JP2000511404A

JP2000511404A - 神経精神、免疫又は内分泌障害を治療するための７α置換ステロイドの使用

Info

Publication number: JP2000511404A
Application number: JP09535961A
Authority: JP
Inventors: レーズ，リチヤード; ローズ，ケニース・アンドリユー; セツクル，ジヨナサン・ロバート; ベスト，ルース; ヤウ，ジヨイス・ライ・ワー; レツキー，キヤロライン・マツケンジー
Original assignee: ビー・テイー・ジー・インターナシヨナル・リミテツド
Priority date: 1996-04-09
Filing date: 1997-04-04
Publication date: 2000-09-05
Also published as: AU716503B2; ATE363908T1; NZ331975A; AU2302197A; EP0954317A2; DE69737791D1; WO1997037664A3; WO1997037664A2; CA2250874A1; EP0954317B1; US6420353B1

Abstract

(57)【要約】神経精神、免疫及び／又は内分泌障害の治療用又は認識増進の誘発用医薬組成物の製造における、コレステロール、アンドロステロン、プレグネノロンもしくはエストラジオールの炭素骨格をもつ７α−ヒドロキシもしくは７−オキソ置換３β−ヒドロキシステロイド又は７位及び３位の一方もしくは両方をエステルもしくはエーテル基で独立して置換したその類似体の使用を提供する。前記ステロイドの製造におけるＣｙｐ７ｂ酵素の使用と、種々の新規ステロイド並びに前記障害の診断用試験キット及び試験方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】神経精神、免疫又は内分泌障害を治療するための７α置換ステロイドの使用本発明は７α−ヒドロキシ置換ステロイドの新規使用、前記ステロイドの製造方法及びこうして製造された新規ステロイドに関する。特に本発明は、所定の３β−ＯＨステロイドの７α−ヒドロキシル化により７ α−ヒドロキシ置換ステロイドを製造するための、シトクロムＰ４５０ファミリーのＣｙｂ７ｂと呼ばれるシトクロムの使用に関する。こうして製造された７α −ヒドロキシ置換ステロイドの所定のもの及び対応する７−オキソ誘導体は新規であり、本発明の別の側面を構成する。本発明はこれらのステロイドの使用、Ｃｙｂ７ｂ酵素の使用及びＣｙｂ７ｂ酵素に生物学的に関連する新規高分子種（例えば抗体及びＤＮＡ）の使用にも関する。シトクロムＰ４５０は特にステロイドだけでなく脂肪酸や生体異物の種々の酸化変換を触媒する多様な群のヘム含有モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰと言う；Ｎｅｌｓｏｎら，ＤＮＡＣｅｌｌＢｉｏｌ．（１９９３）１２，１−５１参照）である。ＣＹＰは精巣、卵巣、胎盤、副腎及び肝臓で最も多量に発現されるが、脳もＣＹＰ発現部位であることが明らかになっている。数種のＣＹＰ活性又はｍＲＮＡが神経系で報告されているが、これらは主に脂肪酸と生体異物を代謝する型である（サブクラスＣＹＰ２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ及び４）。他方、初代ラット脳由来グリア細胞はプレグネノロン及びプロゲステロンをｉｎｖｉｔｒｏ合成する能力をもつ。ＭｅｌｌｏｎとＤｅｓｃｈｅｐｐｅｒ，ＢｒａｉｎＲｅｓ．（１９９３），６２９，２８３−２９２（９）は主要ステロイド合成酵素ＣＹＰ１１Ａ１（ｓｃｃ）及びＣＹＰ１１Ｂ１（１１β）が脳に存在することを分子レベルで証明したが、ＣＹＰ１７（ｃ１７）又はＣＹＰ１１Ｂ２（ＡＳ）を検出するには至らなかった。ＣＹＰ２１Ａ１（ｃ２１）活性が脳に存在することは報告されているが、確実なＣＹＰ２１Ａ１転写産物はこの組織で検出されていない。副腎及び脳由来ステロイド（ニューロステロイド）が認識機能及びシナプス可塑性を調節できるという知見に伴い、脳におけるステロイド代謝に関心が高まっている。例えば、脳に由来するプレグネノロンはマウスで記憶増進効果をもつことが報告されている。しかし、脳におけるステロイド代謝ＣＹＰの完全なスペクトル及びそのｉｎｖｉｖｏ代謝産物の生物学的役割は立証されていない。脳機能の多くの面がステロイドにより調節される。海馬（１）は記憶形成の特定面で主要な役割を果たす脳領域であり、アルツハイマー病（ＡＤ）における機能不全及び損傷の初期主標的であるが、グルココルチコイド（コルチゾール、コルチコステロン）の細胞内レセプターは、この海馬で特に多量に発現される。グルココルチコイドは学習及び記憶、気分及び神経内分泌制御を調節するが、慢性的なグルココルチコイド過剰は特に海馬におけるニューロン活性、シナプス可塑性及び場合によっては生存を脅かす。これらの知見により、グルココルチコイドに媒介される神経毒性が、血漿コルチゾール濃度の顕著な上昇を伴うＡＤ等の所定の年齢関連脳障害に関与していると考えられるようになった（２）。逆に、ヒト副腎皮質の最大ステロイド産物であるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）は加齢脳障害を防ぐことが報告されている（３）。血漿ＤＨＥＡ濃度は認識機能の低下に相関する顕著な年齢関連低下を示すことが多い（４）。齧歯類の大脳辺縁構造にＤＨＥＡ又はその硫酸塩を注射すると、訓練後の記憶が改善され、シナプス可塑性が増す（５）。従って、ＤＨＥＡとグルココルチコイドは記憶機能及びシナプス可塑性に逆の効果があると思われ、ＤＨＥＡは内因性「抗グルココルチコイド」であると主張されている。しかし、この主張を裏付ける夥しい状況証拠にも拘わらず、ニューロンにおけるＤＨＥＡ及びグルココルチコイドシグナル伝達経路の直接相互作用を立証する証拠は全くない。ニューロステロイド合成は分離したラット網膜（８）及び脳（９）で報告されている。コレステロールからのプレグネノロン及びＤＨＥＡの生成以外に、２０ α−デヒドロプレグネノロン、プレグネノロン及びＤＨＥＡの７α−ヒドロキシ誘導体、プロゲステロン、並びに３α−及び３β−ヒドロキシ−５α−プレグナン−２０−オン（参考資料７参照）を含む種々の新規ステロイドが脳抽出物又は培養脳細胞で生成されている。アンドロゲンも特にアロマターゼ及び５α−レダクターゼの作用により修飾される（参考資料１０参照）。しかし、中枢神経系で上記及び他の変換に関与する特定酵素は明確に特性決定されていない。上述のように、中枢神経系には数種のＣｙｐが存在する（１１〜２２）。Ｃｙｐ１９（アロマターゼ）以外に主要ステロイド合成酵素（２３〜２５）に対応する活性又はｍＲＮＡが検出されている。更に、非Ｃｙｐヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＨＳＤ）である３α−ＨＳＤ、３β−ＨＳＤ及び１１β−ＨＳＤをコードするｍＲＮＡが中枢神経系で報告されている（２５，２７〜２９）。脳機能の調節を究明するために、同時係属国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ９５／０２４６５号（国際公開第ＷＯ９６／１２８１０号）及びＳｔａｐｌｅｔｏｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２９７３９−１９９５，１９９５年１２月１５日）に報告されている研究は、学習及び記憶に重要な脳領域である海馬に焦点を当てている。国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ９５／０２４６５号明細書のコピーは本願に関して提出した優先権書類に添付した。