JP2000510871A

JP2000510871A - 少なくとも一種の活性物質特にポリヌクレオチドを標的細胞中へ移送するのに使用できる新規脂質化合物およびこれを含む組成物、ならびに遺伝子治療における使用

Info

Publication number: JP2000510871A
Application number: JP10537387A
Authority: JP
Inventors: レナー、ビショフ; アブデスラム、ナジー; イブ、コルディエ
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1997-02-28
Filing date: 1998-02-27
Publication date: 2000-08-22
Also published as: CA2252942A1; AU727040B2; FR2760193A1; US20020151070A1; AU6735298A; FR2760193B1; US6335199B1; EP0948360A1; WO1998037916A1

Abstract

(57)【要約】本発明は次式の新規脂質化合物に関する：Ｒ−ＨＮ−［−（ＣＨ₂）_m−ＮＲ−］_n-1−（ＣＨ₂）_m−ＮＨ−Ｒ（Ｉ）｛式中Ｒ残基は、互いに独立に、水素原子または次式ＩＩにて表される基である：［式中、Ｒ₁およびＲ₂は、互いに独立に直鎖もしくは分岐型Ｃ₆〜Ｃ₂₃アルキルもしくはアルケニル基、または直鎖もしくは分岐型の基−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ₆−Ｃ₂₃）アルキルもしくは−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ₆−Ｃ₂₃）アルケニル、アリール基、シクロアルキル基、フルオロアルキル基、ポリエチレングリコール基、任意に置換され、任意繰り返しの直鎖もしくは分岐型オキシエチレンもしくはオキシメチレン基であり、ｐは１から４の正の全整数、ｎは１から６の正の全整数、ｍは各−（ＣＨ₂）_m−ＮＲ−単位、一層具体的にはｎ＞１の場合の各−（ＣＨ₂）_m−ＮＲ−単位の場合で異なり得る、１から６の正の全整数、式ＩＩのＲ基の数は１から４である］｝上記化合物は任意にカチオン形態であり、かつ生物学的に容認される一種または二種以上のアニオンと併用される。また本発明は、少なくとも一種の上記カチオン化合物と、上記活性物質の細胞への導入をする負電荷含有活性物質とを含む、新規複合体に関する。特に本発明は、この活性物質が細胞のトランスフエクションに有用な一種または二種以上の核酸からなる場合の、新規複合体に関する。

Description

【発明の詳細な説明】少なくとも一種の活性物質特にポリヌクレオチドを標的細胞中へ移送するのに使用できる新規脂質化合物およびこれを含む組成物、ならびに遺伝子治療における使用本発明は新規脂質化合物およびこれを含む新規組成物に関する。一層詳しくは本発明は、活性物質特に負電荷を含む治療的活性物質、特にポリヌクレオチドを標的細胞特に脊椎動物細胞、一層特定的には哺乳類細胞中へ運ぶためのベクターを調製するための上記化合物または上記組成物の使用に関する。遺伝子を所定細胞中へ運ぶことは遺伝子治療の基本である。応用分野の広いこの新規技術は、従来の治療法では著しい効果のない重い病気、または治療法がない重い病気の処置の想定を可能にさせたり、または遺伝子が原因の（血友病、嚢胞性繊維症、筋障害その他）、または後天的な（がん、ＡＩＤＳその他）疾病のいずれかに適用される。ここ３０年間に、各種異種遺伝子を細胞内特に哺乳類細胞内に導入させ得る多くの手段が開発された。異なるこれらの技法は二つのカテゴリーに分かれる。第１カテゴリーは、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたは粒子衝撃法（particle bombardment）等の物理的技法に関し、これらは有効ではあるが、in vitroでの応用は著しく制約さわ、その実施は煩雑で扱が難しい。第２カテゴリーには、分子および細胞生物学に関連する技法が包含され、ここでは運ぶ遺伝子を、上記材料の導入を促進する生物学的もしくは合成的素質を有するベクターに結合させる。最近の最も有効なベクターはウイルス特にアデノウイルスまたはレトロウイルスベクターである。開発された技法は、これらのウイルスが細胞膜を横切り、これらの遺伝子材料の分解を避け、かつ細胞核中へのこれらのゲノムの浸透を生起させる必要があるという、自然の性質に基ずいている。これらのウイルスは既に多数の研究対象になっており、ある種のものは例えばワクチン接種、免疫療法または遺伝子欠損を補うことを意図した治療の目的で、ヒトの場合の遺伝子用ベクターとして実験的に既に使用されている。しかし、このウイルス的アプローチには多くの制約があり、特にウイルスゲノム中へのクローニング能力の制約、宿主生物中および環境中への産生された感染性ウイルス粒子の拡散されるリスク、レトロウイルスベクターの場合のように宿主細胞中への挿入による人工的突然変異誘発のリスク、および治療的処置時のin vivoでの免疫および炎症性応答の高い誘発が原因で、想定できる多数の治療法の適用が著しく制約されている（McCoyら.，1995，Human Gene Therapy，6，1553-1560;Yangら.，1996，Immunity，1，433-442）。これらの多数の欠点特にヒトへの使用に関連する欠点が、幾つかのチームをしてポリヌクレオチドを移転させる別途システムの開発に導いた。最近ではいくつかの非ウイルス法が利用できる。例示として、リン酸カルシウムを用いる共沈降法、ウイルスシステム擬態の受容体の使用（CottenおよびWagn er，1993，Current Opinion in Biotechnology，4，705-710参照）、またはポリアミドアミン等のポリマーの使用（HaenslerおよびSzoka，1993，Bioconjugate Chem.，4，372-379）または樹枝状ポリマーの使用を記載したＷＯ第95/24221号に開示のようなポリマーの使用、ポリエチレンイミンの使用（文献ＷＯ第96/026 55号に記載)、またはポリプロピレンイミンの使用およびポリリシン複合体の使用（米国特許第5,595,897号およびＦＲ第2,719,316号に記載）が挙げられる。他の非ウイルス技法はリポソームの使用に基ずいており、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、またはある種医薬的活性物質等の、ある種生物学的高分子を細胞中へ導入させ得る薬剤としてのこのものの有用性については広く文献中に記載がある。この結果、幾つかのチームは細胞膜および／または核酸に対して高い親和力を有するカチオン脂質の使用を既に提案している。事実、核酸の場合には、この種高分子はin vivoである種細胞の原形質膜を横切ることがでることが判っているが（ＷＯ第90/11092号）、にも係わらず、観察されたトランスフエクション効率は依然として著しく限定されており、その理由はそれ自体が負の正味の見掛け電荷を有する細胞膜を横切ってこれらが通過するのを妨げる核酸のポリアニオン的素質が主因である。1989年以降（Felgnerら.，Nature，337，387-388 ）、カチオン脂質は、ある種細胞中への核酸等の大きなアニオン分子の導入を促進するのに有利な分子として紹介されてきた。これらのカチオン脂質はアニオン分子を複合体化（complexing）する能力があり、したがって上記分子上の負電荷を中和し、かつこれらが細胞へ接近するのを促進する傾向がある。多数のチームは既に各種カチオン脂質を開発している。例示として、ＤＯＴＭA(Felgnerら.， 1987，PNAS，84，7413-7417)、ＤＯＧＳまたはTransfectam^TM(Behrら.，1989,PN AS，86，6982-6986)、ＤＭＲＩＥおよびＤＯＲＩＥ(Felgnerら.，1993，Meihods 5，67-75)、ＤＣ−ＣＨＯＬ(GaoおよびHuang，1991，BBRC，179，280-285)、ＤＯＴＡＰ□(McLachlanら.，1995，Gene Therapy，2,674-622)またはLipofectami ne□、ならびに特許出願ＷＯ第9116024号またはＷＯ第9514651号記載のものが挙げられる。一層具体的には、特許出願ＷＯ−Ａ−第9116024号には、次式：［式中、Ｒ₁およびＲ₂は特定アルキルまたはアルケニル基；Ｙ₁およびＹ₂は基−ＯＣＨ₂−、−ＯＣ（＝Ｏ）−または−Ｏ−；Ｒ₃およびＲ₄はアルキルまたはアルケニル基；Ｒ₅はアルキレン鎖；Ｒ₆はＣ（＝Ｏ）−（ＣＨ₂）_m−ＮＨ−、ジアミノカルボン酸または上記ジアミノカルボン酸に結合した−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ₂）_m−ＮＨ−；Ｒ₇はＨ、スペルミン、スペルミジン、ヒストン、タンパク質、アミノ酸またはポリペプチドを示す］のカチオン脂質が記載されている。しかし、いくつかの研究（例えば、MahatoらのJ．Pharm．Sci.，1995，84，12 67-1271，Thierryらの1995，P.N.A.S.，92，9742-9746参照）によれば、細胞中へアニオン高分子を運ぶ効率は、特に複合体と細胞膜との間の相互作用、対象細胞、カチン化合物の脂質組成、アニオン分子で形成された複合体の大きさに依存して変わり、一層詳細には上記複合体の異なった成分上の正電荷および負電荷間の比に応じて変わることが実証されている。特にこの複合体と細胞膜との間の相互作用を許容し、かつ細胞中への複合体の移送を可能にする機構は、未だ十分に解明されておらず、研究者らは高度に経験的なアプローチに基ずいて研究を進めている。