JP2000511543A

JP2000511543A - 害虫の駆除法

Info

Publication number: JP2000511543A
Application number: JP10500186A
Authority: JP
Inventors: スワンタラドン，クリアンサク; ハンター，ブルース; ウィットデウィリヘン，ウィルヘルムス・ペトルス・マリア
Original assignee: ノバルティスアクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1996-06-06
Filing date: 1997-05-27
Publication date: 2000-09-05
Also published as: GB9611777D0; WO1997046105A1; ID17325A; CN1312005A; AU3029697A; AU728817B2; HK1041414A1; CN1163146C; CN1221318A

Abstract

(57)【要約】本発明は、穀物であるが、特にトウモロコシ種、および、以下の種を含むがこれに限定されない他の穀物におけるオストリニア・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)種の駆除法を提供する：トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、オート麦、米、モロコシ、黍および関連穀物、飼葉、竹およびサトウキビ。

Description

【発明の詳細な説明】害虫の駆除法本発明は、バチルス・チューリンゲンシスおよび／または他のバチルス属から得られる毒素タンパク質を使用することによる、穀物における鱗翅目メイガ属、好ましくはオストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)の駆除法に関する。バチルス・チューリンゲンシスはグラム陽性、好気性、内生胞子形成細菌の大きなグループに属する。バチルス・セレウスまたはバチルス・アントラシスのような非常に近い他のバチルス属と異なり、現在までバチルス・チューリンゲンシスとして既知の大多数が、その胞子形成中にその結晶性構造のために結晶体と呼ばれるパラスポラル(parasporal)封入体を形成する。この結晶体は殺虫活性結晶プロ毒素タンパク質、いわゆるδ−エンドトキシンから成る。タンパク質結晶はバチルス・チューリンゲンシスの昆虫への毒性を担う。δ− エンドトキシンは結晶体が経口に摂取され、後者が標的昆虫の腸液に溶解される時まで、その殺虫活性を示さない。ほとんどの場合、実際の毒性成分は、昆虫消化管のプロテアーゼの作用によるタンパク質分解の結果として、プロ毒素から放出される。種々のバチルス・チューリンゲンシス株のδ−エンドトキシンは、ある標的昆虫、特に種々の鱗翅目、鞘翅目および双翅目幼虫への高い特異性、およびこのような感受性幼虫に対する高度な活性により特徴付けられる。バチルス・チューリンゲンシス由来の種々の殺虫結晶タンパク質が、その活性 Microbiol．Rev．53:242-255(1989)により発表された分類は、当時既知の殺虫結晶タンパク質を４つの主要なクラスに分けた。一般に、主要なクラスはその活性スペクトルにより定義し、CryＩタンパク質が鱗翅目に活性であり、CryIIタンパク質が鱗翅目および双翅目の両方に対して、CryIIIタンパク質が鞘翅目に対して活性であり、CryIVタンパク質が双翅目に対して活性である。各主要なクラス内で、δ−エンドトキシンは配列類似性に従って分類される。 CryＩタンパク質は典型的に１３０−１４０kDaプロ毒素タンパク質として製造され、それはタンパク質分解開裂され、約６０−７０ｋＤａの大きさの殺虫活性毒素タンパク質を製造する。δ−エンドトキシンの活性部分は、完全長分子のＮパク質を６群、ＩＡ(ａ)、ＩＡ(ｂ)、ＩＡ(ｃ)、ＩＢ、ＩＣおよびＩＤに分類した。それ以来、CryＩＥ、CryＩＦ、CryＩＧ、CryＩＨおよびCryＩＸとして分類されるタンパク質もまた特徴付けされている。バチルス・チューリンゲンシス由来の個々のδ−エンドトキシンの殺虫活性のスペクトルは、幾分狭い傾向があり、あるδ−エンドトキシンは数種の昆虫に対してのみ活性である。特異性は活性毒素タンパク質の製造に関与する種々の段階の効率および続いてそれが昆虫消化管上皮細胞と相互作用する能力の結果である。植物、好ましくは、トウモロコシ、小麦、ライ麦、オート麦、米、モロコシ、黍および関連作物、飼葉、竹およびびサトウキビを含むがこれらに限定されない穀物のオストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)種を駆除する方法を提供することが本発明の目的の一つである。この目的は、驚くべきことに、 CryＩタイプ毒素タンパク質のようなバチルス・チューリンゲンシスの毒素タンパク質を、保護する穀物に投与することにより、本発明の範囲内で達成される。本発明の他の態様において、バチルス種の栄養培養により得られる毒素タンパク質、即ちVIP３[ＥＰ−Ａ０６９０９１６；国際出願第ＥＰ／０３８２６号、その内容を全体を本明細書に引用して包含させる]のようないわゆるベジテーティブ・インセクティシダル・プロテイン(VIP)もまたオストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)害虫駆除に使用できる。本発明は、従って、保護する植物または植物種子または植物の生育領域に、バチルス種の毒素タンパク質、好ましくは上記CryＩタイプまたはVIPタイプタンパク質を、純粋または少なくとも一つの該タンパク質または毒素タンパク質をコードする少なくとも一つの毒素遺伝子を有する微生物、好ましくはバチルス・チューリンゲンシスおよび／またはバチルス・セレウス株を含む殺昆虫性(entomocid al)組成物の形で直接または間接的に投与することを含む、オストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)種によりもたらされる損傷に対する、植物 (その子孫を含む)を保護する方法に関する。本方法で使用する該微生物は、天然に存在する株か、または、毒素をコードする組換え遺伝子を含む別の、組換え株であり得る。好ましい態様において、トランスジェニック植物を、オストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)種によりもたらされる損傷に対して保護する植物に毒素を投与するために使用する。このような植物は、Cry−タイプ、好ましくはCryＩ−タイプ毒素タンパク質またはVIP−タイプタンパク質のようなバチルス種由来の殺虫毒素タンパク質をコードし、このように形質転換した植物を害虫が発生する領域に植えた場合、オストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)の駆除を提供するのに十分な量の該毒素タンパク質を発現する毒素遺伝子での形質転換より得る。オストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)害虫に対して穀物を保護するための本発明の方法で使用する殺昆虫性組成物は、例えば、活性成分として少なくとも一つのCry−タイプ毒素タンパク質、より好ましくは少なくともひとつのCryＩ−タイプタンパク質、より更に好ましくは少なくとも一つのCryＩＡ−タイプ毒素タンパク質および最も特に好ましくは少なくとも一つの配列番号５３から５５に従ったCryＩＡ(ｂ)タイプ毒素タンパク質、より更に好ましくはバチルス・チューリンゲンシスまたは少なくとも一つの該毒素タンパク質をコードする遺伝子を含む微生物、好ましくは該タンパク質をコードする少なくとも一つの遺伝子を含むバチルス・チューリンゲンシス株、またはその誘導体またはその変異体を、担体、希釈剤、界面活性成分または適用促進アジュバントのような農学的アジュバントと共に含む。殺昆虫性活性組成物中の活性成分は、ＥＰ−Ａ −０６９０９１６およびＰＣＴ国際出願ＥＰ９５／０３８２６に記載のようなVI P−タイプ毒素タンパク質またはCryＩ−タイプおよびVIP−タイプタンパク質の組み合わせでもあり得る。保護の範囲内で好ましいのは、VIP１Ａ(ａ)タンパク質またはVIP１(ｂ)タンパク質のようなVIP１−タイプタンパク質、もしくはVIP ２(ａ)タンパク質またはVIP２(ｂ)タンパク質のようなVIP２−タイプタンパク質、またはVIP１−タイプタンパク質とVIP２−タイプタンパク質の組み合わせ、もしくはVIP３(ａ)タンパク質またはVIP３(ｂ)タンパク質のようなVIP３−タイプタンパク質である。保護の範囲内でより好ましいのは、配列番号１、２、４− ７、１７−２４、２６−３２、３５、３６、３９、４０、４２、４３、４５、４６、４９、５０、５１または５２に示すVIP−タイプ毒素タンパク質である。本組成物は、更なる生物学的活性化合物も含み得る。