JP2000510690A - 哺乳類混合リンパ球受容体、ケモカイン受容体（ｍｍｌｒ―ｃｃｒ） - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規なケモカイン受容体（ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ）をコードするポリヌクレオチド（mmlr-ccrまたはmphg-ccr)を提供するものである。本発明は、受容体活性を調節する分子の検出のためのスクーニング方法を提供する。本発明はまた、精製ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲの産生のための宿主細胞、アンチセンス分子、診断用分子、及び組換え発現ベクター；ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲの抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、及びインヒビター；及びこのポリペプチド、その抗体、アンタゴニスト、及びインヒビターに基づく医薬品組成物及び治療方法を提供する。本発明は更に、感染症、炎症、増殖疾患、固形腫瘍、及び循環器病の検出及び治療のための診断用及び治療用組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳類混合リンパ球受容体、ケモカイン受容体（ＭＭＬＲ-ＣＣＲ）技術分野 本発明は一般に分子生物学の分野に関するものであり、特に新規な２つのケモ カイン受容体のヌクレオチド及びアミノ酸配列に関するものである。本発明は更 に、ここに開示する新規なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の、疾患の診断及 び治療における使用に関するものである。背景技術 ケモカインは、一般に約70〜100アミノ酸からなる長さを有し、分子量8〜11ｋ Ｄで、1〜100ng/mlの範囲で活性な小型のポリペプチドである。ケモカインは初 めに炎症組織から単離、精製され、その生物活性について特徴づけられた。最近 では、ケモカインは、分子クローニング技術を通して発見されてきており、機能 分析と構造分析の両面から特徴づけられている。 各ケモカインは、主として成熟細胞における初めの２つのシステイン残基の間 隔に基づきシステインモチーフの一次構造及び存在の双方を通して近縁関係を有 する。現在、各種ケモカインは２つのファミリー、即ちＣ-Ｘ-Ｃケモカイン(α) 及びＣ-Ｃケモカイン(β)の何れか一方に割り当てられている。例外は存在する が、Ｃ-Ｘ-Ｃケモカインは、好中球及び繊維芽細胞を活性化し、Ｃ-Ｃケモカイ ンは単球／マクロファージ、好塩基球、好酸球、Ｔ細胞他を含むより多様な標的 細胞のグループに作用する。Ｃ-Ｘ-Ｃクラスは、メラノーマ成長刺激活性（ＭＧ ＳＡ）、インターロイキン８（IL-8）及び好中活性化ペプチド２（ＮＡＰ-2）を 含む。Ｃ−Ｃクラスは、ＲＡＮＴＥＳ(Regulated on Activation.Normal T Expr essed and Secreted)、マクロファージ炎症性タンパク質１α及び１β（ＭＩＰ- 1 α及び-1β）、及び単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ-1）を含む。 ＭＣＰ-1は、血小板由来成長因子、腫瘍壊死因子α、リポ多糖類、及び酸化型 低密度リポタンパク質を含むメディエーターに応じて、内皮細胞、平滑筋細胞、 及びマクロファージによって産生される強力で特異的な単球アゴニスト及び化学 誘因物質である。ＭＣＰ-1は、慢性関節リウマチ、肺胞炎、アテローム性動脈硬 化症のような炎症性疾患における組織の単球浸潤、及び動物モデルにおいて腫瘍 の成長の抑制に関与し得る腫瘍のマクロファージ浸潤を媒介することに関与して いる（Charo(1994)Proc Natl Acad Sci 91:2752-2756）。Charo（先述）は、動 脈壁における単球の浸潤は、アテローム性動脈硬化症の開始における重要なイベ ントであり、ＭＣＰ-1、及び他の近縁なタンパク質（ＭＣＰ-2及びＭＣＰ-3：Ｍ ＣＰ-1とそれぞれ６２％及び７３％のアミノ酸の同一性を有する）はヒト骨肉腫 株細胞から精製され、単球に対して特異的な化学誘引性を共有していることを報 告している。 白血球遊走に加えて、Ｃ-Ｃ及びＣ-Ｘ-Ｃケモカインの双方は、急性及び慢性 の炎症性疾患、造血の抑制、血管形成及び繊維増殖の調節において主要な関与者 として関与している(Taub et al(1994)Ther Immunol 1:229-246)。マクロファー ジ炎症性タンパク質１α(ＭＩＰ-α)は、in vitro及びin vivoでの造血幹細胞の 増殖を抑制することが報告されている（Cook J 1996 Leukoc Biol 59:61-66）。 又Gewirtz等（1995;Blood86:2559-2567）は、３つのＣ−Ｃケモカイン、ＭＩＰ- 1α、ＭＩＰ-1β及びc10が、好中球活性化ペプチド−２（ＮＡＰ-2）を等価量投 与した場合、巨核球コロニー形成を特異的に抑制することを報告している。Eave s等（1993 Proc Natl Acad Sci USA 90:12015-12019）は、慢性骨髄白血病（Ｃ ＭＬ）の患者に対して、通常の原始造血細胞の増殖のため、ＭＩＰ−１αを投与 することを示唆している。 ケモカインは、その標的細胞、即ち免疫細胞の細胞表面上の特定の受容体と相 互作用することにより生物学的効果を発揮する。既知のケモカイン受容体は、結 合の後内部移行する基礎的なタンパク質である、Ｇタンパク質と結合する。更に 、この受容体は、一連の細胞内及び細胞外ループにより結合される７つの膜貫通 セグメントを含む構造に適合するべく予測されるアミノ酸配列を示す。Ｃ-Ｘ-Ｃ 及びＣ-Ｃケモカイン受容体は高度に特異的であり、２つの異なるクラスのケモ カイン間の結合についての相互の競合は存在しない。この法則の例外は高いアフ ィニティーをもってＣ-Ｃ及びＣ-Ｘ-Ｃケモカインの双方に結合する赤血球ケモ カイン受容体であり、マラリア寄生虫、三日熱マラリア原虫に対する受容体であ ることが分かってきた。しかし、赤血球ケモカイン受容体を以前に特徴付けられ た受容体とは区別する特徴が存在する。赤血球ケモカイン受容体は結合の後内部 侵入を防ぐ、Ｇタンパク質によって調節されない酸性タンパク質である（Horuk （1994）Trends Pharmacol Sci15:159:165）。 少なくとも２つのC-X-Cケモカイン受容体、ＩＬ８_A及びＩＬ８_Bが、それぞれH olmes等（1991 Science 253:1278-1280）及びMurphy等（1991;Science 253:1280 -1283）によって報告されてきた。３つのＣ-Ｃ受容体型、ＭＩＰ-1 α/ＲＡＮＴ ＥＳ型（ＣＣＲ-1）及びＭＣＰ-1型（ＣＣＲ-2）、及びＣＣＲ-3（初めにマウス の好中球に由来）が報告されている（post等(1995)J Immunol 155:5299-305）。 Charo（先述）は、ＭＩＰ-1α受容体に最も近縁な２つのＭＣＰ-1受容体アイソ フォームのクローニングについて報告している。彼は、ＭＣＰ-1受容体における アミノ酸配列、ＩＦＦＩＩＬＬＴＩＤＲＹＬＡＩＶＨＡＶＦＡＬ(Ｋ/Ｒ)ＡＲＴ ＶＦＧＶの存在についても報告している。この配列は、第３の膜貫通ドメイン及 び第２の細胞内ループに発生し、ロドプシンにおいてＧ結合タンパク質と相互作 用することが 知られている。Charo（先述）は、このドメインがＣ−Ｃケモカインに対する受 容体に共通なＧタンパク質活性化の側面を媒体し得ることを示唆している。 単球／マクロファージ走化性に関係する新規なケモカイン受容体の発見により 、受容体活性の調節因子を識別するための新規なスクリーニング方法の開発の基 礎が得られ、又細胞の異常増殖を伴う炎症、感染症、及び病気に対する診断及び 治療薬の開発の助けとなる。発明の開示 本発明は、ここではＭＭＬＲ-ＣＣＲと表記する、新規なケモカイン受容体に 関するものである。ＭＭＬＲ-ＣＣＲをコードするヌクレオチド配列は、二元配 置の混合性リンパ球（ＭＬＲ）培地の２つから一日に回収された塑性接着単核細 胞から作製されたcDNAライブラリーの配列群のなかから見つけられた。本発明は また、ここではＭＰＨＧ-ＣＣＲと表記する、新規なケモカイン受容体にも関す るものである。ＭＰＨＧ-ＣＣＲは、塑性接着（２時間培養）単核細胞から作製 されたcDNAライブラリーの配列群のなかから見出された。本発明は、例えば、感 染症、炎症、増殖性疾患、腫瘍形成、及び循環器病のような、通常の白血球の機 能が、通常の白血球生成によって、或いはケモカインアゴニストやアンタゴニス トによる不適切な活性化によって動揺する疾病状態の研究、診断、及び治療にお いて、ここに開示する２つのケモカイン受容体のヌクレオチド及びアミノ酸配列 を使用することに関係する。 本発明はまた、（１）適切な培養上清における天然の生物学的リガンド、即ち ケモカイン、及び（２）受容体／リガンド結合を調節し、シグナル伝達イベント を調節することによって受容体の活性化を調節する物質、化合物、または合成薬 物を評価し、選別し、同定するために、ＭＭＬＲ-ＣＣＲ及びＭＰＨＧ-ＣＣＲを 発現する遺伝子組換え宿主細胞や mmlr-ccr及びmphg-ccrを使用することに関するものである。このような遺伝子組 換え宿主細胞は、例えば受容体／リガンド結合を調節できる有機分子またはペプ チドライブラリーを選別するために用いることができる。 本発明は、ＭＭＬＲ-ＣＣＲが、GenBankにgi:472558として開示されている、 ＭＣＰ-1 ＣＣＲ-2ケモカイン受容体、ＭＣＰ-1ＲＢ（Charo前述）と共有するア ミノ酸相同性と、ＭＰＨＧ-ＣＣＲが、Charo（前述）の論文に開示されているＣ -Ｃケモカイン受容体３(g881570)及びＭＣＰ-1ＲＡ受容体（g472556）と共有す るアミノ酸相同性に部分的に基づくものである。特に、ＭＭＬＲ-ＣＣＲは、ケ モカイン受容体の第３の膜貫通ドメイン及び第２の細胞内ループにおいて見出さ れた保存的アミノ酸配列ＩＦＦＩＩＬＬＴＩＤＲＹＬＡＶＶＨＡＶＦＡＬ(Ｋ/Ｒ )ＡＲＴＶＦＧＶを含んでいる。前述のケモカイン受容体の第３の膜貫通ドメイ ン及び第２の細胞内ループは、ロドプシンの対応領域において、Ｇタンパク質結 合に関与していることが知られており、このドメインが、Ｃ-Ｃケモカインの受 容体に共通なＧタンパク質活性化の側面を媒介し得ることを示唆している。Char o（前出）が報告しているように、ＭＭＬＲ-ＣＣＲのＧタンパク質結合ドメイン 内である121番目の位置において保存的アミノ酸置換が一箇所あり、イソロイシ ンがバリンに置き換わっている。 従って、本発明は、単球／マクロファージ浸潤及び走化性及び造血が関係し得 る２つの新規なＣ-Ｃケモカイン受容体ＭＭＬＲ-ＣＣＲ及びＭＰＨＧ-ＣＣＲの 発見に基づくものである。ＭＭＬＲ-ＣＣＲ及びＭＰＨＧ-ＣＣＲ及びそれらをコ ードするヌクレオチド配列及びオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、 その断片や部分やアンチセンス分子は、感染症、炎症、増殖性疾患、腫瘍形成、 及び循環器病が関係するＭＭＬＲ-ＣＣＲの検出や定量、或いはその両方のため の診断方法の基礎を提供する。上 述の疾病には、慢性関節リウマチ；肺胞炎；アテローム性動脈硬化症；（過剰な 炎症反応により特徴付けられる）慢性肉芽腫症；喘息；重症筋無力症、糖尿病、 及び炎症性腸疾患のような自己免疫疾患；毒素ショック症候群；敗血症性ショッ ク；（殺菌力の低下により特徴付けられる）チェディアック−東症候群；細胞の 異常増殖を伴う病気；及び固形腫瘍が含まれる。例えば、ここに開示するＭＭＬ Ｒ-ＣＣＲをコードするmmlr-ccrヌクレオチド配列、及びその断片を、このよう な疾病状態が関係し得るmmlr-ccr核酸の検出のための、バイオプシー用に採取さ れた細胞や組織や体液のハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いることが できる。 mmlr-ccrまたはmphg-ccrヌクレオチド配列の異常レベル、若しくは生物学的サ ンプルにおける転写サイズの異常は、受容体が過剰発現されたか、過小発現され る調節状態の特徴であり得る。ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲをコード するヌクレオチド配列は、ケモカイン受容体をコードする遺伝子における欠失、 変異、または染色体転座のような染色体異常を診断的に検出するために用いられ 得るプローブの基礎を提供する。遺伝子発現は、このような疾病状態において、 またはこの受容体をコードする遺伝子の領域に染色体異常が存在し得るときに変 化し得る。 本発明はまた、ヌクレオチド配列のin vitroまたはin vivoでの産生のための 、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲをコードするヌクレオチド配列を含む 遺伝子組換え宿主細胞及び発現ベクターにも部分的に関連する。 更に、本発明は、疾病状態におけるタンパク質の診断的検出及び定量のために 使用され得るケモカイン受容体のアンタゴニストやインヒビターを取出すスクリ ーニングのため、及び抗体の産生のため、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣ Ｒを使用することにも関連するものである。 受容体のレベルまたは活性を調節し得るペプチドまたは小分子は、炎症のよう な受容体の活性化が関係する疾病状態の治療のための医薬品組成物の基礎となる 。ケモカイン受容体アンチセンス分子を、受容体シグナル伝達を低下させること が好ましいような状態の場合に、細胞表面の受容体の存在をダウンレギュレート するのに用いることができる。別形態では、ケモカイン受容体／リガンド相互作 用のアンタゴニストを、受容体活性化を遮断または低下させる、即ち、浸潤／走 化性をもたらすシグナル伝達、及び様々な二次メッセンジャー媒介細胞イベント を遮断または低下させることが好ましいような疾病や病気において、受容体／リ ガンド結合を遮断するために用いることができる。更に別形態では、mmlr-ccrま たはmphg-ccrセンス分子を、受容体の存在をアップレギュレートするために用い たり、また、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲアゴニストを、走化性及び 他の二次メッセンジャー媒介細胞イベントを増加させることが好ましいような状 態の場合に、受容体の活性化を促進してシグナル伝達イベントを促進するために 用いることができる。このような受容体活性を調節できる分子を、単独で、或い は他の治療薬と組み合わせて、疾病の治療のために投与することができる。 本発明は、更に、ポジティブコントロールとして用いることができる精製受容 体の一つ、及び抗受容体抗体を含む、細胞及び組織におけるＭＭＬＲ-ＣＣＲま たはＭＰＨＧ-ＣＣＲの検出のための診断検査法及びキットを提供する。このよ うな抗体は、タンパク質の発現または欠失体または突然変異体の発現が関与する 任意の疾病状態や病気を検出のための、溶液ベース、膜ベース、組織ベースの技 術において用いることができる。図面の簡単な説明 第１Ａ図〜第１Ｄ図は、ＭＭＬＲ-ＣＣＲのポリヌクレオチド配列（配列番号 ：１）及び予測アミノ酸配列（配列番号：２）を示す。保存配列 ＩＦＦＩＩＬＬＴＩＤＲＹＬＡＶＶＨＡＶＦＡＬ(Ｋ/Ｒ)ＡＲＴＶＦＧＶは、107 番目の残基から始まっている。 第２Ａ図及び第２Ｂ図は、ＭＭＬＲ-ＣＣＲとＭＣＰ-1受容体（Charo前出）と のアミノ酸アライメントを示す。この図と第７図に示す配列は、ＤＮＡＳＴＡＲ ソフトウェアのmultisequence alignment program(ＤＮＡＳＴＡＲ社、Madison WI)を用いて作製した。 