これに加えて、例えば複合体の形成、その安定性、in vivoにおけるその挙動、またはそれらの毒性の可能性等の他の因子が脂質の選択の推定を不明にしている。その結果、改良された性質、または既に記載されたカチオン脂質とは異なった性質を有する可能性のある他のカチン脂質の提供が願わしい。この度、本発明者は負電荷を含む活性物質特に治療活性物質、特にポリヌクレオチドを標的細胞中に移送すのに特に有用な、カチオン形態で提供し得る新規脂質を確認したが、このものは遺伝子治療との関連で特にin vivoにおける用途が考えられる。したがって、本発明の目的は先ず第一に次式：Ｒ−ＨＮ−［−（ＣＨ₂）_m−ＮＲ−］_n-1−（ＣＨ₂）_m−ＮＨ−ＲＩ｛式中、Ｒ残基は、互いに独立に、水素原子または次式ＩＩの基である：［式中、Ｒ₁およびＲ₂は、互いに独立に、直鎖もしくは分岐のＣ₆〜Ｃ₂₃アルキルもしくはアルケニル基、または直鎖もしくは分岐の基−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ₆− Ｃ₂₃）アルキルもしくは−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ₆−Ｃ₂₃）アルケニル、アリール基、シクロアルキル基、フルオロアルキル基、ポリエチレングリコール基、任意に置換され、任意に繰り返しの直鎖もしくは分岐のオキシエチレンもしくはオキシメチレン基であり、ｐは１から４の正の整数、ｎは１から６の正の整数、ｍは各モチーフの−（ＣＨ₂）_m、一層特定的にはｎ＞１の時各モチーフの−（ＣＨ₂）_m−ＮＲ−の場合で異なり得る、１から６の正の整数、式ＩＩのＲ基の数は１から４である］｝にて表される脂質化合物である。 ”アルケニル”なる用語は、炭素鎖が上記鎖に沿った一つまたは二つ以上の二重結合を含むことを意味すると理解される。特定の場合によれば、本発明は次式：Ｈ₂Ｎ−［−（ＣＨ₂）_m−ＮＨ−］_nＲＩＩＩＲＮＨ−［−（ＣＨ₂）_m−ＮＨ−］_nＨＩＩＩａ｛式中、Ｒは上記定義のような式ＩＩの基である｝およびＨ₂Ｎ−［−ＣＨ₂）_m−ＮＲ］_n-1−（ＣＨ₂）_m−ＮＨ₂ ＩＩＩｂ［式中、少なくとも一つのＲは式ＩＩの基であること前提に、Ｒは式Ｉの場合に示した意味の一つを有し、かつこれらの式のそれぞれの場合：ｎは１から６の正の整数、ｍは各モチーフの−（ＣＨ₂）_m、一層特定的にはｎ＞１の時各モチーフの−（ＣＨ₂）_m−ＮＲ−の場合で異なり得る、１から６の正の整数である］の化合物から選択された化合物に関する。好ましい場合によれば、式ＩＩＩｂの化合物は式ＩＩの一つまたは二つのＲ基を含む。本発明の好ましい態様によれば、相互の組合せもしくはそうでないものをとる次の変形も選択される： − Ｒ₁およびＲ₂は互いに抽立に直鎖型−Ｃ（＝Ｏ）−アルキルもしくは直鎖型−Ｃ（＝Ｏ）−アルケニル基であり、 − 脂質が式ＩＩの１または２Ｒ基を含む場合のＲ₁およびＲ₂は互いに独立に炭素原子１２から２０、好ましくは炭素原子１２、１６または１８の− Ｃ（＝Ｏ）−アルキルもしくは−Ｃ（＝Ｏ）−アルケニル基であり、 − ｎは数２、３または４から選択した整数、 − ｍは数２、３または４から選択した整数である。特定の場合によれば、Ｒ₁およびＲ₂は炭素原子６から１０を有する基であるが、この場合、式ＩＩのＲ基の数が２、３または４に等しい場合の化合物が好ましく選択されるように、アルキルもしくはアルケニル鎖の長さを低減することができる。本発明の脂質は次式：［式中、Ｒ₁およびＲ₂は同一であり、かつステアロイルおよびオレオイル基から選択される］の化合物からなる群から選択するのが好ましい。本発明化合物は、次式：［式中、Ｒ₃およびＲ₄は保護基、特にFmoc（Grandasら、1989，Int．Journalpep t．prot．Res．vol 33，386-390)］の化合物を、次式のアミン：Ｒ₅ＮＨ［（−ＣＨ₂）_m−ＮＲ₅］_n-1（ＣＨ₂）_mＮＨＲ₅ ＶＩ［式中、ｍおよびｎは式中Ｉの場合と同じ意味を有し、Ｒ₅は保護基、特にｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）または水素原子であり、Ｒ₅基の少なくとも一つおよびＲ₅基の多くて四つは水素原子に該当する］と反応させて調製する。次いで官能基Ｎ−Ｒ₃および−Ｎ−Ｒ₄を脱保護してアミド化またはアルキル化により基Ｒ₁およびＲ₂を既知の方法で、特に対応の−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの作用により結合させる。得られた化合物はトリフルオロ酢酸の存在下に脱保護する。式ＶＩのアミンは既知の方法で調製する。式ＶＩの化合物が１−４−ジ−ｂｏｃ−スペルミジンである場合、合成の実際的手順を知る目的で下記実施例が参照される。記載された方法は、当業者の能力以内の適合に従って本発明化合物の合成に一般的に応用し得る。しかしながら本発明の化合物は、上記調製方法により得られる化合物のみに限定はされない。加えて、本発明化合物は置換されてもよい。かかる置換体は特にラベル化分子（米国特許第4,711,955号公報ラベル化分子参照）からなり、これは細胞標的分子またはアンカー（anchoring）分子をin vitroまたはin vivoで投与後に、上記化合物の分布またはそれらを含む複合体の分布を肉視可能にする。その結果、本発明はまた、少なくともａ）炭素原子の一つ特に基Ｒ₁および／もしくはＲ₂上に存在するものから選択した炭素原子の一つ；またはｂ）上記ポリアミン鎖または上記ジアミノカルボン酸の第２もしくは第１窒素原子の一つ；の仲介で、一種もしくは二種以上の標的成分と複合した上記化合物（目的リガンドとも呼称される）にも関する。かかる成分は、特定細胞タイプを標的にすることが可能で、細胞中への浸透、エンドソームの溶解、または二者択一に細胞内輸送を容易にし、文献中に広く記載されている。例えばこれらは糖類、ペプチド（例えばＧＲＰペプチド、ガストリン放出ペプチド）、オリゴヌクレオチド、脂質、ホルモン、ビタミン、抗原、抗体、膜受容体特異性リガンド、抗リガンドと反応し得るリガンド、融合生成（fusogenic）ペプチド、核局在ペプチド、またはかかる化合物の組み合わせの全てもしくは一部であってもよい。一層特定的には、肝細胞表面のアシアロ糖ンパク質受容体を標的にし得るガラクトシル残基、インフルエンザウイルス血球凝集素サブユニットＨＡ−２（Plankら.,1994，J．Biol．Chem．26 9，12918-12924）由来の融合生成ペプチドINF-7またはSV 40ウイルスT抗原由来の核局在シグナル（LanfordおよびButel，1984，Cell 37，801-813）またはthe Epstein BarrウイルスEBNA-1タンパク質（Ambinderら.，1991，J．Virol．65，1 466-1478）が挙げられる。かかる複合体は文献に広く記載された技法により容易に得られるが、一層具体的には特にトリフルオロアセチルまたはFmocもしくはBoc等の保護基を用いたポリアミン上への化学的結合により、一層詳細にはProtective Groups in Organic Synthesis(頁309-406，1991，eds．T.W．Greene，P.G.M．Wuts，Wiley)中に記載のような直交保護基の一種または二種以上を用いて上記ポリアミンまたは上記ジアミノカルボン酸上に化学的結合して容易に得られる。次いで保護基を選択的に脱保護すると標的成分を結合することが可能になり、次いで脂質が脱保護される。しかし、ＣＨもしくはＣＨ₂基中の炭素原子等の非反応性基の置換は、当業者に既知の方法により本発明化合物の合成時に実施し得るはずであり、一方、第一級または二級アミン等の反応性基は本発明の新合成脂質上の置換の対象になり得る。本発明の有利な場合によれば、上記化合物はカチオン形態のもの、すなわち上記ポリアミン鎖上に存在する一つまたは二つ以上の窒素原子上へのプロトンの結合によりプロトン化された形態のものである。この場合の上記カチオン脂質は、例えばトリフルオロアセテート、ハロゲン化物、モノメチルスルフェート、アセテートもしくはホスフェート、ヨウ化物、塩化物、または臭化物アニオンその他等の一種または二種以上の生物学的に許容されるアニオンと結合している。例えばメチルもしくはエチル基等を用いたアミンの置換により、カチオン形での化合物の取得もできる。本発明の他の局面では、本発明はまた少なくとも一種の上記化合物および任意に上記化合物と活性物質との間の複合体形成を増進し得る、または細胞指向のこれら複合体の機能を増進し得る少なくとも一種の任意佐剤を含む組成物にも関する。かかる佐剤は、例えばトリグリセライド、ジグリセライド、コレステロール（例えば米国特許第5,438,044号公報参照）またはこれら由来の脂質等の中性または双性イオン脂質、特にホスフアチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスフアチジルコリン、ホスフオコリン、スフインゴミエリン、セラミドまたはセレブロシドまたはこれら由来の中性もしくは双性イオン脂質であることが好ましい。有利には、ジオレイルホスフアチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が選択される。本発明化合物と中性もしくは双性イオン脂質との重量比は一般に０．１から１０であるが、それは考慮される成分の性質に応じて変わる。当業者はこれらの僅かな順応を許容するに十分な知識を保有している。中性および／または双性イオン脂質の混合物または代わりにカチオン脂質ならびに中性および／もしくは双性イオン脂質の混合物を使用することも可能である。