JP2000511541A - リポソームアンチセンス送達の効果の増強 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 宿主中のＩＣＡＭ−１の過剰発現に関連する病状の治療のための薬剤組成物。これらの薬剤組成物は、典型的にはリポソームまたは脂質粒子である脂質混合物中にカプセル化されたＩＣＡＭ−１アンチセンス分子の有効量を含む。脂質混合物は典型的には、リン脂質、ステロールおよび陽イオン性脂質よりなる群から選択される少なくとも２つのメンバーを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 リポソームアンチセンス送達の効果の増強発明の背景 オリゴヌクレオチドによるタンパク質発現の阻害に基づく治療薬の開発を目的 とした研究は、多くの限界に遭遇している。多くの型の細胞でアンチセンス分子 の細胞内送達の率が低いことが、インビトロで証明されている。アンチセンス分 子は、細胞の細胞質と核内に局在するｍＲＮＡ標的部位に結合するように設計さ れるため、これは重要な問題である。インビトロ試験はまた、多くのオリゴヌク レオチドが循環流中から急速に除去されることを示した；すなわち、アンチセン ス分子が標的細胞と相互作用する時間は限定されている。さらに多くの研究で、 オリゴヌクレオチドはインビボで投与すると非常に毒性が強いことが証明されて いる。 遊離のアンチセンスの多くの限界（例えば、毒性およびヌクレアーゼ消化）は 、アンチセンス分子をリポソーム中にカプセル化することにより克服できる可能 性がある。比較的小さい粒子（直径約１００nm）として作成した時、リポソーム は、再構成された脈管系内を移動して炎症部位に受動的に蓄積する。リポソーム または脂質複合体は、２つの機構（エンドサイトーシスによる細胞のリポソーム 摂取、および陽イオン性リポソームと標的細胞膜との融合）を介して細胞内にオ リゴヌクレオチドを送達する能力を有することが、多くの試験で決定されている 。 遊離のおよびカプセル化されたオリゴヌクレオチドの比較は、リポソームがヌ クレアーゼ消化を防ぐため、カプセル化されたオリゴのインビトロにおける安定 性の向上を示している。これに対して、ホスホロチオエートオリゴはそれ自身が ヌクレアーゼ耐性であるため、遊離のおよびカプセル化されたホスホロチオエー トオリゴヌクレオチドの比較では、通常安定性の向上はない。すなわち、遊離の ホスホロチオエートであってもカプセル化されたホスホジエステルオリゴヌクレ オチドであっても、同じ量のオリゴヌクレオチドが細胞に送達される可能性があ る。ワング（Wang）た、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：３３１ ８−３３２２（１９９５）。このような研究にもかかわらず、従来の中性のリポ ソーム（例えば、ホスファチジルコリン／コレステロール）がエンドソームを破 壊して、その内容物を細胞質内に放出することを示す証拠は提示されていない。 この問題に対する１つのアプローチは、腸イオン性脂質小胞を利用する。これ らの陽イオン性脂質小胞はＤＮＡ（プラスミドおよびオリゴヌクレオチドを含む ）と「複合体」を形成する。これらの複合体はリポソーム（すなわち、水性スペ ースをカプセル化している完全な二重層）ではなく、陽イオン性脂質と陰イオン 性の核酸の間の静電的引力により引きあう脂質とＤＮＡの凝集物である。最近の 文献では、陽イオン性脂質がフソゲニック因子（fusogenic factor)（例えば、 ホスファチジルエタノールアミンまたは融合タンパク質）と会合した複合体が、 有意なアンチセンス作用または遺伝子トランスフェクションを行うのに必要であ ることを示している。ファーフッド（Farhood）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐ ｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２３５：２８９−２９５（１９９５）；フェルグナー（Fe lgner）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０−２５６１（１９９４ ）；およびウロベル（Wrobel）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ．１２３５：２９６−３０４（１９９５）。 サルにアンチセンスオリゴヌクレオチドを静脈内投与したさらに別の研究は、 この方法では少し毒性が見られることを示した（ガルブレイス（Galbraith）ら 、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．４：２０１−２０６（１９９４）およ びコーニッシュ（Cornish）ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．３：２ ３９−２４７（１９９３）を参照）。観察された毒性の最も可能性の高い原因は 、Ｃ３とＣ５の血管作動性切断産物であるそれぞれＣ３ａとＣ５ａを放出する、 補体系の活性化である。この点で、ＤＮＡとＲＮＡはいずれも種々のインビトロ 測定系で補体を活性化することが証明されている。 補体系は、血液中に入った外来粒子に対する最初の防御線の１つとして作用す る複数のタンパク質からなるカスケードである。補体が外来粒子を攻撃する２つ の基本的な機構は、オプソニン化と細胞溶解である。オプソニン化では、補体断 片（主にＣ３ｂとｉＣ３ｂ）が粒子または細胞の表面に共有結合し、次にこれが 、マクロファージ上に存在する対応する受容体により認識される。細胞溶解では 、複数のタンパク質からなる複合体であるＣ５ｂ−９が集合して、これが細胞膜 を破って穴を開ける。 アンチセンスオリゴヌクレオチドの送達システムとしての中性のリン脂質小胞 （リポソーム）の使用に関する研究は、あまり公表されていない（例えば、ジュ リアノ（Juliano）ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｄｅｖｅ ｌｏｐｍｅｎｔ ２：１６５−１７６（１９９２）を参照）。オリゴヌクレオチ ドは通常１５〜２５塩基の長さであり、高度に荷電している（すなわち、これは 受動的拡散により膜を通過することができない）。アンチセンス薬剤の標的部位 は細胞質または核であり、従って原形質膜が有効なバリアーとして作用する。こ れにもかかわらず、いくつかの遊離のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、イン ビトロおよびインビボで活性があることが証明されており（ジュリアノ（Julian o）ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２：１６５−１７６（１９９２）；ベネット（Bennett）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ ｏｌ．１５２：３５３０−３５４０（１９９４）；ベネット（Bennett）ら、Ａ ｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２８：１−４３（１９９４）；およびステプコウス キー（Stepkowski）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：５３３６−５３４６（１ ９９４）を参照）、さらに、オリゴヌクレオチドの受容体介在摂取機構が関与し ているといういくつかの証拠がある。標的細胞または組織がアンチセンス分子を エンドサイトーシスする能力を示しても、このプロセスは非効率的であり、生物 学的有効性は通常非常に高濃度でのみ観察される。これはおそらく、エンドサイ トーシス後であっても、非常にまれに存在するサソソーム酵素により分解される 前に、ヌクレオチドはエンドソーム膜を通過して細胞質に到達する必要があるた めであろう。抗ＩＣＡＭ−１の場合は、遊離のオリゴヌクレオチドは培養内皮細 胞を貫通できないようであるが、陽イオン性脂質／ホスファチジルエタノールア ミン（ＰＥ）複合体と複合体を形成すると、広範な摂取が観察される。このよう な陽イオン性脂質／ＰＥ複合体は細胞内エンドソームを破壊し、核酸を細胞質内 に送達することが知られている。いったん細胞質内に入ると、アンチセンスオリ ゴヌクレオチドは急速に核中に拡散し（シクソウ（Sixou）ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉ ｄｓ Ｒｅｓ．２２：６６２−６６８（１９９４））、これは、オリゴヌクレオ チドと脂質の凝集物または複合体により送達される抗ＩＣＡＭ−１についても観 察される（ベネット（Bennett）ら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：１０ ２３−１０３３（１９９２）を参照）。前述のように、これらの後者の複合体ま たは凝集物はリポソーム製剤ではなく、複合体の作製のためにカプセル化法を使 用しない。さらに、複合体（カプセル化されていないオリゴヌクレオチド系）は 、エンドソームを破壊することは証明されておらず、従ってインビトロ試験でオ リゴヌクレオチドの細胞内送達を示すのみである。 インビボでの安定性を増強し膜透過性を増強するために、オリゴヌクレオチド の構造に対して広範な修飾が行われている。例えば、リン酸骨格中で酸素原子が イオウにより置換されている前述のホスホロチオエートは、ヌクレアーゼに対す る耐性が上昇しており、通常のホスホジエステルオリゴヌクレオチドよりヌクレ アーゼに対して耐性が増加しており、インビボでより安定である（ジュリアノ（ Juliano）ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍ ｅｎｔ ２：１６５−１７６（１９９２））。もう１つの例は核酸メチルホスホ ネートであり、これはヌクレアーゼに対して耐性であるばかりでなく、ホスホジ エステルの疎水性類似体であり、従って膜透過性が高いと予測される（ヒューズ （Hughes）ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８３：５９７−６００（１９９４）お よびタリ（Tari）ら、Ｂｌｏｏｄ ８４：６０１−６０７（１９９４）を参照） 。これらの進展にもかかわらず、主に、治療薬を標的組織中の細胞に移動させる ことが難しく、また補体活性化のような毒性の副作用があり投与が限定されるた め、アンチセンスオリゴヌクレオチド療法の進展は遅い。 アンチセンス療法の魅力的な標的は、細胞内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、 血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）、および内皮細胞白血球接着分子−１（ ＥＬＡＭ−１）をコードする核酸である。ＩＣＡＭ−１は、白血球の血管外移動 とＴ細胞への抗原提示に関与する９０〜１１０kDaの膜糖タンパク質である（オ ズボーン（Osborn）、Ｃｅｌｌ ５６：９０７−９１０（１９９０）およびスプ リンガー（Springer）、Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）３４６：４２５−４４３（１ ９９０）を参照）。ＩＣＡＭ−１は、通常内皮細胞、ケラチン細胞、繊維芽細胞 および白血球上に低レベルで発現されている。ＩＣＡＭ−１の発現は、多くのサ イトカイン（ＩＬ−１β、腫瘍壊死因子−αおよびインターフェロン−γを含む ）により誘導される。ＩＣＡＭ−１の発現の増加は、多くのヒトの疾患で証明さ れており、また疾患組織の白血球浸潤に相関することが証明されている。 当該分野で必要とされるのは、細胞接着分子の発現を阻害することを目指した アンチセンス分子の送達のための新しい組成物と方法である。このような組成物 は、アンチセンス分子の血清安定性を向上させ、補体活性化のような毒性の副作 用を低下させるはずである。驚くべきことに、本発明はそのような組成物と方法 を提供する。発明の要約 本発明は、宿主中の細胞接着分子（例えば、ＩＣＡＭ−１）の過剰発現に関連 する病状の治療のための薬剤組成物を提供する。これらの薬剤組成物は、典型的 にはリポソームまたは脂質粒子である脂質混合物中にカプセル化されたＩＣＡＭ −１アンチセンス分子の有効量を含む。脂質混合物は典型的には、リン脂質、ス テロールおよび陽イオン性脂質よりなる群から選択される少なくとも２つのメン バーを含む。 １つの群の実施態様において、アンチセンス分子は、約１５〜５０核酸のホス ホロチオエート分子またはメチルホスホネート分子であり、ＩＣＡＭ−１の３’ 非翻訳領域の一部に相補的である。 脂質混合物がリポソーム組成物である実施態様において、リポソームは好まし くは、ホスファチジルコリンおよびコレステロールを含み、より好ましくは卵ホ スファチジルコリンとコレステロールを含む。脂質混合物が脂質粒子として存在 する実施態様において、粒子は好ましくは、リン脂質と陽イオン性脂質を含むで あろう。 さらに本発明は、宿主中のＩＣＡＭ−１の過剰発現に関連する病状の治療方法 を提供する。そのような病状には、アルツハイマー病、多発性硬化症、ブドウ膜 炎、ヘルペス角膜炎、腎同種移植拒絶反応、糸球体腎炎、肝同種移植拒絶反応、 ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、胆管炎、心臓同種移植拒絶反応、動脈硬化 性班、リウマチ様関節炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、乾癬、硬皮、移植片対 宿主反応、接触皮膚炎、扁平苔癬、固定薬疹、菌状息肉腫、および円形脱毛症が ある。図面の簡単な説明 図１は、カプセル化されたアンチセンスのスピンカラム溶出プロフィールを示 す。５０μｌのカプセル化されたアンチセンスを、１mlのバイオゲル（Biogel） Ａ１５ｍ（２００〜４００メッシュ）スピンカラムに添加し、分離した。