該化合物は、肥料または微小栄養素ドナーまたは植物生育に影響する他の製剤であり得る。所望により、製剤の分野で慣用的に用いられる更なる農学的に許容される担体、界面活性成分、適用促進アジュバントと共に、除草剤、殺虫剤、殺真菌剤、殺菌剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤またはこれらの製剤の組み合わせを選択できる。適当な担体およびアジュバントは、固体または液体であり得、製剤法で通常使用される物質に対応し、例えば、天然または再生ミネラル物質、溶媒、分散剤、湿潤剤、粘着性付与剤、結合剤または肥料である。本組成物は０.１から９９重量％の活性成分、１から９９.９重量％の固体または液体アジュバントおよび０から２５重量％の界面活性成分を含み得る。活性成分または該活性成分を含む組成物は、保護する植物または穀物に、ある他の殺虫剤または薬品(1993 Crop Proteciton Chemicals Reference，Chemical and Phar maceutical Press，Canada)と共に、効果を損なうことなく投与し得る。ほとんどの他の一般に使用される農学的噴霧物質と適合性であるが、CryＩ−タイプ毒素が関与する場合、非常にアルカリ性の噴霧溶液中で使用してはならない。粉剤、懸濁液、水和剤または農学的適用に適当な他の物質形として適用し得る。好ましくはバチルス・チューリンゲンシスのCryＩ−タイプ毒素タンパク質および／または前記のVIP−タイプタンパク質の一つである活性成分または該活性成分を含む組成物を、(ａ)害虫が発生し得る環境に、(ｂ)植物または植物の一部を害虫によりもたらされる損傷から保護するために植物または植物の一部に、または(ｃ)種子から発芽する植物を害虫によりもたらされる損傷から保護するために種子に適用し得る。植物保護の領域で好ましい適用法は、植物の葉(葉面処理)であり、適用回数および適用割合は保護する稙物および害虫に感染する危険性に依存する。本発明の方法で使用する組成物はまた果実、塊茎または穀粒または切断植物のような植物繁殖材料、例えば種子を害虫から保護するためにも適している。繁殖材料を植える前に製剤で処理する：種子は、例えば、蒔く前に浸すことができる。本発明の活性成分はまた穀粒(コーティング)に、穀粒に液体製剤を充填するか、またはそれを固体製剤でコーティングすることにより適用できる。製剤は、繁殖材料を植える場合に、植える場所に、例えば、蒔く間に畝にも適用できる。本発明はまた植物繁殖材料を処理する方法およびこのように処理した植物繁殖材料にも関する。本発明の範囲内で、本組成物は種子または土壌を細菌株で処理するために既知の方法で適用し得る。例えば、米国特許第４,８６３,８６６号参照。株は、微生物が生存してなくてさえ、生態的防除に有効である。好ましくは、しかし、生存微生物を適用する。本発明の範囲内で保護する標的穀物は、オストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)種の宿主植物であるものであり、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、オート麦、米、モロコシ、黍および関連作物、飼葉、竹およびサトウキビを含むがこれらに限定されない。本発明の活性成分は非修飾形でまたは、適当な農学的に許容される担体と共に使用し得る。このような担体は、農学的製剤の分野で慣用的に用いられるアジュバントであり、従って、濃乳剤、コート可能ペースト、直接噴霧可能または希釈可能溶液、希釈乳剤、水和剤、可溶性粉末、散剤、顆粒および、例えば、ポリマー物質へのカプセル封入のために既知の方法で調剤し得る。組成物の性質と同様に、噴霧、霧吹き、散剤、拡散または注入を、意図する目的および優勢な環境に従って選択する。有利な投与の割合は、ヘクタール(“ha”、約２.４７１エーカー)当たり約５０ｇから約５kgの活性成分(a.i.)の範囲であり、好ましくは約１００ｇから約2kg a.i.／haである。適用の好ましい割合は２００ｇから約1kga. i.／haまたは２００ｇから５００ｇ a.i.／haである。種子ドレッシングのための有利な適用割合は、０.５ｇから１０００ｇ a.i.／１００kg種子の範囲、好ましくは３ｇから１００ｇ a.i.／１００kg種子である。最も好ましくは、適用割合は１０ｇから５０ｇ a.i.／１００kg種子である。適当な担体およびアジュバントは、固体または液体であり得、通常製剤法で使用される物質に対応し、例えば、天然または再生ミネラル物質、溶媒、分散剤、湿潤剤、粘着性付与剤、結合剤または肥料である。製剤、即ち殺昆虫性組成物、調製物または他の活性成分および適当な場合、固体または液体アジュバントとの混合物は、既知の方法、例えば、活性成分と増量剤、例えば溶媒、固体担体およびある場合、界面活性化合物(界面活性成分)の均質混合および／または粉砕により製造する。適当な溶媒は：芳香族炭化水素、好ましくは８から１２炭素原子を有する分画、例えばキシレン混合物または置換ナフタレン、フタル酸ジブチルまたはフタル酸ジオクチルのようなフタレート、シクロヘキサンまたはパラフィンのような脂肪族炭化水素、エタノール、エチレングリコール、モノメチルまたはモノエチルエーテルのようなアルコールおよびグリコールおよびそのエーテルおよびエステル、シクロヘキサノンのようなケトン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルスルフオキシドまたはジメチルホルムアミドのような強極性溶媒ならびにエポキシド化ココナッツ油または大豆油のような植物油またはエポキシド化植物油；または水である。例えば、粉剤および分散可能粉末に使用する固体担体は、通常、方解石、滑石、カオリン、モンモリロナイトまたはアタパルガイトのような天然ミネラル充填剤である。物理的特性を改善するために、高分散珪酸または高分散吸着ポリマーを添加することも可能である。適当な顆粒状吸着性担体は、多孔性タイプ、例えば、軽石、破壊煉瓦、海泡石またはベントナイトである；そして非吸着担体は、方解石または砂のような物質である。加えて、多くの無機または有機性質の前粒状化物質、特に苦灰石または粉砕植物残渣を使用できる。調剤する活性成分の性質に依存して、適当な界面活性化合物は、良好な乳化、分散および湿潤特性の非イオン性、カチオン性および／またはアニオン性界面活性成分である。“界面活性成分”なる用語は、界面活性成分の混合物も含むと理解される。適当なアニオン性界面活性成分は、水溶性石鹸および水溶性合成界面活性化合物の両方であり得る。適当な石鹸は、高級脂肪酸(Ｃ１０鎖−Ｃ２２鎖) のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩もしくは非置換または置換アンモニウム塩、例えばオレイン酸またはステアリン酸のナトリウムまたはカリウム塩、または例えばココナッツ油または獣脂から得ることができる天然脂肪酸混合物である。更に適当な界面活性成分は、また脂肪酸メチルタウリン塩ならびに修飾または非修飾リン脂質である。より頻繁には、しかしながら、いわゆる合成界面活性成分、特に脂肪性スルホン酸エステル、脂肪性の硫酸塩、スルホン化ベンズイミダゾール誘導体またはアルカリアリールスルホン酸を使用する。脂肪性スルホン酸エステルは通常アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩もしくは非置換または置換アンモニウム塩の形で使用し、一般にＣ８鎖−Ｃ２２鎖アルキル基(これは更にまたアシル基のアルキル部分を含む)を含み、例えばリグノスルホン酸、ドデシルスルホン酸、または天然脂肪酸から得られる脂肪性アルコールスルホン酸の混合物のナトリウムまたはカルシウム塩である。これらの化合物は、硫酸エステルおよびスルホン酸の脂肪性アルコール／エチレンオキサイド付加物の塩も含む。スルホン化ベンズイミダゾール誘導体は好ましくは二つのスルホン酸基および約８から２２炭素原子を含む一つの脂肪酸基を含む。アルキルアリールスルホン酸の例は、ドデシルベンゼンスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸またはナフタレンスルホン酸／ホルムアルデヒド縮合産物のナトリウム、カルシウムまたはトリエタノールアミン塩である。また適当なのは対応するリン酸、例えば、ｐ−ノニルフェノールの付加物の４から１４モルのエチレンオキサイドリン酸エステルの塩である。非イオン性界面活性成分は、好ましくは脂肪族または環状脂肪族アルコール、または飽和または不飽和脂肪酸およびアルキルフェノールのポリグリコールエーテル誘導体であり、該誘導体は３から３０グリコールエーテル基および８から２０炭素原子を(脂肪族)炭化水素部分に、そして６から１８炭素原子をアルキルフェノールのアルキル部分に含む。更に適当な非イオン性界面活性成分は、ポリエチレンオキサイドとポリプロピレングリコール、エチレンジアミノプロピレングリコールおよびアルキル鎖に１から１０炭素原子を含むアルキルプロピレングリコールの水溶性付加物であり、該付加物は２０から２５０エチレングリコールエーテル基および１０から１００プロピレングリコールエーテル基を含む。