JP2000512128A

JP2000512128A - 哺乳類細胞用の細胞培養培地

Info

Publication number: JP2000512128A
Application number: JP09533541A
Authority: JP
Inventors: ブロック，ジョフリー・ディ
Original assignee: ユニバーシティ・オブ・ピッツバーグ
Priority date: 1997-03-12
Filing date: 1997-03-12
Publication date: 2000-09-19

Abstract

(57)【要約】哺乳類肝細胞および他の細胞の維持および長期クローン成長を支持する、化学的に明確にされた哺乳類細胞培養培地を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】哺乳類細胞用の細胞培養培地技術分野本発明は、一般的には哺乳類細胞用の細胞培養培地に関する。特に、本発明は哺乳類肝細胞、肝細胞由来のセルライン、肝細胞由来の悪性細胞等の細胞集団の長期間の増殖と保存を可能とする細胞培養培地に関する。背景技術特定のセルラインは、任意に配合された培養培地あるいは栄養素培地中でインビトロ（in vitro）で成長可能なことはよく知られている。特定の目的に開発されてきた培養培地のいくつかを例示すると：ヒトＢ−リンパ細胞や悪性細胞成長用のRPMI Media（アールピーエムアイメディア）1640、羊水細胞成長用のChangs （チャングス）培地、マウス繊維芽細胞成長用のMedium（メディウム）199、Min imal Essential Medium（ミニマルエッセンシャルメディウム）(MEM)培地、付着哺乳類細胞増殖用の”最小培地”、およびCO₂欠乏下での成長用のLeibovitz（レイボビッツ）媒体が挙げられる。係る種々の培地は、正確なアミノ酸、ビタミン、有機塩、微量元素、および培養細胞を最大に成長促進する他の有機化合物中に決定的に異なる成分を含有している点でそれらをお互いを区別できる。哺乳類細胞成長のために、化学的に明確な培地は、通常、種々の血清、好ましくは胎児ウシ血清あるいは新生児ウシ血清、および他の完全には定義できない成長因子で補足されている。しかし、血清に対する主な障害は、その構成成分が広範囲に渡っており、その為、生化学的細胞的発生の多様性に寄与する栄養素培地に、漠然とした生物学的成分が入れられているということである。さらに、血清は高価であり、細胞を臨床目的に使うとしたら、患者が危険な免疫反応を起こす可能性もある。本発明は主として、細胞集団の長期間の増殖が可能な化学的に明確な培地を使用した哺乳類の肝細胞培養に向けられている。「化学的に明確な培地」という用語は、組織培養において使用されるものであり、定量的にも定性的にも既知の化学的組成物の培養培地を言うものであり、動物血清等自然の生成物を含有する培地と対照的なものである。肝再生は、Crisham,J.W.らCancer Res ．第22巻第842頁(1962)に報告されているように、主として成人の肝細胞の細胞分裂で達成される。本報告の開示を明細書の一部としてここに引用しておく。これらの細胞またはそのフラクションは、異所性サイト（Jirtle，R.L.ら、Cancer Res ．第４２巻、第3,000頁（1982）、その開示を明細書の一部としてここに引用しておく）および形質転換マウスモデル（Rhim，J.Aら、Science第２６３巻、第１１４９頁（1994）、その開示を明細書の一部としてここに引用しておく）における肝細胞移植実験に示されているように、高いクローン成長能力を有している。しかしながら、成熟肝細胞の増殖を抑制しながら、肝臓を刺激して再生すると、任意（faculative）基幹細胞が出現したり増殖したりすることがいくつかの研究に示されている。例えば、Thorgeir sson S.S.ら、Proc ．Soc．Exp．Biol．Med．第２０４巻、第253頁（１９９３）を参照。その開示を明細書の一部としてここに引用する。このような細胞は、「卵円細胞（oval cell）」と呼ばれることもあり、限定動物モデルの肝細胞、または混合肝細胞と胆汁円柱被覆組織マーカーと細胞からなる小管状構造(ductula r structure)（「小管状肝細胞」）に成熟することができる。Amer ．J．Path．第１１０巻、第７０頁（1983）、およびVandersteenhoven，A.M.ら、Arch ．Path ol．Lab．Med．第１１４巻、第403頁（1991）を参照。その開示を明細書の一部としてここに引用する。しかしながら、それらの起源、また形質遷移を肝細胞または小管状細胞に向けて規制する制御についてはほとんど知られていない。直接または任意基幹細胞を経由して、インビトロで肝細胞は高い増殖能力があるにもかかわらず、１次培養における肝細胞成長の成功例がごく限られているため、その成長ポテンシャルおよびその形質遷移を決定する条件は完全には理解されていない。１次分裂促進因子の影響下の１次培養における肝細胞が１つまたは 2つに分裂し、次にはその細胞が退化し死滅するのが一般的なケースである。今まで、肝細胞が増殖しかつ生存できる培地を開発することに色んな研究者が失敗してきた。例えば、Berry，N.M.ら、J ．Cell．Biol．第４３巻、第５０６頁（1969）、その開示を明細書の一部としてここに引用しておくが、それによるとサイズに基づいて肝臓組織をその成分細胞要素に分離できるコラゲナーゼ潅流(perfusion)テクニックが教授されている。後になって、Bissell，D.M.ら、J ．Cell.Biol．第５９（３）巻、第７２２頁（1973）およびBonney，R.J.ら、In Vitro第９巻、第 399頁（1974）、それらの開示を明細書の一部としてここに引用しておくが、それらによると、恐らく1日か2日生き長らえた分離肝細胞を培養する第1の方法が開示されている。コラーゲンゲル上での肝細胞の最大７ないし１０日間の長期培養がMichalopoulos，G.ら、Exp ．Cell．Res、第９４（１）巻、第７０頁（1975 ）により報告されている。その開示を明細書の一部としてここに引用しておく。上記参照のすべての系の共通した特徴は、それらの系での肝細胞が培養維持されたということであるが、細胞増殖のなんの証拠もなということである。その代わりに、それらの系はわずかの期間、非増殖細胞を維持し培養するものにすぎなかったのである。肝細胞におけるＤＮＡ合成を始めて最初に成功した試みは、Richman，R.A.ら、Proc ．Nat．Acad．Sci．USA、第７３巻、第３５８９頁（1976）に開示されているように次に新たに発見された上皮成長因子（ＥＧＦ）を使用していた。その開示を明細書の一部としてここに引用しておく。その後なん年にもわたって、他のいくつかの研究者グループが肝細胞分裂促進因子としてＥＧＦを使用し、ＥＧＦの分裂促進効果および、他の因子、例えばコラーゲンタイプＩ、亜鉛、およびプロリン等のマトリックスによる修飾について報告した。肝細胞成長因子は、散乱因子(scatter factor)としても知られており（以下、 ”ＨＧＦ”または”ＨＧＦ／ＳＦ”という）、それが発見され、クローン化され、１９８０年代後半に完全に配列決定された。Michalopoulos，G.ら、Federatio n Proceedings 、第４２巻、第１０２３頁（1983）、Michalopoulos，G.ら、AACR Proceedings 、第２４巻、第５８頁（1983）、Michalopoulos，G.ら、Cancer Re s. 、第４４（１０）巻、第４４１４頁（１９８４）、およびMiyazawa,Kら、Bioc hem ．Biophys．Res．Comun．、第１６３巻、第967頁（1989）参照。それらの開示を明細書の一部としてここに引用する。ＨＧＦ／ＳＦは被覆組織細胞はもちろん多種類の肝細胞の分裂促進因子になることが見出された。ＨＧＦ／ＳＦの肝臓に対する重要性はそれが内分泌機構を通して肝臓再生トリガーであるという事実による。最近、いくつかの研究によると、ＨＧＦ／ＳＦ，上皮成長因子（”ＥＧＦ”）、および形質転換因子α（”ＴＧＦα”）は化学的に明確な培地における限定肝細胞ＤＮＡ合成を刺激することにより、培養肝細胞の第1分裂促進因子（マイトジェン）となるということが示されている。例えば、Michalopoulos，G.K.ら、F ed.Am ．Soc．Exp．Biochem J. 、第４巻、第１７６頁（1990）参照。その開示を明細書の一部としてここに引用する。これらの成長因子は後になって、さらに部分的肝切除後のインビボ（in vivo）肝再生において役割をしていることが見出された。ＨＧＦ／ＳＦ、ＴＧＦα、またはＥＧＦをラットに注射すると、肝細胞におけるＤＮＡ合成を誘発する。例えば、Liu，M.L.ら、Hepatology、第１９巻、第１５２１頁（1994）参照。その開示を明細書の一部としてここに引用する。しかしながら、これらすべての系において、肝細胞はごく限られた期間、一般的には１〜３日間だけ、ＤＮＡ合成および有糸分裂を行ったということが報告されている。ＤＮＡ合成および細胞分裂を１−２回繰り返した後、培養は退化し、全細胞が約７―１０日で死滅した。現在までに、ＥＧＦまたはＨＧＦのみ、または組み合わせを添加して、細胞培養液中の肝細胞の数が増殖したということは文書で報告されていない。それよりか、これらの成長因子を含む培養中での細胞複製は本質的に制約があり、死滅する肝細胞の数は新たに発生した肝細胞の数を超える。形質転換成長因子等、例えばＴＧＦαや酸性線維芽細胞成長因子等の他の肝細胞分裂促進因子を含む培養液中での細胞複製も同様に本質的に制約がある。さらに最近、Mitaka，T.ら、Hepatology、第１３（１）巻、第２１頁（1991）、Mitaka，T.ら、Hepatology、第１６（２）巻、第440頁（1992）、Mitaka，T. ら、Virchows Arch ．B Cell Pathol．