第３図は、予測アミノ酸配列に基づくＭＭＬＲ-ＣＣＲの疎水性特性の解析結 果を示す。 第４図は、MacDNAsisにより求められたＭＭＬＲ-ＣＣＲの等電点[pI=9.69]を 示す。 第５図は、プローブとして、ＭＭＬＲ-ＣＣＲをコードするインサイト社クロ ーンNo.478861を用いたノーザンブロット分析の結果を示す。 第6Ａ図〜第6Ｃ図は、ＭＰＨＧ-ＣＣＲのポリヌクレオチド配列（配列番号： ３）及び予測アミノ酸配列（配列番号：４）を示す。 第7Ａ図及び第7Ｂ図は、ＭＰＨＧ-ＣＣＲとＣ-Ｃケモカイン受容体（Ｇ188157 0）とのアミノ酸アライメントを示す。 第８図は、予測アミノ酸配列に基づくＭＭＬＲ-ＣＣＲの疎水性特性の解析結 果を示す。 第９図は、MacDNAsisにより求められたＭＰＨＧ-ＣＣＲの等電点を示す。この 結果から、ＭＰＨＧ-ＣＣＲの等電点[pI]は、7.63であることがわかる。発明の実施の形態 本発明は、ここではＭＭＬＲ-ＣＣＲと表記する、新規なケモカイン受容体に 関するものである。ＭＭＬＲ-ＣＣＲをコードするヌクレオチド配列は、二元配 置の混合性リンパ球（ＭＬＲ）培地の２つから一日に回収された単核細胞から作 製されたcDNAライブラリーの配列群のなかから 初めに見つけられた。本発明はまた、ここではＭＰＨＧ-ＣＣＲと表記する、新 規なケモカイン受容体にも関するものである。ＭＰＨＧ-ＣＣＲは、単核細胞か ら作製されたcDNAライブラリーの配列群のなかから初めに見出された。本発明は 、例えば、感染症、炎症、増殖性疾患、腫瘍形成、及び循環器病のような、通常 の白血球の機能が、通常の白血球生成によって、或いはケモカインアゴニストや アンタゴニストによる不適切な活性化によって動揺する疾病状態の研究、診断、 及び治療において、ここに開示する２つのケモカイン受容体のヌクレオチド及び アミノ酸配列を使用することに関係する。 本発明はまた、（１）適切な培養上清における天然の生物学的リガンド、即ち ケモカイン、及び（２）受容体／リガンド結合を調節し、シグナル伝達イベント を調節することによって受容体の活性化を調節する物質、化合物、または合成薬 物を評価し、選別し、同定するために、ＭＭＬＲ-ＣＣＲ及びＭＰＨＧ-ＣＣＲを 発現する遺伝子組換え宿主細胞やＭＭＬＲ-ＣＣＲ及びＭＰＨＧ-ＣＣＲを使用す ることに関するものである。 本発明は、48時間処理された混合性リンパ球培地の単球、即ち、炎症及び免疫 調節に関連する細胞から作製されたcDNAライブラリーにおける5654個の使用可能 な配列のランダムなサンプルにおけるＭＭＬＲ-ＣＣＲをコードするヌクレオチ ド配列の存在に部分的に基づくものである。ＭＭＬＲ-ＣＣＲのヌクレオチド配 列は、混合性リンパ球反応を受けない単球から作製されたcDNAライブラリーにお ける7749個の使用可能な配列のランダムなサンプルには存在していない。本発明 はまた、混合性リンパ球反応を受けない単球から作製されたcDNAライブラリーに おける7749個の使用可能な配列のランダムなサンプルにおけるＭＰＨＧ-ＣＣＲ をコードするヌクレオチド配列の存在に部分的に基づくものである。ここで使用 されるとき、用語「使用可能な配列」とは、ベク ター、ヌクレオチド反復、コンタミ、及びミトコンドリアＤＮＡを除去した後、 ライブラリーにおけるクローンの総数を意味する。本発明は更に、ＭＭＬＲ-Ｃ ＣＲが既知のＭＣＰ-1ケモカイン受容体、ＭＣＰ-1ＲＢ（GenBankアクセス番号g i:472558）と共有するアミノ酸相同性、及びＧタンパク質結合と関連する保存ア ミノ酸モチーフの損じ亜、及びＭＰＨＧ-ＣＣＲがＣ-Ｃケモカイン受容体３及び ＭＣＰ-1ＲＡと共有するアミノ酸相同性に部分的に基づくものである。 従って、本発明は、２つの新規なＣ-Ｃケモカイン受容体ＭＭＬＲ-ＣＣＲ及び ＭＰＨＧ-ＣＣＲの同定に基づくものであり、これらは、例えば感染症、炎症、 増殖性疾患、腫瘍形成、及び循環器病のような、通常の白血球形成により、また はケモカインアゴニストやアンタゴニストによる不適切な活性化により通常の白 血球の機能が動揺する疾病状態に関係し、また、上述の疾病には、慢性関節リウ マチ；肺胞炎；アテローム性動脈硬化症；(過剰な炎症反応により特徴付けられ る)慢性肉芽腫症；喘息；重症筋無力症、糖尿病、及び炎症性腸疾患のような自 己免疫疾患；毒素ショック症候群；敗血症性ショック；（殺菌力の低下により特 徴付けられる）チェディアックー東症候群；及び腫瘍形成のような細胞の異常増 殖を伴う病気が含まれる。 本明細書において「核酸配列」なる用語は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチ ドまたはポリヌクレオチド配列、及びそのフラグメントまたは一部分の配列を意 味し、且つ、一本鎖または二本鎖でありセンス鎖かアンチセンス鎖の何れかを表 すゲノムの若しくは合成のＤＮＡかＲＮＡを意味する。同様に、本明細書におけ る「アミノ酸配列」とは、ペプチドまたはタンパク質配列、またはその一部分を 意味する。本明細書において、小文字の「mmlr-ccr」または「mphg-ccr」とは核 酸配列を意味し、大文字の「ＭＭＬＲ-ＣＣＲ」及び「ＭＰＨＧ-ＣＣＲ」は、タ ンパク質配列を 意味する。本明細書におけるペプチド核酸配列（ＰＮＡ）とは、分子を、相補的 なＤＮＡまたはＲＮＡと対応するオリゴヌクレオチドより高いアフィニティ及び 特異性をもってハイブリッド形成可能になる中性の「ペプチド様」バックボーン を有する情報分子のクラスを意味する（PerSeptive Biosystems 1-800-899-5858 ）。 本明細書において、ＭＭＬＲ-ＣＣＲ及びＭＰＨＧ-ＣＣＲは、ウシ、ヒツジ、 マウス、ブタ、ウマ、好ましくはヒトを含む任意の種の、天然のものか、天然の 、合成の、半合成の、または組換え体何れかの源に由来するＭＭＬＲ-ＣＣＲ及 びＭＰＨＧ-ＣＣＲをそれぞれ意味する。 本明細書において、「天然（または自然発生）」とは、天然に見出されるアミ ノ酸配列を有するＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲを意味し、「生物学的 に活性」なる用語は、天然ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲの構造的、調 節性の、または生化学的機能を有するＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲを 意味する。本明細書において、「免疫学的活性」とは、天然、組換体、または合 成ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ、またはその任意のオリゴペプチドの 、適当な動物や細胞における特定の免疫応答を誘発し、特定の抗体に結合する能 力として定義される。 本明細書において「誘導体」なる用語は、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-Ｃ ＣＲの化学的修飾を意味する。このような修飾の例には、水素からアルキル基、 アシル基、またはアミノ基への置換がある。ケモカイン受容体誘導体は、天然ケ モカイン受容体の必要不可欠な生物学的特性を保持している。 本明細書において「精製」なる用語は、その天然の環境から取り除かれ、天然 にはそれが結合して存在する少なくとも１つの他の成分から単離または分離され た核酸配列またはアミノ酸配列を有する分子を意味する。 コーディング配列 ヒトmmlr-ccr（配列番号：１）及びヒトmphg-ccrのヌクレオチド配列は、それ ぞれ第1Ａ図〜第1Ｄ図及び第6Ａ図〜第6Ｃ図に示されている。mmlr-ccrの部分的 なコーディング領域は、ＭＭＬＲ細胞から作られたcDNAライブラリー内で、5654 個の使用可能な配列に一個の割合で同定された。mphg-ccrの部分的なコーディン グ領域は、マクロファージから作られたcDNAライブラリー内で、7749個の使用可 能な配列に一個の割合で同定された。ヒトＭＣＰ-1受容体（ＮＣＢＩ ＧＩ 4725 58）を、ＭＭＬＲライブラリー（インサイト社ライブラリーＭＭＬＲ2ＬＴ01） のcDNAに対して比較するＢＬＡＳＴ検索(Basic Local Alignment Search Tool;A ltschul SF(1993)J Mol Evol 36:290-300;Altschul SF et al(1990)J Mol Biol 215:403-410)により、インサイト社クローンNo.478861(mmlr-ccr)及び442279(mp hg-ccr)が同定された。mmlr-ccr及びmphg-ccrの５’ヌクレオチド領域を、ＰＣ Ｒによる延長によって得て、配列決定した。 配列番号：１のヌクレオチド配列は、332個のアミノ酸残基を含むＭＭＬＲ-Ｃ ＣＲアミノ酸配列（配列番号：２）をコードしている。このアミノ酸配列は、配 列番号：２のなかの107番目から128番目の位置に生ずるＩＦＦＩＩＬＬＴＩＤＲ ＹＬＡＶＶＨＡＶＦＡＬ(Ｋ/Ｒ)ＡＲＴＶＦＧＶなるドメインを有する。第３図 に示すように、ＭＭＬＲ-ＣＣＲは、一連の細胞内及び細胞外ループによって連 結された７つの膜貫通セグメントを含む。配列番号：３のヌクレオチド配列は、 344個のアミノ酸残基を有するＭＰＨＧ-ＣＣＲアミノ酸配列（配列番号：４）を コードする。 ＤＮＡ配列決定のための方法は周知であり、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ，Se quenase（商標）のクラノウフラグメント（US Biochemical 社,Cleveland OH)、Ｔａｑポリメラーゼ(Perkin elmer社,Foster City CA）、熱 安定性Ｔ７ポリメラーゼ(Amersham社，Chicago IL)、或いはGibco BRL（Gaither sburg MD）Methods社から市販されているＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システムのよう な組換えポリメラーゼとプルーフリーディングエキソヌクレアーゼとの組み合わ せのような酵素を使用する。対象のＤＮＡ鋳型にアニールされたオリゴヌクレオ チドプライマーからＤＮＡを延長する方法は、一本鎖鋳型及び二本鎖鋳型の両方 に対して開発されてきている。連鎖終了反応の生成物は電気泳動を用いて分離さ れ、それに組み込まれた標識された前駆体を介して検出される。最近の機械化さ た反応調製、配列決定並びに解析における改善によって、１日当たりの決定でき る配列数が増えた。好適にはこの処理は、Hamilton MicroLab2200(Hamilton社,R eno NV)、Peltier Thermal Cycler(PTC200；MJ Reserch社,Watertown MA）並び にABI Catalyst800及び377及び373ＤＮＡシーケンサ(Perkin Elmer，Norwalk C N)のような装置を用いて自動化される。 特定のcDNAライブラリの品質は、cDNAのパイロットスケール分析を実行するこ とにより、さらにはクローン含有ベクター、λ或いはE.coli ＤＮＡ、ミトコン ドリア或いは反復ＤＮＡ、並びに公的データベースに厳密に一致、或いは相同的 に一致するクローンのパーセンテージを調べることにより決定される。 受容体ポリヌクレオチド配列の延長 ポリヌクレオチド配列ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲは、配列番号： １または配列番号：３の各ヌクレオチド配列を用いて、プロモータ及び調節エレ メントのような上流配列を検出するための当業者には周知の様々な方法で延長す ることができる。Gobinda等(1993;PCR Methods Applic 2:318-22）は既知の部位に隣接する未知の配列を検索するために汎用プ ライマーを用いる直接的な方法として「制限部位ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣ Ｒ）」を開示している。ここでは、まずゲノムＤＮＡが、既知の領域に対して特 異的なプライマー及びリンカー配列に対するプライマーの存在下で増幅される。 増幅された配列は、その同じリンカープライマー及び最初のプライマーの内部に 含まれる別の特異的プライマーを用いてＰＣＲの２巡目にかけられる。ＰＣＲの 各回の生成物は、適切なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、逆転写酵素を用 いて配列決定される。 逆ＰＣＲ法は、既知領域に基づく分岐プライマーを用いて配列を増幅、または 延長するために用いることができる（Triglia等（1988）Nucleic Acids Res 16: 8186）。プライマーは、Ｏｌｉｇｏ４．０（National Biosciences社，Plymouth MN）或いは別の適切なプログラムを用いて設計され、長さが２２〜３０ヌクレ オチドで、５０％以上のＧＣ含有率を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配 列にアニールする。この方法ではいくつかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知領 域における適切なフラグメントを生成する。次いでこのフラグメントは分子内ラ イゲーションにより環状にされ、ＰＣＲ鋳型として使用される。 キャプチャＰＣＲ法（Lagerstrom M等（1991）PCR Methods Applic1:111-19） は、ヒト及び酵母菌人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡ内の既知の配列に隣接するＤＮ ＡフラグメントのＰＣＲ増幅をするための方法である。またキャプチャＰＣＲで は、多数の制限酵素の消化及びライゲーションによってＰＣＲ前にＤＮＡ分子の 未知の部分に、組換えられた二本鎖配列を配置する必要がある。 Parker JD等（1991;Nucleic Acids Res 19:3055-60）は、歩行ＰＣＲ、すなわ ち未知の配列の検索ができる標的遺伝子歩行のための方法を 教示している。PromoterFinder(登録商標)、Clontech社(Palo Alto CA)から入手 できる新しいキットでは、ＰＣＲ、入れ子状（nested）プライマー並びにプロモ ータファインダライブラリーを用いて、ゲノムＤＮＡ内を歩行させる。この過程 は、ライブラリーをスクリ−ニングする必要がなく、イントロン／エクソン接合 部を探し出すのに有用である。 別のＰＣＲ方法としては、Guebler等による１９９５年６月７日出願の米国特 許第０８／４８７，１１２号「Improved Method for Obtaining Full Length cDN A Sequences」に開示されたものがあり、この明細書を本明細書と一体に参照され たい。この方法では、ＸＬ−ＰＣＲ（登録商標）（Perkin elmer社,Foster City CA）を用いて、ヌクレオチド配列を増幅、並びにまた延長する。 完全長cDNAをスクリーニングするための好適なライブラリーは、サイズ選択さ れた、より大きなcDNAを含むライブラリーである。またランダムに初回刺激を与 えられた（primed）ライブラリーは、遺伝子の５’及び上流領域を含むより多く の配列を含むという点で好適である。ランダムに初回刺激を与えられたライブラ リーは、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーが完全長cDNAを生成しない場合、特に有用 ある。ゲノムライブラリーは、プロモータ結合領域の５’を延長するために有用 である。 サイズがどのくらいかを分析したり、或いは配列決定やＰＣＲ処理の産物のヌ クレオチド配列を確認するための新しい方法はキャピラリー電気泳動法である。 迅速な配列決定のためのシステムは、Perkin elmer社、Beckman Instruments社 （Fullerton CA）並びに他の企業から入手できる。