加えて本発明は、少なくとも一種の上記化合物または少なくとも一種の上記組成物および少なくとも一種の活性物質、特に少なくとも一つの負電荷を含む治療的活性物質を含む複合体に関する。本発明の変形によれば、上記複合体は更に上記例示の文献記載のような一種または二種以上のカチオン両親媒性剤を含有できる。特定の態様によれば、上記活性物質は核酸およびタンパク質から選択される。本発明複合体の活性物質はポリヌクレオチドであることが好ましく、この場合、次いで上記化合物または上記組成物はポリヌクレオチドの細胞中でのトランスフエクション能力を増進できる。 ”ポリヌクレオチド”なる用語は、二本鎖もしくは一本鎖、直鎖もしくは環状、天然、単離もしくは合成のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ断片を呼称し、修飾の有無（例えば米国特許第5,525,711号公報参照）、ラベル化の有無（例えば米国特許第4,711,955号またはＥＰ第302175号参照）等のヌクレオチドの正確なサクセッションを明示して、これによりサイズに限定されずに核酸の断片もしくは領域を定義できるものと理解される。ポリヌクレオチドは、特にｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、トランスフアーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、またはかかるＲＮＡをコードするＤＮＡを呼称するものと理解される。”ポリヌクレオチド”または”核酸 ”は本発明の関連では同意語である。”アンチセンス”なる用語は、標的配列と相補な配列を有する核酸を指し、例えば標的配列とのハイブリッド形成により発現をブロックすると考えられるｍＲＮＡ配列を有する核酸を指し；”センス”なる用語は、標的配列と相同もしくは同一の配列を指し、例えばタンパク質の転写因子に結合し、かつ所定遺伝子の発現に関与する配列を有する核酸を指すものと理解される。本発明の特定の態様における上記ポリヌクレオチドは、目的の遺伝子および上記目的遺伝子の発現を許容する成分を含む。この態様では、上記ポリヌクレオチドはプラスミドの形態であることが有利である。発現を許容するこの成分は、ＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡまたはｍＲＮＡ）への上記ＤＮＡ断片の転写を許容し、かつポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳を許容する全ての成分である。これらは特に上記細胞中で有効なプロモーター配列および／または調節配列であり、かつ任意に標的細胞表面で上記ポリペプチドの排出または発現を許容するのに必要な配列である。例示として、ウイルスRSV、MPSV、SV40、CMVまたは7.5のプロモーター、ワクシニアウイルスのプロモーター、筋クレアチンキナーゼ、アクチン、または肺表面活性物質（surfactant）をコードする遺伝子のプロモーター等のプロモーターを挙げることができる。さらに、所定の細胞タイプに特異的なプロモーター配列、または規定条件下に活性化し得るプロモーターを選択することも可能である。かかるプロモーター配列については文献により多数の情報が提供されている。その上、上記ポリヌクレオチドは、転写プロモーター活性を示す同一または異なる少なくとも二つの配列、および／または転写プロモーター機能もしくは上記配列の転写が影響されない限りは、同一方向または反対方向に互いに遠く離れて、隣接して位置する、同一または異種の少なくとも二つのコードＤＮＡ配列を含み得る。同様に、このタイプの核酸構造体中に、転写に無影響で転写工程に先立ってスプラシングされる“中性”核酸配列もしくはイントロンを導入することもできる。かかる配列およびそれらの用途は文献に記載がある。上記ポリヌクレオチドは細胞内輸送、複製および／または組み込みに必要な配列も含むことができる。かかる配列は当業者には周知である。さらに、本発明ポリヌクレオチドは、標的細胞のゲノム中に組み込まれることができないように修飾されたポリヌクレオチドまたは例えばスペルミン等の薬剤の助けで安定化されるポヌクレオチドであってもよい。本発明の関連では、ヌクレオチドは標的細胞に対して相同または異種であってもよい。ポリペプチド特に治療活性もしくは予防活性を有するポリペプチド、一層特定的には細胞または体液タイプの免疫原活性を有するポリペプチドの全てまたは一部をコードするポリヌクレオチドの使用が有利であり得る。ポリペプチドなる用語は、その大きさまたはその修飾（例えばグリコシル化）の程度には制約されないものと理解されたい。例示として、酵素、ホルモン、サイトカイン、膜受容体、構造ポリペプチド、膜チャンネル形成ポリペプチド、輸送ポリペプチド、粘着分子、リガンド；転写調節因子、翻訳調節因子、複製調節因子、または転写体安定化調節因子をコードする遺伝子、または抗体をコードする遺伝子例えばＣＦＴＲタンパク質、ジストロフイン、因子ＶＩＩＩまたはＩＸ、ＨＰＶのＥ6 ／Ｅ7、ＭＵＣｌ、ＢＲＡＣｌ、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、イターロイキン（ＩＬ）₂、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、腫瘍壊死因子（TNF）タイプα、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロフアージコロニー刺激因子）コード遺伝子、単純ヘルペスウイルスタイプ１（ＨＳＶ−１）ｔｋ遺伝子、網膜芽腫に伴う遺伝子またはｐ53または、断片Ｆ（ａｂ）₂、Ｆａｂ’、Ｆａｂまたは抗イデイオタイプ（米国特許第4,699,880号公報）等の免疫グロブリンの全部もしくは一部に伴う遺伝子が挙げられる。このリストは当然ながら限定的ではなく、他の遺伝子も使用できる。好ましい態様における本発明複合体は、小サイズ（５００ｎｍ未満、有利には２００ｎｍ未満、一層好ましくは１００ｎｍ未満）である。さらに、トランスフェクション実験の実施によれば、本発明の脂質化合物：上記ポリヌクレオチドの重量比は有利には０．０１から１００であることを示している。最適比は０．０５から１０である。本発明はまた、カチオン化合物／アニオン活性物質の複合体の調製方法に関するものであり、この方法の特徴は一種もしくは二種以上のカチオン形態の脂質または脂質がカチオン形態である本発明組成物を、少なくとも一つの負電荷を含む一種または二種以上の活性物質と接触させ、任意の精製工程後に上記複合体を回収することにある。本発明はまた、一種または二種以上の脂質を含む複合体または一種または二種以上の本発明組成物を含む、かかる複合体を調製するためのキットにも関する。先ず最初の変形例によると、一種または二種以上のカチオン化合物を水混和性の適当量の溶剤もしくは溶剤混合物、特にエタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、または好ましくは１：１（ｖ：ｖ）エタノール／ＤＭＳＯ混合物で溶解し、例えば特許出願ＷＯ−Ａ−第9603977号に記載の既知方法に従って脂質凝集体を形成させ、または第２変形例によれば、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラニシド、または６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルボモイル）−メチル−α−Ｄ− グルコピラノシド等の洗剤（detergent）の溶液の適当量で懸濁する。次いでこの懸濁物を緩衝培養液中に置き、負電荷を含む活性物質溶液と混合する。最終複合体中に中性もしくは双性イオン脂質が存在することを所望する場合、水混和性溶剤中または洗剤溶液中に溶解するのに先立って上記カチオン化合物および例えばＤＯＰＥ等の上記中性もしくは双性イオン脂質を含む混合物を用いて既知方法でフイルムを形成させる。この方法の重要な特徴の一つは、カチオン脂質の正電荷と活性物質の負電荷との間の比の選択にある。特定の比により限定されることは望まないが、化合物またはカチオン組成物の正電荷数と活性物質の負電荷数との間の比は０．０５から２０、特に０．１から１５、好ましくは５から１０である。カチオン化合物および／または組成物の正電荷数と上記活性物質の負電荷数との間の比もまた、本発明複合体の有利な特性を構成する。かかる一定比に到達するための計算では、活性物質が有する負電荷を考慮に入れ、かつ上記比を満足するのに必要な化合物の量を調整する。他の成分の量と濃度はそれぞれのモル質量およびそれらの正および／または負電荷数にしたがって調整する。第２変形例および任意例の場合、洗剤を低減させ、複合体を回収する目的で引き続いて透析を行ってもよい。かかる方法の原理は、例えばHoflandらの（1996, PNAS 93,頁7305-7309）中に記載があり、またPhilippotらによる文献（G．Grego riadis，81-89，CRC Press 1993）の第ＩＩ章に記載されている。第１変形例では、得られた複合体のサイズに関して優れた結果が得られることが示された。第３変形例によれば、一種または二種以上の組成物または化合物を緩衝液中に懸濁し、次いでこの懸濁物を、視覚で均質性が得られるまで音波処理にかける。この脂質懸濁物を次いで適当な圧力下に二つの微細孔膜を通じて押し出す。次いで脂質懸濁物を負電荷を含む活性物質溶液と共に混合する。この複合体中に中性脂質が存在する場合は、懸濁物としての調製に先立ってカチオン脂質とＤＯＰＥ等の中性脂質との混合物からなるフイルムが既知の方法で形成される。カチオン脂質の正電荷と活性物質の負電荷との間の比についての同じ所見が、第１変形例で示したように、この第３変形例にも適用される。このいわゆる音波−押出技法は当分野では周知である。