この同時係属出願第ＰＣＴ／ＧＢ９５／０２４６５号はＨｃｔ−１と呼ばれる新規シトクロムＰ４５０タンパク質を明細書及び請求の範囲に記載している。これらのＨＣｔ−１タンパク質はＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎＳｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０ＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによりＣｙｐ７ｂと命名されているので、本明細書ではＣｙｐ７ｂの名称を使用する。Ｃｙｐ７ｂ酵素は肝コレステロール７α−ヒドロキシラーゼ（Ｃｙｐ７ａ）と３９％の配列相同度をもち、他のステロイド合成Ｃｙｐとはこれよりも低いが有意相同度をもつ。これらの酵素の多くに存在すると推定されるステロイド合成領域（３０，３１）がＣｙｐ７ａとＣｙｐ７ｂの両者に存在する。肝特異的であるＣｙｐ７ａとは異なり、Ｃｙｐ７ｂｍＲＮＡは主に齧歯類脳、特に海馬で発現される（３１〜３３及びＥＰ０６４８８４０Ａ２）。本発明者らは今回Ｃｙｐ７ｂの基質特異性を検討し、Ｃｙｐ７ｂがステロイド基質、特に３β−ヒドロキシステロイドの７α位へのヒドロキシル基の導入を触媒することを知見した。従って、シトクロムＣｙｐ７ｂは７α特異性をもつステロイドヒドロキシラーゼ酵素である。７αヒドロキシル化ステロイドは（薬剤自体として又は中間体としての）医薬の製造や、異常レベルの内因性酵素、基質又は産物の存在に関連する疾病状態の試験キット及びアッセイの製造で特に有用であるので、このようなステロイドを製造できることは商業的に非常に重要である。以下の文中ではデヒドロエピアンドロステロンを表すために略称「ＤＨＥＡ」を使用し、従って、７α−ヒドロキシＤＨＥＡとは７α−ヒドロキシデヒドロエピアンドロステロンを意味する。本発明者らはＣｙｐ７ｂに関連する基質／産物対、特にＤＨＥＡ／７α−ヒドロキシＤＨＥＡ（７−ＨＤ）、プレグネノロン／７α−ヒドロキシプレグネノロン（７−ＨＰ）及びβ−エストラジオール／７α−ヒドロキシ−β−エストラジオール（７−ＨＥ）を同定した。本発明者らは更に、脳組織中のＤＨＥＡ濃度が年齢と共に低下するが、他の脳ステロイド濃度はそうではないこと、また、加齢プロセスが所定のステロイドの欠損と更にはＣｙｐ７ｂ自体の濃度の欠損にも関係があるらしいことを確認した。更に、Ｃｙｐ７ｂに媒介される反応により生産される産物の１種である７α−ヒドロキシデヒドロエピアンドロステロンは免疫系の作用に重要な役割を果たすと考えられる。７α−ヒドロキシＤＨＥＡは実質的に脳でしか生産されないと考えられるので、本発明者らは老化が脳で生産される７α−ヒドロキシＤＨＥＡと脳に存在する他のステロイド（例えばＤＨＥＡ、プレグネノロン及び７α−ヒドロキシプレグネノロン）の欠損に起因すると仮定する。本発明者らは更に、本発明により提供される７α−ヒドロキシ置換ステロイドと場合によりその７−オキソ置換ステロイド誘導体の特異的性質の１つが、レセプターレベルであるか否かに拘わらず、グルココルチコイド及び／又はミネラルコルチコイド拮抗作用の特異的性質であることも今回決定した。これは、下記実施例５に７α−ヒドロキシＤＨＥＡについて具体的に実証するが、より一般に適用できる。従って、この活性は、本発明の新規ステロイドの他の用途を与えるだけでなく、本発明方法により利用可能になった公知７α−ヒドロキシ又は７−オキソステロイドをグルココルチコイド及び／又はミネラルコルチコイドアンタゴニストとして使用する第１及び第２の医療用途好ましくは例えばＣＮＳ等のニューロン組織での特異的な拮抗作用におけるそれらの用途も提供する。従って、この活性と特に脳での内因性代謝経路におけるその関与を考慮すると、本発明により提供される新規化合物を含むＣｙｐ７ｂ酵素活性の使用により提供される７α−ヒドロキシ置換３β−ヒドロキシステロイドとその７−オキソ誘導体は、神経精神、免疫及び内分泌障害、これに限定するものでないが、特にステロイド関連障害の治療に有用である。本発明の第１の側面によると、これらの障害の治療及びこのような治療のための医薬の製造における、好ましくはコレステロール、アンドロステロン、プレグネノロンもしくはエストラジオールの炭素骨格をもつこれらの７α−ヒドロキシもしくは７−オキソ置換３β−ヒドロキシステロイド又は７位及び３位の一方もしくは両方をエステルもしくはエーテル基で独立して置換したその誘導体の使用が提供される。特に好ましい誘導体は、エステル及び／又はエーテル基の一方又は両方が対応するヒドロキシ化合物を生産するためにｉｎｖｉｖｏ代謝可能な誘導体である。好ましい誘導体としては、ステロイドが３β置換基−ＯＲ₁及び／又は７α置換基−ＯＲ₂をもつ誘導体が挙げられ、ここで−ＯＲ₁及び−ＯＲ₂は各々独立して遊離ヒドロキシ、エステル又はエーテル基を表し、Ｒ₁及びＲ₂の各々は独立して水素、置換又は非置換Ｃ_1-6アルキル基、Ｒ₅ＣＯ−基（式中、Ｒ₅は置換又は非置換Ｃ_1-6アルキル基から選択することができる）及び式−ＯＰ（ＯＨ）₃の基から構成される群から選択され、全置換基はＯＨ、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）アミノ、Ｃ_1-6アルキルアミノ、Ｃ_1-6ジアルキルアミノ、ＣＯＯＨ又はＣＯＯＲ₄から選択され、Ｒ₄はＣ_1-6アルキル基を表し、化合物は遊離形態でもよいし、薬理的に許容可能なアニオンをもつ酸付加塩の形態でもよい。前記使用が有効な特定障害としては、（ａ）加齢における認識欠損、（ｂ）アルツハイマー病、（ｃ）加齢における免疫系欠損、（ｄ）ＨＩＶ感染における免疫機能の欠損、（ｅ）グルココルチコイド又はミネラルコルチコイド過剰、（ｆ）糖尿病、（ｇ）鬱病、（ｈ）骨粗鬆症及び高カルシウム血症、（ｉ）高血糖症及び高脂血症、（ｊ）筋萎縮症、（ｋ）動脈硬化症、（ｌ）ステロイド糖尿病が挙げられる。更に、これらの７α−ヒドロキシステロイド、そのエステル、エーテル及び７ −オキソ誘導体は正常個体で認識増進を誘発するためにも使用できる。このような使用に好ましいステロイドはアンドロステロン、プレグネノロン又はエストラジオールの炭素骨格をもち、特に好ましい例は７α−ヒドロキシＤＨＥＡと７α−ヒドロキシプレグネノロンである。従って、本発明は上記用途における後記式Ｉａ及びＩｂの新規化合物の使用も提供する。これらの７α置換ステロイドの拮抗性に特に好ましい使用としては、上記分類（ｅ）に該当する障害又は過剰に関係なくこのようなコルチコイドの作用の逆転を必要とする障害の治療が挙げられる。本発明の第２の側面によると、このような使用を実現する医薬組成物が提供される。本発明の新規ステロイド及び公知ステロイドを使用する組成物は当業者に自明であり、一般に医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤と共にステロイド活性成分を含み、例えば吸入や、胃腸（例えば経口）、非経口、局所、経皮又は経粘膜投与に利用できるように調剤される。本発明の化合物自体を投与する代わりに、本発明の第３の側面によると、Ｃｙｐ７ｂ酵素の欠損を補償するために遺伝子治療でＣｙｐ７ｂ遺伝子の遺伝子配列を使用できる。このような治療では、Ｃｙｐ７ｂをコードする配列を含む構築物をアデノウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス及びリポソーム等の慣用送達系にパッケージングし、選択組織、特に脳に優先的にターゲティングするような経路で投与することができる。本発明によると、他の目的でＣｙｐ７ｂ配列の内因性発現を達成するため、例えば免疫原プロセスを促進するために遺伝子治療でＣｙｐ７ｂ遺伝子の遺伝子配列を使用することも可能になる。例えば、適切に改変したワクシニアウイルス（又はその変異体）等のベクターをワクチン製剤と同時投与すると、発現されるＣｙｐ７ｂ配列はワクチンの免疫原性を増加することができる。