JP2000511536A

JP2000511536A - 食道癌用のタンパク質マーカー

Info

Publication number: JP2000511536A
Application number: JP09542706A
Authority: JP
Inventors: サミアエムハナシュ; デビッドジービーア; ローククイック; ロバートヒンデラー
Original assignee: プロテオムサイエンシズピーエルシー
Priority date: 1996-05-30
Filing date: 1997-05-29
Publication date: 2000-09-05
Anticipated expiration: 2017-05-29
Also published as: DE69735676D1; AU739306B2; DK0950062T3; AU3208997A; DE69735676T2; CA2264963C; WO1997045445A1; CA2264963A1; ES2258278T3; EP0950062A1; EP0950062A4; JP4993799B2; NZ333075A; ATE323103T1; EP0950062B1

Abstract

(57)【要約】食道腫瘍由来の組織中のタンパク質の、キャリヤー両性電解質(CA)および固定化pH勾配(IPG)法の両者に基づく、コンピュータ化された2-Dゲルの分析は、腫瘍とコントロール組織との間で異なっているタンパク質を明らかにする。

Description

【発明の詳細な説明】食道癌用のタンパク質マーカー発明の背景発明の分野本発明は、食道癌用のマーカーとしてのタンパク質に関する。食道癌は、死に至る疾患であり、かつ世界規模の最も一般的な10種の癌の一つである。明らかになっていない理由のために、食道腺癌の発生率における急激な増加が見られた。前癌性異形性上皮が、胃食道逆流に伴って正常な偏平上皮と置き換わる、バレット(Barrett's)粘膜と呼ばれる、食道における変化の出現は、この死に至る癌に関する主な危険因子である。この癌に関連する高い死亡率を低減するためには、バレット粘膜を診断し、かつ初期段階において、癌への進行の徴候であるバレット粘膜における変化を同定する、単純化された手段を必要とするであろう。関連技術の説明現時点において、食道癌は主として生検により診断される。不幸なことに、該癌が診断される前に、該癌はしばしば著しく進行している。診断後の生存率は貧弱なものである。従って、初期段階あるいは前癌状態における、食道癌の診断に対する要求がある。該疾患の進行に対応するマーカーを使用して、治療養生を追跡することができる。発明の概要正常な食道、正常な胃粘膜、バレット粘膜由来のタンパク質である2-Dゲルと食道癌との比較により、種々の源である組織中に、一群のタンパク質が同定された。これらのタンパク質は、食道癌の病原論に関する情報を与え、かつ治療養生を追跡するためのマーカーとしての有用性をもつ可能性がある。また、これらタンパク質を精製し、かつ免疫原として使用して、診断薬として使用可能な抗体を生成することもできる。該タンパク質と特異的に結合する抗体を、体液のイムノアッセイで使用して、該タンパク質を検出し、それにより診断情報および／または治療養生を追跡するための情報を得ることができる。このイムノアッセイ法で使用する該体液は血液または血清、尿、唾液、涙液またはその他の体液のサンプルであり得る。更に、該タンパク質およびこれら由来の生成物は、治療上の用途をもつ。図面の簡単な説明第１図は、多くの重要な標識されたスポットをもつ、完全なキャリヤー両性電解質(CA)ゲルを示す図である。第２図は、12サンプル由来のCAゲルに関するスポット102の回りの領域を示す図である。第３図は、12サンプル由来のCAゲルに関するスポット109-111の回りの領域を示す図である。第４図は、12サンプル由来のCAゲルに関するスポット61の回りの領域を示す図である。第５図は、12サンプル由来のCAゲルに関するスポット112の回りの領域を示す図である。第６図は、12サンプル由来のCAゲルに関するスポット115および117の回りの領域を示す図である。第７図は、12サンプル由来のCAゲルに関するスポット118の回りの領域を示す図である。第８図は、12サンプル由来のCAゲルに関するスポット42、44および120の回りの領域を示す図である。第９図は、４サンプル由来のCAゲルに関するスポット121の回りの領域を示す図である。第10図は、12サンプル由来のCAゲルに関するスポット122、123および124の回りの領域を示す図である。第11図は、ゲルの四分の１区を示す図である。