JP2000511204A - 植物寄生線虫に対して有効な殺卵作用を有するバイオ殺線虫剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、土壌、畑、果樹園および温室で各種寄生性線虫に対して有効な本質的に殺卵性の活性を有する生の生物殺線虫剤（NOVI-BIOTECH-7996）の新規な組成物に関する。NOVI-BIOTECH-7996は、土壌中の前記寄生虫の抵抗期および保存期に対して相補的かつ相乗的殺卵効果を有する適合性細菌の組合せである。また本発明は、NOVI-BIOTECH-7996組成物の大量生産方法および種々の条件下での施用方法にも係る。NOVI-BIOTECH-7996は特に、土壌または処理した基質の可能な接種を低減しつつ、各種線虫によって侵され易い栽培物その他の宿主の保護に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】植物寄生線虫に対して有効な殺卵作用を有するバイオ殺線虫剤 １．発明が属する技術分野 本発明は、種々の寄生線虫及び植物寄生線虫を防除するために温室及び野外で 使用される本質的に殺卵作用を有している特に活性のバイオ殺線虫剤の開発を目 的とする。本発明はまた、このような物質の量産、製剤化及び施用の方法を包含 する。本発明のバイオ殺線虫剤は、“ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６”と命 名されている（Ｎｅｍａｔｏｄｅｓ Ｏｖｉｃｉｄｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｃｏｎｔ ｒｏｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９７９／１９９６）。 ２．発明の背景 ２．１ 植物寄生線虫の問題 植物寄生線虫は、種々の作物に対して世界の種々の地域で深刻な問題を生じて いる。地中海沿岸の実態では、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ種が温室の作物の生産高 を１０〜８０％低下させている（参考文献１：Ｂ’ＣＨＩＲ Ｍ．Ｍ．，Ｒｅｖ ｕｅ ｉｎｖｅｓｔｉｓｓｅｕｒ,ＡＰＩＡ−Ｔｕｎｉｓｉｅ １７， ３−４（１９９６）。Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ種は、ジャガイモの生産高を５〜３０ ％低下させている（参考文献２：Ｂ’ＣＨＩＲ Ｍ．Ｍ．＆ ＫＡＣＨＯＵＲＩ Ｎ．，Ｍｅｄ．Ｆａｃ．Ｌａｎｄｂｏｕｗｗ．Ｕｎｉｖ．Ｇｅｎｔ．５９／１ ２５−３６（１９９２）。 複数の種類の線虫が樹木栽培農園の寿命を短縮し生産高を低下させている。 宿主植物が存在しないとき、線虫は土壌中に多少とも長い間保留されている。 この保留時期は本質的に卵から成り、卵は孤立しているかまたはゼリー状物質に よってある程度保護されているかあるいは数百個の卵を内包し得る嚢胞（シスト ）によって保護されている。 ２．２ 植物寄生線虫の防除における問題点 線虫防除のために化学的方法以外の種々の方法を利用し得る（参考文献３：Ｂ ＲＩＤＧＥ Ｊ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏ ｇｉｅ ３４，２０１−２２１（１９９６）。しかしながら、化学的防除が最も 頻用されており、多少とも有効な化学物質が市販されていることによって代替方 法を開発する研究が妨げられてきたとも考えられる。これ らの代替方法は多くの場合にまだ期待のレベルに到達せず、その効果が優れた殺 線虫剤の効果を上回ることも殆どない。 しかしながら、化学的防除には多くの欠点があり、植物無毒性の殺線虫剤（有 機リン化合物及びカーバメート）の残留効果が次第に指摘されるようになってい る。１，３−ＤＤ、ｍｅｔｈａｎ ｓｏｄｉｕｍ及び特に臭化メチルのような燻 蒸剤のオゾン層に対する危険性は、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）よりもは るかに大きい。国連は環境保全の目的で２０１０年以後の臭化メチルの販売を禁 止することを決定している。 従って、代替方法の開発が急務であり、代替方法の開発は世界の多くの国々の 重要な課題となっている（参考文献４：ＮＯＬＩＮＧ Ｊ．Ｗ．＆ ＢＥＣＫＥ Ｒ Ｊ．Ｏ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２６／４Ｓ，５ ７３−５８６（１９９４）。 線虫に抵抗性の変種及び品種の使用は有力な代替方法であると考えられた。し かしながら多くの場合、線虫は抵抗性遺伝子を迂回する能力を有している。実際 、これらの変種を単一栽培すると、毒性の病原型が出現する。従って、抵抗性品 種を感受性品種と同様に保護しなければならない場合が頻繁に生じる。 “太陽熱利用”（参考文献５：ＧＡＵＲＥ．Ｓ．＆ ＰＥＲＲＹ Ｒ．Ｎ．， Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ６０／４，１５３−１６７ （１９９１））及び地熱温水の使用（参考文献１）のような物理的防除方法は線 虫防除にある程度有効である。しかしながら、この効果は極めて不確実でありま た不十分である。完全な線虫防除効果を得るためには、これらの物理的方法を他 の方法と併用することが予想以上に必要である。 線虫防除に使用されるバイオ殺線虫剤は２種類に大別できる。一方は、ＡＢＧ −９００８（参考文献６：ＷＡＲＲＩＯＲＦ．，ＲＥＨＢＥＲＧＥＲ Ｌ．Ａ． ＆ ＧＲＡＵ Ｐ．Ａ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２７ ，５２４−５２５（１９９５））のような生物起源の不活性バイオ殺線虫剤であ り、他方は、“Ｎｅｍａｔｏｐｈａｇｏｕｓ ｆｕｎｇｉ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉ ｏｎ”（参考文献７：ＳＡＭＵＥＬＳ Ｋ．Ｄ．Ｚ．ら，ＰＣＴ Ｎｏ．ＷＯ９ ４／２８７２５，１−４１（１９９４））に記載のような活性のバイオ殺線虫剤 である。しかしながら、生物学的防除は何故有効に化学的防除に代替することが できなかったのであろうか？最も有効な生 物薬剤を選択したであろうか？生物学的防除の計画が難しかったのであろうか？ あるいは、問題点が適切に把握されていなかったのであろうか？ いずれにしても、不活性のバイオ殺線虫剤の使用には、実用の面で化学的防除 の制約と同様の制約がある（毒性、残留性、複合施用、など）。活性のバイオ殺 線虫剤による生物学的防除の構想は複数の研究及び特許の目的となっており、例 えば参考文献（７）及び参考文献８：Ｂ’ＣＨＩＲ Ｍ．Ｍ．，ＩＮＰＹ Ｎｏ ．９５ １５６８７（１９９５）を例示し得る。 線虫の卵の寄生真菌類の効果の限界に関しては、参考文献（９）：ＤＥ ＬＥ ＩＪ Ｆ．Ａ．Ａ．Ｍ．，Ｔｈｅｓｅ Ｌａｎｄｂｏｕｗ．Ｗａｇｅｎｉｎｇｅ ｎ，１４０ｐｐ（１９９２）に記載されている。 ２．３．植物寄生線虫の防除薬剤となる細菌の問題点 Ｐａｓｔｅｕｒｉａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓを生物学的線虫防除剤として実際に 施用するのは難しいが、その理由は、線虫のクチクラに胞子が特異的に付着する ことに本質的に関係がある。予め処理した線虫集団に獲得抵抗性が出現し、これ が生物薬剤の実際の効果を低下させる。 更に、生物学的線虫防除剤としてＢａｃｉ１１ｕｓ属の細菌を使用することを 開示した最も適切な参考文献を以下に挙げる。 Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の複数の種が昆虫に対して病原性であり、殺虫性毒素を産 生する。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓは昆虫に対する生物学的防除のために 最も頻用されている種である。更に、参考文献（１０）、（１１）、（１４）及 び（１９）は、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｉｓｒａｅ１ｅｎｓｉｓの 毒素が、Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓのよ うな動物寄生線虫の卵を殺すことを証明した。Ｂ．ｔ．ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ の作用は、Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓの 幼虫のクチクラ及び／または卵殻を分解させ、その結果として線虫を致死させる 。更に、参考文献（１２）及び（１５）は、Ｂ．ｔ．ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓの 毒素（デルタ内毒素）が昆虫の筋肉及び神経系に作用してこれらを撹乱すること を証明した。この特徴は、細菌株Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの線虫に対す る作用と昆虫に対する作用とが異なっていることを明確に示している（参考文献 ２９、３１、３３、３４、３５）。 参考文献（１７）及び（２５）は、細菌Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの菌 株Ｋｕｒｓｔａｋｉが、Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｓｅｍｉｐｅｎｅｔｒａｎｓ 及びＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ種の卵の孵化を減少させることを示している。 参考文献（２０）は、動物寄生線虫の卵及び幼虫に対するＢ．ｔｈｕｒｉｎｇ ｉｅｎｓｉｓ ｋｕｒｓｔａｋｉの毒素の効果を左右する要因を決定した。 参考文献（１８）は、動物寄生線虫に対する生物学的防除に 使用するためのＳ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの菌株を保護している。 参考文献（２１）は、昆虫を防除するために昆虫寄生線虫と種々のＢ．ｔｈｕ ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの種々の菌株（ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ、ｋｕｒｓｔａｋ ｉ）との併用効果を試験した。著者は、細菌と線虫との拮抗作用を防止するため に細菌の菌株使用の少なくとも２４時間前に線虫を使用しなければならないこと を示している。 参考文献（２２）は、Ｔｕｒｂａｔｒｉｘ ａｃｅｔｉに対するＢ．ｔ．