形成される複合体の特徴は種々の方法で評価きるが、これにより例えば： −特に活性物質が核酸である場合、アガロースゲル電気泳動による遊離核酸の確認による活性物質との複合体形成状態の決定、 −弾性光散乱による、粒子サイズの決定、 −長期に亘る沈殿不在の決定を可能ならしめる。また本発明目的は、上記方法を用いて得られる複合体でもある。また本発明は、少なくとも一種の活性物質特に治療的活性物質、一層特定的には核酸をin vitro、ex vivo、またはin vivo、特にin vivoで標的細胞中へ移すための本発明化合物、組成物または複合体の使用にも関する。本発明の”標的細胞”なる用語は、原核生物細胞、酵母細胞および真核細胞、植物細胞、ヒトまたは動物細胞、および特に哺乳類細胞を意味するものと理解されたい。その上、がん細胞を挙げるべきである。本発明はIn vivoで、肺、気管，皮膚、筋肉、脳、肝臓、心臓、ひ臓、骨髄、胸腺、膀胱、リンパ、血液、膵臓、胃、腎臓、卵巣、睾丸、直腸、末梢または中枢神経系、眼、リンパ器官、軟骨および内皮等の組織の間質または管腔の空間のレベルで応用できる。本発明の有利な選択によれば、上記標的細胞は筋細胞、造血幹細胞またはこれとは別に気道細胞、より具体的には気管または肺の細胞、および有利には呼吸器上皮細胞である。本発明複合体は治療、予防またはワクチン目的の医薬として使用できる。したがって本発明の目的はまた、治療、予防またはワクチン目的の医薬としての本発明の複合体である。かかる複合体は、少なくとも一種の治療的活性物質特にポリヌクレオチドを標的細胞特に哺乳類細胞中に移送することからなる治療的処置方法、一層正確には筋細胞、造血幹細胞、気道細胞、一層詳しくは気管または肺細胞、呼吸器上皮細胞中に移送することからなる治療的処置方法に使用できる。本発明化合物は、筋細胞または肺細胞中に核酸を輸送するのに特に有用である。このものはｐｃＴＧ37として書き留めた化合物である（実施例参照）。一層広範には本発明は、負電荷を含む活性物質を細胞中へ特にin vitroで導入するための方法にも関し、この方法は細胞、特に適切な培地上で培養した細胞を、少なくとも一つの負電荷を含む本発明による複合体カチオン化合物／活性物質と、特に複合体懸濁物の形態で接触さることを特徴とする。一定保温時間後、細胞を洗浄し回収する。活性物質の導入はいずれか適切な手段で照合（任意に細胞の溶解後）できる。導入方法自体は周知である。”導入”なる用語は、負電荷を含む活性物質が細胞中へ移送され、プロセスの終わりに上記細胞内部またはその膜のレベルに位置されることを意味するものと理解される。活性物質が核酸である場合、一層具体的に”トランスフエクション”として引用される。この場合、核酸のトランスフエクションの証明は適当な手段、例えば考慮される遺伝子の発現の測定または発現タンパク質濃度の測定により実施できる。一層特定的には本発明はヒトまたは動物の体の治療、特に遺伝子治療による処置を意図して、本発明化合物、組成物または複合体を治療、予防またはワクチン目的の医薬の調製のための使用に関する。最初の可能性にしたがえば、この医薬は例えば筋肉中へ、エアゾール等により肺中へin vivoで直接投与できる。また患者からの細胞（骨髄幹細胞、末梢血液リンパ球、筋肉細胞等）を採取し、本発明に従ってin vitroでこれらをトランスフエクションし、患者にこれらを再投与することからなるex vivoでのアプローチも採用可能である。本発明複合体は、注射器もしくは他の任意の同等手段、気道または粘膜処置用の吸入、点滴、エアゾール化等の適当なシステムにより筋肉内、気管内、鼻腔、脳内、胸膜内、腫瘍内、心臓内，胃内、腹腔内、表皮内、静脈内もしくは動脈内ルートで投与できる。また、クリームの適用、経口投与、または当業者に十分周知で本発明に適用できる他の任意の手段による投与方式を挙げることができる。また上記複合体中の、化合物もしくは組成物／治療活性物質比、複合体の見掛け電荷（特にLiuら.，1997，Gene Therapy，4，517-523;Thierryら.，1995，P.N .A.S.，92，9742-9746）を調節するように調製した本発明の複合体を投与、特に静脈内ルートで投与して特定器官または組織を標的にすることも本発明範囲に入る。本発明はまた、本発明組成物の適当量を患者に投与することからなる遺伝子治療方法にも関する。本発明によれば、およびin vivoでの遺伝子治療の関連で、投与した化合物の一つに対する重大な免疫反応をなんら引き出すことなく、所定患者にこの方法を提案通り数回繰り返すことが可能である。単回投与でも、または一定間隔を隔てた繰り返し１回投与もしくは数回の投与でもよい。繰り返し投与によれば、治療活性物量の量の低減、一層特定的にはＤＮＡの所定１回投与量の低減が可能になる。適切な投与経路および用量は、例えば処置を受ける個人もしくは病気、あるいは移送されるポリヌクレオチド等の各種パラメーターに応じて変わる。一層特定的には本発明は、例えば医薬調剤を貯蔵目的で安定化し得る、および／または上記複合体のトランスフエクション能を増進せしめ得る少なくとも一種の佐剤を追加的に任意に含有するような上記複合体の少なくとも一種を含む医薬調剤に関するものである。かかる佐剤は例えばクロロキン；プロピレングリコール、ポリチレングリコール、グリセロール、エタノール、１−メチル−Ｌ−２− ピロリドンまたはこれらの誘導体から特に選択したプロトン性極性化合物；またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジエチルスルホキシド、ジ−ｎ−プロピルスルホキシド、ジメチルスルホン、スルホラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、テトラメチル尿素、アセトニトリルまたはこれらの誘導体から特に選択した非プロトン性極性化合物；からなる群から選択できる。同様に上記調剤は、ヒトまたは動物への投与を可能にする、医薬的に容認し得る担体も含み得る。 in vivoでの本発明治療方法の使用の関連で、上記医薬調剤の投与に先立って、更にトランスフエクション率を増進させ得るマクロフアージの一時的減少の観測が示される患者の治療を行うことは可能である。かかる技術は文献に記載がある；特にVan Rooijenら.，1997，TibTech．15，178-184参照。最後に本発明は、上記定義の複合体でトランスフエクションされた細胞特に原核細胞、酵母細胞または真核細胞、特に動物細胞特に哺乳類細胞、および特にがん細胞に関するものである。本発明の好ましい場合によれば、上記細胞は気道の細胞、一層具体的には気管もしくは肺細胞、有利には呼吸器上皮の細胞である。次の実施例はいかなる態様の制限なしに本発明を説明する。この説明と一体部分をなす合成法の略説明図を図１として添付する。図２は本発明の複合体の静脈注射後の観察結果を示し、ルシフェラーゼ活性はＲＬＵ／ｍｇ・タンパク質で示した。実施例Ｒ₁およびＲ₂は同種であり、オレオイルまたはステアロイル基であり、ｎ＝２；ｍα＝３、ｍβ＝４の場合のカチオン脂質（式Ｉ）の調製を、合成経路略図（図１）を参照に次に記載する。αおよびβはカルボニルからの−（ＣＨ₂）_m−ＮＨ−モチーフの位置である。ｎ＝２；ｍα＝３、ｍβ＝４、Ｒ＝オレオイル（ｐｃＴＧ37）の場合の式Ｉのカチオン脂質の合成（図１参照）中間体１，４−ジ−ｂｏｃ−スペルミジンの合成１，４−ジ−ｂｏｃ−スペルミジンを得るために適用したプロトコールはGood nowらの（1990，Tetrahedron 46，3267-3286）により公表されている。実施において、この中間体Ｎ−プロピオニトリル−１，４−ジアミノブタンはジクロロメタン３．８ｍｌ＋メタノール２ｍｌ中に０℃で希釈したジアミノブタン３７．６ｍｍｏｌ（Fluka;照会32790）をアクリロニトリル１８．８ｍｍｏｌ（Fluka;照会0710）と２０℃で１時間反応させて得る。反応生成物のアミノ基は２／１ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＣＨ₃ＯＨ溶媒５０ｍｌ中のＢＯＣ−ＯＮ［（２−ｂｏｃ−オキシイミノ）−２−フエニルアセトニトリル］９９ｍｍｏｌ（Fluka;照会15475）を用いて保護する。この保護反応は一夜室温で放置して行う。溶剤を蒸発で除き、酢酸エチル７５ｍｌ中に溶解し、１ＭＮａＯＨ７５ｍｌを用いて生成物を３回抽出する。有機相を５％クエン酸で再度抽出し、蒸発乾燥に先立ちＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥・濾過する。次いでＬｉＡｌＨ4（Sigma;L0260）２０ｍｍｏｌの存在下、ニトリル還元工程をエーテル中０℃で実施する。１時間３０分後、１ＭＮａＯＨ２０ｍｌを０℃で添加して反応を停止させる。この間に水素が発生する。混合物を濾過し、２０％ＮａＣｌ水溶液で３回抽出する。エーテル画分を乾燥後、生成物を２／１ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＣＨ₃ＯＨ溶剤中、シリカカラム上に沈着させ、次いで１５／５／１ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＣＨ₃ＯＨ／（Ｃ₂Ｈ₅）₃Ｎ溶剤中で溶離する。ジ−ｂｏｃ−スペルミジン含有画分を薄層クロマトグラフイーにかけて測定する。合成された量（１．４５ｇ；５．１ｍｍｏｌ）−アセトニトリル量基準収率２７％ｐｃＴＧ37の合成Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（Sigma;H2006）１４０μｍｏｌ、次いで無水テトラドロフラン１ｍｌ中のジ−ｂｏｃ−スペルミジン１４０μｍｏｌ、および最後にＣＨ₂Ｃｌ₂２ｍｌ中に希釈したジシクロヘキシルカルボジイミド（Si gma;D3128）１８０μｍｏｌをＮ−α Ｎ−β，ジ−Ｆｍｏｃ−ジアミノプロピオン酸（Bachem B2265）１４０μｍｏｌ中に加える。