キャピラリー電気泳動法では 、電気泳動分離のための流動性ポリマー、レーザで活性化される４つの異なる蛍 光色素（各ヌクレオチドに対して１つ）を使用し、ＣＣＤカメラによる放射線の 波長の検出を 行う。出力／光強度は適切なソフトウエア（例えばPerkin elmer社製のGenotype r（登録商標）及びSequence Navigator（登録商標））を用いて電気信号に変換 され、サンプルのロードからコンピュータ解析及び電子データ表示までの全過程 がコンピュータ制御される。キャピラリー電気泳動法は特定のサンプルの限定さ れた量の中に存在するＤＮＡの小片の配列決定に特に適している。この方法によ り３０分間でＭ１３ファージＤＮＡの３５０ｂｐを再現可能な形で配列決定でき たことが報告されている（Ruiz-Martinez MC等（1993）Anal Chem 65:2851-8） 。 発現系 本発明に従って、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ、そのポリペプチド のフラグメント、融合タンパク質或いはその機能的等価物をコードするmmlr-ccr またはmphg-ccrポリヌクレオチド配列を、適切な宿主細胞内でのＭＭＬＲ-ＣＣ ＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲの発現を誘導する組換えＤＮＡ分子を生成するために 用いることができる。遺伝子コードの固有の縮重のために、概ね同一か或いは機 能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列も、ＭＭＬＲ-ＣＣＲま たはＭＰＨＧ-ＣＣＲのクローン化や発現のために用いることができる。当業者 には理解できるように、非自然発生コドンを有するＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰ ＨＧ-ＣＣＲコード化ヌクレオチド配列を生成することは有益であり得る。特定 の原核宿主或いは真核宿主において好適なコドン(Murray E等(1989);Nucleic Ac ids Res 17:)を、例えば、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ発現率を増大 させたり、或いは自然発生配列から生成された転写産物より長い半減期のような 望ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写産物を生成したりするように選択するこ とができる。 また本発明の範囲に含まれるものとして、中程度から最高度の厳密性 の条件の下で、第1Ａ図〜第1Ｄ図または第6Ａ図〜第6Ｃ図のヌクレオチド配列と ハイブリッド形成可能なポリヌクレオチド配列がある。ハイブリダイゼーション 条件は、Berger及びKimmel（1987，Guide to Molecular Cloning Techniques,Me thods in Enzymology,Vol 152,Academic Press,San Diego CA）により教示され 、ここで引用して組み込んでいるように、核酸結合複合体の融点（Ｔｍ）に基づ いており、以下に説明するように、定義された「厳密性」を与える。 「最高度の厳密性」は典型的に約Ｔｍ５℃（プローブのＴｍより５℃下）で発 生し、「高度の厳密性」はＴｍの約５〜１０℃下で発生し、「中程度の現密性」 はＴｍの約１０〜２０℃下で発生し、「低度の現密性」はＴｍの約２０〜２５℃ 下で発生する。当業者には理解できるように、最高度に厳密なハイブリダイゼー ションは、同一のポリヌクレオチド配列を同定、すなわち検出するために用いる ことができるが、一方中程度（或いは低度）に厳密なハイブリダイゼーションは 類似の、すなわち近縁なポリヌクレオチド配列を同定、つまり検出するために用 いられる。本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション」は「核酸の鎖が 塩基対合を介して相補鎖と結合する過程」（Coombe J（1994）Dictionary of Bi otechnology,Stockton Press社，New York)を含む概念である。従って定義によ り、ハイブリダイゼーションは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術で実行さ れるような増幅のプロセスを含むものである。このＰＣＲ技術についてはDieffe nbach CW and GS Dveksler（1995,PCR Primer,a Laboratory Manual,Cold Sprin g Harbor Press社,New york）の論文に記載されており、本明細書と一体に参照 されたい。 本明細書において「欠失」とは、１または２以上のヌクレオチド若しくはアミ ノ酸残基が欠ける、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化として定 義される。 本明細書において「挿入」或いは「付加」とは、天然ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたは ＭＰＨＧ-ＣＣＲに比べて、結果的に１または２以上のヌクレオチド或いはアミ ノ酸残基の加わるようなヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。 本明細書において「置換」とは、１または２以上のヌクレオチド或いはアミノ 酸を異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置換することによって生ずる変化を指 す。 本発明において用いられ得る変異ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲポリ ヌクレオチド配列は、異なるヌクレオチド残基の欠失、挿入並びに置換を含み、 結果的に同一の、または機能的に等価のＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとなる。そのタンパク質も、サイレ ント変化を生ずるアミノ酸残基の欠失、挿入並びに置換を含み、結果的に機能的 に等価な受容体となる。慎重なアミノ酸置換は、受容体の生物学的活性が保持さ れる限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性並びにまた両親 媒性についての類似性に基づいてなされ得る。例えば負に荷電したアミノ酸には アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリジン及 びアルギニンが含まれ、同じ親水値を持つ帯電しない極性頭基を有するアミノ酸 には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、 グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン並びにチロシンが含まれる 。 本発明の範囲に含まれるものとして、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ のアレルがある。ここで用いる「アレル」或いは「アレル配列」とは、ＭＭＬＲ -ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲの別形態である。アレルは突然変異、すなわち核 酸配列の変化に起因し、一般に改変ｍＲＮＡ或いはポリペプチドを生成し、その ｍＲＮＡ或いはポリペプチドの構造或いは機能は変 更される場合もあれば、されない場合もある。遺伝子によっては、アレル形態が ないもの、１つあるもの、或いは多数存在するものがある。アレルを生じる変異 は一般に、アミノ酸の欠失、付加並びに置換に起因する。このタイプの変化はそ れぞれ単独で、或いは他の遺伝子の組み合わせで、与えられた配列内一回または それ以上の回数生じ得る。 本発明のヌクレオチド配列は、限定はしないが遺伝子生成物のクローニング、 プロセッシング並びにまた発現を変化させる変更を含む、様々な目的のＭＭＬＲ -ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲコード配列の変更のために遺伝子を組換えられ得 る。例えば、変異は、当業者には周知の技術、例えば特定部位突然変異誘発を用 いて導入され、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドン選 好の変化等をもたらすことができる。 本発明の別の実施例では、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲの天然、変 異或いは組換え配列が、異種の配列に結合され、融合タンパク質をコードする配 列となる。例えば、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ活性のインヒビター を選び出すべくペプチドライブラリをスクリーニングするために、市販の抗体に より認識される異種のペプチドを発現するキメラケモカイン受容体タンパク質を コード化することが役立つことがある。融合タンパク質はＭＭＬＲ-ＣＣＲまた はＭＰＨＧ-ＣＣＲ配列と異種のタンパク質配列との間の位置に切断部位を包含 するように組換えることもでき、これによってＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ- ＣＣＲを切断して、異種の部分から分けて精製することが可能となる。 本発明の別の実施例では、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲのコード化 配列は、当業者によく知られた化学的方法を用いて、（Caruthers等（1980）Nuc Acids Res Symp Ser 7:215-223、Crea,Horn（1980）Nuc Acids Res 9:2331、Ma tteucci，Caruthers（1980）Tetrahedron Lett 21:719、Chow,Kempe（1981）Nuc Acids Res 9:2807-2817参照）全体的に、或い は部分的に合成することができる。別法では、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ- ＣＣＲアミノ酸配列を、全体的に或いは部分的に合成する化学的方法を用いてタ ンパク質自体を生成することができる。例えばペプチドを固相技術で合成して、 樹脂から切り離し、さらに分離高速液体クロマトグラフィにより精製することが できる（例えばCreighton（1983）Proteins Structure And Molecular Principl es,WH Freeman and Co,New York参照）。合成されたペプチドの構成は、アミノ 酸解析或いは配列決定処理により確認することができる（例えばthe Edmandegra dation procedure;Creighton，上述）。 直接のペプチド合成は、様々な固相技術（Roberge JY等（1995）Science 26 9:202-204）を用いて実行できるが、自動化した合成も、例えば、Applied Biosy stems 431Aペプチド合成器を用いて、製造者により提供される使用説明書に従っ て達成される。さらにＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲのアミノ酸配列、 或いはその任意の部分を、その直接の合成の際に変更したり、また他の細胞内メ ディエータ或いはその任意の部分に由来する配列と化学的方法を用いて結合して 、変異体ポリペプチドを生成することができる。 形質転換体の同定 標識遺伝子発現の存在／不在は、対象の遺伝子も存在することを示唆するが、 その存在及び発現は確認されるべきである。例えばもしmmlr-ccrまたはmphg-ccr が標識遺伝子配列内に挿入されるなら、mmlr-ccrまたはmphg-ccrを含む組換え細 胞が標識遺伝子の機能の存在により同定できる。別法では標識遺伝子は、単一プ ロモータの制御下で受容体配列と直列に配置することができる。誘導または選択 に応じて の標識遺伝子の発現は、通常さらに受容体の発現をも示す。 この他、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲのコード化配列を含み、さら にＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲを発現する宿主細胞が、当業者には周 知の様々な手順により同定できる。これらの手順は、限定はしないが、ＤＮＡ- ＤＮＡ或いはＤＮＡ-ＲＮＡハイブリダイゼーション及び、核酸及びタンパク質 の検出並びにまた定量するための膜、溶液或いは破片ベース技術を含むタンパク 質バイオアッセイ或いはイムノアッセイを含む。 mmlr-ccrまたはmphg-ccrポリヌクレオチド配列の存在は、配列番号：１または 配列番号：３に開示されたプローブ、一部分、或いはフラグメントを用いる、Ｄ ＮＡ-ＤＮＡまたはＤＮＡ-ＲＮＡハイブリダイゼーションや、増幅により検出す ることができる。核酸増幅に基づくアッセイでは、配列番号：１または配列番号 ：３に基づくオリゴヌクレオチド或いはオリゴマーを使用し、mmlr-ccrまたはmp hg-ccrのＤＮＡ或いはＲＮＡを含む形質転換体を検出する。本明細書において「 オリゴヌクレオチド」或いは「オリゴマー」とは、プローブ或いはアンプリマー （amplimer）として用いることができる、少なくとも１０ヌクレオチド、多い場 合には６０ヌクレオチド、好適には１５〜３０ヌクレオチド、より好適には２０ 〜２５ヌクレオチドの核酸配列を指す。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、第 1Ａ図〜第1Ｄ図に示すmmlr-ccrまたはmphg-ccrヌクレオチド配列の３’領域に由 来する。 タンパク質に特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれか を用いて、ケモカイン受容体ポリペプチドの発現を検出し、測定するための種々 のプロトコルが当業者には周知である。このようなプロトコルの例としては、酵 素結合免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び蛍光表 示式細胞分取器法（ＦＡＣＳ）を含 む。ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲポリペプチド上で２つの非干渉なエ ピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナル 用イムノアッセイ（two-site，monoclonal-based immunoassay）は好適ではある が、競合的結合アッセイも用いられる。これらアッセイの並びに他のアッセイは 、Hampton Ｒ等（1990，Serologivcal Methods，a Laboratory Manual，APS Pre ss，St Paul MN）及びMaddox DE等(1983,I Exp Med 158:1211)等に記載されてい る。 さらに多くの標識及び結合技術は当業者には周知であり、種々の核酸及びアミ ノ酸検査法において用いることができる。mmlr-ccrまたはmphg-ccrポリヌクレオ チド配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーション或いはＰＣＲプロ ーブを生成するための手段には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション法、 末端標識化或いは標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅などがある。別法 では、mmlr-ccrまたはmphg-ccr配列、或いはその任意の部分が、ｍＲＮＡプロー ブの生成のためにベクターにクローン化される。そのようなベクターは当分野で は周知で市販されており、Ｔ７，Ｔ３或いはＳＰ６並びに標識されたヌクレオチ ドのような適切なＲＮＡポリメラーゼの付加により、in vitroでのＲＮＡプロー ブ合成のために用いることができる。 Pharmacia Biotech社(Piscataway NJ)、Promega社(Madison WI)並びにUS Bioc hemical社（Cleveland OH）のようないくつかの企業がこれらの手順に対する商 用のキット及びプロトコルを提供する。適切なリポーター分子、すなわち標識に は、放射性核種、酵素、蛍光性、化学ルミネセンス或いは色素性因子及び基質、 補助因子、インヒビター、磁気粒子或いはそれに類似のものが含まれる。そのよ うな標識の使用を教示する特許には、米国特許第3,817,837号、第3,850,752号、 第 3,939,350号、第3,996,345号、第4,277,437号、第4,275,149号並びに第4,336,24 1号がある。また、組換え免疫グロブリンが米国特許第4,816,567号に示されてお り、本明細書とともに参照されたい。 受容体の精製 ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲヌクレオチド配列で形質転換された宿 主細胞は、細胞培地からコード化タンパク質を発現及び回収するために適切な条 件下で培養される。組換え細胞により生成されるタンパク質は、用いられる配列 並びにまたベクターに応じて、細胞内に分泌、つまり含有されるようにすること ができる。mmlr-ccrまたはmphg-ccrを含む発現ベクターは、原核細胞か、真核細 胞の細胞膜を通してのＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲを分泌を誘導する シグナル配列を含むように設計される。他の組換え構成物では、mmlr-ccrまたは mphg-ccrを、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコー ドするヌクレオチド配列に結合することができる（Kroll DJ等（1993）DNA Cell Biol 12:441-53、融合タンパク質を含むベクターに関する上記論議も参照され たい）。 またＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲは、タンパク質精製を容易にする ために加えられた１または２以上の付加的なポリペプチドドメインを備えた組換 えタンパク質として発現される。そのような精製を容易にするドメインには、限 定はしないが、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジントリプトファンモ ジュールのような金属キレートペプチド（Porath J（1992）Protain Expr Purif 3:263-281）、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメ イン、並びにＦＬＡＧＳ延長／アフィニティ精製システムにおいて用いられるド メイン（Immunex社、Seattle WA）が含まれる。精製ドメイン及びＭＭＬＲ- ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ間の第ＸＡ因子或いはエンテロキナーゼのような 切断可能なリンカー配列を含めるのは精製を容易にするのに役立つ。 受容体及び受容体を含む遺伝子組換え宿主細胞の使用 ＭＭＬＲ-ＣＣＲのアミノ酸配列（配列番号：２）は第１Ａ図〜第１Ｄ図に示 されている。ＭＣＰ-1 ＣＣＲケモカイン受容体、即ちＧタンパク質結合に関与 することが知られている第３の膜貫通ドメインにおけるＭＣＰ-1ＲＢ（Charo前 述）に対するその相同性、及びマクロファージ、４８時間混合性リンパ球反応cD NAライブラリーにおけるその存在、及び通常マクロファージＭＭＬＲ-ＣＣＲに おける不存在に基づいて、ＭＭＬＲ-ＣＣＲが、白血球の機能の発揮に関与する ケモカイン受容体であるように思われる。ＭＰＨＧ-ＣＣＲのアミノ酸配列（配 列番号：４）は第６Ａ図〜第６Ｃ図に示されている。Ｃ-Ｃケモカイン受容体３ 及びＭＣＰ-1ＲＡへの相同性、及びマクロファージライブラリーにおけるその存 在に基づき、ＭＰＨＧ-ＣＣＲは、白血球の機能の発揮に関与するケモカイン受 容体であるように思われる。 従って、本発明は、ＭＭＬＲ-ＣＣＲ及びＭＰＨＧ-ＣＣＲアミノ酸配列、及び その受容体を発現する遺伝子組換え宿主細胞を提供し、適切な細胞調整において 天然リガンド、即ちケモカインを評価し、選別し、且つ同定する。本発明のケモ カイン受容体及びその受容体を発現する遺伝子組換え宿主細胞を、受容体／リガ ンド結合を調整し、受容体活性化及びシグナル伝達イベントを調節する物質、化 合物、または合成薬物を同定するためにも用いることができる。例えば、このよ うな遺伝子組換え宿主細胞を、ＭＭＬＲ-ＣＣＲ活性を調節できるペプチドライ ブラリーまたは有機分子を選別するために用いることができる。 本発明のある実施例では、ＭＭＬＲ-ＣＣＲ、ＭＰＨＧ-ＣＣＲ、またはそれ らの変異体、及び／またはＭＭＬＲ-ＣＣＲ、ＭＰＨＧ-ＣＣＲ、またはそれらの 変異体を発現する株細胞を、抗体、ペプチド、または単球／マクロファージ浸潤 及び透過性のモジュレータとして作用する、組み合わせ化学により作製された有 機または無機分子のような他の分子を選別し、免疫用途を調節する治療薬を同定 するために用いることができる。受容体の活性を中和できる抗受容体抗体を、例 えば炎症性疾患の場合において受容体活性化を抑制するために用いることができ る。合成化合物、天然産物、及び他の潜在的に生物学的活性の物質の源を、当業 者には日常的と考えられる様々な方法でスクリーニングすることができる。例え ば、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲの細胞外ドメインをコードするヌク レオチド配列を、株細胞において発現させ、その株細胞を、ＭＭＬＲ-ＣＣＲＡ またはＭＰＨＧ-ＣＣＲ活性のモジュレータ、即ちアゴニストかアンタゴニスト の何れかをスクリーニングするために用いることができる。この１実施例では、 ＭＭＬＲ-ＣＣＲ変異体や、１２１番目の位置の残基がバリンの代わりにイソロ イシンを含むものとなっている。 テスト分子がケモカイン受容体活性またはリガンド結合に干渉する能力は、単 球走化性の測定により決定することができる（Falk et al 1980 JImmunol Metho ds 33:239）。ケモカイン受容体の活性を、例えばＣａ⁺⁺流動（Grynkievicz et al(1985)J Biol Chem 260:3440 and McColl et al（1993）J Immunol 150:4550- 4555）及び脱顆粒及びレスピラトリーバースト応答（Zachariae et al 1990 J.E xp.Med.171:2177-82）及び接着分子発現及びサイトカイン産生の調節(Jiang et al 1992 J Immunol 148:2432-8)のような他の反応を測定することによってもモ ニタできる。 抗体 ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲポリペプチドに対する抗体の生成のた めに、当分野においてよく知られる手順が用いられる。このような抗体には、限 定はしないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖 、Ｆａｂフラグメント並びにＦａｂ発現ライブラリにより生成されるフラグメン トが含まれる。中和抗体、すなわちＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲポリ ペプチドの生物活性を抑制する抗体は、、特に診断及び治療に好適である。 抗体を生成するために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等を含む種々の宿主は 、免疫学的特性を保持するＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲポリペプチド 或いはその任意の部分、フラグメント或いはオリゴペプチドを注入することによ り免疫することができる。宿主種に応じて、種々のアジュバントが免疫学的反応 を促進するために用いられる。そのようなアジュバントには、限定はしないが、 フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのような無機質ゲルアジュバント 、リゾレシチンのような表面活性物質アジュバント、プルロニックポリオルアジ ュバント、ポリアニオンアジュバント、ペプチドアジュバント、油性乳剤アジュ バント、キーホールリンペットヘモシニアンアジュバント並びにジニトロフェノ ールアジュバントが含まれる。ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバ クテリウムパルヴムは潜在的に有用なヒトアジュバントである。 ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲに対するモノクローナル抗体は、培地 中の連続株細胞による抗体分子の産生を行うための任意の技術を用いて調製され る。これらは、限定はしないが、Koehler及びMilstein(1975,Nature 256:495-49 7)に当初掲載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosb or等(1983)Immunol Today 4:72、Cote等（1983）Proc Natl Acad Sci 80:2026-2 030）及びＥＢＶ−ハイブリ ドーマ技術(Cote等(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R L iss lnc,pp77-96）を含む。さらに、適切な抗原特異性並びに生物活性を有する 分子を得るための「キメラ抗体」の生成、即ちヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺 伝子のスプライシングのために開発された技術が用いられる(Morrison等(1984)P roc Natl Acad Sci 81:6851-6855)、Neuberger等（1984）Nature 312:604-608、 Takeda等（1985）Nature314:452-454）。別法では、一本鎖抗体の生成のために 記載された技術（米国特許第4,946,778号）が、特異的一本鎖抗体を生成するた めに適用される。 また抗体は、リンパ球集団におけるin vivo生成を誘導することにより、或い はOrlandi等（1989,Proc Natl Acad Sci 86:3833-3837）並びにWinter Ｇ及びMi lstein Ｃ（1991,Nature 349:293-299）に開示されているような組換え免疫グロ ブリンライブラリー或いは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングす ることによっても生成することができる。 ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲに対する特異結合部位を含む抗体フラ グメントも生成することができる。例えばこのようなフラグメントには、限定は しないが、抗体分子のペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ’）₂ フラグメント及びＦ（ａｂ’）₂フラグメントのジスルフィド架橋を減らすこと により生成することができるＦａｂフラグメントが含まれる。別法では、所望の 特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速に、しかも容易に同定 できるように、Ｆａｂ発現ライブラリーが構築される（Huse WD等（1989）Scien ce 256:1275-1281）。 ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ特異的抗体は、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまた はＭＰＨＧ-ＣＣＲポリペプチドの発現が関連する状態及び疾患の診断のため に有用である。確立された特異性を有するポリクローナル抗体或いはモノクロー ナル抗体のいずれかを用いる競合的結合アッセイ或いは免疫放射定量測定法のた めの種々のプロトコルが当分野ではよく知られている。そのようなイムノアッセ イでは、一般に、ケモカイン受容体とその特異的抗体（或いは類似の受容体結合 分子）との間の複合体の形成、並びに複合体形成の測定が行われる。特異的ＭＭ ＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲタンパク質上の２つの非干渉性エピトープに 対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナル用イムノア ッセイが好適ではあるが、競合結合アッセイも用いられる。これらの検査法はMa ddox DE等（1983,J Exp Med 158:1211）に記載されている。 受容体特異的抗体を用いる診断アッセイ 抗ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ抗体は、例えば、感染症、炎症、腫 瘍形成、細胞の異常増殖、及び循環器病のような受容体活性化を伴う病気の診断 のために役立つ。ケモカイン受容体に対する診断アッセイは、ヒトの体液、細胞 、組織或いはそのような組織の切片または抽出物において、ＭＭＬＲ-ＣＣＲま たはＭＰＨＧ-ＣＣＲを検出するための抗体或いは標識を利用する方法を含む。 本発明のポリペプチド及び抗体は、修飾の有無に拘わらず用いることができる。 多くの場合、ポリペプチド及び抗体は、共有結合、或いは非共有結合かのいずれ かでそれらをリポーター分子と結合することにより標識される。非常に多くのリ ポーター分子が周知となっている。 それぞれのタンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体或いはモノクロー ナル抗体を用いて、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲポリペプチドを測定 するための種々のプロトコルが当分野では周知である。その例として、酵素結合 免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ （ＲＩＡ）並びに蛍光表示式細胞分取器法（ＦＡＣＳ）がある。ＭＭＬＲ-ＣＣ ＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープに対して 反応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナル用イムノアッセイ が好適であるが、競合的結合アッセイも用いられる。これらのアッセイは、他に もあるが、Maddox DE等（1983,I ExpMed 158:1211）に記載されている。 疾病の診断の基礎を提供するために、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ 発現についての通常値、すなわち標準値が確立されなければならない。これは複 合体形成のために適切な条件下で、ヒト或いは動物どちらでもよいが、正常の被 験者から得られる体液或いは細胞抽出物と、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-Ｃ ＣＲに対する抗体とを結合することにより得ることができ、これは当分野ではよ く知られた技術である。