JP2000510879A

JP2000510879A - 特異的なオリゴ糖−ニューレグリン相互作用のためのアナログおよびその使用

Info

Publication number: JP2000510879A
Application number: JP09511366A
Authority: JP
Inventors: ラッシェ，ジェイムズ; サドハルター，ジュディス; ケイ．マハンサッパ，ナゲシュ; エイ．マーチオニ，マーク; アール．ジャコブソン，アラン
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-09-05
Filing date: 1996-09-04
Publication date: 2000-08-22
Also published as: EP0848613A1; WO1997009051A1; AU6965696A; CA2230385A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ニューレグリンとニューレグリン特異的グリコサミノグリカン配列との間の相互作用を調節するための方法を提供する。本発明は、特異的ニューレグリン−グリコサミノグリカン配列相互作用を模倣する能力を有する化合物を同定し、そしてそれらの選択のための方法および治療剤としての使用を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】特異的なオリゴ糖−ニューレグリン相互作用のためのアナログおよびその使用背景１．発明の分野本出願は、増殖因子−グリコサミノグリカン相互作用の分野に関する。２．本発明の背景グリコサミノグリカン構造グリコサミノグリカン（GAG）は、おそらくエフェクター分子との相互作用によって、血液凝固、血管新生、腫瘍増殖、神経細胞発達、平滑筋細胞増殖、および遺伝子発現を含む多くの細胞プロセスの調節に関連する天然に存在する炭水化物ベースの分子である。GAGは、150単位までの長さであり得る繰り返しの２個の糖（二糖）単位の直鎖状の非分枝鎖であり、そして周知であり当該分野で記載されている。例えば、Jacksonら，（1991）Physiological Reviews 71:481-539およびKjellenら，（1991）Ann ．Rev．Biochem. 60:443-475を参照のこと。GAGは、いつもではないがしばしば、プロテオグリカンと呼ばれる構造においてタンパク質コアに共有結合することが見いだされる。プロテオグリカン構造は細胞表面に豊富であり、そして細胞のまわりの細胞外マトリクスと会合される。グリコサミノグリカン（本明細書および技術分野では「グリカン」とも呼ばれる）は、骨格における繰返し二糖単位に基づいて４つの主なクラスに分けられ得る。代表的には、１つの糖がウロン酸であり、そして他方がN-アセチルグルコサミンまたはN-アセチルガラクトサミンのいずれかである。クラスは、以下の４つのGAGによって例示される：(1)ヘパラン硫酸（HS）（D-グルクロン酸／N-アセチル-またはN-スルホ-D-グルコサミン）；(2)コンドロイチン／デルマンタン硫酸（D-グルクロン酸またはL-イズロン酸／N-アセチル-D-ガラクトサミン）；(3)ケラタン硫酸（D-ガラクトース／N-アセチル-D-グルコサミン）、および(4)ヒアルロン酸。ヒアルロン酸を除くすべてのGAGは、糖の環ヒドロキシル基へ種々にエステル化された硫酸基を含む。これらの負の電荷を有する基は、グリコサミノグリカンに帰する生物学的特性に優先的に関係すると考えられる。GAGの天然に存在する形態、特にヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびデルマンタン硫酸は、実際、差別的に硫酸化された糖残基の混合物から構成される複合ヘテロオリゴ糖である。最も綿密に研究されたグリコサミノグリカンの１つは、広く使用される抗凝固剤のヘパリンである。ヘパリンは、ヘパラン硫酸の高度に硫酸化された形態であり、ほとんどの細胞中で見られる。市販の製品として、ヘパリンは、約100〜300 Åの全体に伸ばした長さを有し、それに会合するタンパク質を有さない約20〜60 モノマー単位のヘテロオリゴ糖組成物であり、そしてその抗凝固特性は、炭水化物鎖で見出される特定の硫酸化パターンに独占的に帰すると考えられ得る。いわゆる「低分子量」ヘパリンは、代表的には、約40Åの全体に伸ばした長さを有する、約25〜30モノマー単位のヘテロオリゴ糖組成物である。ヘパリンは、例えば、補体活性化をブロックする能力を含む血液凝固を阻害する能力、平滑筋細胞増殖、および腫瘍増殖を越える種々の潜在的に有用な生物学的活性を有することが知られている。しかし、インビボでこれらの活性を示すために必要とされるレベルでのヘパリンの毒性は、臨床的使用を限定している。ヘパラン硫酸は、細胞表面の主なGAGであり、ヘパリンよりも少ない硫酸基を含み、そして低い硫酸化の領域または硫酸化のない領域間に散在する高い硫酸化の領域を含むことが示されている。当該技術分野で記載され、そしてヘパリンに帰するものと類似の臨床的に有用な活性を有すると断定される他のポリ硫酸化化合物としては、天然に存在するGA G、ペントサンポリ硫酸（PPS）、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびケラタン硫酸の画分またはフラグメント；ならびにその構造モチーフがGAG配列のモチーフをおそらく模倣するポリ硫酸化ナフチル尿素であるスラミンを含む。ヘパリンについてと同様に、治療的有用性に必要とされるレベルでのこれらの化合物の毒性は、その臨床的使用を限定している。これらの化合物およびそれらの断定された生物学的活性を記載する刊行物の代表的リストとしては、以下が挙げられる：1992年10月27日に発行された米国特許第5,158,940号；1989年5月2日に発行された米国特許第4,826,827号；国際特許公開公報WO 90/15816（1990年12月 27日公開）、同WO 91/13624（1991年9月19日公開）、および同WO 93/07864（199 3年4月29日公開）;Wellsteinら，（1991）J ．Natl．Cancer Inst. 83:716-720；およびJentschら，（1987）J ．Gen．Virol. 68:2183-2192。 GAG結合タンパク質およびGAG結合特異性多くの重要な調節タンパク質は、ヘパリンに堅密に結合し、これにはケモカイン、増殖因子（サイトカインを含む）、酵素、および脂質代謝に関連するタンパク質を含む。この結合特性は、長い間にわたって、ヘパリンの負の電荷を有する硫酸とタンパク質上の正の電荷を有する領域に関する非特異的イオン相互作用からのみ生じると考えられた。しかし、２つのタンパク質、アンチトロンビンIII （AT III）および塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を用いた最近の結果は、ヘパリンとAT IIIまたはbFGFとの間の相互作用が特異性を示し得ることを示す。特異的相互作用は、タンパク質分子上の複合結合部位およびヘパリンGAG鎖にたまに生じる配列を含む。例えば、1992年10月21日に公開されたEPO特許公開公報050 9 517 A2;Turnbullら，（1992）J ．Biol．Chem. 267:10337-10341；Gallagherら，（1992）Glycobiology 2:523-528;Habuchiら，（1992）J ．Biochem. 285:805- 813；Yayonら，（1991）Cell 64:841-848；およびRapraegerら，（1991）Scienc e 252:1705-1708を参照のこと。特異的なタンパク質結合配列がヘパリンの炭水化物鎖に存在し得ることは、いくつかの調製物が凝固を阻害することにおいて他のものよりも効果的であるという観察によって、最初に示唆された。1987年の注意深い研究は、トロンビンおよび血液凝固を開始する他の酵素の作用をブロックするプロテアーゼインヒビターである、AT IIIに対する特異的結合を示す特徴的な硫酸化パターンを有する、所定の５つの糖配列（五糖）が存在することを示した。AT IIIとこの特異的なGAG 認識部位との間の結合についてのKdは、約10nM（10^-8M）であり、これは高親和性相互作用とみなす。これらのタンパク質のヘパリンの他の領域への特異的結合は、より弱くおよびより少なく生じ得、実質的にヘパリンのすべての抗凝固活性はこの５つの糖配列に帰する。一般的にAT III結合部位として公知のこの五糖は、現在、化学的に合成されており、そして天然に存在する配列の適切な活性を有することが示されている。この部位へのAT IIIの結合は、プロテアーゼであるトロンビンおよび第Xa因子に対する酵素インヒビターを配置することおよび「提示する」ことによって、ヘパリンの抗凝固活性についての根拠を提供すると考えられる。幾分か特異的な結合部位の第２の例は、線維芽細胞増殖因子にてついて報告されている。線維芽細胞ヘパラン硫酸から単離されたこのGAG配列は、存在する最も堅密な結合画分を示すことが見いだされた。しかし、他のヘパリン結合増殖因子のような他の分子がこの配列に結合し得るかどうかが明らかではなく、あるいはこの結合の親和性がbFGFとヘパリンとの間の結合と同じくらい高いことも明らかではない。単離されたGAG配列とbFGFとの間の相互作用は、現在、絶対に特異的であるよりもむしろ選択的であるとして次に記載されることが最良であり得る。増殖因子およびサイトカイン内因性ヘテロオリゴ二糖ヘパラン硫酸およびヘパリンは、サイトカインおよび増殖因子と呼ばれる広いスペクトルのマイトジェンタンパク質にかなりの親和性で結合するが、これらの相互作用の強度は異なる因子間でかなり変化することが十分に認識されている。ヘパリン／HS-結合タンパク質として記載される増殖因子およびサイトカインには、以下のものがある：TGF-β、内皮細胞増殖因子、IL 3およびGM-CSF、インターフェロン-γ、肝細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子（ FGF）-1（酸性FGF）、FGF-2（塩基性FGF）、FGF-3（int-2）、FGF-4（Hst-1、K- FGF）、FGF-5、FGF-6（Hst-2）、およびFGF-7（ケラチノサイトGF）。例えば、ヘパリンは、α2-マクログロブリンとの不活性複合体からTGF-βを放出し、そしてTGF-β作用を強める。酸性および塩基性FGF（aFGFおよびbFGF）の溶液中での安定性は、HS/ヘパリンの存在で増強され、そして多糖は、FGFの、特にaFGFのマイトジェン活性を強める。これらの効果は、タンパク質分解および熱変性から保護することによってタンパク質の生物学的寿命を延長するFGFとヘパリンとの間の複合体の形成によると推定される。組織において、aFGFおよびbFGFは、細胞外マトリクスおよび基底膜で検出され得、そこでこれらはHSに結合する。ヘパラン硫酸プロテオグリカンを分解するヘパリナーゼまたはプロテアーゼの作用が、近くの標的細胞で作用することを可能にする基底膜からFGFを放出すると、提案されている。FGF安定性および組織局在化の効果の他に、bFGFと細胞シグナリングレセプターとの相互作用を制御する中心的役割がHSについて記載されている。ニューレグリン最近記載された増殖因子のファミリーである、ニューレグリン（Mudge，（199 3）Curr ．Biol. 3:361；PelesおよびYarden，（1993）Bioessays 15:815により総説される）は、ニューロンによって（Marchionniら，（1993）Nature 362:313 ）およびいくつかの実質器官由来の間葉細胞によって（MeyerおよびBirchmeier ，（1994）PNAS 91:064）合成される。p185^erbB2を結合するニューレグリンおよび関連因子は、精製され、クローニングされ、そして発現されている（Benvenis teら，PNAS，82:3930，1985；Kimuraら，（1990）Nature 348:257；Davisおよび Stroobant，（1990）J ．Cell Biol. 110:1353；Wenら，（1992）Cell 69:559；Y ardenおよびUlrich，（1988）Ann ．Rev．Biochem. 57:443；Dobashiら，（1991 ）Proc ．Natl．Acad．Sci. 88:8582；Lupuら，（1992）Proc ．Natl．Acad．Sci. 89:2287；Wenら，（1994）Mol ．Cell．Biol. 14:1909）。組換えニューレグリンは、末梢グリアについてマイトジェン性であることが示されており（Marchion niら，（1993）Nature 362:313）、そして神経筋接合部の形成に影響を与えることが示されている（Fallsら，（1993）Cell 72:801；Joら，（1995）Nature 373 :158；Chuら，Cell 14:329，1995）。ニューレグリン遺伝子は、少なくとも13エキソンからなる。ニューレグリン転写物は、オルタナティブスプライシングされ、そしてこれらは多くの異なるペプチド増殖因子をコードし、これはニューレグリンと呼ばれる（Marchionniら，Na ture 362:313，1993）。DNA配列比較は、p185^erbB2（neuまたはHER2としても公知）レセプターチロシンキナーゼのリガンドとして精製されたneu differentiat ion factor（NDF）（Wenら，（1992）Cell 69:559）およびヒレグリン（Holmes ら，(1992)Science 256:1205）がまたニューレグリン遺伝子のスプライシング改変であることを示した。