第12図は、ゲルの四分の１区を示す図である。第13図は、12サンプル由来のCAゲルに関するスポットPCNAの回りの領域を示す図である。第14図は、12サンプル由来のCAゲルに関するスポット29の回りの領域を示す図である。第15図は、12サンプル由来のCAゲルに関するスポット31の回りの領域を示す図である。第16図は、12サンプル由来のCAゲルに関するスポット42の回りの領域を示す図である。第17図は、12サンプル由来のCAゲルに関するスポット44の回りの領域を示す図である。第18図は、12サンプル由来のCAゲルに関するスポット５の回りの領域を示す図である。第19図は、固定化pH勾配(IPG)ゲルの四分の１区を示す図である。第20図は、IPGゲルの四分の１区を示す図である。第21図は、10サンプル由来のIPGゲルに関するスポット29の回りの領域を示す図である。第22図は、10サンプル由来のIPGゲルに関するスポット15、51および53の回りの領域を示す図である。第23図は、10サンプル由来のIPGゲルに関するスポット56の回りの領域を示す図である。第24図は、10サンプル由来のIPGゲルに関するスポット57の回りの領域を示す図である。第25図は、IPGゲルの四分の１区を示す図である。発明の詳細な説明実施例１：食道癌のキャリヤー両性電解質(CA)に基づく2-Dゲル 27名の患者の、腫瘍組織および正常な食道由来の組織を、2-D分析のために得た。バレット粘膜の関連において腫瘍が発生している患者に対して、バレット組織をも得た（バレット粘膜の興味ある病理的特徴は、これが見出される場所において、食道組織ではなく寧ろ胃腸型の組織と類似することである。該食道の下端部は、真の食道組織ではなく寧ろ胃粘膜に類似するので、その位置に発生する腫瘍は、コントロールとしての正常な食道並びに胃組織と比較する必要がある）。食道の下端部に発生する腫瘍については、正常な胃粘膜をも入手した。全ての検体は、最初の手術の時点で入手した。従って、何れの患者についても、該癌組織以外に、２種のコントロール組織、即ち該患者の半数に対して正常な食道およびバレット組織を、および残りの半数の患者に対して正常な食道および胃組織を入手した。 pH範囲約3.5-10.0に渡るキャリヤー両性電解質を主成分とする2-Dゲルを、全ての検体について調製した。組織を、蒸留脱イオン水中に、（1リットル当たり）8Mの尿素、20mlのノニデット( Nonidet)P-40界面活性剤、20mlの両性電解質(pH3.5-10)、20mlの２-メルカプトエタノール、および0.2mMのフェニルメチルスルホニルフルオライドを含有する溶解バッファーを添加することにより可溶化した。70μｇのタンパク質を含有する約30μｌのアリコートを各ゲル上に重層した。等電点電気泳動法は電荷修飾に敏感であるので、これは、不適当なサンプル調製に起因する恐れのある、タンパク質の変更（例えば、タンパク質分解、グルタミンおよびアスパラギンの脱アミド化、シスチンのシスチックアシッド(cystic acid)への酸化、カルバミル化）を最小化するために重要である。一旦可溶化したら、サンプルは、大幅なタンパク質の変更の恐れ無しに、-80℃にて短期間（< １カ月）凍結保存することができる。 2-D PAGEを、以前に記載（ストレーラー(Strahler)等，J．Clin．Invest.，19 90，85:200-207）されたように実施した。多くの場合において、アリコートは、即座に等電点電気泳動ゲルに適用した。一次ゲルは、１リットル当たり50mlの両性電解質(pH3.5-10)を含んでいた。等電点電気泳動を、1,200Vにて16時間および1,50 0Vにて２時間実施した。20個のゲルを同時に泳動させた。二次元の分離については、11.4-14.0g/dlのアクリルアミド勾配を使用した。ゲル中のタンパク質スポットを、メリル等（メリル(Merril)等，Science，1981，211:1437-1438）の銀- 染色技術を利用して可視化した。実施例２：食道癌の固定化されたpH勾配(IPG)2-Dゲルキャリヤー両性電解質に基づく2-Dパターンの生成に加え、固定化されたpH勾配を利用した第二群のパターンを、補足的な組として生成した。サンプルを、実施例１に記載の該CAゲルと同様にして調製した。一次分離のための固定化pH勾配は、pH4-10の分離範囲に渡る。二次元分離は実施例１の該CAゲルに関するものと同一である。 IPGゲルを、特定のpK値をもつ、カルボキシルまたはt-アミノ基を有するアクリルアミドの誘導体を使用して調製する。線形pH勾配を、高密度の酸性溶液および僅かに塩基性の溶液から、２−チャンバー微小勾配形成装置を使用して調製する。