Incl．Mol．Pathol.、第６２巻、第３２９頁（1992）、Mitaka，T.ら、Cancer Res.、第５３巻、第３１４５頁（1993）の開示を明細書の一部としてここに引用するが、それらによるとニコチンアミド、デキサメタゾンおよびＥＧＦを従来の培養培地に添加すると、標準サイズの実質肝細胞の濃厚培養液中に小さな肝細胞のコロニーが形成されることが報告されている。さらに、Mitaka，T.ら、J ．Cell．Physiol.、第１５７巻、第461頁（1993）の開示を明細書の一部としてここに引用するが、それによるとＥＧＦ＋ＨＧＦ、ＥＧＦ＋ＴＧＦ−αおよびＨＧＦ＋ＴＧＦ−αの組み合わせによって誘発されるコロニーの数は各分裂促進因子単独で誘発されたコロニーの数と違っていなかったと報告されている。現在までに、肝細胞の長期間の増殖、分化および生存を維持することができる化学的に明確な培地は、補足があるなしにかかわらず、存在しない。種々の目的ために、不明確な補足の使用は満足のいくものとなるが、成長、新陳代謝、および／または培養液中の細胞の分化の研究を行う場合には、明確な補足を有することが最も望ましい。不明確な成分を細胞培養液に入れると、研究結果や細胞培養液の適用に変異性、非予測性、およびコンタミネーションをもたらすことになる。明確な培地を使用することが、ドラッグ新陳代謝、人工臓器開発、細胞移植、遺伝子治療および基礎的細胞研究の分野で特に重要であり、有益である。上記したように1次培養液中で肝細胞を増殖させるには限度があるので、長期間の研究または長期間の生存や増殖が必要とされる使用は妨げられていた。それ故、肝細胞培養液の細胞移植や遺伝子治療への応用も妨げられていた。従って、細胞が増殖でき長期間生存できる化学的に明確な培地が必要とされている。そのような培地やそのように培養された肝細胞や他の細胞の潜在的な応用としては、遺伝子治療、生物学的人工臓器、細胞移植、ドラッグ製造、およびドラッグや化学薬品のテストである。上記したように、現在の技術状況は、肝細胞が持続性増殖により細胞集団として増殖する肝細胞培養培地系を提供していないし、そしてそのような系に対する要望がある。本発明は肝細胞の持続性増殖および長期間増殖が可能な完全に明確な培養培地を提供する。発明の要約本発明によると新規な化学的に明確な細胞培養培地が提供される。本培地は、１次肝細胞および肝細胞セルライン、遺伝的に形質転換された肝細胞および腫瘍性源から得られた肝細胞の持続性クローン成長を維持し、その結果、細胞集団が増殖することになる。本培地はさらに、そこで成長する細胞の代謝性、構造的、分泌機能の完全な分化を可能とする。このような条件下では、肝細胞は多発性増殖サイクルを経る。一旦、合流（confluency）に達すると、あるいは特定のマトリックス成分、栄養素、および／または成長因子の存在下に、これらの増殖細胞は分裂を停止し、何ヶ月も何ヶ月も成熟肝細胞表現型を維持する。従って、本発明の第1の目的は肝細胞の持続性増殖および生存が可能な培養培地を提供することである。もう一つの目的は肝細胞の持続性分化と生存が可能な培養培地を提供することである。さらなる本発明の他の目的は、成長が停止するにつれ完全な分化に先祖返りする肝細胞の持続性増殖が可能な培養培地を提供することである。本発明の別の目的は、血清を全く含有しておらず、完全に明確である、肝細胞の長期間増殖が可能な培養培地を提供することにある。さらなる本発明の別の目的は、色々なマトリックス基質上で肝細胞の持続性増殖、分化、および生存を可能とする培養培地を提供することである。本発明の上記および他の目的は以下の1以上の具体例で達成される。ひとつには、本発明は哺乳類肝細胞のメインテナンス、長期成長が可能な化学的に明確なＨＢＭ培養培地であることを特徴としていおり、以下からなる：（ａ）哺乳類細胞培養用にデザインされた合成保存基礎培地、（ｂ）ニコチンアミド、アミノ酸、トランスフェリン、ホルモン、デキサメタゾン、微量の金属、および、Ｄ−グルコースおよびＤ−ガラクトースからなるグループから選択される単純炭化水素から選択される成分およびそれらの組み合わせの肝細胞細胞成長促進量。好ましい態様においては、本発明は、さらにバッファー、抗生物質およびアルブミンを含有するＨＢＭ培養培地を特徴とする。別の面においては、本発明は、表Ｉおよび表ＩＩで明らかにされているようなＨＧＭ組成物からなる哺乳類細胞培養培地を特徴としており、表Ｉの保存基礎培地は、Ｄ−グルコースの最終濃度が好ましくは約２．０ｇ／Ｌ、そしてＤ−ガラクトースの量が好ましくは約２．０ｇ／ＬとなるようにブレンドされているＤＭＥＭからなる。本発明の他の特徴及び利益は以下の好ましい具体例の記述およびクレイムから明らかになる。図面の簡単な説明図１Ａ−１Ｃはラット肝細胞を、本明細書で記述されているように成長因子が補足されたＨＢＭ培地で培養した研究結果を示すグラフである。すべての点は少なくとも3つの別々の培養の平均および標準誤差を表している。図１Ａは肝細胞分離培養後の色々な時間での増殖細胞培養のラベル化された核のパーセント（ＢＲｄＵ）を示す。細胞はＨＧＦ／ＳＦおよびＥＧＦで補足されたＨＢＭ中で成長した。図１Ｂは、肝細胞分離培養後の色々な時間での培養中のＤＮＡへの［³Ｈ］チミジンの取り込み（1分当たりの壊変）を示している。細胞をＨＧＦ／ＳＦのＨＢＭ培地（◇）；ＥＧＦのＨＢＭ培地（○）；ＨＧＦ／ＳＦ＋ＥＧＦのＨＢＭ培地（△）；およびコントロールであるＨＢＭ単独（□）にさらした。図１ＣはＨＢＭ培地単独（コントロール）（■）；ＨＧＦ／ＳＦのＨＢＭ培地（△）；ＥＧＦのＨＢＭ培地（▽）；およびＨＧＦ／ＳＦ＋ＥＧＦのＨＢＭ培地（●）中で成長した細胞の異なる日数での平板培養(plate)当たりのＤＮＡの量を示している。図2は示されている成長因子を有するＨＢＭ中で成長したラット肝細胞の１平板培養当たりの１５日（ｄａｙ１５）後のＤＮＡを示している。コントロール（日数ｔ＝０）および１５日は成長因子を有さないＨＢＭ中で成長したものである。図３は異なったマトリックス上で成長したＨＧＦ／ＳＦおよびＥＧＦ補足ＨＢＭ中１５日でのラット肝細胞のプレート当たりのＤＮＡ合成量（μｇ／培養）を示すグラフである。”ＣＣ”はコラーゲンがコートされていることを意味している；”ＥＣＬ”は商業マトリックスである；”ｍ COLL IV"はマウスコラーゲンＩＶを意味する；”ＣＣＶＩＴＲＯＧＥＮ”はウシ皮コラーゲンタイプＩを意味する；”ＰＯＬＹＤＬＹＳ”はポリＤ−リジンを意味する；”ｍＬＡＭＩＮＩＮ”はマウスラミニンを意味する；”ｈＦＩＢＲＯＮＥＣＴ”はヒトフィブロネクチンを意味する；および”ｍＣＯＬＩ”はマウスコラーゲンＩを意味する。図4Ａ―4Ｇは種々の条件下本明細書に記載されているようにＨＢＭ中で培養されたラット肝細胞の写真である。図4Ａは、一般的なサブコンフルーエント（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）非増殖肝細胞を示すもので、分離培養1日でのＨＧＦ／ＳＦおよびＥＧＦを有するＨＢＭ媒体中での肝細胞を示す。図4Ｂは、一般的な散乱形態を示すもので、ＨＧＦ／ＳＦを導入されたＨＢＭ培地中4日での肝細胞を示す。図4Ｃは一般的な形態を示すもので、１５日で達成されたコンフルエンシー（c onfluency）を有する肝細胞培養を示す。図4Ｄおよび4Ｅはそれぞれ図4Ａおよび４Ｃにおける細胞の電子顕微鏡写真である。図4Fおよび４Ｇは、ラック（ｌａｃ）−Ｚ−含有複製欠損レトロウイルスで３日目に形質移入され、以下に記述するようにβ−ガラクトシダーゼ発現用に染色され、形質移入後、１日目（図4F）、１０日目（図４Ｇ）に撮影した、染色肝細胞の顕微鏡写真である。図５Ａおよび５Ｂは、本明細書に記述されているようにＨＧＦ／ＳＦおよびＥＧＦの存在下ＨＢＭ中に保持されたラット肝細胞培養における異なる日にちでの特定の遺伝子発現を示すノーザンプロット法の写真である。ＧＡＰＤＨ発現およびエチジウムブロミド染色後の２８ＳＲＮＡの強度を内部コントロールとして使用した。図6Ａ―6Ｆは、本明細書で記述されているようにＨＧＦ／ＳＦおよびＥＧＦの存在下ＨＢＭ培地で培養された増殖ラット肝細胞およびそのノーザンプロット法の写真である。図6Ａは、８日目にマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）を上張りされ、１８日目に撮影された増殖肝細胞培養の位相差顕微鏡写真である。粒状の細胞質および一般的な胆細胞様相が細胞間に白線として現れている。図6Ｂおよび６Ｃはそれぞれ、培養１８日目、マトリゲルで上張り後１０日目の細胞の、低出力および高出力電子顕微鏡写真である。ミトコンドリア、結晶性中心を持つ微小体、胆細管（”ｃ”）（図6Ｂ）、豊富なミトコンドリア（”Ｍ ”）、およびグリコーゲン（”Ｇ”）（両者図6Ｃ）の回りを包んでいる小胞体のラメラのように肝細胞細胞質の一般的な特徴が示されている。図6Ｄは、マトリゲル添加後のアルブミンｍＲＮＡの増加発現を示すノーザンプロット法の写真である。アルブミンｍＲＮＡは、コラーゲナーゼ潅流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）により肝臓から分離後すぐにかつ培養前にコントロール培養に発現している。発現は培養8日目で最小である。マトリゲル添加３日目および７日目（”＋”でマークされているレーン）で、アルブミンｍＲＮＡの発現の増加があった。ＧＡＤＰＨ発現は内部コントロールとして使用した。図6Ｅは8日目にマトリゲルで処理され、２日後（培養１０日）にフェノバルビトール（”ＰＢ”）にさらされた培養液におけるチトクロムＩＩＢ１ｍＲＮＡの誘導を示すノーザンプロット法の写真である。細胞は培養１５日で収穫された。ＧＡＰＤＨ発現はｍＲＮＡ増量の内部コントロールとして使用した。図6Fは、マトリゲルを添加（培養8日目で添加）して培養された細胞のノーザンプロット法のグラフである。シトケラチン（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）１９、増殖肝細胞により発現した胆管マーカーはマトリゲルの添加により抑制されており、マトリゲルを入れていないコントロール培養では抑制されなかった。