これらの化合物は、通常、プロピレングリコール単位当たり１から５エチレングリコール単位含む。非イオン性界面活性成分の代表例はノニルフェノールポリエトキシエタノール、ヒマシ油ポリグリコールエーテル、ポリプロピレン／ポリエチレンオキサイド付加物、トリブチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコールおよびオクチルフェノキシポリエトキシエタノールである。ポリエチレンソルビタントリオレエートのようなポリエチレンソルビタンの脂肪酸エステルもまた非イオン性界面活性成分である。カチオン性界面活性成分は、好ましくはＮ−置換基として、少なくとも一つのＣ８鎖−Ｃ２２鎖アルキル基および更なる置換基として、低級非置換またはハロゲン化アルキル、ベンジルまたはヒドロキシル低級アルキル基を含む四級アンモニウム塩である。これらの塩は好ましくはハライド、メチル硫酸塩、エチル硫酸塩、例えば、ステアリルトリメチルアンモニウムクロリドまたはベンジルジ−( ２−クロロエチル)エチルアンモニウムブロミドの形である。製剤の分野で慣習的に使用される界面活性成分は、例えば、“McCutchenon's Detergents and Emulsifiers Annual”，MC Publishing Corp．Redgewood，N．J .，1979;Dr．Helmut Stache,“Tensid Taschenbuch”(Handbook of Surfactants ),Carl Hanser Verlag，Munich/Viennaに記載されている。本発明の殺昆虫性組成物の他の特に好ましい特性は、植物および土壌に適用した時の活性成分の持続性である。活性の減少の可能性のある原因は、紫外線、熱、葉滲出物およびｐＨによる不活性化を含む。例えば、高ｐＨでは、特に還元剤存在下で、δ−エンドトキシン結晶が溶解し、従ってタンパク質分解による不活性化を受けやすい。高葉ｐＨは、また特に葉表面がｐＨ８−１０の範囲になり得る点で、重要である。本発明の方法に使用する殺昆虫性組成物の調剤は、活性成分の損失を防止するのを助ける添加剤を含むか、または活性成分が不活性化から保護される方法でカプセル封入することにより、これらの問題を扱う。カプセル封入は化学的(McGuireおよびShasha，J．Econ．Entomol．85:1425-1433，1992) または生物学的(BarnesおよびCummings，1986;ＥＰ−Ａ−０１９２３１９)により達成できる。化学的カプセル封入は、活性成分をポリマーでコートする過程を含み、一方生物学的カプセル封入は、微生物中でのδ−エンドトキシン遺伝子の発現を含む。生物学的カプセル封入のために、毒素タンパク質を含むそのままの微生物を製剤中の活性成分として使用する。ＵＶ保護剤の添加は照射損傷の減少に有効である。熱による不活性化は、適当な添加剤の包含によりまた制御される。本発明の範囲内で好ましいのは、活性成分として生存微生物を、成長細胞またはより好ましくは、利用可能な場合胞子の形で含む製剤である。適当な製剤は、例えば、多価カチオンと架橋し、これらの微生物を含むポリマーゲルから成り得る。これは、例えば、ポリマー物質のアルギン酸塩がD．R．Fravel et al．Phyt opathology，Vol．75，No.．7，774-777，1985に記載されている。この刊行物から、担体物質を共使用できることも既知である。これらの製剤は、該して、天然に存在するまたは合成ゲルー形成ポリマー、例えばアルギン酸塩の溶液と個々の小滴の形のような多価金属イオンの水性塩溶液の混合により製造し、微生物を二つのうち一つの懸濁液または両方の反応溶液に懸濁することが可能である。ゲル形成は小滴形への混合で開始する。これらのゲル粒子の続く乾燥が可能である。この方法は向イオン性ゲル化と呼ばれる。乾燥の程度に応じて、構造的に多価カチオンを介して架橋し、微生物および優れて均質に分散して存在する担体を含むポリマーの密集した硬粒子を形成させる。粒子のサイズは5mmまでである。微生物に加えて、担体物質として細分散珪酸を含み得、架橋が例えばＣａ⁺⁺イオンを介して起こる部分的に架橋したポリサッカライドを基本にした組成物は、ＥＰ−Ａ１−００９７５７１に記載されている。本組成物は０.３より多くない水活性を有する。W．J．Cornick et al.はレビュー文献[New Directions in Bio logical Control:Alternatives for Suppressing Agricultural Pests and Dise ases，p．345-372，Alan R．Liss，Inc．(1990)]で向イオン性ゲル化法により製造した種々の製剤システムを記載し、担体としてバーミキュライトを含む顆粒および密集アルギン酸ビーズを述べている。このような組成物はまたD．R．Fravel ,Pesticide Formulations and Application Systems:11th Volume，ASTM STP 11 12 American Society for Testing and Materials，Philadelphia，1992，p．17 3-179にも記載され、本発明の組換え微生物を調剤するのに使用できる。生存微生物を調剤する更なる方法はＷＯ９６／０２６３８に記載されている。本発明の組成物は、少ない割合の適用でさえ、害虫駆除の分野における予防的および／または治療的処置に有効であり、温血動物種、魚および植物に非常に耐容性であり、非毒性であり、非常に好ましい殺生物スペクトルを有する。本発明の組成物は、オストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)害虫の全てのまたは個々の生育段階に対して活性である。本発明の化合物の殺虫活性は、直接的に、即ち、害虫をすぐにまたはわずかな時間経過後に破壊することにより、明らかにできる。本組成物は、実質的に純粋な形で毒素タンパク質を含む化学的混合物の形で、または微生物またはトランスジェニック植物の一部として、少なくとも一つの毒素タンパク質を含む混合物の形で提供できる。本発明の具体的態様において、活性成分の一つを植物に直接、例えば、先に本明細書で述べたような葉面処理により、適用し得、一方第２の作用素因は該第２の素因をコードした遺伝子で先に形質転換した遺伝子を発現することにより、植物自身により提供される。本発明の方法で使用する殺昆虫性組成物は、通常約０.１から約９９％、好ましくは約０.１から約９５％および最も好ましくは約３から約９０％の活性成分；約１から約９９.９％、好ましくは約１から約９９％、および最も好ましくは約５から約９５％の固体または液体アジュバント；および約０から約２５％、好ましくは約０.１から約２５％および最も好ましくは約０.１から約２０％の界面活性成分を含む。商品は濃縮剤として調剤するのが好ましいが、最終使用者はかなりの低濃度の希釈製剤を使用する。殺昆虫性組成物はまた安定化剤、消泡剤、粘性調節剤、結合剤、粘着性付与剤および肥料のような更なる成分、ならびに特定の効果を得るための他の活性成分も含み得る。本発明はまた活性成分として、成長細胞の形で、または利用可能な場合、胞子の形で存在する生存微生物を含む製剤にも関する。本発明の更なる目的は、オストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)種によりもたらされる損傷に対して穀物をコントロールする方法におけるC ryＩ−タイプタンパク質のようなバチルス・チューリンゲンシスの毒素タンパク質をコードする毒素遺伝子を含む組換え微生物の使用に関し、組換え生物は直接保護する植物に適用するか、または組換え的に製造した毒素を最初に組換え微生物から単離し、保護する穀物に適用する前に前記のように調剤する。組換え微生物はＥＰ−Ａ−６９０９１６および国際出願ＥＰ９５／０３８２６に記載のようなVIP−タイプ毒素タンパク質をコードする毒素遺伝子またはそれぞれ少なくとも一つのCry−タイプ毒素および一つのVIP−タイプ毒素をコードする遺伝子の組み合わせを含み得る。宿主生物での毒素タンパク質の組換え製造のために、コード配列を選択した宿主のために設計した発現カセットに挿入し、組換え的に製造する宿主に挿入する。選択した宿主に適当なプロモーター、シグナル配列、５'および３'非翻訳配列およびエンハンサーのような特異的調節配列は、当業者の技術範囲内である。適当な読み取り枠に結合した個々のエレメントを含む得られた分子を、宿主細胞を形質転換できるベクターに挿入する。タンパク質の組換え製造のための適当な発現ベクターおよび方法は、エシェリキア・コリ(例えば、StudierおよびMoffatt ，J．Mol．Biol．189:113(1986);Brosius，DNA 8:759(1989)参照)、酵母(例えば、SchneiderおよびGuarente，Meth．Enzymol．194:373(1991)参照)および昆虫細胞(例えば、LuckowおよびSummers，Bio/Technol．