このpH勾配は、グリセロールの同時線形勾配により、インモビリン(Immobil ine）−アクリルアミド−ビスアクリルアミドマトリックスの重合中に安定化される。狭いpH勾配(1pH単位)または広いpH勾配(>１pH単位，６pH単位まで)に対する該pH制限溶液用の滴定インモビリンを含む緩衝用のインモビリン混合物の処方は公開されている(ギアナッツァ(Gianazza)等，Electrophoresis，1985，6:113 およびLKBアプリケーションノート324(1984))。該二次元分離は、SDSゲル内で分子量に基づいてタンパク質を分離する。11.5 〜14％T（2.6％架橋）アクリルアミド勾配は、15,000〜100,000の分子量をもつタンパク質の効果的な分離をもたらす。この範囲外のタンパク質は、さほど十分には解像（分離）されない。10,000Da未満の分子量をもつタンパク質は、染料フロントに近接して電気泳動され、分離されない。実施例３：2-D ゲルのコンピュータによる解析各ゲルを1024×1024画素フォーマットで走査させた。ここで、各画素は、異なる強度値を表す、256個の可能な値の一つであり得る。研究した画像についてのスポットリストは、主画像のスポットリストと一致しており、従って得られた結果は、適合タンパク質スポットの一階層(hierarchy)である。このマッチングの目的は、ストレーラー等（ストレーラー(Strahler)等，J．Clin．Invest.，1990 , 85:200-207）に記載されているように、該階層を介して同一のポリペプチドスポットを関連付け、その存在、量的な変動および特異性の評価を可能とすることである。ゲル同志の、個々のタンパク質の量を比較するために、調節法を利用する。mm²当たりの光学密度単位で測定された、検出されたポリペプチドの積分された強度(integrated intensity)は、至るところに示されている基準ポリペプチドの強度に対して調節されている。この調節は、タンパク質の重層または染色による、ゲル間のあらゆる変動を補償するようになされる。実施例４：正常な組織に比して、バレット異形成において過度に発現されるタンパク質バレットと正常な食道との間のスポットの違いの数は莫大であった。バレットのサンプルがより一層胃粘膜サンプルに類似することが明らかであり、従って胃粘膜に比してバレット中で大きなスポットを同定した。バレット中に存在し、かつ胃組織中に存在しない該スポットの幾つかは、正常な食道に存在し、しかもこれらは多分さほどに重要ではない。これらはスポット６から始まって、底部に現れる。バレットにおいてより大きい該スポットは、食道腺癌においても大きいことに注目すべきである。というのは、これら２種の型のサンプルは、本質的に同一の組織を表すが、悪性状態に関しては異なっているからである。スポット102は分析された正常な組織におけるよりも、バレットにおいてより大きい。より大きなスポット109、110および111は、胃粘膜または正常な食道におけるよりも、バレットにおいて殆ど常に存在している。これらはまた、食道腺癌においても大きい。スポット33は、バレットにおいて常にかなり大きなスポットであり、また場合によっては胃粘膜におけるものとほぼ同一であるが、しばしばこれよりも小さい。このことは、該スポットが食道腺癌においてより大きいと思われることを除いて、わざわざ述べる程のことではない。スポット61は、殆ど常にバレットにおいてより大きい。その直ぐ右のスポットは通常は胃粘膜においてより大きい。スポット112は、殆どのバレットにおいてより大きい。スポット113は、バレットにおいてより大きいが、胃粘膜においても、明確なスポットとして存在している（113の直ぐ右側のスポットは胃粘膜において大きい）。スポット117は、潜在的に興味深いものである。これは多くの胃粘膜中に見出すことが困難である。というのは、これは多くの小さなスポットを含むある領域内にあるからである。スポット115は、かなり良好に観測され、またスポット117近傍にある。スポット118は、通常バレットにおいてより大きい。これは全く基本的なことであり、従って全てのゲルにおいて比較することは困難である。スポット44は良好に見えるが、興味あるスポットの一つとして既に分かっている。というのは、これが食道腺癌でより大きいと考えられるからである。スポット120はバレットおよび食道腺癌において特に大きい。スポット121はバレットおよび食道腺癌において膨大な、灰色の極めて塩基性のl8kDのスポットである。これは該ゲル上の右側の遠位にあるので、該ゲル上にあるのか、ゲル外にあるかを決定することはしばしば困難である。スポット122はバレットにおいてより大きい。