アセチルコリンレセプター誘導活性（ARIA）はまた、ニューレグリン遺伝子の産物である（Fallsら，（1993）Cell 72:801）。ニューレグリンの共通の構造的特徴は、単一の上皮増殖因子様（EGF）ドメインの存在である。ニューレグリン遺伝子発現の部位は、ノーザンブロッティング、RNアーゼ保護、またはインサイチュハイブリダイゼーションのような種々の方法によってRNA 試料を分析するための核酸プローブの使用によって特徴づけられている。転写物は、神経系および種々の他の組織で検出されている（Holmesら，（1992）Scienc e 256:1205；Wenら，（1992）Cell 69:559；MeyerおよびBirchmeier，（1994）P NAS 91:1064）。遺伝子発現の部位は、脳および脊髄にならびに他の組織に局在化している（Orr-Urtegerら，（1993）PNAS 90:1867；Fallsら，（1993）Cell 7 2 :801；Marchionniら，（1993）Nature 362:313；MeyerおよびBirchmeier，（19 94）PNAS 91:1064；Chenら，（1994）J ．Comp．Neurol. 349:389；Corfasら，（ 1995）Neuron 14:103）。特に網膜感覚上皮では、ニューレグリン転写物の発現は、ラットの胚18日目に検出されている（MeyerおよびBirchmeier，（1994）PNA S 91:1064）。多数のニューレグリンがオルタナティブスプライシングによって産生され得るが、これらは、推定の膜結合および可溶性イソ形に広く分類され得る。前者は、推定の膜貫通ドメインを含み、そして細胞表面に存在し得る。膜アンカーペプチド増殖因子は、細胞接着または近接分泌(juxtacrine)メカニズムによる細胞−細 m. 62:515によって総説される）。あるいは、推定の膜結合イソ形は、細胞表面から切断され、そして可溶性タンパク質として機能し得る（Wenら，（1992）Cel l 69:559；Fallsら，（1993）Cell 72:801）。可溶性ニューレグリンイソ形は、推定膜結合イソ形の細胞外ドメインに対応する配列を含むが、膜貫通ドメインの前で終結する。これらのニューレグリンイソ形は分泌され得、そのため離れた細胞に影響を及ぼし得る；または、これらは、細胞質に存在し得るが、細胞性傷害で放出され得る。後者の場合、ニューレグリンは、毛様体神経栄養因子について仮 2:920）。ニューレグリンの作用のこれらの態様のいずれか１つが生じ得る。ペプチド増殖因子の細胞標的は、１つまたは複数の因子に対するレセプターを有する標的であり、そしてインビトロまたはインビボのいずれかのバイオアッセイで応答することが示される標的である。チロシン残基におけるリン酸化を示す研究または架橋実験に基づいて、ニューレグリンは、レセプターチロシンキナーゼp185^erbB2（またはヒトにおけるHER-2）、p185^erbB3（ヒトにおけるHER-3）、 p185^erbB4（ヒトにおけるHER-4）、またはEGFレセプター（EGFR）遺伝子ファミリーの関連のメンバーに対する候補リガンドである。ひとまとめにして、これらのレセプターは、erbBレセプターと呼ばれ得る。各ニューレグリンタンパク質と EGFRファミリーの各メンバーとの正確なリガンド−レセプター関係は、まだ明らかにされていないが、いくつかの方向の証拠は、リガンドの結合がerbB3およびe rbB4のいずれかによって媒介されるが、シグナリングはerbB2、erbB4、および種々のサブユニットのヘテロダイマーのいずれかによって生じることを示唆する（例えば、CarrawayおよびCantley，（1994）Cell 78:5）。これらのレセプターは、シュワン細胞および筋細胞（Joら，（1995）Nature 373:158）、ならびに乳房および胃上皮のような種々の腫瘍組織に由来する細胞株のような他のニューレグリン標的に存在することが公知である。HER-4遺伝子の発現の部位は、脳のいくつかの領域へのインサイチュハイブリダイゼーションによって局在化され、この領域には、海馬、歯状回、新皮質、内側手綱、視床網様体核、および扁桃が含まれる（LaiおよびLemke，（1991）Neuron 6:691）。ニューレグリンは、研究されている細胞タイプに依存する種々の生物学的活性を有することが示されている。天然のウシGGFI，II、およびIII、ならびに組換えヒトGGF2（rhGGF2）を含むいくつかのニューレグリンは、シュワン細胞についてマイトジェン性であり（Marchionniら，（1993）Nature 362:313）、ヒレグリンB1も同様である（Leviら，（1995）J Neurosci．15:1329）。シュワン細胞におけるrHGGF2のさらなる活性は、神経増殖因子のような神経栄養因子の移動の刺激および誘導を含む（Mahanthappa，（1994）Soc ．Neurosci. Abst#691.7）。ヒト筋肉培養物において、rhGGF2は、筋管における強力な栄養効果を有する（Skla rら，米国特許出願#08/059,022）。rhGGF2への分化応答もまた、培養した筋管におけるアセチルコリンレセプターの誘導を含む（Joら，（1995）Nature 373:158 ）。この活性は、ARIA（Fallsら，（1993）Cell 72:801）およびヒレグリンB1 （Chuら，（1995）Neuron 14:329）を含むニューレグリンの他の形態と、ならびにrhGGF2と関連する。さらに、ARIAは、ニワトリ骨格筋における電位依存性ナトリウムチャンネルの合成を誘導することが示されている（CorfasおよびFishbach ，（1993）J ．Neurosci. 13:2118）。グリア増殖因子（GGF）、およびより詳細にはrhGGF2は、インビトロでグリア細胞に分化するように神経堤幹細胞(neuralc rest stem cell)を制限し得る（Shahら，（1994）Cell 77:349）。要約すると、標的細胞の増殖、生存、および分化に影響を与えるニューレグリンタンパク質の例がある。ニューレグリンは、レセプターチロシンキナーゼのEGFRサブファミリーの以下のいくつかのメンバーを結合および活性化することによって、細胞の増殖および分化のためのシグナルを提供する：erbB2、erbB3、およびerbB4（Padhyら，（19 82）Cell 23:865-872：Coussensら，（1985）Science 230:1132-1139；Krausら，（1993）Proc Natl Acad Sci USA 90:2900-2904；Plowmanら，（1993）Nature 366:473-475）。 1994年11月22日に発行された米国特許第5,367,060号および1996年6月25日に発行された米国特許第5,530,109号で提供される、ニューレグリン（ヒレグリンおよびerbB2リガンドとも呼ばれる）に関する情報は、本明細書に参考として援用される。プロテオグリカンは増殖因子機能のメディエータである。細胞表面プロテオグリカンおよび細胞外マトリクス（ECM）は、増殖、運動性、および分化の調節における重要な成分である（総説については、Adamsら，（1 993）Development 117:1183-1198を参照のこと）。ヘパラン硫酸プロテオグリカン（HeSPG）の細胞表面およびECM形態は、増殖因子シグナリングに特に関連がある。HeSPGは、線維芽細胞増殖因子、インターロイキン２、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子Ｂ、および多くの他のものを結合することが知られている（Ad amsら，（1993）Development 117:1183-1198）。NDF（Yardenら，（1991）Bioch em 30:3543-3550；Pelesら，（1992）Cell 69:205-216）、HRG-α（Holmesら，（1992）Science 256:1205-1210）、およびARIA（Fallsら，（1993）Cell 72:80 1-815) の精製の方法は、すべてヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを使用した。癌 erbBレセプターの活性化または発現の変化は、ある癌の発達において重要な工程であるようである。p185^erbB2の膜貫通領域における特定のアミノ酸置換は、E tNU処理ラットにおいて癌原性形質転換へ導く構成的に活性なレセプターチロシンキナーゼを生成した。neu（neuT）のこの癌原性形態を発現するトランスジェニックマウスの研究は、抗erbB2抗体の全身投与が、90週齢までの乳腫瘍の発達を妨げたことを示している。この特定の変異はヒトの癌では観察されないが、このファミリーのいくつかの異なるレセプターの増幅した発現は、悪性腫瘍と関連している。これらの癌の中には以下のものがある：erbB2（ヒトにおけるHER-2）については−−乳房、胃、および卵巣の腺癌；EGFRについては−−悪性神経膠腫および扁平上皮癌、および；erbB3およびerbB4については−−乳癌。したがって、動物研究および癌患者の分子診断の両方とも、転移乳癌患者が最も満足する抗 HER-2（erbB2）モノクローナル抗体を癌原性形質転換におけるerbBレセプターの脱調節された発現したまたは異所性発現に結びつけている。完全または部分的緩和が、rhuMab HER2の10週用量後の処置した患者の11.6％で観察された。これらのデータは、このシグナリング経路で指示される薬学的介在についての強力な症例を構築する。 erbBレセプターシグナリング経路の連続的刺激はまた、ニューレグリンの過度の産生によって媒介され得た。例えば、両側聴神経腫および神経鞘腫から単離されたマイトジェン活性は、ウシ下垂体から精製された天然のGGFに類似のクロマトグラフ特性を示した。より最近には、変異誘発し、形質転換したSyrianハムスター線維芽細胞株の新生物表現型は、ニューレグリンによって媒介された機能亢進性オートクラインループによるものであった。そのため、ニューレグリンは、細胞の連続的増殖を引き起こし得る場所および時期に発現される。したがって、ニューレグリンを含む癌の処置のための治療剤の開発が非常に望ましい。発明の要旨ニューレグリンの活性が、ニューレグリンと、細胞または細胞外表面に固定されたプロテオグリカンからの特異的で、決定可能なオリゴ二糖構造（「グリカン」）ペンダントとの相互作用によって調節されることが、現在発見されている。ニューレグリンとオリゴ二糖との間の特異的結合は、糖（代表的には二糖）の構造および配列によって決定され、そして通常、オリゴ二糖単位内の規定された硫酸化パターンを含み、そのすべては所定のニューレグリンに対するかなり高い親和性および特異性を有する結合部位（「グリセプター（Glyceptor）」）を共に規定する。これらのオリゴ二糖表面に固定された結合部位は、この部位が、代表的にはリガンド−レセプター結合と関連する膜貫通シグナル機能を欠き、そして代表的にはレセプター結合部位によって認識される部位とは異なるニューレグリンの部位に結合するという点で、真の細胞表面レセプターとは異なる。この新しい観察から、ニューレグリンの生理学的機能の調節および制御のための機会が提供される。１つの局面では、本発明の方法は、目的のニューレグリンとそのグリセプター配列との相互作用を実質的に阻止あるいは妨害する工程を包含する。ニューレグリンとそのグリセプター配列との間の相互作用を何らかの方法で妨害することによって、そのレセプターまたは他のタンパク質と相互作用するニューレグリンの能力を効果的に妨害する。ニューレグリンとそのグリセプター配列との相互作用を実質的に阻止あるいは妨害する工程は、グリセプター配列アナログ（「グリセプター配列アンタゴニスト」）として作用する分子を動物に投与することによって達成され得、そしてこれはニューレグリン結合についてグリセプター配列と競合する。グリセプター配列アンタゴニストは、タンパク質がそのグリセプター配列と相互作用するのを阻止することによって、および／またはタンパク質をそのグリセプター配列シートと競合的に置き換えることによって、作用し得る。本発明が意図する有用なグリセプター結合配列アンタゴニストとしては、グリセプター結合配列の可溶性形態、またはグリセプター配列の構造を構成するかまたは機能的に模倣する任意の他の合成または天然供給源の配列が挙げられ、そしてこれは特異的な予め決定された組成を有する。大多数のニューレグリンと表面に固定したGAG鎖との間の相互作用があらゆる程度の特異性を示し得ることは、これまでに証明も予測もされていない。今回このような特異性が予期せず発見されたことで、これまでに想像されていない、所定のニューレグリンの作用と特異的に拮抗し得るある種の阻害分子の開発が可能になる。例えば、あるものは、ニューレグリンの作用をより特異的に拮抗し得る一方で、他のヘパリン結合増殖因子の作用に著しく影響を及ぼさない。さらに、この発見によって、アゴニストとして作用し得る、あるいは、インビボでの他の有用性（例えば、画像化剤または組織標的化剤を含む）を有し得る、特異的グリコサミノグリカン配列のアナログの開発が可能になる。本明細書では、このような治療的に有用な化合物の同定を可能にする重要な発見および得られる概念の実施可能な記載が提供される。また、特異的GAG結合配列の全範囲を同定および単離するためのプロセスの実施可能な記載、および治療的に有用な化合物についてスクリーニングするためにこのような配列を利用するためのプロセスの実施可能な記載、ならびにタンパク質−グリカン相互作用に対するアンタゴニストとして作用するものを含む、有用な天然の供給源由来または合成で生成したアナログを定義する特徴の記載が提供される。