で、予想される734bpのバンドが生じる。ウェスタンブロット分析 は葉内部でのhis−インチミンの発現レべルを決定するために行う。his−インチ ミンの発現が全植物タンパク質の0.1％を超えたら、一工程ニッケルカラム精製 （Stolzら，Plant Journal 6:225-233(1994)）を用いてhis−インチミンタンパ ク質を単離する。実施例IIの精製方法は代替法である。his−インチミンを実施 例IIIに示す接着性アッセイに処して機能的な結合を立証する。 抽出物の調製 推定トランスジェニックタバコ植物から以下のようにしてタンパク質抽出物を 回収する：500μｌの抽出バッフア（20mlの0.5ＭトリスHCl pH8.0、4mlの0.5Ｍ ＥＤＴＡ pH8.0、36mlのグリセロール、20mlのβ−メルカプトエタノール）また は500μｌのリン酸バッファ（50ｍＭ Na−リン酸pH7.8、300ｍＭ NaCl）を0.2g の葉組織に加え、この混合物を氷上でホモジナイズした後、微量遠心管において パルス回転することにより清澄化する。その上清を回収し、新鮮なエッペンドル フ管に入れて−70℃で保存する。タンパク質抽出物を、上記実施例IXに説明する モノクローナルまたはポリクローナル抗−インチミン抗体のいずれかを用いて、 Stewartら，Plant Physiol．112:121．129(1996)に記述されるウェスタンブロッ ト分析により試験する。 his−インチミンの発現がeaeの高アデニン（Ａ）／チミン（Ｔ）含量によって 妨げられる場合には、その遺伝子を本明細書に参考として援用するAdangら（Ada ngら、1993）に略述される方法を用いて再構築する。簡単に述べると、pINTに含 まれるeaeのセグメントについて、そのヌクレオチド配列を分析してインチミン 断片の各アミノ酸を指定するコドンを決定する。遺伝暗号の重複性を利用して、 コドンを、そのコドンによって指定されるアミノ酸を変更することなくＡまたは ＴがＣまたはＧに置き換わるように書き換える；これにより、例えば細菌由来の 、異種ＤＮＡのコドンが植物細胞における発現に好ましいコドンに置き換わる。 用いられる植物種のコドン優先度に従って好ましい置換を選択する。例えば、 Murray，E．E.ら，Nucleic Acids Res．17(2):477-498（1989）；Dinesh-Kumar ，S．P.およびMiller，W．A.，Plant Cell 5(6):679-692(1993);Kumar，P．A． およびSharma，R．P.，J．Plant Chemistry and Plant Biotechnol．４(2):113- 115(1995)を参照のこと。 この合成遺伝子配列を200−300bpの領域に分割し、各領域についてオリゴヌク レオチドを合成する。オリゴヌクレオチドはアラバマ州ハンツビルのリサーチ・ ジェネティクス（Research Genetics）によって合成される。他の多くの商用実 験施設においてこれらのオリゴヌクレオチドを合成できることを当業者は認める であろう。これらのオリゴヌクレオチドをAdangらPlant Mol．Biol．21:1131-11 45(1993)に説明される方法に従って連結し、再構築した遺伝子をpKYLX71S2に挿 入する。得られたプラスミドpINTrecCAを用いて、好ましいアグロバクテリウム ・ツメファシエンスLBA4404、GV3850またはEHA105株のいずれか１つを形質転換 する。上に説明するように、タバコを形質転換して発現産物を分析する。 Ｃ．他の植物の形質転換 タバコは食用ではなく、したがって、安全に使用するために、タバコ植物にお いて発現したインチミンは精製してアルカロイドを除去しなければならない。患 者の通常の食事の一部であり、かつ容易に加工される植物が好ましい。例として 、限定しようとするものではないが、ウシ、ブタ、およびヒツジについては、ア ブラナ（Stewartら、合成バシラス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensi s）Cryla（c）遺伝子を含むトランスジェニックアブラナ、ブラシカ・ナプスＬ ．