の３ つの菌株（ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ、ｋｕｒｓｔａｋｉ及びｍｏｒｒｉｓｏｎｉ ）の効果を証明した。Ｂ．ｔ．ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓが最も有効である。 参考文献（１３）は、線虫に対する作用を有しているＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅ ｎｓｉｓの新規な菌株を保護している。この新規な菌株の毒素は線虫の腸組織に 直接作用する。この菌株は参考文献（３３）、（３４）及び（３５）で詳細に検 討された。細菌を捕食する線虫の死骸はＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの増殖 培地を構成し得る（参考文献３２）。 参考文献（２５）は、土壌の微生物（無脊椎動物）に対する Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの作用が可変であることを示している。 参考文献（２７）及び（３０）は、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのいくつ かの菌株がオオムギ、トマト、トウガラシ及びオランダイチゴのような種々の宿 主作物のＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ種、Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｒｅｎｉｆ ｏｒｍｉｓ及びＰｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｐｅｎｅｔｒａｎｓのような植物寄 生線虫に対して多少とも有効であり得ることを指摘している。 しかしながら、線虫の腸璧に対するＳ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの菌株の 作用モード及び効果と線虫集団中の抵抗性出現の可能性とから考えて、参考文献 （３５）は、殺線虫性の菌株が生物学的線虫防除剤としては殺虫作用を有する菌 株と同程度にしか期待できないと主張している。 参考文献（１６）は、またＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓが昆虫の 腸細胞に作用することを指摘している。参考文献（２３）及び（２４）は、ａｇ ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒと任意に組合せて土壌に施用さ れたＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓが、ジャガイモに対 する線虫（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｌｌｉｄａ）の発生率を低下させ、この作 物の生産性を改良することを示している。これらの細菌は、宿主に対する幼虫の 根侵入を抑制する。 参考文献（２８）は、またＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓがトマトに対する Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ種の幼虫の根侵入を抑制することを示している。殺線虫 効果は処理された土壌中のアンモニア濃度の増加に関係がある。 これらの参考文献全部をより詳細に検討すると、殆どの場合にはＢａｃｉｌｌ ｕｓ種の１つの種または菌株が単独で生物薬剤として施用されており、線虫の最 も重要な保留段階を構成する卵に安定な二成分の組合せを施用し、組合せによる 相乗作用を試験したものはないことが判明する。 参考文献（７）は、線虫捕食性及び線虫寄生性の真菌類が加わった別の組合せ による効果を証明した。しかしながら、生物学的線虫防除剤として真菌類を施用 する方法の成功は、真菌類の製剤化技術及びその保存技術に依存する。 ２．４．生物薬剤の製剤化及び保存 参考文献（７）及び（８）は、現状では液体媒体中の生物薬剤の量産に重大な 支障となる問題が存在しないことを示してい る。 しかしながら、アルギン酸塩ボール中に生物薬剤を含む形態の製剤は、土壌に 施用されたときにその効果が低下する（参考文献３６：ＪＡＦＦＥＥ Ｂ．Ａ． ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２７（４）５０４、及び、 参考文献３７：ＲＯＢＩＮＳＯＮ．Ａ．Ｆ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｍ ａｔｏｌｏｇｙ ２７（４）５２０（１９９５））。 合成殺線虫剤の後継とする目的及び／または合成殺線虫剤の作用範囲を補完す る目的のバイオ殺線虫剤が市場で成功を得るか否かは、それらの効果及び施用の 容易性に依存し、特に、処理済み土壌の汚染率の上昇のような栽培終期の二次効 果の解消に依存する。 本願発明の目的となるＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６は残留効果を有して いるので、市場で入手できる天然または合成の化学物質よりも有効であるとは言 えなくても、少なくとも同程度には有効である。ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９ ９６は更に、多様な寄生線虫群に対する防除の分野で広範囲に使用できる可能性 を有している。 ３．発明の概要 本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に所属する少なくとも２種類の適合性細菌株を 含む活性のバイオ殺線虫剤組成物、その製造方法及びその使用方法に関する。 １９７９から１９９０まで行った１つの栽培方法によって細菌複合体（ＮＯＶ Ｉ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６）を実験的に選択した。ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ− ７９９６は好ましくは、互いに適合性の少なくとも１つの菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓと１つの菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉ ｃｕｓとを含み、この細菌複合体は、多様な種類の植物寄生線虫に対して相乗的 な殺卵作用を有している。 ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６は好ましくは、５０〜８０％のＢａｃｉｌ ｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓと２０〜５０％のＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉ ｎｇｉｅｎｓｉｓとから構成されている。 好ましくは、野菜粒の抽出物とエネルギー源となるショ糖とを主成分とする天 然の液体培地または従来の合成液体培地（参考文献８）においてＮＯＶＩ−ＢＩ ＯＴＥＣ−７９９６を産生させる。 本発明はまた、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６をそのまま使用できる液体 懸濁液の形態または好ましくは潅漑用水に加える水和剤の形態で製剤化する方法 に関する。本発明は更に、最適効果を得るように種々の作物を自然条件下で生物 処理するための好ましい技術に関する。 本発明の目的であるＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６によれば、多様な種類 の線虫が発生している作物を極めて有意に保護することができ、しかも従来の処 理の欠点、即ち栽培終期の土壌の汚染率の増加という欠点を回避できる。 ４．発明の詳細な説明 ４．１ 殺卵作用を有する生物薬剤（ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６）の証 明及び選択 チュニス近郊２０ｋｍ圏のモルナグの地で６０×８ｍの温室を用いて生物薬剤 の証明及び選択を実施した。２０％粘土を含む土壌には３種類のＭｅｌｏｉｄｏ ｇｙｎｅ（Ｍ．ｊａｖａｎｉｃａ、Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ及びＭ．ａｒｅｎａ ｒｉａ）が自然発生していた。３つの基本区画を、底部まで届く抵抗性プラスチ ックフィルムによって隔離した。どの実験区画においても、Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉ ｔａが他の２つの種を圧倒していた。 ４．１．１ 実験プロトコルの第一段階（１９７９−１９８５）では、異なる４ つのプログラムに従って温室の栽培サイクルを実施した（表１）。 表 １ ＳＳ及びＳＲの処理に先立って、１９７９年及び１９８０年に感受性トマトを ２回栽培した。また、ＲＳ及びＲＲの処理に先立って、抵抗性トマトを連続して ２回栽培した。 表２は栽培サイクル後に測定したゴール指数の変化を示す（ゴール指数は根の 潜在的汚染率を表しており、Ｏ−５までの数値で評価される）。 表 ２ 処理による平均ゴール指数の測定値 処理毎の違いは、異なる栽培サイクルがトマトの根における線虫の発生に影響 を与えたためであると考えられる。 また、作物における線虫発生率が次第に低下しており、これは、土壌中の天然 拮抗物質の増加に対応すると考えられる。 この実験プロトコル条件では、抵抗性品種の抵抗性遺伝子を迂回し得る毒性病 原型の大発生は観察されなかった。 ４．１．２ 実験プロトコルの第二段階（１９８６−１９９０）では、メロン及 びトマトのような線虫に感受性の作物に対する残留効果を異なる４つの栽培プロ グラムによって測定した。 この第二段階期間（１９８６−１９９０）では、宿主（メロンまたはトマト） に関わりなく、一方が処理ＳＳ及びＳＲから成り他方が処理ＲＳ及びＲＲから成 る２つの処理グループの違いが明らかであった。 表３は、種々の栽培プログラムで観察された線虫発生挙動に対する残留効果を 、感受性トマト（Ｈ６３−５）作物を基準として評価した値で示す。 ＲＳ及びＲＲのグループの区画とＳＳ及びＳＲのグループの区画ではトマトの 栽培サイクル中の線虫発生の進行は統計的に異なっている。ＲＲ及びＲＳの区画 内の線虫の挙動は１９８６ 年から１９９０年まで定常的に変化した。 表 ３ トマトの根1ｇあたりの線虫（１９８８） ＲＳ及びＲＲの区画内では線虫の発生が緩徐になっている。複数の栽培サイク ルによって、線虫に対する“抵抗性土壌”の形成が誘発されたためであると考え られる。 