Ｃｙｐ７ｂ低下を伴う障害以外のＣｙｐ７ｂ関連障害の場合には、例え、ばＣｙｐ７ｂ発現を阻害するのに有効なＣｙｐ７ｂのアンチセンス配列を含むベクターを使用するのが望ましいことが理解されよう。Ｃｙｐ７ｂ酵素に免疫学的に関連する高分子は本発明の第４及び第５の側面を構成し、この点では抗体、特にＣｙｐ７ｂに選択的に結合することが可能なモノクローナル抗体は上記障害（ａ）〜（ｌ）の診断に有用である。抗Ｃｙｐ７ｂ抗体（モノクローナル抗体を含む）及び抗体フラグメントを含む結合分子は公知方法により製造し、Ｃｙｐ７ｂ酵素アッセイ用試験キットで使用することができる。本発明の第６の側面によると、７α−ヒドロキシ置換ステロイドの製造方法が提供され、該方法は、７位にヒドロキシル置換基をもたない対応するステロイド基質をＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼ酵素の存在下にヒドロキシル化することを特徴とする。本発明の方法で使用するＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼ酵素は上記国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ９５／０２４６５号明細書及び請求の範囲に（Ｈｅｔ −１として）記載されているＣｙｐ７ｂ酵素が好ましい。このような酵素は、（ａ）マウス、ラット及びヒトＣｙｐ７ｂについて特定されている詳細なアミノ酸配列をもつ酵素、（ｂ）他の種からの相同酵素、並びに（ｃ）定義（ａ）及び（ｂ）に含まれる酵素の配列とは異なるが、７α−ヒドロキシル基の導入を触媒する能力が除去されていないアミノ酸配列をもつ酵素を含む。適切なＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼ酵素のアミノ酸配列は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ９５／０２４６５号に開示されているＤＮＡコーディング配列により定義することができる。従って、Ｃｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼ酵素は、（ａ）配列番号１に示すラットＣｙｐ７ｂのコーディング配列を含むＤＮＡ分子のコーディング配列、（ｂ）配列番号２に示すマウスＣｙｐ７ｂのコーディング配列を含むＤＮＡ分子のコーディング配列、（ｃ）６５℃で２×ＳＳＣとして定義される標準ハイブリダイゼーション条件下で（ａ）又は（ｂ）に定義したＤＮＡ分子とハイブリダイズすることが可能なＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ分子、（ｄ）５５℃で６×ＳＳＣとして定義される低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に定義したＤＮＡ分子とハイブリダイズすることが可能なＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ分子から選択されるＣｙｐ７ｂ酵素のＤＮＡコーディング配列によりコードされる配列をもち得る。上記配列（ａ）及び（ｂ）はラット及びマウスＨｃｔ−１遺伝子配列に相当する。他の脊椎動物種、特に哺乳動物種（ヒトを含む）からの相同配列は（ｃ）又は（ｄ）に記載したＤＮＡ分子分類に該当する。従って、ヒトＣｙｐ７ｂでは、ステロイドヒドロキシラーゼ酵素は、（ｅ）（ｉ）配列番号３で「エキソン３」と呼ぶ配列、（ｉｉ）配列番号３で「エキソン４」と呼ぶ配列から選択されるＤＮＡコーディング配列、（ｆ）６５℃で２×ＳＳＣとして定義される標準ハイブリダイゼーション条件下で（ｅ）に定義したＤＮＡ分子とハイブリダイズすることが可能なＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ分子、（ｇ）５５℃で６×ＳＳＣとして定義される低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で（ｅ）又は（ｆ）に定義したＤＮＡ分子とハイブリダイズすることが可能なＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ分子、（ｈ）（ｉ）配列番号３で「エキソン３」と呼ぶ配列、（ｉｉ）配列番号３で「エキソン４」と呼ぶ配列から選択される配列の連続対を含むＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ分子、（ｉ）６５℃で２×ＳＳＣとして定義される標準ハイブリダイゼーション条件下で（ｈ）に定義したＤＮＡ分子とハイブリダイズすることが可能なＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼをコードるすＤＮＡ分子、（ｊ）５５℃で６×ＳＳＣとして定義される低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で（ｈ）又は（ｉ）に定義したＤＮＡ分子とハイブリダイズすることが可能なＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ分子、（ｋ）配列番号３の「エキソン３」及び「エキソン４」配列から構成される連続コーディング配列を含むＤＮＡ分子のコーディングＤＮＡ配列、（ｌ）６５℃で２×ＳＳＣとして定義される標準ハイブリダイゼーション条件下で（ｋ）に定義したＤＮＡ分子とハイブリダイズすることが可能なＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ分子、（ｍ）５５℃で６×ＳＳＣとして定義される低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で（ｋ）又は（ｌ）に定義したＤＮＡ分子とハイブリダイズすることが可能なＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ分子によりコードされる配列を含み得る。上記ＤＮＡ配列はゲノムＤＮＡから構成されるか又はゲノムＤＮＡに由来するものでもよいが、一般にはｃＤＮＡから構成されるか又はｃＤＮＡに由来することが理解されよう。このような配列は国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ９５／０２４６５号の発明により提供される配列に基づくハイブリダイゼーションプローブを使用して適当なライブラリー（ｃＤＮＡ又はゲノム）をプローブすることにより得られ、あるいは化学的合成又はサブ配列の連結により作製することもできる。上記定義では、Ｃｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼをＤＮＡ配列情報により定義した。本発明の方法により使用するＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼ酵素は上記定義の代わりに又は上記定義に加えてアミノ酸配列情報により定義することもでき、例えば配列番号４、５又は６に含まれるアミノ酸配列により定義することができる。従って、本発明の方法により使用するＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼ酵素は上記配列の１種に厳密に一致する配列をもつものでもよいし、あるいは使用する酵素は７α−ヒドロキシル基の導入を触媒する能力が除去されないという条件で上記配列とは異なる配列をもつものでもよい。例えば、公知方法（例えば部位特異的突然変異誘発又は他のＰＣＲに基づく方法）により突然変異酵素を作製し、本明細書に記載する手順に従って選択基質への７α−ヒドロキシル基の導入を触媒する能力について発現産物を試験してもよい。