脂質は リン酸分析（〇）により測定し、オリゴヌクレオチドはブライとダイア（B1igh and Dyer）抽出後にＡ₂₆₀を測定して検出した（●）。 図２は、精製したリポソームアンチセンス調製物を示す。リポソームでカプセ ル化されたアンチセンスは、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラムで「精製 した」。遊離アンチセンスの除去は、１mlのバイオゲル（Biogel）Ａ１５ｍカラ ムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーにより評価した。脂質はリン酸分析（ ○）により測定し、オリゴヌクレオチドはブライとダイア（Bligh and Dyer）抽 出後にＡ₂₆₀を測定して検出した（●）。 図３は、カプセル化されたアンチセンスの漏出の経時変化を示す。カプセル化 されたアンチセンスの漏出は、室温で１日（○）、３日間（■）、および５日間 （●）追跡した。 図４は、４℃でのカプセル化されたアンチセンスの漏出の経時変化を示す。カ プセル化されたアンチセンスの漏出は、室温で１日（○）、３日間（□）、およ び５日間（●）追跡した。 図５は、リポソームによる補体活性化を示す。補体活性化は、ＥＰＣ／ＣＨリ ポソーム調製物を使用して調べた。リポソームは１００±３０nmであった。脂質 組成は、モル比で表した。 図６は、ＩＣＲマウスの耳腫脹特性を示す。測定値は、ベースライン測定値（ 抗原刺激前）に対する耳の厚さの増加を示す。値は、２つの異なる実験について 示してある。誤差棒は、４匹のマウスの測定値の標準偏差を示す。 図７は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの耳腫脹特性を示す。測定値は、ベースライン測 定値（抗原刺激前）に対する耳の厚さの増加を示す。誤差棒は、４匹のマウスの 測定値の標準偏差を示す。 図８は、炎症の種々の時間間隔のＩＣＲマウスの耳におけるリポソーム蓄積を 示す。耳の炎症の開始後０時間、２４時間、４８時間目に、リポソームをマウス に注入した。リポソームを２４時間循環させた後、耳を回収し、消化し、放射能 標識脂質について分析した。誤差棒は、４匹のマウスの測定値の標準偏差を示す 。 図９は、炎症の種々の時間間隔のＢＡＬＢ／ｃマウスの耳におけるリポソーム 蓄積を示す。耳の炎症の開始後０時間、２４時間、４８時間目に、リポソームを マウスに注入した。リポソームを２４時間循環させた後、耳を回収し、消化し、 放射能標識脂質について分析した。誤差棒は、４匹のマウスの測定値の標準偏差 を示す。 図１０は、炎症の間のＩＣＲマウスの耳におけるＭＰＯレベルを示す。炎症の 開始後種々の時間で、炎症した耳（■）と対照耳（●）を回収し、ホモジナイズ し、ＭＰＯ活性について測定した。誤差棒は、４匹のマウスの測定値の標準偏差 を示す。 図１１は、炎症中のＩＣＲマウスの炎症を起こした耳への細胞の浸潤を示す。 骨髄細胞と循環白血球を、炎症の開始の２４時間前に標識した。炎症の開始後種 々の時間に、リポソームを回収し、消化し、液体シンチレーション計測により、 放射能標識された細胞について分析した。誤差棒は、４匹のマウスの測定値の標 準偏差を示す。 図１２は、ＩＣＲマウスを使用した典型的な炎症実験を示す。以下のパラメー タを測定した：耳の腫脹（△）；炎症を起こした耳（●）と炎症を起こしていな い耳（■）におけるリポソーム蓄積；および細胞浸潤（〇）。 図１３は、炎症の最初の２４時間のＩＣＲマウスの耳における９ポソーム蓄積 を示す。耳の炎症の開始直後に、ＤＳＰＣ：ＣＨリポソームをマウスに注入した 。種々の時間に、マウスを屠殺し、耳を回収し、分析した（炎症を起こした耳（ ●）と炎症を起こしていない耳（■））。誤差棒は、４匹のマウスの測定値の標 準偏差を示す。 図１４は、［³Ｈ］−アンチセンスとリポソームでカプセル化された［³Ｈ］− アンチセンスの循環クリアランス速度を示す。 図１５は、遊離の［³Ｈ］−アンチセンス（Ｉｓｉｓ２３０２）の組織生体分 布を示す。 図１６は、リポソームでカプセル化されたアンチセンス製剤の脂質とアンチセ ンス部分の両方の組織生体分布プロフィールを示す。 図１７は、耳の炎症を阻害する遊離のアンチセンスの能力を示す。 図１８は、マウスの耳の炎症を低下させる、遊離およびカプセル化されたＩＣ ＡＭ−１アンチセンス製剤の効果を示す。 図１９は、遊離およびカプセル化されたアンチセンスで処理したマウスにおけ る浮腫形成（耳の重量に基づく）を示すグラフである。発明の詳細な説明 略語と定義 本明細書で使用される略語は以下の意味を有する：ｉ．ｖ．、静脈内；ＤＣ− Ｃｈｏｌ、３β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル） コレステロール（ガオ（Gao）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．１７９：２８０−２８５（１９９１）を参照）；ＤＤＡＢ、Ｎ，Ｎ− ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド；ＤＭＲＩＥ、Ｎ−（１ ，２−ジミリスチルオキシプロピ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロ キシエチルアンモニウムブロミド；ＤＯＤＡＣ、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ− ジメチルアンモニウムクロリド（本出願人によるＵＳＳＮ ０８／３１６，３９ ９号を参照、これは参考のため本明細書に組み込まれる）；ＤＯＧＳ、ジオクタ デシルアミドグリシルカルボキシスペルミン；ＤＯＰＥ、１，２−ｓｎ−ジオレ イルホスファチジルエタノールアミン；ＤＯＳＰＡ、Ｎ−（１−（２，３−ジオ レイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル） −Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロ酢酸；ＤＯＴＡＰ、Ｎ−（（２， ３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムク ロリド；ＤＯＴＭＡ、Ｎ−（（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド；ＥＰＣ、卵ホスファチジルコリン；Ｒ Ｔ、室温；ヘペス、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスル ホン酸；ＨＢＳ、ヘペス緩衝化食塩水（１５０mM ＮａＣｌと２０mMヘペス）； ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ₂₀、１−Ｏ−（２’−ω−メトキシポリエチレングリコール ）スクシノイル）−２−Ｎ−アラキドイル−スフィンゴシン；ＰＥＧ−Ｃｅｒ− Ｃ₁₄、１−Ｏ−（２’−ω−メトキシポリエチレングリコール）スクシノイル） −２−Ｎ−ミリストイル−スフィンゴシン；ＰＢＳ、リン酸緩衝化生理食塩水； ＥＧＴＡ、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）−四酢酸；ＯＧＰ、ｎ−オ クチルβ−Ｄ−グリコプラノシド（シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）、 セントルイス、ミズーリ州）；ＰＯＰＣ、パルミトイルオレオイルホスファチジ ルコリン（ノーザンリピッズ（Northern Lipids）、バンクーバー、ブリティッ シュコロンビア）；ＱＥＬＳ、準弾性光散乱；ＴＢＥ、２mM ＥＤＴＡを含有す る８９mMトリスホウ酸；およびＥＤＴＡ、エチレンジアミン四酢酸（フィッシャ ーサネンティフック（Fisher Scientific）、フェアローン（Fair Lawn）、ニュ ージャージー州）；ＲＥＳ、網内系；ＳＰＤＰ、Ｎ−スクシニミジル３−（２− ピリジルジチオ）プロピオン酸；ＤＴＴ、ジチオスレイトール；ＮＥＭ、Ｎ−エ チルマレイミド；Ｃｈｏｌ、コレステロール；ＤＭＰＣ、１，２−ｓｎ−ジミリ ストイルホスファチジルコリン；ＤＳＰＣ、１，２−ｓｎ−ジステアロイルホス ファチジルコリン；ＥＤＴＡ、エチレンジアミン四酢酸；ＭＬＶ、多重膜小胞； ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、ポリ（エチレングリコール）−修飾ジステアロイルホスファ チジルエタノールアミン；ＬＵＶ、大きい単一膜小胞；ｓｕＶ、小さい単一膜小 胞；ＰＥＧ、ポリ（エチレングリコール）；³Ｈ−ＣＨＥ、³Ｈ−コレステリルヘ キサデシルエーテル。 「オリゴヌクレオチド」という用語は、５’から３’末端に読んだデオキシリ ボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の１本鎖または２本鎖ポリマーを意 味する。これは、自己複製プラスミド、ＤＮＡまたはＲＮＡの感染性ポリマーお よび非機能性ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。オジゴヌクレオチドを意味するために 使用される時、「ホスホロチオエート」および「メチルホスホネート」という用 語は、ヌクレオチド間結合の少なくとも１つの非ブリッジ酸素がそれぞれイオウ またはメチル基で置換されて、ホスホジエステルヌクレオチド間結合が修飾され ているオリゴヌクレオチドを意味する。好ましくは少なくとも１０％のヌクレオ チド間結合が修飾され、より好ましくは少なくとも３０％の結合が修飾される。 最も好ましくは少なくとも５０％の結合が修飾される。 「相補的」という用語は、１つの核酸が別の核酸に選択的にハイブリダイズす ることを意味する。全体の特異性の欠如より選択的なハイブリダイゼーション（ または、塩基対合）が起きる時、ハイブリダイゼーションの選択性が存在する。 典型的には、少なくとも１４〜２５ヌクレオチドの区間にわたって少なくとも約 ５５％の対になった塩基がある時、好ましくは約６５％、より好ましくは少なく とも約７５％、および最も好ましくは少なくとも約９０％の対になった塩基があ る時、選択的ハイブリダイゼーションが起きる。カネヒサ（M．Kanehisa）、Ｎ ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２：２０３（１９８４）を参照されたい （参考のため本明細書に組み込まれる）。 「脂質」という用語は、脂質物質の疎水性部分が二重層の方を向き、親水性部 分が水層の方を向くように、二重層を形成することができる脂肪酸誘導体を意味 する。親水性は、ホスファト、カルボキシル、スルファト、アミノ、スルフヒド リル、ニトロ、および他の類似の基に由来する。疎水性は、長鎖飽和および非飽 和脂肪族炭化水素基および１つまたはそれ以上の芳香族、脂環式または複素環基 により置換された基を含む（しかし、これらに限定されない）基を含むことによ り付与される。好適な脂質は、ホスホグジセジド類とスフィンゴ脂質類であり、 これらの代表例には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン 、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシドール、ホスファチジル酸、パ ルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、リソ ホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオ レオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンまたはジ リノレオイルホスファチジルコリンが使用できる。リンが欠如した他の化合物、 例えばスフィンゴ脂質およびグリコスフィンゴ脂質ファミリーはまた、脂質と呼 ぶ群内にある。さらに上記の両親媒性脂質は、他の脂質（トリグリセリド類およ びステロール類を含む）と混合してもよい。 「陽イオン性脂質」という用語は、生物学的ｐＨで真の正の電荷を有する多く の脂質種の任意のものを意味する。このような脂質には、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭ Ａ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−ＣｈｏｌおよびＤＭＲＩＥがあるが、これら に限定されない。さらに本発明で使用できる多くの市販の陽イオン性脂質が利用 できる。これらには、例えばリポフェクチン（LIPOFECTIN）（登録商標）（ＤＯ ＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む市販の腸イオン性リポソームであり、ギブコ／ビー アールエル（GIBCO/BRL）（グランドアイランド、ニューヨーク州、アメリカ合 衆国）から入手できる）；リポフェクタミン（LIPOFECTAMINE）（登録商標）（ ＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む市販の陽イオン性リポソームであり、ギブコ／ ビーアールエル（GIBCO/BRL）から入手できる）；およびトランスフェクタム（T RANSFECTAM）（登録商標）（ＤＯＧＳを含む市販の陽イオン性リポソームであり 、プロメガ社（Promega Corp.）（マジソン、ウィスコンシン州、アメリカ合衆 国）から入手できる）がある。 本明細書において「ＩＣＡＭ−１の過剰発現に関連した病状」という用語は、 中枢神経系（例えば、アルツハイマー病および多発性硬化症）、月（例えば、ブ ドウ膜炎およびヘルペス角膜炎）、腎臓（例えば、腎同種移植拒絶反応および糸 球体腎炎）、肝臓（例えば、肝同種移植拒絶反応、ウイルス性肝炎、アルコール 性肝炎、胆管炎）、心臓（例えば、心臓同種移植拒絶反応および動脈硬化性班） 、骨（例えば、リウマチ様関節炎）、甲状腺（例えば、グレーブス病および橋本 甲状腺炎）、および皮膚（例えば、乾癬、硬皮、移植片対宿主反応、接触皮膚炎 、扁平苔癬、固定薬疹、菌状息肉腫、および用形脱毛症）の疾患を含む。 