スポット123は、極めて低位かつ酸性であり、バレットにおいてより大きな一群のスポットの一部である。スポット124は、良好に見える。これはホスホリル化されたPl8("c")である可能性がある。スポット６、７および８は、バレットにおいてより大きいが、正常な食道には HUGEスポットがある。スポット116は、通常バレットにおいてより大きいが、食道において大きいと思われる。 HSP27スポットは、通常バレットにおいてより大きいが、これらは正常な食道においても大きい。スポット119は興味あると思われるが、これは食道由来の大きなスポットである。胃粘膜(GM)、噴門における癌(CC)、バレット(B)および食道腺癌(EA)に及ぶスポットの概要：キー：U=興味ありかつアップ(up) i=幾分興味深い（アップ）が、他のスポット程確信的でない。 n=さほど興味深いものではない。EA対Ｂについては、これは通常同一のサイズを維持するスポットを意味する(GMよりも大きい）。 D=これはダウン(down)を意味するが、これらスポットについては必要とされない。初めの５個のスポットは、EA対Ｂの比較により初めて認識され、Ｂ対GM比較により残りが認識された（多分、スポット115はEA対Ｂにおいても認識できる）。スポット# BvsGM EAvsB CCvsGM pH MW ５ n U n 4.4 57 29 i U i 6.1 42 31 n U n 5.7 33 42 n U n 6.2 25 44 U U U 5.9 27 33 U n n 典型的なパターン：GM、CCよりもＢ、EAにおいてより大きい。 61 U n i 4.4 58 113 U n n 4.4 41 102 U n n 5.7 51 109 U n i 6.0 48 110 U n i 6.1 49 111 U n i 6.2 50 112 U n n 6.3 53 117 U n i 6.1 41 115 U i U 6.1 39 （ＢにおけるよりもEAにおいてより大きいが、顕著ではない） 113 U n n 4.4 41 120 U n n 5.8 25 122 U n n 5.2 17 123 U n i 5.0 14 124 U n n 5.6 19 121 U 6.8 17 IPG において確実に同定できるバレットスポット：上記した同一の患者に対する、バレットと、胃粘膜および正常な食道との比較により、該一次元において等電点電気泳動(IEF)により調製したゲルを使用して、バレットにおいて増加すると考えられる15個のスポットが同定された。１つを除き全てのスポットが、等量であるいは増加量で、食道腺癌サンプル中に存在していた。IEF上のスポット位置の指標としてスポットカラーを使用し、同一の銀染色プロトコールを利用して、固定化pH勾配(IPG)におけるこれら同一のタンパク質スポットを同定すべく、またバレットとコントロール物質（正常な食道、胃粘膜）との間の類似の差異がIPGに観測されるか否かを明らかにすべく、努力がなされている。該スポットの９個は、確実に同定された。これらは、スポット番号113、109-1 11(単一のタンパク質として計数されたスポット群である)、117、118、120、122 、123、124および44（これは食道腺癌においてより大きいものとして報告されたスポットに含まれる）である。スポット61および121も確実に同定された。残りの４個のタンパク質スポット( 38、102、112、115)は仮にIPGに属するものとして同定した。食道腺癌において観測される変化本研究のこの構成は、最も顕著であると思われる５名の患者のパターンを解析することにより開始した。該分析はバレットと腺癌との比較である。この比較は以下の発見に導いた：スポット５ EAにおいて増加するものと思われる；スポット13 EA、Ｉにおいて増加する；スポット25 殆どのEAにおいてアップであり、そのため良好な塩基側のパターンが存在する；スポット29 多くの患者のEAにおいてアップであるが、小さく識別困難；スポット30 殆どのサンプルについて、EAにおいてアップである；スポット31 30の直ぐ左側にあり、１名の患者以外の全ての患者のEAにおいてアップであり、該１名の患者ではダウンである；スポット32 殆どの患者のEAにおいてアップである；スポット33 殆どの患者のEAにおいてアップである；スポット35 EAにおいてアップであるが、識別困難である。２名の患者において最も明確にアップである；スポット38 何れのサンプルでも、EAにおいてアップである。これはPCNA であると考えられる；スポット40 ２名の患者のEAにおいてアップである；スポット41 数名の患者のEAにおいては極めてアップであるが、食道においても見られる；スポット42 EAにおいてアップである。