表４は、種々の実験区画におけるトマトの反応を表す。 表 ４ 感受性トマトの栽培に関する評価基準（栽培周期、１９８８） ＊同じ文字を添付した値は統計的に同等である。 ＲＲ及びＲＳの区画に線虫は存在しているが、作物に対する線虫の影響はＳＳ 及びＳＲの区画で観察された影響に比較すれ ば無に等しい（表４）。 この場合の卵の致死率の増加は、ＲＳ及びＲＲの区画の土壌中に殺卵作用を有 する細菌複合体が増殖したことに関係がある。連続する２回の栽培サイクル間に ゼリー状物質内に保護されている卵の生存率に対してこれらの細菌が影響を及ぼ すことは明らかである。 ４．２ 土壌中で選択された生物薬剤の同定 殺卵性細菌を感染させたＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ種の卵の集合塊をＲＳ及びＲ Ｒの区画から採取し、これらの卵に付着したすべての細菌株を単離し、濃縮寒天 培地で精製した。 線虫に対して特に活性の３つの細菌株を保存した。これらの細菌株をＢＴＡ、 ＢＴＢ及びＢＳＭと命名し、単独でまたは２つずつ組合せて、固体寒天栄養培地 （参考文献８）に定期的に植付けた。 選択された３つの細菌株はＢａｃｉｌｌｕｓ属に所属する。これらの細菌は０ ℃以下及び４５℃以上の温度でも生存し得る。これらの細菌は、固体培地、液体 培地及び殆どの農業土壌で増殖し得る。 これらの細菌の培養培地のｐＨは５〜８の範囲でよいが、好 ましくは６〜７．５である。 殺卵性細菌の増殖温度は８℃〜４８℃の範囲でよいが、好ましくは２０℃〜３ ５℃である。これらの細菌の増殖は特に、Ｐｒｉｓｔｉｏｎｃｈｕｓ ｎ種のよ うな細菌捕食性線虫の存在によって刺激される（参考文献８）。 これらの細菌株の同定をその脂肪酸組成の分析によって行った。その結果とし て得られたプロフィルから、菌株ＢＴＡ及びＢＴＢをＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕ ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ種に所属する菌株として同定し、ＢＳＭをＢａｃｉｌｌｕ ｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ種に所属する菌株として同定した。 親菌株を単独でまたは２つずつ組合せて、−２０℃の冷凍庫で保存するか、ま たは、凍結乾燥粉末の形態でパラフィン油中に室温で保存した。 ４．３ 単離した生物薬剤の作用モード及び相乗効果 ３つの菌株ＢＴＡ、ＢＴＢ及びＢＳＭの効果を種々の齢期の種々の線虫群（植 物寄生性及び細菌捕食性）に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ試験した。 カバーグラスに滴下した種々の殺卵性菌株の存在下で、パラフィン油を収容し た凹部をもつスライドグラスに線虫を配置す る。このプレパラートは変質しないように配慮すれば数週間保存できる。プレパ ラートを種々の倍率の顕微鏡で定期的に観察し、顕微鏡写真を作製する。 細菌の作用モードの研究から、胚の成長中の卵が３種類の細菌株の作用に最も 感受性であることが判明した。菌株ＢＴＡとＢＳＭとは互いに適合性であり、そ れらの殺卵作用は菌株ＢＴＢの殺卵作用よりもはるかに顕著である。 離生齢期及び成虫期の線虫は卵よりもこれらの種々の細菌株の作用を受け難い 。Ｐｒｉｓｔｉｏｎｃｈｕｓ ｎ種は寒天培地で培養された細菌株、特にＢＴＢ の存在下でも摂食し発育し得る。ＢＳＭの存在下で発育したＰｒｉｓｔｉｏｎｃ ｈｕｓ ｎ種の雌の体内ではしばしば、生殖管の内部の卵細胞の処に細菌集団が 増殖しており、これらの細菌集団はかなりの割合の卵を発生以前に致死させ得る 。細菌感染した卵は細菌を培養培地で播殖させる。 孵化直後の幼虫は成虫よりも細菌の作用に感受性である。 しかしながら、“抵抗性”幼虫（Ｄａｕｅｒ ｌａｒｖｅｓ）は細菌の作用に 対して最も耐性の発育段階を構成している。従って、増殖ポテンシャルが大きい こと、胚の成長速度が高いこ と、及び、特に二重クチクラ壁によって保護された抵抗性齢期（Ｄａｕｅｒ ｌ ａｒｖｅｓ）が存在することなどを考慮すると、細菌捕食性線虫は他のグループ の線虫よりもＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６に対して感受性でない。 従って、本発明の目的であるＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６の作用は本質 的に、引用の参考文献の多く（参考文献１０、３３、３４及び３５）によって示 されているような、線虫の腸組織を破壊または損傷する毒素の摂取には無関係で ある。発明者らは、本発明の特徴はＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６の組成に Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株（ＢＴＡ）を加えたことにあると考えてい る。 雌雄同体の両性種であるＰｒｉｓｔｉｏｎｃｈｕｓ ｎ種の卵は子宮内では２ ３℃で１２時間以内に速やかに発育する。成虫の体内ではこれらの卵の大半が、 細菌株ＢＴＡ、ＢＴＢによる殺卵作用の影響を受けない。 Ｐｒｉｓｔｉｏｎｃｈｕｓ ｎ種の雌（雌雄同体）の表面を消毒し解剖した後 で第一齢の発達段階の卵を抽出すると、菌株ＢＴＡ及びＢＳＭの殺卵作用の研究 と２つの菌株の組合せ効果の研究とを容易に行うことができる（表５）。 表 ５ Pristionchus ｎ種の卵の致死率％に対する菌株ＢＴＡ及び ＢＳＭの殺卵効果（４８時間） 表５は、処理の４８時間後には、ＢＴＡ＋ＢＳＭの組合せによる殺卵作用がこ れらの２つの菌株単独による殺卵作用よりもはるかに顕著であることを示す。し かしながら処理の７２時間後には、３つのどの場合でもＰｒｉｓｔｉｏｎｃｈｕ ｓ ｎ種の孵化直後の幼虫及び卵が細菌懸濁液によって全滅した。 線虫の卵に対して菌株ＢＴＡ及びＢＳＭの組合せ（ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ− １９９６）が示した殺卵作用は、２つの菌株単独による殺卵作用よりもはるかに 明確である。この作用は、肝の成長期間が長い植物寄生線虫に対してより顕著で ある。従って、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６の殺卵作用は１つの群または １つの種の線虫に特異的ではない。 更に、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６は、双翅類（ショウジョウバエ）の 幼虫に対する明らかな殺虫効果及びＧａｍａｚｉｄｅｓに対する殺ダニ活性を示 さない。 表６は、卵の集合塊の処理の２週後（ＩＩ）及び３週後（ＩＩＩ）のＭｅｌｏ ｉｄｏｇｙｎｅ ｊａｖａｎｉｃａの卵の致死率に対する殺卵性細菌の影響を示 す。 細菌ＢＴＡ及びＢＳＭのバイオ殺線虫作用が卵に与える効果は極めて有意であ るが、緩徐である。細菌ＢＴＡ及びＢＳＭの存在下で孵化し得る受精卵（幼虫Ｌ ２）の割合は極めて低い。 表 ６ Meloidogyne javanicaの卵の致死率％に対するＢＴＡ、ＢＴＢ及びＢＳＭの “in vitro”効果 処理の３週後には発育中の卵が全滅した。卵の感受性は早期感染に関係がある 。Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｊａｖａｎｉｃａの卵に対するＮＯＶＩ−ＢＩＯＴ ＥＣ−７９９６の作用モードを研究し顕微鏡写真を作製した。菌株ＢＴＡは卵の 周囲で活性化することによって卵殻を攻撃する。感染の２４〜４８時間後に卵殻 が変質する。卵殻が多少とも多孔性及び透過性になり、細菌が大量に卵殻に付着 する。 分割球の細胞崩壊の進行に伴って、卵の中身の緊張が次第に 高まる。卵殻の分解速度は接種物の濃度及びインキュベーション温度に比例する 。 胚の成長は急激に停止し、菌株ＢＳＭが卵に侵入して分割球の処で増殖したり 、または、細菌が卵殻を透過して侵入しなくても卵の細胞崩壊が生じたりする。 表７は、Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ属の線虫の卵に対するＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ− ７９９６の殺卵作用を示す。 着色した成熟嚢胞（Ｋｍ）内では大部分の卵が胚の成長を停止しており、各卵 は孵化を待つ第二齢の幼虫（Ｌ２）または休眠中の幼虫を内包している。 これに反して、空の嚢胞（Ｋｂ）は特に、胚の成長の第一段階の卵を内包して いる。 表 ７ Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ種の卵の致死率（嚢胞あたりの％）に対するＮＯＶＩ−Ｂ ＩＯＴＥＣ−７９９６の“ｉｎ ｖｉｔｒｏ”効果 ＊同じ文字を添付した数値は統計的に同等である。 処理の３週後に嚢胞内の卵の致死率を測定した。成熟嚢胞内 の致死率は、バイオ殺線虫剤によって処理しない対照嚢胞内の卵の致死率に統計 的に同等である。これに反して、空の嚢胞内の卵の致死率は顕著であり、バイオ 殺線虫剤による処理は、対照嚢胞内の僅か２０％の致死率に比べて処理嚢胞内で ９９％の致死率を誘発した。この試験によって、胚の成長中の卵に対するバイオ 殺線虫剤の好ましい効果が確認される。しかしながら、ジャガイモの２回の栽培 サイクル間に成熟嚢胞内の卵の致死率は増加を続け、これは、処理された土壌の 線虫発生率をかなり低下させる。従って、細菌に侵入された嚢胞は環境温度で多 少とも長期間保存された後では感染能力を喪失している。 ０．４５μｍの膜を用いた限外濾過によって得られた細菌培養物の純粋抽出物 は有意な殺線虫性効果及び／または殺卵作用を有していない。 細菌ＢＴＡ及びＢＳＭまたはそれらの純粋抽出物は、処理された土壌中の線虫 の幼虫孵化メカニズムに対して有意な影響を及ぼすのであろうか？ 幼虫の孵化メカニズムの撹乱に対するＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６の影 響を、Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ属の線虫を用いて試験した。この場合、幼虫の孵化は 本質的に宿主植物（ジャガ イモ）の存在に関係がある。Ｇ．ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓの嚢胞の複数の均 質ロットを菌株ＢＴＡ及びＢＳＭ並びにそれらの純粋抽出物の細菌懸濁液によっ て４８時間処理した。処理した嚢胞の孵化率を非処理の対照嚢胞の同様のロット の孵化率に比較した。菌株ＢＴＡはＧｌｏｂｏｄｅｒａの幼虫の孵化メカニズム の変化に対してより持続的な効果を有している。