6:47(1988)参照)のような宿主生物で既知である。具体例は、pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)、pFLAG (International Biotechnologies，Inc.，New Haven，CT)、pTrcHis(Invitrogen ，La Jolla，CA)およびバキュロウイルス発現ベクター、例えばオートグラフィカ・カリフォルニカ核多核体病ウイルス(AcMNPV)のゲノム由来のものを含む。好ましいバキュロウイルス／昆虫システムはpVI11392/Sg21細胞(Invitrogen，La J olla，CA)である。組換え製造毒素タンパク質は、種々の標準法を使用して単離および精製できる。使用し得る実際の方法は、使用する宿主生物、毒素タンパク質が分泌のために設計されたものか、および当業者が知っているこのような因子に依存する(例えば、Ausbel,F．et al.，“Current Protocols in Molecular Biology”,John Wi ley & Sons，Inc．出版(1994)の１６章参照)。本発明の好ましい目的は、オストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)種の駆除に十分な量、バチルス・チューリンゲンシスの毒素タンパク質、特にCryＩ−タイプ毒素タンパク質をコードする遺伝子を含み発現するトランスジェニック植物の、オストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー) 害虫によりもたらされる損傷に対して植物を保護する方法における使用に関する。本植物は、核形質転換またはプラスチド形質転換(ＷＯ９５／２４４９２参照) によりもたらされ得る。特に好ましいのは、バチルス・チューリンゲンシスのCr y ＩＡ(ｂ)毒素タンパク質を発現するトランスジェニック植物である。本発明はまた、その全体を本明細書に引用して包含させるＥＰ−Ａ−６９０９１６および国際出願ＥＰ９５／０３８２６に記載のVIP−タイプタンパク質をコードする毒素遺伝子を含むトランスジェニック植物の使用にも関する。本発明はまたオストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)種の駆除を提供するのに十分な量で、バチルス・チューリンゲンシスの毒素タンパク質をコードする毒素遺伝子であるが、特にCry−タイプ毒素遺伝子を含み、発現し、またVIP−タイプタンパク質をコードする毒素遺伝子を含み、発現するトランスジェニックの使用にも関する。該毒素遺伝子を発現する宿主植物は、オストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)種の昆虫攻撃に対する促進された抵抗性を有し、このような攻撃に関する穀物損失への抵抗を備える。一つの好ましい態様において、トランスジェニック植物における１個またはそれ以上のＢｔ δ−エンドトキシンは、１個またはそれ以上のVIP−タイプタンパク質の発現により達成される。この同じトランスジェニック植物内での殺虫素因の１個以上の殺虫剤の同時発現は、必要な全ての遺伝子を含み、発現するように植物を遺伝子操作することにより達成される。あるいは、親１である植物をVI P−タイプタンパク質の発現のために遺伝子操作する。親２である第２植物をＢｔ δ−エンドトキシンの発現のために遺伝子操作する。親１と親２を交配することにより、子孫植物を得、それは親1および２に挿入した全ての遺伝子を発現する。特に好ましくは、Ｂｔ δ−エンドトキシンは本明細書に引用して包含させるＥＰ−Ａ−０６１８９７６に記載のものである。本発明にまた包含されるものは、バチルス種の毒素タンパク質をコードするＤＮＡ分子であるが、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド長の該毒素タンパク質のコード配列の連続部分を含む該ＤＮＡ分子から得られるオリゴヌクレオチドプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ分子をコードする遺伝子を含む組換え微生物またはトランスジェニック植物の使用である。本発明は、好ましくはバチルス・チューリンゲンシスまたはバチルス・セレウスの毒素タンパク質をコードするＤＮＡ分子、特にCry−タイプタンパク質をコードするＤＮＡ分子またはVIP−タイプ毒素タンパク質、好ましくは CryＩＡ(ｂ) タンパク質をコードする毒素遺伝子とハイブリダイズするＤＮＡ分子をコードする遺伝子を含む組換え微生物またはトランスジェニック植物の使用を含む。ハイブリダイズの安定性に作用する因子は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する。一つのこのような因子は、ＤＮＡＰＲＯＢＥＳ，Ge orgeH．KellerおよびMark M．Manak，Macmillan Publishers Ltd．1993，Sectio none:Molecular Hybridizatoin Technology:８頁以降に提供される式に従って容易に計算できる融解温度Ｔ_mである。好ましいハイブリダイゼーション温度は、計算融解温度Ｔ_mの約２５℃下の範囲であり、好ましくは計算融解温度Ｔ_mの約１２−１５℃下の範囲であり、オリゴヌクレオチドの場合、融解温度Ｔ_mの約５−１０℃下の範囲である。本発明は、更に、バチルス・チューリンゲンシス、好ましくはCry−タイプ毒素タンパク質、より好ましくはCryＩ−タイプ毒素タンパク質をコードする毒素遺伝子を少なくとも一つ含み、該毒素タンパク質を、オストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)の駆除に十分な量発現する、トランスジェニックの種子を含む、穀物のオストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー) 害虫を駆除するための使用の指示のラベルをした商品袋に関する。本発明の範囲内で好ましいのは、活性成分として、少なくとも一つのCry−タイプ毒素タンパク質およびVIP−タイプタンパク質をコードする遺伝子を含むトランスジェニック植物の種子を含む商品袋である。特に好ましいのは、CryＩＡ(ｂ)毒素タンパク質とVIP−タイプタンパク質の組み合わせである。本発明の更なる目的は、本発明の殺虫組成物を含む、穀物のオストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)の駆除のための使用の指示のラベルをした商品袋である。植物なる用語は、当分野の方法で遺伝的に形質転換できる植物種を意味するが、特に、以下の植物種を含むがこれに限定されないオストリアナ・フルナカリス (アジア・コーン・ボーラー)種の宿主植物である植物である：トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、オート麦、米、モロコシ、黍および関連穀物、飼葉、竹(カモガヤ、ウシノケグサ属等)およびサトウキビ。植物形質転換のために既知の方法を下記に記載する。宿主植物は、先に標的穀物として挙げたものを含むが、これらに限定されない。本発明は、更にバチルス・チューリンゲンシスの毒素タンパク質をコードする遺伝子を含み、害毒素タンパク質をオストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)種の駆除を提供するのに十分な量発現するトランスジェニック植物の種子および該種子を含む商品袋に関する。植物なる用語は、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、オート麦、米、モロコシ、黍および関連穀物、飼葉、竹およびサトウキビを含むが、これらに限定されないオストリアナ・フルナカリス( アジア・コーン・ボーラー)の宿主となる植物種を意味する。天然バチルス・チューリンゲンシス毒素遺伝子のコドン使用性は、典型的植物遺伝子のものとは明らかに異なる。特に、天然バチルス・チューリンゲンシス遺伝子のコドン使用性は、トウモロコシ遺伝子のものと非常に異なる。結果として、この遺伝子由来のｍＲＮＡは十分に利用されない。コドン使用性は、翻訳または転写のレベルまたはｍＲＮＡ処理で遺伝子の発現に影響を与える。毒素タンパク質を植物内、例えばトウモロコシ内での発現に最適とするために、コドン使用性を、天然毒素遺伝子配列で発見された同じタンパク質をコードする合成遺伝子の合成においてトウモロコシでもっとも好ましいコドン(トウモロコシ優先コドン)の使用により最適化する。最適化トウモロコシ優先コドン取り扱いは、高レベルのＢｔ殺虫タンパク質の発現に有効である。トウモロコシ最適化合成毒素遺伝子の構築の更なる詳細は、本明細書にその全体を引用して包含させるＷＯ９３／０７２７８に見ることができる。微生物由来の毒素遺伝子は、植物遺伝子とも異なり得る。