標準的な複合体形成量は、一連のポジティブコントロー ルの希釈系列とそれを比較することにより定量され、抗体の既知の量が既知の濃 度の精製ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲと結合される。その後正常サン プルから得られた標準値を、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲが関係する 障害或いは疾患により潜在的に影響を受けた被験者からのサンプルから得られた 値と比較する。標準値と被験値との偏差によって疾患状態の存在を確認できる。 薬物スクリーニング ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ、その免疫原性フラグメント或いはそ のオリゴペプチドは、種々の任意の薬物スクリーニング技術において治療用化合 物のスクリーニングのために用いることができる。そのような試験において用い られるフラグメントは、溶液、固体支持体への付着、細胞表面への付着、或いは 細胞内への定着において制限はない。ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲと 試験される薬剤との間の触媒活性ま たは結合複合体形成の消滅が測定される。従って、本発明は、ＭＭＬＲ-ＣＣＲ 、ＭＰＨＧ-ＣＣＲまたはそれらのフラグメントに対して特異的結合親和性を有 するものを複数の化合物のなかからスクリーニングする方法であって、複数の化 合物を準備する過程と；本発明のケモカイン受容体またはそのフラグメントと、 複数の化合物のそれぞれとを、適切な条件の下で結合できるだけの十分な時間を 掛けて結合させる過程と；ケモカイン受容体またはそのフラグメントと、複数の 化合物のそれぞれとの結合を検出し、もってケモカイン受容体に特異的に結合す る化合物を同定する過程とを有することを特徴とする方法を提供する。このよう なアッセイでは、複数の化合物は、当業者に周知の組み合わせ化学技術により生 成される。本発明の或る実施例では、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲオ リゴペプチドが、細胞外結合ドメインから得られる。 薬物スクリーニングのための別の方法は、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-Ｃ ＣＲポリペプチドへの安定的な結合親和性を有する化合物の高スループットスク リーニングを提供するものであり、1984年９月13日公告の欧州特許出願第84/035 64号（Guysen）に詳細に記載されており、本明細書に一体に引用されている。概 要としては、多数の別々の小ペプチド試験用化合物をプラスチックピン或いはい くつかの他の表面のような、固体マトリックス上で合成する。ポリペプチド試験 化合物をＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲフラグメントと反応させ、洗浄 する。次いで結合した本発明のＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲを当分野 で周知の方法により検出する。また精製ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ を前述の薬物スクリーニング技術において使用するために、プレート上に直接コ ーティングすることもできる。別法では、ペプチドを捕捉し、固形支持体上にペ プチドを固定するために非中和抗体を用いる。 また本発明は、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲに結合し得る中和抗 体が、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲとの結合について特に試験化合物 と競合する競合的薬物スクリーニングアッセイの使用も意図している。このよう にして、抗体を用いて１または２以上の抗原性決定基をＭＭＬＲ-ＣＣＲまたは ＭＰＨＧ-ＣＣＲと共通に有する任意のペプチドの存在を検出することができる 。 受容体ポリヌクレオチドの使用 mmlr-ccrまたはmphg-ccrポリヌクレオチド、或いはその一部が診断並びにまた 治療目的で用いられる。診断目的の場合、本発明のmmlr-ccrまたはmphg-ccrポリ ヌクレオチド配列は、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ活性が関係する状 態や疾病、例えば、感染症、炎症、腫瘍形成、増殖性疾患、及び循環器病におけ る遺伝子発現を検出し、かつ定量するために用いられる。治療目的の場合、ＭＭ ＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲアンチセンス分子を、細胞表面の受容体の存 在をダウンレギュレートすることが望ましい病状の患者に投与し、ＭＭＬＲ-Ｃ ＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲの活性を抑制する。別法として、治療目的で、ＭＭ ＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲのセンスポリヌクレオチド配列を、シグナル 伝達イベントの促進が望ましい病気の患者に投与する。 本発明の範囲には、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ 分子、ＰＮＡ及びリボザイムが含まれており、これらはＭＭＬＲ-ＣＣＲまたは ＭＰＨＧ-ＣＣＲのｍＲＮＡを不安定化したり、mmlr-ccrまたはmphg-ccrの翻訳 を抑制するように機能する。 本発明の別の側面は、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはまたは近縁な分子、例えばアレ ルをコードする、ゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出できるハイブリ ダイゼーションプローブ或いはＰＣＲプローブを提供する。そして、そのプロー ブの特異性、すなわち非常に高い保存領域またはド メイン、保存的な領域またはドメイン、若しくは非保存領域またはドメインの何 れに由来するのかということや、ハイブリダイゼーション或いは増幅の（高度の 、中程度の或いは低度の）厳密性によって、そのプローブが天然mmlr-ccrのみを 同定するものであるか、或いは近縁な配列も同定するものであるかが決まってく る。近縁な核酸配列の検出のためのプローブは、既知のケモカイン受容体の保存 的、または高度に保存的な領域、例えばＧタンパク質結合ドメインから選択され る。同一の核酸配列の検出のため、または最高度の厳密性が要求される、例えば 診断試験のような場合には、核酸プローブは、mmlr-ccrポリヌクレオチドの非保 存的ヌクレオチド領域または一義的な領域から選択される。本明細書において、 「非保存的ヌクレオチド領域」とは、ここに開示するmmlr-ccr及びmphg-ccrに独 特で、近縁なケモカイン受容体には発生しないヌクレオチド領域を意味する。 受容体ポリヌクレオチドの診断のための使用 ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲコード化ポリヌクレオチド配列を、受 容体活性化が関係する疾病、例えば感染症、炎症、腫瘍形成、及び循環器病の診 断に用いる。例えば、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲをコードするポリ ヌクレオチド配列を、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲの異常発現を検出 するための生検用に採取された組織や体液の、ハイブリダイゼーションアッセイ 或いはＰＣＲアッセイにおいて用いることができる。そのような定性的及び定量 的方法の形態は、サザンブロット法或いはノーザンブロット法、ドットブロット 法或いは他の膜用技術、ＰＣＲ技術、浸漬法、ピン或いはチップ技術及びＥＬＩ ＳＡ技術を含む。これらの技術は全て、当分野ではよく知られており、実際に市 販されている多くの診断キットの基礎となっている。 このようなアッセイは、特定の治療行為の有効性を評価するために修正され、 動物実験、臨床試験、或いは個々の患者の治療をモニタする際に用いることがで きる。疾患を診断するための基礎を与えるために、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰ ＨＧ-ＣＣＲ発現に対する正常な或いは標準的なプロフィールが確立されなけれ ばならない。これは、正常な被験者、すなわち動物或いはヒトから得られる体液 或いは細胞抽出物を、ハイブリダイゼーション或いは増幅に適切な条件下で、Ｍ ＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ、或いはその一部と結合することにより達 成される。標準的なハイブリダイゼーションの定量は、正常被験者に対して得ら れる値と、既知の精製ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ量が用いられる同 一の実験におけるポジティブコントロール希釈系列で得られる値とを比較するこ とにより定量することができる。正常なサンプルから得られた標準値は、ＭＭＬ Ｒ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ発現に関連する障害或いは疾患により潜在的に 影響を受けている被験者からのサンプルから得られる値と比較される。標準値と 被験者値との偏差から疾患状態の存在が確立される。疾患が確立された場合は、 現存する治療用薬剤が投与され、治療プロファイル或いは数値が生成される。最 終的にアッセイは、その数値が正常、すなわち標準パターンに進むか、或いは戻 るかを評価するために規則的に繰り返される。治療プロファイルは治療の有効性 を示すために用いられ、数日間或いは数ヶ月の期間に渡って継続される。 米国特許第4,683,195、4,800,195並びに4,965,188号に記載のあるようなＰＣ Ｒ法により、mmlr-ccrまたはmphg-ccr配列に基づくオリゴヌクレオチドのための 追加の使用法が提供される。このようなオリゴマーは一般には化学的に合成され るが、酵素を用いて発生させたり、或いは組換えソースから生成することもでき る。一般にオリゴマーは、通常特定の遺伝子或いは状態を同定するために最適な 条件下で用いられる２ つのヌクレオチド配列、即ちセンス方向（５’→３’）のヌクレオチド及びアン チセンス方向（３’←５’）のヌクレオチドからなる。同一の２つのオリゴマー 、入れ子状のオリゴマーの組、或いはオリゴマーの縮重プールでさえ、近縁なＤ ＮＡまたはＲＮＡ配列の検出や定量のためのより低い厳密性の条件下であっても 用いることができる。 さらに特定の分子の発現を定量するための方法には、放射性標識（radiolabel ing）(Melby PC等1993 J Immunol Methods 159:235-44)或いはビオチン標識（Du plaa Ｃ等1993 Anal Biochem 229-36）ヌクレオチドの利用、制御核酸の同時増 幅（coamplification）の利用、並びに実験結果を補完して書かれた標準的なグ ラフ曲線の利用が含まれる。多数のサンプルの定量は、ＥＬＩＳＡ形式のアッセ イを実行することにより迅速に行うことができ、対象のオリゴマーが様々な希釈 溶液中に現れ、分光光度分析或いは比色分析反応により迅速に定量することがで きる。 ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲポリヌクレオチドの治療のための使用 ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＭＬＲ-ＣＣＲアンチセンス分子は、受容体の存在を ダウンレギュレートし、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ活性を抑制する ことが望ましいような、受容体活性化が関係する様々な異常状態、例えば、感染 症、炎症、細胞の異常増殖、腫瘍形成、及び例えばアテローム性動脈硬化症のよ うな循環器病の治療のための基礎となり得る。別形態では、ＭＭＬＲ-ＣＣＲま たはＭＰＨＧ-ＣＣＲをコードするポリヌクレオチド配列が、受容体をアップレ ギュレートし、免疫応答を促進することが望ましいような、種々の異常状態の治 療における遺伝子治療の基礎となり得る。 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス或いはワクシニアウイル スに由来する発現ベクター、或いは細菌性プラスミドに由来する発現ベクターは 、標的の器官、組織、または細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いら れる。当業者によく知られた方法は、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲを 発現する組換えベクターを構築するために用いることができる。例えばManiatis 等（上記）及びAusubel等（上記）に記載された技術を参照されたい。別形態と して、組換えＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲを、リポソームに入れて標 的細胞に送達させることができる。 完全長cDNA配列、並びにまたその調節エレメントを含むポリヌクレオチドによ り、研究者は遺伝子機能のセンス調節（Youssoufian H及びHF Lodish 1993 Mol Cell Biol 13:98-104）、或いはアンチセンス調節（Eguchi等（1991）Annu Rev Biochem 60:631-652）の調査用のツールとしてＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ- ＣＣＲを用いることができる。ゲノムＤＮＡから得られたcDNAまたは調節配列か らデザインされたオリゴヌクレオチドを、発現を抑制するためにin vitroまたは in vivoで用いることができる。このような技術は、現在当分野ではよく知られ ており、センス或いはアンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはより大きなフラ グメントを、コーディング領域或いは制御領域に沿った様々な位置から設計する ことができる。 更に、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ活性を抑制することが望ましい ような状態において、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ断片を高レベルで 発現する発現ベクターを細胞または組織にトランスフェクトすることにより、Ｍ ＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ発現を調節することができる。このような 作製物は、翻訳不可能なセンス或いはアンチセンス配列とともに細胞から溢れ出 し得る。ＤＮＡへの組み込みがない場合ですら、このようなベクターは、全ての 複製物が内在性ヌクレアーゼにより分解 されるばで、ＲＮＡ分子を転写し続ける。このような過渡的発現は、非複製ベク ター（Mettler I,personal communication）でも１ヶ月以上、適当な複製エレメ ントがベクター系の一部である場合には更に長い期間継続し得る。 mmlr-ccrまたはmphg-ccr遺伝子のの制御領域、例えばプロモータ、エンハンサ 或いはイントロンに対するアンチセンス分子、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡを設 計することにより遺伝子発現を修飾することができる。