１名の患者はこれを示さない；スポット44 多くの患者のEAにおいてアップである；スポット47 寧ろ良好であるように見える；スポット50 EAにおいてアップであり、極めて高い酸性で、識別困難；スポット52 １名の患者を除きEAにおいてアップである。引き続き、他のゲルを、上記のスポット差について精査した。全てのゲルについて分析したが、そのデータは、最も明確なゲルのサブセットについてのみ表に示した。以下の表は、最良のスポット差を示すもののみを含む、上記スポットのサブセットのみを示した。星印は、これらの中で最も興味深いものと思われるものに次ぐものであると考えられる。該表中の記号は以下の通りである：＋、＋＋＝増加；-、--＝減少；０＝スポットなし；？＝困難な領域／判定困難；”s”＝スポットサイズの差異はあったとしても僅か。患者は３文字で特定する。スポット Wil Ray Har Sta Sco Bal Ing Pal Ben Rea Ril P18 ++ s + + s + s - + + + NDPK ++ s + s s s + - + + + 38= PCNA ++ s s s + s ++ + + + + 5^* + + s + s s + + + ? ++ 小さいが、しばしば殆ど定性的な差異。 13 -- s + s -- + + s s + アクチン近傍，常にアップではない。 29^* 0 0 s + + 0 + 0 + ++ ++ 小さいが、しばしば殆ど定性的。 31^* ++ 0 s + + + + ++ ++ + 良好なスポットであるが、決して非常に大きくはない。 35 + 0 0 + 0 0 ? ? ? + + 良好であると思われるが、小さく、識別困難。 42^* ++ + + ++ s ? + ++ ++ ++ 良好、しばしば大きい。正にアップであり、"L2"hsp27型の右側。 44^* + + s + + s/+ - s + + + 良好で、しばしば大きいが、常にバレット中に存在する。 47 + ? s + + ? - + + + ++ 興味深い。寧ろむらのある、寧ろ塩基性のスポット。識別困難、確実でない。 50 ? 0 + + s + s s + + + 極めて低いMW、高い酸性のタンパク質。曖昧。多分、部分的には、該腫瘍サンプルに対して良好なサンプル性能の関数である。 57 ++ s ? + + - - + + + + 極めて低いMWのスポット、幾分大きいが、幾分ダウンである。食道腺癌とバレットサンプルとを比較するIPGゲル初めに酸性であった重層されたIPG(固定化さたpH勾配ゲル)を、３名の患者(c0 071-80)について実験を行い、塩基性の重層されたIPGを別の３名の患者(c1025-3 4)についてテストし、別々に分析した。前の実験と同様に、各個人由来のサンプルの各対について多くの固有の差異が存在し、その幾つかは種々のサンプルの不純物の量の変動に基づくものであり、その他は多分固有性質の変化によるものであり、後者が真の差異であるが、多くの腫瘍には付与されていない。従って、多くの腫瘍に付与された差異を見出すことは困難である。第19図は、該酸性の重層されたゲルにおけるバレットと比較した腫瘍においてより大きな12ケのスポットを示し、これについて患者の本質は分かっていない（既知のスポットP18およびNDPKAも、これら患者の腫瘍内では、大きいものと思われた）。これらゲルの幾つかは、寧ろ軽質であり、従ってこの組における確信は、該塩基性の重層されたゲルに対する程には高くなく、また候補スポットのEst 程にも高くない。第20図は、該塩基性の重層されたIPGにおいて大きいと考えられる、候補スポットのより大きな組を示す。実際に、非常に多くの差異が存在して、患者の特定のサブセットを選択したことと幾分かの関連性を生じた。番号付けした系は、該酸性の重層ゲルにおけるスポットの番号付けと一致しており、従ってスポット15 、18および19は、第一の図に示したように、同一のスポットであるが、該IPGストリップの対向末端に重層されたゲルのこれら２つの組間のスポットを関連付けることは常に容易である訳ではない。２つの新たな塩基性の重層したIPGを作成し、これから３つの最良のパターン対（腫瘍、バレット）を選択して、どの候補スポットが最も再現性のあるスポット変化を示すかを決定した。このレビューによれば、順序について追跡する価値の最も高い６つのスポットが存在すると思われる。他の幾つかのものよりも、これらのスポットがより価値があることは、該腫瘍の強度によって部分的に色付けされることである。というのは、このことが、これらが如何に容易に精製され、かつ順序付けられるかに関連しているからである。