本明細書において「宿主」という用語は、ヒト、ラット、マウス、犬、ウシ、 ヒツジ、ウマ、ネコおよびヤギを意味する。実施態様の説明 本発明は、リポソームまたは脂質粒子組成物中にカプセル化されたアンチセン ス分子は、ＩＣＡＭ−１の過剰発現に応答して炎症部位に送達され、こうして関 連する炎症を低下させることができるという、驚くべき発見から得られる。陽イ オン性リポソーム製剤またはフソゲニック（fusogenic）脂質またはタンパク質 が、細胞またはエンドソーム融合に必要であるという従来の考え方を考慮すると 、電荷が中性の脂質やステロール（例えば、コレステロール）から基本的に構成 されるリポソーム製剤がアンチセンス送達に有効であるということは、特に驚く べきことである。 従って本発明は、細胞接着分子（好ましくはＩＣＡＭ−１）の過剰発現に関連 する症状の治療のための薬剤組成物を提供する。これらの組成物は、脂質混合物 中にカプセル化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。脂質混合物は、 ２つの型のいずれでもよい。第１は通常のリポソームであり、これは好ましくは 電荷が中性であり、基本的に中性のジン脂質とステロール（例えば、コレステロ ール）から構成され、アンチセンス分子で受動的に充填することができる。第２ の型は、リン脂質、陽イオン性脂質、ステロールおよびこれらの組合せを含む脂 質粒子である。 最近他の研究者らは、ＩＣＡＭ−１アンチセンス分子の送達のためのＮ−（（ ２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム クロリド（ＤＯＴＭＡ）の陽イオン性リポソーム調製物を記載している（ベネッ ト（Bennett）ら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：１０２３−１０３３（ １９９２）を参照）。ベネット（Bennett）らが使用したこの調製物は、２５０n mのリポソームを形成した、ＤＯＴＭＡとジオレオイルホスファチジルエタノー ルアミンの１：１混合物である。これらの系は、カプセル化されていないアンチ センス分子の複合体を提供した。さらにこれらの系は、インビボでエンドソーム を破壊しないため、細胞内送達のためにインビトロでのみ有用である。アンチセンスオリゴヌクレオチド 本発明において有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＥＬＡＭ−１（ヒ ト）、ＶＣＡＭ−１（ヒト）およびＩＣＡＭ−１（ヒトとマウス）（これらは、 それぞれ配列番号１、３、５、および７に提供される）のような細胞接着分子を コードする、哺乳動物の核酸の一部に対して相補的なオリゴヌクレオチドである 。 ＥＬＡＭ−１は、膜糖タンパク質の選択的ファミリーのメンバーである１１５ kDaの糖タンパク質である（ベビラクア（Bevilacqua）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２ ４３：１１６０−１１６５（１９８９）を参照）。ＥＬＡＭ−１のアミノ末端領 域は、レクチン様タンパク質のメンバーに対して相同的な配列を含有し、次に上 皮増殖因子と類似のドメインが続き、次に補体受容体１と２に存在するものと類 似の６つのタンデムの６０アミノ酸繰り返しが続く。ＥＬＡＭ−１は、３．９kb のｍＲＮＡによりコードされる。ＥＬＡＭ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域は、 Ｅ ＬＡＭ−１発現の一過性に一致して、細胞性ｍＲＮＡの迅速なターンオーバーの 原因である、セバー（sever）配列モチーフＡＴＴＴＡを含有する。 ＥＬＡＭ−１は、限定された細胞分布を示し、血管内皮細胞上でのみ同定され ている。ＩＣＡＭ−１と向様にＥＬＡＭ−１は、腫瘍壊死因子、インターロイキ ン−１およびリンホトキシンを含む多くのサイトカイン、および細菌のリポ多糖 により誘導される。ＩＣＡＭ−１と異なり、ＥＬＡＭ−１は、ガンマインターフ ェロンには誘導されない。ヒトの臍帯内皮細胞中のＥＬＡＭ−１ ｍＲＮＡの誘 導と消失の動態は、細胞表面でのＥＬＡＭ−１の出現と消失に先行する。 ＶＣＡＭ−１は、３．２kbのｍＲＮＡによりコードされる１１０kDaの膜糖タ ンパク質である。これは、スプライシングを受けて６つまたは７つの免疫グロブ リンドメインを有する生成物を生成する単一コピー遺伝子によりコードされる（ オズボーン（Osborn）ら、Ｃｅｌｌ ５９：１２０３−１２１１（１９８９）を 参照）。ＣＤ２９に結合しＲａｍｏｓ細胞のＶＣＡＭ−１への接着を阻止するモ ノクローナル抗体により証明されるように、ＶＣＡＭ−１の受容体はＣＤ２９（ ＶＬＡ−４）であると提唱されている。ＶＣＡＭ−１は主に血管内皮細胞上で発 現されており、サイトカインによる処理によっても制御される（ライス（Rice） ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１３０３−１３０６（１９８９）およびライス（ Rice）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：１３６９−１３７４（１９９０）を参 照）。発現の増加は、ｍＲＮＡの誘導に帰因するようである。 ヒトＩＣＡＭ−１は、５５，２１９ダルトンのタンパク質を与える３．３kbの ｍＲＮＡによりコードされる。ＩＣＡＭ−１は、Ｎ−結合グリコシル化部位を介 して、高度のグリコシル化されている。この成熟タンパク質は、ゲル電気泳動で 測定すると見かけの分子量９０kDaを有する（スタウントン（Staunton）ら、Ｃ ｅｌｌ ５２：９２５−９３３（１９８８）を参照）。ＩＣＡＭ−１は、免疫グ ロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、アミノ末端に５つの免疫 グロブリン様ドメインを有し、次にトランスメンブランドメインと細胞質ドメイ ンが続く。第１の免疫グロブリン様ドメイン中に、ＬＦＡ−１とライノウイルス の主要な結合部位が存在する。しかしこの結合部位は、離れているようである。 ＩＣＡＭ−１は広い組織分布と細胞分布を示し、白血球、内皮細胞、繊維芽細 胞、ケラチン細胞および他の上皮細胞上に存在するようである。ＩＣＡＭ−１の 発現は、細菌性リポ多糖、サイトカイン（例えば、インターロイキン−１、腫瘍 壊死因子、ガンマインターフェロン、およびリンホトキシン）を用いる処理によ り、血管内皮細胞、繊維芽細胞、ケラチン細胞、星状細胞およびいくつかの細胞 株で制御することができる（例えば、フローマン（Frohman）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒ ｏｉｍｍｕｎｏｌ．２３：１１７−１２４（１９８９）を参照）。 好適な実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＩＣＡＭ −１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域に対して相補的であり、約１０〜約５０ヌクレ オチド、より好ましくは約１５〜約３０ヌクレオチドを含有する。特に好適な実 施態様において、アンチセンスオジゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートオリ ゴヌクレオチドまたはメチルホスホネートオリゴヌクレオチドである。ホスホロ チオエートオリゴヌクレオチド（ＰＳ−オリゴ）は、ヌクレオチド間結合のブリ ッジしていない酸素の１つがイオウで置換されているオリゴヌクレオチドである 。これらのＰＳ−オリゴはヌクレアーゼ分解に対して耐性であり、配列特異的活 性を保持している。同様にメチルホスホネートオリゴヌクレオチド（ＭｅＰ−オ リゴ）は、ヌクレオチド間結合のブリッジしていない酸素の１つがメチル基で置 換されているオリゴヌクレオチドである。これらのＭｅＰ−オリゴは、その天然 のホスホジエステル結合誘導体よりヌクレアーゼに対して耐性であることが証明 されている。ＩＣＡＭ−１ならびにＶＣＡＭ−１およびＥＬＡＭ−１の産生阻害 を目的とし、本発明において有用な多くのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、 ＰＣＴ出願に記載されている：ＰＣＴ／ＵＳ９１／０５２０９号、ＰＣＴ／ＵＳ ９４／０９０２６号、ＰＣＴ／ＵＳ９４／１２７９７号、およびＰＣＴ／ＵＳ９ ３／０８１０１号（これらは、参考のため本明細書に組み込まれる）。 本発明で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、固相または溶液中で 合成してもよい。一般的に固相合成が好ましい。亜燐酸−トリエステル、ホスホ トリエステル、およびＨ−ホスホネート化学によるオリゴヌクレオチドの固相合 成の詳細な説明は、広く入手できる（例えば、イタクラ（Itakura）、米国特許 第４，４０１，７９６号；カルサース（Caruthers）ら、米国特許第４，４５８ ，０６６号および４，５００，７０７号；ボカージ（Beaucage）ら、Ｔｅｔｒａ ｈ ｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−１８６２（１９８１）；マテウッチ （Matteucci）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５−３１９１ （１９８１）；カルサース(Caruthers)ら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ ｉｎｇ ４：１−１７（１９８２）：Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎ ｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ゲイト（Gait）（ 編）、アイアールエルプレス（IRL Press）、ワシントンディーシー（１９８４ ）中の、ジョーンズ（Jones）、第２章、アトキンソン（Atkinson）ら、第３章 、およびスプロート（Sproat）ら、第４章；フレーラー（Froehler）ら、Ｔｅｔ ｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２７：４６９−４７２（１９８６）：フレーラー （Froehler）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４ ０７（１９８６）；シンハ（Sinha）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２４：５８４３−５８４６（１９８３）；シンハ（Sinha）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃ ｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：４５３９−４５５７（１９８４）（これらは、参考のた め本明細書に組み込まれる）を参照されたい。 一般に、結合サイクル中で使用されるモノマー性ヌクレオチドの添加の時期と 濃度は、市販のＤＮＡ合成機で使用される市販のホスホラミダイトについて典型 的なプロトコールとは異ならないであろう。これらの場合には、市販の合成機（ 例えば、モデル３８０Ｂ、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems） 、フォスターシティ（Foster City）、カリホルニア州、アメリカ合衆国）の追 加のホスホラミダイト用のポート上の容器に、モノマーを含有する溶液を添加す るだけでよい。しかし、特定のモノマーの結合効率が他のホスホラミダイトより 実質的に低い場合、合成を最適化するために試薬の添加の時期または濃度を変化 させることが必要なことがある。低い結合効率を修正するためにオリゴヌクレオ チド合成を最適化するための手段は、当業者に公知である。一般的には添加する 試薬の濃度または試薬の量を単に増加させるだけで、より高い結合効率が達成さ れる。例えば５’−ヒドロキシル保護基がジメトキシトリチル（ＤＭＴ）の場合 は、ＤＭＴ基の酸性除去の間のＤＭＴ陽イオン濃度を測定することにより結合効 率は決定される。ＤＭＴ陽イオン濃度は、通常酸性洗浄液を分光学的に追跡する ことにより測定される。酸／ＤＭＴ溶液は、明るいオレンジ色である。あるいは 、結合が成功しなかったオリゴヌクレオチドのさらなる伸長はキャッピングによ り阻止されるため、例えばキャピラリー電気泳動またはＨＰＬＣを使用して、端 を切り取ったオリゴヌクレオチドと完全長オリゴヌクレオチドの比を比較するこ とにより、結合効率が推定できる。 固相オリゴヌクレオチド合成は、多くの固体支持体を使用して行われる。適当 な支持体は、合成されたオリゴヌクレオチド中で３’末端の塩基になる保護され たモノマーの付着のための官能基を提供するものである。支持体は、特定の合成 化学に使用される試薬に対して不活性でなければならない。適切な支持体は当業 者に公知である。固体支持体物質には、ポラクリロイルモルホリド、シリカ、調 節多孔ガラス（ＣＰＧ）、ポリスチレン、ポリスチレン／ラテックス、およびカ ルボキシ修飾テフロンがあるが、これらに限定されない。好適な支持体は、アミ ノ官能基化調節多孔ガラスおよびカルボキシル官能基化テフロンである。 固相オリゴヌクレオチド合成は、出発点として、固体支持体に結合した充分に 保護されたモノマー（例えば、保護されたヌクレオシド）を必要とする。この結 合は典型的には、３’−ヒドロキシルを介する。典型的には３’−ヒドロキシル の一方にリンカー基を共有結合し、他端で周体支持体に共有結合することが便利 である。