植物遺伝子は、その転写ＲＮＡが開始メチオニンに隣接した定義されたリボソーム結合部位は配列を有しないことで、微生物で見られた遺伝子と異なる。結果として、微生物遺伝子は、ＡＴＧの真核細胞コンセンサス翻訳イニシエーターの包含により促進することができる。Clontech(1993/1994カタログ、２１０頁)は、植物内のエシェリキア・コリuidA遺伝子の発現のためのコンセンサス翻訳イニシエーターとして配列ＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＴＣを示唆する。更に、Joshi(Nucl．Acids Res．15:6643-6653(1987))は、ＡＴＧに隣接した多くの植物配列を比較し、コンセンサスＴＡＡＡＣＡＡＴＧＧＣＴを示している。植物内での微生物ＯＲＦの発現が困難である状況において、これらの配列の一つの開始ＡＴＧへの挿入が翻訳を改善し得る。このような場合、コンセンサスの少なくとも３つのヌクレオチドは、２次アミノ酸残基の修飾のために、修飾配列への包含に適当でないことがある。好ましい開始メチオニンに隣接した配列は、異なる植物種で異なり得る。GenBank/EMBLデーターベースに存在するトウモロコシ遺伝子の配列を測量することにより、ＡＴＧに隣接したヌクレオチドがトウモロコシに挿入した毒素遺伝子の翻訳を促進するために修飾すべきであることを認めることができる。加えて、異常スプライス部位の除去が挿入遺伝子の発現および安定性を増加できることが示されている。非植物源からクローン化され、植物内での発現に最適化されていない遺伝子は、5'または３'スプライス部位として植物内で認識できるモチーフを含み得る。結果として、転写処理は早く停止し、切断または欠失ｍＲＮＡを産生する。毒素遺伝子は、これらの異常スプライス部位を、当分野で既知の方法を使用して除去することにより操作できる。バチルス・チューリンゲンシス由来の多くのδ−エンドトキシンがプロ毒素として発現される。これらのプロ毒素は、昆虫消化管のアルカリ環境で可溶性であり、次いでタンパク質分解的にプロテアーゼにより開裂され、毒素コアフラグメ CryＩクラスのδ−エンドトキシンタンパク質に関して、毒素コアフラグメントはプロ毒素のＮ−末端側半分に局在化する。新規毒素タンパク質の完全長プロ毒素形または切断毒素コアフラグメントをコードする遺伝子が宿主植物で殺虫特性を付与するための植物形質転換ベクターに使用できることが本発明の範囲内である。組換えＤＮＡ分子は、植物細胞内に多くの当分野で認識された方法で挿入できる。当業者は、方法の選択が形質転換の標的の植物のタイプ、即ち単子葉または双子葉に依存することを認識する。植物細胞を形質転換する適当な方法は、マイクロインジェクション(Crossway et al.，BioTechniques 4:320-334(1986))、エレクトロポレーション(Riggs et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83/5602 −5606(1986))、アグロバクテリウム介在形質転換(Hinchee et al.，Biotechnol ogy 6:915-921(1988))、直接遺伝子移入(Paszkowski et al.，EMBO J．3:2717-2 722(1984))およびAgracetus，Inc．Madison，Wisconsinおよび Dupont，Inc.，Wilmington，Delaware(例えば、Sanford et al.，米国特許第４, ９４５,０５０号；およびcCabe et al.，Biotechnology 6:923-926(1988)参照) から入手可能な装置を使用した軌道粒子加速を含む。またWeissinger et al.，A nnual Rev．Genet．22:421-477(1988);Sanfordeet al .，Particulate Science and Technology 5:(27-3791987)(タマネギ);Chri stou et al.，Plant Physiol ．87:671-674(1988)(大豆);McCabe et al.，Bio/Technology６:923-926(1988)( 大豆);Datta et al.，Bio/Technology 8:736-740(1990)(米);Klein et al.，Pro c．Natl．Acad．Sci．USA，85:4305-4309(1988)(トウモロコシ);Klein et al.， Bio/Technology 6:559-563(1988)(トウモロコシ);Klein et al.，Plant Physiol ．91:440-444(1988)(トウモロコシ);Fromm et al.，Bio/Technology 8:833−839 (1990)；そしてGordon-Kamm et al.，Plant Cell 2:603-618(1990)(トウモロコシ);Svab et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:8526-8530(1990)(タバコ葉緑体);Koziel et al．(Biotechnology 11:194-200(1993))(トウモロコシ);Shima moto et al.，Nature 338:274-277(1989)(米);Christou et al.，Biotechnology 9:957-962(1991)(米);欧州特許出願ＥＰ０３３２５８４(カモガヤおよび他のプーイデアエ);Vasil et al．(Biotechnology 11:1553-1558(1993)(小麦);Weeks e t al．(Plant Physiol．102:1077-1084（1993）(小麦);Wan et al．(Plant Phys iol．104:37-48(1994)(大麦);Umbeck et al.，(Bio/Technology 5:263-266(1987 )(綿)もまた参照。組換えＤＮA分子をトウモロコシに、微粒子銃により挿入する一つの特異的な好ましい態様が、その全体を引用して本明細書に包含させるＷＯ９３／０７２７８に見ることができる。更なる好ましい態様は、その全体を引用して本明細書に包含させる出願ＥＰ−Ａ−２９２４３５に記載のような、トウモロコシの原形質形質転換法である。上記トランスジェニック種子および植物に操作された遺伝的特性は、有性生殖または栄養生育で継代され、従って、子孫植物に維持され、繁殖する。一般に、該維持および繁殖は、耕作、種蒔きまたは収穫のような特異的目的に適するために開発された既知の農学的方法の使用をする。水耕栽培または温室法のような特殊な目的もまた適用できる。生育穀物が昆虫によりもたらされる攻撃および損傷または感染にならびに雑草植物との競争に無防備であるため、処置は雑草、植物疾病、昆虫、線虫類および他の不利な条件の制御のために行い、収率を改善する。これらは土壌の耕地または雑草および感染植物の除去の機械的処置、ならびに除草剤、殺菌剤、殺配偶子剤、殺線虫剤、成長調節剤、成熟剤および殺虫剤のような農薬の適用を含む。本発明のトランスジェニック植物および種子の有利な遺伝的特性の使用は、更に、害虫、除草剤または負荷への耐性、改善された栄養価、増加した収率、もしくは倒伏または破損による損失の減少をもたらす改善された構造の植物を開発する目的の植物育種でも成し得る。種々の育種段階が、交配すべき系の選択、親系の管理受粉または適当な子孫植物の選択のような明確な人の関与により特徴付けられる。所望の特性に依存して、異なる育種処理を行う。適切な方法は当分野で既知であり、ハイブリダイゼーション、同系交配、戻し交配、多系育種、種々の交雑、種間ハイブリダイゼーション、異数体法などを含むが、これらに限定されない。ハイブリダイゼーション法は、また植物の断種を含み、機械的、化学的または生化学的処理で雄性または雌性不稔植物を作る。雄性不稔植物と異なる系の花粉の交差受粉は、雄性不稔であるが、雌性稔性植物のゲノムが均質に両方の親系の特性を獲得することを確実とする。従って、本発明のトランスジェニック種子および植物は、例えば、除草剤または農薬処置のような慣用法の効果を増加させるか、その修飾遺伝子の特性のために、該方法の施行をさせる改善された植物系の育種に使用できる。あるいは、改善された負荷体制の新規植物は、その最適化遺伝子“装備”のために、同等な不利な発育条件に耐性でないものの生産物よりも良好な質の生産物を収穫することができる。種子製造において、発芽質および種子の均一性は、必須の生産物特性であるが、農家が収穫し、発売した種子の発芽質および均一性は重要ではない。穀物の他の穀物および雑草種子から離しておくことが難しいため、種子運搬疾病をコントロールするために、そして良好な発芽の種子を製造するために、かなり大量の、そして明確な種子製造慣例が、純粋な種子の生育、条件付けおよび販売の分野の経験者である種子生産者により開発されている。従って、自分の穀物から収穫した種子を使用する変わりに、特異的な質的標準に合う保証できる種子を買うことは農家にとって慣例である。