また、スポット15および51の場合には、これらスポットが以前に、IEFゲルにおける興味ある差異として認識されたという事実のために、リスト上に残してある。幾つかの図があり、これらは一つの実験からの３名の患者および第二の実験からの更に２名（僅かに異なる状態）の患者に関する、ゲルのクローズアップされた部分を含み、左側にバレットのサンプルを、また右側に腫瘍サンプルが示されている。スポット29（約35kD）は赤色である。スポット51(28kD)は、矛盾なく腫瘍において大きい。幾つかの実験について、該腫瘍は大きなスポットを与え、一方でしばしばこれはさほど大きくなく、このことは該タンパク質が可溶化し難いことを示唆している。スポット15(26kD)は、極めて一貫した差を示すが、該スポットはしばしばさほど大きくないので、順序付けを必要とする可能性がある。スポット53(24kD)は、関連のあるまたは関連性のない可能性のある他のスポットと幾分重複している。スポット56(20kD)は、実際にスポット対として現れ、該対は関連性があると思われる。というのは、そのサイズが相関していると考えられるからである。スポット57(10kD?)は赤色がかった、極めて低分子量のスポットである。該図のゲルの２対の底部において、極めて良好には出現しない。というのは、これが「染料フロント内(in the dye front)」の１ビットであるが、実際のゲル上では差異は明白であるからである。バレットと比較した、食道腺癌における最も興味深いスポット研究を、一次元分離の２つの異なる方法、即ち等電点電気泳動(IEFs)および固定化したpH勾配ゲル(IPGs)法を利用して実施した。我々は、まずIEFサンプルにおける最も一貫した差異として、５個のスポット(IEF5、IEFl5、IEF29、IEF31、 IEF51)を選抜した。ここで、我々は該食道腺癌以外の組織（バレット、胃粘膜、正常な食道）中には存在しないか、殆ど存在しないスポットを探究した。引き続き、IPGの研究において、該食道腺癌サンプルにおいてより大きな、６個（IPG29、IPG56、IPG57、IPG53、IPG51およびIPG15、最後の２つはそれぞれスポットIEF42およびIEF44と同等である）の極めて興味深いスポットを同定した。スポットIEF5、IEF29およびIEF31は、仮に該IPGゲル中にあるものと同定した。以下の表は、バレットと比較して、（ゲルの両方の型における）どのスポットが該食道腺癌において増大するかについてまとめた。”+”は明らかに増大したことを示し、”-”は差がないことを示し、また”?”は該当するスポットの評価が、通常は他の大きなスポットの存在のために、あるいはスポットIPG57の場合には該スポットが、該二次元ゲルの該染料フロント（底部）から十分に分離されていないために、困難であることを示す。患者ゲル IPG29 IPG56 IPG57 IPG53 IPG51 IPG15 IEF5 IEF29 IEF31 型 =IEF42 =IEF44 1Bal IPG ＋＋＋＋＋ − IEF ＋＋＋＋ − ＋ − − ＋ 2Ben IPG ＋＋＋ − − ＋ IEF ＋＋＋＋＋＋＋＋＋ 3Sta IPG ＋＋＋＋＋＋ IEF ＋＋＋＋＋＋＋＋＋ 4Rea IPG ＋＋＋＋＋ − IEF ＋＋＋＋＋＋？＋＋ 5Sco IPG ＋＋？ − ＋ − IEF − ＋＋ − − ＋ − ＋＋ 6Wil IPG ＋＋＋＋＋＋ IEF ＋＋＋＋＋＋＋ − ＋ 7Pal IPG − ＋＋ − − − IEF − ＋＋＋＋ − ＋ − ＋ 8Har IPG ＋＋？ − ＋＋ IEF ＋＋＋ − ＋ − − − − 9Bit IPG ＋＋＋＋ − ＋ IEF ＋＋＋＋ − ＋？？？患者ゲル IPG29 IPG56 IPG57 IPG53 IPG51 IPG15 IEF5 IEF29 IEF31 型 =IEF42 =IEF44 10Lab IPG ＋ − ＋＋＋ − IEF ＋ − ＋＋＋ − ？？？ 11Duc IPG ＋＋？ − ＋＋ IEF ？＋＋＋＋＋＋＋＋ 12Ray IEF − − ？ − ＋＋＋ − − 13Ril IEF ＋＋？＋＋＋＋＋＋分子量(kD) 37 19 10 26 25 27 57 42 33pH 4.7 4.3 4.6 6.4 6.2 5.9 4.4 6.1 5.7 スポット56は、実際に対として現れ、該対は関連性があると思われる。というのは、そのサイズが相関していると考えられるからである。実施例５：分泌されたタンパク質の分析分泌されたタンパク質のゲルを、正常な食道、胃粘膜、およびバレットについての、２名の新たな患者からの新鮮な組織片、並びに細胞を培養するのに使用した培地中にタンパク質を分離するコントロールゲルから調製した。