菌株ＢＳＭ及び２種類の菌株の 純粋抽出物は、処理卵の孵化の開始を非処理の対照卵に比較して数日間遅らせる だけである。 従って、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６の効果は、最終産物を形成する菌 株ＢＴＡとＢＳＭとの共働作用に関係がある。菌株ＢＴＡの作用が卵殻の変質及 び孵化メカニズムに対する直接効果であるとすれば、菌株ＢＳＭの作用は補完的 な殺卵作用である。 ４．４ ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６の量産及び乾燥（ｃｏｎｄｉｔｉｏ ｎｎｅｍｅｎｔ） 本発明の目的となるバイオ殺線虫剤は、可変容量の従来の発酵槽内で撹拌され る液体培地を用いて製造し得る。 ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６を大量に増殖させる液体培地は極めて単純 な培地でよく、培地１リットルあたり以下の 構成成分を含有している。 −野菜粒 ６０ｇ −炭酸カルシウム ２０ｇ −ショ糖 ３０ｇ また、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６をＣｚａｐｅｃｋ Ｄｏｘ培地のよ うな半合成液体培地を用いて製造してもよい。この培地の１リットルあたり以下 の組成を有している。 −硝酸ナトリウム ３１．２０ｇ −塩化カリウム ００．７８ｇ −グリセロリン酸マグネシウム ００．７８ｇ −硫酸第一鉄 ００．０２ｇ −硫酸カリウム ００．５５ｇ −ショ糖 ３０．００ｇ 液体培地を１１５℃のオートクレーブで２０〜３０分間処理する。完全発酵に 必要な時間は発酵槽の容量及び発酵温度に従って変化する。汚染の危険を伴うこ となく速やかな発酵が得られるようにこれらのパラメーターを計算しなければな らない。 発酵産物を液体製剤として直接使用してもよく、または、凍結乾燥後に水和剤 の形態で使用してもよい。 ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６を潅概用水に混入して施用したりまたは散 布によって施用したりする場合、このような施用を容易にするために、凍結乾燥 した有効成分に従来の保湿剤及び中性充填剤を添加する。 液体製剤は５℃〜８℃で数カ月間保存できるが、乾燥抽出物は周囲温度で１年 以上保存できる。 凍結乾燥前（または後）のＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６に、１リットル あたり５〜１０グラムのカオリンを添加し得る。これによって得られた乾燥抽出 物をパラフィン油に希釈し得る。この希釈物は周囲温度で数年間保存できる。 表 ８ １００ｍｌのＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６懸濁液の；凍結乾燥後に得 られた抽出物の量の変化 表８はカオリン非添加の１００ｍｌの細菌懸濁液の凍結乾燥後に得られたＮＯ ＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６の乾燥抽出物の量の変化を示している。 凍結乾燥したＢＴＡ及びＢＳＭの１０ｍｌの懸濁液は平均して０．５３ｇの乾 燥抽出物に相当する。 ５．種々の植物寄生線虫に対する最終産物の効果 本願発明の目的である新規な細菌複合体を、レモンに対するＴｙｌｅｎｃｈｕ ｌｕｓ ｓｅｍｉｐｅｎｅｔｒａｎｓ、ジャガイモに対するＧｌｏｂｏｄｅｒａ 種及び集約栽培作物に対するＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ種のように、経済的に重要 な作物を種々の線虫から防除するために温室内及び野外で種々の栽培条件下で試 験する。 ５．１ レモンに対するＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６の効果 Ｔ．ｓｅｍｉｐｅｎｅｔｒａｎｓが自然侵入したダイダイに接ぎ木した後生レ モンの農園でＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６の効果に関する試験を実施した 。 樹齢５年の樹木を各２ｍ３容のセメント槽に単離する。液体懸濁液の形態のＮ ＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６を１ｍ²あたり１０ｍｌの施用量で３月に施用 した。各処理を１２回繰返す。ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６の接種の７カ 月後に、処理区画及び非処理対照区画のレモンの線虫発生率及び生産量 の変化を比較する。 表９は、生物処理の１週前の後生レモンの線虫発生に関する特性値を示す。根 ２０ｇあたりの線虫発生に関する特性値を以下の基準で評価した。 卵の数（Ｗ） 幼虫の数（Ｌ２） 雌の数（Ｆ） 接種物合計（Ｗ＋Ｌ２） 孵化率％（Ｌ２／Ｗ＋Ｌ２の％） 総合的発生率（Ｉｎｆ／ｇ） 雌の生殖能力（Ｗ＋Ｌ２／Ｆ） これらの結果は、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６の施用の１週前の対照樹 木及び処理樹木の線虫発生が統計的に同等であることを示す。 表１０は、生物薬剤の施用の７カ月後のレモンの線虫発生率の変化に対するＮ ＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６処理の効果を示す。 表 ９ 生物処理の１週前のＴ．ｓｅｍｉｐｅｎｅｔｒａｎｓによるレモンの 汚染持性値 本願発明の目的であるＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６は、処理された樹木 の線虫発生率の低下に関して極めて有意な効果を示す。処理区画で観察された線 虫発生率の低下は、卵の孵化率（Ｌ２／Ｗ＋Ｌ２）の変化にも雌の生殖能力（Ｗ ＋Ｌ２／Ｆ）の変化にも関係がない。メルドラ（Ｍｅｌｄｏｌａ）ブルーで特異 的染色すると、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６で処理した区画における卵の 致死率は７３％を上回る値であるが、対照区画で採取した卵の致死率は極めて小 さい値（＜１％）であることが判明した。 表 １０ 根２０ｇあたりのレモンの害虫汚染特性値（処理７週後） 表１１は、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６で処理された樹木の反応を対照 樹木との比較によって示す。生物処理の７カ月後に各樹木を以下の項目に関して 評価した。 −苗条数／樹木（樹木１本あたりの苗条数）（Ｎ） −苗条の長さｃｍ（Ｌ） −総成長ｃｍ／樹木（樹木１本あたりの長さの成長）（ｃ．ｔ） −生産量Ｋｇ／樹木（樹木１本あたりの生産量）（Ｐ．Ｋｇ／ａ） 生物処理は、処理された後生レモンの成長反応に関しては顕著な効果を発揮し たが、この処理がレモンの生産量に対して与えた効果はあまり顕著ではなかった 。その理由は恐らく、１９９５年の実験樹木の全体に、柑橘類の葉虫Ｐｈｙｌｌ ｏｃｎｉｔｉｓ ｃｉｔｒｅｌｌａが発生しており、処理区画及び対照区画のレ モンに対する線虫の作用を隠蔽したからである。 表 １１ 処理７ヵ月後に測定したＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６の施用に対する レモンの反応 ５．２ 嚢胞をもつ線虫が発生したジャガイモに対するＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ −７９９６の効果 チュニジアでは、ジャガイモを１年に４回栽培できるが（促成栽培、特別促成 栽培、普通栽培、秋期栽培）、普通栽培の作物の生産量が最も多い。この場合、 植付け時期は１月から３月に分割され、収穫は５月に始まって７月に終わる。 ２種類のＧｌｏｂｏｄｅｒａ属（Ｇ．ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ及びｐａｌ ｌｉｄａ）が自然発生しており、Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｌｌｉｄａが優勢（ ７４．５±９．５％）であるような２種類の土壌でＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７ ９９６の効果を試験した。 約８ｋｇの各土壌を収容した大容量の鉢を用いて試験した。２種類の土壌（Ｓ Ｉ及びＳＩＩ）の線虫発生率を示す以下の特性値を表１２に示す。 −土壌１ｋｇあたりの充実嚢胞の数（Ｋ／Ｋｇ） −空洞嚢胞の数（％ Ｋｖ） −卵の自然致死率％（％ Ｍｗ） −嚢胞あたりの生存卵の数（Ｗｖ／Ｋ） −休眠卵の％（％ Ｋｄｉａ） −孵化卵の％（％ Ｋｅｃ） −土壌１ｇあたりの生存卵の数 ２種類の土壌中の線虫の初期集団（Ｐｉ）は異なっている。双方の場合に、土 壌の線虫発生率は、土壌１ｇあたり１０個の生存卵とするジャガイモ栽培の許容 限度を超過している。 表 １２ Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ種によって自然汚染された実験土壌の特性値 野菜粒の抽出物を主成分とする液体培地（参考文献８）で培養した２種類の菌 株ＢＴＡ及びＢＳＭの組合せによって得られたＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９ ６を用いて生物処理を実施 した。次に、細菌懸濁液を凍結乾燥し、周囲温度で１２カ月以上保存する。処理 に使用した最終産物は、潅漑用水１リットルあたりに５０グラムの乾燥抽出物を 懸濁させることによって得られた。２つの試験（ＥＩ及びＥＩＩ）では、凍結乾 燥したＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６を１鉢あたり１ｇの用量で施用したが 、この用量は、細菌懸濁液２０ｍｌの施用に相当する。ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ −７９９６を、一方では、１鉢あたり５ｇの用量で施用したエトプロホス（Ｍｏ ｃａｐ １０Ｇ）による化学処理（Ｍ）に比較し、他方では、非処理対照（Ｔｍ ）に比較する。エトプロホスの施用量は１ｍ２あたり１０ｇのＭｏｃａｐの施用 に相当する。農園で処理を実施し、各処理を１０回繰返す。 栽培の終了時期、即ち植付けの３カ月後に以下の項目を評価した。 −植物１本あたりの生産量Ｋｇ（Ｐ．Ｋｇ／ｐｌ） −塊茎の平均重量ｇ（Ｐ．