ラット、マウス及びヒト酵素間の相同度と、ヒドロキシラーゼ酵素の種相違に関する公知データを考慮すると、配列番号１、２及び３のＤＮＡ配列と比較したとき、突然変異酵素は５０連続ヌクレオチド長にわたって前記配列と少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは少なくとも７０％の相同度をもつ配列によりコードされることが好ましい。好ましくは、突然変異酵素はコーディング配列全体と少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％の相同度をもつ配列によりコードされる。あるいは、配列番号４、５及び６のアミノ酸配列と比較したとき、突然変異酵素は３０連続アミノ酸長にわたって前記配列と少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは少なくとも７０％の相同度をもつことが好ましい。好ましくは、突然変異酵素は各場合にアミノ酸配列全体と少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％以上の相同度をもつ。他方、このような突然変異酵素は上記配列と徹底的に相違しないことが好ましく、この点ではアミノ酸置換を行う場合には置換するアミノ酸は所謂「同義」又は「保存」置換であることが好ましく、即ち親水性、疎水性、塩基性及び酸性アミノ酸を同種のアミノ酸で置換することが好ましい（米国特許第５３８０７１２号参照）。より具体的には、突然変異酵素と本明細書に記載する厳密な配列との相違は２０以下、より好ましくは１０以下、最も好ましくは５以下のアミノ酸置換、挿入又は欠失であることが好ましい。本明細書に記載するＣｙｐ７ｂ酵素は毒物学及び薬剤評価試験で使用することができ、このような使用は本発明の別の側面を構成する。本発明のこの側面の特に好ましい態様では、Ｃｙｐ７ｂ酵素を発現することが可能な細胞系を１種以上のＣｙｐ７ｂ基質のアッセイの基礎として使用する。このような細胞系は毒物学及び薬剤評価試験で有用である。最も好ましくは、細胞系はＣｙｐ７ｂ酵素を発現するように人工的に形質転換した原核又は真核細胞系を含む。例えば細菌、酵母及び哺乳動物細胞が挙げられる。少なくとも１種の組織（特に非脳組織）がＣｙｐ７ｂ酵素を発現するトランスジェニック動物でもよい。このようなトランスジェニック動物は外来コーディング配列を体細胞又は生殖系細胞に導入するための公知方法により作製することができる。本発明の方法で使用する基質は、３β−ヒドロキシル基をもち、更に好ましくはコレステロール、アンドロステロン、プレグネノロン又はエストラジオールの炭素骨格をもつことを特徴とし、但し基質がコレステロールの炭素骨格をもつ場合には、基質は２５、２６又は２７位、好ましくは２５位にヒドロキシル基をもつ。このような基質の例としては２５−ヒドロキシコレステロール、デヒドロエピアンドロステロン、プレグネノロン及びエストラジオールが挙げられ、その場合に生産されるステロイドは夫々７α−ヒドロキシ−２５−ヒドロキシコレステロール、７α−ヒドロキシデヒドロエピアンドロステロン、７α−ヒドロキシプレグネノロン及び７α−ヒドロキシエストラジオール（即ちエストラ１，３，５（１０）−トリエン−３，７α，１７β −トリオール）である。本発明により生成した７α−ヒドロキシル化ステロイドを公知酵素又は非酵素法により酸化し、７−オキソ置換ステロイドを生成してもよく、この後期処理段階は本発明の別の側面を構成する。本発明により製造される所定の７α−ヒドロキシ置換ステロイドと所定の対応する７−オキソ誘導体は新規であり、本発明の別の側面を提供する。従って、本発明は７α−ヒドロキシ又は７−オキソ置換基をもつことを特徴とする新規３β −ヒドロキシステロイドを更に提供する。好ましい新規ステロイドはコレステロール、アンドロステロン、ブレグネノロン又はエストラジオールの炭素骨格をもち、但し骨格がコレステロールの骨格である場合には、２５、２６又は２７位、最も好ましくは２５位がヒドロキシル化される。特定新規ステロイドは式：（式中、ＯＲ₁、ＯＲ₂及びＯＲ₃は各々独立して遊離ヒドロキシ基、エーテル基又はエステル化ヒドロキシ基を表す）で表される。ＯＲ₁、ＯＲ₂及びＯＲ₃が各々独立してエーテル基を表す場合には、Ｒ₁、Ｒ₂ 及びＲ₃の各々は置換又は非置換Ｃ_1-6アルキル基から選択することができ、前記全置換基はＯＨ、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）アミノ、Ｃ_1-6アルキルアミノ、Ｃ_1-6ジアルキルアミノ、ＣＯＯＨ又はＣＯＯＲ₄から選択され、Ｒ₄は上記置換基の１種以上で置換されていてもいなくてもよいＣ_1-6アルキル基を表す。ＯＲ₁、ＯＲ₂及びＯＲ₃が各々独立してエステル化ヒドロキシ基を表す場合には、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃の各々は式Ｒ₅ＣＯ−［式中、Ｒ₅は置換又は非置換Ｃ_1-6アルキル基から選択することができ、前記全置換基はＯＨ、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）アミノ、Ｃ_1-6アルキルアミノ、Ｃ_1-6ジアルキルアミノ、ＣＯＯＨ又はＣＯＯＲ₄から選択され、Ｒ₄はＣ_1-6アルキル基を表す］及び式−ＯＰ（ＯＨ）₃の基で表すことができる。式Ｉａ又はＩｂの化合物がカルボキシル基、リン酸基又は置換もしくは非置換アミノ基等の置換基を含む場合には、化合物は遊離形態でもよいし、薬理的に許容可能なアニオン（例えばリン酸又はハロケン化物イオン）又はカチオン（例えばアルカリ金属カチオン）をもつ酸付加塩の形態でもよい。例えばＯＲ₁、ＯＲ₂及びＯＲ₃がヘムコハク酸ＨＯＯＣ（ＣＨ₂）₂ＣＯを表す場合には、得られるヘムコハク酸塩は例えばＮａ又はＫ塩の形態であり得る。本発明は、上記７α−ヒドロキシル化及び７−オキソステロイドを更にステロイド骨格上の他の位置で直接置換したものを提供することが理解されよう。７α−ヒドロキシエストラジオール及び７−オキソエストラジオールは式Ｉａ及びＩｂの化合物の具体例である。以下、特に図面と実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。図面の説明図１は種々の細胞抽出物のＤＨＥＡヒドロキシル化能を評価する実験で使用したＴＬＣプレートのオートラジオグラムを示す。図２は種々の組織が７−３Ｈ−プレグネノロンから放射能を放出する能力を示す。図３はＣｙｐ７ｂにより媒介される主要ステロイド相互変換を示す。図４は実施例５に記載するような種々のステロイドの濃度によるルシフェラーゼ発現の誘導倍率をプロットしたヒストグラムである。図５は実施例５に記載するようなアルツハイマー病におけるＣｙｐ７ｂ遺伝子発現の緩和を示す。図６は本発明方法により製造した７α−ヒドロキシＤＨＥＡとその参照試料の質量スペクトロメータープロットを示す。実施例１：ＭｕＣｙｐ７ｂの基質特異性の実証Ａ．ワクシニア発現構築物の調製Ｃｙｐ７ｂにより触媒される反応を実証するために、Ｌａｔｈｅ、Ｒｏｓｅ及びＳｔａｐｌｅｔｏｎ（ＰＣＴ／ＧＢ９５／０２４６５）とＳｔａｐｌｅｔｏｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２９７３９−１９９５，１９９５年１２月１５日）により報告されているマウス酵素をコードするｃＤＮＡを改変し、同文献に記載されているようにＣｙｐ７ｂオープンリーディングフレームの５’末端に翻訳開始コンセンサス配列を導入した。改変したｃＤＮＡをＬａｔｈｅらに記載されているように標準手順（例えばＧｏｎｚａｌｅｚら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０６，８５−９２，１９９１とその引用文献参照）に従って組換え交換によりワクシニアウイルスのゲノムに導入した。Ｂ．