種子として使用する繁殖材料は、除草剤、殺虫剤、殺真菌剤、殺菌剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤またはこれらの混合物を含む保護剤コーティングで慣習的に処理される。慣習的に使用される保護剤コーティングは、化合物は、細菌、真菌または動物害虫によりもたらされる損傷に対する防御を提供するために、調剤の分野で慣習的に用いられる更なる担体、界面活性成分または適用促進アジュバントと調剤する。保護剤コーティングは、液体製剤を繁殖材料に浸透させるか、または湿潤または乾燥製剤の組み合わせでコーティングすることにより適用し得る。直接芽または果実を処置するような他の適用法もまた可能である。オストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)の駆除を提供するための、本発明のトランスジェニック植物、トランスジェニック植物材料またはトランスジェニック種子使用により特徴付けられる、上記で例示の方法のような新規農業的方法の提供は本発明の更なる態様である。本発明の方法で形質転換した植物から子孫を育てるために、下記のような方法を使用し得る：下記の実施例に記載のように製造したトウモロコシ植物を温室内の鉢または土壌で、当分野で既知のように育て、花を咲かせる。花粉を成熟雄穂から得、同じ植物、同朋種、または任意の望ましいトウモロコシ植物の雌穂の受粉に使用する。同様に、形質転換植物から発育した雌穂を同じ植物、同朋種または任意の望ましいトウモロコシ植物から得た花粉で受粉し得る。この方法で得た形質転換子孫を導入遺伝子および／または随行ＤＮＡ(遺伝子型)の存在、または付与表現型により、非形質転換子孫と区別し得る。形質転換子孫は、同様に、所望の特性を担持する植物で通常行うように、自家受粉するか、または他の植物と交配させ得る。同様に、この方法で製造したタバコまたは他の形質転換植物を、所望の特性を有する子孫を製造するために当分野で既知のように、自家受粉するか、交配し得る。同様に、他の当分野で既知の方法と本発明の方法の組み合わせで製造したトランスジェニック生物は、当分野で既知のように育種し、所望の特性の子孫を生産し得る。実施例以下の実施例は、本発明の具体的態様を得るために使用する材料および方法を更に記載する。それらは説明のために記載し、本発明の記載を限定するものと解釈してはならない。実施例１：一般法ＤＮＡ操作は、当分野で慣用的に実施されている方法を使用して行った。これらの方法は、結果を実質的に変えることなく、しばしば修飾および／または置換できる。他の引用文献が同定されていない限り、本方法は、Sambrook et al.，M olecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Pres s，第２版，1989のような一般的教則本に記載されている。実施例２：植物形質転換ベクター植物形質転換は、両方とも本明細書に引用して包含させるＷＯ９３／０７２７８およびKozziel et al．（1993）[Biotechnology Vol．11，194-200]に記載の形質転換ベクターpCIB4431およびpCIB3064を使用して行う。pCIB4431はトウモロコシの形質転換のために設計されたベクターである。これはトウモロコシ中で発現可能な二つのキメラ合成Ｂｔ CryＩＡ(ｂ)エンドトキシン遺伝子を含み、その中の一つはＰＥＰカルボキシラーゼプロモーター／合成−CryＩＡ(ｂ)遺伝子を含み、他方は花粉プロモーター／合成CryＩＡ(ｂ)遺伝子を含む。pCIB4431は配列番号１に記載の合成CryＩＡ(ｂ)遺伝子を含み、アメリカ合衆国６１６０４イリノイ州、ペオリア、ノース・ユニバーシティー・ストリート１８１５番、ノーザン・レジオナル・リサーチ・センターのアグリカルチュラル・リサーチ・サービス、パテント・カルチャー・コレクション(ＮＲＲＬ)に受託番号ＮＲＲＬＢ−１８９９８で１９９２年９月２１日に寄託した。pCIB3064は、本来ストレプトマイセス・ヒグロスコピクスからクローン化した[Thompson et al．（1987）E MBO J．6，2519-2523]植物発現可能bar遺伝子(６１５bp)を含む。これはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(ＰＡＴ)をコードし、ホスフィノトリシンに対する耐性を付与する。bar遺伝子はＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびターミネーター[OW et al．（1987）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84，4870-487 4]の制御下にあり、ホスフィノトリシンに対する耐性を提供する。実施例３：合成トウモロコシCryＩＡ(ｂ)遺伝子を含むトランスジェニックトウモロコシ植物の製造下記実施例は、ＤＮＡコート粒子をトウモロコシ細胞に挿入するために微粒子銃装置を使用し、そこから形質転換植物を発生させる。３.１組織１.５−２.５mm長の未成熟トウモロコシ胚を遺伝子型6N615の雌穂から、受粉誤１４−１５日後に取った。母植物を温室で栽培した。取り出す前に、雌穂を２０％Cloroxで２０分表面殺菌し、３回滅菌水ですすいだ。個々の胚を胚盤側を上に、２cm平方領域に置き、カルス開始培地、2DG4＋５クロラムベン培地(Ｎ６主要な塩、Ｂ５少ない塩、ＭＳ鉄、２％スクロース)で３６個の胚を平板培養し、５mg／ｌクロラムベン、２０mg／ｌグルコースおよび１０m１Ｇ４添加物(表１) をオートクレーブ後加えた。表１：Ｇ４添加物成分培地１リットル当たりカゼイン加水分解産物０.５ｇプロリン１.３８ｇニコチン酸０.２mg ピリドキシン−ＨＣｌ０.２mg チアミン−ＨＣｌ０.５mg コリン−ＨＣｌ０.１mg リボフラビン０.０５mg ビオチン０.１mg 葉酸０.０５mg パントテン酸Ｃａ０.１mg ｐ−アミノ安息香酸０.０５mg Ｂ１２０.１３６μｇ３.２送達のためのＤＮＡの製造本質的に微粒子銃装置に添付の説明書に従って、マイクロキャリアを製造した。１０μｍマイクロキャリア５０μｌをボルテックス処理しながら、pCIB4431( １.２３μｇ／μｌ)[#898]＋２μｌ pCIB3064(０.８９５μｇ／μｌ)[#456]、続いて２. ５ＭＣａＣｌ₂ ５０μｌ、次いで０.１Ｍスペルミジン(遊離塩基、ＴＣグレード)を添加した。得られた混合物を３分ボルテックス処理し、１０秒微量遠心した。上清を除去し、マイクロキャリアを２回１００％ＥｔＯＨ(ＨＰＬＣグレード)２５０μｌで、簡単にボルテックス処理し、遠心し、上清を除去することにより洗浄した。マイクロキャリアを１００％ＥｔＯＨ６５μｌに再懸濁した。３.３照射組織をPDS-100He Biolistics装置を使用して照射した。組織を停止スクリーンシェルフの８cm下のシェルフに置いた。組織を、マクロキャリア上で乾燥させた１０μｌのＤＮＡ／金マイクロキャリア溶液で１回撃った。使用した停止スクリーンを１０×１０ステンレススチールメッシュスクリーンを使用して、手で穿孔した。１５５０psi値の破断ディスクを使用した。照射後、胚を暗中、２５℃ で培養した。３.４カルス形成胚を３mg／ＰＰＴ含有カルス開始培地に、照射１日後に移した。胚を照射２および３週間後にカルス形成に関して計数した。反応のあったものをカルス維持培地、３mg／ＬＰＰＴ添加２ＤＧ４＋０.５２,４−Ｄ培地に移した。カルス維持培地はＮ６主要な塩、Ｂ５少ない塩、ＭＳ鉄、２％スクロースであり、０.５m g／ｌ２,４−Ｄ、２０mg／ｌグルコースおよび１０mg Ｇ４添加物をオートクレーブ後に添加した。胚形成カルスを２週間毎に３mg／ＬＰＰＴを含む新鮮維持培地に継代した。全てのカルスは暗中、２５℃で保温した。タイプＩカルス形成反応は１５％であった。カルスを形成した全ての胚を、個々の系を発生させる個々の事象として培養した。３.５再生選択１２週間後、組織をＰＰＴ含有カルス維持培地から除き、再生培地に置いた。再生培地は２週間0.25MS3S5BA(０.２５mg／ｌ２,４−Ｄ、５mg／ｌＢＡＰ、ＭＳ塩、３％スクロース)であり、続いて植物の再生のためにMS3S培地に継代した。４から１０週後、植物は再生し、ＧＡ７に蒔いた。実施例４：トランスジェニックトウモロコシ植物の分析４.１ＥＬＩＳＡアッセイトランスジェニックトウモロコシ中のcryＩＡ(ｂ)遺伝子発現の検出を、アジア・コーン・ボーラー昆虫バイオアッセイおよび得られたCryＩＡ(ｂ)のレベルの定量的測定のためのＥＬＩＳＡ分析を使用して追跡する。トランスジェニック植物の葉のCryＩＡ(ｂ)殺虫タンパク質の定量的測定は、Clark M F，Lister RM ，Bar-Joseph M:ELISA Techniques．Weissbach A，Weissbach H(編)Methods in Enzymology 118:742-766，Academic Press，Florida(1986)に記載のような酵素結合免疫収着検定(ＥＬＩＳＡ)を使用して行う。