転写開始部位、例えばリ ーダ配列の＋１０〜−１０領域の間に由来するオリゴヌクレオチドが好適である 。またアンチセンス分子は、転写産物がリボソームへの結合するのを防止するこ とにより、ｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設計される。同様に、抑制は、「三 重らせん」塩基対合としても知られる、Hogeboom塩基対合方法論を用いて達成す ることができる。三重らせん対合は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、或 いは調節分子を結合するために十分に開放する機能を抑制する。三重らせんＤＮ Ａを用いた最近の治療法は、Gee JEら（Huber BE and BI Carr(1994)Molecular and Immunologic Approaches，Futura Publishing Co,Mt Kisco NY）により 再検討されている。 リボザイムはＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素性ＲＮＡ分子で ある。リボザイム作用の機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特 異的ハイブリダイゼーションが行われ、その後エンドヌクレアーゼによる切断（ endonucleolytic cleavage）がなされる。発明の範囲内には、mmlr-ccrまたはmp hg-ccrのエンドヌクレアーゼによる切断を、特異的に及び効果的に引き起こす工 学的に処理されたハンマーヘッド状モチーフ（hammerhead motif）リボザイム分 子も含まれている。 任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位の最初の 同定は、配列ＧＵＡ、ＧＵＵ並びにＧＵＣが後続するリボザイム切断部位に対す る標的分子を走査することにより行われる。一度同定されると、切断部位を含む 標的遺伝予の領域に対応する１５〜２０個のリボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ 配列は、そのオリゴヌクレオチドの機能を停止させる２次構造の特徴について評 価される。また候補の標的の適切性の評価は、リボヌクレアーゼ保護アッセイを 用いて相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に対する接触性を試験 することにより行われる。 本発明のアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子及びリボザイムは、ＲＮＡ分子を 合成するのための当分野で周知の方法により調製することができる。これらの技 術には、固相ホスホラミダイト（phosphoramidite）化学合成のような化学的合 成オリゴヌクレオチドの技術が含まれる。別法では、ＲＮＡ分子を、ＭＭＬＲ- ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲをコードするＤＮＡ配列のin vivo及びin vitro転 写により生成することができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７或いはＳＰ６の ような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモータを有する多種のベクターに組み込ま れる。別法では、構造的に或いは誘導的にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチ センスcDNA構成物が、株細胞、細胞或いは組織内に導入される。 ＤＮＡ分子は細胞内安定性を高め及び半減期を長くするために修飾することが できる。実行可能な修飾には、限定はしないが、その分子の５’並びにまた３’ 末端のフランキング配列の付加、或いは分子のバックボーン内にホスホジエステ ラーゼ連鎖ではなくホスホロチオネート（phosphorothioate）或いは２’−Ｏ− メチルを使用することを含む。 細胞或いは組織内にベクターを導入するための方法には、以下に議論される方 法が含まれる。これらの形質転換またはトランスフェクション方法のいくつかは 、ex vivo治療法に対しても適切なものである。 更に、ここに開示するmmlr-ccrまたはmphg-ccrのヌクレオチド配列は、新技術 、即ち、限定はしないが、それがトリプレット遺伝暗号及び特異的塩基対合相互 作用のような特性を含む、現在周知のヌクレオチド配列の特性に依存する技術で あれば、まだ開発されていない分子生物学的技術においても用いることができる 。 ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲに近縁なポリヌクレオチド配列の検出及 びマッピング mmlr-ccrまたはmphg-ccr核酸配列は、天然ゲノム配列のマッピングのためのハ イブリダイゼーションプローブを生成するために用いることができる。この配列 は、よく知られる技術を用いて、特定の染色体或いはその染色体の特定領域に対 してマッピングすることができる。このような技術には、拡散させた染色体（ch romosomal spreads）に対するin situハイブリダイゼーション（Verma等（1988 ）Human Chromosomes:A Manual of Basic Technique,Pergamon Press，New York ）、フローソート（flow-sorted）染色体調製法、或いは酵母菌人工染色体（Ｙ ＡＣｓ）、細菌性人工染色体（ＢＡＣｓ）、細菌性Ｐ１構造体或いはPrice CM（ 1993;Blood Rev 7:127-34）及びTrask BJ（1991;Trends Ganet 7:149-54）に概 要が示されている単染色体cDNAライブラリのような人工染色体構造が含まれる。 染色体調製物のin situハイブリダイゼーション及び確定された染色体マーカ ーを用いる連鎖解析のような物理的地図作成技術は、遺伝子地図を延長する際に 大変重要である。ヒトゲノムのＳＴＳに基づく地図の最近の例は、Whitehead-MI T Center for genomic Reserch（Hudson TJら(1995)Science 270:1945-1954）か ら最近出版されている。多くの場合、特定のヒト染色体の数或いは腕が知られて いなくても、マウスのよ うな別の哺乳動物種の染色体上の遺伝子の配置から、関連する標識を明らかにす ることができる。新しい配列は、染色体の腕、或いはその一部への物理的マッピ ングにより割当てることができる。これは位置クローニング或いは他の遺伝子発 見技術を用いて疾患遺伝子を調査する研究者に貴重な情報を提供する。ひとたび 毛細血管拡張性運動失調（ＡＴ）のような疾患或いは症候群が、特定のゲノム領 域、例えばＡＴ〜11q22-23への遺伝子連鎖により粗く局所化されれば、その領域 にマッピングされる任意の配列は、さらなる研究のための関連する遺伝子、或い は調節遺伝子を表すことができる（Gatti等（1988）Nature 336:577-580）。本 発明のヌクレオチド配列は、正常者、保菌者或いは感染した個体間の転座、逆位 等による染色体位置の違いを検出するために用いることもできる。 医薬品組成物 本発明は、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲのヌクレオチド、タンパク 質、抗体、アンタゴニスト、インヒビターを、単独で、或いは安定化化合物のよ うな少なくとも１つの他の薬剤とともに含んでいる医薬品組成物に関するもので ある。この医薬品組成物は、任意の無菌の生体適合性担体に含めて投与されるが 、このような担体には、限定はしないが、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖或 いは水が含まれる。これらの分子は、患者に対して、単体で、或いは他の薬品や ホルモンと結合して、医薬品添加物或いは製薬学的に許容される担体と混合され る他の薬品組成物に入れて投与され得る。本発明の一実施例では、製薬学的に許 容される担体とは、製薬学的に不活性なものである。医薬品組成物の投与 医薬品組成物は経口投与、或いは非経口投与される。非経口投与の方法には、 局所的投与、動脈内（腫瘍への直接の）投与、筋肉内投与、皮下投与、髄内投与 、くも膜下内投与、脳室内投与、静脈内投与、腹腔内投与或いは鼻腔内投与を含 む。活性成分に加えて、これらの薬品組成物は、薬学的に用いられ得る調合物内 への活性化合物の処理を容易にする賦形剤及び補助剤を含む適切な製薬学的に許 容される担体を含み得る。調合或いは投与に関する技術の詳細は、“Remington' s Pharmaceutical Sciences（Mack Publishing Co,Easton PA）”の最新版にお いて見出すことができる。 経口投与用の薬品組成物は、当分野でよく知られる製薬学的に許容される担体 を用いて適切な剤形に製剤される。このような担体により、薬品組成物は、治療 を受ける患者による摂取のための、錠剤、丸剤、カプセル剤、液体剤、ゲル剤、 シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤或いは類似の剤形として処方される。 経口投与するための製薬調製は、活性化合物と固形の賦形剤とを組み合わせる ことによって得ることができるが、所望に応じて、必要なら適切な補助剤を添加 した後、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理して、錠剤或いは糖衣剤 核を得ることができる。適切な賦形剤は、ラクトース、サクロース、マンニトー ル或いはソルビトールを含む砂糖のような糖質或いはタンパク質充填剤、とうも ろこし、小麦、米、じゃがいも等からのでんぷん、メチルセルロース、ヒドロキ シプロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムの ようなセルロース、アラビアゴム或いはトラガカントのようなゴム、並びにゼラ チン或いはコラーゲンのようなタンパク質である。必要ならば、クロスリンクし たポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸或い はアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような、崩 壊剤或いは可溶化剤が加えられる。 糖衣剤核は、濃縮砂糖溶液のような適切な錠皮を与えられるが、溶液はアラビ アゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル剤、ポリエチレングリ コール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶剤或いは溶剤混 合物が含み得る。錠剤の識別のため、すなわち活性化合物の量、すなわち投与量 を特徴付けるために染料或いは色素が錠剤或いは糖衣錠皮に加えられてもよい。 経口投与可能な製剤は、ゼラチンからなるプッシュフィットカプセル及びゼラ チンからなる柔らかい、密封されたカプセル、並びにグリセロール或いはソルビ トールのような錠皮を含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトース或いはで んぷんのような充填剤或いは結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネシウムの ような潤滑剤、並びに付加的には安定剤と混合された活性処方組成物を含み得る 。柔らかいカプセルでは、活性化合物は、安定剤があるなしにかかわらず、脂肪 油、液体パラフィン、液体ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解或 いは懸濁される。 非経口投与用の剤形は、水溶性の活性化合物の水溶液を含む。注射用として、 本発明の薬品組成物を水溶液、好適にはハンクの溶液、リンガー溶液或いは生理 緩衝食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液に入れて製剤することができる。 水性の注入懸濁剤は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール 或いはデキストランのような懸濁剤の粘性を増加する物質が含み得る。更に、活 性成分の懸濁液は、適切な油性注入懸濁剤として調製される。適切な親油性の溶 媒或いは媒介物は、胡麻油のような脂肪油や、オレイン酸エチル、トリグリセリ ド或いはリポソームのような合成脂肪酸エステルを含む。また懸濁剤は、所望に 応じて、それにより溶解度を増加し、非常に濃縮された溶液の調製が できるようになる適切な安定剤或いは薬剤を含んでもよい。 局所的投与または経鼻投与用には、浸透される特定の障壁に対して適切な浸透 剤を配合する。このような浸透剤は、従来より周知である。製造と保管 本発明の薬品組成物は周知の方法、例えば従来の混合処理、溶解処理、顆粒化 処理、糖衣形成処理、研和処理、乳化処理、カプセル化処理、封入処理或いは凍 結乾燥処理により製造される。 この医薬品組成物は塩類として提供されることもあり、限定はしないが、塩酸 、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む、多くの酸とともに 形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形態である水性或いはプロトニ ック溶剤において、より可溶性が高くなる傾向がある。他の場合には、好適な製 剤は、1ｍＭ〜50ｍＭのヒスチジン、0.1％〜2％のショ糖、使用前に緩衝剤と結 合させたｐＨ範囲4.5〜5.5にある2％〜7％のマンニトールにおける凍結乾燥粉末 である。 製薬学的に許容される担体内に製剤された本発明の化合物を含む組成物は、調 製された後、適切な容器内に入れられて、さらに提示した疾病状態の治療のため にラベル付けされる。ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲの投与の場合、こ のようなラベルには、投与の量、頻度、方法が表示される。治療上効果的な投与量 本発明において使用するために適切な医薬品組成物は、活性成分を所望の目的 を達成するに効果的な量だけ含む組成物である。効果的な投与量の決定は、当業 者の能力の範囲内で行うことができる。 任意の化合物の場合、治療的に有効な投与量は、初めに、新生物細胞、 或いは通常マウス、ウサギ、イヌ、ブタのような動物モデルの何れかの細胞培地 のアッセイから推定される。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおいて効 果的な投与量や投与経路を決定することができる。 治療的に有効な投与量とは、症状や疾病を寛解するタンパク質、その抗体、ア ンタゴニスト、またはインヒビターの量である。そのような化合物の毒性及び治 療有効性は、例えばＬＤ50（個体群の50％の致死投与量）及びＥＤ50（個体群の 50％において治療的に効果のある投与量）を決定するための、細胞培地或いは実 験動物における標準的な製薬学的手順により決定することができる。毒性と治療 有効性との間の投与量比は治療指数であり、比ＬＤ50/ＥＤ50として表すことが できる。大きな治療指数を示す医薬品組成物が好ましい。これらの細胞培地のア ッセイ及び付加的な動物研究から得られるデータは、ヒトへの使用に対する投与 量の範囲を決める際に用いることができる。そのような化合物の投与量は、毒性 がほとんど或いは全くなく、ＥＤ50を達成する循環濃度の範囲内にあることが望 ましい。投与量は、用いられる剤形、患者の感受性並びに投与経路に応じてこの 範囲内で変化する。 正確な投与量は治療されるべき患者を考慮して個々の医師により選択される。 