エチジウムブロミドで染色されている２８ＳｒＲＮＡを内部コントロールとして使用した。図７Ａ−７Ｅは、ＨＧＦ／ＳＦの存在下ＨＢＭ中2つのタイプのＩコラーゲンゲル層間に培養初期から保持されているラット肝細胞の培養中に小管状／細葉構造の形成を示す研究結果を示している。図７Ａ−図７Ｄ写真は１５日培養のものである。図７Ａは、コラーゲン筋原繊維に取り囲まれた小管状構造の様子を示す位相差顕微鏡写真（Ｘ１００）である。図７Ｂはヘマトキシリンおよびエオシンで染色された図７ＡタイプＩコラーゲンのパラフィン切片の顕微鏡写真（Ｘ１００）である。図７Ｃおよび７Ｄは、同じルーメンを取り囲む細胞であるが図７Ｂで見られる小管状構造の1つのルーメンの回りの異なる位置での電子顕微鏡写真である。図７Ｃは胆管上皮と同じ形態学を有する細胞を示しており、多くのデスモソームで連結された長い平行接触を有し、豊富なケラチン中間体フィラメントを有する。図７Ｄは肝細胞表現型により似た細胞を示しており、粗面小胞体およびミトコンドリを有しており、濃く染色された第2ライソソームおよびより少ないフィラメントを示している。図７Ｅは小管状／細葉構造を有するシトケラチン１８および１９の発現が培養で増加しているが、アルブミンは極わずかしか発現していないことを示しているノーザンプロット法の写真を示している。図8は、本明細書に記述されているようにＨＧＦ／ＳＦおよびＥＧＦが補足されているＨＢＭ中で成長した染色ヒト肝細胞培養の１、３、５、７、１０、１２および１９日目の写真を示している。発明の詳細な説明本発明は肝細胞基礎培地、本明細書ではＨＢＭという、を提供するものであり、肝細胞の細胞集団、ＨｅｐＧ２、肝臓の胎児上皮細胞、および肝臓の第1肝癌細胞等の肝細胞誘導セルラインの長期間増殖、分化、および生存をインビトロで可能とする。さらに、本発明の培地は、膵臓島細胞、尿細管性細胞、伊藤細胞、小腸上皮細胞、その他、ＭＲＣ５、ＣａＣｏ、および３Ｔ３等の色々なセルラインを培養するために使用することができる。本発明のＨＢＭは代謝経路および合成機能、すなわち成熟成人の肝細胞の分化を維持する。さらに、本発明のＨＢＭは、特定のマイトジェンおよび細胞外のマトリックス組成物と併用すると、肝細胞は分化転換され、胆管状構造に至らせることができる。本発明のＨＢＭは哺乳類肝細胞および、それらに限定されるものではないが、ヒト、ラット、ドッグ、豚、マウスおよびヒヒ起源を含むその他の細胞の培養に使用することができる。ＨＢＭ培地は適当な濃度の必須および非必須アミノ酸およびバルクイオン（ｂｕｌｋｉｏｎ）および微量元素、バッファー、ビタミン、炭水化物、脂質、タンパク、およびホルモンからなり、インビトロ哺乳類細胞培養に適した栄養素培地として機能する。より広い観点においては、本発明は、それ自身が長期間生存、分化、および哺乳類肝細胞、その他の細胞の成長を可能とする化学的に明確な基礎培地、ＨＢＭを特徴とする。さらに、ＨＧＦ／ＳＦ、ＥＧＦ、またはＴＧＦα、他のマイトジェン等の成長因子の存在下、補足ＨＢＭ中で成長する細胞はより急速な集団増殖およびクローン成長する。以下、さらに示されているように、本発明のＨＢＭはＨＧＦ／ＳＦで補足されると、一定のマトリックス構成物と共に胆管状構造の形成を引き起こす。しかしながら、上記したようにそのような成長因子は1次培養における特定の分化パターンに対しては要求されなが、これを特定の目的に所望すれば成長および集団増殖を加速する。本発明のＨＢＭ培地は、哺乳類細胞培養のためにデザインされた化学的に明確な保存基礎培地（以下、”ＳＭ”という）からなる。保存基礎培地は、好ましくは１成分としてダルベッコの修飾イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle Med ium)("DMEM")を使用して構成することができが、本発明は本明細書で述べられているように配合がガイドラインの範囲内にある限り、そのように限定されるものではない。それに限定されるものではないが、本発明に従い使用され得る他の明確な基礎培地は以下のものが包含される：ベイサル・メディア・イーグル（Basa l Media Eagle）(BME)、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１ＤＭＥＭおよびＦ−１２体積：体積）；メディウム(Medium)199;F-12（ハム）（Ｈａｍ）ニュートリエント・ミクスチャー（Nutrient Mixture）；F-10（ハム）ニュートリエント・ミクスチャー；ミニマル・エッセンシャル・メディア(Minimal Essential Media)( MEM);ウィリアムズメディア(Williams’Media)Ｅ；およびＲＰＭＩ１６４０、それらすべてギブコービーアールエル／ライフテクノロジー社（Gibco-BRL/Life T echnologies Inc.）、ゲーサーズバーグ、メリーランド、その他の会社から入手可能である。これら多数の培地のいくつかのバージョンが入手可能であり、ＨＢＭを構成するに特に有用なものとしては、限定されるものではないが、ＤＭＥＭ１１９６６、ＤＭＥＭ１０３１４、ＨＥＭ１１０９５、ウィリアムズメディアＥ１２２５１、ＨａｍＦ１２１１０５９、ＭＥＭ−アルファ（ａｌｐｈａ）１２５６１、およびメディウム（Ｍｅｄｉｕｍ）１９９１１１５１（すべてGibc o-BRL/Life Technologies（１９９５−１９９６カタログ）から入手可能である）を包含する。それ故、例えば、Ｌ−アルギニンおよび／またはＤ−グルコースがすでに必要量保存基礎培地中にあるならば、補足としてさらに成分を添加する必要はほとんど、または全くない。保存基礎培地の特別の組成によるが、ＳＭは、ここでより十分に記述されているように、Ｄ−グルコースおよび／またはＤ−ガラクトース、ニコチンアミド、ＳＭに既存していないアミノ酸および微量の金属からなる他の微量養素、例えばＬ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチン、亜鉛、マンガン、銅、およびセレン等、元素鉄が結合している精製トランスフェリンまたは鉄グルコネートと組み合わせたアポトランスフェリン（apo-transferrin）、デキサメタゾンやインシュリン等のホルモンおよびＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ−［２−エタンスルホン酸］）等のｐＨバッファーで補足されている。ペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質、ｐＨ指示薬、アルブミンおよび／またはデキストラン、必須脂肪酸、代替（alternative）バッファー、ビタミン、浸透圧剤、および他の形態の微量金属を所望により添加してもよい。一般的には、基礎培地は６．５−８．２、好ましくは７．０−７．７、最も好ましくは７．２−７．５範囲のｐＨを有する。フェノールレッドはｐＨの制御を助けるために添加される一般的指示薬である。ＳＭおよびそれへの補足は本発明のＨＢＭ培地からなる。ＨＢＭ培地は、促進成長を望むのであれば、所望により1以上の成長因子、例えばＨＧＦ／ＳＦ、ＥＧＦおよびＴＧＦα等で補足されていてもよい。単純炭水化物Ｄ−グルコースおよび／またはＤ−ガラクトースを保存基礎培地に添加してＨＢＭをなしてもよい。Ｄ−グルコースおよびＤ−ガラクトースともに使用する場合、それらの総濃度の合計は好ましくは８．０ｇ／Ｌ以下であるが、保存基礎培地中に存在するかもしれないいくらかのＤ−グルコースの量を考慮すると、その場合、０．０１ｇ／Ｌより大きい。Ｄ−グルコースまたはＤ−ガラクトースの一方しか使用しない場合、その濃度は好ましくは５．０−０．１ｇ／Ｌである。例えば、本明細書における実施例においては、使用された混和ＤＭＥＭ保存基礎培地は２．０ｇ／ＬのＤ−グルコースを含有しており、Ｄ−グルコースは全く添加していない。Ｄ−ガラクトースの２．０ｇ／Ｌを補足として添加した。ニコチンアミド、もう一つのＨＢＭ成分であるが、それは肝細胞分化を持続させ、チトクロームＰ４５０の発現を高め、従来の培養液中で肝細胞の生存を１０−１４日引き伸ばすことが示されている。Rosenbergら、In Vitro、第１８巻、第７７５頁（１９８２）およびInoue,Cら、Biol ．Chem.、第２６４（９）巻、第４７４７頁を見よ。それらの開示を本明細書の一部としてここに引用する。トランスフェリンは細胞膜上トランスフェリンレセプターと相互作用する鉄結合性タンパクである。それは鉄イオンをキレート化したり輸送したりする働きをする。本発明において好ましく使用されるトランスフェリンは３０％鉄飽和のホロ（ｈｏｌｏ）−トランスフェリンであるか、完全不飽和（アポトランスフェリン）であり、鉄グルコネートと組み合わされる。デキサメタゾン、合成コルチコステロイドであるが、それは、Sand,T.-F.ら、Acta ．Endocrinol．第１０９巻、第３６９頁（１９８５）に報告されているように、ＥＧＦ誘発ＤＮＡ合成を高めることが示されている。その開示を本明細書の一部としてここに引用する。本発明で使用されているように、デキサメタゾンは、プレドニゾン、プレドニシロン（prednisilone）、コルチゾル、ヒドロコルチゾン、および他の誘導体等のいかなるコルチゾル誘導体であってもよい。インシュリンおよびインシュリン様成長因子が、グルコース摂取、アミノ酸輸送、多数の中間代謝物質経路の維持のために要求される。これらの効用は分化を維持し、増殖をサポートするのを助ける。ＨＢＭ、保存基礎培地中にＬ−アルギニンを含ませること、すなわちそれへの補足は、重要に思える。培養中の肝細胞は、ウレアサイクルを通じてアルギニンを合成する能力を失う傾向にあるからである。Ｌ−アルギニンが存在しないと、培養中の肝細胞は、L-アルギニン合成をできなくなるので、そんなに長くは生きられない。タンパク合成がブロックされるのである。Ｄ−グルコースに加えＤ− ガラクトースを使用することはＨＢＭに有益である。