バチルス・チューリンゲンシス亜種クルスタキ殺虫タンパク質に特異的な免疫親和性精製ポリクローナルウサギおよびヤギ抗体を使用して、葉サンプルの粗抽出物から可溶性タンパク質mg当たりの殺虫タンパク質の量を測定する。ダブルサンドイッチＥＬＩＳＡの感度は、ＥＬＩＳＡマイクロタイター皿ウェル当たり５０μｇの全タンパク質を使用して、可溶性タンパク質mg当たり１−５ng殺虫タンパク質である。トウモロコシ抽出物を、抽出緩衝液(５０ｍＭＮａ₂ＣＯ₃、ｐＨ９.５、１００ｍＭＮａＣｌ、０.０５％トリトン、０.０５％トゥイン、１ｍＭＰＭＳＦおよび１μＭロイペプチン)の存在下、手持ちボールベアリングホモジナイザー(ＡＧＤＩＡ)Elkart IN.)を使用して、ガーゼで裏打ちしたナイロン袋中で葉組織を挽くことにより行う。タンパク質測定をBio-Rad(Richmond，CA)タンパク質アッセイを使用して行う。４.２アジア・コーン・ボーラーッセイ１から４cm切片をトウモロコシ植物の伸びた葉から切断する。各葉切片を５０ ×９mmペトリ皿の湿らせたフィルターディスク上に置く。５匹の新生アジア・コーン・ボーラー幼虫を各葉切片上に置く(植物当たり合計５−２０匹幼虫とする) 。ペトリ皿を２９.５℃で保温する。食べられた葉の損傷および致死日を２４、４８および７２時間に採点する。実施例５：オストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)野外試験アッセイ最初にトランスジーンの存在および発現を試験したトランスジェニック実生の小さなピート鉢を野外に移植した。非トランスジェニック同系交配系を同じ場所に６週間に渡り植え、コントロールとしておよび受粉のために使用する。野外で植物が葉が４０cmの長さに到達した時、研究室飼育オストリアナ・フルナカリス (アジア・コーン・ボーラー)幼虫の感染を、トランスジェニックおよび非トランスジェニックコントロール植物の両方で開始する。ひきわりトウモロコシと混ぜた約３００匹の新生幼虫を各植物の輸生に、デービス・イノキュレーターを使用して挿入する。感染は、週基本で４週間続け、アジア・コーン・ボーラーの最初の発生を刺激した。最初の感染から２週間後に開始して、各植物を週毎に４週間、１から９点(１＝目に見える葉の損傷無し；９＝ほとんどの葉は長い傷害部を有する、数枚の葉は壊れた中央肋を有する、アジア・コーン・ボーラーによる成長を妨げられた植物の可能性)を使用して採点する。平均アジア・コーン・ボーラー損傷得点を各トランスジェニックおよび非トランスジェニックコントロール植物で計算する。各植物が開花に達したため、３００匹幼虫／植物を週単位で４週間適用し、第２世代感染を刺激する。ひきわりトウモロコシ中の１００匹の新生幼虫を初期雌穂の葉腋および初期雌穂節の一節上または下の葉腋に挿入した。従って、全部で約２４００匹の幼虫を各植物に適用する。最初の第２世代感染の約５０日後、全ての移植およびある非トランスジェニック植物から茎を採取する。全植物における内部第２世代感染穴形成損傷の程度を測定する。実施例６：形質転換原形質抽出物の、オストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)に対する殺虫活性のアッセイウエスタンブロット分析を、トウモロコシ最適化遺伝子を発現するようにＤＮＡで一過性に形質転換したトウモロコシ細胞から得た抽出物を使用して行う。定質的昆虫毒性試験を回収した原形質を使用して行う。懸濁液をバイオアッセイで試験する各レプリケートで製造する。例えば、レプリケートはアジア・コーン・ボーラー、オストリアナ・フルナカリスを使用して、鱗翅目の昆虫に対するその活性を試験する。０.１％トリトンＸ−１００中の１００μｌの原形質懸濁液を、５０mm×１０mmのパチンと締まる蓋のペトリ皿中の人工タマナヤガ餌(Bioserv ，Inc．Frenchtown，NJ;F9240)の表面にピペットで移す。空気乾燥後、１０匹の新生幼虫を書くプレートに添加する。致死率を約４日後に記録する。実施例７：オストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)植物浸漬試験７.１バチルス・チューリンゲンシス(Ｂｔ)結晶バチルス・チューリンゲンシス(Bt)結晶を貯蔵懸濁液から、２２ml蒸留水で調製した。懸濁液は冷蔵庫に保管する。７.２パラメーター記録３日齢オストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)幼虫にトウモロコシ葉を食べさせる。幼虫は非処理葉を既に食べている。１２０時間後、幼虫の死んだ数を記録する。葉植物の食べられた損傷の種類を各場合に観察する。７.３試験法アジア・コーン・ボーラーに感受性の二つのゼア・メイズのホモ接合体交配系の植物を使用する(Ａ系およびＢ系)。９−１０日齢実生を種々の濃度のＢｔタンパク質懸濁液に浸し、幼虫を実生植物の乾燥葉に離す(植物当たり５−１０幼虫) 、給餌実験に使用する。実生植物をナイロンメッシュ袋でカバーし、ナイロンメッシュケース内に保つ。４つづつ４−５濃度で試験し、致死率を測定する。温度を２１−３０℃に保つ。７.４結果表２：Ａ系の結果表３：Ｂ系の結果トウモロコシ葉で二つの種類の損傷が明らかに識別された：実生植物のＢｔ浸漬葉は軽い損傷であったが、コントロール実生の葉は非常に損傷を受けた。以下のＬＣ₅₀値を得た：Ａ系：ＬＣ₅₀＝２３.４１２ppm(１７.８３４から３０.７３４の範囲）Ｂ系：ＬＣ₅₀＝１２.２３４ppm(９.５４７から１５.６７６の範囲）実施例８：オストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)植物浸漬アッセイ(VIP3A) ８.１ VIP ３Ａタンパク質 VIP３Ａタンパク質５mgを種々の濃度のVIP３タンパク質を調製するために５０ ml蒸留水で調整した：１００ppm、５０ppm、２５ppm、１２.５ppm、６.２５ppm および０ppm(照合用)。８.２オストリアナ・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー) ラチャ・ブリの農家から、Entomology and Animal Science Division DOAにより得た蛹を、試験のための幼虫(Ｌ２)調製に注文する。８.３パラメーター記録データーを５日保温後、死んだ幼虫の数を計数し、次いで幼虫の致死率をプロビット分析プログラムで分析した。７.３試験法アジア・コーン・ボーラーに感受性の二つのゼア・メイズのホモ接合体交配系の植物を使用する(Ｂ系およびＣ系)。Ｂ系を鉢植え植物試験(５つの各濃度および照合用で４つづつ)のために処置し、Ｃ系を葉浸漬試験(１００、５０、２５pp mの濃度および照合用で４つづつ)のために処理した。１０−１４日齢実生を種々の濃度のVIP３Ａタンパク質懸濁液に浸し、幼虫を実生植物の乾燥葉に離す(植物当たり５−１０幼虫)、給餌実験に使用する。実生植物をナイロンメッシュ袋でカバーし、ナイロンメッシュケース内に保つ。切断葉をブラスチックブロックに入れ、制御された室温に保ち、４つづつを本実験のために使用した。７.４結果表４：Ｂ系の結果表５：Ｃ系の結果１２０時間後、以下のＬＣ₅₀値を得た：Ｂ系：ＬＣ₅₀＝２９.５５８ppm(２１.２９８から４１.０２２の範囲）Ｃ系：ＬＣ₅₀＝７８.４９８ppm(５３.６４４から１１４.８６６の範囲）寄託アメリカ合衆国６１６０４イリノイ州ペオリア、ノース・ユニバーシティ・ストリート１８１５番、アグリカルチュラル・リサーチ・サービス、パテント・カルチャー・コレクション(ＮＲＲＬ)、ノーザン・レジオナル・リサーチ・センターに寄託。株名称受託番号寄託日バチルス・セレシウスAB78 NRRL B-21058 １９９３年３月１８日エシェリキア・コリpCIB4431 NRRL B-18998 １９９２年１１月２１日

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ウィットデウィリヘン，ウィルヘルムス・ペトルス・マリアブラジル、コディゴ・デ・エンデレサメント・ポスタル―38401―097ミナス・ジェライス、ウベルランディア、ルア・ラファエル・リナルディ281番、アパルタメント 1700、エディフィシオ・サン・マルコ

Claims