２時間反応後、生成したジシクロヘキシル尿素を濾過し、この生成物を９９／１ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＣＨ₃ＯＨ溶剤中のシリカカラム上で精製する。蒸発後、２０％ピペリジン、２０％テトラドロフランおよび６０％ＣＨ₂Ｃｌ₂溶液中で１時間、Ｆｍｏｃ基を生成物から除去する。蒸発後、１／１ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＣＨ₃ＯＨ溶剤中のシリカカラム上で更なる精製を行う。生成物を含む画分は薄層クロマトグラフイーにより測定を行う。この生成物は最終結合に先立ち乾燥する。無水ＣＨ₂Ｃｌ₂５ｍｌ中に希釈したオレイン酸（Sigma;0 9506）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル５１０μｍｏｌをジ−ｂｏｃ−スペルミジン−ジアミノプロピオンアミド中に加える。蒸発後、生成物をシリカカラム（エーテル／酢酸エチル；１／１）上で精製する。ＣＨ₂Ｃｌ₂１ｍｌ中に溶解し最終生成物は、トリフルオロ酢酸(Fluka 91699) １０ｍｌ中でＢｏｃ脱保護する。トリフルオロ酢酸を除くために、ｎ−ヘキサン５０ｍｌ中に希釈後、減圧下に蒸発を行う。合成の全体収率：６４％（８９ｍｇ；９０μｍｏｌ）質量スペクトル；測定値 759.7 Da（計算値760.2 Da）ｎ＝２、ｍα＝３、ｍβ＝４；Ｒ＝ステアロイルの場合の式Ｉのカチオン脂質 (脂質ｐｃＴＧ39)の合成ステアリン酸およびカップリング剤としてのジシクロヘキシルカルボジイミドまたは（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリ−ピロリジノホスフオニウム・ヘキサフルオロホスフエート（ＰｙＢＯＰ）を用いて同じ方法で化合物pc ＴＧ39 １４０μｍoｌを調製する。合成の全体収率：２２％（３０ｍｇ；３０μｍｏｌ）質量スペクトル；測定値 764.5 Da（計算値764.3 Da）エタノール中への懸濁による脂質−ＤＮＡ複合体の調製１．複合体脂質pc ＴＧ37、任意にＤＯＰＥ，−ＤＮＡの調製脂質の量は最終ＤＮＡ（in vitroで試験の場合０．１ｍｇ／ｍｌ）濃度、所望電荷比、選択カチオン脂質のモル質量および正電荷数に準拠して計算する。カチオン脂質により提供される正電荷と最終ＤＮＡ濃度０．１ｍｇ／ｍｌにおけるＤＮＡにより提供される負電荷間の比が１０における、ｐｃＴＧ 37／ＤＯＰＥとプラスミドＤＮＡとの間の複合体を得るには、次の計算に従って異なる成分を混合する：ＤＮＡ０．１ｍｇ／ｍｌすなわちｍｌ当り（０．１／３３０）ｍｍｏｌの負電荷（３３０Ｄａはヌクレオチドの平均分子量）は０．３０μｍｏｌ／ｍｌの負電荷に該当する。１０倍を超える正電荷を得るには、カチオン脂質により提供される３．０μｍｏｌ／ｍｌの正電荷濃度が必要である。トリフルオロ酢酸形態のｐｃＴＧ37のモル質量は９８８ｇ／ｍｏｌであり、またこの分子は２正電荷を含む。したがって、ｐｃＴＧ37の１．５μｍｏｌ／ｍｌが必要であり、これは１．４９ｍｇ／ｍｌに該当する。Ｌ−α−ジオレオイル−ホスフアチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ、７４４ｇ／ｍｏｌ、Sigma;P0510）の等モル濃度を得るには、脂質調製において１．１２ｍｇ／ｍｌが必要である。他の化合物の場合の量と濃度はそれぞれのモル質量とそれらの正電荷数にしたがって調節する。この脂質をクロロホルム中に溶解し、蒸発・乾燥し、次いでクロロホルム／メタノール（ｖ：ｖ）中に溶解し、再度乾燥する。カチオン脂質を秤量し、１０または２０ｍｇ／ｍｌのクロロホルムストック溶液から上記量のＤＯＰＥを、アルコールおよびＵＶで滅菌したガラス管中に加え、カチオン脂質濃度２ｍＭを得る。この溶剤を４０回転／分の渦動(Labconco，Rapidvap，Uniequip，Martinsried ，Germany)を用いて４５℃で４５分間減圧［０．２×１０５Ｐａ（２００ｍｂａｒ）］下に蒸発する。脂質フイルムを５０ｍｇ／ｍｌのカチオン脂質濃度になるようにエタノール中に溶解する。ｐｃＴＧ37/DOPE １．４９ｍｇ＋１．１２ｍｇ＝２．６１ｍｇ（３０μｌエタノール中）。この溶液を２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５（ＮａＯＨで調整）を用いて２７０μｌに調整して最終５ｍｇ／ｍｌ溶液を調製する。プラスミドＤＮＡは１ｍｇ／ｍｌストック溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）から調製する。最終０．５ｍｌ溶液の場合、ストック溶液（５０μｇＤＮＡ）５０μｌを採取し、これに２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５の３００μｌを加える。ＤＮＡを脂質調製物と複合化するために、この脂質をＤＮＡに添加する。ピペットを使って吸入／吐き出し（１０回）によりこの懸濁物を混合する。複合体は＋４℃で貯蔵する。０．１ｍｇ／ｍｌＤＮＡおよび電荷比１０の複合体０．５ｍｌを得るために、ＤＮＡ溶液３５０μｌにｐｃＴＧ37／ＤＯＰＥ１５０μｌを加える。複合体の調製は層流キヤビネット下に実施する。得られる複合体の特性を表１に示す。２．複合体脂質ｐｃＴＧ39、任意にＤＯＰＥ、−ＤＮＡの調製上記と同じプロトコールに従って複合体を得る。洗浄剤溶液中への懸濁による脂質−ＤＮＡ複合体の調製１．複合体脂質ｐｃＴＧ37、任意にＤＯＰＥ、−ＤＮＡの調製最終ＤＮＡ濃度（in vitroで試験の場合０．１ｍｇ／ｍｌ）、所望電荷比、モル質量および選択したカチオン脂質の正電荷数に準拠して上記のように脂質の量を計算する。アルコールおよびＵＶで滅菌したガラス管中で脂質を混合し、２ｍＭカチオン脂質溶液（上記参照）を得る。この溶剤を蒸発し、脂質フイルムをｎ −オクチル、β−Ｄ−グルコピラノシド（オクチルグルコシド、Sigma，0 9882 ）溶液中にカチオン脂質／洗剤比１：５（モル：モル）で溶解する。２０ｍＭオクチルグルコシド３７５μｌの２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５溶液を採取し、pcＴＧ37／ＤＯＰＥ脂質混合物のフイルムを溶解するのに用いる。プラスミドＤＮＡは１ｍｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡストック溶液から最終容量０．５ｍｌ（最終０．１ｍｇ／ｍｌ）の場合、５０μｌを取り除き、これに２０ｍＭＨＥＰＥＳのｐＨ７．５を添加する。ピペットを用いて１０回の吸入・吐き出しにより脂質懸濁物１８７．５μｌをＤＮＡに加え、ＤＮＡ０．１ｍｇ／ｍｌおよび＋／−電荷比１０の最終懸濁物得る。洗剤除去のために、２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５に対して室温で３回、透析マイクロバッグ（１３．２ｋＤのカット・オフ；Sartorius，Gottingen，Germany）中で４時間透析を行う。透析済みＤＮＡ／脂質複合体は＋４℃で貯蔵する。この調製は層状流れキヤビネット中で行う。得られる複合体の特性を次表１に示す。２．脂質ｐｃＴＧ39複合体、任意にＤＯＰＥ、−ＤＮＡの調製同じプロトコールに準拠し、表１に示す特性の複合体を得る。音波押出による脂質−ＤＮＡ複合体の調製最終ＤＮＡ濃度（in vitroで試験の場合０．１ｍｇ／ｍｌ）、所望電荷比、モル質量、選択したカチオン脂質の正電荷数に準拠して上記のように脂質量を計算する。アルコールおよびＵＶで滅菌したガラス管中で脂質を混合し、２ｍＭカチオン脂質溶液（上記参照）を得る。溶剤を蒸発し、脂質フイルムを２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５の９００μｌ中に４℃で約１６時間で溶解する。この懸濁物を音波浴（Bransonic 221）中、肉視で均一になるまで音波処理する。直径０．２μｍ（Nucleopore，Costar，Cambridge，MA，USA）の孔を有する膜２枚を通じてこの脂質懸濁物を押し出し、最高圧５０バールで２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５を用いてリンスする（Lipex Biomembranes，Vancouver，Canada製押出機）。この脂質懸濁物を室温で１時間放置する。プラスミドＤＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ）ストック溶液５０μｌに脂質懸濁物４５０μｌを加え、ピペットで吸入／吐き出し１０回により混合する。脂質／ＤＮＡ複合体は＋４℃で貯蔵する。この調製は層状流れキヤビネット中で行う。脂質によるＤＮＡの複合体化の評価のプロトコールＴＡＥ緩衝液（ＴＡＥ：Tris 4.86g/l+酢酸ナトリウム0.68g/l+ＥＤＴＡ 0.33 6g/l pH7.8）中で１％（ｗ：ｖ）アガロースゲルを調製する。必要に応じて、ＴＡＥ中に試料を希釈し、次いで試料緩衝液０．０８３％ブロモフエノールブルー、０．０８３％シアノールキシレンＦＦ、１０％グリセロール水溶液を加えて５０ｎｇＤＮＡ／μｌとする。この試料を軽く渦撹拌し、室温で３０分放置する。対照として、同一濃度で調製した未複合化プラスミドを使用する。ゲル上に１０μｌ（５００ｎｇのＤＮＡ）を沈着し、６０ｍＶで３時間移動を行う。０．００６％（ｖ：ｖ）臭化エチジウム１０ｍｇ／ｍｌを含むＴＡＥ中で少なくとも３０分間ゲルを展開する。