なぜならそれらを組み合わせると、それらの物質単独で使用する場合に比べ、最大の成長力が与えられるからである。上記したような、ＨＧＦ／ＳＦ、ＥＧＦ、およびＴＧＦαは、本発明に従い一緒にまたは単独で使用されると、以下に示されているように、増殖効果を高めることを示すマイトジェンである。本発明のＨＢＭを補足するのに使用することができる前述のマイトジェンのリストは完全なものではない。しかしながら、これらのマイトジェンは、ＨＢＭ中で成長するとき肝細胞の生存または分化に要求されるものではないということには注意されたい。マイトジェンが添加されると、ＨＢＭ中での成長する肝細胞はよりスローに増殖する。本願でクレイムされている培地に使用されているインシュリン、ＥＧＦ、ＨＧＦ、およびＴＧＦαは、組換製造、遺伝設計されていてもよいし、自然源から精製されていてもよい。例えば、その種類は、ヒト、ウシ、ウマ、ネズミ、ブタ、またはラットであってよい。いくつかの好ましい保存基礎培地、ＤＭＥＭ１１９６６、ＤＭＥＭ１０３１４、ＭＥＭ１１０９５、およびウィリアムズメディウムＥ１２２５１は、下記表Ｉに示されているように滅菌脱イオン水１０００ｍｌ当たり以下の成分を含有している。本発明の好ましい具体例によると、表ＩＩにおける次の補足成分を、総容量１０００ｍｌ中、表Ｉの保存基礎培地に添加する。リストに挙げられている好ましい量は、保存基礎培地が４４５ｍｌのＤＭＥＭ１０３１４および５５５ｍｌの１１９６６から構成され、Ｄ−グルコース濃度が２．０ｇ／Ｌとなって、さらなるＤ −グルコースが全く添加されていない実施例における下記の量と一致する。他の保存基礎培地を使用する場合、添加されるこれらの成分の最も望ましい量は変化してもよことは理解されるべきである。下記表ＩＩＩは、特定の目的に向け、そして肝細胞や特定のセルラインまたは悪性細胞の特定の種の起源を考慮して、細胞成長を最も効果的にするために所望によりＨＢＭ培地に添加してもよい物質をリストしている。繰り返すが、これらの量は、特定の成分が使用される保存基礎培地に既存しているかいなかによって、変化する。成長の加速を望む場合、本発明のＨＢＭに種々の成長因子を添加してもよい。ＨＧＦ／ＳＦ、ＥＧＦ、およびＴＧＦαが現在のところ好ましいが、他の成長因子を添加してもよいということが理解されるべきである。係る成長因子の好ましい量は一般には特定の使用される源で変化する。それゆえ、ここにリストされている量は、使用される特定の源に必然的に限定される。以下の実施例においては、ＨＧＦ／ＳＦが４０ｎｇ／ｍｌでＨＢＭに添加されることがこの好ましい；ＥＧＦが２０ｎｇ／ｍｌで添加されることが好ましい；そしてＴＧＦαが２０ｎｇ／ｍｌで添加されることが好ましい以下の実施例は例示的に示すものであって、本発明の範囲を限定する意図のものではない。実施例材料および方法材料チャールズ・リバー（Charles River）（ペンシルバニア）由来の雄性フィッシャー３４４ラットを、ラット肝細胞単離を含む全ての実験に用いた。ＥＧＦおよびマトリゲル（Matrigel）（ＥＨＳマウス腫瘍から誘導されたマトリックス成分の混合物）を、コラボレーティブ・リサーチ（Collaborative Research）（ウォールサム（Waltham）、マサチューセッツ）から得た。［³Ｈ］チミジンを、ＩＣＮラジオケミカルズ（アービン（Irvine）、カルフォルニア）から得た。肝細胞単離のためのコラゲナーゼ（collagenase）を、ボアリンガー・マンハイム（B oehringer Mannheim）（インディアナポリス、インディアナ）から得た。ビトロゲン（Vitrogen）（セルトリクス・ラブズ（Celtrix Labs）、パロ・アルト（Palo Alto）、カルフォルニア）を、コラーゲンゲルの構築のために用いた。一般試薬をシグマ・ケミカル・コーポレーション（Sigma Chemical Co.）（セント・ルイス、ミズーリ）から得た。これらの研究のために用いられるＨＧＦ／ＳＦは△５変異体（variant）であった。ＥＣＬマトリックスはアップステイト・バイオテクノロジー（Upstate Biotechnology）（レイク・プラシッド、ニューヨーク）から購入した。肝細胞の単離および培養ラット肝細胞を、コースト（Kost）、Ｄ．Ｐ．等、ジェイ・セル・フィジオロ (J．Cell．Physiol．）１４７：２７４（１９９１））で教示されるようなカルシウム２段階コラゲナーゼ潅流技術（the calcium two step collagenase perfu sion technique）の適応により単離した。ここでその開示を参考文献として引用する。純粋な肝細胞の集団を得るよう、全ての上記の調製を設計した。多くの他の肝細胞培養系とは異なり、本発明は支持細胞共培養（feeder cell co-culture ）または支持細胞条件培地（feeder-cell conditioned media）を必要としないか、または用いない。肝細胞の単離後、細胞を、培養プレートへの細胞付着に用いられる培地に懸濁した。この培地はＮＥＡＡ（ＧＩＢＣＯ１１１４０）、インスリン５ｍｇ／Ｌ、およびゲンタマイシン５μｇ／ｍｌを含むＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ１２５７０）であった。肝細胞を、以下の記載に従って単層のコラーゲン被膜上で平板培養し、２時間で付着させた。コーニング（Corning）由来の６− ウェル・クラスター・プレート（プレートあたり９．８平方センチメートル）を用いた。肝細胞を増殖させる予定のない実験、または分化された機能のアセスメントを行う実験のために、細胞を、表面積１平方センチメートルあたり８０，０００肝細胞の濃度で平板培養した。増殖または異種ＤＮＡによる遺伝形質導入を引き起こす予定の実験のために、細胞を、表面積１平方センチメートルあたり１，０００または１０，０００肝細胞の初期濃度で平板培養した。細胞を平板培養した後、２時間で、およびその後４８時間ごとに、平板培養培地を本発明のＨＢＭ培地と取り替えた。チミジン、成長因子、および他の成分は、必要なときは培地交換のときに添加した。ヒト肝細胞を、ストロム（Strom）、Ｓ．Ｃ．等、ジャーナル・オブ・ナショナル・カンサー・インスチチュート (Journal of National Cancer Institute)６５（５）：７７１〜８（１９８２）で記述されているようなコラゲナーゼ潅流技術（the collagenase perfusion technique）の適応により単離した。ここでその開示を参考文献として引用する。ラット肝細胞についての上記記載と同様にして、細胞を培養した。コラーゲンゲルを、ミケロポーラス（Michalopoulos）、Ｇ．Ｋ．等、エクスプ・セル・レス (Exp ．Cell．Res.)９４：７０（１９７５）による記載と同様にして調製した。ここでその開示を参考文献として引用する。コラーゲンおよびマトリゲルでのプレートのドライコーティング（dry coating）も、製造業者による詳述と同様にして行った。０．５ｍｌの培地に、付着細胞上、直接的にマトリゲル溶液５０μｌを添加することにより、マトリゲルゲルを製造した。上で引用したコースト（Kost）、Ｄ．Ｐ．等（１９９１）による記載と同様にして、材料沈殿性のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）へのトリチウム標識チミジンの取り込みによりＤＮＡ合成を測定した。所望により、コラーゲンゲルを、使用されるＭＥＭ培地１ｍｌあたり２ｍｇのコラゲナーゼで消化した。その後、３７℃で３０分間インキュベーションを行った。消化されたゲルをＮａＯＨで処理し、その後、上で引用したコースト（Kost）、Ｄ．Ｐ．等（１９９１）による記載と同様にＴＣＡで処理して、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質を沈殿させた。ＨＢＭ培地の組成ＤＭＥＭ、ＨＥＰＥＳ、Ｌ−グルタミン、および抗生物質をＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（ガイザーズブルク（Gaithersburg）、メリーランド）から購入した。ＩＴＳ混合物（インスリン、トランスフェリン、セレン）をボアリンガー・マンハイムから購入した。全ての他の添加剤は細胞培養グレード（cell culture grade）（シグマ（Sigma））であった。特定の実験について、特記しない限り、保存基礎培地は最終のＤ−グルコース濃度が２．０ｇ／ＬとなるようブレンドされたＤＭＥＭＩ１９６６およびＤＭＥＭ１０３１４からなった。した。この場合、４４５ｍｌのＤＭＥＭ１０３１４を５５５ｍｌのＤＭＥＭ１１９６６とブレンドし、上記濃度を達成した。これらの保存基礎培地の配合は上記の表Ｉで説明する。その後、得られたブレンド培地を以下のもので補足した：精製ウシアルブミン２．０ｇ／Ｌ、Ｄ−ガラクトース２．０ｇ／Ｌ、Ｌ−オルニチン０．１ｇ／Ｌ、プロリン０．０３０ｇ／Ｌ、ニコチンアミド０．６１０ｇ／Ｌ、ＺｎＣｌ₂０．５４４ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．７５０ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ０．２０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ₄０．０２５ｍｇ／Ｌ、グルタミン５．０ｍＭ、ＩＴＳ（ｒｈ−インスリン５．０ｍｇ／Ｌ、ヒトトランスフェリン５．０ｍｇ／Ｌ［３０％ダイフェリック鉄飽和（30% diferric iron saturated）］、セレン５．０ μｇ／Ｌ）、デキサメタゾン１０^-7Ｍ、およびＨＥＰＥＳ緩衝剤２０．０ｍＭ。ペニシリンおよびストレプトマイシンをそれぞれ１００Ｕ／Ｌおよび１００μｇ／Ｌで添加した。混合された基礎ＨＢＭを、０．