培体のタンパク質（血清）と混合された「分泌タンパク質」のパターンが予想される。しかしながら、ここでは本研究が新鮮なサンプルを必要とする点で限界があり、従ってサンプル数は少数に制限する。これまでの結果は、正常な食道および胃粘膜に対して、バレットにおいて増大することが分かっている、109-111と番号付けした一群のスポットが、コントロールサンプルに比して、該バレットの「分泌されたタンパク質」サンプル中で非常に大きいということである。実施例６：配列決定配列決定および同定する必要のあるスポットが、全体として少なくとも約20個存在する。これらスポットは、該ゲルから溶出され、かつ配列決定分析に付される。上記の多数の有力なマーカーの評価された等電点(pI)および分子量を基にした、該多数のマーカーは、そのN-末端配列に関して更に特徴付けられている。この情報は、タンパク質データベースとのマッチングに基づいて、該タンパク質の幾つかの同定並びに他のものに関する新規な配列の決定に導いた。データを以下に示す。配列決定されたスポット 101，MW 52kD，pH5.8，サイトケラチン８，開裂。配列T?GPRAF??Rに基づく。 111，MW 50kD，pH6.2，アルブミン，開裂。 109-111は一連の関連したスポットである。配列に基づいて、開裂されたアルブミンとして11個が同定された。 120，MW 25kD，pH5.8，アルブミン，開裂。また、配列DAHKSEVに基づけば、開裂された血清アルブミンであるとも考えられる。 124，MW 19kD，pH5.6，多分コラーゲンと関連している。配列XXAPLTATAP。データベースとのマッチングはないが、APLTATはコラーゲンの一部と一致する。 29(IPG)，MW37kD，pH4.7，ヒトHS72またはHS7C，開裂。配列GSTRIPKIQKLLQD。これは開裂されたヒトHS72またはHS7Cである。 42，MW25kD，pH6.2，アクチンキャップタンパク質，開裂。配列QVKGKKNIRATEを与え、これは開裂されたアクチンキャップタンパク質である。 53(IPG)，MW 26kD，pH6.4，トリオースホスフェートイソメラーゼ，開裂。配列GNWKMNQR（および少数配列VGGNWKMN）に基づけば、トリオースホスフェートイソメラーゼであると考えられる。 56(IPG)，MW 19kD，pH4.3，配列について何れも一致しない。配列(ASQ)VFV(FG)RM?MKを与えるが、該データベースでは、何れにもマッチングせず、従って新規であると考えられる。 14，MW 50kD，pH5.8，モエシンまたはエズリン。 (LHD)-MGNHELYMなる配列に基づく、モエシンまたはエズリンの内部配列。 139，MW 20kD，pH4.4，アミロイドβ(A4)類似体２先駆体。配列MYPELQV(?)Dに基づく、開裂されたアミロイドβ(A4)類似体２先駆体であり得る。 157，MW 52kD，pH4.2，配列について何れも一致しない。配列K(?)HKGE(?)N(?)LLRAQP(小)ELを与えるが、該データベースでは、この配列とマッチングするものは存在しない。 164-166，MW 46kD，pH4.4，ビメチン(Vimetin),開裂。一連の関連するスポット。配列SSVPGVRLLQに基づく、開裂されたビメチンであると思われる。 92，MW 5kD，pH5.1，恐らくサイトケラチン17 アミノ酸解析に基づけば、これはサイトケラチン17であると考えられる。配列解析はXTXILKFTLの弱いシグナルを与え、またckl7はN-末端配列TTSIRQFTSSを有し、その幾つかをラインアップする。 143，MW 56kD，pH5.6，多分グルタチオンシンセターゼ。恐らくグルタチオンシンセターゼであろうが、アミノ酸解析の結果は確信するに十分な程に強力ではない。実施例７：抗体生産実施例６におけるように、該ゲルから溶出されたタンパク質、またはそのペプチドフラグメントは、抗体生産用の免疫原として使用できる。該抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体何れであってもよい。該抗体は、当業者には公知の方法によって製造する。該抗体の抗原−結合フラグメントは、当業者には公知の方法によって製造する。極めて高いアフィニティーおよび特異性をもつ抗体または抗体フラグメントは、食道癌のマーカーに関する免疫学的テストの目的で使用することができる。極めて高いアフィニティーおよび特異性をもつ抗体または抗体フラグメントを使用して、体液を、上記の同定されたタンパク質の存在につきテストする。テストされる体液は、血液または血清、尿、唾液、涙液またはその他の体液であり得る。