したがって、本発明の１つの目的は、ニューレグリンとそれに結合するグリカン配列との間の相互作用を調節する（阻止するあるいは妨害することを含む）ことによって、ニューレグリン−レセプターまたはニューレグリン−タンパク質相互作用によって誘導される生物学的効果を調節するための手段を提供することである。別の目的は、所定のニューレグリンに対する特異性を有するグリカン配列のアナログを同定および単離するための方法を教示すること、およびアゴニストまたはアンタゴニストとしてのこれらのアナログの使用を教示することである。別の目的は、インビボで望ましくない細胞の成長および増殖を制御することによって、種々のタイプの癌を試験するための手段を提供することである。本発明のさらに別の目的は、ニューレグリンおよび関連する生物学的分子機能の治療的および予防的な処理のための手段を提供することであり、これには、新規組成物を提供すること、および有用な新規組成物を発見するためのプロセスを提供することが包含される。このような組成物は、増殖因子のニューレグリンファミリーの１つ以上のメンバーの作用を阻害または増強することによって、病理学的応答を変化させるための有用性を有する。本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の説明、図面、および請求の範囲から明らかである。本発明の上記および他の目的、その種々の特徴、ならびに本発明それ自体は、添付の図面とともに読むと、以下の説明からより十分に理解され得る。図面の簡単な説明図１は、抗ホスホチロシンイムノブロッティングによって検出した場合の、p1 85（推定ニューレグリンレセプター）のrhGGF2誘導したリン酸化に対する異なるグリコサミノグリカンの効果を示す。図2Aは、培養シュワン細胞におけるrhGGF2誘導したDNA合成に対する種々の用量のヘパリンの効果を示す。図2Bは、培養シュワン細胞におけるrhGGF2誘導したDNA合成に対する種々の用量のヘパラン硫酸の効果を示す。図2Cは、培養シュワン細胞におけるrhGGF2誘導したDNA合成に対する種々のグリコサミノグリカンの効果を示す。図３は、培養シュワン細胞におけるrhGGF2誘導したDNA合成に対する4-メチルルンベリフェリル-β-D-キシロシド（プロテオグリカン生合成のインヒビター）の効果を示す。図4Aは、「グリセプター」との相互作用によって、ニューレグリンが細胞にシグナルを出す方法の概略図である。図4Bは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンへの正常なニューレグリン結合を阻止することによって、「グリセプター」配列アンタゴニストがニューレグリンのシグナリングを妨害する方法の概略図である。図4Cは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンにおけるニューレグリン結合部位を占領することによって、ヘパラン硫酸プロテオグリカンへの正常なニューレグリン結合を阻止することによって、リガンドアンタゴニストがニューレグリンのシグナリングを妨害し得る方法の概略図である。図5Aは、rhGGF2の濃度を変化させることによる¹²⁵I-ヘパリン移動度の遅延を示す（挿入図で示すアフィニティー同時電気泳動ゲル）。図5Bは、rhGGF2の濃度を変化させることによる¹²⁵I-ヘパリン移動度の遅延を示す（挿入図で示すアフィニティー同時電気泳動ゲル）。図６は、フィルター結合アッセイでの、rhGGF2/複合体の保持に対する増加するrhGGF2濃度の効果を示す。図７は、フィルター結合アッセイでの、rhGGF2/ヘパリン複合体形成に対する３つの異なるポリアニオン化合物の効果を示す。図8Aは、rhGGF2誘導したDNA合成に対する３つのポリアニオン化合物の効果を示す。図8Bは、洗い流し（「w.o.」）条件によって示される場合の、rhGGF2誘導した DNA合成に対するポリアニオンの効果が可逆的であることを示す。図９は、アシルアミノ酸を形成するための、１級アミン、アルデヒドまたはケトン、カルボン酸、およびイソニトリルの化学反応を説明する。図10は、４つのセットの反応物についての可能性のある官能基を説明する：酸、アルデヒドまたはケトン、アミン、およびイソニトリル。図11は、反応物としての種々のアルデヒドおよびアミンとともにパイロットコンビナトリアルライブラリーの構築のために使用した96ウェル様式を示す。図12は、アシルアミノ酸アミドについての一般式を示す。図13は、シュワン細胞増殖アッセイにおける、同定したコンビナトリアル化合物の効果を説明する。図14は、シュワン細胞増殖アッセイで試験した４つの同定したコンビナトリアル化合物の構造を説明する。発明の詳細な説明本発明は、ニューレグリンとそれらのグリセプター配列との間の相互作用を調節するための方法を提供する。本明細書で使用する場合、用語グリセプター配列とは、硫酸化した二糖を含むオリゴ二糖配列をいい、これは細胞または細胞外マトリクス表面に固定された所定のグリコサミノグリカン内に含まれ、そしてグリカン結合タンパク質に特異的に結合する。従って、本明細書で使用される場合、グリセプター配列および「ニューレグリン特異的グリコサミノグリカン配列」は、互換的に使用され、そして同義語であると理解される。所定のグリセプター配列と特異的に相互作用するニューレグリンの分子表面構造は、本明細書では「グリカン結合部位」と呼ばれる。代表的には、グリセプター配列−エフェクタータンパク質相互作用は単独では、膜貫通シグナル伝達または他の直接的効果を有さない。どのような既知の理論にも限定されることなく、ニューレグリンとそのグリセプター配列との相互作用は、そのレセプターまたは他のタンパク質と相互作用する、および／またはシグナリングを容易にするニューレグリンの能力を、可能にするかさもなければ増強するために役立つ。リガンド−レセプターまたは他のタンパク質−タンパク質相互作用は、グリセプター配列が固定される同じ細胞表面で生じ得、隣接細胞で生じ得、または細胞外マトリクス表面で生じ得る。例えば、外因性ヘパリンおよびHSは、rhGGF2に対する初期および後期の両方のシュワン細胞応答を阻害する。erbB2ファミリーメンバーの迅速なリン酸化は、ニューレグリンに応答する細胞における一貫した初期の事象である（Peiesら，（1993）BioEssays 15:815-824）。培養初代ラットシュワン細胞の場合は、Ｍ_r ＝185kDタンパク質（p185）（erbBファミリーメンバーと一致したサイズ）は、r hGGF2への曝露の２分以内にリン酸化される（MarChionniら，（1993）Nature 36 2 :312-318）。HeSPGがレセプターチロシンキナーゼ活性化の前にニューレグリン結合で重要な役割を演じるならば、外部から適用されたヘパリンまたはヘパリン様分子は、競合的可溶性ニューレグリンレセプターとして役立つべきであり、それによってp185リン酸化を阻害する。シュワン細胞を、種々のGAG、またはこれらのGAGの存在下で15ng/mlのrhGGF2に曝露した。図１に見られ得るように、ヘパリンは、用量依存的様式でp185リン酸化を阻害し、そして1.0mg/mlでリン酸化を完全にブロックする。ヘパリンよりも著しく効力が低いが、HS処置は1.0mg/mlでいくらかの阻害を及ぼす。ケラタン硫酸も、デルマタン硫酸も、コンドロイチン硫酸も、試験した用量でp185リン酸化の阻害を全く示さない。シュワン細胞でのp185リン酸化は、rhGGF2への曝露の２〜３分以内に検出されるが、因子に応じての検出可能なDNA合成は、曝露の48時間の期間にわたってアッセイされる。ヘパリンおよびHSはまた、この分裂促進応答を阻害する（図2AおよびB）。p185リン酸化を阻害する場合には、ヘパリンは、HSよりも強力な、rhG GF2誘導したDNA合成のインヒビターである。試験したrhGGF2の最高用量（32ng/m l）で、ヘパリンは1.0mg/mlの濃度でDNA合成を90％阻害し；10mg/mlの濃度で、H SはDNA合成を50〜60％阻害する。顕著に対照的に、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、およびコンドロイチン硫酸は、10mg/mlの濃度で少しの阻害活性を示すのみである（図2C）。従って、ヘパリンおよび密接に関連するHSは、試験した中でrh GGF2に対するシュワン細胞応答性をブロックする唯一のGAGである。この結果は、外因性ヘパリン様分子によって阻害され得るrhGGF2とHeSPGとの間の直接的相互作用を示唆する。さらに、プロテオグリカン生合成の公知のインヒビターは、rhGGF2へのシュワン細胞応答性を阻害する。rhGGF2の結合において細胞表面HeSPGと競合するよりもむしろ、外因性ヘパリンおよびヘパリン関連分子の効果は、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーに類似の相互作用によって細胞表面からrhGGF2を隔離する結果としてのみ解釈され得る。シュワン細胞HeSPGの発現を直接的に混乱させるために、細胞を、β-キシロシドの存在下で培養した；細胞透過性β-キシロシドは、プロテオグリカンコアタンパク質へのGAG鎖の付着を阻害することによって、プロテオグリカン生合成に影響を及ぼす（Robinsonら，（1975）Biochem J 148:25-34；Galliganiら，（1975）J Blol Chem 250:5400-5406）。シュワン細胞の場合、0.5〜1.0mMのβ-キシロシドの存在下で１週間の培養により、細胞に結合したプロテオグリカンへのGAG付着に75％〜80％の減少を生じ、そして培養培地中の遊離のGAG鎖に10〜12倍の増加を生じる（Careyら，（1987）J Cell B iol 1987:1013-1021）。図３に見られ得るように、0.5〜1.0mMのβ-キシロシドを含む培地中での48時間のシュワン細胞の培養、次いでrhGGF2を加えたβ-キシロシドを含む培地中でのさらに48時間の培養によって、等量希釈のβ-キシロシド溶媒のジメチルスルホキシドを加えたrhGGF2を含む培地中で増殖したコントロール細胞に対して、最大DNA合成が60％〜90％の減少を生じる。従って、rhGGF2 に対するシュワン細胞応答性がβ-キシロシドの存在下で減少した程度は、プロテオグリカン生合成のこのインヒビターによって誘導した、細胞に付着したGAGで報告された減少に比例した（Careyら，（1987）J Cell Biol 1987:1013-1021）。従って、ニューレグリンの活性は、細胞または細胞外表面に固定したプロテオグリカンからの特異的で決定可能なオリゴ二糖構造（「グリカン」）ペンダントとのこれらのタンパク質の相互作用によって調節される。グリカン結合タンパク質とオリゴ二糖との間の特異的結合は、糖（代表的には二糖）の構造および配列によって決定され、そして通常はオリゴ二糖単位内で定義された硫酸化パターンを含み、そのすべては、所定のグリカン結合タンパク質に対する比較的高い親和性および特異性を有する結合部位を共に定義する。これらのオリゴ糖表面に固定した結合部位は、この部位が、代表的にはリガンド−レセプター結合に関連する膜貫通シグナリング機能を欠き、そして代表的にはレセプター結合部位によって認識される部位とは異なるタンパク質の部位に結合するという点で、真の細胞表面レセプターとは異なる。上記の観察は、ニューレグリンの生理学的機能の調節および制御のための機会を提示する。１つの局面では、本発明は、増殖因子レセプター、隣接細胞、または細胞外マトリクスと同じ細胞上にあり得るそのグリセプター配列との、所定の増殖因子の相互作用を妨害するかさもなければ阻止することによって、ニューレグリンによって誘導される生物学的効果を調節するための方法を提供する。従って、本発明の方法は、ニューレグリンとそのグリセプター配列との相互作用を実質的に阻止するかさもなければ妨害する工程を包含する。ニューレグリンとそのグリセプター配列との間の相互作用を何らかの方法で妨害することによって、そのレセプターまたは他のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力を効果的に妨害する。ニューレグリンのそのグリセプター配列との相互作用を実質的に阻止するかさもなければ妨害する工程は、グリセプター配列アナログ（「グリセプター配列アンタゴニスト」）として作用する分子を動物に投与することによって達成され得、そしてこれはニューレグリン結合についてグリセプター配列と競合する。グリセプター配列アンタゴニストは、ニューレグリンをそのグリセプター配列と相互作用するのを阻止することによって、および／またはニューレグリンをそのグリセプター配列と競合的に置き換えることによって作用し得る。本発明によって意図される有用なグリセプター配列アンタゴニストとしては、可溶性形態のグリセプター結合配列、またはグリセプター配列の構造を構成するかもしくは機能的に模倣する任意の他の合成または天然供給源の配列が挙げられ、そしてこれは特異的な予め決定された組成を有する。この方法は、癌を含む過剰増殖性疾患で生じ得るような望ましくない細胞増殖を阻害することに特に有用であることが予測される。ニューレグリンは培養物中の細胞の遊走を刺激することが示されているので、この方法は、腫瘍の転移を阻害することに有用であり得る。あるいは、グリセプター配列結合についてニューレグリンと競合し、そして結合した場合にタンパク質がグリセプター配列へ結合するのを阻止もしくは実質的に阻害するか、および／またはタンパク質をそのグリセプター配列と競合的に置き換える、グリカン結合タンパク質アナログ（「リガンドアンタゴニスト」または「おとりリガンド」）である分子が投与され得る。このようなニューレグリンアンタゴニストとしては、グリセプター配列において１つ以上のエピトープを認識し、そしてグリセプター配列のリガンド結合部位をブロックするかさもなければ妨害し得る抗体が挙げられる。