次に第１の結合サイクルで、その３’リン酸を介して、３’−５’ホス ホジエステル結合を形成させる縮合反応により、ヌクレオチドモノマーを結合ヌ クレオシドの５’−ヒドロキシルに結合させる。以後の合成サイクルは、ヌクレ オチドモノマーを、最後の結合ヌクレオチドの５’−ヒドロキシルに付加する。 こうして３’から５’の方向にオリゴヌクレオチドが合成され、３’末端が固体 支持体に結合した「増殖する」オリゴヌクレオチドが生成する。 ヌクレオシドモノマーを固体支持体に結合させる多くの手段が当業者に公知で あるが、コハク酸塩またはヘミコハク酸塩を介して調節多孔ガラスに共有結合し たモノマーが一般に好ましい。ヘミコハク酸塩を介して調節多孔ガラスに結合し た通常の保護ヌクレオシドが、多くの供給元から販売されている（例えば、グレ ンリサーチ（Glen Research）、スターリング（Sterling）、バーモント州、ア メリカ合衆国；アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）、フォスタ ーシティ（Foster City）、カリホルニア州、アメリカ合衆国；およびファルマ シアエルケービー（Pharmacia LKB）、ピスカタウェイ（Piscataway）、ニュー ジャージー州、アメリカ合衆国）。 完全長オリゴヌクレオチドがいったん合成されると、オリゴヌクレオチドは使 用の前に脱保護され、固体支持体から切断される。切断と脱保護は、同時にまた は逐次的に起きてもよい。いくつかの保護基がオリゴヌクレオチドから除去され てから固体支持体から切断され、溶液中の切断されたオリゴヌクレオチドから他 の基が脱保護されるように、この２つの方法は連続していなくてもよい。この操 作の順序は、存在する特定のブロッキング基、周体支持体への特定の結合、およ び合成を行う個人の好みに依存する。切断の前に脱保護を行う場合は、固体支持 体に結合して残るオリゴヌクレオチドから保護基は洗い流される。逆に切断の後 に脱保護を行う場合は、除去された保護基はオリゴヌクレオチドとともに溶液中 に残る。オリゴヌクレオチドはしばしば、使用の前にこれらの保護基からの単離 を必要とするであろう。 好適な実施態様および多くの商業的ＤＮＡ合成において、５’−ヒドロキシル 上の保護基は合成の最後の段階で除去される。次にオジゴヌクレオチドは固体支 持体から切断され、残りの脱保護は溶液中で起きる。典型的には、次にヌクレオ チドモノマーに結合する前に末端５’−ヒドロキシル保護基を除去するために、 合成の間使用される試薬と同じ試薬で、５’−ヒドロキシル保護基が除去される 。５’−ヒドロキシル保護基がジメトキシトサチル基である時、脱保護は、酢酸 、ジクロロ酢酸およびトリクロロ酢酸で処理することにより行われる。 オリゴヌクレオチドがリボヌクレオチドであり２’−ヒドロキシル基がｔｅｒ ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）残基でブロックされる場合、大きい基 は合成の最後にテトラヒドロフラン中のフッ化テトラブチルアンモニウムを使用 して除去してもよい。ウー（Wu）ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：４７１７− ４７２４（１９９０）を参照されたい。フェノキシアセチル保護基は、アルコー ル中の無水アンモニアを用いて除去することができる（これらの条件下でＴＢＤ ＭＳ基は安定であり、オリゴヌクレオチドは切断されない）。シチジンのベンゾ イル保護基もまた、アルコール中の無水アンモニアを用いて除去される。 切断され充分に脱保護されたオリゴヌクレオチドは直接使用される（脱保護試 薬を除去するために凍結乾燥または溶媒を留去した後）か、または使用前に精製 される。脱保護工程で除去された保護基から、およびより重要なことは、次のヌ クレオチドモノマーと結合しなかったオリゴヌクレオチドが合成中でキャッピン グされた時に形成された端を切り取ったオリゴヌクレオチドから、完全長オリゴ ヌクレオチドを単離するために、一般に合成オリゴヌクレオチドの精製が必要で ある。 オリゴヌクレオチド精製技術は、当業者に公知である。その方法には、シリカ プレート上の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動、サイズ分画（ 例えば、セファデックスカラムを使用）、逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｈ ＰＬＣ）および陰イオン交換クロマトグラフィー（例えば、モノ−Ｑカラムを使 用、ファルマシアエルケービー（Pharmacia LKB）、ピスカタウェイ（Piscatawa y）、ニュージャージー州、アメリカ合衆国）があるが、これらに限定されない 。オリゴヌクレオチド精製の考察については、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ゲイト（ Gait）（編）、アイアールエルプレス（IRL Press）、ワシントンディーシー（ １９８４）中の、マクローリン（McLaughlin）ら、第５章、およびウー（Wu）ら 、第６章を参照されたい。 ＩＣＡＭ−１へのアンチセンス分子の送達ビヒクルとしてのリポソームの治療 活性を試験するために、アイエスアイエスファーマシューチカルズ（ISIS Pharm aceuticals）は、そのアンチセンス分子であるＩＳＩＳ２３０３（ヒト、配列番 号９）と３０８２（マウス、配列番号１０）をプロジェクトに寄付した。これら のオリゴヌクレオチドは、各ホスホジエステル結合がホスホロチオエートジエス テル結合である、ホスホロチオエート分子である。さらに各オリゴヌクレオチド は、ＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域中の配列に特異的に結合するよう に設計された２０ヌクレオチドから構成される。現在、このアンチセンス分子は ２つの可能な機構（ｍＲＮＡの安定性に必要なステムーループ構造の安定化の生 成の阻害、およびＲＮａｓｅ−Ｈ分解の増加を介する標的ｍＲＮＡの分解の増加 ）を介して、ＩＣＡＭ−１の発現を阻害するために、転写後に作用すると考えら れている。 アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する薬剤組成物の調製は、典型的には リポソーム内でのオリゴヌクレオチドのカプセル化、またはオリゴヌクレオチド が脂質混合物でコーティングされている脂質粒子の形成のいずれかを使用する。リポソームでカプセル化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド 本発明で使用されるリポソームは、標準的小胞形成性脂質から形成され、これ らは一般に、中性および陰性に荷電したリン脂質、好ましくは中性リン脂質、お よびステロール（例えば、コレステロール）を含む。脂質の選択は一般に、例え ばリポソームのサイズおよび血流中のリポソームの安定性を考慮して行われる。 典型的には、リポソーム中の主要な脂質成分はホスファチジルコリンである。 種々の鎖の長さと飽和度を有する種々のアシル鎖基を有するホスファチジルコジ ンが、利用できるか、または公知の技術により単離または合成される。特にフィ ルター滅菌の目的のためにサポソームのサイズを約０．３ミクロン以下にする必 要がある時、一般的にはあまり飽和していないホスファチジルコリンの方がサイ ズの調節が容易である。炭素鎖の長さがＣ₁₄〜Ｃ₂₂の範囲の飽和脂肪酸を含有す るホスファチジルコリンが好ましい。モノまたはジ飽和脂肪酸および飽和と非飽 和脂肪酸の混合物を有するホスファチジルコリンも使用することができる。他の 適切な脂質には、エステル結合ではなくエーテル結合を介してグリセロールに脂 肪酸が結合したホスホノ脂質がある。本発明において有用なリポソームはまた、 スフィンゴミエリン、またはコリン以外の頭部の基、例えばエタノールアミン、 セリン、グリセロールおよびイノシトールを有するジン脂質から構成されてもよ い。好適なリポソームは、ステロール（好ましくはコレステロール）をモル比０ ．１〜１．０（コレステロール：リン脂質）で含有する。最も好ましいリポソー ム組成物は、卵ホスファチジルコリン／コレステロール、ジステアロイルホスフ ァチジルコリン／コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン／コレ ステロール、およびスフィンゴミエリン／コレステロールである。リポソームの サイズの調節およびフィルター滅菌に使用される方法は、後述する。 リポソームは、現在公知であるかまたは以後リポソームの調製のために開発さ れる任意の方法により調製することができる。例えばリポソームは、多重膜脂質 小胞（ＭＬＶ）を調製するための通常の技術により、すなわちクロロホルム中に 脂質を溶解して適当な容器の内壁上に１つまたはそれ以上の選択された脂質を沈 積させて、次にクロロホルムを蒸発させ、次にカプセル化される水溶液を容器に 加え、水溶液で脂質を水和させ、そして得られる脂質懸濁液を回転またはボルテ ックス混合して、作成することができる。このプロセスにより、所望のリポソー ムを含む混合物が生成する。 あるいは大きい単一膜脂質小胞（ＬＵＶ）を製造するための方法、例えば逆相 蒸発、注入法、および界面活性剤希釈を使用して、リポソームを製造することが できる。脂質小胞を作成するためのこれらおよび他の方法の総説は、リポソーム 技術（Liposome Technology）、第１巻、グレゴリー・グレゴリアディス（Grego ry Gregoriadis）編、シーアールシープレス（CRC Press）、ボカラトン（Boca Raton）、フロリダ州（１９８４）（これは参考のため本明細書に組み込まれる ）中に記載されている。例えば、脂質含有粒子は、レンク（Lenk）ら、米国特許 第４，５２２，８０３号、およびファウンテン（Fountain）ら、米国特許第４， ５８８，５７８号と４，６１０，８６８号（これらの開示内容は、参考のため本 明細書に組み込まれる）に開示されたタイプの、ステロイド性脂質小胞、安定な 多重膜脂質小胞（ＳＰＬＶ）、単一相小胞（ＭＰＶ）、または脂質マトリックス 担体（ＬＭＣ）の型でもよい。ＬＵＶを調製するための特に好適な方法は、米国 特許第５，００８，０５０号に記載されている。 さらにＭＬＶの場合、必要であれば、捕捉容量と捕捉効率を上げるためにおよ び溶質のより均一な膜間分布を得るために、リポソームを複数（５回またはそれ 以上）の凍結−融解サイクルに付してもよい（メイヤー（Mayer）ら、Ｊ．Ｂｉ ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：８０２−８０８（１９８５））。 リポソーム調製後に、リポソームのサイズを調節して、所望のサイズ範囲とリ ポソームサイズの比較的狭い分布を達成する。好適な実施態様において、リポソ ームの直径は、約５０〜約１５０nm、より好ましくは約７５〜約１２５nmであろ う。 リポソームを所望のサイズに調節するためのいくつかの技術が利用できる。１ つのサイズ調節法は、米国特許第４，７３７，３２３号（参考のため本明細書に 組み込まれる）に記載されている。浴またはプローブ超音波処理のいずれかによ るリポソーム懸濁液を超音波処理することにより、サイズが徐々に低下して約０ ．０５ミクロン以下の小さい単一膜小胞（ＳＵＶ）になる。ホモジナイズは、大 きいリポソームを小さいリポソームに断片化するのに剪断エネルギーに依存する 別の方法である。典型的なホモジナイズ法では、多重膜小胞は、選択されたリポ ソームのサイズ（典型的には約０．１〜０．５ミクロン）が観察されるまで、標 準的エマルジョンを介して再循環される。両方の方法において、粒子サイズ分布 は、通常のレーザービーム粒子サイズ測定により追跡することができる。 小孔のポリカーボネート膜または非対称セラミック膜からリポソームを押し出 す方法もまた、リポソームサイズを比較的明確なサイズ分布に低下させるのに有 効な方法である（米国特許第５，００８，０５０号、およびホープ（Hope）ら、 リポソーム技術（Liposome Technology）、第１巻、第２版（ジー・グレゴリア ディス（G．Gregoriadis）編）、シーアールシープレス（CRC Press）、１２３ −１３９頁（１９９２）、この開示内容は参考のため本明細書に組み込まれる） 。典型的には、所望のリポソームサイズ分布が得られるまで、懸濁液を膜に１回 またはそれ以上の回数サイクルさせる。連続的に小さくなる孔の膜から押し出し て、リポソームサイズの段階的低下が達成される。本発明の使用において、約０ ．０５ミクロン〜約０．１５ミクロンのサイズを有するリポソームが好ましい。 他の有用なサイズ調節法（例えば、超音波処理、溶媒蒸発または逆相蒸発）は当 業者に公知である。 本発明の方法および薬剤組成物で使用するために調製されるリポソームは、長 期間の保存のために脱水してもよい。リポソームは好ましくは、標準的な凍結乾 燥装置または同等の装置を使用して減圧下で脱水される。脂質小胞およびその周 りの媒体はまた、液体窒素中で凍結した後、脱水されるかまたは脱水されず、減 圧下に置かれる。あらかじめ凍結しない脱水は、あらかじめ凍結した場合の脱水 より時間が長くかかるが、凍結工程のない方が全体のプロセスは穏やかであり、 従って脂質小胞への傷害は小さく、内容物の損失はより少ない。室温および約１ mmHgの圧力を生成することができる真空ポンプによる減圧下でのあらかじめ凍結 しない脱水は、典型的には約２４〜３６時間かかり、同じ条件下であらかじめ凍 結する脱水は、約１２〜２４時間かかる。 リポソームが、内容物の実質的部分を失うことなく脱水プロセスを受けること を確実にするために、脂質小胞膜と相互作用してシステム中の水を除去した時完 全なままであるようにする、１つまたはそれ以上の保護性の糖を利用できること が重要である。トレハロース、マルトース、ショ糖、グルコース、乳糖、および デキストランのような糖を含む、種々の糖が使用できる。一般に、単糖より二糖 の方が有効であることが見いだされ、二糖であるトレハロースとショ糖が最も有 効である。