２２-μｍ低タンパク結合フィルター系（0.22-μｍ low protein-binding filter system）（コーニング）によるろ過により滅菌し、４℃で保存し、４週間以内に用いた。所望により、培地を替えるときごとに、成長因子を特定濃度でＨＢＭフレッシュに添加した。レトロウイルス形質移入およびクローン増殖のアセスメントはじめに肝細胞を１０⁴／ｃｍ²で平板培養し、ＨＧＦ／ＳＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）およびＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）で補足されたＨＢＭで成長させた。６８時間後、培地を、ジトボゲル（Zitvogel）,L.H.等、Hum ．Gene．Ther.5:1493(1994) で記載されているように、ＬＴＲプロモーター下Ｅ．コリ（coli）β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＣＲψＰ−パッケージ複製−欠損両種指向性レトロウイルス（ｍｌあたりＭＦＧ〜５×１０⁵ユニット）由来の上澄みで置き換えた。ここでその開示を参考文献として引用する。ポリブレネ（polybrene）を２μｇ／ｍｌで添加した。１８時間後、上澄みを、ＥＧＦ２０ｎｇ／ｍｌおよびＨＧＦ／ＳＦ４０ｎｇ／ｍｌで補足されたＨＢＭと取り替えた。ウイルス含有上澄みでの短時間の曝露は、肝細胞の生存または増殖について、不利な効果をもたらさなかった。示された時間において、細胞を、ＰＢＳ中０．５％グルタルアルデヒド（gl utaraldehyde）で１０分間固定し、Ｘ−Ｇａｌ基質で３７℃にて１６時間発育させた。Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子を発現する形質導入された細胞は、図４Ｇおよび４Ｆで示されるように、積極的に染色された。各成分についての適切なコントロールはＸ−Ｇａｌ染色について陰性であった。透過型電子顕微鏡透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）用のサンプルを、２．５％グルタルアルデヒドおよび２％ホルムアルデヒド（formuldehyde）を含む０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．４）中、１〜１．５時間培養プレート上に固定した。プレートをその後、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．４）で２回および５％スクロースを含む０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．４）で２回すすいだ。それらを１〜７日間スクロース緩衝剤中、保持し、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．４）で２回すすいだ後、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝剤中１％ＯｓＯ₄中、１時間二次固定（postfixed）した。その後、プレートを緩衝剤中、再度すすいだ後、固定され処理されたコラーゲンゲルをかみそりの刃で細片状にカットした。その後、細片をガラス製試料バイアルに移し、一連の等級のエタノール（２５〜１００％）および２プロピレンオキシド・チェインジズ（two propylene oxide changes）を通じて脱水し、エポン−アラルダイト樹脂（Epon-Araldite resin）（バイオテック、テキサス）で浸潤した。コラーゲンゲルがプロピレンオキサイドを保持するのに貢献しながら、数回の樹脂交換を２日間にわたって行った。コラーゲン細片を平坦包埋し、６０℃一晩中で硬化した。ノーザンブロット法による遺伝子発現の分析培養からの全ＲＮＡおよびｍＲＮＡの抽出１ウェルあたり２．０ｍｌのＲＮＡｚｏｌＢ（バイオテック）を用いて、未洗浄細胞培養から全ＲＮＡを抽出し、製造業者のガイドラインに沿って精製した。ＲＮＡ濃度および純度を従来からの分光測光法によって測定した。レーン（la ne）あたり２０μｇＲＮＡのサイズ分離を変性１％アガロースゲル上で完結し、毛細管法（capillary method）によりナイロン膜（nylon membranes）（アメルシャム(Amersham)、アーリントン・ハイツ(Arlington Heights)、イリノイ）に移した。ＵＶ光下での架橋後、アメルシャム・ランダム・プライマー・キット（ Amersham random primer kit）を用いて、［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰで標識化された特定のｃＤＮＡｓ（図に示すように）で膜を一晩中ハイブリダイズした。その後、膜を最強条件下で洗浄し、１〜３日間、ＸＡＲフィルム（イーストマン・コダック、ロチェスター（Rochester）、ニューヨーク）に曝露した。ＲＮＡハイブリダイゼーション結合の定量をレーザーデンシトメトリーにより行った。ｃＤＮＡプローブの源遺伝子発現を研究するために用いられるｃＤＮＡプローブは容易に得られ、注文により以下の源から入手可能である：ノーマン・マーシュー（Norman Marceau ）博士（ラバル（Laval）大学）由来のサイトケラチン８；デニス・ループ(Denn is Roop)博士(ベイラー（Baylor）薬科大学)由来のサイトケラチン１４；ロバート・オシマ(Robert Oshima)博士(ラジョラ・カンサー・リサーチ・ファンデーション（LaJolla Cancer Research Foundation）)由来のサイトケラチン１８；アンドレ・ロイヤル博士（モントリオール大学）由来のサイトケラチン１９；デービッド・リー博士（チャペル・ヒルにあるノース・キャロライナ大学）から得られたＴＧＦα（ラット）；シェルドン・エープ（Sheldon Earp）博士（チャペル・ヒルにあるノース・キャロライナ大学）から得られたＥＧＦ−Ｒ（ラット）；アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Coll ection）(ＡＴＣＣ)由来のａＦＧＦ（カタログＮｏ．７８２２２）；ＡＴＣＣ由来のａＦＧＦ−Ｒ（カタログＮｏ．６５７９６）；ジェイ・デージャン（Jay De gen）博士（シンシナティー大学）から得られたｕＰＡ；スチーブ・ストローム博士（ピッツバーグ大学）由来のシトクロム１１Ｂ１；アルブミンのためのｃＤＮＡｓ、αフェトプロテイン、および転写因子分析はジョー・ロッカー（Joe Lo cker）博士（ピッツバーグ大学）が起源であった。得られた結果細胞増殖における培地成分およびマトリックス基質の役割ＨＢＭ培地の十分な記載は上にある。各種培地成分の相対的な重要性を評価するために、幾つかの実験を行い、その結果を以下の表ＩＶ（Ａ、Ｂ、およびＣ）に示した。表ＩＶＡに示されるように、完全なＨＢＭ培地組成物から、成分Ｄ −グルコース、アルブミン、デキサメタゾン、トランスフェリンおよびセレン、ニコチンアミド、および微量元素を個々に除いた。成長１４日後の培養あたりの全ＤＮＡをそこに示す。容易に理解できるように、デキサメタゾンの除去は最も劇的な影響をもたらし、次にニコチンアミドの除去が続く。表ＶＩＢでは、１４日で達成された細胞の成長を、ダイフェリックトランスフェリン（鉄飽和）を含むＨＢＭ培地と鉄不飽和トランスフェリンのものとの間で比較する。鉄含有ダイフェリックトランスフェリン（３０％飽和）の添加は、成長を促進するのに、より有効であることがわかった。不飽和トランスフェリンへの元素鉄（ＦｅＳＯ₄ 、０．１μＭ）の添加は差を克服することはできなかった。表ＶＩＣは、ＨＢＭ培地中でのＤ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、およびＬ−オルニチンの相対的な効果についての情報を提供する。これら３種類の全ての成分は細胞に対してエネルギーのポテンシャル源（potential sources）である。３種類の全ての成分を除去したとき、成長の完全な中断が見られた。Ｄ−グルコース単独の添加は応答（response）のほとんどを回復させたが、Ｄ−ガラクトース単独の添加では効果は少なかった。オルニチン単独では最小の効果がもたらされた。アルブミンおよびＤ−グルコースそれぞれの濃度はリットルあたり２ｇが最適であることがわかったが、効果はそれぞれの場合でリットルあたり１または３ｇと統計学上異なっていなかった。これらの成分の完全除去の影響を表ＩＶＡに示す。肝細胞はＨＧＦ／ＳＦ、ＥＧＦ、およびＴＧＦαの影響下で散発的に（Diffusely）増殖にはいる図１Ａおよび１Ｂは、μｇＤＮＡあたりのチミジンの取り込みと、ＨＧＦ／ＳＦおよびＥＧＦ（それぞれ４０、２０ｎｇ／ｍｌ）存在下での細胞成長における様々な培養日数でのＢＲｄＵ核標識指数を示す。認識できるように、増殖のほとんどが５〜１２日で起こる。１５日までに培養はコンフルーエント(ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ)となり、ＤＮＡ合成は減速した。持続性増殖の期間中における高い核標識指数は、増殖細胞は直接的に成熟肝細胞に由来することを示す。成長因子ＨＧＦ／ＳＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＫＧＦ（角質細胞成長因子）、ＳＣＦ（幹細胞因子）、およびａＦＧＦ（酸性繊維芽細胞成長因子）を個々にＨＢＭ培地に添加した。添加された成長因子の中で、ＨＧＦ／ＳＦ、ＥＧＦ、およびＴＧＦα（図２において「ＴＧＦａ」と示す）は、１５日での培養あたりの全ＤＮＡ量によって示されるように、有意な細胞増殖を引き起こした。ＫＧＦ、ａＦＧＦ、およびＳＣＦは、単独でまたは組み合わせて添加されたとき、図２に示すように増殖効果を有さなかった。ＴＧＦαは、ＨＢＭ培地に単独で添加されたとき、他のいかなるマイトジェンより強い増殖効果を有した。