１つの実施態様では、有用なニューレグリンアンタゴニストとしては、特異的にグリセプター配列をなお結合し得るが、改変されているのでインビボで生物学的活性をもたらすために必要な他のタンパク質またはレセプターと相互作用し得ない、改変された可溶性形態のニューレグリンが挙げられる。改変されたグリカン結合エフェクタータンパク質を含むリガンドアンタゴニストは、インビボ標的化剤としてさらなる有用性を有する。例えば、画像化剤または細胞傷害剤は、標準的手段を使用して（例えば、共有結合によって）改変されたグリカン結合タンパク質と複合体化し得、そしてそれによってリガンドの作用の部位へ標的化し得る。標的特異的複合体を作製するための方法は周知であり、そして、例えば、癌治療の分野で十分に記載されている。さらに他の有用なリガンドアンタゴニストとしては、リガンドでのグリカン結合部位を模倣し得る分子を規定する合成有機物が挙げられる。さらに別の局面では、本発明は、共有結合し、そして特異的グリカン結合タンパク質への各上記タンパク質特異的グリコサミノグリカン配列の同時結合をさせるために十分なコンホメーションを有する、少なくとも２つのグリセプター配列を含むキメラ合成分子を意図する。好ましくは、各タンパク質特異的グリコサミノグリカン配列は、異なるタンパク質特異的グリコサミノグリカン結合部位に結合する。２つの結合部位は、スペーサーとして作用し得るリンカーによって、ならびに架橋手段によって係留され得る。好ましくは、リンカーはまた、互いに独立して２つの部位を自由に回転させる。キメラ分子は、例えば、レセプターの二量体化を引き起こすために、および／または、可溶性エフェクタータンパク質および表面に結合したタンパク質の両方を結合することによって、レセプターに対してグリカン結合エフェクタータンパク質を提示するのを助けるために機能するアゴニストとして、特別の有用性を有することが予期される。１つの実施態様では、アンタゴニストおよびアゴニストとして有用な本発明のグリセプター配列アナログは、10^-6M-10^-12の範囲の解離定数によって規定されるニューレグリンに対する結合親和性を有し、好ましくは５×10^-6Mよりも小さい、より好ましくは10^-7Mまたはさらに10^-8Mよりも小さい解離定数を有する。当業者に認識されるように、アナログの結合親和性が高いほど、インビボで治療的効果を誘導するために必要な濃度は低くなり、従って、この分子が毒性応答を誘導する可能性は低くなる。別の実施態様では、グリセプター配列アナログの全体の長さは、好ましくは約 40Åを越えず、そして好ましくは40Å未満であり、約15〜20Åくらいである。使用されるべき単離されたグリセプター配列またはアナログがオリゴ二糖配列を含む場合、分子は、好ましくは、20よりも少ないモノマー単位、好ましくは16よりも少ないモノマー単位、最も好ましくは４以上15以下の単位を有する。より小さいオリゴ糖配列は特異性を減少し得、そしてより大きな配列は毒性を増強し得る。好ましいオリゴ糖アンタゴニストはまた、40Åよりも小さい全体の長さを有する。すべての場合、意図されるオリゴ二糖アナログは、特異的な所定の組成を有し、これは、本発明の組成物を体内で見いだされ得る内因性の可溶性の不均一なオリゴ糖混合物と区別するために役立つ。グリセプター配列アナログとして有用な非オリゴ二糖分子としては、ニューレグリンのグリセプター配列結合部位と特異的に相互作用し得る、抗体または他のペプチドが挙げられる。さらに別の有用なクラスの分子としては、化学構造が、グリカン結合タンパク質との特異的結合におけるグリセプター配列の構造を機能的に模倣する、合成有機分子が挙げられる。これらの合成構築物は、炭水化物およびアミノ酸配列を含んでも含まなくてもよい。例えば、ポリスルホン化ナフチル尿素であるスラミンは、おそらくリガンド結合部位についてグリセプター配列と競合することによって、グリセプター配列−エフェクター分子相互作用を妨害する。ここで、ナフチル尿素は、タンパク質特異的なグリコサミノグリカン配列を規定する硫酸化オリゴ二糖配列を機能的に模倣するために、複素環のあたりに配置されるスルホネートの適切な分布を足場または骨格構造に提供するようである。従って、他の合成有機物は、独特の骨格構造を有するように生成され得、そして骨格構造上に適切な電荷およびサイズの構成要素が配置される。しかし、誘導体化されると、グリセプター配列アナログは、好ましくは、グリカン結合部位と特異的に相互作用し得る機能的置換基の適切な分布を有する。合成有機物については、適切な置換基は、ペンダントカルボキシレート、ホスフェート、スルホネート、ヒドロキシレート、アミノ基、アルキル部分、および芳香族部分によって提供され得る。別の実施態様では、合成有機グリセプター配列アンタゴニストは、グリカンアナログが相互作用するニューレグリン上のグリカン結合部位の特徴に構造が基づく分子のクラスに由来し、このクラスの特徴は、本明細書に以下に詳細に記載されるような一般構造によって定義される。化学合成の当業者に認識されるように、一般構造に基づいて作製される多数の候補配列を含むコンビナトリアルライブラリーが構築され得、この候補は、リガンドに対する適切な親和性を有する、アンタゴニストを含む有用なアナログを同定するために、本明細書で示されるスクリーニングアッセイで試験される。同様に、一般構造によって規定される単離され捕獲された候補分子、ニューレグリン、および予め選択された閾値レベルを超える親和性で上記グリカン結合タンパク質を結合する能力について候補をスクリーニングするための手段を含むコンビナトリアルライブラリー「キット」が構築され得る。従って、さらに別の局面では、本発明は、ニューレグリンと特異的に相互作用する特異的オリゴ二糖配列およびその機能的アナログを同定するための方法を提供する。本明細書に記載されるように、規定のパターンの荷電基、ならびに所定のリガンドに対する所望の結合特異性および親和性を有する、選択されたオリゴ二糖配列は、それ自体が有用であるか、またはポリペプチドもしくは有機物に基づくグリセプター配列アナログの合理的設計のためのスクリーニング試薬もしくはテンプレートとして、血清可溶性グリセプター配列アナログを作製するために同定および使用され得る。さらに別の局面では、本発明は、候補アナログ分子を同定するための高流量スクリーニングアッセイを提供する。本発明は、本質的に、特異的グリセプター配列−ニューレグリン相互作用を模倣するその能力について選択される化合物、ならびにその選択および使用のための方法からなる。１つの実施態様では、化合物は、ニューレグリンとグリコサミノグリカン（GAG）鎖におけるその同種結合配列との相互作用を特異的に阻害し、そしてインビボでのその相互作用を阻害するために特別の有用性を有する。図４は、それがニューレグリン−グリセプター配列相互作用に適する場合、およびグリセプター配列が細胞表面に結合した配列である場合、本発明によって提供される化合物の１つのメカニズムを示す。本発明はまた、グリセプター配列が細胞外マトリクス表面に結合される、ニューレグリン−グリセプター配列相互作用に有用であることが予期される。図4Aは、グリセプター配列218と膜貫通レセプター216との両方をその表面に有する細胞210を示す。ニューレグリン分子214は、膜貫通シグナルを介して細胞増殖を活性化するために、ニューレグリン「鍵」をレセプター「錠」にガイドするグリセプター配列「手」に類似しているグリセプター配列218によって、レセプター216に対する結合が助けられる。図4Bでは、グリセプター配列アンタゴニスト225は、ニューレグリン214と溶液中で反応し、そして細胞210上のニューレグリン214の活性を調節する（ここでは減少する）ためにグリセプター配列218に結合したニューレグリンを競合的に取り除いている。図4Cは、ニューレグリン活性を同様に調節するリガンドアンタゴニスト230を示す。ニューレグリンの場合、本発明のアンタゴニストの使用は、例えば、望ましくない細胞増殖を妨害し得る。本発明の有用なグリセプター配列アナログ化合物には、「グリセプター」を結合することによりニューレグリン−リセプター配列相互作用と相互作用および妨害し得る、抗体または他の関連分子が含まれ得る。抗体は、抗原として目的の単離されたオリゴ二糖グリセプター配列を使用して、当該分野で周知であり、そして記載される標準的手段（例えば、Immunology，Roittら編，HarperおよびRow， New York，1989を参照のこと）によって作製され得る。他の有用なグリセプター配列アナログは、可溶性形態のGAGオリゴ二糖を含むか、または内因性の同種GAG結合配列に由来し得る。あるいは、アナログは、非炭水化物模倣化合物を含む、同種GAG配列の模倣化合物であり得る。簡単にいうと、この実施態様によって得られたグリセプター配列アナログ組成物は、天然で見いだされるグリセプター配列のものを含む、所定の規定された配列の硫酸化グリコサミノグリカンオリゴ二糖であり得、またはこれらはその合成模倣物であり得る。このような適切な化合物の選択のためのプロセスが本明細書で提供される。有用な合成グリセプター配列アナログを設計するための手段は、多くのグリカン結合増殖因子の配列を比較しそして相同性および非相同性の領域を比較することである。この情報は、いくつかのこのようなタンパク質の公知の３次元構造の研究とともに、エフェクタータンパク質におけるグリカン結合部位の物理的「マップ」を同定するのを可能にする。（例えば、Baldwinら，（1991）PNAS 88:502 、およびCloreら，（1991）J ．Mol．Biol. 27:611を参照のこと）。特徴として、グリカン結合部位は、酵素−基質相互作用で生じ得るように、例えば、ポケットを定義するというよりも、タンパク質の表面を横切って延びる伸長したバンドである。さらに、グリカン結合部位は、代表的には、GAG上の陰イオン電荷と有利に相互作用する正の電荷を有する残基の特定の分布によって規定される。そしてグリカン結合部位はまた、立体的またはイオン的な妨害のいずれかによって、特定のGAGとの相互作用を阻止または制限し得る他の残基を含み得る。本発明で有用な合成有機アナログ分子は、天然に由来するか、合成によって生成されるか、実質的に事実上オリゴ二糖であるか、または実質的に炭水化物を含まないかのいずれであろうとも、天然に存在するGAG結合配列の作用を模倣する合成分子である。このような化合物は、グリカン結合部位を特徴づける塩基性側鎖と相互作用するその構造中の正確な位置に硫酸エステルまたは負の荷電基を含み得る。この場合、アナログは、天然供給源の配列の結合構造を特異的に模倣する。あるいは、アナログは、グリカン結合部位とアナログとの特異的結合相互作用をさせるために十分であるが、異なる接触によって、グリカン結合部位中の他の異なる側鎖と相互作用する官能基を含み得る。いずれかの場合、アナログは、もともとのグリセプター配列のタンパク質結合構造を機能的に模倣するといわれ得る。もちろん、特異的構造模倣物である分子はまた、機能的模倣物である。１つの実施態様では、天然から得られる候補化合物は本明細書に記載のようにスクリーニングされ得る。あるいは、候補化合物は、グリセプター配列およびそれが相互作用するグリカン結合部位のサイズおよび電荷分布の考慮を含むアプローチを利用して処方され得る。相互作用は、内因性グリカン配列によって行われるのと類似する接触によって、またはその部位で機能的に等価な特異的相互作用を生じる異なる接触によって達成され得る。当業者には認識されるように、内因性配列の親和性よりも高いかまたは低い結合親和性を有するアナログは、この方法によって得られ得る。好ましくは、そして本明細書に記載のように、一群の設計された候補物を含むコンビナトリアル「ライブラリー」が作製され、各分子は異なる組成を有し、そしてこの群は、閾値親和性を越えて目的のリガンドを結合する分子についてスクリーニングされる。予め選択したグリカン結合タンパク質についての候補グリセプター配列アナログの閾値親和性は、以下の実施例３、７、および８に記載および例示されるように、標準的競合アッセイによって、および／またはゲルシフトアッセイによって容易に決定され得る。好ましくは、候補物は、例えば、10^-7M 〜10^-12Mの範囲、好ましくは10^-8より小さいかまたはさらに10^-9Mより小さいKd 値を有する、低い解離定数によって示される結合親和性を示す。スクリーニングプロトコルニューレグリンに結合し、そして阻害するために選択的なリード化合物を同定するためのスクリーニング手順は、以下の通りである：１．コンビナトリアル合成反応産物−−溶媒、開始物質、中間体、および最終産物を含む個々のウェルの内容物である。これは、合成化学の最初の終点および生化学スクリーニング工程の開始を示す。２．一次結合ヒット−−96ウェル形式でスクリーニングした場合、rhGGF2へのヘパリン結合の特定のレベルを阻止するコンビナトリアル合成反応産物である。３．確定された結合ヒット−−個々のアッセイで分析した場合、rhGGF2への（特定のレベルへの）ヘパリン結合の再現可能な阻止を有する一次結合ヒットである。完全結合阻害曲線は、すべての確定された結合ヒットについてのおおよその IC₅₀値を決定するために行われる。４．選択された結合候補物−−IC₅₀値が比較的低く、そして最終産物が、再合成、産物精製、ならびに広範囲の分析化学および結合研究を保証する合成反応産物において十分な収量で存在する確定された結合ヒットである。５．予備的生物活性候補物−−非毒性であり、そしてインビトロアッセイにおいてrhGGF2への培養Schwann細胞の応答を阻止する、選択された結合候補物である。６．確定された生物活性候補物−−ヒト腫瘍細胞株でテストされ、そして増殖停止アッセイにおいて非毒性および活性であることが見いだされる、予備的生物活性候補物である。７．リード化合物−−他のヘパリン結合増殖因子と比較して、rhGGF2に結合し、そして阻害することについて少なくとも10倍選択的である、確定した生物活性候補物である。