次いでゲルをＴＡＥ中でリンスし、ＵＶ下に分析する。準弾性光散乱による粒子サイズ測定のプロトコール試料を２０分間平衡化後、Coulter N4Plus（Coultronics France S.A.，Marge ncy，France）上で２５℃で分析を行う。試料のアリコットを吸引し、ピペッティングするに先立ち数回放出する。試料を計量タンク中で希釈し、均一化する。９０°で回析した光の測定は１８０秒待ち後１８０秒行う。使用範囲は３１bins で３nmから10,000nm間である。有効であるためには、試料が50000から1000000カウント／秒を与えなければならない。物理化学的特性電荷比約１０、または５において等モルＤＰＯＥ量の存在または不在下に、処方”エタノール注入”、”洗剤の透析”および”音波処理／押出”の３方法を本発明カチオン脂質に適用する。これらの処方は、ＤＮＡが完全に複合体化（アガロースゲル中での移動なし）の場合、および複合体が５００ｎｍ未満の直径（準弾性光散乱法により測定）を有する場合に適当であると考えられる。これらの分析結果を表１に示す。表示の全てのＤＮＡ／脂質複合体はそのＤＮＡを完全に複合体化する。１：カチオン脂質の正電荷とＤＮＡの負電荷との間の比２：強さ１０％未満の集団は示さない。サイズは調製後２４−４８時間後に測定。これらの分析によれば、上記処方は必要な要件を満たしていることを示す。“ エタノールの注入”法が最善の結果を与え、試験した異なる調製物のサイズは１００ｎｍ未満である。洗剤の透析または音波処理／押出法でも本発明の基準を満す複合体が得られる。随伴細胞のin vitroでのトランスフエクションイヌ筋肉おびヒト筋肉の培養を、１０％ウシ胎児血清（FCS，Hyclone，Logan ，UT）、１０μｇ／ｍｌインスリン（Sigma）、ＥＧＦ(Sigma)およびＦＧＦ（Pe pro Tec Inc.，Rocky Hill，NJ）１０ｎｇ／ｍｌ、２ｍＭのグルタミン（bioMer ieux）、および４０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Schering Plough）で補給したＨａｍＦ１４培地（Life Technologies）中で行う。この細胞を２４から４８時間保温（incubate）し、ウエル当り約５×１０³から１０⁴細胞を用いて９６−ウエル培養プレート中へ約３０％集合（confluence）でトランスフェクションし、５％ＣＯ₂および９５％空気雰囲気中、３７℃で保持する。電荷比および最適ＤＮＡ濃度／ウエルを決定する目的で、各種量の脂質およびプラスミドＤＮＡの混合物でトランスフエクションを実施する。使用複合体はトランスフエクションに先立ち２４から４８時間に調製し、ゲンタマイシン４０μｇ／ｍｌおよびグルタミン２ｍＭを含むＨａｍＦ培地中に希釈する。培養基を取り除き、１０％ＦＣＳの存在または不在下にトランスフエクション混合物１００μｌを各ウエル中に移し、プレートを３７℃で４時間保温する。次いで全てのトランスフエクション培地を最終２５０μｌ容量に対して、１０％ＦＣＳ、インスリン（Sigama）１０μｇ／ｍｌ、ＥＧＦ（Sigma）およびＦＧＦ（Pepro Tech Inc.，Rocky Hill，NJ）１０ｎｇ／ｍｌ、グルタミン（bioMeri eux）２ｍＭ、およびゲンタマイシン（Schering Plough）４０μｇ／ｍｌに調整する。この培養物を４８時間保温し、次いで細胞を回収しルシフエラーゼ遺伝子の発現能力を試験する。タンパク質濃度はタンパク質(Promega)量を試験する場合のシステムにより測定する。脂質複合体を用いたＡ５４９細胞のトランスフエクションＡ５４９細胞（ヒト肺がん腫由来の上皮細胞）を、１０％ウシ胎児血清(Gibco BRL)を含むDulbecco's修飾Eagle's培地（ＤＭＥＭ）中で２４時間培養し、次いで９６ウエルプレート（２×１０⁴細胞／ウエル）中でのトランスフエクションを３７℃の湿潤雰囲気中、および５％ＣＯ₂／９５％空気中で開始する。血清不在の場合のトランスフエクトンでは、培地を除き無血清培地で置換する。他の一つのマイクロプレートで、脂質／ＤＮＡ複合体の次の懸濁物を調製する（ＤＮＡ０．１ｍｇ／ｍｌおよび示した電荷比における脂質／ＤＮＡ複合体）：最初の３ウエル中ではストック溶液４４μｌ（４．４μｇＤＮＡ）、２２μｌ（２．２μｇＤＮＡ）、５．５μｌ（０．５５μｇＤＮＡ）、および次のウエル中では１０倍に希釈したストック溶液１１μｌ（０．１１μｇＤＮＡ）。この容量をＤＭＥＭで１１０μｌに調整し、１００μｌをＡ５４９細胞上に移す。保温はウエル当たり４、２、０．５、および０．１μｇのＤＮＡを用いて４時間行う。トランスフエクション開始後４時間で（ＤＭＥＭ＋３０％ウシ胎児血清）５０μｌを加え、次いで（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）１００μｌをトランスフエクション開始後２４時間で加える。血清を用いた培地中でトランスフエクションが生起すること以外は、同じ方法で１０％ウシ胎児血清の存在下でのトランスフエクションを行う。トランスフエクションの分析トランスフエクション後４８時間で、培地を除き、細胞をＰＢＳリン酸溶液１００μｌで洗浄し、溶菌緩衝液（Promega）５０μｌを用いて溶解する。溶解物をルシフェラーゼ活性測定まで−８０℃で冷凍する。後者は動力学的モードで９６ウエルプレート中、Luciferase”測定システム（Promega）（LB96P Berthold luminometer）を用いて２０μｌの混合物について１分間行う。 in vitro でのトランスフエクションＡ５４９細胞およびイヌ一次筋芽細胞を用いてin vitroでのトランスフエクションでカチオン脂質ｐｃＴＧ37の調製物を評価する。結果およびウエル当りの相対光単位（relative light units)（ＲＬＵ）を表２に示す。表示の値はウエル当りＤＮＡ０．５μｇを用いて得られる。全ての複合体はエタノール注入法を用いて調製される。ウエル当りの全タンパク濃度は従来技法（ＢＣＡテスト，Pierce）により測定する。参考として、一ウエルは約２０から３０μｇのタンパク質を含む。１：カチオン脂質の正電荷とＤＮＡの負電荷との間の比２：０から２７０相対光単位間の遊離ＤＮＡ本発明化合物の他の合成モードを開発した１．ポリアミン部分の合成１．１．式ＩＩのＲ基がその第二アミンに結合している”Ｔ−分岐 ”化合物を合成できる目的で、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｂｏｃ−スペルミンを合成した。１，４−ジｂｏｃ−スペルミジンを得るために適用されるプロトコールはGoodno wら（1990，Tetrahedron 46，3267-3286）により公開されている。中間体Ｎ，Ｎ’−（ジ−ｂｏｃ）−Ｎ，Ｎ’−（ジプロピオニトリル）−１，４，−ジアミノブタンはジクロロメタン３．８ｍｌ＋メタノール２ｍｌ中に０℃ で希釈したジアンミノブタン（Fluka;照合32790）３７．６ｍｍｏｌをアクリロニトリル７５．２ｍｍｏｌ（Fluka;照合01710）と０℃で１時間反応して得る。反応生成物は２／１ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＣＨ₃ＯＨ溶剤５０ｍｌ中のＢＯＣ−ＯＮ［（２−ｂｏｃ−オキシイミノ）−２−フエニルアセトニトリル］１００ｍｍｏｌ（ Fluka;照合15475）を用いてブロックする。このブロック反応は室温で一夜放置して行う。溶剤を蒸発し、生成物を酢酸エチル２００ｍｌ中に溶解し、次いで１ＭＮａＯＨ２００ｍｌで３回抽出する。有機相を５％クエン酸で再度抽出し、蒸発乾固に先立ってＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥・濾過する。次いでニトリル還元工程をＬｉＡｌＨ₄（Sigma；L0260）２６０ｍｍｏｌの存在下、エーテル中０℃で行う。１５時間後、０℃で１ＭＮａＯＨ１００ｍｌの添加により反応を停止する。この間、水素が発生する。混合物を濾過し、２０％ＮａＣｌ溶液で３回抽出する。エーテル画分の乾燥後、１／１ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＣＨ₃ＯＨ溶剤中のシリカカラム上に沈着させ、次いで１５／５／１ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＣＨ₃ＯＨ／（Ｃ₂Ｈ₅）₃Ｎ溶剤中で溶離する。ジ−ｂｏｃ−スペルミンを含む画分を薄層クロマトグラフイーで測定する。最終生成物重量：２．４５ｇ（５．８ｍｍｏｌ）。全体収率：１５．５％。１．２．スペルミジンからのＮ，Ｎ’−ジ−ｂｏｃ−スペルミジンの合成。ジクロロメタン２０ｍｌ中に希釈したスペルミジン（Sigma;S2626）２０ｍｍｏｌを、メタノール２０ｍｌ、ジイソプロピルエチルアミン１１ｍｍｏｌ（２ｍｌ）を０℃でおよび１／１ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＣＨ₃ＯＨ溶剤８０ｍｌ中のＢＯＣ −Ｏ−ＢＯＣ［ジ（tert.‐ブチル）−ジカーボネート］（Fluka;照合34660）４０ｍｍｏｌに添加する。このブロッキング反応は室温で一夜放置して行う。溶剤を蒸発し、生成物をシリカカラム上に沈着させ、９／１から８／２ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＣＨ₃ＯＨ溶剤の段階で溶離する。Ｎ，Ｎ’−ジ−ｂｏｃ−スペルミジン含有画分をＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフイーで測定する。かくしてＮ，Ｎ’−ジ−ｂｏｃ−スペルミジンの純粋部分がジ−ｂｏｃ−スペルミジンの他の位置異性体から単離する。