（アブラナ科）における昆虫の制御および用量効果（Stewartら，Plant Physi ol．112:115-120(1996)）またはアルファルファ（Thomasら，Plant Cell Rep．1 4:31-36(1994)）のいずれかを形質転換してインチミンまたはインチミン融合タ ンパク質を発現させることができる。ヒトについては、アブラナまたはニンジン （Drogeら、1992）を形質転換することができる。 患者はインチミン含有植物または植物のインチミン含有部分を摂取するべきで ある。摂取される部分は植物の葉、根、果実、液果、種子、塊茎、球茎、花部、 茎等、またはそれらの組み合わせであり得る。また、摂取される部分は、植物の 派生物、例えば、微粉末、粗挽き粉、スラリー、浸出液、ペースト、ジュース、 粉末、ケーク、ペレットとして植物から抽出することもできる。さらに、摂取さ れる部分は、当該技術分野において一般に知られる技術に従って複合供給原料ま たは食材に含めることができる。 Haqら，Science，268:714-716，1995では、ＥＴＥＣ熱不安定性エンテロトキ シンのＢサブユニットをコードする遺伝子（ＬＴ−Ｂ）またはミクロソーム滞留 配列を有するこの遺伝子（ＳＥＫＤＥＬ）を用いてトランスジェニックタバコお よびジャガイモ植物が作製されている。これらの植物の両者は融合タンパク質を 発現し、これらは天然リガンドを結合するオリゴマーを形成した。ＬＴ−Ｂ−Ｓ ＥＫＤＥＬを発現するタバコの葉の粗製可溶性抽出物をマウスに経管給餌すると 、それらは血清および腸粘膜抗−ＬＴ−Ｂ免疫グロビンを産生し、これは細胞防 御アッセイにおいてエンテロトキシンを中和した。ＬＴ−Ｂ−ＳＥＫＤＥＬを発 現するジャガイモの塊茎を給餌したマウスもＬＴ−Ｂに特異的な血清および腸粘 膜免疫を生じた。 本発明の実施において用いることができる植物には、タバコ（ニコチアナ・タ バクム）、ジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム（Solanum tuberosum））、ダイ ズ（グリシネ・マックス（glycine max））、ヒマワリ、落花生（アラキス・ヒ ポガエ（Arachis hypogaea））、綿（ゴスシピウム・ヒルスツム（Gossypium hi rsutum））、サツマイモ（イポモエ・バタツス（Ipomoea batatus））、カッサ バ（マニホト・エスクレンタ（Manihot esculenta））、コーヒー（コーヒー種 ）、ココナツ（ココス・ヌシフェラ（Cocos nucifera））、パイナップル（アナ ナス・コモスス（Ananas comosus））、柑橘類（シトルス（Citrus）種）、カカ オ（テオブロマ・カカオ（Theobroma cacao））、チャ（カメリア・シネンシス （Camellia sinensis））、バナナ（ムサ（Musa）種）、アボカド（ペルセア・ アメリカナ（Persea americana））、イチジク（フィクス・カシカ（Ficus casi ca））、グアヴア（シジウム・グアジャバ（Psidium guajava））、マンゴー（ マンギフェラ・インディカ（Mangifera indica））、オリーブ（オレア・エウロ パエ（Olea europaea））、パパイア（カリカ・パパヤ（Carica papaya））、カ シュー（アナカルジウム・オクシデンタレ（Anacardium occidentale））、マカ デミア（マカダミア・インテグリフォリア（Macadami a integrifolia））、アーモンド（プルヌス・アミグダルス（Prunus amygdalus ））、サトウダイコン（ベタ・ブルガリス（Beta vulgaris））、トウモロコシ （ゼア・マイス（Zea mays））、コムギ、カラスムギ、ライムギ、オオムギ、イ ネ、野菜、観賞用植物、および針葉樹が含まれるが、これらに限定されない。