Ｃｙｐ７ｂ酵素抽出物の調製ＨｅＬａ細胞を半集密（細胞１０６個／５ｃｍ皿、５ｍｌ培地）まで増殖させ、組換え（ＶＶ−Ｃｙｐ７ｂ）及び対照（ＶＶコペンハーゲン株）ワクシニアウイルスを０．１ｐｆｕ／細胞で感染させ、１６時間後に感染細胞を洗浄し、Ｗ（Ｗａｘｍａｎ）緩衝液（０．１ＭＫＰＯ４，１ｍＭＥＤＴＡ，２０％グリセロールｐＨ７．５；５００μｌ／プレート）にとり、再遠心分離（５分、１０００ｒｐｍ）した。全細胞抽出物を得るために、細胞を１／１００容量（５０μｌ／プレート）のＷ緩衝液に再懸濁し、−７０℃で凍結保存した。ミクロソーム調製物（Ｗａｘｍａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６０，８１−８５，１９８９）を得るために、細胞を１／１０初期容量のＷ緩衝液（５００μｌ／プレート）に再懸濁し、氷上で６×５秒音波処理し、破壊されなかった細胞を遠心分離（１０分、４℃、３０００ｒｐｍ）により除去した。上清から遠心分離（１００，０００ｇ）４５分、４℃、ＢｅｃｋｍａｎＳＷ５０．１ローター）によりミクロソームフラクションを調製し、Ｐｏｔｔｅｒホモジナイザーを使用して１／５０初期容量のＷ緩衝液（１００μｌ／プレート）に再懸濁した後、−７０℃で保存した。新鮮組織をＷ緩衝液（２．５ｍｌ／ｇ）中で均質化し、遠心分離（４０００ｒｐｍ、５分、４℃）により短時間清澄化することにより雄ラットの肝臓及び脳から対照抽出物を調製し、上清を−７０℃で保存した。Ｃ．薄層クロマトグラフィーによる基質同定 ¹⁴Ｃ又は³Ｈ標識ステロイドをＤｕＰｏｎｔ−ＮＥＮから購入した（¹⁴Ｃ標識分子：比活性４５〜６０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ；３Ｈ：比活性７０〜１００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）。標識基質の１ｎＭｏｌアリコートを乾燥し、ミクロソーム又は細胞及び組織抽出物を加え（２５〜５０μｌ）、Ｗ緩衝液で１７５μｌまで希釈した。８ｍＭＮＡＤＰＨ２５μｌを加えることにより反応を開始した。３７℃で１５分間インキュベーション後、反応物に酢酸エチル（ＢＤＨ）５００μｌを加えて震盪した。有機相を取り出して乾燥し、酢酸エチル１０μｌに懸濁した。アリコート（５×２μｌ）を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）シート（Ｍｅｒｃｋ）に加え、酢酸エチル／ｎ−ヘキサン／酢酸１６：８：１（Ｗａｘｍａｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０６，４６２−４７６，１９９１の溶媒系Ｎ）で展開した。乾燥後、Ｘ線フィルムに露光してクロマトグラム１４Ｃを可視化した。³Ｈ標識クロマトグラムは露光前にＥＮ³ ＨＡＮＣＥＴＭ（ＤｕＰｏｎｔ−ＮＥＮ）スプレーで処理した。Ｄ．結果図１は溶媒系Ｎで展開したＴＬＣプレートのオートラジオグラムであり、基質は３Ｈ−ＤＨＥＡであり、試料は酢酸エチルで抽出し、乾燥後にＴＬＣプレートに加えた（図面の下部の起点）。抽出物は、１：対照ワクシニアウイルスを感染させたＨｅＬａ細胞からのミクロソーム（負の対照）、２：ＶＶＣｙｐ７ｂを感染させたＨｅＬａ細胞からのミクロソーム、３：ＶＶＣｙｐ７ｂを感染させたＨｅＬａ細胞からのミクロソームの二重反復調製物、４：ラット脳ホモジネートである。図１から明らかなように、Ｃｙｐ７ｂを発現する組換えワクシニアを感染させた細胞からのミクロソームは、１４Ｃ−デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）をヒドロキシル化物に最も一致する低移動度形態に変換した。脳抽出物は区別できない移動度の生成物を生じ、Ｃｙｐ７ｂが脳で発現されるという本発明者らの上述の論証に一致した。生成物の相対移動度から、本発明者らはＣｙｐ７ｂが７位でＤＨＥＡをヒドロキシル化しているらしいと推測した。プロゲステロン、コルチコステロン、コルチゾール及びテストステロンは代謝されるとしても不十分であった。他方、プレグネノロンとエストラジオールはいずれも２５−ヒドロキシコレステロールと同様に酵素により変換された。これらの全基質は３βヒドロキシ基をもつ。実施例２：³Ｈ放出による修飾の位置の決定修飾の位置を決定するために、ステロイド主鎖の７位を主に³Ｈ置換した³Ｈ− プレグネノロン（ＮＥＮ）を使用した。ミクロソーム抽出物を上記と同一条件下で³Ｈ−プレグネノロンと共にインキュベートした。反応後、標識ステロイドを酢酸エチル（２×１ｍｌ）で抽出し、廃棄し、³Ｈの水相への放出を液体シンチレーション計数によりモニターした。図２は、７−³Ｈ−プレグネノロンを抽出物と共にインキュベートし、酢酸エチルで抽出後に水相への放射能放出をアッセイした結果を示す。抽出物は、１：対照ワクシニアウイルスを感染させたＨｅＬａ細胞からのミクロソーム（負の対照）、２：ＶＶＣｙｐ７ｂを感染させたＨｅＬａ細胞からのミクロソームを３：ＶＶＣｙｐ７ｂを感染させたＨｅＬａ細胞からのミクロソームの二重反復調製物、４：ラット脳ホモジネート、５：ラット肝臓ホモジネートである。図２から明らかなように、Ｃｙｐ７ｂを発現する組換えワクシニアを感染させた細胞からのミクロソームは水相に³Ｈを高率で放出した。脳もこの反応を生じたが、肝臓では生じなかった。プレグネノロンの７位からの³Ｈの放出は、Ｃｙｐ７ｂがプレグネノロンを７位でヒドロキシル化して７−ヒドロキシプレグネノロン（７ＨＰ）を生じることを立証しており、Ｃｙｐ７ｂは同様にＤＨＥＡをヒドロキシル化し（て７−ヒドロキシＤＨＥＡ［７ＨＤ］を生じ）、エストラジオールをヒドロキシル化して７−ヒドロキシエストラジオール［７ＨＥ］を生じると推論することができる。実施例３：Ｃｙｐ７ｂヒドロキシル化の立体化学種々の位置（例えば２、６、７、１５、１６）でヒドロキシル化したステロイドはα位が修飾されているかβ位が修飾されているかによってＴＬＣ上のその移動度が異なる（Ｗａｘｍａｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０６，４６２−４７６，１９９１）。精製７α− ヒドロキシＤＨＥＡを入手し（ウィスコンシン大学、酵素研究所、Ｈ．Ａ．Ｌａｒｄｙ博士の寄贈品）、Ｃｙｐ７ｂをＤＨＥＡに作用させた産物と混合し、ＴＬＣにかけた。前記産物は７α−ヒドロキシＤＨＥＡと同様に移動し、Ｃｙｐ７ｂが７αヒドロキシラーゼであることを裏付けた。実施例４：プレグネノロン及びＤＨＥＡの７αヒドロキシル化における酵素の活性酵素Ｃｙｐ７ｂの触媒活性を検討するために、ｃＤＮＡを哺乳動物細胞系で発現させた。細胞抽出物は薄層クロマトグラフィーでＤＨＥＡ（Ｋｍ１３．３μＭ；Ｖｍａｘ２８８ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）及びプレグネノロン（Ｋｍ３．６μ Ｍ；Ｖｍａｘ３４ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）からより低移動度の形態へ実質的なＮＡＤＰＨ依存性変換を示した。ラット脳抽出物も同一移動度の産物を生じた。発現された酵素は２５−ヒドロキシコレステロール、１７β−エストラジオール及び５α−アンドロステロン−３β，１７β−ジオールに対する活性が低く、プロゲステロン、コルチコステロン及びテストステロンに対する活性は低〜検出不能であった。［³Ｈ−７α］プレグネノロンをＣｙｐ７ｂ抽出物と共にインキュベートすると、媒体への放射能の放出度は、ヒドロキシル化が７α位に優先的であることを示唆した。ＤＨＥＡをＣｙｐ７ｂ抽出物と共にインキュベーション後の修飾ステロイドのガスクロマトグラフィー及び質量分析では、保持時間と分画パターンは基準７α−ヒドロキシＤＨＥＡ（７ＨＤ）で得られるものに一致し、反応生成物もＴＬＣ上で７ＨＤと同様に移動した。