最終生成物の重量：０．５８ｇ（１．６８ｍｍｏｌ）。総体収率：８．５％。１．３．１，４−ジ−ｂｏｃ−スペルミン合成の新規方法：ジクロロメタン５０ｍｌ中に希釈したジアミノブタン（Fluka;照合32790）５０ｍｍｏｌをアクリロニトリル（Fluka;照合01710）５８ｍｍｏｌと共に０℃でメタノール２０ｍｌに添加、０℃で１時間放置する。反応生成物を２／１ＣＨ₂ Ｃｌ₂／ＣＨ₃ＯＨ溶剤５０ｍｌ中のＢＯＣ−ＯＮ［（２−ｂｏｃ−オキシイミノ）−２−フエニルアセトニトリル］（Fluka;照合15475）１０９ｍｍｏｌを用いてブロックする。このブロック反応は室温で一夜放置して行う。溶剤を蒸発し、生成物を酢酸エチル３００ｍｌ中に溶解し、１ＭＮａＯＨ３００ｍｌで３回抽出する。有機相を５％クエン酸で再度抽出し、蒸発乾燥に先立ってＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥・濾過する。次いでニトリルの還元工程をＬｉＡｌＨ₄（Sigma;L0260）１４０ｍｍｏｌの存在下、０℃でエーテ中で行う。１５時間後、１Ｍ水酸化ナトリウムの１００ｍｌを０℃で添加して反応を停止する。この間、水素が発生する。混合物を濾過し、２０％ＮａＣｌ溶液で３回抽出する。エーテル画分を乾燥後、最終精製のために生成物をシリカカラム上に析出させる。２．疎水性部の合成Ｎ−ａ−Ｎ−β−ジ［オレイルアミド］プロピオン酸の合成。ジオキサン１０ｍｌ中に希釈したオレイン酸（Sigma;0 9506）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル９．０４ｍｍｏｌ（３．４３ｇ）を、水２２ｍｌ、ジオキサン４４ｍｌおよびジイソプロピルエチルアミン２０．５ｍｍｏｌ（２．６５ｍｌ）の混合物中のＮ−ａ−Ｎ−β−ジアミノプロピオン酸，ＨＣｌ（Bachem F3040）４．１ｍｍｏｌ（０．５８ｇ）に添加する。反応２時間後、エーテル／ＨＣｌ５％で２回抽出し、次いで飽和ＮａＣｌで洗浄、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥後、エーテル画分を蒸発乾燥する。生成物を９５／５ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＣＨ₃ＯＨ溶剤中のシリカカラム上に析出させ、次いで９５／５、さらに９２．５／７．５、最後に９０／１０ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＣＨ₃ＯＨ溶剤の段階で溶離する。Ｎ−α−Ｎ−β−ジ［オレイルアミド］プロピオン酸含有画分は薄層クロマトグラフイーで測定する。ＴＬＣ（ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＣＨ₃ＯＨ９０／１０）およびＮＭＲによるコントロール。乾燥。秤量：０．９１６ｇ（１．４５ｍｍｏｌ）、収率：３５．４％。Ｎ−α−Ｎ−β−ジ［ラウリルアミド］プロピオン酸の合成。ジオキサン１０ｍｌ中に希釈したラウリン酸（Sgma;L3900）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル２．２ｍｍｏｌ（０．６５ｇ）を、水１０ｍｌ、ジオキサン２０ｍｌおよびジイソプロピルエチルアミン５ｍｍｏｌ（０．６５ｍｌ）の混合物中のＮ−α −Ｎ−β−ジアミノプロピオン酸，ＨＣｌ（Bachem F3040）１ｍｍｏｌ（０．１４ｇ）に添加する。同じ精製プロトコール（Ｎ−α−Ｎ−β−ジ［オレイルアミド］プロピオン酸参照）を適用する。秤量：０．４ｇ（０．５ｍｍｏｌ）。収率：５０％。Ｎ−α−Ｎ−β−ジ［パルミチルアミド］プロピオン酸の合成。ジオキサン１０ｍｌ中に希釈したパルミチン酸（Sigma;P1162）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル２．２ｍｍｏｌ（０．７９ｇ）を、水１０ｍｌ、ジオキサン２０ｍｌおよびジイソプロピルエチルアミン５ｍｍｏｌ（０．６５ｍｌ）の混合物中のＮ−α−Ｎ−β−ジアミノプロピオン酸，ＨＣｌ（Bachem F3040）１ｍｍｏｌ（０．１４ｇ）に添加する。添加により活性化エステルが沈殿し、不均一相で１５時間、撹拌下に室温で反応が生起する。同じ精製プロトコール（Ｎ−α−Ｎ−β −ジ［オレイルアミド］プロピオン酸参照）を適用する。秤量：０．１４ｇ（０．１５ｍｍｏｌ）。収率：１５％。３．ｐｃＴＧ37の新合成Ｎ−α−Ｎ−β−ジ［オレイルアミド］プロピオン酸１．４５ｍｍｏｌ（９１６ｍｇ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（Sigma；H2006）１．７４ｍｍｏｌ（２３５ｍｇ）、ジイソプロピルエチルアミン２ｍｍｏｌ（２６５μｌ）、および最後にＣＨＣｌ₃の１０ｍｌ中に希釈したジシクロヘキシルカルボジイミド（Sigma;D3128）２．１７５ｍｍｏｌ（４４９ｍｇ)を、無水ＣＨＣｌ₃３０ｍｌ中に希釈した１，４−ジ−ｂｏｃ−スペルミジン１．４５ｍｍｏｌ（５００ｍｇ）に添加する。反応２時間後、媒体を濾過し、蒸発後、５０／５０エーテル／ヘキサン中に再希釈し、さらに濾過・蒸発を行う。生成物をエーテル中で析出したシリカカラム上で精製し、エーテル／酢酸エチル溶剤：７５／２５、５０／５０、２５／７５および１００％酢酸エチルの段階で溶離する。ＴＬＣ（酢酸エチル）およびＮＭＲでコントロール。ＣＨ₂ＣＬ₂１０ｍｌ中に溶解し最終生成物を、７２℃で再蒸留してＣＨ₂Ｃｌ₂５０ｍｌ中に希釈したトリフルオロ酢酸５０ｍｌ（Fluka;91699）を０℃で滴下することによりｂｏｃ脱保護する。４時間後、ｎ −ヘキサン５０ｍｌ中に希釈後、減圧下に媒体を２回蒸発する。エーテル１０ｍｌ中に生成物を溶解し、ヘキサン中に沈殿させ、濾紙上で濾過する。濾紙を１／１ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＣＨ₃ＯＨ溶剤中で洗浄して生成物を溶解する。ＴＬＣ（酢酸エチル）、ＨＰＬＣおよびＮＭＲでコントロール。蒸発および秤量：６７０ｍｇ（０．６８ｍｍｏｌ）収率：４７％。４．ｐｃＴＧ89（Ｔ−分岐形態である以外はｐｃＴＧ37に該当）の合成１，４−ジ−ｂｏｃ−スペルミジンをＮ，Ｎ’−ジ−ｂｏｃ−スペルミジンで置き換える以外はpc ＴＧ37の場合と同じプロトコールを適用する。保護生成物の秤量：１７０ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）、収率：１２．２％。本発明複合体の静脈注射結果を図２に要約する。本発明複合体はＤＯＰＥの存在または不在（２：１、モル：モル）下に、固定電荷比５でルシフエラーゼｐＴＧ11033（フランス特許出願第97/08267号）の遺伝子を含むプラスミドを用いて上記方法に従ってｐｃＴＧ337化合物から合成した。使用マウスは生後９−から１１週令のＣ57ＢＬ／６雌マウスである。本発明複合体の注射に先立つ１日前に、全容量２００μｌ（＋ＰＢＳ緩衝液１５０μｌ）中に組み込んだリポソーム（Van RooijenおよびSanders，1994，J．Immunol．Me thods，174，83-93参照）中にカプセル封入したクロドロネート(chlodronate)調製物５０μｌの注射によりマウスを予備処理する。７０％エタノールで皮膚の消毒後、尾部中へ静脈注射する。注射容量は２５０μｌ、ＤＮＡ量は６０μｇ、脂質量は３４５μｇである。注射後２日目、マウスを犠牲にする。抽出後、組織を液体窒素中で冷凍し、−８０℃で貯蔵する。ルシフエラーゼ活性の測定には、ドライアイス上に置いた乳針中の乳棒を使って機械的に組織を粉砕する。肺から得られた組織片にリーシス緩衝液(Promega)５００μｌを添加し、３回冷凍／解凍工程にかける。遠心により細胞片を除き、試薬１００μｌの添加およびルミネセンスによる活性測定により、メーカー使用説明書（Promega）に従って上層液２０μｌにつきルシフエラーゼ活性（１分間当りの相対光単位、ＲＬＵ／分で表示）を測定する。測定したルシフエラーゼ活性は市販ルフエラーゼ（Promega）により調製した較正系列を用いてタンパク質量との相関で標準化する。さらに、ビシンコニン酸（bicinchoninic acid）ＢＣＡ比色定量法（Smithら、1985，Anal ．Biochem.，150，76-85 Pierce）により上清のアリコットを用いて全タンパク量を測定する。これにより組織から抽出したタンパク質のミリグラム当りのＰＬＵでルシフエラーゼ活性の表示が可能である。対照は、マウスを注射しない場合または２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．５中ＤＮＡ単独（６０μｇ）を注射した場合について行う。結果（図２）は、ＤＯＰＥの存在下、電荷比５において本発明化合物を含む複合体の静脈注射後、肺のルシフエラーゼリポーター遺伝子の発現が、ＤＮＡ単独注射の場合に比べて顕著に増進されることを示す。表示値は注射された３マウスから得られた平均値である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 16/00 16/00 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ

Claims