他のより複雑な糖も使用することができる。例えば、アミノグリコシ ド（ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンを含む）は、脱水中 の脂質小胞を保護することが見いだされた。 典型的には１つまたはそれ以上の糖が、脂質小胞の内部または外部媒体の一部 として含まれる。最も好ましくは、糖は内部および外部媒体の両方に取り込まれ 、その結果、リポソームの膜の内部および外部表面の両方と相互作用することが できる。内部媒体中への導入は、糖を緩衝液に加えると、これが脂質小胞形成プ ロセス中に脂質小胞中にカプセル化されることにより行われる。ほとんどの場合 に、この緩衝液はまた、最終脂質小胞の浴媒体を形成するため、緩衝液中に糖を 導入すると、これらは外部媒体の一部となる。 使用される糖の量は、使用される糖のタイプおよび保護される脂質小胞の性質 に依存する。米国特許第４，８８０，６３５号およびハリガン（Harrigan）ら、 Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ ５２：１３９−１４９（１９９０）（この 開示内容は、参考のため本明細書に組み込まれる）を参照されたい。当業者は種 々のタイプの糖および濃度を容易に試験して、特定の脂質小胞調製に最適な組合 せを決定することができる。一般に、最も高いレベルの保護を達成するためには １００mMオーダーおよびそれ以上が必要であることがわかった。膜リン脂質のモ ル量では、１００mMオーダーのミリモルレベルは、リン脂質１モルあたり約５モ ルの糖に対応する。 あらかじめ凍結しない脱水の場合は、脱水される脂質小胞が多重膜脂質層を有 するタイプであり、かつ調製物中のもともとの水の約２％〜約５％が調製物中に 残る終点まで脱水が行われるなら、１つまたはそれ以上の保護性糖の使用は省略 することができる。 脂質小胞がいったん脱水されると、これらは使用するまで長期間保存すること ができる。保存に適した温度は、脂質小胞の組成と脂質小胞中にカプセル化され ている物質の温度感受性に依存する。例えば当該分野で公知のような、種々のオ リゴヌクレオチドは熱感受性であり、従ってそのようなオリゴヌクレオチドを含 有する脱水した脂質小胞は、低温で保存して、その物質の効果は失わないように しなければならない。またそのような物質については、脱水プロセスは好ましく は室温ではなく低温で行われる。 リポソームにアンチセンスオリゴヌクレオチドを充填する方法は、典型的には 、アンチセンスオリゴヌクレオチドが緩衝液中に入れられ、そして脂質成分のみ の乾燥フィルムに添加される、カプセル化技術を使用して行われる。こうしてオ リゴヌクレオチドは、リポソームの水性内部にカプセル化される。リポソームの 形成で使用される緩衝液は、任意の生物学的に適合性のある緩衝液、例えば等張 食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、または他の低イオン強度緩衝液でよい。一般 にアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約０．０１ng/ml〜約２００mg/mlの量で 存在する。水層内部または膜中にアンチセンスオリゴヌクレオチドが取り込まれ た得られたリポソームは、次に前述のように随時サイズが調節される。 あるいはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１９９５年６月７日に出願され た同時係属米国出願第０８／４８４，２８２号および０８／４８５，４５８号（ 参考のため本明細書に組み込まれる）に記載のような脂質粒子中に製剤化される 。アンチセンス脂質粒子 アンチセンス脂質粒子は、界面活性剤溶液中でアンチセンスオリゴヌクレオチ ドを陽イオン性脂質と組合せて、コーティングされたアンチセンス複合体を提供 することにより調製することができる。次にこの複合体をリン脂質と接触させて 、界面活性剤、アンチセンス−脂質複合体およびリン脂質の溶液を得て、次に界 面活性剤を除去して、血清に安定なアンチセンス−脂質粒子（ここで、アンチセ ンスオリゴヌクレオチドは脂質二重層中にカプセル化される）の溶液を得る。こ うして形成された粒子は、約５０〜１５０nmのサイズを有する。 あるいは、血清に安定なアンチセンス−脂質粒子は、有機溶媒中で陽イオン性 脂質とリン脂質の混合物を調製し；アンチセンスオリゴヌクレオチドの水溶液を 、陽イオン性脂質とリン脂質の混合物に接触させて、清澄な単相を得て；そして 有機溶媒を除去してアンチセンス−脂質粒子の懸濁液（ここで、アンチセンスオ リゴヌクレオチドは脂質二重層中にカプセル化され、粒子は血清中で安定であり 、約５０〜１５０nmのサイズを有する）を得ることにより形成される。 本発明の面において有用な陽イオン性脂質は、例えばＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ 、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＲＩおよびＤＭＲＩＥを含む。 本発明においても有用なこれらの脂質と関連類似体は、同時係属ＵＳＳＮ０８／ ３１６，３９９号；米国特許第５，２０８，０３６号、５，２６４，６１８号、 ５，２７９，８３３号、５，２８３，１８５号および５，３３４，７６１号中に 開示されている（この開示内容は参考のため本明細書に組み込まれる）。さらに 、多くの陽イオン性脂質の市販の調製物が入手でき、本発明で使用することがで きる。これらには、例えばリポフェクチン（LIPOFECTIN）（登録商標）（ＤＯＴ ＭＡおよびＤＯＰＥを含む市販の腸イオン性リポソームであり、ギブコ／ビーア ールエル（GIBCO/BRL）（グランドアイランド、ニューヨーク州、アメリカ合衆 国）から入手できる）；リポフェクタミン（LIPOFECTAMINE）（登録商標）（Ｄ ＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む市販の陽イオン性リポソームであり、ギブコ／ビ ーアールエル（GIBCO/BRL）から入手できる）；およびトランスフェクタム（TRA NSFECTAM）（登録商標）（ＤＯＧＳを含む市販の陽イオン性リポソームであり、 プロメガ社（Promega Corp.）（マジソン、ウィスコンシン州、アメリカ合衆国 ）から入手できる）がある。 コーティングされたアンチセンス−脂質複合体の初期溶液は、界面活性剤溶液 中でアンチセンスオリゴヌクレオチドを陽イオン性脂質と組合せることにより形 成される。界面活性剤溶液は好ましくは、１５〜３００mM、より好ましくは２０ 〜５０mMの決定的に重要なミセル濃度を有する中性界面活性剤の水溶液である。 適当な界面活性剤の例としては、例えばＮ，Ｎ’−（（オクタノイルイミノ）− ビス−（トリメチレン））−ビス−（Ｄ−グルコンアミド）（ＢＩＧＣＨＡＰ） ；ＢＲＩＪ３５；デオキシ−ＢＩＧＣＨＡＰ；ドデシルポリ（エチレングリコー ル）エーテル；ツイーン２０；ツイーン４０；ツイーン６０；ツイーン８０；ツ イーン８５；メガ（Mega）８；メガ（Mega）９；ツビッタージェント（Zwitterg ent）（登録商標）３−０８；ツビッタージェント（Zwittergent）（登録商標） ３−１０；トリトンＸ−４０５；ヘキシル−、ヘプチル−、オクチル−、および ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド；およびヘプチルチオグルコピラノシドがあ り；オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドが最も好ましい。界面活性剤溶液中の界 面活性剤の濃度は、典型的には約１００mM〜約２Ｍであり、好ましくは約２００ mM〜約１．５Ｍである。 陽イオン性脂質とアンチセンスオリゴヌクレオチドは典型的には、電荷比（＋ ／−）約１：１〜２０：１、好ましくは約１：１〜約１２：１、およびより好ま しくは約２：１〜約６：１を生成するように組合せられる。さらに溶液中のアン チセンスオリゴの全体的濃度は、典型的には約２５μg/ml〜約１５０mg/ml、好 ましくは約１００μｇ/ml〜約５０mg/ml、およびより好ましくは約１００μｇ/m l〜５mg/mlである。界面活性剤溶液中のアンチセンスオジゴと陽イオン性脂質の 組合せは、典型的には室温で、コーティング複合体が生成するのに充分な時間維 持される。あるいはアンチセンスオリゴと腸イオン性脂質は界面活性剤溶液中で 組合せられ、約３７℃まで加熱される。温度に特に感受性のアンチセンスオリゴ については、典型的には約４℃まで低い温度で、コーティングされた複合体が形 成される。 コーティングされたアンチセンス−脂質複合体の界面活性剤溶液は、次に非陽 イオン性脂質と接触させて、アンチセンス−脂質複合体と非陽イオン性脂質の界 面活性剤溶液を得る。この工程で有用な非陽イオン性脂質には、ジアシルホスフ ァチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィ ンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、およびセレブロシドがある。好適 な実施態様において、リン脂質はジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホス ファチジルエタノールアミン、セラミドまたはスフィンゴミエリンである。これ らの脂質中のアシル基は、好ましくはＣ₁₀〜Ｃ₂₄炭素鎖を有する脂肪酸から得ら れるアシル基である。さらに好ましくは、アシル基は、ラウロイル、ミリストイ ル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレオイルである。特に好適な実施態 様において、非陽イオン性脂質は、１，２−ジオレオイルホスファチジルエタノ ールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯ ＰＣ）または卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）である、最も好適な実施態様に おいて、アンチセンス−脂質粒子は、インビボでの性質が増強されているフソゲ ニック（fusogenic）粒子であり、リン脂質はＤＯＰＥである。他の好適な実施 態様において、非陽イオン性脂質はさらに、同時係属ＵＳＳＮ０８／３１６，４ ２９号（参考のため本明細書に組み込まれる）に記載の、ポリエチレングリコー ルーベースのポリマー、例えばＰＥＧ２０００、ＰＥＧ５０００、およびセラミ ドに結合したポリエチレングリコールを含む。 本発明の方法で使用されるリン脂質の量は、典型的には約２〜約１５０mg/ml の総脂質対約２〜約１５０mg/mlのアンチセンスオリゴヌクレオチドである。好 ましくは総脂質の量は、約５０〜約１００mg/ml対５０〜１００mg/mlアンチセン スである。 アンチセンス−脂質複合体と非陽イオン性脂質の界面活性剤溶液の生成後、界 面活性剤を、好ましくは透析により除去する。界面活性剤の除去により、アンチ センスオリゴを取り囲む脂質二重層が形成され、約５０〜１５０nmのサイズを有 する血清に安定なアンチセンス−脂質粒子が得られる。こうして生成した粒子は 凝集せず、随時サイズの調節をして均一な粒子サイズを得る。 血清に安定なアンチセンス−脂質粒子は、リポソームのサイズ調節のために入 手できる任意の方法により、サイズの調節することができる。サイズの調節は、 所望のサイズ範囲と比較的狭い粒子サイズ分布を得るために行われる。 粒子を所望のサイズに調節するためのいくつかの技術が利用できる。リポソー ムに使用され本発明の粒子に同様に応用可能な１つのサイズ調節法は、米国特許 第４，７３７，３２３号（参考のため本明細書に組み込まれる）に記載されてい る。浴またはプローブ超音波処理のいずれかにより粒子懸濁液を超音波処理する ことにより、サイズが徐々に低下して約５０nm以下の粒子になる。ホモジナイズ は、大きい粒子を小さい粒子に断片化するのに剪断エネルギーに依存する別の方 法である。典型的なホモジナイズ法では、粒子は、選択された粒子のサイズ（典 型的には約６０〜８０nm）が観察されるまで、標準的エマルジョンホモジナイザ ーを介して再循環される。両方の方法において、粒子サイズ分布は、通常のレー ザービーム粒子サイズ測定またはＱＥＬＳにより追跡することができる。 小孔のポリカーボネート膜または非対称セラミック膜から粒子を押し出す方法 もまた、粒子サイズを比較的明確なサイズ分布に低下させるのに有効な方法であ る。典型的には、所望の粒子サイズ分布が得られるまで、懸濁液を膜に１回また はそれ以上の回数サイクルさせる。連続的に小さくなる孔の膜から押し出して、 粒子サイズの段階的低下が達成される。 前述のように血清に安定なアンチセンス−脂質粒子はまた、有機溶媒中で陽イ オン性脂質と非陽イオン性脂質の混合物を調製し；アンチセンスオリゴヌクレオ チドの水溶液を脂質の混合物に接触させて、清澄な単相を得て；そして有機溶媒 を除去してアンチセンス−脂質粒子の懸濁液（ここで、アンチセンスオリゴヌク レオチドは脂質二重層中にカプセル化され、粒子は血清中で安定であり、約５０ 〜約１５０nmのサイズを有する）を得ることにより形成される。 この群の実施態様において有用なオリゴ、陽イオン性脂質およびリン脂質は、 前述の界面活性剤透析調製法について記載されたものと同様である。 有機溶媒の選択には、典型的には溶媒の極性と粒子生成の後期段階での溶媒の 除去のし易さが考慮される。可溶化剤としても使用される有機溶媒は、アンチセ ンスオリゴヌクレオチドと脂質の清澄な単相混合物を提供するのに充分な量であ る。適切な溶媒には、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、シク ロヘキサン、シクロペンタン、ベンゼン、トルエン、メタノール、または他の脂 肪族アルコール（例えば、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｔｅ ｒｔ−ブタノール、イソ−ブタノール、ペンタノールおよびヘキサノール）があ る。