野 菜には、トマト（リコペルシコン・エスクレンツム（Lycopersicon esculentum ））、レタス（例えば、ラクツエア・サティバ（Lactuea sativa））、グリーン ビーンズ（ファセオルス・ブルガリス（Phaseolus vulgaris））、リラマメ（フ ァセオルス・リメンシス（Phaseolus limensis））、エンドウマメ（ピスム（Pi sum）種）ならびにククミス（Cucumis）属の一員、例えばキュウリ（C．サチブ ス（C．sativus））、カンタロープ（C．カンタルペンシス（C．cantalupensis ））、およびマスクメロン（C．メロ（C．melo））が含まれる。観賞用植物には 、アザレア（ロドデンドロン（Rhododendron）種）、アジサイ（マクロフィルラ ・ヒドランゲ（Macrophylla hydrangea））、ハイビスカス（ヒビスクス・ロサ サネンシス（Hibiscus rosasanensis））、バラ（ロサ（Rosa）種）、チューリ ップ（ツリパ（Tulipa）種）、スイセン（ナルシッサス（Narcissus）種）、ペ チュニア（ペツニア・ヒブリダ（Petunia hybrida））、カーネーション（ジア ンツス・カリオフィルス（dianthus caryophyllus））、ポインセチア（エウホ ルビア・プルケリマ（Euphorbia pulcherima）およびキクが含まれる。本発明を 実施するために用いることができる裸子植物には針葉樹が含まれ、これにはマツ 、例えば、テーダマツ（ピヌス・タエダ（Pinus taeda））、ベイマツ（シュー ドツガ・メンジエシイ（Pseudotsuga menziesii））；ウェスタンヘムロック（W estern hemlock）（ツガ・カナデンシス（Tsuga canadensis））；シトカ・スプ ルース（Sitka spruce）（ピセア・グラウカ（Picea glauca））；およびアメリ カスギ（セコイア・セムペルビレンス（Sequoia sempervirens））が含まれる。 実施例XI 様々な植物、例えば、トウモロコシ、コムギ、およびイネ等の単子葉植物の遺伝 子銃介在形質転換 植物を形質転換してインチミンまたはインチミン融合タンパク質を発現させる 別の方法が提供される。実施例IXに説明するプラスミド、pINTを微小発射物（微 粒子）上にコートする。具体的には、１μｇのpINTを直径1ミクロンの金微粒子 （シルバニア（Sylvania）から得られるバイオラッド・ラボラトリーズ（Biorad Laboratories）タングステン粒子を用いることもできる）10mg上にコートする 。次に、108細胞のアグロバクテリウム・ツメファシエンス5μｌをpINTでコート された微小発射物上に上塗りする。この二重コート微小発射物1mgを製造元（バ イオラッド・ラボラトリーズ）に従ってＰＤＳ 1000−He銃に装填する。 この二重コート微小発射物を未成熟子葉から得たダイズ胚1gに1000psiで打ち込 む。打ち込まれた胚を、組織培養において、カナマイシン（200mg/L）の選別下 で増殖させる。それらを成熟させて発芽させ、動物、例えばブタに給餌する。 同じ方法をバナナの形質転換に用いることができる。また、上記方法は、アグ ロバクテリウム・ツメファシエンスを添加する工程なしで達成することもできる 。 eae遺伝子または所望の遺伝子領域の再構築は実施例IXに説明する通りに達成 することができる。 実施例XII キメラウイルス粒子（ＣＶＰ）融合タンパク質としてのインチミンの発現 植物を形質転換してインチミンを発現させる別の方法は、組換え植物ウイルス を用いることによるものである。この方法は安価な経ロワクチンの迅速な開発お よび送達に好ましい。インチミンもしくはインチミン様タンパク質、またはそれ らの一部、またはそれらの組換え融合タンパク質は、植物組換えウイルス感染お よび発現系、例えば、Dalsgaardおよび共同研究者によって記述されるもの（Dal sgaardら，Nature Biotechnology，15:248-252(1997)、その開示は本明細書に参 考として援用する）さらにArntzenによって記述されるもの（Nature Biotechnol ogy，15:221-222(1997)、その開示は本明細書に参考として援用する）を用いて 発現させることができる。