Ａ）予備スクリーニング上記の溶液相結合アッセイは、rhGGF2へのヘパリンの結合を拮抗する化合物を選択するために、高スループットスクリーニングシステムに組立てられる。簡単にいえば、rhGGF2の20nM溶液を、１つまたは複数のテスト化合物および微量の高親和性GAGフラグメント（これは還元末端でチラミン化されそしてヨウ素化される）とともに室温で60分間インキュベートする。スクリーニングアッセイは、ニトロセルロースシートによる迅速な濾過を可能にする96ウェルHybridot Manifol d（BRL）で行われ得る。このシートは96の放射活性「スポット」を含み、これは続いて、Wallacマイクロベータマイクロタイタープレートシンチレーションカウンターで計数される。このアプローチは、非常に効率的であることが証明されており、そして12個のマイクロタイタープレート（960ウェル)/週までスクリーニングするために日常的に使用され得る。人為的な可能性を減少させるために、開始成分の任意の結合効果がアッセイされ得る。すべての場合、イソニトリル化学、酸、アミン、およびアルデヒドの個々の成分は、反応しない開始物質によるものではあり得ない。ライブラリーは、一点での調査において最初に分析される。一次結合ヒットは、２つの群に分かれる：１）50％より多くの結合を阻止したウェル、および2）2 0〜50％の結合を阻止したウェル。一次結合ヒットのすべては、再スクリーニングされ、そしておおよそのIC₅₀値が、確定された結合ヒットについて算出される。これらの化合物はまた、色または化学消光についてテストされ、そして妨害する任意の化合物が排除される。これらのライブラリーの生化学スクリーニングから適切な数の選択された結合候補物を見いだす可能性を最大にするために、40uM の「カットオフ」が設定され得る。ライブラリー構築理論が正しいかどうかを迅速に確かめるために、最初の少数の確定された結合ヒットは、より広範に分析され得る。初期に確定された結合ヒットは、再合成されそして精製される；そして化学構造は、計算された単一の分子イオンピークならびに特徴的なフラグメンテーションを示すHRES-MSによって特徴づけられ、これらの確定された結合ヒットが実際に予測されたアシルアミノ酸アミドであることを示す。一旦優先して確定された結合ヒットが同定される（IC₅₀＜10uMなど）と、化合物は、より大規模に独立して合成され得る。各合成について、最初に、粗反応は、HPLC分析によって再度チェックされ、そして結合アッセイで再評価される。これらの分析が予想されたデータ（すなわち、最初のスクリーニングと同様の保持時間および結合阻害）を提供するならば、大規模産物を分取用HPLCに供する。すべての主要ピークを収集しそしてアッセイする。次いで、結合アッセイで活性を示す画分を乾燥し、そして固体物質を高分解能質量分析法（HRES-MS）、NMR、または化学分析によって分析する。rhGGF2に対する純粋な化合物の結合分析は、IC₅₀ 値を得るために数回繰り返され得る。次いで、これらの選択された結合候補物のそれぞれの分析からのデータは、次のステージに進む化合物を優先させるために、比較され得る。次に、選択された結合候補物は、ニューレグリン−erbBシグナリングのアンタゴニストとしてのそれらの可能性を確認するために、細胞培養アッセイでスクリーニングされる。培養した初代ラットSchwann細胞は、rhGGF2アンタゴニストの生物活性をテストするための第１のバイオアッセイシステムを提供する。rhGGF2を含むグリア増殖因子の精製、クローニング、および発現は、ニューレグリンへのSchwann細胞の増殖性応答に基づき（Marchlonniら，（1993）Nature 362:312-318）、そしてこの応答は、rhGGF2の活性をモニターする非常に信頼できるインビトロアッセイシステムを提供する。化合物（選択された結合候補物）は、培養した細胞株（例えば、NIH-3T3）または初代ラットSchwann細胞における任意の明白な毒性について最初にテストされ得る。非毒性化合物は、rhGGF2に対する初期（ニューレグリンレセプターリン酸化）および後期（DNA合成）の両方のSchwann細胞応答の阻害について、そして続いて作用の可逆性についてテストされ得る。DNA合成のための高スループットアッセイを使用して、選択された結合候補物の第１のバイオアッセイは、rhGGF2 刺激したSchwann細胞のDNA合成の阻害である。IC₅₀値は決定されそして結合データと比較され得る。一旦rhGGF2刺激したDNA合成の阻害が特定の化合物について確立されると、p18 5ニューレグリンレセプターのリン酸化は、以下のようにアッセイされ得る：Sch wann細胞は、DNA合成アッセイのために上記のように調製されて、24ウェルプレートにDME/5で250,000細胞/0.5mlの濃度で播種される。テスト試料（rhGGF2および種々の濃度の選択された結合候補物は、結合を平衡化するために60分間予め混合される）は、37℃にて2.5〜３分間で細胞に添加される。培地を吸引して、（6 5℃に予め加熱された）50ulのSDS還元試料緩衝液を各ウェルに添加する。ウェルを掻き取って粉砕した後、内容物をマイクロ遠心チューブに移し、10分間煮沸して、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供する。タンパク質をニトロセルロース膜にエレクトロトランスファーする。膜を、200uMオルトバナジン酸ナトリウム（Sigma）を含むトランスファー緩衝液で予めすすぎ、そしてトランスファーを、同じ緩衝液を使用して行う。膜を、組換え抗ホスホチロシン抗体、RC20H（Trans duction Laboratories）でプローブし、そして製造者の指示に従ってECL化学発光試薬（Amersham）を使用して免疫反応性バンドを可視化する。rhGGF2のレセプターリン酸化およびDNA合成活性の両方を阻止する化合物は、Sudhalterら（Sudh alterら，（1996）Glia 17:28-38）に記載のように、洗浄実験において作用の可逆性についてさらに分析される。これらの最初のバイオアッセイからの結果は、十分に特徴付けされたSchwann 細胞システムでの生物活性を有する化合物を同定する。スクリーニングのこのステージの結果、ニューレグリン−erbBシグナリングの可能性のあるアンタゴニストは、以下を含むいくつかの重要な基準を満たすべきである：1）rhGGF2への初期および後期の応答の両方を可逆的に阻止する；および2）生化学分析に匹敵するインビトロの能力のランク順を示す。細胞に基づくスクリーニングのこの最初のステージを首尾よく通過する化合物は、初代生物活性候補物と命名される。初代生物活性候補物が癌細胞により関連する細胞で活性を有するかどうかを決定するために、第２の列を細胞に基づくスクリーニングステージに添加し、これはヒト腫瘍細胞株の使用を包含する。多くのヒト腫瘍細胞株は、ニューレグリンに応答することが知られている。いくつかの株はまた、１つ以上のニューレグリンのイソ形態を発現する。例えば、乳腺癌株MDA-MB231およびMDA-MB-453は、NDFおよびヒレグリンの精製をモニターするために使用されたerbB2レセプターリン酸化バイオアッセイで利用された（W enら，（1992）Cell 69:559-572；Holmesら，（1992）Science 256:1205-1210）。グリア腫瘍株U87MG（星状細胞腫）およびU13876（グリア芽腫）は、ノーザンブロッティングによって検出されたニューレグリンおよびerbBレセプターの転写物を発現する。これらの株は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから得られ得、そしてそれらを使用してさらに初代生物活性候補物を評価する。erbBレセプターの活性化および増殖は、これらの株におけるパラクラインまたはオートクラインのニューレグリンシグナリングによって刺激され得るので、これらの株は２つのタイプのバイオアッセイについての機会を提供する。第１に、Schwann 細胞と同様の方法で、本発明者らは、テスト化合物が外因性rhGGF2への応答を阻止し得るかどうかを決定する。第２に、化合物は、添加したrhGGF2なしで、低濃度から中程度の濃度のウシ胎児血清（FCS）で増殖した細胞株の増殖を停止し得る。使用されたFCSの濃度は、各株について実験的に決定され得る。したがって、ヒト腫瘍株でのこれらの実験は、神経細胞増殖を越える初代スクリーニングシステムの適応性を示すために助けとなるはずであり、そして全体のアプローチをさらに確認する。本出願はまた、ランダムに得られたかまたは合理的に設計された候補化合物のコレクションから、グリカン結合タンパク質グリセプター配列相互作用の有用なアナログを選択するための新規なプロセスを提供する。１つの局面では、本明細書中に記載されるプロセスによって選択される化合物は、その機能的に活性な位置からニューレグリンを特異的に移動させることの有用な特性を有する。例えば、本発明のニューレグリンアンタゴニストの使用は、望ましくない細胞増殖を妨害し得る。したがって、腫瘍増殖を妨げるために使用され得る。このタイプの分析を使用して、候補グリセプター配列アナログを生成するために有用な、特に候補物のコンビナトリアルライブラリーの一部として有用な一般構造が生成され得る。好ましい一般構造を図12に示す。一般構造は、少なくとも２つのモノマー単位およびそれからの１つ以上の官能基ペンダントから構成されるオリゴマー構造を定義する。一般構造中のペンダント官能基の位置および組成は、天然に存在するグリセプター配列の接触と同じ接触をなすことによって、あるいは異なる接触をなすことによってのいずれかによって、グリカン結合部位を定義する側鎖と相互作用し得る有用な置換基の「ライブラリー」を提供するように設計される。本明細書中に記載のように調製された治療剤としての使用のためのグリセプター配列アンタゴニストまたはニューレグリンアンタゴニストは、適切な手段によって、好ましくは直接的または全身的に、例えば、非経口で、好ましくは薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、個体に提供され得る。本明細書中で使用される「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意およびすべての溶媒、分散媒体、ヒトに非毒性である抗菌剤および抗真菌剤などを含む。薬学的に受容可能な塩が特に意図され、それらは、塩基塩、アルカリ金属塩、およびアルカリ性金属塩であり得る。薬学的に活性な物質としてのこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。治療剤が、直接的（例えば、局所的に、注射によって、所望の組織部位に）、または非経口で（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、眼窩内、眼、室内、頭蓋内、嚢内、脊髄内、槽内、腹腔内、頬内、直腸内、膣内、鼻内によって、またはエアロゾル投与によって提供されるべきである場合、例えば、治療剤は、好ましくは、水性溶液の一部を含む。溶液は生理学的に受容可能であり、そのため、患者への所望の治療剤の送達に加えて、溶液は、患者の電解質および容量のバランスに他の不都合な影響を及ぼさない。したがって、治療剤についての水性媒体は、正常な生理学的食塩水（0.9％NaCl，0.15M）、pH7〜7.4を含み得る。経口投与または非経口投与に有用な溶液は、薬学の分野で周知の方法のいずれかによって調製され得、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences，（Gen naro，A.編，Mack Pub.，1990）に記載される。処方物は、例えば、インビボでの治療剤の放出を制御するための有用な賦形剤を含み得る。本明細書中で提供される治療剤はまた、単独で、または、例えば、炎症応答を調節することに有益な効果を有することが公知である、および／または所望の組織または細胞表面へ薬剤を標的化することを増強し得る、他の分子と組み合わせて投与され得る。他の有用な補因子は、防腐剤、抗生物質、抗ウイルス剤、および抗真菌剤、ならびに鎮痛剤および麻酔剤を含む、症候緩和補因子を含み得る。本明細書中で提供される化合物は、薬学的に受容可能な非毒性の賦形剤およびキャリアとの混合によって薬学的組成物に処方され得る。上記のように、このような組成物は、非経口投与のために、特に液体溶液または懸濁液の形態で；直接投与のために、粉剤、鼻点滴、またはエアロゾルの形態で、調製され得る。本発明の化合物は、単独、または上記の１つ以上の他の治療剤と組み合わせてのいずれかで、活性化合物と不都合に反応せずそしてそのレシピエントに有害でない従来の賦形剤（すなわち、非経口、腸内、または鼻内適用に適切な薬学的に受容可能な有機または無機のキャリア物質）との混合での薬学的組成物として用いられ得る。適切な薬学的に受容可能なキャリアは、水、塩溶液、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香料油、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリド、石油エーテル(petroethral)脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的調製物は滅菌され得、そして所望であれば、活性化合物と不都合に反応しない補助薬剤（例えば、滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、着色剤、香味剤および／または芳香物質など）と混合され得る。