２つまたはそれ以上の溶媒の組合せも本発明において使用できる。 アンチセンスオリゴヌクレオチドと陽イオン性およびリン脂質の溶液との接触 は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの第１の溶液（これは典型的には、水溶液 である）と、脂質の第２の有機溶液を混合することにより行われる。この混合は 任意の数の方法、例えばボルテックスミキサーを用いるような機械的手段により 行われることは、当業者は理解するであろう。 アンチセンスオリゴヌクレオチドが脂質の有機溶液と接触した後、有機溶媒は 除去され、血清に安定なアンチセンス−脂質粒子の水性懸濁液が生成する。有機 溶媒を除去するために使用される方法は典型的には、減圧下での溶媒留去または 混合物への不活性ガス流の吹き付け（例えば、窒素またはアルゴン）を含む。 こうして形成された血清に安定なアンチセンス−脂質粒子は、典型的には約５ ０〜１５０nmのサイズである。粒子のさらなるサイズの低下または均一化を達成 するためには、前述のようにサイズの調節を行うことができる。アンチセンス製剤の投与 本発明はさらに、宿主中のＩＣＡＭ−１の過剰発現に関連する病状の治療方法 を提供する。これらの方法において、前述の薬剤組成物が宿主に投与される。好 適な実施態様において、宿主は哺乳動物であり、好ましくはマウス、ラット、ヒ ト、ウマ、イヌ、ネコ、ウシまたはブタである。より好ましくは、宿主はヒトで ある。好適なアンチセンスオリゴヌクレオチド、脂質混合物および脂質は、本発 明の化合物について前述したものである。 前述のアンチセンスオリゴヌクレオチドリポソームおよび脂質粒子は、任意の 適当な方法で、好ましくは薬剤学的に許容される担体とともに投与することがで きる。本発明において動物へのこのような組成物の適切な投与方法が利用でき、 特定の組成物を投与するのに２つ以上の経路を使用することができるが、特定の 経路が別の経路より迅速でより有効な反応を与えることを、当業者は理解するで あろう。薬剤学的に許容される担体もまた、当業者に公知である。担体の選択は 、一部は特定の組成物により、および組成物を投与するのに使用される特定の方 法により決定されるであろう。従って、本発明の薬剤組成物の適切な製剤には広 範囲のものがある。 経口投与に適した製剤は、（ａ）液性溶液、例えば水、食塩水またはｐｅｇ４ ００に溶解した有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチド（リポソームまたは脂 質粒子中）；（ｂ）適切な液体中の懸濁物；および（ｃ）適切なエマルジョン、 とからなる。 非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内投与、および皮下経路） に適した製剤には、水性および非水性の、等張の無菌注射溶液があり、これは抗 酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および目的の受容者の血液と等張にする製剤、ならび に水性および非水性無菌懸濁物（これは、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤お よび保存剤を含有してもよい）を含有することができる。この製剤は単回投与量 または複数回投与量の密封した容器（例えば、アンプルやバイアル）中で提供し て、注射用の無菌の液性担体（例えば、水）を使用直前に加えるだけでよい凍結 乾燥条件で保存することができる。用時調製される注射溶液および懸濁物は、既 に記載されているような種類の無菌の粉末、顆粒、および錠剤から調製すること ができる。 本発明において動物（特にヒト）に投与される量は、妥当な時間範囲にわたっ て動物に治療応答を示すのに充分な量である。投与量は、使用される特定の化合 物の強度、動物の状態、ならびに治療される動物の体重または表面積により決定 される。投与量の大きさはまた、特定の動物に特定の化合物を投与した時に伴う 有害な副作用の有無、性質および程度により決定される。 前述のようにアンチセンスオリゴヌクレオチド（リポソームまたは脂質粒子製 剤中）は、例えば静脈内注入、経口的、局所的、腹腔内、膀胱内、またはくも膜 内投与により投与することができる。 経口投与のためには、本発明の組成物は、３０００mg/m²体表面積までの割合 で投与することができ、これは平均的な患者で約６ｇ／日である。好適な割合は １〜３００mg/m²体表面積である。これは、単回または分割投与により達成でき る。静脈内投与のためには、この化合物は、約２５００mg/m²/日までの割合、好 ましくは約０．１〜約２００mg/m²/日で投与することができる。膀胱内投与のた めには、この化合物は、約２５００mg/m²/日までの割合、好ましくは約０．１〜 約２００mg/m²/日で投与することができる。局所投与のためには、この化合物は 、約２５００mg/m²/日までの割合、好ましくは約０．１〜約２００mg/m²/日で投 与することができる。吸入／エアゾル投与のための投与量は、約２５００mg/m²/ 日までの割合、好ましくは約０．１〜約２００mg/m²/日である。直接腹腔内投与 投与は、約３０００mg/m²/日まで、好ましくは約０．１〜約１００mg/m²/日を使 用して行われる。脳または髄液への病巣内投与量は、約２０００mg/m²/日まで、 好ましくは約０．１〜約１００mg/m²/日である。除放性腹腔内投与または皮下投 与のためには、投与量は、ボーラスで約０．１〜約５０００mg／日、好ましくは 約０．１〜約２００mg／日である。くも膜内投与のためには、約２０００mg/m²/ 日ま で、好ましくは約０．１〜約１００mg/m²/日である。 以下の例は例示のためにのみ提供されるものであり、決して本発明を限定また は規定するのもではない。 例 材料 １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＳ ＰＣ）と卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）は、アバンチポーラーリピッズ（Av anti Polar Lipids）（アラバスター（Alabaster）、アラバマ州、アメリカ合衆 国）から購入した。コレステロール、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン −Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ヘペス）、セファロース（登録商標）ＣＬ −４Ｂ、セファデックス（登録商標）Ｇ−２５、セファデックス（登録商標）Ｇ −５０、およびジチオスレイトール（ＤＴＴ）は、シグマケミカル社（Sigma Ch emical Co.）（セントルイス、ミズーリ州、アメリカ合衆国）から得た。³Ｈ− コレステリルヘキサデシルエーテル（³Ｈ−ＣＨＥ）は、アマシャム（Amersham ）（オークビル（Oakville）、オンタリオ州、カナダ）から得た。雌のＩＣＲお よびＢＡＬＢ／ｃマウスを、ハーレイースプレーグデービス（Harley-Sprague D avis）から得た。緩衝液 ５×ベロナール緩衝化生理食塩水（ＶＢＳ）。８５．０ｇのＮａＣｌ、３．７ ５ｇのナトリウムバルビトンおよび５．７５ｇのバルビトンを、１．６リットル の蒸留水中で混合する。混合物を加熱してバルビトンを溶解する。容量を蒸留水 で２．０リットルにする。ｐＨは７．４〜７．６になる。４℃で保存する。 ＧＶＢ^2-。０．５ｇのゼラチンを１００mlの蒸留水に溶解して、加熱して溶解 する。１００mlの５×ＶＢＳを加え、蒸留水で総量を５００mlにする。４℃で保 存する。この緩衝液は数日毎に作成する。 Ｄ５Ｗ^2-。２５ｇのＤ−グルコースを５００mlの蒸留水に溶解する。この溶液 は数日毎に作成する。４℃で保存する。 ＤＧＶＢ²⁺。２５０mlのＤ５Ｗを２５０mlのＧＶＢ^2-を混合する。７５μｌの １．０Ｍ ＣａＣｌ₂と１００μｌの２．５Ｍ ＭｇＣｌ₂を加える。４℃で 保存する。この緩衝液は数日毎に作成する。 ＥＤＴＡ・ＧＶＢ^2-。１．４８９ｇのＥＤＴＡ、０．５ｇのゼラチン、１００ mlの５×ＶＢＳ、および２００mlの蒸留水を混合する。５Ｍ ＮａＯＨでｐＨを ７．４にする（これは、ＥＤＴＡを溶解するのを助ける）。容量を蒸留水で５０ ０mlにする。４℃で保存する。この緩衝液は数日毎に作成する。 例１ 本例は、リポソーム中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの受動的カプセル化 を示す。従って本例はリポソームを例示し、カプセル化されていないＤＮＡを、 サイズ排除クロマトグラフィーを使用して分子量の差により分離する。 １．１ アンチセンスのカプセル化 卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）（１．７８ｇ）とコレステロール（ＣＨ） （０．７２ｇ）を、層流ドラフト中で計り取り、１５０mlの丸底フラスコ中のク ロロホルム中で組合せた。クロロホルムを、ロータリーエバポレーターで３時間 除去する。 アンチセンス分子ＩＳＩＳ２３０２（１．５ｇ）を１０mlの無菌リン酸緩衝化 生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、２．５ｇのＥＰＣ：ＣＨ（５５：４５；モル： モル）からなる脂質フィルムに加えた。得られる多重膜小胞（ＭＬＶ）を３つの ５mlクリオバイアルに写し、液体窒素での凍結と４０℃での融解を５サイクル行 なった。凍結−融解ＭＬＶを組合せ、無菌の１００ml容量の押出し機（リペック スバイオメンブランズ（Lipex Biomembranes）、バンクーバー）に写し、０．１ μｍのフィルターから１０回押し出した。 より小さいリポソームアンチセンス調製物について同様の条件を行ったが、２ ００mgのオリゴヌクレオチドを２５０mg（総量）のＥＰＣ：ＣＨ脂質中で再水和 した。 １．２ ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィー 非カプセル化（遊離）アンチセンス分子を、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６ Ｂを使用して陰イオン交換クロマトグラフィーにより、捕捉した分子から分離し た。カラム物質の妥当な無菌性を確保するために、カラムを無菌ＰＢＳで洗浄し 、次にＥＰＣからなる１００nmの小胞３００ml（ＰＢＳ中２４mg/ml）を溶出し た。カラムは、５mlのパック容量を有する６mlのシリンジで構成された。アンチ センス−リポソーム懸濁物の４００mlアリコートを、各カラムで溶出し、脂質を 含有する画分を集め一緒にした。各カラムを２回使用し、次にアンチセンス分子 の後の回収のために４℃で保存した。 カラム溶出液の総量は約１１０mlであった；従ってリポソームアンチセンスを 濃縮することが必要であった。リポソームアンチセンスは、透析チューブ（分子 量カットオフ、１４０００）に入れ、アクアシド（Aquacide）を使用して約２８ m1に濃縮した。この精製の結果を図２に示す。 １．３ 捕捉効率の測定 捕捉効率は、既に記載されている（チョン（Chonn）ら、１９９１）ように１m lのバイオゲル（Biogel）Ａ１５ｍスピンカラムを使用して、サイズ排除クロマ トグラフィーにより測定した。簡単に説明すると、リポソームアンチセンスの５ ０μｌのアリコートを７０μｌのＰＢＳで消化し、２つのカラムのそれぞれにつ いて５０μｌを溶出した。各画分は、１０００rpmで１分遠心分離中の溶出した 容量（〜４０μｌ）から構成された。カラム溶出液を集め、カラムに５０μｌの ＰＢＳを加え、前述のようにカラムを再度遠心分離し、溶出液は新しい１３×１ ００ｍm試験管に集めた。全部で３６画分が集まるまでこれを繰り返した。各画 分を、２５０μｌの蒸留水を添加後、脂質とＤＮＡについて測定した。各試料か らの５０μｌのアリコートをシンチレーション計測またはリン酸分析（フィスケ とサバロ−（Fiske and Subbarow）、１９２５）をして、各画分を脂質について 測定し、残り（約２５０μｌ）はブライとダイア（Bligh and Dyer）抽出プロト コールによりＤＮＡについて測定した。結果を図１に示す。 １．４ 抽出プロトコール ７５０μｌのクロロホルム：メタノール（１：２．１）を添加してクロロホル ム：メタノール：水（１：２．１：１）からなる単層を形成させて、２５０μｌ のＨ₂Ｏ中のＤＮＡを分離した。試料にさらに水（２５０μｌ）とクロロホルム （２５０μｌ）を加えて、２層系を得た。次に試料を３００rpmで１０分遠心分 離して、有機層と水層の迅速な分離を促進した。上の水層を集め、２６０nmでの 吸光度により４００μｌをＤＮＡについて測定した。 下のクロロホルム層を、３００μｌのメタノール：水（１：１）で３回洗浄し 、窒素下で乾燥した。脂質フィルムを１mlの水につけ、アリコートを取ってリン 酸塩を測定した。 １．５ カプセル化されたリポソームアンチセンスの安定性 リポソームアンチセンス調製物は必ずしも直ぐ使用しなかったため、調製物の 安定性を数日間にわたって測定することが必要であった。このために、リポソー ム中のアンチセンスの保持を、４℃で室温で５日間測定した。カプセル化された アンチセンスの漏出は、バイオゲル（Biogel）Ａ１５ｍスピンカラムの取り込ま れた容量中でピークとして現れるであろう。種々の時間に、試料の５０μｌのア リコートを、１mlのバイオゲル（Biogel）Ａ１５ｍカラムに適用し、前述のよう に溶出した。脂質とオリゴヌクレオチドは前述のように測定した。オリゴヌクレ オチド溶出プロフィール中の第２のピークは、カプセル化されたオリゴヌクレオ チドの漏出を示すと考えた。４℃または室温で５日後も、漏出は見られなかった （図３と４を参照）。 例２ 本例は、リポソームアンチセンス製剤による補体活性化を例示する。 