質量分析：９５％非標識ＤＨＥＡ（Ｓｉｇｍａ）と５％［１４Ｃ］−ＤＨＥＡ（最終比活性２．２５〜３ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を使用して１０倍規模反応を実施し、反応時間を１時間まで延長した。生成物をＴＬＣにより精製し、取り出し、酢酸エチルで抽出後、乾燥した。乾燥残渣と基準７ＨＤ（５０ｍｇ）をそのメトキシム−トリメチルシリル（ＭＯ−ＴＭＳ）誘導体に変換した。電子衝撃（ＥＩ）モードで作動するＴｒｉｏ１００質量スペクトロメーターを使用し、ＨＰ− １架橋メチルシロキサンカラム（２５ｍ，内径０．２５ｍｍ、０．１７ｍｍフィルム）を装着したＨＰ５８９０ガスクロマトグラフに連結し、電子エネルギー７０ｅＶ、イオン源温度２００℃、界面温度２８０℃、炉温度５０℃から３０℃／分で２００℃まで上昇後、１０℃／分で３００℃まで上昇、注入温度２８０℃の条件下でこれらの生成物の分析を行った。実施例５：シス−トランス同時トランスフェクションアッセイ、拮抗作用の立証チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を保存し、１５％ウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び２００ｍＭＬ−グルタミン（いずれもＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｐａｉｓｌｅｙ，英国）を補充したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中にてトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間前にＣＨＯ細胞を３×１０⁵／６０ｍｍ皿（Ｃｏｓｔａｒ，英国）の密度でプレーティングした。細胞をリン酸カルシウム法によりトランスフェクトした。要約すると、ＭＭＴＶ−ＬＵＣ５μｇとｐＲＳｈＧＲ１μｇ又はトランスフェクション効率の対照としてｐＳＶ２５μｇにｐＧＥＭ３を加えて合計１０μｇ／ＤＮＡプレートとした。２．５ＭＣａＣｌ₂ ３０μｌを滅菌水で１０倍に希釈し、３００μｌをＤＮＡに加えた。次に２ ×Ｈｅｐｅｓ緩衝塩類溶液（２８０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、５０ｍＭＨｅｐｅｓ，１２ｍＭデキストロース、ｐＨ７．０５）３００μｌをかきまぜながらＤＮＡ／ＣａＣｌ２混合物にゆっくりと加えた。この溶液を３０分間放置して微細沈殿を形成させ、６００μｌを各プレートに滴下した。２４時間後に培地を取り出し、細胞を無血清培地で洗浄し、適当な濃度のＤＨＥＡ／７α−ヒドロキシＤＨＥＡと共に１０％木炭処理血清を含む培地で更に２４時間培養した。ＤＨＥＡ／７α−ヒドロキシＤＨＥＡの添加から６時間後にＢ又はＤｅｘを各プレートに加えた。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄し、溶解用溶液（２５ｍＭＴｒｉｓ−リン酸ｐＨ７．８、２ｍＭＤＴＴ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び１０％グリセロール）０．３ｍｌで溶解させ、掻き取り、遠心分離し、細胞抽出物４０μｌ、３０ｍＭＡＴＰ５μｌ、アッセイ緩衝液（２０ｍＭトリシン、１．０７ｎＭ（ＭｇＣＯ₃）₄・Ｍｇ（ＯＨ）₂・５Ｈ₂Ｏ、２．６７ｍＭＭｇＳＯ₄、０．１ｍＭＥＤＴＡ、３３．３ｍＭＤＴＴ、０．２ｍｇ／ｍｌ補酵素Ａ）１００μｌ及び反応を開始するために注入したルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ，英国）１０５μｌを含む総容量２５０μｌ中でＢｅｒｔｈｏｌｄルミノメーターで上清を２回アッセイした。発光を１０秒間にわたって測定し、相対光単位／μｇタンパク質を計算した。結果を図４に示し、同図は単独及びＧＲ活性化濃度のコルチコステロンの存在下で対照、ＤＨＥＡ及び７α−ヒドロキシＤＨＥＡ（７ＨＤ）を添加した場合のルシフェラーゼの誘導倍率をヒストグラムにより示す。この結果から明らかなように、７ＨＤはＧＲにより媒介される転写を活性化するコルチコステロン効果のアンタゴニストとして作用するが、ＤＨＥＡはそうではない。実施例６：アルツハイマー病ニューロンにおけるＣｙｐ７ｂ発現対照及びアルツハイマー病の海馬からのクリオスタット脳切片（１０μｍ）を切断し、融解し、ゼラチンを下塗りしたポリ−Ｌ−リジン被覆スライドに載せ、− ８０℃で保存した。ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション試験では、脳切片をアセチル化（０．１Ｍトリエタノールアミン中０．２５％無水酢酸、ｐＨ８．０）により１０分間４％パラホルムアルデヒド中で後固定し、リン酸緩衝塩類溶液で濯ぎ、分量を終えたアルコールで脱水し、風乾した。Ｘｂａｌで直鎖化してセンスプローブ用にＴ３ＲＮＡを転写したヒトＣｙｐ７ｂｐＭＭＣｔＩクローンの５００ｂｐＸｂａｌ／Ｐｓｔｌフラグメントからｉｎｖｉｔｒｏ合成した［³⁵Ｓ］−ＵＴＰ標識ｃＲＮＡアンチセンスプローブ（ハイブリダイゼーション緩衝液中１０×１０⁶ｄｐｍ／ｍｌ）を使用してハイブリダイゼーションを行った。各スライド当たり２０μｌのプレハイブリダイゼーション緩衝液（デキストラン硫酸を含まない以外は、ハイブリダイゼーション緩衝液と同じ）を用いて切片を５０℃で３時間プレハイブリダイズした。プローブと５０℃で一晩ハイブリダイゼーション後、切片をＲＮａｓｅＡ（３０μｇ／ｍｌ、４５分、３７℃）で処理し、６０℃で０．１×ＳＳＣの最終ストリンジェンシーまで洗浄した。スライドを脱水し、写真乳剤（ＮＴＢ−２，Ｋｏｄａｋ）に浸漬し、４℃で５週間露光後、現像し、１％ピロニンで逆染色した。画像分析システム（Ｓｅｅｓｃａｎｐｌｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，英国）を使用してコンピューター援用粒子計数により個々の海馬ニューロンの銀粒子密度を測定し、分析はブラインドで実施した（別人が切片を切断し、コード化した）。各スライドにつき１個の海馬切片が各検体に相当する。ニューロン６〜１０個／サブ領域を試験し、白質領域で計数されたバックグラウンドを差し引いた。データをＡＮＯＶＡで評価後、Ｓｃｈｅｆｆｅの事後試験で評価した。有意差はｐ＜０．０５とした。値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。図５はアルツハイマー病及び同年齢の対照脳の試料の歯状回、ＣＡ１及びＣＡ３サブフィールドにおける粒子数／ニューロンにより示したＣｙｐ７ｂ発現を示すヒストグラムである。結論ラット、ヒト及び他の哺乳動物種からのＣｙｐ７ｂ及び同系酵素は３βヒドロキシ基をもつステロイド基質に特異的な７α−ヒドロキシラーゼであると結論することができる。ＤＨＥＡ、プレグネノロン及びコレステロールを７−ヒドロキシル化する活性は種々の粗組織ホモジネートで従来報告されている（例えばＡｋｗａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８８，９５９−９６４，１９９２）が、関与酵素の特性決定はまだ実施されておらず、また、エストラジオールに関する活性も報告されていない。従って、Ｃｙｐ７ｂを発現する組換え生物は、これに限定するものではないが主に治療用途又は７−オキソ分子等の他のステロイド誘導体の生産を目的とした７ＨＰ、７ＨＤ及び７ＨＥの大規模製造手段を提供する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 19/10 Ａ６１Ｋ 31/00 ６１９Ｅ 21/04 ６２１Ｄ 25/28 ６２６Ｎ 25/24 ６２６Ｌ 37/04 ６３７ＣＡ６１Ｋ 31/565 31/565 Ｃ０７Ｊ 1/00 Ｃ０７Ｊ 1/00 Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/00 33/00 (31)優先権主張番号９７０４９０５．