ＨＧＦ／ＳＦおよびＥＧＦ同時は、他のいかなる単一マイトジェンまたは組み合わせが有していたのより、連続１５日の与えられた期間で最も強い増殖効果を有した。全ての成長因子の同時添加は、図２でわかるように、組み合わされたＨＧＦ／ＳＦおよびＥＧＦより優れた効果はなかった。ＨＧＦ／ＳＦおよびＥＧＦ単独またはこれらの組み合わせによって推論される詳細な細胞速度論（detailed cell kinetics）を図１Ｃに示す。培養あたりの全ＤＮＡを培養時間の関数として示す。１５日での最も大きなＤＮＡ蓄積量がＨＧＦ／ＳＦおよびＥＧＦの組み合わせで見られた。１５日での培養あたりのＤＮＡは時間０でのそれの１２倍であり、細胞数の増加を示している。ＨＧＦ／ＳＦおよびＥＧＦはおよそ等しい効力があった。ＴＧＦα 単独は、ＨＧＦ／ＳＦまたはＥＧＦいずれか単独より良好なマイトジェンであった。マトリックス基質の効果いくつかのマトリックス基質がこの系において細胞成長を促進した。ラット肝細胞を、ＨＧＦ／ＳＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）およびＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）で補足されたＨＢＭ中で１５日間、培養し、図３で示されるような様々なマトリックスで成長させた。細胞を上述のようにして培養した。コラーゲンタイプＩＶ（マウス）、タイプＩ（ウシ）、フィブロネクチン、およびラミニンでのドライコーティングは、１５日での培養あたりの全ＤＮＡの測定によりアッセイされるように、細胞成長の促進に同様に有効であった。ＥＣＬ（ＥＨＳゲルの市販の誘導体、ＵＢＩ）でのドライコーティングは優れた効果があった。タイプＩコラーゲン（ビトロゲン（Vitrogen）市販の調製）でのコーティングは、特記しない限り、実験で採用される標準的な方法であった。これらの培養において特定の表現型転化（specific phenotypic conversions）を促進するときのマトリックスゲルの効果をさらに以下で検討する。増殖中における肝細胞の表現型変化（Phenotypic Changes）（４０ｎｇ／ｍｌＨＧＦ／ＳＦおよび２０ｎｇ／ｍｌＥＧＦで補足された上述のようなＨＢＭで培養された）増殖細胞のモルホロジー（morphology）は細胞増殖の刺激後、様々な時間で変化した。ミケロポーラス（Michalopoulos）、Ｇ．Ｋ．等、ジェイ・セル・フィジオロ（J ．Cell．Physiol.）１５６：４４３（１９９３）で記載されているように、図４Ｂで見られる肝細胞でのＨＧＦ／ＳＦの「分散(scattering)」効果によるものとして一般的に記載される表現型と仮定して、図４Ａで示される正常肝細胞モルホロジーから、はじめの４日での増殖細胞は長い突起部を得た。ここでその開示を参考文献として引用する。６日と８日の間において、増殖細胞はほとんどの細胞質顆粒を喪失し、核はより少なく突出するようになり、突起部は縮小し、細胞は単層パッチ（monolayer patches）として成長しはじめた。ついには、細胞として合体されたこれらのパッチは成長し続け、図４Ｃに見られるような連続単層を形成した。図４Ｄおよび４Ｅで見られる電子顕微鏡観察による試験は、成熟肝細胞を象徴する特色のほとんどが欠けていることを示した。１５日までに、ミトコンドリア周辺を包む小胞体のラマラエ（ lamallae）はなく、グリコーゲンロゼットまたはペルオキシソームはなかった。毛細胆管はなかった。ケラチン中間フィラメント（keratin intermediate filam ents）の束の突出した増加があった。核は非常に突出した核小体で角張っていた（angular）。コンフルーエンシー（confluency）の後、モルホロジーは、図６Ｂおよび６Ｃにおいてと同様に、小胞体ラマラエ、ミトコンドリア、グリコーゲン、ペルオキシソーム、毛細胆管等を有する成熟分化肝細胞（maturedifferenti ated hepatocytes）に徐々に戻った。増殖ラット肝細胞のクローン成長（clonal growth）を図４Ｆおよび４Ｇに図示する。肝細胞を培養３日にウイルスＬＴＲの影響下で、ラック（ｌａｃ）−Ｚ遺伝子を含む複製−欠失性レトロウイルスで形質移入し、β−ガラクトシダーゼの発現のために染色した。図４Ｆでわかるように、培養４日（形質移入後、１日）では単細胞は大抵、染色陽性であった。一方で、１０日での染色および２８日までの継続は、図４Ｇでわかるように、はじめの形質移入された肝細胞のクローン成長と矛盾することなく、染色陽性の肝細胞のパッチ（patches）を示した。ラック−Ｚ−陽性細胞（lac-Z-positive cells）の割合（〜２０％）は培養中、変化しなかったらしい。増殖肝細胞は変化されたレベルの様々な遺伝子を発現するいくつかの特定の遺伝子の発現を増殖肝細胞においてアッセイした。これらには、肝細胞分化に関与するｍＲＮＡ遺伝子（アルブミン、シトクロムＩＩＢＩ（図５ＡにおいてＰ４５０と表示されている））、サイトケラチンマーカーをコードする遺伝子（サイトケラチン１４，１８、および１９）、または肝細胞成長に関係する遺伝子（ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、ＨＧＦ／ＳＦおよびそのレセプターｃ−ｍｅｔ（図５ＡにおいてＭＥＴと表示されている）、ＥＧＦ（ＥＧＦＲと表示されている）およびＴＧＦαおよびそれらのレセプター、酸性ＦＧＦおよびそのレセプター、ならびにＴＧＦβ１）が含まれていた。混合されたＨＧＦ／ＳＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）およびＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）（図５Ａおよび５Ｂ）またはＴＧＦα単独（２０ｎｇ／ｍｌ）（データは示さない）いずれかの存在下で成長された培養からのＲＮＡのノーザン・ブロット分析によって上記遺伝子を研究した。０日、６日、１０日、１５日、および２１日に、培養から全ＲＮＡを単離した。試験されたいかなる時点においても、ＨＧＦ／ＳＦまたはＴＧＦβ１ｍＲＮＡの発現は見られなかった。認識され得るように、時間０においてアルブミンおよびシトクロムＩＩＢＩｍＲＮＡは存在し、その後減少した。アルブミンｍＲＮＡは、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）のｍＲＮＡが同様に検出される２１日までに増加した。サイトケラチン、１４、１８、および１９のためのｍＲＮＡは培養中、増加した。ａＦＧＦおよびＴＧＦαのためのｍＲＮＡにおいては、安定した増加があった。ＨＧＦ／ＳＦのためのレセプター（ＭＥＴ、図５Ａ）およびａＦＧＦ（図５ＢａＦＧＦＲ）のｍＲＮＡは培養時間中ずっと存在したままであった。ＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ）ｍＲＮＡは０日から減衰したが、発現は維持された。参考「ハウスキーピング」遺伝子としてＧＡＰＤＨｍＲＮＡを用いた。ウロキナーゼならびにサイトケラチン１４および１９の発現において劇的な増加が認められた。ＨＧＦ／ＳＦおよびＥＧＦの代わりにＴＧＦα（２０．０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で維持される培養において、上記のパターンとのいくつかの違いが見られた。これらの培養においてアルブミン発現およびＨＧＦ／ＳＦレセプターの発現は増殖中、より良好に維持されたが、ＡＦＰはより早く現れた。（データは示さない）いったんコンフルーエンシー（confluency）が達成されれば、遺伝子発現パターンにおいて観察された差異にかかわらず、ＴＧＦαまたはＨＧＦ／ＳＦプラスＥＧＦの存在下で成長する細胞間で形態学上の差異は見られなかった。増殖肝細胞はマトリゲルの影響下または非実質細胞（Nonparenchymal Cells）存在下または培養時間によって成熟肝細胞に戻るマトリゲルで８日に培養を覆うと、迅速な（２日以内の）毛細胆管の出現および線状構造（cord-like structures）への細胞の編成（organization）があった。これらの細胞の特徴を図６Ａに示す。図６Ｂおよび６Ｃで電子顕微鏡観察により示されるように、これらの細胞は成熟肝細胞の典型的なマーカーを有し、ミトコンドリア、毛細胆管、およびグリコーゲンの存在（presence）の周辺での小胞体の包みがみられた。マトリゲルに１０日間（培養において８日から１８日）曝露された培養からｍＲＮＡを調製した。アルブミンの発現を図６Ｄに示すように、培養０日（コラゲナーゼ潅流後すぐ）、培養８日（マトリゲルで覆う前）、およびマトリゲルで覆った後３日および７日の間で比較した。アルブミンｍＲＮＡの発現が最小に検出可能なコントロール増殖培養と比較して、マトリゲルの添加は、アルブミンｍＲＮＡの発現の劇的な増加をもたらした。マトリゲル処理培養におけるシトクロムＰ４５０ＩＩＢ１ｍＲＮＡのレベルについてのフェノバルビトール（Phenobarbitol）（ＰＢ）の効果も図６Ｅに示すようにして測定した。マトリゲルを８日に培養に添加した。ＰＢを２日後（培養１０日）に添加した。ＰＢの添加後５日（培養１５日）で細胞を得た。マトリゲル処理培養においてだけＰＢの添加はシトクロムＩＩＢ１ｍＲＮＡを誘導した。フェノバルビトールによるこのｍＲＮＡの誘導は肝細胞の象徴であり、ミケロポーラス（Michalop oulos）、Ｇ．等、サイエンス（ワシントンＤＣ）１９３：９０７（１９７６）によって報告されたように、他のいかなる細胞においても起こらない。ここでその開示を参考文献として引用する。典型的には、肝細胞培養は急速にＰＢに対する応答能を失う。図６Ｂおよび６Ｃで示される電子顕微鏡観察による構造によってわかるように、この結果は、増殖肝細胞の培地へのマトリゲルの添加は成熟肝細胞表現型を誘導するという証拠を支持している。サイトケラチン１９（ＣＫ１９）（図６Ｆ）の発現について、種々の条件を導入する前に増殖肝細胞によって発現される総胆管マーカー（bile duct marker）はまた、図５Ｂでわかるように、マトリゲルの添加後に発現をやめた。