【特許請求の範囲】１．次式の脂質化合物：Ｒ−ＨＮ−［−（ＣＨ₂）_o−ＮＲ−］_n-1−（ＣＨ₂）_m−ＮＨ−ＲＩ｛式中、Ｒ残基は、互いに独立に、水素原子または次式ＩＩの基である：［式中、Ｒ₁およびＲ₂は、互いに独立に，直鎖もしくは分岐のＣ₆〜Ｃ₂₃アルキルもしくはアルケニル基、または直鎖もしくは分岐型の基−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ₆ −Ｃ₂₃）アルキルもしくは−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ₆−Ｃ₂₃）アルケニル、アリール基、シクロアルキル基、フルオロアルキル基、ポリエチレングリコール基、任意に置換され、任意に繰り返しの直鎖もしくは分岐のオキシエチレンもしくはオキシメチレン基であり、ｐは１から４の正の整数、ｎは１から６の正の整数、ｍは各モチーフの−（ＣＨ₂）_m、一層特定的にはｎ＞１の時各モチーフの-（ＣＨ₂）_m−ＮＲ−の場合で異なり得る、１から６の正の整数であり、式ＩＩのＲ基の数は１から４である］｝２．次式：Ｈ₂Ｎ−［−（ＣＨ₂）_m−ＮＨ−］_nＲＩＩＩＲＮＨ−［−（ＣＨ₂）_m−ＮＨ−］_nＨＩＩＩａ［式中、式ＩＩのＲは請求項１で定義した基、ｎは１から６の正の整数、ｍは各モチーフの−（ＣＨ₂）_mの場合で異なり得る、１から６の正の整数である］にて表される化合物から選択される、請求項１記載の化合物３．次式：Ｈ₂Ｎ−［−ＣＨ₂）_m−ＮＲ］_n-1−（ＣＨ₂）_m−ＮＨ₂ ＩＩＩｂ［式中、少なくとも一つのＲ基は式ＩＩのものであることを前提に、Ｒは請求項１の式Ｉの場合に示した意味の一つを有し、ｎは１から６の正の整数、ｍは各モチーフの−（ＣＨ₂）_m、一層特定的にはｎ＞１の場合の各モチーフの−（ＣＨ₂）_m−ＮＲ−の場合で異なり得る、１から６の正の整数である］にて表される請求項１記載の化合物。４．式ＩＩの、一つまたは二つのＲ基を含むことを特徴とする、請求項３記載の化合物。５．Ｒ₁およびＲ₂が、互いに独立に、直鎖−Ｃ（＝Ｏ）−アルキルまたは直鎖−Ｃ（＝Ｏ）−アルケニル基であることを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の化合物。６．上記アルキルもしくはアルケニルが炭素原子１２から２０を含み、かつ上記化合物が式ＩＩの１または２のＲ基を含むことを特徴とする、請求項５記載の化合物。７．上記アルキルもしくはアルケニルが炭素原子１２、１６または１８を含むことを特徴とする、請求項６記載の化合物。８．ｎが、数２、３または４から選択された整数であることを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載の化合物。９．ｍが、数２、３または４から選択された整数であることを特徴とする、請求項１から８のいずれかに記載の化合物。１０．次式の化合物：［式中、Ｒ₁およびＲ₂は同一であり、かつステアロイルおよびオレオイル基から選択される］からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１記載の化合物。１１．ポリアミン鎖またはジアミノカルボン酸の第２または第１窒素原子の一つを介して、目的のリガンドの一種または二種以上と複合化されることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項記載の化合物。１２．上記標的成分が、糖類、ペプチド、オリゴヌクレオチド、脂質、ホルモン、ビタミン、抗原、抗体、膜受容体特異性リガンド、抗リガンドと反応し得るリガンド、融合生成ペプチド、核局在ペプチド、またはかかる化合物の組み合わせの全てまたは一部からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１記載の化合物。１３．カチオン形態をなすことを特徴とする、請求項１から１２のいずれか一項記載の化合物。１４．請求項１〜１３のいずれか一項記載の少なくとも一つの化合物および、任意に上記化合物と活性物質との間の複合体形成を特に増進し得る、少なくとも一種の佐剤を含むことを特徴とする組成物。１５．上記佐剤が中性または双性イオン脂質であることを特徴とする、請求項１４記載の組成物。１６．上記中性または双性イオン脂質が、トリグリセライド、ジグリセライド、コレステロール、ホスフアチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスフアチジルコリン、ホスフオコリン、スフインゴミエリン、セラミドまたはセレブロシド、またはこれら由来のものであることを特徴とする、請求項１５記載の組成物。１７．上記中性または双性イオン脂質がジオレイルホスフアチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）であることを特徴とする、請求項１６記載の組成物。１８．化合物／佐剤の重量比が０．１から１０であることを特徴とする、請求項１４から１７のいずれか一項記載の組成物。１９．少なくとも一種の請求項１３記載の化合物または請求項１４から１８のいずれか一項記載の少なくとも一種の組成物、ならびに少なくとも一つの活性物質特に少なくとも一つの負電荷を含む治療的活性物質を含む複合体。２０．上記活性物質が核酸およびタンパク質から選択されることを特徴とする，請求項１９記載の複合体。２１．上記活性物質が、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、トランスフアーＲＮＡ、またはかかるＲＮＡをコードするＤＮＡからなる群から選択された核酸であることを特徴とする、請求項２０記載の複合体。２２．上記核酸が、目的の遺伝子、および上記目的遺伝子の発現を許容する成分含むことを特徴とする、請求項２１記載の複合体。２３．５００ｎｍ未満、有利には２００ｎｍ未満の大きさを有することを特徴とする、請求項１９から２２のいずれか一項記載の複合体。２４．１００ｎｍ未満の大きさを有することを特徴とする、請求項２３記載の複合体。２５．カチオン化合物および／または組成物の正電荷数と上記活性物質の負電荷数との比が、０．０５から２０、より特定的には０．１から１５、好ましくは５から１０の範囲で変わることを特徴とする、請求項１９から２４のいずか一項記載の複合体。２６．請求項１３の一種または二種以上の化合物および／または請求項１４から１８のいずれか一項記載の少なくとも一つの組成物を、少なくとも一つの負電荷を含む一種または二種以上の活性物質と接触させ、かつ上記複合体を任意に精製工程後に回収することを特徴とする、請求項１９から２５のいずれか一項記載の複合体の調製方法。２７．上記化合物および／または組成物を、水混和性溶剤特にエタノールもしくはジメチルスルホキシドまたはこれらの両方混合物中に前以て溶解することを特徴とする、請求項２６記載の調製方法。２８．上記化合物および／または組成物を、洗剤溶液中に前以て懸濁することを特徴とする、請求項２６記載の調製方法。２９．透析による上記複合体の精製工程を追加的に実施することを特徴とする、請求項２８記載の調製法。３０．少なくとも一種の活性物質、特に治療的活性物質、特に核酸をin vit ro、ex vivoもしくはin vivo、一層特定的にはin vivoで標的細胞中へ移送するための、請求項１から１３のいずれか一項記載の化合物、請求項１４から１８のいずれか一項記載の組成物、請求項１９から２５のいずれか一項記載の複合体の使用。３１．上記標的細胞が哺乳類細胞であることを特徴する、請求項３０記載の使用。３２．上記標的細胞が、筋細胞、造血幹細胞、気道の細胞、一層特定的には気管または肺細胞から選択されことを特徴とする、請求項３１記載の使用。３３．細胞中に少なくとも一つの負電荷を含む活性物質を移送する方法であって、上記細胞を請求項１９から２５のいずれか一項記載の複合体と接触させることを特徴とする、上記方法。３４．治療、予防またはワクチン目的の医薬としての、請求項１９から２５のいずれか一項記載の複合体。３５．少なくとも一種の治療的活性物質、特に核酸を標的細胞中へ移送することからなる治療処置法を実施するための請求項１９から２５のいずれか一項記載の複合体。３６．上記標的細胞が哺乳類細胞であることを特徴とする、請求項３５記載の複合体。３７．上記標的細胞が、筋細胞、造血幹細胞、気道の細胞、一層特定的には気管また肺細胞、呼吸器上皮の細胞から選択されることを特徴とする、請求項３６記載の複合体。３８．ヒトまたは動物身体の治療を意図した、特に遺伝子治療による、治療、予防またはワクチン目的の医薬の調製のための、請求項１から１３のいずれか一項記載の化合物、請求項１４から１８のいずれか一項記載の組成物、請求項１９から２５のいずれか一項記載の複合体の使用。３９．医薬が、筋肉内注射、吸入〜気管内注射、点滴、エアゾール化、局所経路または経口経路による投与を意図したものであることを特徴とする、請求項３８記載の使用。４０．請求項１９から２５のいずれか一項記載の少なくとも一種の複合体を含むことを特徴とする、医薬製剤。４１．上記複合体のトランスフエクション能を増進し得る少なくとも一種の佐剤を追加的に含むことを特徴とする、請求項４０記載の製剤。４２．上記佐剤が、クロロキン；プロピレングリコール、ポリチレングリコール、グリセロール、エタノール、１−メチル−Ｌ−２ピロリドンまたはこれらの誘導体から特に選択したプロトン性極性化合物；またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジエチルスルホキシド、ジ−ｎ−プロピルスルホキシド、ジメチルスルホン、スルホラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、テトラメチル尿素、アセトニトリルまたはこれらの誘導体から特に選択した非プロトン極性化合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項４１記載の製剤。４３．ヒトまたは動物への投与が許容される、医薬的に容認された担体を追加的に含むことを特徴とする、請求項４０から４２のいずれか一項記載の製剤。４４．請求項１９から２５のいずれか一項記載の複合体を用いてトランスフエクションされた細胞。