ｇ／ｔｂ） −茎の平均長さｃｍ（Ｌ／ｔｉ） −茎／根の重量比（Ｋ／ｒａｃ） −根１０ｇあたりの嚢胞（Ｋ／ｒａｃ） −根１０ｇあたりの空の嚢胞（Ｋｂ／ｒａｃ） −根１０ｇあたりの成熟嚢胞（Ｋｍ／ｒａｃ） −空の嚢胞あたりの卵（Ｗ／Ｋｂ） −空の嚢胞あたりの生存卵（Ｗｖ／Ｋｂ） −卵の致死率（空の嚢胞）（％Ｍ Ｗ／Ｋｂ） −成熟嚢胞あたりの卵（Ｗ／Ｋｍ） −成熟嚢胞あたりの生存卵（Ｗｖ／Ｋｍ） −卵の致死率（空の嚢胞）（％Ｍ Ｗ／Ｋｍ） −根１ｇあたりの生存卵（Ｗｖ／ｇ ｒａｃ） −土壌１０ｇあたりの嚢胞（Ｋ／ｓｏｌ） −土壌中の嚢胞あたりの卵（Ｗ／Ｋｓｏｌ） −土壌中の嚢胞あたりの生存卵（Ｗｖ／Ｋｓｏｌ） −土壌中の卵の致死率（％Ｍ Ｗ／Ｋｓｏｌ） −土壌１ｇあたりの生存卵（Ｗｖ／ｇｓｏｌ） −土壌中の線虫の最終集団と初期集団との比（Ｐｆ／Ｐｉ） 表１３及び１４は、ジャガイモ（“Ｓｐｕｎｔａ”品種）の普通栽培に伴うＧ ｌｏｂｏｄｅｒａ属の線虫に対するＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６の効果を 試験した２つの試験の結果を示している。 表 １３ Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ種によって汚染されたシャガイモに対するＮＯＶＩ−ＢＩＯ ＴＥＣ−７９９６(Ｂｉｏ)の効果（試験Ｉ） 試験Ｉ及びＩＩの統計的分析は、１鉢あたり１ｇの用量の凍結乾燥ＮＯＶＩ− ＢＩＯＴＥＣ−７９９６による生物処理が１鉢あたり５ｇのＭｏｃａｐ １０Ｇ による処理に少なくとも同程度に有効であることを示す。 試験Ｉ及びＩＩにおいて、化学処理（Ｍ）及び生物処理（Ｂｉｏ）の効果は、 非処理対照（Ｔｍ）に比べてジャガイモの生産量が有意に増加することによって 示される。２種類の処理（化学処理Ｍ及び生物処理Ｂｉｏ）はＧｌｏｂｏｄｅｒ ａ属の線虫に対して異なる作用モードを有している。 本質的に植付け時期の幼虫に作用するエトプロホス（Ｍｏｃ ａｐ）は作物における線虫の発生を遅らせる。これは、処理されたジャガイモの 根系の処で幼虫間の競争が減少することによって示される。栽培終期に多少とも 顕著な根の線虫発生率の増加傾向はこの競争の減少によるものであると理解でき る。化学処理（Ｍ）後に根の嚢胞の数（Ｋ／ｒａｃ、特に成熟嚢胞の数（Ｋｍ／ ｒａｃ）が対照（Ｔｍ）に比較して増加していることは、根及び土壌から採取し た嚢胞中の卵の致死率にある程度の関係がある（％Ｍ Ｗ／Ｋｂ、％Ｍ Ｗ／Ｋ ｍ及び％Ｍ Ｗｓｏｌ）。 孵化以前の線虫の卵に対してより強力に作用するＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７ ９９６は、栽培終期には化学処理（Ｍ）の場合と同様の根系の線虫発生率の増加 傾向を示さない。 ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６による処理はエトプロホスとほぼ同等に卵 の致死率を顕著に増加させる（％Ｍ Ｗ／Ｋｂ、％Ｍ Ｗ／Ｋｍ及び％Ｍ Ｗ／ Ｋｓｏｌ）。更に、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６によって処理した土壌に 由来する嚢胞中の卵の致死率のパーセンテージはジャガイモの２回の栽培サイク ル間にかなり増加する。 表 １４ Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ種によって汚染されたジャガイモに対するＮＯＶＩ−ＢＩ ＯＴＥＣ−７９９６(Ｂｉｏ)の効果（試験ＩＩ） ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６による生物処理（Ｂｉｏ）後に測定した土 壌１ｇあたりの生存卵の数（Ｗｖ／ｇｓｏｌ）、及び、栽培サイクル中の線虫（ Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）の増殖率（Ｐｆ／Ｐｉ）は、対照（Ｔｍ）及びエトプロホ スによる化学処理（Ｍ）の双方に対応する値から統計的に異なっている。 処理土壌に由来の細菌感染嚢胞を周囲温度で３年間保存したとき、この嚢胞は 絶えず５℃の低温室に維持された嚢胞に比べて生存率を９９％以上喪失している 。 従って、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６による処理は、従来の化学処理の 逆に、生産性を有意に改善するだけでなく、土壌の線虫発生率を低下させる。即 ち、Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ種に対してこの生物薬剤を適切に使用することによって ジャガイモの各栽培サイクル後の線虫による土壌汚染の進行を防止できるので、 このような使用を総合的処理戦略の一環に加えることができる。 ５．３ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ．（ネコブセンチュウ）に感染した温 室栽培へのＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６の効果 Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ種の線虫は大食性であり、温室栽培や露地栽培の多く のの観賞植物、果樹及び野菜栽培を攻撃する。経済的に最も重要な種は、Ｍ．ｊ ａｖａｎｉｃａ（ジャワネコブセンチュウ）、Ｍ．ａｒｅｎａｒｉａ（アレナリ アネコブセンチュウ）、Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ（サツマイモネコブセンチュウ ）、Ｍ．ｈａｐｌａ（キタネコブセンチュウ）、及び特にジャガイモに有害な新 しい種であるＭ．ｃｈｉｔｗｏｏｄｉである。 Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅの経済的な重要性は栽培のシステムによって大きく異 なる。さらに、一般的にＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅによって引き起こされる被害は 、土壌外あるいは土壌中で加温する温室で行われる栽培に対して極めて大きいこ とが確認されている。 世界的な市場で市販されている線虫駆除薬の５０％以上がＭｅｌｏｉｄｏｇｙ ｎｅの駆除用であり、処理の大部分は野菜栽培に適用される。 総合処理プログラムの枠内でのＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ駆除方法の評価は、次 の判定基準を考慮に入れる： −実験区画内における最初の線虫個体群（Ｐｉ）の評価（感染の程度）。 −処理を行った栽培期間中の線虫（Ｅｃ）の評価。 −最終的な線虫個体群（Ｐｆ）の評価。 −処理を行った残存接種個体の質の検討（休眠及び羽化…の死亡率の％）。 −感染に対する栽培の反応の評価（ゴール（えい瘤）指数、生命力指数、感染し た根の％…）。 −参照処理及び処理していない対照と比べた栽培の生産性の比 較試験。 ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６を、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅｓｐｐ．の病 原性が特に高くて有害である加温温室での種々の野菜栽培の自然条件下で試験し た。これらの条件下で、チュニジアの農業経営者の私有地での温室栽培の異なる 地域において５つの試験を実施した。 ５．３．１ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅに感染した端境期のキュウリ栽培へのＮＯ ＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６の効果（試験Ｉ） 試験Ｉは、３カ月間土壌を占める、「Ｆａｋｏｕｓ：ｖｅｒｔｄ’Ａｒｍｅｎ ｉｅ（アルメニアの緑）」と呼ばれる端境期のキュウリの栽培に関して実施した 。キュウリの播種は８月の初めに実施された；この栽培は、加温温室において土 壌外で、プラスチックフィルムによって土から分離した基質上で行われた。線虫 （Ｍ．ｊａｖａｎｉｃａ）に自然感染させた濾過した砂を主成分として構成され る基質を深さ４０ｃｍの溝に入れ、ｐＨ６〜７の肥料液で定期的に灌漑した。 この試験Ｉでは、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６による処理（Ｂｉｏ）を 、処理していない対照（Ｔｍ）及び湯による物理的処理（Ｈ₂Ｏ）と比較した。 ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ− ７９９６は、液体製剤としてｍ²当り１０ｍｌの用量で使用した。播種の１ヵ月 前に、湿らせた基質に生物学的製剤を混ぜ合わせた。地熱由来の湯による土壌の 物理的処理は、土壌を４時間５２℃に保持し、２０時間以上４８〜５０℃に保持 することができた。各々の処理を８回反復した；基本的区画は各々６．５ｍ²と 測定された。 試験Ｉにおける栽培の期間中及び栽培終了時に、次の実験判定基準を評価した ： −ｍ²当りのｋｇ生産量 （Ｐ．Ｋｇ／ｍ²） −ゴール指数（０〜５） （ＩＧ） −根のグラム当りの線虫 （Ｎ／ｇ ｒａｃ） −根のグラム当りの卵 （Ｗ／ｇ ｒａｃ） −根のグラム当りの幼虫 （Ｌ２／ｇ ｒａｃ） −根の１０グラム当りの雌 （Ｆ／１０ｇ ｒａｃ） −根の１０グラム当りの雄 （Ｍ／１０ｇ ｒａｃ） −栽培中の苗木当りの線虫 （Ｐ．Ｅｃ／Ｐｌ） −根のグラム当りのバクテリオファージ （Ｂ／ｇ ｒａｃ） −雌の見かけ上の生殖能力 （Ｗ＋Ｌ２／Ｆ） −感染した根の％ （％ Ｒ ｉｎｆ） −根のグラム当りの最終的個体群 （Ｐｆ／ｇ ｒａｃ） −対数（苗木当りの最終的個体群＋１） （ｌｏｇ Ｐｆ＋１） −土壌のグラム当りの潜在的接種個体 （Ｗ／ｇ ｓｏｌ） −苗木当りのＰｆ／Ｐ．Ｅｃ比 （Ｐｆ／Ｐ．Ｅｃ） 表１５は、播種後１ヶ月目のキュウリの根の感染に対する処理の比較効果を示 す。 キュウリの播種後１ヶ月目には、湯による処理だけが栽培の感染率の明らかな 有意の低下として表れた。 表１６は、栽培終了時、すなわち播種後３ヶ月目の種々の処理の効果を示して いる。 栽培終了時に評価した結果は、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６による生物 学的処理が、湯による物理的処理と同程度に端境期のキュウリ栽培を保護し、処 理していない対照に比べてその生産量を有意に改善することを示した。 表 １５ M.javanicaのキュウリ侵入に対する処理の効果（試験Ｉ、栽培中） しかし、湯による土壌の処理と異なって、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６ による生物学的処理（Ｂｉｏ）はさらに、未処理対照と比べて根（Ｐｆ／ｇ ｒ ａｃ、Ｗ／ｇ ｒａｃ、Ｌ２／ｇ ｒａｃ、Ｆ／１０ｇ ｒａｃ、Ｍ／１０ｇ ｒａｃ及びｌｏｇ Ｐｆ＋１）及び土壌（Ｗ／ｇ ｓｏｌ）における線虫（Ｍ． ｊａｖａｎｉｃａ）個体群の極めて有意の減少に寄与した。 