組成物は、治療的に有効な量で、例えば、上記のように目的の所望のリガンド −グリセプター配列相互作用を阻害するために十分な時間、標的組織への薬剤の適切な濃度を提供する量で、ヒトまたは他の哺乳動物への非経口投与または経口投与のために処方され得る。当業者に明らかなように、治療組成物中の記載された化合物の濃度は、多くのファクターに依存して変化し、これには、投与される薬物の用量、用いられる化合物の化学的特徴（例えば、疎水性）、および投与経路が含まれる。投与される薬物の好ましい投与量はまた、組織喪失または欠損のタイプおよび範囲、特定の患者の全体の健康状態、選択した化合物の相対的な生物学的効力、化合物の処方、処方物中の賦形剤の存在およびタイプ、および投与経路のような変数に依存し得る。一般的に、本発明の化合物は、非経口投与のために約0.001〜0.1％w/vの化合物を含む水性の生理学的緩衝溶液で提供され得る。代表的な用量範囲は、１日当たり約10ng/kg〜約1g/kg体重であり；好ましい用量範囲は、約0.1ug/kg〜10 0mg/kg体重である。より高い結合親和性を有するアナログは、代表的には、比較的低い結合親和性を有するアナログよりも低い合計の投与濃度を必要とすることが、当業者には明らかである。略語本明細書全体を通して、以下の略語および用語が使用される：グリセプター配列−タンパク質特異的グリコサミノグリカン配列；HS−ヘパラン硫酸；HSPG−HSプロテオグリカン；GF−増殖因子；dp−ポリマー化の程度（例えば、二糖については、dp＝２など）；GlcA−グルクロン酸；IdoA−イズロン酸； IdoA(2s)−イズロン酸2-硫酸；GlcNAc−N-アセチルグルコサミン；GlcNSO₃−N- 硫酸化グルコサミン；GlcNSO₃(6s)−N-硫酸化グルコサミン6-硫酸；GlcA(2s)− グルクロン酸2-硫酸；PBS、リン酸緩衝化生理食塩水。ヘパリンを結合することが公知の増殖因子 −塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF） −酸性線維芽細胞増殖因子（aFGF） −ヘパリン結合上皮増殖因子（HB-EGF） −組換えヒトグリア増殖因子２（rhGGF2）ニューレグリンに対する特異性を有する有用なオリゴ二糖配列を同定する方法（実施例１、２、５、および６）、ならびにニューレグリン−グリセプター結合の阻止におけるその有効性について（実施例３）およびインビトロでの活性を評価するための培養細胞におけるその有効性について（実施例４および７）、同定されたグリセプター配列およびそのアナログの有効性をテストする方法を開示する実験の記載が、以下に提供される。実施例１ヘパリンおよびHSは、rhGGF2に高い親和性で結合する−アフィニティ −同時電気泳動による証明種々のGAGについてのペプチド増殖因子の結合親和性を測定するために、［¹²⁵ I]-GAG鎖の水平アガロースゲル電気泳動を、wittおよびLander(Wittら、（1994 ）Curr Biol 4:394-400)に記載されるように、行った。ブタ腸粘膜由来のヘパリン(Sigma)を、チラミンで誘導体化し、そして¹²⁵Iで放射標識した（SanAntonioら、（1993）Biochem 32:4746-4755)。この物質を、P D-10カラム上で脱塩し、そしてSephadex G-50カラム上でゲル濾過に供した。分子量約4000のサンプルを、この研究で使用した。HS16マー(HS16)をブタ腸粘膜から精製した。HS16を¹²⁵Iで標識し、そしてSephadex G-50カラム上でゲル濾過に供した(Leeら、（1991）Proc ．Natl Acad Sci USA 88:2768-2772)。１％アガロースゲル中の個々のレーンに種々の濃度のrhGGF2を取り込ませ、そして[¹²⁵I]-ヘパリンまたは[¹²⁵I]-HS(約3000cpm/サンプル)を、0.1M酢酸ナトリウム、50mM MOPSO、0.5％ CHAPS(pH7.0)の緩衝系のゲルで電気泳動した。電気泳動後直ちにゲルを強制温風で乾燥させ、そして放射活性の分布をホスホルイメージャー(Fuji BAS 1000)を使用して可視化した。タンパク質含有ウェルを通しての負に荷電したオリゴ糖の電気泳動によって、タンパク質のGAGへの平衡結合を反映するGAG鎖の移動度の変化がもたらされる。遅延係数(Ｒ)を、タンパク質の各濃度について算出し得る。みかけの解離定数を、式Ｒ＝Ｒ./(１＋Ｋ_d[タンパク質])を使用して、GAGが最大の半分に遅延するタンパク質濃度に対して方程式化する(Leeら、（1991）Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 88:2768-2772)。この技術によって、［¹²⁵I]-ヘパリン(図５Ａ、挿入図)および[¹²⁵I]-HS(図５Ｂ、挿入図)の電気泳動移動度の遅延をアガロースゲル中に包埋されているrhGGF 2濃度の範囲によって観察することにより、みかけの解離定数の決定が可能になった。解離定数を、標識したGAGの最大の半分の移動度の移行を生じたrhGGF2の濃度を決定することによって、ヘパリン(図５Ａ)およびHS(図５Ｂ)について算出した(Leeら、(1991)Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 88: 2768-2772)。観察された値は、ヘパリンについてはＫ_d=9.7nM、そしてHSについてはＫ_d＝22nMであった。実施例２ヘパリンは、高い親和性でrhGGF2に結合する−ニトロセルロース上でのヘパリン/rhGGF2複合体の液相結合および捕獲による証明タンパク質とGAGとの間の結合相互作用を定量するための別の方法は、このような結合を溶液中で生じさせ、次いで生じたタンパク質-GAG複合体を吸引濾過によってニトロセルロースフィルター上に捕獲することである。フィルター結合を、放射標識したヘパリンフラグメントへのrhGGF2の結合をブロックする化合物についてのアッセイとして使用した。平衡結合を、種々の濃度で存在するrhGGF2を含むPBS中で達成し、そして[¹²⁵I]-ヘパリンフラグメントの濃度を、Ｋ_dより下で維持した。一旦平衡に達すると(1.5時間)、rhGGF2-GAG複合体を、0.45μMニトロセルロースフィルター上への吸引濾過によって捕獲した。次いで、フィルターを4 2℃で30分間乾燥させ、そしてマトリクスアレイシンチレーション検出器(Wallac 1205Betaplate)を使用して評価した。タンパク質-GAG複合体のみがフィルター上に保持され、そしてこのようにしてフィルター上に保持されているヘパリンの量をプロットした。図６に見られ得るように、フィルター上の[¹²⁵I]-ヘパリンの保持は、添加したrhGGF2の濃度に依存する。GAG鎖の出発濃度がrhGGF2結合についてのＫ_dを下回る場合、適切なＫ_dは、投入したGAG鎖の半分がフィルター上に保持されるrhGGF2濃度となる。この場合、その濃度は5.5nMであり、実施例１で決定したＫ_dに匹敵する値であった。実施例３ヘパリン-rhGGP2結合は、合成アンタゴニストによって阻害されるが、他の高度に硫酸化したGAGによっては阻害されない。フィルター結合アッセイはまた、種々の化合物がrhGGF2の標識したヘパリンヘの結合を競合的に阻害する能力を定量的に比較するのに有用なツールである：フィルター結合を、放射標識したヘパリンフラグメントへのrhGGF2結合をブロックする化合物についてのアッセイとして使用した。平衡結合を、各反応について40nM(Ｋ_dのすぐ上)で維持されているrhGGF2濃度を含むPBS中で達成し、そして [¹²⁵I]-ヘパリンフラグメントの濃度をＫ_dより下に維持した。試験化合物を10μ Mでアッセイ溶液に添加し、そして化合物あたり全部で９つの濃度について、２倍段階希釈した。一旦平衡に達すると(1.5時間)、rhGGF2-GAG複合体を、0.45μM ニトロセルロースフィルター上への吸引濾過によって捕獲し、そして実施例２に記載されるように分析した；競合剤の非存在下でフィルター上に保持されているヘパリンの量を100％としてプロットした。競合剤によるタンパク質[¹²⁵I]−ヘパリン複合体の崩壊によって、フィルター上に保持されている放射活性が減少する；50％のカウントが保持される点を、その薬物についてのIC⁵⁰として算出した。図７は、スラミンならびに２つの関連するポリアニオン化合物、GL12およびNF 066による、ヘパリンに結合しているrhGGF2の用量依存的阻害を示す。競合曲線を、これらの化合物のそれぞれのIC₅₀を算出するために使用した（表１）。試験した増殖因子 rhGGF2 bFGF GL12 0.9mg/ml 3.8mg/ml スラミン 2.2mg/ml 21.6mg/ml NF066 2.0mg/ml 25.0mg/ml 表１．ヘパリンへのrhGGF2およびbFGFの結合に対するポリアニオン化合物のIC₅₀ 値の比較。ヘパリンへの結合のＫ_dは、rhGGF2については5.5nMであり、そしてbF GFについては5.0nMである。IC₅₀値を、フィルター結合アッセイを使用して決定した。IC₅₀値を、図５Ｂでの最大の半分の阻害を達成するに必要な容量を算出することによって決定した。これらの化合物の阻害活性の等級順序は、GL12＞＞スラミン＞NF066であり、r hGGF2およびbFGFの両方についてと同じであることに留意のこと。フィルター結合アッセイによってまた、同じGAGは、試験した用量では、rhGGF2-ヘパリン結合と競合しないことが示された。この、種々の高度に硫酸化したGAGによる競合が存在しないことから、rhGGF2とヘパリン型硫酸化ポリマーとの間の相互作用の特異性が示される(表２)。グリコサミノグリカンヘパリンからrhGGF2を置換するためのIC₅₀ ヘパリン .06mg/ml コンドロイチン硫酸 30.0mg/ml デルマタン硫酸＞ 12.5mg/ml ケラタン硫酸＞ 25.0mg/ml 表２．ヘパリンへのrhGGF2結合に対するGAGのIC₅₀値の比較。ヘパリンへの結合のＫ_dは、rhGGF2については5.5nMである。IC₅₀値を、フィルター結合アッセイを使用して決定し、そして表１に示すように、最大の半分の阻害を達成するに必要な用量を算出することによって決定した。実施例４ヘパリン-GGF結合の合成アンタゴニストはrhGGF2に対するシュワン細胞の応答性を阻害する。スラミンおよびそのアナログに関するデータ(実施例３)は、シュワン細胞表面 HeSPGとのrhGGF2の相互作用を直接的に混乱させるさらなる薬学的手段を提供する：３日齢ラット由来の坐骨神経シュワン細胞を、Brockes(Brockes（1987）Meth Enzymol 147:217-225)の方法によって精製した。細胞を、10％熱失活ウシ胎児血清(Hyclone)を補充した低グルコースのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM，Fish er/Mediatech)中で、ポリ-D-リジン(PDL、Collaborative Research)で予めコートした組織培養プラスチック上にプレーティングした。この培地をDMEM/10という。24時間後、培地を10mMシトシンアラビノシド(Sigma)を含有する新鮮なDMEM/ 10と置き換えた。２〜３日後、培地を除去し、そして部分的に精製されたウシGG F(ウシ下垂体抽出物のカルボキシメチルセルロース画分、GGF-CM(Goodearlら、（1993）J Biol Chem 268:18095-19102))および5mMフォルスコリン(Calblochem) を補充したDMEM/10で置き換えた。細胞がコンフルエントに達したときに、これをトリプシン処理し、そして抗Thy 1(T11D7e、Serotec)およびウサギ補体(Gibco )で処理して混入している線維芽細胞を除去した。次いで、細胞をGGF-CMおよびフォルスコリンで補充したDMEM/10中にプレーティングした。さらなる拡大に際し、細胞ストックを、以下に詳述するアッセイ目的のために使用するか、または将来使用するために凍結した。 DNA合成アッセイを、若干改変したBrockes(Brockes，（1987）Meth Enzymol 1 47 :217-225)の方法に従って行った。シュワン細胞を、GGF-CMおよび5mMのフォルスコリンの存在下でPDLコートしたプラスチック上でコンフルエントになるまで増殖させることによってアッセイのために調製した。次いで、細胞から増殖因子およびフォルスコリンを３日間取り除き、トリプシン処理し、そして５％血清を補充したDMEM中(DMEM/5)で10,000細胞/100mlの濃度で96ウェルプレートにプレーティングした。翌日試験サンプルをウェルに添加し、そして24時間後に[¹²⁵I]-U dRまたは[メチル-³H]チミジンのいずれかを添加した。細胞を、約18時間後に、T omtec Harvestorを使用して回収し、そしてサンプルをWallac 1450 MicroBeta液体シンチレーションカウンターを使用して計数した。図８Ａは、GL12、スラミン、およびNF066が用量依存的様式でrhGGF2誘導性DNA 合成を阻害するのみならず、その効力の等級順序は、無細胞アッセイ(図７および表１、上記)におけるヘパリンへのrhGGF2の結合を阻害するその効力と一致することを示す。60ng/mlのrhGGF2の存在下で培養した場合、シュワン細胞DNA合成の最大阻害の半分は、GL12によっては約５mM、スラミンによっては約20mM、そしてNF066によっては約35mMである。スラミンおよびそのアナログの効果は可逆的であり、そして非特異的細胞傷害性には起因しない。このことは、シュワン細胞が通常の培地、100mMスラミン、または100mM GL12中で24時間維持された「ウォッシュアウト(washout)」実験によって示された。