マトリゲルに曝露された培養においてＤＮＡ合成を測定したところ、本質的な減少があった。熟成肝細胞モルホロジーへの分化（differentiation）がＤＮＡ合成を必要としたかどうかを評価するために、２０ｍＭヒドロキシ尿素をＨＢＭ培地に添加した。これは示されており（ミケロポーラス（Michalopoulos）、Ｇ．Ｋ．等、カンサー・レス（Cancer Res.）３８：１８６６（１９７８）、ここでその開示を参考文献として引用する。）、リボヌクレオチドレダクターゼを阻害することにより肝細胞における予定された半保存的ＤＮＡ合成を撤廃する。マドリーゲルで覆う前にヒドロキシ尿素を培養に添加し、次の５日間を通して維持した。ＤＮＡ合成は、マトリゲルの不存在下で維持される増殖培養においてはコントロール（ヒドロキシ尿素なし）の３．９３％に減少し、マトリゲルの存在下で維持される培養においてはコントロール（ヒドロキシ尿素なし）の６．２７％に減少した。ＤＮＡ合成はコントロール（＋マトリゲル、ヒドロキシ尿素なし）レベルの６．２７％に減少したが、成熟肝細胞モルホロジーへの増殖肝細胞の転化（conversion）は全く影響されず、完全な集団を伴った。ＨＧＦ／ＳＦ（ＴＧＦαまたはＥＧＦはない）は増殖肝細胞を誘導し、タイプＩコラーゲンゲル中、管状／粒状（Ductular/Acinar）構造に分化する２層のコラーゲンゲル層の間で維持された肝細胞は、ミケロポーラス（Michal opoulos）、Ｇ．Ｋ．等、ジェイ・セル・フィジオロ（J ．Cell.Physiol.）１５６：４４３（１９９３）で記載されているように、長時間（prolonged time per iods）、そのモルホロジーおよび分化を保持する。ここでその開示を参考文献として引用する。ＨＧＦ／ＳＦを含む従来からの培地での培養でコラーゲンゲルサンドイッチ中で維持される肝細胞は激しく増殖し、突出した突起部を形成し、ついに肝平板培養（hepatic plates）を暗示する構造を編成した。前述のように２層のコラーゲンゲルの間で維持された肝細胞のふるまいを試験したが、上述のようにＨＧＦ／ＳＦまたはＥＧＦいずれかで補足されたＨＢＭの存在下であった。ＥＧＦ補足培地において肝細胞が上述のように典型的なトランジションを受けたことが注目された。一方で、ＨＧＦ／ＳＦ単独で補足されたＨＢＭ中の肝細胞においては、上述された増殖肝細胞と外観が同じ細胞の増殖後、１０日と１５日との間で多様な管状構造（multiple ductshaped structures）が現れた。これらは突出してきて、培養において存在するほとんどの細胞を取り囲んだ。およそ１０日からはじまって、１５日までに、培養におけるほとんどの細胞が上記の管状構造に配列された。これらの構造の外観を図７Ａに示す。組織構造の断面を図７Ｂ（光学顕微鏡）および図７Ｃおよび７Ｄ（電子顕微鏡）に示す。構造は管状または粒状のコンフィギュレーションを有していた。これらの構造を囲んでいるいくつかの細胞は非常に細まっており、総肝管上皮と同様の光学および電子顕微鏡観察による外観を有していた。しかしながら他の細胞はより大きく、イン・ビボモデルでの先の研究において述べた管状肝細胞とより密接に類似している。コラーゲンゲルサンドイッチでのＥＧＦまたはＨＧＦ／ＳＦいずれかの下における細胞の増殖（データは示さない）は、乾燥コラーゲンで被覆されたプラスチック上での培養において見られる増殖より、ずっと少なかった（最も高いピークにおいて＜２５％）。最も多い増殖は１０日までに終わり、細胞増殖が終わった後（１０日から１５日）管状様構造（duct-like structur es）が現れた。ＨＧＦ／ＳＦおよびＥＧＦを組み合わせたとき、これらの培養において管状粒状構造が注目されたが、ＨＧＦ／ＳＦ単独の場合より少なかった。マトリゲルで覆ったとき、ＤＮＡ合成を阻害するためのヒドロキシ尿素の添加（阻害はコントロールの５．１％まで低下させる）は管状構造の形成に影響を及ぼさなかった（データは示さない）。図７Ｅは、これらの細胞は管細胞（duct cel ls）の特徴であるサイトケラチン１９を発現することを示す。（シリカ（Sirica ）、Ａ．Ｅ．、プログ・リバー・ディス（Prog ．Liver Dis.）１０：６３（１９９２）およびシリカ（Sirica）、Ａ．Ｅ．、ヒストロ・ヒストパソル（Histol ． Histopathol ）１０：４３３（１９９５）参照、ここでその開示を参考文献として引用する。）図７Ｄで見られる管状構造内での肝細胞様細胞（hepatocyte-lik e cells）の存在と矛盾せず、少量のアルブミン発現も保持された。この総肝管マーカーの発現をとめる成熟肝細胞由来物（mature hepatocyte lineage）に向かって分化する細胞と対照的に、管状細胞は非増殖状態（nonproliferating sta te）においてＣＫ１９発現を維持することが注目される(図７Ｆ)。ＨＧＭ中、ＨＧＦ／ＳＦおよびＥＧＦの存在下、ヒト肝細胞の持続性成長および集団増殖（Population Expansion）ヒト肝細胞培養はラットのものほど広く特質を明らかにされていないが、入手可能な文献では、これらの細胞もまた、成長因子による刺激後に制限された範囲のＤＮＡ合成を受け、培養において急速に退化することが示されている。イスマイル（Ismail）、Ｔ．等、ヘパトロジー（Hepatology）１４：１０７６（１９９１）を参照せよ。ここでその開示を参考文献として引用する。ＨＢＭ培地中、ＨＧＦ／ＳＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）およびＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）に対するヒト肝細胞の応答を研究した。図８でわかるように、ラット肝細胞で記述されたのと同様の結果がヒト肝細胞の一次培養においてえられた。ヒト細胞は培養３〜４日で急速に増殖しはじめ、１９日までにコンフルーエンシーに達する。上述したように、イン・ビトロで培養される肝細胞を細胞集団として増殖させる培地の必要性がある。本発明のＨＢＭはかかる増殖を可能にし、このため、さらに必要とされる増殖肝細胞の研究を可能にする。本発明は以下で概説される多くの他の適用においても有用である。例えば、転移遺伝子（transferred genes）の安定な長期の発現を達成する肝臓−標的遺伝子治療における現在の全ての方法は、初期の形質移入中、積極的に分裂する細胞を必要とする。正常肝臓は、任意の特定の日におけるＳ段階成長において２０，０００肝細胞中、１つしか有さない。細胞増殖を増大させるために、患者の肝臓の大部分（２／３）を切除しなければならない。その後、肝臓−標的遺伝子キャリア源を血管内に注射する。この激しい手段の代わりに採りうる方法は、少量の肝臓（１０％）を切除し、肝細胞を培養し、培養においてそれらを形質移入した後、細胞を肝臓に再注輸することである。この後者の方法は前者の方法より安全で、高価でなく、うまく制御されるが、長期の増殖（prolonged pr oliferation）、本質的に全ての培養細胞のクローン増殖、および細胞の長期間の生存力を可能にするＨＢＭのような培養培地の不足によって現在、妨げられている。細胞成分を含む生物人為的肝臓組織（bioartificial liver tissue）に基づく現在の体外肝臓装置のデザインは形質転換（腫瘍）肝細胞または動物肝細胞に頼っている。動物細胞は、使用されるバイオリアクターにおいてわずかな日数以上は生き残らず、増殖しないため、より頻繁に、かつきわめて接近してバイオリアクターを発生させ、必要を見越して全ての必要な設備、材料および動物ドナーを維持することが必要とされる。さらに動物細胞は、臨床的にそれらの使用を困難にするか、または危険にするいくつかの好ましくない面を有するかもしれない。また、これらの装置で用いられる腫瘍細胞は患者への細胞の漏出の危険を伴うため、潜在的に患者に腫瘍を起こし得る。本発明のＨＢＭ培地は動物および／またはヒト肝細胞および／または他の細胞を含むバイオリアクターの生産を可能にし、細胞数を増加させつつ、一方で長期間の生存力と完全な分化を維持するという独特の特性を提供する。かかるリアクターはまた、薬剤製造、薬物代謝、毒物学研究、および複合生物学研究（complex biological studies）に有用である。本発明のＨＢＭ培地の別の可能な使用は肝細胞の自己移植（aoutotransplanta tion）においてである。肝細胞移植は末期（endstage）肝疾患患者を処置するのに比較的新規なアプローチである。方法は、臓器移植に用いられないドナー臓器の使用に頼る。自己移植には免疫抑制性薬剤を必要としないという利点があるが、細胞の数を拡大し、細胞をドナーに戻すのに充分に長く生存を維持することができなければ、実用的でない。末期肝臓移植片はまた、選択された条件下、例えば、被包形成（encapsulation）および遺伝子操作で、ドナー肝細胞源を提供できるだろう。肝細胞の源に関係なく、長期の培養および再移植（replantation）（脾臓、門脈系、ペリトニウム（peritonium）、腎被膜等へ）における細胞数の拡大は有効な肝合成的および解毒的処理を長期間促進する。限定的な点は肝細胞が不足することである。ＨＢＭは細胞の上記不足を排除する可能性を有し、これによって、肝不全を治療され得る患者の数を劇的に拡大する。同様に、本発明の培地における他の細胞成長での自己移植またはヘテロ移植は、生物細胞治療（bi ocellular therapies）可能な患者や処置の数を拡大し得る。本発明のＨＢＭはまた、薬物および化学薬品の試験行為にも有用であり得る。実質的に全ての薬物、化学薬品、および他の製造生成物は、ＦＤＡ、ＵＳＤＡ、ＮＩＯＳＨおよびＥＰＡ規制の一部分として、肝細胞培養における変異誘発性および毒性について試験されなければならない。現在、長期生存力または有意な増殖の不足のため、上記の試験は短期培養におけるラット肝細胞で行われている。