種々のリポソームおよび／またはＤＮＡ製剤の作用を追跡するために、我々は 、これらの製剤の相対的補体活性化をスクリーニングするためにヒト血清を使用 するインビトロ補体溶血測定法を確立した。この測定法は２工程法である。第１ の工程では、リポソームおよび／またはＤＮＡにより補体が消費され、第２の工 程では、測定法の第１の部分で活性化されなかった残存補体により、抗体感作ヒ ツジ赤血球が溶解される。 直径１００±３０nmのＥＰＣ／ＣＨリポソーム組成物を使用して、リポソーム と遊離のアンチセンスによる補体活性化を調べた。 ２．１ 正常ヒト血清プール 試験した測定の第１の成分は、新鮮な血清プールの活性である。血清プール間 には補体活性に若干の差があり、これが測定の感度に影響を与えるため、新しい 血清プールを作成するたびに、この活性は試験しなければならない。一連の血清 希釈物を試験して、吸光度の読み値で最大の赤血球溶解と最小の妨害を与える希 釈率を決定した（血清希釈が濃縮されるほど、高いバックグランド吸光度が観察 される）。１００倍未満の血清希釈が、赤血球溶解の妥当なレベルを与えた。補 体活性を阻害するために、測定の最後にＥＤＴＡ−ＧＶＢ^2-を加えた。ＥＤＴＡ −ＧＶＢ^2-の容量を変更して、血清プールの活性により測定法の吸光度範囲を増 加または減少させた。以後のすべての測定においては５０倍血清希釈を使用した （工程１で２５倍希釈で、工程２で２倍希釈）。さらに測定を停止させるために 使用したＥＤＴＡ−ＧＶＢ^2-の量は１．０mlであり、吸光度範囲（Ａ₄₁₀）０〜 ０．８を得た。 ７人の健常男性と６人の健常女性からの血液を、冷却した血清試験管に集め、 直ちに氷／水浴に入れた。各人について３０mlの血液を採取した。（凝固を避け るために）６本の試験管毎に、試験管を２５００rpmで４℃で１０分遠心分離し た。すべての試験管から血漿を採取し、氷上の２５０mlのビーカーにプールした 。次に、いくつかのクローニングスティックの存在下で（凝固を小さくするため に）、プールした血漿を３７℃で３０分インキュベートした。血清を、１．５ml のエッペンドルフ試験管中にアリコート（１．０ml）して、使用するまで−６５ ℃で保存した。 ２．２ 感作ヒツジ赤血球（ＥＡ細胞）の調製 ヒツジ全血（アルセバー（Alsever's）中の５０％溶液；セダーレーン（Cedar lane））のアリコートをストック溶液から取り出し、１５００rpmで１０分遠心 分離した。次に細胞を、１０部のＥＤＴＡ−ＧＶＢ^2-で３回洗浄した。洗浄した 細胞を、最初のアリコートの約５倍量であるＥＤＴＡ−ＧＶＢ^2-に再懸濁した。 再懸濁した細胞のアリコート（１００μｌ）をキュベット中で２．９mlの蒸留水 と混合し、５４１nmの吸光度を測定した。細胞の濃度を、以下の情報に従って、 ＥＤＴＡ−ＧＶＢ^2-で１×１０⁹細胞／mlに調整した。 細胞懸濁物を振盪浴中で３７℃に暖め、ウサギ抗ヒツジ赤血球抗体（ヘモリジン ）を加えて、最終の抗体希釈率１／５００（すなわち、細胞１０ml中抗体２０μ ｌ）を得た。混合物を３７℃で３０分インキュベートした。インキュベーション 後、細胞を１５００rpmで４℃で５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞をＥＤ ＴＡ−ＧＶＢ'-で洗浄した。次に、遊離の抗体をさらに除去し、細胞懸濁物中に 陽イオンを導入するために、細胞をＤＧＶＢ²⁺で２回洗浄した。最後に上記情報 を使用して、ＤＧＶＢ²⁺で細胞濃度を２×１０⁸細胞／mlに調整した。調製後、 細胞を絶えず４℃に維持し、同じ日に使用した。 ２．３ 補体溶血測定法 数オーダーの範囲をカバーする濃度範囲にわたって、すべての試料を連続希釈 した。希釈した試料またはオリゴヌクレオチド試料（１００μｌ）を、ＤＧＶＢ²⁺ で５倍に希釈した１００μｌの正常ヒト血清（ＮＨＳ）に加えた。試料を３７ ℃で３０分インキュベートし、次に氷上に置いた。氷冷したＤＧＶＢ²⁺（３００ μｌ）を各試験管に加えて、消費されていない補体を希釈した。 試料（１００μｌ）の希釈インキュベーション混合物を、１００μｌのＥＡ細 胞または１００μｌのＤＧＶＢ²⁺（色ブランク用、これらはリポソーム濃度＞１ mMで通常必要である）に加えた。混合物を３７℃で３０ｍインキュベートし、次 に氷上に置いた。補体活性を阻害するためにＥＤＴＡ−ＧＶＢ^2-（１．０ml）を 試料に加え、混合物を４℃で１５００rpmで５分間遠心分離した。ペレットにな った赤血球を乱さないように注意しながら、上清のアリコート（２５０μｌ）を マイクロタイタープレート（３重測定）に移した。上清の吸光度を、電子式プレ ートリーダーで４１０nmで測定した。 図５は、リポソーム組成物の補体活性化能を示す。図から明らかなように、中 性ＥＰＣ：ＣＨリポソームは、試験した濃度範囲にわったて補体活性化は観察さ れなかった。 例３ 本例は、遅延型過敏症（ＤＴＨ）に帰因する炎症を低下させるためのリポソー ムアンチセンス組成物によるマウスの治療を示す。 遅延型過敏症（ＤＴＨ）の１つの型である接触過敏症のマウスモデルを樹立し た。このモデルでは、マウスの腹部領域を強い接触感作物質であるジニトロフル オロベンゼン（ＤＮＦＢ）で感作する。次に、後に（最初の感作の５日後）、Ｄ ＮＦＢの希薄溶液で耳を抗原刺激して、炎症を誘導する。このモデルは、炎症の いくつかの共通の特徴について解析されている：具体的には、浮腫（耳の厚さの 測定）、血管漏出（炎症を起こした耳でのリポソーム蓄積）、および細胞浸潤（ 好中球／単球についてのミエロペルオキシダーゼ測定、または［³Ｈ］−チミジ ンによる骨髄細胞と循環白血球のプレ標識による）。さらに、近交系（ＢＡＬＢ ／ｃ）および非近交系（ＩＣＲ）マウスの両方とも、このモデルで試験し、両方 のマウス株について同様の炎症パターンが観察された。 ３．１ マウス 雌のＢＡＬＢ／ｃマウスとＩＣＲマウスは、ハーレイースプレーグデービス（ Harley-Sprague Davis）から得た。ＢＡＬＢ／ｃマウスは６〜９週齢であり、Ｉ ＣＲマウスは８〜１０週齢であった。各実験群は、４匹のマウスからなり、実験 は少なくとも２回繰り返した。 ３．２ 感作と接触過敏症の誘発 毛を剃った腹部に連続２日問、アセトン：オリーブ油（４：１）中の０．５％ の２，４−ジニトロ−１−フルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）２５μｌを適用してマ ウスを感作した。２回目の適用の４日後に、耳の背側表面にアセトン：オリーブ 油（４：１）中の０．２％のＤＮＦＢ １０μｌを適用して抗原刺激した。ある 場合には、対照マウスに耳の背側表面に１０μｌのビヒクルを与えた。 ３．３ 耳の腫脹の評価 耳の抗原刺激の直前とＤＮＦＢ抗原刺激後種々の時間に、エンジニアのマイク ロメーター（engineer's micrometer）（ミツトヨ（Mitutoyo）、東京、日本） を使用して耳の厚さを測定した。抗原刺激後の測定値から抗原刺激前の測定値を 引いて、耳の厚さの測定値の増加を測定した。 ＩＣＲ（非近交系）マウスとＢＡＬＢ／ｃ（近交系）マウスについての３日間 にわたる耳の炎症の進展を、それぞれ図６と７に示す。抗原刺激直後に紅斑は明 らかであり、試験の残りにわたって強度は徐々に低下した。ＩＣＲマウスは、耳 炎症の誘導後２４時間目に耳の厚さのピークを示した。最大の耳の厚さは、１７ ０×１０^-4インチであり、耳の厚さの７０％の増加に相当する。炎症開始後４８ 時間と７２時間では耳の腫脹は徐々に低下するが、耳の測定値はベースラインの 厚さのレベル（９０〜１００×１０^-4インチ）に戻らなかった。 ＢＡＬＢ／ｃマウスは、耳の抗原刺激後２４〜４８時間目に耳の厚さの測定値 のピークを示す。このマウスの最大の耳の厚さは、１３０×１０^-4インチであり 、これは、耳のベースライン値の〜５０％の増加に相当する（７５〜８５×１０^-4 インチ）。 ３．４ リポソーム蓄積の評価 ジステアリルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）とコレステロール（ＣＨ）（ モル比５５：４５）からなる大きい単一膜小胞を、２つの重ねた１００nmのポリ カーボネートフィルターから押し出して、ヘペス緩衝化食塩水（２０mMヘペス、 １４５mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で調製した。リポソームは、交換不可能な 放射性脂質マーカーである［³Ｈ］コレステリルヘキサデシルエーテル（ＣＨＥ ）を含有した。ＬＵＶを１００mg/kg（２００μｌ；〜２μCiのＣＨＥ／マウス ）で、背側尾静脈に、耳炎症開始後の０、２４、４８、７２時間目に投与した。 耳の測定値を取ってから２４時間、リポソームを循環させた。次にマウスを屠殺 し、耳を採取して、リポソーム蓄積と細胞浸潤を分析した。 リポソーム蓄積の分析は、炎症の種々の段階で血管の変性を相対的に示すよう に行なった。従って、以下の時間間隔にわたってリポソーム蓄積を測定した：０ 〜２４時間、２４〜４８時間、４８〜７２時間（およびある場合には７２〜９６ 時間）。両方の株のマウスについて、最大のリポソーム蓄積は最初の２４時間に 発生した（図８と９）。すなわち、血管中の最も顕著な変化は、０〜２４時間の 間に起きたようである。 ３．５ 細胞浸潤の評価 炎症を起こした耳および炎症を起こしていない耳の細胞浸潤は、好中球（およ び単球）ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性についての酵素的測定、または ［³Ｈ］メチルチミジンによる骨髄細胞と循環白血球のプレ標識により評価した 。 細胞のアズール親和性顆粒からＭＰＯを抽出するために、少し厳しい条件を使 用した。耳をはさみで細かく切り、０．５％ヘキサデシルトリメチルアンモニウ ムブロミド（ＨＴＡＢ）を含有するリン酸緩衝液（５０mMリン酸カリウム、０． ５％ＨＴＡＢ、ｐＨ６．０）２．０mlに加えた。次にポリトロン（polytron）ホ モジナイザーを１分間使用し（高出力）、３０秒間超音波処理（出力、４；４０ ％パルス）して試料をホモジナイズした。次に試料を、２つの１．０ml部分に分 割した。１つの部分をソルバブル（Solvable）を使用して消化し、標準的液体シ ンチレーション計測で分析した。第２の部分は、液体窒素中で５回凍結−融解し 、再度３０秒間超音波処理（出力、４；４０％パルス）した。次に試料を１８０ ００ｇで１０分間遠心分離して、細胞破片を除去した。上清を取り、０．１mlの アリコートを２．９mlの基質緩衝液（５０mMリン酸カリウム、ｐＨ６．０、０． １６７mg/mlｏ−ジアニシジンジヒドロクロリドと０．０００５％過酸化水素を 含有する）でインキュベートしてＭＰＯ活性について測定した。４６０nmでの吸 光度を数分間追跡し、多くの場合に３０秒と９０秒の吸光度からΔＡ₄₆₀を求め た。操作を通してすべての溶液はできるだけ氷上に維持した。１単位のＭＰＯ活 性は、２５℃で１分間に１μモルのペルオキシダーゼを分解する酵素の量である として定義される。 ［³Ｈ］メチルチミジンで血球をプレ標識した実験について、すべてのマウス を、耳をＤＮＦＢで抗原刺激する２４時間前に、無菌食塩水中の［³Ｈ］メチル チミジンを５００μｌ（１μＣｉ／ｇ体重）腹腔内注射した。耳の厚さを測定後 、耳を採取して、サルバブル（Solvable）で消化し、標準的液体シンチレーショ ン計測で標識細胞を分析した。細胞浸潤の相対的推定は、炎症を起こした耳と炎 症を起こしていない耳で観察された放射能の比を求めて行なった。図１０は、炎 症を起こした耳と炎症を起こしていない耳のＭＰＯ蓄積の経時変化を示す。約４ ８時間でピークＭＰＯ活性に達し、９６時間までにベースラインレベルに戻る。 放射能標識血球（主に、好中球、単球、およびＴリンパ球）の蓄積に基づき、細 胞蓄積は２４時間までにピークに達し、７２時間にわたっって比較的高く維持さ れる（図１１を参照）。これらの２つの操作の大きな差は、ＭＰＯ測定法では主 に好中球蓄積を測定している（好中球は、単球より３倍多くのＭＰＯを有する） のに対して、［³Ｈ］メチルチミジン法では、すべての細胞の流入を均等に測定 している。延長部位での好中球蓄積は、最初の２４時間に急速に上昇し、ほとん ど急速に低下することが証明されている。２４〜４８時間から、単球とＴリンパ 球のレベルの上昇が延長部位で観察される。 ３．６ 典型的な炎症実験 図１２は、ＩＣＲマウスを用いる典型的な炎症実験の詳細を示す。耳の抗原刺 激の約１２時間後に、耳の腫脹が現れ出す。脂質の蓄積はほとんど直後に始まり 、２４時間にわたって一貫して増加する（この図の６時間、１２時間、および２ ４時間の脂質蓄積の時点は、ｔ＝０時間で注射した）。最後に、ラグ期間が観察 された後細胞浸潤が始まり、これは６時間後に増加し始め、２４時間目にピーク に達し、次に７２時間にわたって徐々に低下する。 例４ 本例は、マウス耳炎症モデルを使用して、延長部位への大きい単一膜小胞の受 動的ターゲティングを例示する。 リポソーム蓄積はピーク炎症事象に対応して、炎症開始後の０〜２４時間およ び２４〜４８時間の間に最大であるようであった。この後、「漏出している」血 管の再構成と修復に対応して、リポソーム蓄積は急激に低下した。 炎症の進展にとって最も重要なことは、皮膚の微小血管細胞中で起きる形態学 的および機能的変化である。サイトカインにより活性化されると、内皮細胞は血 管拡張し、炎症領域への血液の流入が増加する。さらに、血管が刺激されて構造 が再構成され、免疫細胞が血管から管外遊出して炎症部位に近づくことができる 。このような変化後、炎症部位への白血球と巨大分子の浸潤のために内皮細胞が 最適化される。こうして、比較的小さい小胞（例えば、我々の研究では直径１０ ０nmのリポソーム）は、「漏出している」血管中を活発に移動し、炎症部位に受 動的に蓄積する。 ４．１ 方法 使用したマウス、および感作と接触過敏症の誘発は、例３に記載のように行な った。リポソーム蓄積を、炎症の最初の２４時間にわたって追跡した。ＤＮＦＢ で抗原刺激直後に、背側の尾静脈から１００mg/kg（２００μｌ；〜２μCiのＣ ＨＥ／マウス）のＬＵＶを投与した。