表 １６ M.javanicaが侵入した栽培キュウリに対するNOVI-BIOTEC-7996(Bio)の効 力（試験Ｉ、栽培終期） ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６による処理はまた、根において計数された バクテリオファージ線虫個体群（Ｂ／ｇ ｒａｃ）への有意の効果も示した。 栽培中（Ｐ．Ｅｃ）及び栽培終了時（Ｐｆ）に計数された苗木当りの線虫個体 群のレベルの比は、未処理対照区画において認められたものに比べて湯で処理し た区画では３倍高かった；この比率はＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６で処理 した区画においては１０倍低かった。 湯で処理した区画（Ｈ₂Ｏ）における栽培終了時の線虫個体群の増加は、土壌 中の線虫の敵である他の微生物へのこの物理的処理の二次的作用、及び／又は宿 主苗木の幼根系の発達と比べた感染の時間的経過のずれによって説明できる。湯 で処理した区画においては、実際に、感染した根のパーセンテージ（％Ｒ ｉｎ ｆ）が最も高かった。 播種の１ヵ月前の、ｍ²当り１０ｍｌの用量でのＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７ ９９６による土壌の処理は、従って、湯による物理的処理（Ｈ₂Ｏ）及び処理し ていない対照（Ｔｍ）と異なって、Ｍ．ｊａｖａｎｉｃａに感染した端境期のキ ュウリ栽培の生産量を有意に改善しただけでなく、土壌の感染率の有意 の低下にも寄与した。それでは、キュウリのすぐ後に同じ温室で行われたトマト 栽培へのこの効果の程度はどのようであろうか。 ５．３．２．Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅに感染したはしり（ｅｘｔｒａ−ｐｒｉｍ ｅｕｒ）のトマト栽培へのＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６の効果（試験ＩＩ ） 試験ＩＩは、試験Ｉに続いてキュウリ栽培のすぐ後に、同じ温室内ではしりの トマトに関して実施した。 従って試験ＩＩの目的は、先にキュウリを栽培したのと同じ温室において行わ れた２番目の栽培に関して、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６（Ｂｉｏ）と湯 （Ｈ₂Ｏ）による処理の遅延効果を検討することである。この試験ＩＩはまた、 ＩＮＰＩ特許願第９５ １５６８７号の対象である、補食性菌類及びその関連細 菌を主成分とする生物学的抗線虫剤（Ｃｈｐ）の効果を評価することも目的とし ている。１０月末に播種されたトマトの栽培は９ヵ月間温室を占めた。トマトは 、通常はＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅに耐性な雑種Ｆ１（ＣＥＮＣＡＲＡ）であった 。この地域では毒性病原型が頻発していたため、この耐性な栽培変種植物があた かも線虫に対して感受性のある種の ようであった。 試験は４つの処理を含み、各々を４回繰り返した。生物学的処理（Ｂｉｏ）と 物理的処理（Ｈ₂Ｏ）の遅延効果を、処理していない対照（Ｔｍ）の効果、なら びにトマト栽培の播種から１ヵ月後にｍ２当り２０ｍｌの用量で適用した第二の 生物学的処理（Ｃｈｐ）の作用と比較した。 表１７は、栽培中、すなわち播種から４ヵ月後のトマトの根の感染に対する処 理の比較効果を示している。播種から４ヶ月目に、トマトの苗木の感染率は、対 照区画（Ｔｍ）と事前に湯で処理しておいた区画（Ｈ₂Ｏ）において同等であっ た。 ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６（Ｂｉｏ）の遅延効果及び補食性菌類を主 成分とする第二の生物学的処理（Ｃｈｐ）の線虫への効果は極めて有意であった 。従って２つの生物学的処理は統計学的に同等であり、末処理対照（Ｔｍ）及び 湯による物理的処理（Ｈ₂Ｏ）とは明らかな差があった。 表 １７ M.javanicaのトマト侵入に対する処理の効果（試験II、栽培中） 表１８は、栽培終了時、すなわち播種から９ヵ月後の種々の処理の効果を示し ている。 栽培終了時に、試験Ｉで評価した事柄に加えて次の判定基準を検討した： −栽培の生命力指数（０〜４） （ＩＶ） −卵の死亡率の％ （％ Ｍ Ｗ） −幼虫の死亡率の％ （％ Ｍ Ｌ２） −胚休眠の％ （％ Ｄｉａ） −対数（生存接種個体＋１の） （ｌｏｇ Ｐｖ＋１） 播種の２ヵ月前に適用したＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６による処理は、 ２つの栽培を有効に保護することができた：端境期のキュウリ栽培とはしりのト マト栽培（表１８）。 ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６（Ｂｉｏ）で処理した区 画では、処理していない対照区画（Ｔｍ）及び事前に湯で処理した区画（Ｈ₂Ｏ ）に比べて、トマト栽培の生産量（Ｐ．Ｋｇ／ｍ²）が７５．８％増加した。 表 １８ M.javanicaか侵入した栽培トマトに対するNOVI-BIOTEC-7996(Bio)の効力 （試験II、栽培終期） トマトを直播きした一ヶ月後に捕食性菌類を主成分とする第二の生物学的処理 （Ｃｈｐ）によって、第一の処理（Ｂｉｏ）と同じ割合で、この作物の生産量を 増やすことができた。トマト栽培の生産性のこうした改善は、栽培作物の反応に よって間接的に（ＩＶ、ＩＧ及び％Ｒｉｎｆ）、あるいは宿主の根の中の線虫類 を一つ一つ数え上げることによって直接的に（Ｐｆ／ ｇ ｒａｃ、ｗ／ｇ ｒａｃ、Ｌ２／ｇ ｒａｃ、Ｆ／１０ｇｒａｃ及びＬｏｇ Ｐｆ＋１）評価された線虫個体群の著しい減少に関連している。 栽培周期中に、二種類の生物学的処理（Ｂｉｏ及びＣｈｐ）を行なうことによ って、トマトの根の中の線虫類の増殖率（Ｐｆ／Ｐ．Ｅｃ）は、処理を行ってい ない対照区画（Ｔｍ）に比べて著しく６分の１以下に減少した。それに対してこ の増殖率は、湯で予め処理された区画ではおよそ５倍であった（Ｈ₂Ｏ）。 しかしながらＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６（Ｂｉｏ）の作用形態と、捕 食性菌類を主成分とする第二の生物学的抗線虫剤（Ｃｈｐ）の作用形態は非常に 異なる。ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６（Ｂｉｏ）が、主に卵の死亡率（％ Ｍ Ｗ）に作用するのに対して、生物学的抗線虫剤（Ｃｈｐ）は主に幼虫の死 亡率（％ ＭＬＺ）を決定する。残留潜在害虫感染率（ｌｏｇ Ｐｖ＋１）は、 湯で処理された区画（Ｈ₂Ｏ）において最も高く、この区画では、休眠中の卵の パーセンテージ（％ Ｄｉａ）もまた最も高い。 根における種内栄養競争から、各処理間の雌の見かけ上の生殖能力（Ｗ＋Ｌ２ ／Ｆ）の違いを説明することができる。この 種内競争の規模は、それ自体が、処理法に応じた害虫感染の時間的経過に関連し ている。したがって、試験１１によって、特許出願ＩＮＰＩ １９９５年１２月 ２２日付第９５ １５６８７号の対象である生物学的抗線虫剤の効果を確認する ことができた。この試験によってまた、同一の土地で連続的に行われる二つの栽 培を保護することができるＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６による処理の残留 性が大きいことがわかった。 これら二つの生物学的製剤を組み合わせて散布した場合の線虫類に対する効果 はどれぐらいのものであろうか。 ５．３．３ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅがが感染した超促成栽培のピーマンの栽培 に対するＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６の効果（試験ＩＩＩ） 試験ＩＩＩは、試験ＩＩと同じ実験条件において、地上の、温室の中で栽培さ れたＭ．ｊａｖａｎｉｃａが感染した超促成栽培のピーマンに対して行われた。 ピーマン、交配種Ｆ１（“Ｂ２６”と呼ばれるＣＨＡＡＭＢＩ）は、２ヶ月間 の夏季休眠期間後、１０月の始めに直播きされた。この夏季期間中、８月と９月 に土地のソラリゼーション（Ｓ）の効果がテストされた。この物理的処理では、 土地を灌漑し、 プラスチック薄膜で覆う。土の温度は、ほとんど４８℃を超えることはない。し かし、この要因と湿度の影響が結びつくことによって、宿主がいない場合には地 中の線虫類の卵の孵化が促進される。ソラリゼーションは、このようにして段階 的に、地中の潜在的接種体を枯渇させ、その感染率を減少させる。 したがってソラリゼーションの効果が、この試験ＩＩＩにおいて、１ｍ２当り の細菌浮遊量（ＢＴＡ及びＢＳＭ）２０ｍｌの用量で使用されるＮＯＶＩ−ＢＩ ＯＴＥＣ−７９９６による生物学的処理の効果と比較される。この生物学的製剤 は、この試験では、ピーマン栽培の播種の２ヶ月後に散布された。 さらに、ソラリゼーション（Ｓ）と生物学的処理（Ｂｉｏ）を、処理を施され ていない非処理対照区画（Ｔｍ）及び、１ｍ²当り５ｍｌの用量で播種の３ヶ月 後に使用される液状エトプロフォス（ｅｔｈｏｐｒｏｐｈｏｓ）による化学的処 理と比較した。 基本区画は１３ｍ²であり、各処理は４回繰り返された。 ピーマンの栽培中と栽培終了時に評価される基準は、試験Ｉ及びＩＩの中で評 価された基準と同じである。 表１９は、栽培中、すなわちピーマンの播種から５ヶ月後の 処理の効果を比較したものである。 表 １９ ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６（Ｂｉｏ）で処理された区画においては、ピ ーマンは、対照区画（Ｔｍ）及びエトプロフォス（Ｍ）又はソラリゼーション（ Ｓ）によって処理された区画よりも線虫類の感染（Ｐ．Ｅｃ／Ｐｌ）が少ない。 一般に、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ．に対するピーマン栽培の反応は、 トマトとは異なる。この宿主植物は、トマトよりも許容性か大きく、実際に、そ の栽培周期中に新しい二次根を生やすという特性がある。この二次根は、地中の 植物寄生性微生物及び／又は植物病原性微生物のさまざまな感染によって損なわ れて行く根に、次第に代わっていく。 表２０は、栽培の終わり、すなわち播種の９ヶ月後における、線虫類が感染し たピーマンの栽培に対する各種処理の影響を表 わしている。 表 ２０ M.javanicaが侵入した栽培トウガラシに対するNOVI-BIOTEC-7996(Bio)の効力 （試験III、栽培終期） 対照区画（Ｔｍ）に対して、ＮＯＶＩ−ＢＯＴＥＣ−７９９６（Ｂｉｏ）によ る生物学的処理は、ピーマンの生産量（Ｐ．