新鮮なコントロール培地で洗浄した後、培養物を標識したヌクレオシドを含む４つの実験培地(コントロール培地、60ng/ml rhGGF2、100mM試験化合物、またはrhGGF2および試験化合物)の１つに移した。全DNA合成を、前の実験と同様に48時間後にアッセイした。図８Ｂに見られ得るように、最初の24時間試験化合物中で維持し、次いでコントロール培地(ウォッシュアウト条件)に移した細胞は、全培養期間を通してコントロール培地または試験化合物中で維持した細胞と同一のレベルのDNA合成を示した。上記の条件のいずれにおいても、光学顕微鏡によっては、目立った細胞傷害性の徴候は観察されなかった。コントロール培地からrhGGF2含有培地に移した細胞は、予測されたDNA合成の増加を示した。試験化合物培地からrhGGF2を含有する化合物を含まない培地に移されたシュワン細胞は、試験化合物で予備処理していないrhGGF2処理細胞に匹敵するレベルの DNA合成を示した。従って、スラミンおよびそのアナログによるrhGGF2誘導性DNA 合成の阻害は、細胞表面HeSPGへのrhGGF2の結合の直接的な阻害を介して生じるようである。実施例５コンビナトリアル化学ライブラリー構築。コンビナトリアルライブラリー構築は、多数の単一の工程、高収率の溶液相反応を行うために使用され得るという点におけるイソニトリルの顕著な利点を活用した(Gokel．Gら、Isonitrile Chemlstry，(Ugi，I.編)、Academic Press，New York，40)。96ウェルフォーマットにおいて有機化合物を生成するコンビナトリアルイソニトリル(Ugi)化学技術を開発した。固相化学に依存せずに、ウェルあたり１つ(または少数)の化合物で、同時に多くの化合物を合成することは可能であった。このことは、活性の弱い化合物(非特異的結合剤)の複合体混合物をアッセイすることから生じ得る人工産物を避け、そして「ヒット」の構造同定を単純化する。本発明者らは、図９に示すようなアクリルアミノ酸アミドを形成するための、第一級アミン、アルデヒドまたはケトン、カルボン酸およびイソニトリルの反応を調べた。このタイプの化合物は、極性溶媒中で当モル量の４つの反応物を混合することによって合成された。以下に記載するライブラリーについては、Ｒ₂はＨではなく、従って各反応によって２つの異性体化合物が生じる。単純なアルキル置換出発物質については、90％を超えて産生されることが報告されている(Leeら、（19 91）PNAS USA 88:2768-2772)。さらに、何千もの市販されているアミン、アルデヒド、およびカルボン酸が存在し、これらは事実上任意のタイプの官能基を有する化合物のセットを合成することを可能にする。出発物質の確認イソニトリル化学を用いる前に、出発物質を決定して高収率産物の形成と一致する可溶性および反応性の特性を有するようにした。代表的には、各潜在的な反応物は、上記の「モデル反応」から、対応するアミン、アルデヒド、またはカルボン酸について置換された。逆相HPLC分析の結果から、この化学は、優れた収率の産物が芳香族および脂肪族のアミン、ケトン、ならびにアルデヒド、および構造的に妨げられるカルボン酸の範囲から得られるという点で、極めて確固としたものであることが示された。このタイプの実験から、一貫して高収率を産生した20アミン、16アルデヒド/ケトン、および24カルボン酸のセットを定性した。さらに、一連のイソニトリルを評価し、そしてn-ブチル、シクロヘキシル、ベンジル、および酢酸メチルは全て優れた結果をもたらした。反応物のこれらの４つのセット中に示される官能基を図10に示す(各構造の矢印は、アミノ酸骨格に結合する点を示す)。反応物のセットを、構造の重複が最小になるように選択した。従って、アミン置換は異なり、そしてアルデヒド/ケトン、またはカルボン酸置換に相補的である。結果は、反応物の現在のセットは、58の異なるファーマコフォア(pharmacop hore)を含んだ。官能基は以下であるように選択された：１）アミノ酸の側鎖を模倣する；２）多くの既存するタンパク質結合薬物において見出されるように種々のヘテロ環式環系を含む；および３）フェノール、アルコール、エステル、エーテルなどの水素結合を形成する官能基に富む。後者の特徴は、水素結合を形成する官能基は増殖因子上で炭水化物結合ポケットに結合する薬物に適しているという想定に基づいている。このライブラリーについて１つのさらなる所望される特性は、陰イオン性官能基である。カルボン酸は、本来この化学とは非適合性あるので、実質的に加水分解されて対応するカルボン酸(以下を参照)になり得るメチルおよびエチルエステルが、このライブラリーに導入するために選択された。パイロットコンビナトリアルライブラリー構築。選択された反応物がライブラリーを作製するために使用され得ることを確認するために、化合物を96ウェルフォーマットにおいて合成する一連の実験を行った。ここで、全ウエルは3-フロ酸およびN-ブチルイソニトリルを含み、そして行および列は、図11に示すように、特定のアルデヒドおよびアミンを含む。実験の詳細は、以下のようであった：各反応物の２Ｍのストック溶液を、適切な溶媒中で調製した。４つの適切な反応物の等量(50ml)を、１ウェルの容量が1mlである96ウェルポリプロピレンプレートの80ウェルに添加した。各行における反応は、特定のアミンを含み、そして示したアルデヒドを各列に添加した。単一のカルボン酸、3-フロ酸、およびn-ブチルイソニトリルを全80ウェルに添加した。行11および12を、スクリーニングの前に添加するコントロールとして保存した。20時間後、反応物を200mlのDMSOおよび6 00mlのメタノールを添加して希釈し、その順序は、産物が沈澱しているこれらのウエルにおける産物の回収を最大にするために経験的に決定した。50％の収率を想定し、これらのプレートにおける産物の濃度を50mMとする。産物は安定であり、そして-20℃で保存した場合に沈澱しない。次いで、アリコートを各ウェルから採取し、そしてHPLCによって分析した。各クロマトグラムに置いて、産物の割り当てを、反応物側鎖の増加的寄与から、産物の保持時間が２分以内であるとの予測を可能にするアルゴリズムによって確認した。各反応についての収率を、対応するウェルに示す。50％を超える収率が、70/80(88％)の反応において観察され、そして63/80(79％)の反応においては60％を超えていた。いくつかのウェル( G3、H3)において、収率は、産物の選択的沈澱に起因して低かった。他のウェル( E3、E6)においては、主な副産物は、反応順序の最初の段階でアミンとアルデヒドとから形成されるSchiff塩基であった。従って、主な不純物は、出発物質またはSchiff塩基である。11のさらなるプレートを、異なるアミン、アルデヒド/ケトン、およびカルボン酸を評価したこのプロトコルによって合成した。これらのプレートについて、サンプルを、HPLCによる分析のために、プレートあたり10ウェルから採取した。分析した110の反応のうち、96(87％)が50％を超える生成物の収率を示した。 96ウェルプレートフォーマットにおいて、エステル含有化合物を加水分解することによって、カルボン酸塩を誘導するためのプロトコルをまた、開発した。エステルを含むウェルを、メタノールで５倍希釈して、産物濃度を約10mMにした。 50μlの化合物溶液のアリコートを、10mlの１Ｍ K₂HPO₄(pH13.3)と合わせて、pH を12を超えるように増加させた。加水分解を室温で一晩進行させ、そして溶液を 10mlの１Ｍ KH₂PO₄(pH2.2)の添加によって中和した。これらの条件は、リン酸塩またはエステルの沈澱を伴わずに定量的な加水分解を提供するように経験的に決定された。実施例６パイロットライブラリー合成／スクリーニングコンビナトリアル合成のための本発明者らの戦略の成分および操作のすべては作業する順序であるようなので、組み合わせた合成／スクリーニング技術を、中程度のスケールの(数千化合物)化合物スクリーニングにおいて実行した。コンビナトリアル合成技術を、GAG様構造の傾向がある化学的官能基を有する化合物の２つのライブラリーの構築のために適用した。最初のライブラリーにおいて、各化合物はカルボン酸部分を含んだ。カルボン酸部分は続いて加水分解されて対応する酸になるエステルとしてUgi反応において導入された。第２のライブラリーを、GAGに見出されるスルホン酸基、ならびにスラミン、GL12、およびNF066に見出されるスルホン酸基を模倣するように、スルホン酸基を含有する反応物を用いて構築した。２つのライブラリーの詳細な組成を、以下の表１に示す： 2544カルボン酸塩および1280スルホン酸塩誘導体のセットの合成に続いて、本発明者らは、ヒットの最初のセットを同定するために、96ウェルフォーマットに合わせたrhGGF2結合アッセイを用いた。簡潔に述べると、20nMのrhGGF2溶液を、試験化合物、およびトレース量の高親和性のGAGフラグメント(これは、還元末端でトリアミン化されそしてヨウ化されている)と共に、室温で60分インキュベートした。bFGFおよびVEGFについてのアッセイを、タンパク質濃度を、それぞれ、 7.5nMおよび15nMで設定した以外は、同様の条件下で行った。スクリーニングアッセイを、96ウェルHybrid Manifold(BRL)(これは、96の放射活性「スポット」を含むニトロセルロースシートを通す迅速な濾過を可能にする)中で行った。フィルター上の放射活性を、実施あたり10枚までのニトロセルロース上で定量した。このアプローチは、非常に効率的であることが示されており、そして12マイクロタイタープレート(960ウェル)/週をスクリーニングするために慣例的に使用されている。各プレートは、80個の反応産物を含んだので、16ウェルが、適切なアミン、アルデヒド、カルボン酸、およびイソニトリル反応物の精製されたサンプルを含むポジティブおよびネガティブコントロールとして利用可能であった。他のコントロールは、化合物を添加されていないウェル、および過剰の「コールド」ヘパリンを含むウェルを含んだ。２つのライブラリーを、最初に一点調査で分析した。陽性のヒットは、２つのグループに分けられた：１）結合を50％を超えてブロックするウェル、および２）結合を20〜50％ブロックするウェル。第２の群からのウェルを、再スクリーニングして、ブロックが再現可能であるか否かを決定した。再現可能である場合、完全結合阻害曲線について第１の群におけるそれらのウェルと共に選択して、化合物のIC₅₀値を決定した。IC₅₀が30μM未満である化合物を、さらなる分析のために選択した。これらの選択された化合物を、色または化学的クエンチングについて試験し、そしていくつかを排除した。いくつかをHPLCによって精製し、そして再度分析した。これらのスクリーニングの現在の状況を表２に示す。表３において、IC₅₀のデータは、このスクリーニングにおける、８個の最も優れた化合物について報告する。これらの成果により、17個の予備的なリード化合物が同定された。２個のカルボン酸塩および15のスルホン酸塩は、種々の分析の段階である。0.45％の混成のヒットの割合は、本発明者らのアプローチの一般的な設計が、計画したように作動していること、およびさらなるスクリーニングの成果を十分に予言することを意味していると解釈される。表２．rhGGF2ライブラリースクリーニングａ 30〜40μMの間の化合物濃度；20〜50％のインヒビターである化合物を１つの点として再スクリーニングする：50％を超えるインヒビターである化合物を化合物のIC₅₀を決定するための完全結合阻害曲線を用いて再スクリーニングする。ｂ 20〜50％インヒビターとして反復する１つの点の再スクリーニングを完全結合阻害曲線について選択して、化合物のIC₅₀を決定する；IC₅₀が30μM未満である化合物をさらなる分析のために選択する。ｃ IC₅₀を２〜３回繰り返して、再現性を決定した；化合物を色またはシグナルの化学的クエンチングについて試験する；化合物を、再現性およびシグナルクエンチングを有さないものについて排除する。ｄ精製された化合物を、さらに生物学的に分析する。分析は、活性の確認(IC₅ ₀ 値）；構造の確認（質量分析）；および、他の増殖因子に対する特異的結合アッセイを包含する。表３．８つの選択された化合物のIC₅₀ ^aのまとめ実施例７シュワン細胞増殖アッセイにおける同定されたコンビナトリアル化合物の効果結合アッセイにおいて同定された３つの化合物を、より大きなスケールで再合成し、次いでHPLCによって精製し、そしてシュワン細胞の増殖の阻害について試験した。サンプルを100％メタノール中に提供し、そしてバイオアッセイで使用した最大濃度で培地中に少なくとも100倍希釈した。これらの化合物を、Sudhalt erら(Sudhalterら、（1996）Glia 17:28-38)により記載される方法を使用して、シュワン細胞増殖アッセイにおける生物学的活性について分析した。図13は、このアッセイの結果を示す。化合物およびコントロールを、培養培地中に希釈し、そしてrhGGF2(60ng/mlの最終濃度)と混合して、0.195μM〜200μMの範囲の最終濃度を達成させた。室温で90分間インキュベートした後、混合物を細胞の培地を置き換えるために使用し、次いで標準的なプロトコルに従ってアッセイを行った。個々の化合物のストックを、200mMメタノール(ROY20.2およびROY20.3以外、これらは20mMであった)であった。化合物ROY20.1は、100％メタノール、溶媒コントロールであった。このアッセイにおいて最大約0.1％までで存在する場合、シュワン細胞のrhGGF2に対する有糸分裂応答を妨害しなかった。化合物ROY22.2はスラミン(ポジティブコントロール)であり、これは、このアッセイにおいてほぼ50μMのIC₅₀を示した。化合物RO Y22.3は、このバッチにおいて、最も強力であるようであったが、細胞に対して極めて毒性であった。