好ましい態様においては、インチミンもしくはインチ ミン様タンパク質、またはそれらの一部、またはそれらの組換え融合タンパク質 をコードするＤＮＡを、それらの被覆タンパク質をコードする遺伝子に組 換えにより挿入し、および、任意に、その被覆タンパク質を有する融合タンパク 質として発現させる。好ましくは、このインチミンもしくはインチミン様タンパ ク質、またはそれらの一部、またはそれらの融合タンパク質は抗原性である。そ の後、得られた組換えウイルスゲノムを植物、植物の一部、植物細胞または植物 抽出物において増殖させ、インチミンもしくはインチミン様タンパク質、または それらの一部、または組換え融合タンパク質の発現を生じさせる。このようにし てウイルスベクターによって産生されたインチミンもしくはインチミン様タンパ ク質、それらの一部、または組換え融合タンパク質を摂取させ、抽出し、富化し 、精製し、または他の方法で本明細書の他所に開示される方法に適用することが できる。 実施例XIII 通常はHis−インチミンを発現しない他の細菌種におけるHis−インチミンの発現 インチミンもしくはインチミン様タンパク質、それらの一部、または組換えイ ンチミン融合タンパク質を宿主細菌において発現させ、その宿主細菌をワクチン として投与することができる。例えば、Su．G-F.らMicrobial Pathogenesis 13: 465（1992）（その材料および方法の部分は参考として本明細書に援用する）は 大腸菌ヘモリシンＡ（HlyA）の23kDa C末端に融合した志賀毒素Ｂサブユニット を示しており、これは、次に、サルモネラ菌aroA（SL3261）の弱毒化坦体株から それを搬出するために用いられた。この遺伝子融合体の発現は構造的制御の下ま たは鉄調節プロモーターの制御の下でのものであった。このハイブリッド株を用 いるマウスの経口および腹腔内免疫感作の結果、有意のＢ−サブユニット特異的 粘膜および血清Ab応答が生じた。細胞質での発現および抗原坦体株からの細胞外 搬出の両者が、抗原特異的免疫応答を生じることが示された。 加えて、Pozzi，G.らInfect．Immun．60:1902（1992）（その開示は参考とし て本明細書に援用する）は、外来抗原が化膿連鎖球菌に由来する原線維Ｍタンパ ク質のＣ末端接着モチーフに融合する系を示す。この融合タンパク質はＳ．ゴル ドニイ（S．gordonii）、口腔内の共生生物、の表面に発現する。この研究にお いては、16型ヒトパピローマウイルスのE7タンパク質が外来抗原として選択され 、原線維Ｍタンパク質に融合された。マウスの皮下に感染させた。Ｓ．ゴルドニ イの表面上に発現したＭ−Ｅ7融合タンパク質は、感染マウスからプールした血 清を用いるウェスタンブロット分析によって示されるように、マウスにおいてこ の融合タンパク質の両局面について免疫原性であることが示された。 加えて、Schafer，R.らJ．Immunol．149:53（1992）（その材料および方法の 部分は参考として本明細書に援用する）は、大腸菌β−ガラクトシダーゼを発現 するリステリア菌（外来抗原）を生ワクチンベクターとして用いることを示した 。ＢＡＬＢ／ｃマウスを経口または腹腔内により免疫感作した。経口投与の1週 間後、または経口投与もしくは腹腔注射の5週間後（４週目に追加免疫感作）に 採取した脾臓細胞は、β−ガラクトシダーゼ特異的細胞毒性Ｔリンパ球応答を示 した。腹腔内または静脈内投与によって免疫感作したマウスからの個々の血清サ ンプルを抗−β−ガラクトシダーゼ抗体について試験した；約11％がこれらの抗 体に対する陽性力価を有していた。これらの結果は、この種での経口および非経 口免疫感作の両方が、外来タンパク質に対する細胞性免疫応答が生じることを示 す。 Suらの方法による本発明の実施の例をここに示す。この例においては、eae（ またはhis−eae）をエアロバクチンプロモーターの制御下に配置し、所望のタン パク質を細胞外に送り出す23C末端へモリシンＡ（HlyA）シグナルドメインをコ ードするＤＮＡ断片に融合する。エアロバクチンプロモーターを腸粘膜環境にお いて認められる条件である鉄制限下で活性化する。これはin vivoでの遺伝子の 発現を促進する。