【特許請求の範囲】１．直接または間接的に植物または植物種子もしくは植物の生育場所に、活性成分としてバチルス種の毒素タンパク質を適用することを含む、オストリニア・フルナカリス種によりもたらされる損傷に対して、植物(子孫を含む)を防護する方法。２．毒素タンパク質がバチルス・チューリンゲンシスの毒素タンパク質である、請求項１記載の方法。３．毒素タンパク質がバチルス・セレウスの毒素タンパク質である、請求項１記載の方法。４．毒素タンパク質がCry−タイプタンパク質、好ましくはCryＩ−タイプタンパク質、更に好ましくはCryＩＡ−タイプタンパク質、および最も好ましくはCry ＩＡ(ｂ)タンパク質である、請求項１記載の方法。５．毒素タンパク質が配列番号５３から５５に記載のCryＩ−タイプタンパク質である、請求項４記載の方法。６．毒素タンパク質がVIP−タイプタンパク質、好ましくは、VIP１Ａ(ａ)タンパク質またはVIPＩＡ(ｂ)タンパク質のようなVIP１−タイプタンパク質、または VIP２Ａ(ａ)タンパク質またはVIP２Ａ(ｂ)タンパク質のようなVIP２−タイプタンパク質もしくはVIP１−タイプタンパク質とVIP２−タイプタンパク質の組み合わせである、請求項１記載の方法。７．毒素タンパク質がVIP３Ａ(ａ)タンパク質またはVIP３Ａ(ｂ)タンパク質のようなVIP３−タイプタンパク質である、請求項１記載の方法。８．毒素タンパク質が配列番号１、２、４−７、１７−２４、２６−３２、３５、３６、３９、４０、４２、４３、４５、４６、４９、５０、５１または５２に記載のVIP−タイプタンパク質である、請求項６または７に記載の方法。９．毒素タンパク質を殺昆虫性組成物の形で植物に適用する、請求項１記載の方法。１０．殺昆虫性組成物が微生物を含む、請求項９記載の方法。１１．毒素タンパク質がCryＩ−タイプタンパク質である、請求項１から９のいずれかに記載の方法。１２．殺昆虫性組成物が、少なくとも一つのCryＩ−タイプ毒素タンパク質または、該毒素タンパク質をコードする少なくとも一つの遺伝子を有する微生物、好ましくはバチルス・チューリンゲンシスおよび／またはバチルス・セレウス株を、適当な担体と共に含むものである、請求項９記載の方法。１３．微生物が、毒素タンパク質をコードする少なくとも一つのcryＩ−タイプ毒素遺伝子を含む天然に存在する生物である、請求項１２記載の方法。１４．微生物が、少なくとも一つのcry−タイプ毒素遺伝子、好ましくはcryＩ −タイプ毒素遺伝子、より好ましくはcryＩＡ−タイプ毒素遺伝子、および最も好ましくはcryＩＡ(ｂ)毒素遺伝子を含む天然に存在する生物である、請求項１０記載の方法。１５．微生物が毒素タンパク質をコードする組換え形の少なくとも一つのcry Ｉ−タイプ毒素遺伝子を含む組換え生物である、請求項１２記載の方法。１６．微生物が、cry−タイプ毒素遺伝子、好ましくはcryＩ−タイプ毒素遺伝子、より好ましくはcryＩＡ−タイプ毒素遺伝子、および最も好ましくはcryＩＡ (ｂ)毒素遺伝子を含む組換え生物である、請求項１０記載の方法。１７．殺昆虫性組成物が少なくとも一つのVIP−タイプ毒素タンパク質または、毒素タンパク質をコードする少なくとも一つの遺伝子を有する微生物、好ましくはバチルス・スリンギエンシスおよび／またはバチルス・セレウス株を、適当な担体と共に含むものである、請求項１０記載の方法。１８．微生物がVIP−タイプタンパク質をコードする少なくとも一つの遺伝子、好ましくは、VIP１Ａ(ａ)タンパク質またはVIP１Ａ(ｂ)タンパク質遺伝子、またはVIP２Ａ(ａ)タンパク質またはVIP２Ａ(ｂ)タンパク質遺伝子のようなVIP２ −タイプタンパク質遺伝子を有する天然に存在する生物である、請求項１０記載の方法。１９．微生物が少なくとも一つのVIP３Ａ(ａ)タンパク質またはVIP３Ａ(ｂ)タンパク質遺伝子のようなVIP３−タイプタンパク質をコードする遺伝子を有する天然に存在する生物である、請求項１０記載の方法。２０．毒素タンパク質が配列番号１、２、４−７、１７−２４、２６−３２、３５、３６、３９、４０、４２、４３、４５、４６、４９、５０、５１または５２に記載のVIP−タイプタンパク質である、請求項１７−１９のいずれかに記載の方法。２１．毒素タンパク質が配列番号５３−５５に記載のCry−タイプタンパク質である、請求項１１−１６のいずれかに記載の方法。２２．微生物が組換え生物である、請求項１７−２１のいずれかに記載の方法。２３．植物をバチルス種の毒素タンパク質をコードする毒素遺伝子で形質転換し、このように形質転換した植物を害虫が発生し得る領域に植えた場合に、毒素タンパク質をオストリニア・フラカリス(アジア・コーン・ボーラー)種の駆除をするのに十分な量発現させることにより、毒素タンパク質を間接的に植物に適用する、請求項１から２２のいずれかに記載の方法。２４．毒素遺伝子がバチルス・チューリンゲンシスまたはバチルス・セレウスの毒素タンパク質をコードする、請求項２３記載の方法。２５．毒素遺伝子がCry−タイプ毒素タンパク質、好ましくはCryＩ−タイプタンパク質、より好ましくはCryＩＡ−タイプタンパク質、および最も好ましくは配列番号５３から５５に記載のようなCryＩＡ(ｂ)タンパク質をコードする、請求項２３記載の方法。２６．毒素遺伝子がVIP−タイプ毒素タンパク質、好ましくはVIPＩＡ(ａ)タンパク質またはVIP１Ａ(ｂ)タンパク質、またはVIP２Ａ(ａ)タンパク質またはVIP ２Ａ(ｂ)タンパク質のようなVIP２−タイプタンパク質をコードする、請求項２３記載の方法。２７．毒素遺伝子がVIP３Ａ(ａ)タンパク質またはVIP２Ａ(ｂ)タンパク質のようなVIP３−タイプタンパク質をコードする、請求項２３記載の方法。２８．毒素遺伝子が合成遺伝子であり、そのコドン使用性が植物に最も好ましいコドンを使用することにより最適化されてる、請求項２３−２７のいずれかに記載の方法。２９．毒素遺伝子がCryＩ−タイプタンパク質をコードする、請求項２３から２８のいずれかに記載の方法。３０．毒素遺伝子が、配列番号１、２、４−７、１７−２４、２６−３２、３５、３６、３９、４０、４２、４３、４５、４６、４９、５０、５１または５２に記載のVIP−タイプタンパク質をコードする、請求項２６または２７に記載の方法。３１．保護する植物が穀物である、請求項１から３０のいずれかに記載の方法。３２．保護する植物がトウモロコシ植物である、請求項３１記載の方法。３３．Cry−タイプ毒素タンパク質を、直接または間接的に植物または植物種子もしくは保護する植物の生育領域に、VIP−タイプ毒素タンパク質と組み合わせて、アジア・コーン・ボーラー(オストリニア・フルナカリス)害虫を駆除するのに十分な量適用する、請求項１から３２のいずれかに記載の方法。３４．活性成分がCry１Ａ(ｂ)タンパク質である、請求項１から３２のいずれかに記載の方法。３５．活性成分がVIP−タイプタンパク質である、請求項１から３２のいずれかに記載の方法。３６．穀物のオストリニア・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)害虫の駆除のための、請求項１から３５のいずれかに記載の活性成分の使用。３７．穀物のオストリニア・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)害虫の駆除のための、請求項２３記載のトランスジェニック植物の使用。３８．穀物のオストリニア・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)害虫の駆除のための、各毒素タンパク質をコードするcry−タイプまたはVIP−タイプ遺伝子と、中位のストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ分子を含む、請求項２３から３０のいずれかに記載の組換え微生物またはトランスジェニック植物の使用。３９．バチルス・スリンギエンシスの毒素タンパク質をコードし、穀物のオストリニア・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)種の駆除に十分な量の毒素タンパク質を発現する毒素遺伝子を含む種子を含み、穀物のオストリニア・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)害虫の駆除のためのその使用の指示のラベルの付いた、商品袋。４０．トランスジェニック植物の種子または、請求項１から３０、３２および３３のいずれかで定義の毒素タンパク質をコードする少なくとも一つの毒素遺伝子を含み、オストリニア・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)の駆除に十分な量の毒素タンパク質を発現する微生物であるが、特にバチルス・チューリンゲンシスおよび／またはバチルス・セレウス株を含み、穀物のオストリニア・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)害虫の駆除のためのその使用の指示のラベルの付いた、商品袋。４１．請求項２３から３２のいずれかに定義のように、バチルス種の毒素タンパク質をコードする毒素遺伝子を含み、穀物のオストリニア・フルナカリス(アジア・コーン・ボーラー)種の駆除のために十分な量の毒素タンパク質を発現するトランスジェニック植物またはその子孫、またはそのトランスジェニック種子を使用する、農学的方法。４２．セサミア害虫の駆除を提供するのに十分な量、少なくとも一つのCry− タイプ毒素タンパク質を、VIP−タイプ毒素タンパク質と組み合わせて保護する植物に発現する、請求項１８から２６のいずれかに記載の方法。４３．活性成分として少なくとも一つのCry−タイプ毒素タンパク質およびVIP −タイプタンパク質を、農学的に許容される担体と共に殺虫的に有効な量含む、組成物。