Ｋｇ／ｍ²）のおよそ４０％の改善 を示している。ピーマンの生産量に対するソラリゼーション（Ｓ）とエトプロフ ォス（Ｍ）による化学的処理の効果は、反対にそれほど大きいものではない。し たがって、栽培中に遅れて散布される液状エトプロフォスは、感染を遅らせるこ とも栽培作物を保護することもできない。 この試験（ＩＩＩ）においては、各種処理の間に認められた 違いは、試験Ｉ及びＩＩにおいて各種処理の間に認められた違いよりも複雑であ る。 栽培の終わりに評価された各基準の統計的分析（フリードマンの非パラメトリ ックテスト及びフリードマンの階数の総和に基づく平均値のさまざまな比較）は 、それぞれ処理へのピーマンの栽培の反応が異なることを示している。ＮＯＶＩ −ＢＩＯＴＥＣ−７９９６は、ソラリゼーション（Ｓ）や、化学的処理（Ｍ）や 非処理対照区画はと異なる。どの処理でも、根の感染率（Ｐｆ／ｇ ｒａｃ、ｗ ／ｇ ｒａｃ、Ｌ２／ｇ ｒａｃ、Ｆ／１０ｇ ｒａｃ）を小さくすることがで きるとはいえ、その減少の割合は、生物学的処理（Ｂｉｏ）の場合が最も大きい 。ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６の生物学的処理による効果がより大きいこ とは、この生物学的製剤が卵及び幼虫の死亡率（％ Ｍ Ｗ及び％ Ｍ Ｌ２） に対してかなり大きな効果をもつことから説明できる。植物ごとの線虫類の個体 群（ｌｏｇＰｆ＋１）及び、ピーマンの根の中のＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅｊａｖ ａｎｉｃａの増殖率（Ｐｆ／Ｆ．Ｅｃ）は、さらに、対照区画（Ｔｍ）又は処理 された区画（Ｓ及びＭ）よりＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６で処理された区 画の方が小さくなる。 ピーマンの根における種内競争がより小さいことによって、雌の生殖能力（Ｗ ＋Ｌ２／Ｆ）は、ソラリゼーション（Ｓ）及び生物学的製剤（Ｂｉｏ）によって 処理された区画の方が大きいようにみえる。しかし、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ− ７９９６によって処理された区画の地中に栽培の終わりに残された生きている潜 在的接種体（ｌｏｇ Ｐｖ＋１）は、他の処理法よりも統計的に少なくなる。さ らに、対照区画（Ｔｍ）、“ソラリゼーション処理された”区画（Ｓ）、さらに エトプロフォスによって処理された区画（Ｍ）においては、孵化していない生き ている卵のパーセンテージ（％ Ｄｉａ）は、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９ ６によって処理された区画（Ｂｉｏ）において評価された割合より大きい。 したがって、試験ＩＩＩによって、ピーマンの播種から２ヶ月後に散布ＮＯＶ Ｉ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６による処理は、地上の温室内で育てられた超促成栽 培のこの作物に対して化学的処理よりもすぐれた効果的保護が可能であることが わかった。ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６はまた、物理的（Ｓ）及び化学的 （Ｍ）処理とは反対に、地中の害虫感染率を著しく減少させるのに役立つ。 ５．３．４ Ｍｅｌｏｙｄｏｇｙｎｅによって感染された超促成栽培のメロン に対するＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６の効果（試験ＩＶ） 試験ＩＶは、試験Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩと同じ実験条件において、地上の温室内で 育てられ、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ．が感染した超促成栽培−促成栽培 メロンに対して行われた。 この栽培作物は、交配種Ｆ１“ＣＡＬＩＰＳＯ”であり、Ｆｕｓａｒｉｕｍ０ ．１及び２種さらにうどん粉病にも耐性があるが、線虫類には敏感である。この 作物の栽培はで７ヶ月間行われる。実験用の各区画で１１月に直播きされた。 試験ＩＶでは、自然にＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ属の線虫類が感染した、各々１ ３ｍ２の基本区画の中で４回処理が繰り返された。 この試験（ＩＶ）においては、栽培中（播種から２ヶ月後）に、１ｍ²当り５ ｍｌの用量で散布されるエトプロフォスによる化学的処理の作用と、メロンの直 播きから１ヶ月後に、１ｍ²当り有効物質の浮遊量１０ｍｌの用量で散布される 二種類の生物学的処理（Ｂｉｏ１及びＢｉｏ２）の作用がテストされた。 生物学的処理（Ｂｉｏ１）は、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ− ７９９６（容積の４／５）と、試験ＩＩの中で“Ｃｈｐ”と呼ばれた生物学的抗 線虫剤（容積の１／５）を組み合わせて行われる。特許出願ＩＮＰＩ第９５ １ ５６８７号の対象となっている生物学的抗線虫剤“Ｃｈｐ”は、捕食性菌類の無 性芽及びそれらに結びついた細菌の浮遊で構成される。 第二の生物学的処理（Ｂｉｏ２）は、組み合わされる第一の生物学的処理（Ｂ ｉｏ１）と同じ用量及び同じ日に、単独で散布ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９ ６に対応する。この試験（ＩＶ）においては、メロンの栽培中及び栽培の終わり における各処理の評価基準は、先の試験（試験Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）の評価基準と 同じである。 表２１は、栽培中、すなわちメロンの播種から５ヶ月後の処理の作用の比較を 表わしている。 Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ．に非常に敏感なこの栽培作物は、これら線 虫類の感染に非常に大きな反応を示している。 栽培中（すなわちメロンの播種から５ヵ月後）、“Ｃｈｐ”と呼ばれる生物学 的抗線虫剤と結びついたＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６による処理（Ｂｉｏ １）は、一方では、メロンの根における線虫類の個体群の成長（Ｎ／ｇ ｒａｃ 、Ｗ／ｇ ｒａｃ、Ｌ２／ｇ ｒａｃ、Ｆ／１０ｇ ｒａｃ、ｌｏｇ Ｐ．Ｅｃ／Ｐ１ ）に対して、もう一方では、感染に対する栽培作物の反応（ＩＶ及びＩＧ）に対 して最も著しい作用を示している。 一般に、二種類の生物学的処理（Ｂｉｏ１及びＢｉｏ２）は、化学的処理（Ｍ ）及び対照区画（Ｔｍ）と明らかに異なる。 処理法Ｂｉｏ１とＢｉｏ２との間に栽培中に認められる効果の違いは、線虫類 の幼虫と同時に卵に対して作用する、組み合わされたＢｉｏ１の殺線虫効果によ って説明される。それに対して、処理Ｂｉｏ２は、主に線虫類の卵に作用する。 雌の見かけ上の生殖能力（Ｗ＋Ｌ２／Ｆ）は、栽培中の根の感染率（Ｎ／ｇｒ ａｃ）の減少に対する処理の作用の反応によって、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７ ９９６と“Ｃｈｐ”（Ｂｉｏ１）と呼ばれる生物学的抗線虫剤の組合わせによっ て処理された区画においてより大きくなる。 表２２は、メロンの反応、さらには、栽培の終わり、すなわちメロンの播種か ら７ヶ月後の感染の変化に対する各種処理の影響を表わしている。敏感な作物（ メロン）の特定の場合においては、根の多少とも早期の損傷の後に、栽培中に評 価された根の感染率は、栽培の終わりまで減少し続ける。 Ｐ．Ｅｃ／Ｐｆの比によって、播種後５ヵ月（Ｐ．Ｅｃ）から７ヵ月（Ｐｆ） の間に見られる、メロンの根における線虫類の個体群のこの相対的減少を評価す ることができる。 表 ２１ Meloidogyneのメロン侵入に対する処理の効果（試験IV、栽培中） 栽培の終わりにおけるデータの分析（フリードマンの非パラメトリックテスト 及びフリードマンの階数の総和に基づく平均値のさまざまな比較）は、化学的処 理（Ｍ）及び二種類の生物学的処理（Ｂｉｏ１及びＢｉｏ２）が、線虫類が感染 したメロンの生産量を著しく改善できたことを表わしている。ＮＯＶＩ−ＢＩＯ ＴＥＣ−７９９６の処理（Ｂｉｏ２）によって、非処理対照区画（Ｔｍ）に対し てメロンの生産量（Ｐ．Ｋｇ／ｍ²）を４０％以上増大することが可能になった 。 表 ２２ Meloidogyneが侵入した栽培メロンに対するNOVI-BIOTEC-7996(Bio)の効力 （試験IV、栽培終期） メロン栽培の敏感さを計算に入れると、各実験区画における植物の生命力指数 （ＩＶ）は、処理がいかなるものであれ、統計的に比較可能である。虫瘤指数（ ＩＧ）及び植物ごとの感染された根のパーセンテージ（％Ｒｉｎｆ）は、反対に 、生物学的製剤によって処理された区画（Ｂｉｏ１及びＢｉｏ２）における方が 小さくなり、このことは、化学的処理（Ｍ）及び非処理対照区画（Ｔｍ）に対す る栽培作物の潜在的感染の減少におけるこれらの生物学的製剤の効果を表わして いる。 この生物学的処理（Ｂｉｏ１及びＢｉｏ２）の効果は、メロ ンの栽培作物の根の中の感染の変化（Ｐｆ／ｇ ｒａｃ、Ｗ／ｇ ｒａｃ、Ｌ２ ／ｇ ｒａｃ、Ｆ／１０ｇ ｒａｃ、ｌｏｇＰｆ＋１）を分析した後に確認され る。 これらの二種類の生物学的処理（Ｂｉｏ１及びＢｉｏ２）は、試験ＩＶにおい て、テストされた生物学的製剤によって、主にＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９ ６によって引き起こされる卵の死亡率の大きさ（％ Ｍ Ｗ）という観点から、 非処理対照区画（Ｔｍ）及びエトプロフォスによる化学的処理（Ｍ）と異なる。 地中の卵と幼虫に同時に作用する処理Ｂｉｏ１は、栽培中に線虫類の増殖率を 著しく減少させた（表２１：Ｎ／ｇ ｒａｃ及びｌｏｇ Ｐ．Ｅｃ／ＰＬ）。Ｎ ＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６による生物学的処理（Ｂｉｏ２）は、メロンの 栽培を効果的に保護しながらも、非処理対照区画（Ｔｍ）に対して１５０倍もの 割合で、植物ごとの潜在的接種体を減少させることができた。 実際に、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６による生物学的処理は、根におい て評価された最も少ない線虫類の生きている接種体に対応する（ｌｏｇ Ｐｖ＋ １）。Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ が感染したメロンの栽培作物に対して行われた試験ＩＶは、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴ ＥＣ−７９９６による生物学的処理の効果を明白に表わしている。この試験は、 ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６と、特許出願ＩＮＰＩ第９５ １５６８７号 の対象である“Ｃｈｐ”と呼ばれる生物学的抗線虫剤との組合わせの有益な作用 は、単独で使用されるＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６の作用よりも統計的に 大きくないことを表わしている。 二つの生物学的抗線虫剤の組合わせにおいては、同一の実験区画に同時に使用 されたＮＯＶＴ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６の細菌の株と殺線虫生物学的製剤“Ｃ ｈｐ”の細菌株との間に、まるで競争及び／又は特定の拮抗作用があるかのよう にすべてが進行する。 したがって、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６のみの単独使用による処理は 、栽培の終わりに地中及び根の感染率の目覚しい減少を保証しながら、Ｍｅｌｏ ｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ．に感染された栽培作物を保護することができる。 ５．３．５ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅが感染した超促成栽培トマトに対するＮＯ ＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６の効果（試験Ｖ） ７ヶ月間行われるトマト（交配種Ｆ１、ＥＬＥＮＡ Ｆ２２４）の栽培に対し て試験Ｖが行われた。この作物の植え付けは、線虫類（主にＭ．ｊａｖａｎｉｃ ａ）が多量に感染した、温室下の重い土（１５％以上が粘土）の中に、１０月に 行われた。 この栽培品種（ＥＬＥＮＡ）は、通常、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅに対して耐性 があるが、この土の中におけるウィルス性の病気の頻度は耐性障害を回避するこ とができることから、この交配種Ｆ１は、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ、に する敏感な変種として作用するといえる。 試験Ｖの目的は、作物が地上に植えられていた試験Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶと は反対に、完全に地中で成長するＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅが感染したトマトの栽 培作物に対するＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６の効果を確認することにある 。 試験Ｖは、このようにして、非処理対照区画（Ｔｍ）と比較される三種類の処 理を対象としている。すなわち： −栽培中に、すなわち１ｍ²当り５ｍｌの用量で植付けの３ヶ月後に使用され るエトプロフォスによる化学的処理（ｍ）。 −地熱のエネルギーを利用して、８月の予備植付け時に使用される物理的処理 （Ｈ２Ｏ）。こうして、土は湯で処理され、 １２時間以上もの間５０℃の温度に達した。 −植付けの２ヶ月後に１ｍ²当り１０ｍｌの用量で使用されるＮＯＶＩ−ＢＩ ＯＴＥＣ−７９９６による生物学的処理（Ｂｉｏ）。 したがって、民間の農家で行われた試験Ｖでは、自然にＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎ ｅが感染した、各々１３ｍ２の基本区画において、４種類の処理が４回繰り返さ れた。 表２３は、栽培中、トマトの作物の植付けから３ヶ月後に各種の処理の影響の 比較したものである。 表 ２３ Meloidogyneによる栽培トマトへの侵入に対する処理の効果（試験Ｖ、栽培中） 植付けから３ヶ月後、湯による処理（Ｈ２Ｏ）のみが、トマトの根の感染率の 著しい減少を示している。生物学的処理（Ｂｉｏ）は、この時点では、非処理対 照区画（Ｔｍ）とは違いがない。 表２４は、温室下の自然にＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ．が感染した地中 におけるトマトの栽培に対して、試験Ｖの栽培の終わりに、評価されたデータの 統計的分析後の結果（フリードマンの非パラメトリックテスト）を示している。 表 ２４ M.javanicaが侵入した栽培トマトに対するNOVI-BIOTEC-7996(Bjo)の効力 （試験Ｖ、栽培終期） １ｍ²当りの生産量（Ｐ．Ｋｇ／ｍ²）、植物の生命力指数（ＩＶ）、虫瘤指数 （ＩＧ）さらに感染された根のパーセンテージ（％ Ｒｉｎｆ）は、ＮＯＶＩ− ＢＩＯＴＥＣ−７９９６による生物学的処理によって、生産量を１５％以上改善 しながらトマトの栽培の効果的な保護が行われたことを示している。 非処理対照区画（Ｔｍ）に比べてトマトの生産量を改善することができるよう になるわけではないが、物理的処理（Ｈ₂Ｏ）及び化学的処理（Ｍ）は、根の感 染率（Ｐｆ／ｇ ｒａｃ、Ｗ／ｇ ｒａｃ、Ｆ／ｇ ｒａｃ、ｌｏｇ Ｐｆ＋１ ）を減少させることができた。とはいえ、この減少率は、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥ Ｃ−７９９６（Ｂｉｏ）によって処理された区画においてははるかに大きくなる 。卵の死亡率のパーセンテージ（％ ＭＷ）は、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９ ９６（Ｂｉｏ）によって処理された区画において最も高くなる。しかしながら、 幼虫の死亡率（％ Ｍ Ｌ２）は、エトプロフォスによって処理された区画の方 が大きい。 そのことから、休眠中と呼ばれる孵化してない生きている卵のパーセンテージ （％ Ｄｉａ）は、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６（Ｂｉｏ）において処理 される基本区画において、より小さくなる。 雌の見かけ上の生殖能力（Ｗ＋Ｌ２／Ｆ）が最も低いのは、この試験において は、生物学的処理（Ｂｉｏ）の場合である。このことから、トマトの栽培の終わ りにおいて、根の中に残された生きている接種体（ｌｏｇ Ｐｖ＋１）は、ＮＯ ＶＩ−Ｂ ＩＯＴＥＣ−７９９６によって処理された区画において統計的に最も低い。実際 に、この生きている接種体は、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６によって処理 された区画における最終的個体群の１９％に過ぎない。それに対して、対照区画 （Ｔｍ）、湯による処理区画（Ｈ２０）及びエトプロフォス処理区画（Ｍ）にお いてはそれぞれ、３０％、４７％、３３％であった。 したがって、試験Ｖはもう一度、自然にＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅが感染した地 中で直接行われる温室下栽培の保護におけるＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６ の効果のみならず、物理的及び化学的処理とは反対に、栽培の終わりに根の感染 率を大幅に減少させることを明らかに示している。 畑の真ん中で、１０年間以上“生体外”実験を行ったが、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴ ＥＣ−７９９６の組成に帰される細菌の殺卵作用に対する自然の抵抗及び／又は 誘発された抵抗はまったく見られなかった。 したがって、ＮＯＶＩ−ＢＩＯＴＥＣ−７９９６は、さまざまな線虫類の群に 対する一貫した退治計画に完璧に適合する安定効果を有する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ブシール，モアメド・ムルデイ チユニジア国、1082・チユニス―マーラジ エーヌ、アブニユ・シヤルル・ニコール、 43

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 土壌中の各種寄生性線虫およびバクテリオファージの保存期に対して作用 する相乗性殺卵活性を示す生の生物殺線虫剤（NOVI-BIOTECH-7996）であって、 少なくとも２種の適合性細菌株すなわち「ＢＴＡ」および「ＢＳＭ」からなるこ とを特徴とする生物殺線虫剤。 ２． 菌株「ＢＴＡ」および「ＢＳＭ」がそれぞれBacillus thuringiensisおよ びBacillus sphaericusから選択される、請求項１記載の生物殺線虫剤。 ３． 菌株「ＢＴＡ」が、その組成物中で本質的に線虫の卵の殻の分解に作用す るようになり、その結果幼虫の孵化を妨げ、卵の生存力に影響を及ぼす、請求項 ２記載の生物殺線虫剤。 ４． 菌株「ＢＳＭ」がその組成物中で本質的に線虫の卵の内部の胚期の死亡率 に作用するようになり、その作用が「ＢＴＡ」の存在下で助長され増幅される、 請求項２記載の生物殺線虫剤。 ５． 好ましくは、２０〜５０p.100の「ＢＴＡ」および５０〜８０p.100の「Ｂ ＳＭ」からなる、請求項１〜４のいずれかに記載の生物殺線虫剤。 ６． 容量のかなり大きい発酵器において好ましくは単純液体倍地中で増殖させ ることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の生物殺線虫剤の製造。 ７． （i）Cicer arietinum(Legumineuse)の抽出物と蔗糖を主体とする攪拌液 体倍地中で大量に産生させ、 （ii）得られた細菌懸濁液を、界面活性剤および中性支持体を添加する前ま たは後に凍結乾燥させ、 （iii）抽出物をパラフィン油中に貯蔵する ことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の生物殺線虫剤を製造する請 求項６記載の方法。 ８． 攪拌液体倍地での培養温度が８〜４８℃、好ましくは２０〜３０℃であり 、ｐＨが６〜８、好ましくは６．０〜７．５である、請求項７記載の製造。 ９． 液体培養におけるバイオマスにより、凍結乾燥後乾燥抽出物が少なくとも ０．５p.100得られることを特徴とする、請求項６〜８のいずれかに記載の方法 。 １０． 施用量が細菌懸濁液（または乾燥抽出物の形態の等価物）１０〜２０ｍ ｌであり、最終製品を処理した土壌の汚染の程度に応じて栽培前または栽培中に 施用することを特徴 とする、請求項１〜５のいずれかに記載の生物殺線虫剤の施用方法。