このような発現の促進に用いられるプラスミドは中程度コピー pBR322ベースのプラスミドであり、これはpUC18のような高コピープラスミドよ りも高い程度の免疫を付与する。外来タンパク質を発現させるための細菌宿主は サルモネラ菌aroA SL3261 pLG575株、腸内病原体の弱毒化誘導物（Suらに記述さ れるように、ドイツ、ブラウンシュベッヒ（Braunschweig）Ｄ−3300、ＧＢＦ− 国立バイオテクノロジー研究センター（ＧＢＦ-National Research Centre for Biotechnology）微生物学部門のKenneth Timmisから入手可能）である。この株 は、インチミン−HlyAタンパク質の搬出に必要なhlyBおよびhlyD遺伝子をコード するプラスミドpLG575も含む。 簡単に述べると、（図18）BamHI StxB断片をプラスミドpSU204（ドイツ、ブラ ウンシュベッヒＤ−3300、ＧＢＦ−国立バイオテクノロジー研究センター微生物 学部門のKenneth Timmisから入手可能、上記参考文献）から脱落させてpSU2004 を作製する。インチミンまたはインチミン融合タンパク質をコードするBamHI Ｄ ＮＡ断片を、ＰＣＲにより、そのコーディング領域がpSU2004に含まれるエアロ バクチンプロモータ一およびhlyAコーディング領域の両者を伴う正しいリーディ ングフレーム内に配置されるように構築する。このBamHI eae断片をpSU2004に連 結し、pAero−Eaeを生じさせる。このプラスミドで、Hanahan，D．J.，Mol．Bio l．166:577-580(1983)の方法に従い、制限陰性修飾陽性（restriction-negative modification-positive）サルモネラ菌SL5283株（Kenneth Timmisから入手可能 ）を形質転換する。この工程はpAero-Eae ＤＮＡをメチル化により修飾し、この 株から精製されたプラスミドＤＮＡはサルモネラ菌aroA SL3261 pLG575株をより 効率的に形質転換する。メチル化pAero-Eae ＤＮＡで、Hanahan，D．J.，Mol．B iol．166:577-580(1983)の方法によりサルモネラ菌aroA SL3261 pLG575株を形質 転換する。 ８ないし10週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにこの免疫原性細菌宿主を以下のように 給餌する。細菌を100μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢブロス中で37℃で一晩 増殖させ、１：50の希釈率で新鮮な培地に接種してＯＤ600＝0.3まで増殖させる 。次に、プロモーターを２，２’−ビピリジル（最終濃度100μＭ）を３時間用 いて誘発する。この培養物を洗浄して給餌用にＰＢＳに再懸濁する。 1010ＣＦＵの細菌を、４日間隔で一回用量を２回、給餌管の助けを借りて給餌 す、る。初回給餌の21日後、追加免疫感作注射を施す。マウスを1週間後に屠殺し 、これらは粘膜性および体液性の免疫応答を示す。 本発明の他の態様は、本明細書およびここに開示される本発明の実施を考慮す ることにより当業者には明らかであろう。本明細書および例は例示のためのみの ものであると見なされ、本発明の真の範囲および思想は以下の請求の範囲によっ て示されるものであることが意図されている。
【手続補正書】 【提出日】平成１０年１２月２５日（１９９８．１２．２５） 【補正内容】 （別紙） (1)明細書 ２ページ１０行目 Mecrobiol．53:2394(1987) を、 Microbiol．53:2394(1987) に補正する。 (2)明細書２３ページ７行目 pW4−EaeのＮ末端側… を、 pMW104−EaeのＮ末端側… に補正する。 (3)明細書２５ページ２６行目 40μｇ／mlのカナマイシンを含むLBブロスに接種する。 を、 40μｇ／mlのカナマイシンを含むLBブロス11に接種する。 に補正する。 (4)明細書３４ページ６行目 同様の実験が初乳欠乏新生子ウシモデルに… を、 同様の実験が初乳欠乏新生仔ウシモデルに… に補正する。 (5)明細書３４ページ１６行目 eae変異体を給餌された子ウシよりも… を、 eae変異体を給餌された仔ウシよりも… に補正する。 (6)明細書３６ページ１６行目 この乳を飲む子ウシは… を、 この乳を飲む仔ウシは… に補正する。 (7)明細書３９ページ２７行目 ピロリ菌 を、 ヘリコバクター・ピロリ に補正する。 (8)明細書４１ページ２２行目 の547アミノ酸をコードする）… を、 の547個のアミノ酸をコードする）… に補正する。 【手続補正書】 【提出日】平成１２年３月３０日（２０００．３．３０） 【補正内容】 (1)明細書 ５ページ２５行目 「遺伝子の推定タンパク質配列を示す。」 を、 「遺伝子の推定タンパク質配列（配列番号１９）を示す。」 に補正する。 (2)明細書５ページ２７行目 「配列を示す。」 を、 「配列（配列番号２０）を示す。」 に補正する。 (3)明細書６ページ２行目 「列を示す。」 を、 「列（配列番号２１）を示す。」 に補正する。 (4)明細書６ページ９行目 「発現プラスミド（QIAGEN社）を示す。」 を、 「発現プラスミドpQE-30（配列番号２２）、pQE-31（配列番号２３）、pQE- 32（配列番号２４）（QIAGEN社）を示す。」 に補正する。 (5)明細書６ページ１０行目 「プラスミド（QIAGEN社）（多コピー）を示す。」 を、 「プラスミド（配列番号２５）（QIAGEN社）（多コピー）を示す。」 に補正する。 (6)明細書１６ページ１３行目 「Sn20-CGTTGTTAAGTCAATGGAAAC、5 ’プライマー」 を、 「Sn20-CGTTGTTAAGTCAATGGAAAC（配列番号１）、5 ’プライマー」 に補正する。 (7)明細書１６ページ１６行目 「GAGAAAACGTGAATGTTGTCTCT、3 ’プライマー」 を、 「GAGAAAACGTGAATGTTGTCTCT（配列番号２）、3 ’プライマー」 に補正する。 (8)明細書１８ページ８行目 「GATGGTTTTCCAGCCAATCAGTGAG 3’およびInv3」 を、 「GATGGTTTTCCAGCCAATCAGTGAG 3’（配列番号３）およびInv3」 に補正する。 (9)明細書１８ページ９行目 「CACAGAGCGGG 3’）を」 を、 「CACAGAGCGGG 3’（配列番号４）を」 に補正する。 (10)明細書１８ページ２０行目 「GAATGTTCATGGCTGGGG 3’）およびInv3」 を、 「GAATGTTCATGGCTGGGG 3’（配列番号５））およびInv3」 に補正する。 (11)明細書１８ページ２１行目 「AGCGGG 3’）を」 を、 「AGCGGG 3’（配列番号４））を」 に補正する。 (12)明細書２２ページ２６行目 「GGTG 3’；MW2（3’PCRプライマー）」 を、 「GGTG3’（配列番号６）；W2（3’PCRプライマー）」 に補正する。 (13)明細書２２ページ２７行目 「TAG 3’；」 を、 「TAG 3’（配列番号７）；」 に補正する。 (14)明細書２３ページ１行目 「3’；MW4（3’ＰＣＲプライマー）」 を、 「3’（配列番号８）；MW4（3’ＰＣＲプライマー）」 に補正する。 (15)明細書2３ページ２行目 「3’）；」 を、 「3’（配列番号９））；」 に補正する。 (16)明細書２３ページ５行目 「CTGATCAAACCAAGGCCAGCATTAC 3’；MW6(3’PCRプライマー)」 を、 「CTGATCAAACCAAGGCCAGCATTAC 3’（配列番号１０）；MW6(3’PCRプライマ ー)」 に補正する。 (17)明細書２３ページ６行目 「ACCTTATTCTACACAAACCGCATAG 3’）；」 を、 「ACCTTATTCTACACAAACCGCATAG 3’（配列番号１１）；」 に補正する。 (18)明細書２３ページ１５行目 「g 3’；MW6)；」 を、 「g 3’（配列番号１２）；MW6)；」 に補正する。 (19)明細書２３ページ１８行目 「3’；MW6)；」 を、 「3’（配列番号１３）；MW6)；」 に補正する。 (20)明細書２３ページ２１行目 「G3’；MW6)；」 を、 「G3’（配列番号１４）；MW6)；」 に補正する。 (21)明細書２３ページ２４行目 「3’；MW6)；」 を、 「3’（配列番号１５）；MW6)；」 に補正する。 (22)明細書２３ページ２９行目 「GTACCTCCAGAACGCTGCTCACTAG 3’）」； を、 「GTACCTCCAGAACGCTGCTCACTAG 3’（配列番号１６）；」 に補正する。 (23)明細書２４ページ６行目 「3’）。」 を、 「3’（配列番号１７））。」 に補正する。 (24)明細書２５ページ３行目 「“DDDK”（Asp4−Lys）」 を、 「“DDDK”（Asp4−Lys）（配列番号２６）」 に補正する。 (25)明細書２９ページ２９行目 「M1（MM1=ATAACATGAGTACTCATGGTTG；eae構造遺伝子の」 を、 「M1（MM1=ATAACATGAGTACTCATGGTTG（配列番号１８）；eae構造遺伝子の」 に補正する。 (26)明細書３０ページ１行目 「MM2(MM2=TCTAGAGAGAAAACGTGAATGTTGTCTCT)と」 を、 「MM2(MM2=TCTAGAGAGAAAACGTGAATGTTGTCTCT)(配列番号２)と」 に補正する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者 マッキー，マリアン，エル. アメリカ合衆国 22066 ヴァージニア州, グレート フォールズ，ホリー クリーク ドライブ 929 (72)発明者 オブライアン，アリソン，ディー. アメリカ合衆国 20817 メリーランド州, ベゼスダ，シャルロット ロード 5514 (72)発明者 ワッチテル，マリアン，アール. アメリカ合衆国 20879 メリーランド州, ガイサーズベルグ，ウォーカーズ チョイ ス ロード ２番，18705

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．免疫応答を刺激する方法であって、 ａ）インチミン、インチミン様タンパク質、またはその一部をコードするベ クターで植物を形質転換して、該植物がインチミン、インチミン様タンパク質 、またはその一部を発現するようになし、そして ｂ）該植物またはその一部を患者に投与する、 ことを含んでなる方法。 ２．インチミン、インチミン様タンパク質、またはその一部が、該インチミン、 インチミン様タンパク質、またはその一部に組換え的に融合された少なくとも １つの抗原、少なくとも１つの薬物またはそれらの組合せ物をさらに含む、請 求項１に記載の方法。 ３．免疫応答を刺激する方法であって、 ａ）インチミン、インチミン様タンパク質、またはその一部をコードするベ クターで植物を形質転換して、該植物がインチミン、インチミン様タンパク質 、またはその一部を発現するようになし、 ｂ）該植物またはその一部からインチミン、インチミンの一部、またはイン チミン様タンパク質を抽出し、そして ｃ）抽出したインチミン、インチミンの一部、またはインチミン様タンパク 質を患者に投与する、 ことを含んでなる方法。 ４．インチミン、インチミン様タンパク質、またはその一部が、該インチミン、 インチミン様タンパク質、またはその一部に組換え的に融合された少なくとも １つの抗原、少なくとも１つの薬物またはそれらの組合せ物をさらに含む、請 求項３に記載の方法。 ５．投与に先立ってインチミン、インチミンの一部、またはインチミン様タンパ ク質を富化することをさらに含む、請求項３または４に記載の方法。 ６．投与に先立ってインチミン、インチミンの一部、またはインチミン様タンパ ク質を精製することをさらに含む、請求項３または４に記載の方法。 ７．前記植物がEHEC（腸管出血性大腸菌）のインチミンを発現する、請求項１、 ２、３または４に記載の方法。 ８．インチミン、インチミン様タンパク質、またはその一部がヒスチジンタグを さらに含む、請求項１、２、３または４に記載の方法。 ９．前記植物が単子葉植物である、請求項１、２、３または４に記載の方法。 10．前記植物が双子葉植物である、請求項１、２、３または４に記載の方法。 11．前記植物がアルファルファである、請求項１、２、３または４に記載の方法 。 12．