投与量及び投薬量は、十分なレベルの活性部分を与え、かつ所定の効果を維持す るために調整される。考慮すべき付加的な要因は、疾患状態の重症度、または患 者の年齢、体重並びに性別、食事、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感 受性、並びに治療への耐性／反応を含む。長期的に作用する薬品組成物は３〜４ 日毎に、１週間毎に、或いは半減期及び特定の処方のクリアランス速度に応じて ２週間に１度、投与してもよい。 通常の投与量は0.1〜100,000μｇの範囲にあって、全投与量は最大約１ｇであ り、投与経路に応じて変化する。特定の投与量或いは供給の方 法に関するガイダンスは、文献において見出すことができる。米国特許第4,657, 760号、第5,206,344号或いは第5,225,212号を参照されたい。当業者は、ヌクレ オチドに対しては、タンパク質やそのインヒビター用の剤形とは異なる剤形を採 用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、細胞 、病状、位置等によって決まってくる。 ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲのアンタゴニストまたはアゴニストを 、それぞれ、ケモカイン受容体活性を抑制か、促進することが望ましい病気の患 者に、適切な剤形で送達することが企図されている。 以下に本発明の実施例を示す。但し、以下の実施例は単なる例示であって、本 発明をこの実施例に限定しようとするものではない。 産業上の応用 １ ＭＭＬＲ-ＣＣＲライブラリーの構築及びcDNAクローンの単離 例として、ＭＭＬＲ2ＤＴ01 cDNAライブラリーの構築について説明する。ＭＰ ＨＧＮＯT03ライブラリーは類似した方法を用いて作製した。 このライブラリーのために使用した通常の末梢血液マクロファージは、２人の ２４歳の白人男性から得た。このライブラリーは、フィコール／ハイパク精製軟 膜（Ficoll/Hypaque purified buffy coats）から得られた同種間で刺激された ヒトマクロファージ集団の混合物を表す。２つの異なるドナー（ＨＬＡアレル型 ではない）からの細胞を、１×１０⁶／ｍｌの密度でインキュベートし、ＤＭＥ 含有１０％ヒト血清のなかで４８時間培養した。 インキュベーションの後、マクロファージは大半がペトリ皿のプラスチックの 表面に付着し、大抵の他の細胞型Ｂ及びＴリンパ球は溶液の中に残っていた。Ｄ ＭＥをウェルからデカントし、そのウェルをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄 した。ＰＢＳ/１ｍＭ ＥＤＴＡの中でペトリ皿を静か に剥がすことにより、マクロファージはプラスチックの表面から放出された。即 座にマクロファージをグラニジウムイソチオシアネート含有緩衝液の中に溶解し た。 この可溶化液を、ｐＨ８．０のフェノールとクロロホルムの混合物で２度抽出 し、Ｌ8-70Ｍ Ultracentrifuge(Beckman Instruments)においてBeckman ＳＷ28 rotorを用いて塩化セシウムクッションと共に遠心分離した。ＲＮＡを０．３Ｍ 核酸ナトリウム及び２．５容量のエタノールを用いて沈殿させ、水に再懸濁して 、３７℃で１５分間かけてDNase処理をした。全ＲＮＡをQiagen 0ligotex kit(Q IAGEN Inc,Chatsworth CA)を用いて単離した。Ｔ及びＢリンパ球のコンタミもあ る程度存在することに注意しなければならない。 このポリＡ⁺ＲＮＡをSuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and P lasmid Cloning(catalogue＃18248-013;Gibco BRL,Gaithersburg MD)において、 推奨プロトコルに従って使用した。cDNAをSepharose ＣＬ4Ｂカラム(catalog＃2 75105,Pharmacia)上で分画化し、これらの４００ｂｐを越えるcDNAをpSport Ｉ にリゲートした。このプラスミドを化学的にコンピテントなＤＨ５宿主細胞(Gib co BRL)にトランスフォームした。 プラスミドＤＮＡは細胞から放出され、Miniprep Kit(Catalogue＃77468;Adva nced GeneticT 0echnologies Corporation,Gaithersburg MD)を用いて精製した 。このキットは９６０回の精製用の試薬を備え、９６穴ブロックから成る。以下 の変更点を除いて、推奨プロトコルを用いた。（１）９６個のウェルには、２５ ｍｇ／Ｌのカルベニシン及び０．４％のグリスロールを有する無菌のTerrific B toth(Catalogue＃22711,Gibco/BRL,Gaithersburg MD)の１ｍｌのみをそれぞれ充 填した。（２）その穴に接種がなされ、次いで６０μｌの溶解緩衝液に溶解した 後黴菌 を２４時間培養した。（３）Beckman ＧＳ-6Ｒを用いて＠２９００ｒｐｍで５分 間の遠心分離を行った後、ブロックの内容物を一次フィルタプレートに加えた。 （４）ポリスバッファにイソプロパノールを添加するオプションの工程は定例的 には実施しなかった。プロトコルの最終ステップの終了後、サンプルを貯蔵のた めBeckman９６穴ブロックに移送した。 プラスミドＤＮＡを精製するための別の方法では、MAGIC MINIPREPS^TMDNA Pur ification System(Catalogue＃A7100,Promega,Madison WI)またはQIAwell^TM-8 P lasmid,QIAwell PLUS DNA、QIAwell ULTRA DNA Purification Systems及び(QIAG EN Chatsworth CA)を使用する。 cDNAの配列決定は、４つのPeltier Thermal Cyclers(PTC200from MJ Research ,Watertown MA)及びApplied Biosystems 377または373 DNA Sequencing Systems (Perkin Elmer)を組み合わせてHamilton Micro Lab 2200(Hamilton,Reno NV)を 用いるSanger F及びAR Coulson(1975;J Mol Biol 94:441f)の方法より行い、読 み枠を決定した。 ２ cDNAクローン及びその推定タンパク質の相同性検索 各cDNAを、ＢＬＡＳＴ検索（Basic Local Alignment Search Tool（Altschul SF(1993)J Mol Evol36:290-300:Altschul,SF等(1990)J Mol Biol215:403-10）） を用いて、GenBankの配列と比較した。この方法で、ヒトＭＣＰ-1ＲＢ受容体（ ＮＣＢＩ ＧＩ472558）Charo（前出）と不完全に一致するインサイト社クロー ンNo.478861、及びＣ-Ｃケモカイン受容体３及びＭＣＰ-ＩＲＡ（Charo前出）と 不完全に一致するインサイト社クローンNo.442279を同定した。 ＢＬＡＳＴを用いて局部的な配列アライメントを検索した。ＢＬＡＳＴは ヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方のアライメントを生成して配列類似性を求 める。そのアライメントの局所性のために、ＢＬＡＳＴは厳密な一致を求める際 に、すなわちホモログを求める際に特に有効である。ＢＬＡＳＴは間隙を含まな い一致を求めるのに役立つ。ＢＬＡＳＴアルゴリズム出力の基本的な単位は、Hi gh-scoring Segment Pair（ＨＳＰ）である。 ＨＳＰは２つの配列フラグメントからなり、両フラグメントは任意ではあるが 、そのアライメントが局所的に最大となっている等しい長さものであり、そのア ライメントスコアはユーザにより設定された閾値すなわちカットオフスコアを満 足、即ち、カットオフスコアを超えている。ＢＬＡＳＴアプローチは問い合わせ 配列とデータベース配列との間のＨＳＰを見つけ出すものであり、見出された任 意の一致の統計的有意性を評価し、そのユーザが設定した有意性の閾値を満足す る一致のみを報告するものである。パラメータＥはデータベース配列一致を知ら せるための統計的に有意な閾値を確定するパラメータである。Ｅは全データベー ス検索の情況においてＨＳＰ（或いはＨＳＰの組）の発生の機会の期待される頻 度の上側の境界として解釈される。その一致がＥを満足する任意のデータベース 配列がプログラム出力において報告される。 ３ cDNAクローンの読み枠の決定 ＭＭＬＲ2ＤＴ01ライブラリーから得られた個々のcDNAクローンの読み枠を、 ポリヌクレオチド配列の開始コドン（ＡＴＧ、ＧＴＧ等）及び停止コドン（ＴＧ Ａ、ＴＡＡ、ＴＡＧ）を解析することにより得た。典型的には、１つのフレーム はcDNA配列のすべての主要な部分を通じて継続し、他の２つの未決定のフレーム は多数の停止コドンを含む傾向がある。 読み枠を決定するためのアルゴリズムとして、各推定上のコドントリプ レットの個々のヌクレオチド塩基の発生を解析するアルゴリズムが開発されてき た（例えばFickett，J.W.(1982)Nucleic Acids Research 10:5303）。コーディ ングＤＮＡでは、あるトリプレットの周期現象内に含まれるあるヌクレオチドが 優勢、例えば第３のコドン位置においてピリミジンが有意に優勢である傾向があ る。このようなアルゴリズムは幅広く市販のソフトウェアに組み込まれており、 任意のＤＮＡストレッチのコーディング可能性（及びフレーム）を決定するのに 用いられる。このアルゴリズムから得られた情報を開始／停止コドン情報と組み 合わせて、ライブラリー内の個々のクローンの適当な読み枠を高い確実性をもっ て決定し、適当な発現媒介物との正しい読み枠のアライメントが得られる。 ４ 調節エレメント回復までのmmlr-ccrまたはmphg-ccrの延長 完全長mmlr-ccrまたはmphg-ccrの核酸配列を、ゲノムライブラリから完全長配 列を得るためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために用いる。一方の プライマーはアンチセンス方向（ＸＬＲ）の延長を開始するために合成され、他 方のプライマーはセンス方向（ＸＬＦ）に配列を延長するために合成される。こ れらのプライマーにより、周知のmmlr-ccrまたはmphg-ccr配列を「外側に」延長 し、対象の制御領域の新しい未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成 できるようになった。初期プライマーは、Oligo4.0（National Biosciences社、 Plymouth MN）、或いは他の適切なプログラムを用いて、長さが２２〜３０ヌク レオチドで５０％以上のＧＣ含有率を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配 列にアニールするように設計することができる。結果的にヘアピン構造及びプラ イマー−プライマー二量体化を生じる任意のヌクレオチドのストレッチの延長は 避けられる。 ５’上流配列を延長し、増幅するためにヒトゲノムライブラリを用いる。必要 なら、既知領域をさらに延長するためにプライマーの第２の組をデザインする。 ＸＬ-ＰＣＲキット（Perkin Elmer社）のための指示に従って、酵素と反応混合 物とを完全に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られる。40pmolの各プ ライマと、推奨された濃度のキットの他の全ての成分とから増幅を開始する場合 、ＰＣＲはPeltier Thermal Cycler（PTC200；MJ Reserch社、Watertown MA）を 用いて、以下のパラメータで実行される。 ステップ１ ９４℃で１分間（初期変性） ステップ２ ６５℃で１分間 ステップ３ ６８℃で６分間 ステップ４ ９４℃で１５秒間 ステップ５ ６５℃で１分間 ステップ６ ６８℃で７分間 ステップ７ ステップ４〜６をさらに１５サイクル反復 ステップ８ ９４℃で１５秒間 ステップ９ ６５℃で１分間 ステップ１０ ６８℃で７分１５秒間 ステップ１１ ステップ８〜１０を１２サイクル反復 ステップ１２ ７２℃で８分間 ステップ１３ ４℃（その温度を保持） 反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを、低濃度（約０．６〜０．８％）ア ガロースミニゲルにおける電気泳動で解析して、反応物が配列を延長することに 成功したか否かを決定する。最も大きな生成物或いはバンドを選択して、ゲルか ら切り出した。さらなる精製には、QIAQuick（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ社）の ような市販のゲル抽出法を用いる。ＤＮＡ 回収の後、クレノウ酵素を用いて一本鎖ヌクレオチドの延び出しを切り取り、再 結合及びクローニングを容易にする平滑末端を作った。 エタノール沈殿の後、生成物を１３μｌのリゲーション緩衝液内に再溶解し、 １μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチド キナーゼを加えて、その混合物を、室温で２〜３時間、或いは１６℃で一昼夜イ ンキュベートする。コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞（４０μｌの適切な溶媒内 にある）を、３μｌのリゲーション混合物を用いて形質転換し、８０μｌのＳＯ Ｃ培地（Sembrook Ｊ等、上記）で培養する。３７℃で１時間のインキュベーシ ョンの後、全ての形質転換混合物を、２ｘＣａｒｂを含むLuria Bertani（ＬＢ ）寒天上にのせる。後日、いくつかのコロニーを各プレートから無作為に選択し 、適切な市販の無菌の９６穴マイクロタイタープレートの個々のウェル内に入れ られた１５０μｌの液状ＬＢ／２ｘＣａｒｂ培地で培養する。さらに後日、５μ ｌの各オーバーナイト培養物を非無菌９６穴プレート内に移し、水で１：１０に 希釈した後、各５μｌのサンプルをＰＣＲアレイ内に移す。 ＰＣＲ増幅の場合、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの４単位を含む１８μｌの濃 縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）、ベクタープライマー、並びに延長反応に用い られる遺伝子特異的プライマーの一方或いは両方を各ウェルに加える。増幅は以 下の条件に従って行う。 ステップ１ ９４℃で６０秒間 ステップ２ ９４℃で２０秒間 ステップ３ ５５℃で３０秒間 ステップ４ ７２℃で９０秒間 ステップ５ ステップ２〜４をさらに２９サイクル反復 ステップ６ ７２℃で１８０秒間 ステップ７ ４℃（そのまま保持） ＰＣＲ反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で移動 させる。ＰＣＲ生成物のサイズを元の部分的なcDNAと比較して、適切なクローン を選択し、プラスミドに結合して、配列決定を行う。 ５ ハイブリダイゼーションプローブのラベリング 配列番号：１及び配列番号：３の核酸配列に由来するハイブリダイゼーション プローブは、cDNA、ｍＲＮＡ並びにゲノムＤＮＡをスクリーニングするために用 いられる。約２０の塩基対からなるオリゴヌクレオチドのラベリングについて特 に記すが、大きなcDNAフラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌ クレオチドを、５０ｐｍｏｌの各オリゴマーと、２５０ｍＣｉの[γ‐³²Ｐ]アデ ノシン三リン酸（Amersham社，Chicago IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ （DuPont NEN（商標）、Boston MA）とを組み合わせて用いてラベルする。