０ (32)優先日平成９年３月10日(1997．3．10) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ローズ，ケニース・アンドリユーイギリス国、エジンバラ・イー・エイチ・９・３・ジエイ・キユー、ウエスト・メインズ・ロード、ユニバーシテイ・オブ・エジンバラ（番地なし) (72)発明者セツクル，ジヨナサン・ロバートイギリス国、エジンバラ・イー・エイチ・４・２・エツクス・ユー、ウエスターン・ジエネラル・ホスピタル、ザ・ユニバーシテイ・オブ・エジンバラ、モルキユラー・エンドクリノロジー、モルキユラー・メデイシン・センター（番地なし) (72)発明者ベスト，ルースイギリス国、エジンバラ・イー・エイチ・４・２・エツクス・ユー、ウエスターン・ジエネラル・ホスピタル、ザ・ユニバーシテイ・オブ・エジンバラ、モルキユラー・エンドクリノロジー、モルキユラー・メデイシン・センター（番地なし) (72)発明者ヤウ，ジヨイス・ライ・ワーイギリス国、エジンバラ・イー・エイチ・４・２・エツクス・ユー、ウエスターン・ジエネラル・ホスピタル、ザ・ユニバーシテイ・オブ・エジンバラ、モルキユラー・エンドクリノロジー、モルキユラー・メデイシン・センター（番地なし) (72)発明者レツキー，キヤロライン・マツケンジーイギリス国、エジンバラ・イー・エイチ・４・２・エツクス・ユー、ウエスターン・ジエネラル・ホスピタル、ザ・ユニバーシテイ・オブ・エジンバラ、モルキユラー・エンドクリノロジー、モルキユラー・メデイシン・センター（番地なし)

Claims

【特許請求の範囲】１．神経精神、免疫及び内分泌障害の治療用又は認識増進の誘発用医薬組成物の製造における、７α−ヒドロキシもしくは７−オキソ置換３β−ヒドロキシステロイド又は７位及び３位の一方もしくは両方をエステルもしくはエーテル基で独立して置換したその誘導体の使用。２．前記障害が、（ａ）加齢における認識欠損、（ｂ）アルツハイマー病、（ｃ）加齢における免疫系欠損、（ｄ）ＨＩＶ感染における免疫機能の欠損、（ｅ）グルココルチコイド又はミネラルコルチコイド過剰、（ｆ）糖尿病、（ｇ）鬱病、（ｈ）骨粗鬆症及び高カルシウム血症、（ｉ）高血糖症及び高脂血症、（ｊ）筋萎縮症、（ｋ）動脈硬化症、（ｌ）ステロイド糖尿病から選択される請求項１に記載の使用。３.ステロイドが３β置換基−ＯＲ₁及び／又は７α置換基−ＯＲ₂をもち、ここで−ＯＲ₁及び−ＯＲ₂は各々独立して遊離ヒドロキシ、エステル又はエーテル基を表し、Ｒ₁及びＲ₂の各々は独立して水素、置換又は非置換Ｃ_1-6アルキル基、Ｒ₅ＣＯ−基（式中、Ｒ₅は置換又は非置換Ｃ_1-6アルキル基から選択することができる）及び式−ＯＰ（ＯＨ）₃の基から構成される群から選択され、全置換基はＯＨ、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）アミノ、Ｃ_1-6アルキルアミノ、Ｃ_1-6 ジアルキルアミノ、ＣＯＯＨ又はＣＯＯＲ４から選択され、Ｒ₄はＣ_1-6アルキル基を表し、化合物は遊離形態でもよいし、薬理的に許容可能なアニオンをもつ酸付加塩の形態でもよい請求項１又は２に記載の使用。４．ステロイドがコレステロール、アンドロステロン、プレグネノロン又はエストラジオールの炭素骨格をもつステロイドであることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。５．神経精神、免疫及び内分泌障害の診断用試験キットの製造におけるＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼ酵素の使用。６．前記障害が、（ａ）加齢における認識欠損、（ｂ）アルツハイマー病、（ｃ）加齢における免疫系欠損、（ｄ）ＨＩＶ感染における免疫機能の欠損、（ｅ）グルココルチコイド又はミネラルコルチコイド過剰、（ｆ）糖尿病、（ｇ）鬱病、（ｈ）骨粗鬆症及び高カルシウム血症、（ｉ）高血糖症及び高脂血症、（ｊ）筋萎縮症、（ｋ）動脈硬化症、（ｌ）ステロイド糖尿病から選択される請求項５に記載の使用。７.Ｃｙｐ７ｂ酵素に特異的に結合することを特徴とする抗体、特にモノクローナル抗体。８．Ｃｙｐ７ｂ酵素の存在をアッセイするための試験キットにおける請求項５に記載の抗体の使用。９．Ｃｙｐ欠損もしくは過剰の遺伝子治療又は免疫原プロセスを促進するための標的送達薬剤の製造におけるＣｙｐ７ｂコーディング配列又はアンチセンス配列の使用。１０．ベクターをワクチン製剤と同時投与し、投与後にＣｙｐ７ｂ配列が発現され、生産した発現産物がワクチンの免疫原性を増加する請求項９に記載の使用。１１．７位に置換基をもたない対応するステロイド基質をＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼ酵素の存在下でヒドロキシル化することを特徴とする７α−ヒドロキシ置換ステロイドの製造方法。１２．酵素がマウス、ラット又はヒトＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼ酵素である請求項１１に記載の方法。１３．Ｃｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼ酵素が、（ａ）配列番号１に示すラットＣｙｐ７ｂのコーディング配列を含むＤＮＡ分子のコーディング配列、（ｂ）配列番号２に示すマウスＣｙｐ７ｂのコーディング配列を含むＤＮＡ分子のコーディング配列、（ｃ）６５℃で２×ＳＳＣとして定義される標準ハイブリダイゼーション条件下で（ａ）又は（ｂ）に定義したＤＮＡ分子とハイブリダイズすることが可能なＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ分子、（ｄ）５５℃で６×ＳＳＣとして定義される低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に定義したＤＮＡ分子とハイブリダイズすることが可能なＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ分子から選択されるＣｙｐ７ｂ酵素のＤＮＡコーディング配列によりコードされる配列をもつ請求項１１に記載の方法。１４．Ｃｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼ酵素が、（ｅ）（ｉ）配列番号３で「エキソン３」と呼ぶ配列、（ｉｉ）配列番号３で「エキソン４」と呼ぶ配列から選択されるＤＮＡコーディング配列、（ｆ）６５℃で２×ＳＳＣとして定義される標準ハイブリダイゼーション条件下で（ｅ）に定義したＤＮＡ分子とハイブリダイズすることが可能なＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ分子、（ｇ）５５℃で６×ＳＳＣとして定義される低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で（ｅ）又は（ｆ）に定義したＤＮＡ分子とハイブリダイズすることが可能なＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ分子、（ｈ）（ｉ）配列番号３で「エキソン３」と呼ぶ配列、（ｉｉ）配列番号３で「エキソン４」と呼ぶ配列から選択される配列の連続対を含むＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ分子、（ｉ）６５℃で２×ＳＳＣとして定義される標準ハイブリダイゼーション条件下で（ｈ）に定義したＤＮＡ分子とハイブリダイズすることが可能なＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼをコードるすＤＮＡ分子、（ｊ）５５℃で６×ＳＳＣとして定義される低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で（ｈ）又は（ｉ）に定義したＤＮＡ分子とハイブリダイズすることが可能なＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ分子、（ｋ）配列番号３で「エキソン３」及び「エキソン４」配列から構成される連続コーディング配列を含むＤＮＡ分子のコーディングＤＮＡ配列、（ｌ）６５℃で２×ＳＳＣとして定義される標準ハイブリダイゼーション条件下で（ｋ）に定義したＤＮＡ分子とハイブリダイズすることが可能なＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ分子、（ｍ）５５℃で６×ＳＳＣとして定義される低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で（ｋ）又は（ｌ）に定義したＤＮＡ分子とハイブリダイズすることが可能なＣｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ分子から選択されるＣｙｐ７ｂ酵素のＤＮＡコーディング配列によりコードされる配列をもつ請求項１１に記載の方法。１５．Ｃｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼ酵素が、配列番号４、５もしくは６に含まれるアミノ酸配列から選択されるＣｙｐ７ｂ酵素のＤＮＡコーディング配列又は７α−ヒドロキシル基の導入を触媒する能力を除去しないという条件で上記配列の１種以上と少なくとも５０％の相同度をもつ配列によりコードされる配列をもつ請求項１１に記載の方法。１６．Ｃｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼ酵素が、７α−ヒドロキシル基の導入を触媒する能力が除去されないという条件で上記配列の１種以上と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％の相同度をもつＤＮＡコーディング配列によりコードされる配列をもつ請求項１５に記載の方法。１７．Ｃｙｐ７ｂステロイドヒドロキシラーゼ酵素が、２０以下、好ましくは１０以下、最も好ましくは５以下のアミノ酸置換、挿入又は欠失により配列番号４、５又は６に含まれるアミノ酸配列と相違する請求項１５に記載の方法。１８．基質が３β−ヒドロキシル基をもつステロイドである請求項１１から１７のいずれか一項に記載の方法。１９．基質がコレステロール、アンドロステロン、プレグネノロン又はエストラジオールの炭素骨格をもつステロイドであり、但し基質がコレステロールの炭素骨格をもつ場合には、基質は２５、２６又は２７位にヒドロキシル基をもつ請求項１１から１８のいずれか一項に記載の方法。２０．基質が２５−ヒドロキシコレステロール、デヒドロエピアンドロステロン、プレグネノロン又はエストラジオールである請求項１９に記載の方法。２１．製造される７α−ヒドロキシ置換ステロイドが７α−ヒドロキシエストラジオール、７α−ヒドロキシプレグネノロン又は７α−ヒドロキシデヒドロエピアンドロステロンである請求項１１から２０のいずれか一項に記載の方法。２２．生成したステロイドを酸化段階にかけ、Ｈ．ＯＨをオキソ基に変換する請求項１１から２１のいずれか一項に記載の方法。２３．式：（式中、ＯＲ₁、ＯＲ₂及びＯＲ₃は各々独立して遊離ヒドロキシ基、エーテル基又はエステル化ヒドロキシ基を表す）のステロイド。２４．Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃の各々が置換又は非置換Ｃ_1-6アルキル基から選択することができ、前記全置換基はＯＨ、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）アミノ、Ｃ_1- ₆ アルキルアミノ、Ｃ_1-6ジアルキルアミノ、ＣＯＯＨ又はＣＯＯＲ₄から選択され、Ｒ₄は上記置換基の１種以上で置換されていてもいなくてもよいＣ_1-6アルキル基を表すか、ＯＲ₁、ＯＲ₂及びＯＲ₃が各々独立して式Ｒ₅ＣＯＯ−のエステル化ヒドロキシ基を表し、式中、Ｒ₅は置換又は非置換Ｃ_1-6アルキル基から選択することができ、前記全置換基はＯＨ、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）アミノ、Ｃ_1-6アルキルアミノ、Ｃ_1-6ジアルキルアミノ、ＣＯＯＨ又はＣＯＯＲ₄から選択され、Ｒ₄はＣ_1-6アルキル基を表すか、あるいはＯＲ₁、ＯＲ₂及びＯＲ₃が各々独立して式−ＯＰ（ＯＨ）₃のエステル化ヒドロキシ基を表す請求項２３に記載のステロイド又は薬理的に許容可能なその塩。２５．７α−ヒドロキシエストラジオール又は７−オキソエストラジオール。２６．３β−ヒドロキシステロイドであることを特徴とする請求項２３に記載のステロイド。２７．７α−ヒドロキシエストラジオール、７α−ヒドロキシプレグネノロン又は７α−ヒドロキシデヒドロエピアンドロステロンを酸化することを特徴とするオキソ置換ステロイドの製造方法。２８．神経精神、免疫及び内分泌障害又は認識増進のための治療を必要とするヒト又は動物の治療方法であって、有効量の７α−ヒドロキシもしくは７−オキソ置換３β−ヒドロキシステロイド又は７位及び３位の一方もしくは両方をエステルもしくはエーテル基で独立して置換したその誘導体を投与することを特徴とする前記方法。２９．前記障害が、（ａ）加齢における認識欠損、（ｂ）アルツハイマー病、（ｃ）加齢における免疫系欠損、（ｄ）ＨＩＶ感染における免疫機能の欠損、（ｅ）グルココルチコイド又はミネラルコルチコイド過剰、（ｆ）糖尿病、（ｇ）鬱病、（ｈ）骨粗鬆症及び高カルシウム血症、（ｉ）高血糖症及び高脂血症、（ｊ）筋萎縮症、（ｋ）動脈硬化症、（ｌ）ステロイド糖尿病から選択される請求項２８に記載の方法。３０．ステロイドがコレステロール、アンドロステロン、プレグネノロン又はエストラジオールの炭素骨格をもち、３β置換基−ＯＲ₁及び／又は７α置換基− ＯＲ₂をもち、ここで−ＯＲ１及び−ＯＲ₂は各々独立して遊離ヒドロキシ、エステル又はエーテル基を表し、Ｒ₁及びＲ₂の各々は独立して水素、置換又は非置換Ｃ_1-6アルキル基、Ｒ₅ＣＯ−基（式中、Ｒ₅は置換又は非置換Ｃ_1-6アルキル基から選択することができる）及び式−ＯＰ（ＯＨ）₃の基から構成される群から選択され、全置換基はＯＨ、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）アミノ、Ｃ_1-6アルキルアミノ、Ｃ_1-6ジアルキルアミノ、ＣＯＯＨ又はＣＯＯＲ₄から選択され、Ｒ₄はＣ₁ _-6 アルキル基を表し、化合物は遊離形態でもよいし、薬理的に許容可能なアニオンをもつ酸付加塩の形態でもよい請求項２８に記載の方法。３１．治療用としての、コレステロール、アンドロステロン、プレグネノロンもしくはエストラジオールの炭素骨格をもつ７α−ヒドロキシもしくは７−オキソ置換３β−ヒドロキシステロイド又は７位及び３位の一方もしくは両方をエステルもしくはエーテル基で独立して置換したその誘導体。３２．７α−ヒドロキシデヒドロエピアンドロステロン、７α−ヒドロキシプレグネノロン又は７α−ヒドロキシエストラジオールから選択される請求項３１に記載のステロイド。３３．発熱物質を含まない滅菌形態の医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤と共に、コレステロール、アンドロステロン、プレグネノロンもしくはエストラジオールの炭素骨格をもつ７α−ヒドロキシもしくは７−オキソ置換３β−ヒドロキシステロイド又は７位及び３位の一方もしくは両方をエステルもしくはエーテル基で独立して置換したその誘導体を含むことを特徴とする医薬組成物。