化合物ROY22.4〜22.6は、この結合アッセイにおいて、ポジティブであったHPLC精製化合物を示す。rhGGF2の刺激によるシュワン細胞増殖の阻害は、100μMの範囲において見られた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 31/351 Ａ６１Ｋ 31/35 ６０１ 31/4045 31/40 ６０８ 31/4406 31/44 ６０２ 31/5375 31/535 ６０５ 31/726 31/715 ６０９ 31/727 ６１０ 38/00 39/395 Ｄ 39/395 45/00 45/00 Ｃ０７Ｃ 237/22 Ｃ０７Ｃ 237/22 309/17 309/17 309/57 309/57 Ｃ０７Ｄ 209/12 Ｃ０７Ｄ 209/12 209/16 209/16 213/82 213/82 215/00 215/00 233/00 233/00 295/12 295/12 309/08 309/08 315/00 315/00 401/12 401/12 405/12 405/12 407/12 407/12 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/566 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (71)出願人サドハルター，ジュディスアメリカ合衆国マサチューセッツ 02162，ニュートンロワーフォールズ, グローブストリート 416，アパートメントシー−１ (71)出願人マハンサッパ，ナゲシュケイ. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02139，ケンブリッジ，ノーフォークストリート 240 (71)出願人マーチオニ，マークエイ. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02174，アーリントン，ツインサークルドライブ 24 (71)出願人ジャコブソン，アランアール. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02143，ソマービル，スケハンストリート 35，アパートメント３ (71)出願人プロスキュア，インコーポレイテッドアメリカ合衆国マサチューセッツ 02194，ニードハム，４ティーエイチアベニュー 117 (72)発明者ラッシェ，ジェイムズアメリカ合衆国マサチューセッツ 01701，フラミンガム，ブリッガムロード 18 (72)発明者サドハルター，ジュディスアメリカ合衆国マサチューセッツ 02162，ニュートンロワーフォールズ, グローブストリート 416，アパートメントシー−１ (72)発明者マハンサッパ，ナゲシュケイ. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02139，ケンブリッジ，ノーフォークストリート 240 (72)発明者マーチオニ，マークエイ. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02174，アーリントン，ツインサークルドライブ 24 (72)発明者ジャコブソン，アランアール. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02143，ソマービル，スケハンストリート 35，アパートメント３

Claims

【特許請求の範囲】１．ニューレグリンに対して優先的な結合活性を有する単離されたタンパク質特異的グリコサミノグリカン配列アナログであって、該タンパク質特異的グリコサミノグリカン配列アナログは、1）ポリ硫酸化ナフチル尿素以外の組成；2）該ニューレグリンに対する特異性を有するタンパク質特異的グリコサミノグリカン配列のオリゴ二糖配列構造を機能的に模倣すること；および3）該ニューレグリンにおいて分子表面構造に対して優先的な親和性を有すること、を包含する、単離されたタンパク質特異的グリコサミノグリカン配列アナログ。２．血清可溶性結合部分に非共有結合したニューレグリンを含む単離された複合体であって、ここで、該部分が、1）該ニューレグリンに対する特異性を有するタンパク質特異的グリコサミノグリカン配列のオリゴ二糖配列構造を機能的に模倣し、そして2）該ニューレグリンにおいて分子表面構造に対して優先的な親和性を有する、タンパク質特異的グリコサミノグリカン配列アナログを含む、単離された複合体。３．前記アナログが、約５×10^-7M未満の解離定数によって示される前記ニューレグリンに対する結合親和性を有する、請求項１に記載の単離されたタンパク質特異的グリコサミノグリカン配列アナログ、または請求項２に記載の単離された複合体。４．前記ニューレグリンが、インビボで第２のタンパク質に対する特異的結合親和性をさらに有し、該ニューレグリンにおける部位で生じる該第２のタンパク質との該特異的結合相互作用が、前記タンパク質特異的グリコサミノグリカン配列またはアナログと優先的に相互作用するものとは異なる、請求項１に記載の単離されたタンパク質特異的グリコサミノグリカン配列アナログ、または請求項２に記載の単離された複合体。５．前記ニューレグリンがrhGGF2である、請求項１または２に記載のニューレグリン。６．前記アナログが、タンパク質特異的グリコサミノグリカン配列アンタゴ二ストである、請求項１に記載の単離されたタンパク質特異的グリコサミノグリカン配列アナログ、または請求項２に記載の単離された複合体。７．前記アナログが、タンパク質特異的グリコサミノグリカン配列アゴニストである、請求項１に記載の単離されたタンパク質特異的グリコサミノグリカン配列アナログ、または請求項２に記載の単離された複合体。８．前記タンパク質特異的グリコサミノグリカン配列アナログが、硫酸化二糖を含む予め決定された組成を有するオリゴ二糖配列を含む、請求項１に記載の単離されたタンパク質特異的グリコサミノグリカン配列アナログ、または請求項２に記載の単離された複合体。９．前記タンパク質特異的グリコサミノグリカン配列が、非炭水化物の合成有機分子である、請求項１に記載の単離されたタンパク質特異的グリコサミノグリカン配列アナログ、または請求項２に記載の単離された複合体。１０．タンパク質−ニューレグリン相互作用に対して特異的な第２の異なる結合部位を有する天然に存在するニューレグリンの単離された改変体を、薬学的に受容可能なキャリアと混合して含む、哺乳動物へ投与するための組成物であって、該改変体が、該タンパク質−ニューレグリン相互作用を阻止または実質的に妨害するように改変されている、組成物。１１．以下の式の化合物：であって、ここで、各Ｒ基は、それぞれ、Ｒ₁酸；Ｒ₂アミン；Ｒ₃アルデヒド；およびＲ₄イソニトリルに由来する、化合物。１２．前記Ｒ₁の酸が、フロ酸、グルタル酸、スルホサリチル酸およびスルホ酢酸、ナフトエ酸、インドールカルボン酸、ジメチルグリシン、およびジヒドロキシフェニル酢酸からなる群より選択される、請求項１１に記載の化合物。１３．前記Ｒ₂のアミンが、アミノインダゾール、ピペロニルアミン、トリプタミン、アミノプロパンスルホン酸、スルファニル酸、およびアミノナフトールジスルホン酸からなる群より選択される、請求項１１に記載の化合物。１４．前記Ｒ₃のアルデヒドが、ベンズアルデヒド、フェノキシベンズアルデヒド、シクロヘキサンカルボキシアルデヒド、メチルホルミルベンゾエート、フルアルデヒド、キノリンカルボキシアルデヒド、およびホルミルフランスルホン酸からなる群より選択される、請求項１１に記載の化合物。１５．前記Ｒ⁴のイソニトリルが、ブチルイソシアニド、メチルイソシアノアセテート、ジイソシアノヘキサン、およびジエチル（イソシアノメチル）ホスホネートからなる群より選択される、請求項１１に記載の化合物。１６．２つの共有結合したニューレグリン特異的グリコサミノグリカン配列を含む合成分子であって、各該ニューレグリン特異的グリコサミノグリカン配列が、該ニューレグリンに対する結合特異性を有し、該分子が、各該ニューレグリンへの各該ニューレグリン特異的グリコサミノグリカン配列の同時結合を可能にするコンホメーションを有する、合成分子。１７．複数のニューレグリンに対する特異性を有する、請求項１６に記載の合成分子。１８．各前記ニューレグリン特異的グリコサミノグリカン配列が、約５×10^-7 M未満の解離定数によって示されるその該ニューレグリンに対する親和性を有する、請求項１６に記載の合成分子。１９．各前記ニューレグリン特異的グリコサミノグリカン配列が、請求項１１に定義されるニューレグリン特異的グリコサミノグリカン配列アナログのクラスから選択される、請求項１６に記載の合成分子。２０．請求項２に記載の単離された複合体を、薬学的に受容可能なキャリアと混合して含む、哺乳動物へ投与するための治療組成物。２１．検出可能な部分と複合体化した請求項１または請求項１１に記載のタンパク質特異的グリコサミノグリカン配列アナログを含む、インビボ画像化剤。２２．前記検出可能な部分が、放射活性原子を含むか、またはインビボで陽子の緩和を誘導する手段を含む、請求項２１に記載のインビボ画像化剤。２３．哺乳動物体内の細胞または細胞外マトリクスの表面に固定されたニューレグリン特異的グリコサミノグリカン配列へのニューレグリンの結合を阻害する方法であって、該方法が、ポリスルホネートナフチル尿素以外、かつ予め決定された組成を有する血液血清可溶性ニューレグリン特異的グリコサミノグリカン配列アンタゴニストを該哺乳動物に投与する工程を包含し、該アンタゴニストが、該ニューレグリン特異的グリコサミノグリカン配列の構造を機能的に模倣し、そしてインビボで活性ニューレグリンを該ニューレグリン特異的グリコサミノグリカン配列と置き換えるために有効な濃度で、該ニューレグリンと選択的に結合する、方法。２４．哺乳動物体内の細胞または細胞外マトリクスの表面に固定されたニューレグリン特異的グリコサミノグリカン配列へのニューレグリンの結合を阻害する方法であって、該方法が、インビボで活性ニューレグリンと該ニューレグリン特異的グリコサミノグリカン配列を置き換えるために有効な濃度で、該ニューレグリンに特異的なニューレグリン特異的グリコサミノグリカン配列と結合する血液血清可溶性ニューレグリンアンタゴニストを該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。２５．請求項２３または２４に記載の方法であって、ここで、前記細胞が、前記ニューレグリンに対する膜に固定されたレセプターを含み、該方法が、ニューレグリン−レセプター結合を調節するために前記アンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。２６．前記タンパク質特異的グリコサミノグリカン配列アンタゴニストが、硫酸化二糖を含む予め決定された組成を有するオリゴ二糖配列を含む、請求項２４に記載の方法。２７．前記アンタゴニストが合成有機分子である、請求項２３または２４に記載の方法。２８．前記アンタゴニストが抗体である、請求項２３または２４に記載の方法。２９．前記アンタゴニストが、前記ニューレグリン−レセプター結合を阻止または実質的に妨害するように改変された該ニューレグリンの改変体である、請求項２７に記載の方法。３０．前記ニューレグリンがrhGGF2である、請求項２３または２４に記載の方法。３１．予め選択されたニューレグリンと優先的に結合するタンパク質特異的グリコサミノグリカン配列またはそのアナログを含む分子を、混合物から単離するための方法であって、該方法は、以下の工程： a）非変性電気泳動ゲルのマトリクス内に分散した目的のニューレグリンを、該電気泳動ゲルに適用される電場に平行な所定のバンド中に提供する工程； b）電気泳動移動度によって分離可能な複合体を形成するために候補配列間の結合を促進するような条件下で、該バンドによって少なくとも１つの候補タンパク質特異的グリコサミノグリカン配列を含む分子の混合物を電気泳動する工程； c）該分離した複合体を単離し、そして該単離した複合体に結合した該候補タンパク質特異的グリコサミノグリカン配列の組成物を決定する工程、を包含する、方法。３２．請求項３２に記載の方法であって、ここで、前記混合物が、複数の候補配列を含み、そして工程b)における電気泳動条件が、電気泳動移動度によって分離可能な複合体を形成するための、目的の前記ニューレグリンと該候補配列の少なくとも１つのサブセットとの間の結合を促進するために十分である、方法。３３．前記候補分子が、検出可能な部分と会合する、請求項３０に記載の方法。３４．前記検出可能な部分が放射活性原子を含む、請求項３１に記載の方法。３５．前記候補分子が天然に由来する分子である、請求項３２に記載の方法。３６．前記候補化合物が、プロテオグリカンからオリゴ糖を単離することによって提供される、請求項３２に記載の方法。３７．前記候補分子が非炭水化物の有機分子である、請求項３２に記載の方法。３８．閾値レベルを超える予め選択されたニューレグリンに対して優先的な結合親和性を有する特定の合成タンパク質特異的グリコサミノグリカン配列を得るための、コンビナトリアルライブラリーキットであって、該キットは、以下： a）候補タンパク質特異的グリコサミノグリカン配列を捕獲する手段であって、該捕獲された候補が、請求項１１によって定義される該候補アナログのサブセットのメンバーを構成し、各該捕獲された候補が、特定のオリゴマー骨格配列およびそれに由来する１つ以上の特異的官能基ペンダントを有する、手段； b）ニューレグリン；および c）該予め選択されたニューレグリンに対する結合性について該捕獲された候補をスクリーニングする手段、を含む、キット。３９．細胞増殖を阻害するための、請求項１または請求項１１に記載のアナログの使用。４０．過剰増殖性疾患を処置するための、請求項１または請求項１１に記載のアナログの使用。４１．前記過剰増殖性疾患が癌またはアテローム性動脈硬化症誘導性疾患である、請求項４０に記載の使用。