前記植物がニンジン、カノーラ、タバコ、バナナおよびジャガイモよりなる 群から選択される、請求項１、２、３または４に記載の方法。 13．前記植物細胞がダイズ、ヒマワリ、落花生、綿、サツマイモ、カッサバ、コ ーヒー、ココナツ、パイナップル、柑橘類、ココヤシ、チャ、アボカド、イチ ジク、グアヴァ、マンゴー、オリーブ、パパイア、カシュー、マカデミア、ア ーモンド、サトウダイコン、トウモロコシ、コムギ、カラスムギ、ライムギ、 オオムギ、イネ、トマト、レタス、インゲン(green bean)、アオイマメ（lima bean）、エンドウマメ、cucumis(キュウリ、メロン)、cantalupensis、マス クメロン、アザレア、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、スイセ ン、ペチュニア、カーネーション、ポインセチア、キクおよびコニファーより なる群から選択される、請求項１、２、３または４に記載の方法。 14．植物におけるインチミン、インチミン様タンパク質、またはその一部をコー ドする異種ＤＮＡの発現をコードしているＤＮＡ構築物。 15．異種ＤＮＡがインチミン、インチミン様タンパク質、またはその一部に組換 え的に融合された少なくとも１つの抗原、少なくとも１つの薬物またはそれら の組合せ物をさらにコードしている、請求項14に記載のＤＮＡ構築物。 16．前記構築物が植物形質転換ベクターである、請求項14または15に記載のＤＮ Ａ構築物。 17．植物形質転換ベクターがアグロバクテリウム(Agrobacterium)ベクターであ る、請求項16に記載のＤＮＡ構築物。 18．植物形質転換ベクターが微粒子である、請求項16に記載のＤＮＡ構築物。 19．植物形質転換ベクターがウイルスベクターである、請求項16に記載のＤＮＡ 構築物。 20．前記ＤＮＡによりコードされるインチミン、インチミン様タンパク質、また はその一部がヒスチジンタグをさらに含む、請求項16に記載のＤＮＡ構築物。 21．異種ＤＮＡのコドンが植物細胞内での発現にとって有利なコドンと置き換え られる、請求項16に記載のＤＮＡ構築物。 22．インチミン、インチミン様タンパク質、またはその一部をコードする異種Ｄ ＮＡをコードしかつ発現する異種ＤＮＡ構築物を含有する植物細胞。 23．異種ＤＮＡがインチミン、インチミン様タンパク質、またはその一部に組換 え的に融合された少なくとも１つの抗原、少なくとも１つの薬物またはそれら の組合せ物をさらにコードしている、請求項22に記載の植物細胞。 24．異種ＤＮＡによりコードされるインチミン、インチミン様タンパク質、また はその一部がヒスチジンタグをさらに含む、請求項22に記載の植物細胞。 25．異種ＤＮＡのコドンが植物細胞内での発現にとって有利なコドンと置き換え られる、請求項22、23または24に記載の植物細胞。 26．再生能のある植物細胞を用意し、該植物細胞を請求項14または15に記載のＤ ＮＡ構築物で形質転換することを含んでなる、トランスジェニック植物細胞の 作出方法。 27．植物細胞に前記ＤＮＡ構築物を移入するアグロバクテリウムベクターを該植 物細胞に感染させることで形質転換を行う、請求項26に記載の方法。 28．前記ＤＮＡ構築物を担持する微粒子を植物細胞に射入することで形質転換を 行う、請求項26に記載の方法。 29．ウイルスベクターを用いて形質転換を行う、請求項26に記載の方法。 30．植物細胞が再生能のある植物組織中にある、請求項26に記載の方法。 31．形質転換した植物細胞からシュートを再生させることをさらに含む、請求項 26に記載の方法。 32．形質転換した植物細胞から根を再生させることをさらに含む、請求項26に記 載の方法。 33．形質転換した植物細胞から植物体を再生させることをさらに含む、請求項26 に記載の方法。 34．前記植物が単子葉植物である、請求項26に記載の方法。 35．前記植物が双子葉植物である、請求項26に記載の方法。 36．前記ＤＮＡによりコードされるインチミン、インチミン様タンパク質、また はその一部がヒスチジンタグをさらに含む、請求項26に記載の方法。
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