抗原刺激の６、１２、および２４時間後に 、マウスを屠殺した。耳を採取し、前述のように分析した。 ４．２ 炎症部位でのリポソーム蓄積 これらの小胞が「炎症を起こした」血管から管外遊出する能力の相対的指標を 得るために、マウスの耳の炎症の種々の段階で、リポソーム蓄積を調べた。これ は、リポソーム性薬剤（例えば抗ＩＣＡＭ−１オリゴヌクレオチドおよびコルチ コステロイド）の炎症部位への受動的ターゲティングにとって興味深い。リポソ ーム蓄積を以下の時間間隔にわたって測定した：０〜２４時間、２４〜４８時間 、４８〜７２時間。ＩＣＲマウスとＢＡＬＢ／ｃマウスの両方について、最大の リポソーム蓄積は炎症の最初の２４時間に起きた。すなわち、血管への最も顕著 な変化は炎症の最初の０〜２４時間に起きたようである。これは、比較的小さい 分子およびタンパク質（例えば、ＢＳＡ）の血管外漏出を説明している前記報告 と一致する。 ４．３ 炎症の最初の２４時間にわたるリポソーム蓄積 図１３は、炎症の最初の２４時間にわたる、耳の抗原刺激（ｔ＝０時間）直後 の投与されたＤＳＰＣ：ＣＨリポソームの蓄積を示す。予測されるように、最初 の２４時間の間に炎症を起こした耳に脂質が着実に蓄積し、これは炎症を起こし た領域の血管内皮の再構成に一致する。対照の耳（炎症を起こさなかった）では 内皮の再構成は起きなかったため、脂質蓄積の増加は観察されなかった。 図１３は、炎症部位でＬＵＶの受動的蓄積が起きることを例示する。リポソー ム蓄積は、０〜２４時間（炎症の開始後）の問に最大になるようである。この後 に、「漏出している」血管の再構成と修復に対応して、蓄積は急激に低下する。 例５ 本例は、遊離のオリゴヌクレオチドとカプセル化されたオリゴヌクレオチドの 血漿クリアランスと生体分布を示す。 例３のようにマウスを感作し抗原刺激した。耳の抗原刺激の１５分後、尾の側 方（２００μｌ）からオリゴヌクレオチド投与量５０mg/kgで種々のアンチセン ス製剤を投与した。対照マウスにはＰＢＳまたは食塩水を投与した。種々の時点 で、心臓穿刺によりマウスから血液を採取し、ＥＤＴＡを含有する血漿試験管に 採取した。分析のために全血のアリコートを取った。血液を３０００rpmで１０ 分遠心分離し、血漿のアリコートを標準的液体シンチレーション分析により計測 した。臓器を採取し、ホモジナイズし、消化し、そして放射能標識アンチセンス と放射能標識脂質の存在について、標準的液体シンチレーション計測で分析した 。 遊離およびカプセル化されたオリゴヌクレオチドのクリアランスの相対的速度 を図１４に示す。遊離のオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ２３０２）の循環半減期 は非常に短かった（約２．５分）。しかし、ＥＰＣ：ＣＨ（５５：４５）リポソ ーム中にアンチセンスがカプセル化された製剤は、循環流からのクリアランス速 度がはるかに遅かった。カプセル化されたオリゴヌクレオチドは数分の循環半減 期ではなく、約８時間の半減期を有した。すなわち、カプセル化は半減期を約１ ００倍増加させる。 図１５は、オリゴヌクレオチドの静脈内注入（５０mg/kg投与量）後の肝臓、 脾臓、肺、および腎臓での［³Ｈ］−アンチセンスの組織分布を示す。アンチセ ンス分子は血漿から迅速にクリアランスされ、投与量の大部分はおもに肝臓と腎 臓に分布していた。牌臓と肺にわずかに蓄積が観察された。しかし臓器の重量に 基づき、腎臓はアンチセンス除去の最も効率的な臓器であった。この結果は、体 内からの遊離のアンチセンスの消失の主要な経路は尿排泄であるという報告と一 致する。図１６は、カプセル化された製剤の脂質とアンチセンス部分の両方につ いての生体分布プロフィールを示す。アンチセンスと脂質の両方について、肝臓 が主要な蓄積臓器であることがわかった。一部の蓄積は脾臓に見られ、微量が肺 と腎臓に検出された。この生体分布パターンは、標準的リポソーム生体分布プロ フィールと非常によく似ているが、遊離のオリゴヌクレオチドが示した腎臓と肝 臓組織分布とは大きく異なる。すなわち、脂質成分の生体分布は、アンチセンス 分子がリポソームから漏出しない場合に予測されるように、アンチセンス分子の 分布を決定する。 例６ 本例は、マウス抗ＩＣＡＭオリゴヌクレオチドの効果を示す。 マウスＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効 果を、前述の耳炎症モデル（例３）を使用して試験した。試験オリゴヌクレオチ ドは、アイエスアイエスファーマシューチカルズ（ISIS Pharmaceuticals）によ り開発され、Ｉｓｉｓ３０８２と呼ばれる。このアンチセンスは、マウスＩＣＡ Ｍ−１ ｍＲＮＡの非翻訳５’領域中の配列に対する２０塩基（２０量体）ホス ホロチオエートである（ベネット（Bennett）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２ ：３５３０−３５４０（１９９４）：ベネット（Bennett）ら、Ａｄｖ．Ｐｈａ ｒｍａｃｏｌ．２８：１−４３（１９９４）；およびチアング（Chiang）ら、Ｊ ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１８１６２−１８１７１（１９９１）を参照） 。このオリゴヌクレオチドは最近、マウスの心臓同種移植片拒絶を低下させる活 性を示すことが証明された（ステプコウスキー（Stepkowski）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕ ｎｏｌ．１５３：５３３６−５３４６（１９９４）、およびステプコウスキー（ Stepkowski）ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．２７：１１３（１９９５） を参照）が、ＤＴＨモデルでは有効であることは見いだされなかった（私信、ベ ネット（F．Bennett）、イシス（Isis））。 耳の抗原刺激の直前とＤＮＦＢの抗原刺激の２４時間後に、エンジニアのマイ クロメーター（engineer's micrometer）（ミツトヨ（Mitutoyo）、東京、日本 ）を使用して耳の厚さを測定した。抗原刺激後の測定値から抗原刺激前の測定値 を引いて、耳の厚さの測定値の増加を測定した。 マウスの耳の炎症開始の１５分後に、背側の尾静脈を介して５０mg/kg（２０ ０μｌ中）のオリゴヌクレオチド投与量で、種々のアンチセンス製剤を投与した 。炎症対照マウスにはＰＢＳを投与した。２４時間後に耳の測定を行い、浮腫の 形成（耳の腫脹）を測定した。 マウスの耳炎症の進展に及ぼす遊離の抗ＩＣＡＭ−１オリゴヌクレオチドの影 響を、図１７に示す。図から明らかなように、各セットのマウス（ＩＳＩＳ２３ ０２または３０８２で処理した）は、ＰＢＳを注射した炎症対照マウスと同様の 、耳の厚さの測定値の増加を示した。すなわち、単回投与（５０mg/kg）の遊離 のオリゴヌクレオチドは、浮腫の進展を防止するには不充分であった。 カプセル化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、前述のように注射し、 結果を図１８に示す。ＰＢＳを投与したマウスで耳の厚さの増加が観察された。 同様に単回投与の遊離のＩＳＩＳ３０８２、空のＥＰＣ：ＣＨリポソーム、また はカプセル化されたヒトＩＣＡＭ−１特異的オジゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ２３ ０２）で処理したマウスは、耳の厚さが大幅に増加した（＞１００％）。しかし 、ＥＰＣ：ＣＨリポソーム中にカプセル化されたマウスのＩＣＡＭ−１特異的ア ンチセンス分子（ＩＳＩ３０８２）は、炎症の３０分前でも直後に投与しても、 耳の浮腫を大きく低下させることができた。この結果は、コルチコステロイド（ ＨＢＰ）で局所的にマウスを処理した対照に匹敵する。 別の実験において、ＤＮＦＢで抗原刺激した耳と未処理の耳の重量を、遊離の ＩＳＩＳ３０８２、カプセル化されたＩＳＩＳ３０８２、およびＰＢＳの単回投 与で処理したマウスについて比較した（図１９を参照）。遊離のアンチセンス分 子またはＰＢＳで処理したマウスについて、抗原刺激した耳の重量の約２倍の増 加が観察された。しかし、カプセル化されたＩＳＩＳ３０８２で処理したマウス の左の耳および右の耳の間にほとんど差は観察されず、浮腫がないことを示して いた。 本明細書で言及されたすべての刊行物、特許および特許出願は、あたかもこれ らの各刊行物、特許または特許出願が本明細書に具体的にかつ個々に取り込まれ ているように同程度に、参考のため本明細書に組み込まれる。 前述の本発明を、理解を容易にするために図と例により詳細に説明したが、添 付の請求の範囲の範囲内でいくつかの変更や修飾が実施できることは明らかであ ろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｋ 31/00 ６０９Ｇ 17/00 ６１７ 19/02 ６１９Ａ 25/00 ６２５ 25/28 ６２６Ｎ 27/02 ６２７Ａ 31/12 ６３１Ｈ 37/06 ６３７Ｄ 43/00 ６４３Ｄ Ａ６１Ｋ 31/711 31/70 ６２５ 47/24 47/24 47/28 47/28 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 セムプル，シーン，シー. カナダ国 ブイ６エイチ ２ケイ５ ブリ ティッシュ コロンビア，バンクーバー, オーク ストリート 301―2880 (72)発明者 シャーラー，ピーター カナダ国 ブイ６エイチ ２ティ５ ブリ ティッシュ コロンビア，バンクーバー, バーチ ストリート 301―2664 (72)発明者 ホープ，マイケル，ジェイ. カナダ国 ブイ６アール ２ケイアール ブリティッシュ コロンビア，バンクーバ ー，ウエスト イレブンス アベニュー 3550

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．宿主中のＩＣＡＭ−１の過剰発現に関連する病状の治療のための薬剤組成物 であって、薬剤組成物は、脂質混合物中にカプセル化されたＩＣＡＭ−１アンチ センス分子の有効量を含み、脂質混合物は、リン脂質、ステロールおよび陽イオ ン性脂質よりなる群から選択される少なくとも２つのメンバーを含む、上記薬剤 組成物 ２．脂質混合物はリポソームの形であり、基本的に中性リン脂質とステロイドか らなる、請求の範囲第１項に記載の薬剤組成物。 ３．脂質混合物は脂質粒子の形である、請求の範囲第１項に記載の薬剤組成物。 ４．ＩＣＡＭ−１アンチセンス分子は約１５〜約５０の核酸を含み、ＩＣＡＭ− １の３’非翻訳領域の一部に相補的である、請求の範囲第１項に記載の薬剤組成 物。 ５．ＩＣＡＭ−１アンチセンス分子は、ホスホロチオエート分子である、請求の 範囲第４項に記載の薬剤組成物。 ６．ＩＣＡＭ−１アンチセンス分子は、メチルホスホネート分子である、請求の 範囲第４項に記載の薬剤組成物。 ７．脂質混合物は基本的に卵ホスファチジルコリンとステロールからなるリポソ ームの形である、請求の範囲第１項に記載の薬剤組成物。 ８．脂質混合物は基本的に卵ホスファチジルコリンとコレステロールからなるリ ポソームの形である、請求の範囲第１項に記載の薬剤組成物。 ９．脂質混合物は、基本的に中性リン脂質とコレステロールからなり、リポソー ムは約５０〜約１５0nmの直径を有する、請求の範囲第１項に記載の薬剤組成物 。 １０．リポソームは、約７５〜約１２５nmの直径を有する、請求の範囲第９項に 記載の薬剤組成物。 １１．脂質混合物は、脂質粒子の形であり、脂質粒子は約５０〜約９０nmの直径 を有する、請求の範囲第１項に記載の薬剤組成物。 １２．脂質混合物は、脂質粒子の形であり、脂質粒子は約６０〜約８０nmの直径 を有する、請求の範囲第１項に記載の薬剤組成物。 １３．脂質粒子はリン脂質と陽イオン性脂質を含み、陽イオン性脂質は、ＤＯＤ ＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＣ−Ｃｈ ｏｌおよびこれらの組合せよりなる群から選択されるメンバーであり、リン脂質 は、ＤＯＰＥ、ＰＯＰＣ、ＥＰＣおよびこれらの組合せよりなる群から選択され るメンバーである、請求の範囲第１２項に記載の薬剤組成物。 １４．請求の範囲第１項に記載の薬剤組成物を宿主に送達することを含む、宿主 のＩＣＡＭ−１の過剰発現に関連する病状の治療方法。 １５．組成物はリポソーム組成物である、請求の範囲第１４項に記載の方法。 １６．組成物は脂質粒子を含む、請求の範囲第１４項に記載の方法。 １７．ＩＣＡＭ−１アンチセンス分子は約１５〜約５０の核酸を含み、ＩＣＡＭ −１の３’非翻訳領域の一部に相補的である、請求の範囲第１４項に記載の方法 。 １８．送達は静脈内への投与を含む、請求の範囲第１４項に記載の方法。 １９．送達は局所的投与を含む、請求の範囲第１４項に記載の方法。 ２０．脂質粒子はリン脂質と陽イオン性脂質を含み、陽イオン性脂質は、ＤＯＤ ＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＣ−Ｃｈ ｏｌおよびこれらの組合せよりなる群から選択されるメンバーであり、リン脂質 は、ＤＯＰＥ、ＰＯＰＣ、ＥＰＣおよびこれらの組合せよりなる群から選択され るメンバーである、請求の範囲第１６項に記載の方法。 ２１．請求の範囲第１４項に記載の方法であって、病状は、アルツハイマー病、 多発性硬化症、ブドウ膜炎、ヘルペス角膜炎、腎同種移植拒絶反応、糸球体腎炎 、肝同種移植拒絶反応、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、胆管炎、心臓同種 移植拒絶反応、動脈硬化性班、リウマチ様関節炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎 、乾癬、硬皮、移植片対宿主反応、接触皮膚炎、扁平苔癬、固定薬疹、菌状息肉 腫、および円形脱毛症である、上記方法。 ２２．症状は接触皮膚炎である、請求の範囲第１４項に記載の方法。