標識 付けられたオリゴヌクレオチドを、SephadexG-25超精細樹脂カラム（Pharmacia 社）を用いて精製する。それぞれ毎分１０⁷カウントを含む各部分を、以下のエ ンドヌクレアーゼ(AseI,BglII,EcoRI,PstI，Xba1或いはPvuII；DuPont NEN（商 標）)の１つを用いて消化されるヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ハイブリダイゼ ーション解析において用いる。 各消化物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画化して、ナイロン 膜（Nytran Plus,Schleicher&Schuell,Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーシ ョンは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くために、ブロ ットは、０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウ ムまで段階的に厳密性が増す条件 下で、室温にて順次洗浄される。ＸＯＭＡＴ ＡＲ(登録商標)フィルム(Kodak,Ro chester NY)を、数時間かけてPhosphoimager cassette(Molecular Dynamics,Sun nyvale CA)においてブロツトに露光された後、ハイブリダイゼーションパターン が視覚的に比較される。 ６ アンチセンス分子 ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ配列或いはその任意の一部は、内生Ｍ ＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲのin vivoまたはin vitro発現を抑制する ために用いることができる。約２０塩基対からなるアンチセンスオリゴヌクレオ チドの使用について特に記すが、大きなcDNAフラグメントの場合でも概ね同じ手 順を用いることができる。ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲのコード化配 列に基づくオリゴヌクレオチドを用いて、内生ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ- ＣＣＲの発現を抑制することができる。Oligo 4.0を用いて、相補的なオリゴヌ クレオチドを保存的な5'配列からデザインし、プロモータが上流の非翻訳配列を 結合するのを防ぐことにより転写を抑止したり、或いは、リボゾームがｍＲＮＡ に結合するのを防止することによりＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ転写 物の翻訳を抑止するために用いることができる。 ７ ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ特異的抗体の産生 ポリクローナル抗体の産生のために、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ の予測アミノ酸配列をＤＮＡＳＴＡＲソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ社）を用い て解析して免疫抗原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成して 、ウサギで抗体を産生するために用いる。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性 領域内のエピトープのような、適切なエピトープを選択するための解析は、Ausu bel FM等（上記）の論文に記載されてい る。通常、約１５残基の長さを有するオリゴペプチドを、fmoc-chemistryを用い るＡＢＩペプチドシンセサイザーModel 431A（Perkin Elmer，Norwalk，CN）を 用いて合成し、Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス テル（ＭＢＳ：Ausubel FM等、上記）を用いた反応によりキーホールリンペット ヘモシニアン（ＫＬＨ、Sigma）に結合する。フロイントの完全アジュバントに おけるオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫する。得られた抗血 清の抗ペプチド活性を検査するには、例えばペプチドをプラスチックに結合し、 １％ＢＳＡを用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射 性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧを用いて反応させる。 ８ 特異的抗体を用いるＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲの精製 内生ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲや組換えＭＭＬＲ-ＣＣＲまたは ＭＰＨＧ-ＣＣＲは、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲに対する特異的な 抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより精製することができ る。イムノアフィニティーカラムは、ＣｎＢｒ活性化Sepharose（Pharmacia Bio tech社）のような活性化クロマトグラフ樹脂とＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ- ＣＣＲ抗体とを共有結合させることにより構成される。結合後、その樹脂を製造 者の指示に従って、ブロックし洗浄する。 ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲを含む培地をイムノアフィニティーカ ラムに通し、そのカラムをＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲを優先的に吸 収できる条件下（例えば界面活性剤の存在下での高イオン強度緩衝剤）で洗浄す る。このカラムを、抗体／ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ結合を切るよ うな条件下（例えばｐＨ２〜３の緩衝剤、或いは高濃度の尿素またはチオシアン 酸塩イオンのようなカオトロピックイオ ン）で溶離させ、ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲを回収する。 ９ ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲと相互作用する分子の同定 ＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ、或いはその生物学的に活性なフラグ メントを、¹²⁵Ｉボルトンハンター試薬を用いて標識する（Bolton,AE及びHunter ,WM（1973）Biochem J 133:529）。９６穴プレートのウェル内に前に入れておい た候補分子を、標識したＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲとともに培養し 、洗浄し、標識したＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ複合体を有する任意 のウェルをアッセイする。異なる濃度のＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ-ＣＣＲ を用いて得られるデータを用いて、候補分子とＭＭＬＲ-ＣＣＲまたはＭＰＨＧ- ＣＣＲとの会合の数、アフィニティー並びに会合度の値を計算する。 １０ ノーザン分析 ＭＭＬＲ-ＣＣＲをコードする、インサイト社クローンNo.478861からの0.6kb SalI/NotIフラグメントを用いてClontech Labsから得られた種々の組織のノーザ ン分析を、0.2Ｘ ＳＳＣ/0.1％ＳＤＳ洗浄を用いて行った。この分析の結果、第 ５図に示す１６の組織、通常の心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓 、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸、及び白血球の全てにおいて4. 0kbの主要な転写物が存在することがわかった。第５図に示すように、転写物は 、肺、脾臓、胸腺、卵巣、小腸、末梢血の白血球の調製物において最も豊富に存 在していた。2.5kbのより小さい転写物は、胎盤にみられた。 上記のすべての刊行物及び特許明細書は、本明細書と一体に参照されたい。本 発明の記載した方法及びシステムの種々の変更例及び変形例は、 本発明の範囲及び精神から逸脱しないことは当業者には明らかであろう。本発明 は特に好適な実施例に関連して記載されているが、本発明の請求の範囲は、その ような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際 には、本発明を実施するために記載された方法の種々の変更例は、分子生物学或 いは関連する分野の当業者には明らかなように、以下の請求項の範囲内に含まれ るものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ ，ＣＨ，ＣＮ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＩＬ， ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＳＥ，ＳＧ，Ｕ Ｓ (72)発明者 コールマン、ロジャー アメリカ合衆国カリフォルニア州94041・ マウンテンビュー・＃２・マリポーザ 260 (72)発明者 ワイルド、クレイグ・ジー アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ サニーベイル・マンダリンドライブ 1239

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号：２の配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む精製ポリヌ クレオチド。 ２．前記核酸配列が、配列番号：１の配列を含むることを特徴とする請求項１に 記載の精製ポリヌクレオチド。 ３．前記ポリペプチドが、１２１番目の残基にイソロイシンを有することを特徴 とする請求項１に記載の精製ポリヌクレオチド。 ４．請求項２のポリヌクレオチドまたはその一部に相補的な配列を含むアンチセ ンス分子。 ５．請求項１のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。 ６．請求項５の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 ７．請求項１のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを含むmmlr-ccrポリヌ クレオチド配列の検出のための診断用組成物。 ８．配列番号：２のアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド。 ９．１２１番目の残基にイソロイシンを有することを特徴とする請求項８に記載 の精製ポリペプチド。 １０．請求項８のポリペプチドに対して特異的な抗体。 １１．配列番号：２のアミノ酸配列を有するＭＭＬＲ-ＣＣＲポリペプチドの生 成方法であって、 ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件の下で請求項６の宿主細胞を培養す る過程と、 ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むことを 特徴とする配列番号：２のアミノ酸配列を有するＭＭＬＲ-ＣＣＲポリペプチド の生成方法。 １２．複数の化合物のなかから請求項８のポリペプチドに対して特異的な結合親 和性を有するものを選別するためのスクリーニング方法であっ て、 ａ）複数の化合物を準備する過程と、 ｂ）請求項８のポリペプチドと、前記複数の化合物のそれぞれとを、適切な条 件の下で結合できるだけの十分な時間をかけて結合させる過程と、 ｃ）請求項８のポリペプチドと前記複数の化合物のそれぞれとの結合を検出し 、請求項８の前記ポリペプチドに特異的に結合する化合物を同定する過程とを含 むことを特徴とするスクリ−ニング方法。 １３．請求項１０の抗体を含むポＭＭＬＲ-ＣＣＲリペプチド配列の同定のため の診断用組成物。 １４．細胞内でのＭＭＬＲ-ＣＣＲの発現を抑制する方法であって、 請求項４のアンチセンス分子を前記細胞に効果的な量だけ投与する過程を含む 細胞内でのＭＭＬＲ-ＣＣＲの発現を抑制する方法。 １５．前記細胞がin vivoであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。 １６．配列番号：４の配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む精 製ポリヌクレオチド。 １７．前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号：２の配列を含むことを特徴とす る請求項１６に記載のポリヌクレオチド。 １８．請求項１６に記載のポリヌクレオチドまたはその一部分に相補的な配列を 含むアンチセンス分子。 １９．請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。 ２０．請求項１９の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 ２１．請求項１６のポリヌクレオチド、またはそのフラグメントを含むmphg-ccr ポリヌクレオチド配列の検出のための診断用組成物。 ２２．配列番号：４のアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド。 ２３．請求項２２のポリペプチドに対して特異的な抗体。 ２４．配列番号：４のアミノ酸配列を有するＭＰＨＧ-ＣＣＲポリペプチドの生 成方法であって、 ａ）前記ポリペプチドの発現に適切な条件の下で、請求項２０の宿主細胞を培 養する過程と、 ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むことを 特徴とする配列番号：４のアミノ酸配列を有するＭＰＨＧ-ＣＣＲポリペプチド の生成方法。 ２５．複数の化合物のなかから請求項２２のポリペプチドに対して特異的な結合 親和性を有するものを選別するためのスクリーニング方法であって、 ａ）複数の化合物を準備する過程と、 ｂ）請求項２２のポリペプチドと、前記複数の化合物のそれぞれとを、適切な 条件の下で結合できるだけの十分な時間をかけて結合させる過程と、 ｃ）請求項２２のポリペプチドと前記複数の化合物のそれぞれとの結合を検出 し、請求項２２の前記ポリペプチドに特異的に結合する化合物を同定する過程と を含むことを特徴とするスクリーニング方法。 ２６．請求項２３の抗体を含むＭＰＨＧ-ＣＣＲポリペプチド配列の同定のため の診断用組成物。 ２７．細胞内でのＭＰＨＧ-ＣＣＲの発現を抑制する方法であって、 請求項１８のアンチセンス分子を前記細胞に効果的な量だけ投与する過程を含 む細胞内でのＭＰＨＧ-ＣＣＲの発現を抑制する方法。 ２８．前記細胞がin vivoであることを特徴とする請求項２７に記載の方法。