該イムノアッセイは、当業者には公知の任意の型のアッセイであり得る。該アッセイは均一または不均一何れであってもよい。該アッセイは、自動化装置と共に使用でき、あるいは低級の技術環境で機能させることも可能である。このようなテストは、上記の重度の疾患の診断に役立つ、簡単かつ迅速なテストを提供する。実施例８：インビボでの用途実施例７において調製した該抗体または抗体フラグメントを、放射性標識と結合して、患者に注入することができる。適当な撮像技術を利用して、該放射能結合抗体の使用により、腫瘍を局在化することができる。該抗体に結合した放射能の量が著しく高い場合、あるいは該抗体または抗体フラグメントを毒素と結合した場合には、該複合体はインビボで腫瘍細胞を殺すのに利用できる。該抗体またはフラグメントは、ターゲット機能を与え、該毒素または放射能は該抗体により目標として定められた細胞を殺害する。実施例９：遺伝子療法本発明の方法により同定された腫瘍特異的タンパク質に対応する遺伝子は、当業者には公知の技術によって単離し、かつ同定することができる。次いで、該遺伝子を、分子生物学的技術によって不活性化し、遺伝子療法により身体内で置換できる。あるいはまた、アンチセンス(anti-sense)分子を該腫瘍特異的マーカーの遺伝子として作成して、該アンチセンス分子を治療薬物として使用することができる。当業者には公知の上記方法の何れかにより、該腫瘍特異的遺伝子の発現を減じる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年５月１８日（１９９８．５．１８）【補正内容】請求の範囲 1. 2Dゲル解析により決定された、正常な食道組織に比して、食道腫瘍において過度に発現された単離ヒト蛋白質であって、該タンパク質が、IPG29、IPG56、IP G57、IPG53、IPG51．IPG15、IEF5、IEF15、IEF29、IEF31およびIEF51からなる群から選ばれた、単離ヒトタンパク質。 2. 請求項１に記載のタンパク質と特異的に結合する、抗体または抗原結合フラグメント。 3. 食道癌の進行を診断または追跡する方法であって、 1) 患者由来のサンプル中の少なくとも１種のタンパク質の量を測定する工程と、ここで該タンパク質は正常な食道組織に比して、食道腫瘍において過度に発現されており、また該タンパク質が、IPG29、IPG56、IPG57、IPG53、IPG51，IPG 15、IEF5、IEF15、IEF29、IEF31およびIEF51からなる群から選ばれたものであり、 2) 該タンパク質の量と、該疾患の存在または段階とを相関付ける工程と、を含むことを特徴とする上記方法。 4. 該測定工程が免疫学的アッセイを含む請求項３に記載の方法。 5. 請求項１に記載のタンパク質をコードする単離した遺伝子。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ビーアデビッドジーアメリカ合衆国ミシガン州 48109― 0752 アンアーバーシンプソンドライブ 101 ユニバーシティオブミシガンコンプリヘンジブキャンサーセンター (72)発明者クイックロークアメリカ合衆国ミシガン州 48109― 0752 アンアーバーシンプソンドライブ 101 ユニバーシティオブミシガンコンプリヘンジブキャンサーセンター (72)発明者ヒンデラーロバートアメリカ合衆国ミシガン州 48109― 0752 アンアーバーシンプソンドライブ 101 ユニバーシティオブミシガンコンプリヘンジブキャンサーセンター

Claims

【特許請求の範囲】 1. 2Dゲル解析により決定された、正常な食道組織に比して、食道腫瘍において過度に発現された、単離ヒトタンパク質。 2. IPG29、IPG56、IPG57、IPG53、IPG51、IPG15、IEF5、IEF15、IEF29、IEF31 およびIEF51からなる群から選ばれる、請求の範囲第１項に記載のタンパク質。 3. 請求の範囲第１項に記載のタンパク質と特異的に結合する、抗体または抗原結合フラグメント。 4. 食道癌の進行を診断または追跡する方法であって、 1) 患者由来のサンプル中の少なくとも１種のタンパク質の量を測定する工程と、ここで該タンパク質は正常な食道組織に比して、食道腫瘍において過度に発現されており、 2) 該タンパク質の量と、該疾患の存在または段階とを相関付ける工程と、を含むことを特徴とする上記方法。 5. 該測定工程が免疫学的アッセイを含む請求の範囲第４項に記載の方法。 6. 該測定工程が2-Dゲル電気泳動を含む請求の範囲第４項に記載の方法。 7. 請求の範囲第１項に記載のタンパク質をコードする単離した遺伝子。