ＨＢＭの使用は、（１）試験期間を拡大し（長期生存力）、（２）より低い濃度での、より長期の曝露を可能にし、（３）増殖肝細胞での変異誘発性および毒性の観察を可能にし、（４）他の毒物学的調査で使用され得るヒト肝細胞の供給を役立たせるだろう。本発明は説明することを目的として詳述されているが、上記の詳述は単にその目的のためだけであること、および請求項によって制限される場合を除いて、本発明の趣旨および範囲から離れなければ、変形は当該分野の当業者によってその場で行われ得ることは理解され得る。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年４月１３日（１９９８．４．１３）【補正内容】請求の範囲１．培養に導入された生細胞の総数よりも培養中に細胞総数を増加させるに十分な量で、ニコチンアミド、鉄キレート化トランスフェリン、インシュリンあるいはインシュリン様成長因子、糖質コルチコイドステロイド、微量金属、グルコースおよびガラクトースからなるグループから選択される炭水化物、アルギニン、プロリン、およびグルタミンを含有する、血清が含まれていなくてもインビトロで肝細胞を増殖することができる細胞培養培地。２．（ａ）哺乳類細胞培養用の保存基礎培地；および（ｂ）ニコチンアミド、鉄キレート化トランスフェリン、インシュリンあるいはインシュリン様成長因子、糖質コルチコイドステロイド、微量金属、グルコースおよびガラクトースからなるグループから選択される炭水化物、アルギニン、プロリン、およびグルタミン；但し、それらのいずれかの物質が、培養に導入された生細胞の総数よりも培養中に細胞総数を増加させるに十分な量で保存基礎培地に含有されていないとき；からなる、血清が含まれていなくてもインビトロで肝細胞を増殖することができる細胞培養培地。３．クレイム１またはクレイム２の細胞培養培地にさらに１以上の成長因子を添加してなり、該成長因子は該細胞に対してマイトジェンとして機能するクレイム１またはクレイム２記載の培養培地。４．さらに以下のもの1以上を含有するクレイム１記載の細胞培養培地；細胞に対してマイトジェンとして機能する成長因子；アルブミン、０−１０ｇ／Ｌ；ピルビン酸ナトリウム、０−２．０ｇ／Ｌ；ガンマトコフェロール、０−３．５ｍｇ／Ｌ；アルファトコフェロール、０−２．５ｍｇ／Ｌ；ビタミンＤ₃，０−１．８ｍｇ／Ｌ；デキストラン、０−５．０ｇ／Ｌ；リノレン酸、０−５．０Ｇ／Ｌ；アポートランスフェリン、０−２０．０ｍｇ／Ｌおよび鉄グルコネート、０−１００μｇ／Ｌ；レチノール、０−２．０ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ₁₂、０ −２．０ｍｇ／Ｌ；アスコルビン酸、０−１０．０ｍｇ／Ｌ；塩化コリン、０．２ −１２．５ｍｇ／Ｌ；ビオチン、０．２−１５．０ｍｇ／Ｌ。５．さらに以下のものを1以上含有するクレイム２記載の細胞培養培地；細胞に対してマイトジェンとして機能する成長因子；アルブミン、２．０ｇ／Ｌ；ピルビン酸ナトリウム、０．１５ｇ／Ｌ；ガンマトコフェロール、０．３５ｍｇ／Ｌ；アルファトコフェロール、０．１５ｍｇ／Ｌ；ビタミンＤ₃，０．２０ｍｇ／Ｌ；デキストラン、２．０ｇ／Ｌ；リノレン酸、１．０ｇ／Ｌ；アポートランスフェリン、５.０ｍｇ／Ｌおよび鉄グルコネート、２５．０μｇ／Ｌ；レチノール、０．０５ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ₁₂、０．１５ｍｇ／Ｌ；アスコルビン酸、３．０ｍｇ／Ｌ；塩化コリン、１．５ｍｇ／Ｌ；ビオチン、０．７５ｍｇ／Ｌ。６．１以上の添加成長因子が、肝細胞成長因子、上皮成長因子、および形質転換成長因子アルファからなるグループから選択されるクレイム３の培養培地。７．該保存基礎培地が、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ，ウィリアムズメディア(Williams ’Media)Ｅ、ＢＭＥ、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、メディア(media)１９９、F-12（ハム）（Ｈａｍ）ニュートリエント・ミクスチャー（Nutrient Mixture）、F-10（ハム）ニュートリエント・ミクスチャー、およびＲＰＭＩメディア１６４０からなるグループから選択されるクレイム２の培養培地。８．基礎培地がＤＭＥＭであるクレイム７の培養培地。９．ＤＭＥＭが2.0ｇ／ＬのＤ−グルコースを含有するクレイム８の培養培地。１０．微量金属が亜鉛、マンガン、銅、およびセレンからなるクレイム１またはクレイム２いずれかの培養培地。１１．微量金属がさらにＺｎＣｌ₂、ＺｎＳＯ₄、およびＣｕＳＯ₄を含有するクレイム１０の培養培地。１２．糖質コルチコイドステロイドが、コルチゾル、プレドニゾン、プレドニソォン（prednisolone）、およびヒドロコルチゾン等のコルチゾル誘導体、およびデキサメタゾンからなるグループから選択されるクレイム１またはクレイム２いずれかの培養培地。１３．以下の成分を有する保存基礎培地からなる、インビトロで肝細胞を増殖可能な細胞培養培地；ＣａＣｌ₂（無水）、２００.００ｍｇ／Ｌ；Ｆｅ（ＮＯ₃ ）・９Ｈ₂Ｏ、０．１０ｍｇ／Ｌ；ＫＣｌ、４００ｍｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ₄（無水）、９７．６７ｍｇ／Ｌ；ＮａＣｌ、６４００．００ｍｇ／Ｌ；ＮａＨＣＯ₃、３７００．００ｍｇ／Ｌ；ＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ、１２５．００ｍｇ／Ｌ；Ｌ−シスチン・２ＨＣｌ、６３．００ｍｇ／Ｌ；グリシン、３０．００ｍｇ／Ｌ；、Ｌ −ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ₂Ｏ、４２．００ｍｇ／Ｌ；Ｌ−イソロイシン、１０５．００ｍｇ／Ｌ；Ｌ−ロイシン、１０５．００ｍｇ／Ｌ；Ｌ−リジン・ＨＣｌ、１４６．００ｍｇ／Ｌ；Ｌ−メチオニン、３０．００ｍｇ／Ｌ；Ｌ−フェニルアラニン、６６．００ｍｇ／Ｌ；Ｌ−セリン、４２．００ｍｇ／Ｌ；Ｌ−トレオニン、９５．００ｍｇ／Ｌ；Ｌ−トリプトファン、１６．００ｍｇ／Ｌ；Ｌ−チロシン・２Ｎａ・２Ｈ₂Ｏ、１０４．００ｍｇ／Ｌ；Ｌ−バリン、９４．００ｍｇ／Ｌ；Ｄ−Ｃａパントテン酸塩、４．００ｍｇ／Ｌ；コリンクロライド、４．００ｍｇ／Ｌ；葉酸、４．００ｍｇ／Ｌ；ｉ−イノシトール、７．２０ｍｇ／Ｌ；ピリドキシンＨＣｌ、４．００ｍｇ／Ｌ；ピリドキサールＨＣｌ、４．００ｍｇ／Ｌ；リボフラビン、０．４０ｍｇ／Ｌ；チアミン・ＨＣｌ、４．００ｍｇ／Ｌ；Ｄ−ガラクトース、０．０１−５．０ｇ／Ｌ；Ｄ−グルコース、０．０１−５．０ｇ／Ｌ；ニコチンアミド、１−３０５０ｍｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、１−１２０ｍｇ／Ｌ；Ｌ−アルギニン、１−１５０ｍｇ／Ｌ；Ｌ−オルニチン、１−５００ｍｇ／Ｌ；ヒト−ホロートランスフェリン（３０％鉄飽和）、０．１−１００ｍｇ／Ｌ；ｈ−インシュリン、１０^-11Ｍを超える；デキサメタゾン、１０^-12−１０^-13Ｍ；ＺｎＣｌ₂、１−３０００μｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ₄、１−２５０μｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、１−３０００μｇ／Ｌ；ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、１−１０００Iμｇ／Ｌ；セレン、１−１５０μｇ／Ｌ；Ｌ−グルタミン、２．０−１０．０ｍＭ；ＨＥＰＥＳ、５−５０ｍＭ。１４．次の成分を特定量含むクレイム１１の培養培地：精製ウシアルブミン；Ｄ−グルコース、２．０ｇ／Ｌ；Ｄ−ガラクトース、２．０ｇ／Ｌ；Ｌ−オルニチン、０．１ｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、０．０３０ｇ／Ｌ；ニコチンアミド、０．６１０g/L；ＺｎＣｌ₂、０．５４４ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．７５０ｍｇ／Ｌ；ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、０．２０ｍｇ／Ｌ；ＭｎＳＯ₄、０．０２５ｍｇ／Ｌ；グルタミン、５．０ｍＭ；ＩＴＳ（ｒｈ−インシュリン、５．０ｍｇ／Ｌ；ヒトトランスフェリン、５．０ｍｇ／Ｌ（３０％第2鉄（diferric）鉄飽和）；セレン、５．０μｇ/L）、デキサメタゾン、１０^-7M；およびＨＥＰＥＳバッファー、２０．０ｍＭ。１５．液体に添加されるとクレイム１またはクレイム２いずれかの細胞培養培地を形成する成分の混合物。１６．乾燥成分を液体に添加し培養培地を形成することからなる、クレイム１またはクレイム２いずれかの細胞培養培地の製造方法。１７．クレイム１またはクレイム２いずれかの培養培地中に肝細胞を含有する素生物。１８．クレイム１またはクレイム２いずれかの細胞培養培地中に肝細胞を導入すること、および該培地中で導入した肝細胞を培養することからなる、インビトロで肝細胞を増殖する方法。１９．クレイム１またはクレイム２いずれかの細胞培養培地中に肝細胞を導入すること、そして該培地中で肝細胞を培養することにより細胞増殖をおこすことからなる、インビトロで肝細胞を増殖する方法。２０．クレイム１またはクレイム２いずれかの細胞培養培地中に肝細胞を導入すること、細胞増殖がおこるように該培地中で導入した肝細胞を培養すること、導入した肝細胞よりも分化の少ない細胞を製造するのに十分な時間細胞増殖させることからなる、インビトロで肝細胞の表現型をより分化の少ない状態に修飾する方法。２１．クレイム１またはクレイム２いずれかの細胞培養培地中に肝細胞を導入すること、十分な時間細胞増殖をおこらしめより分化の少ない段階まで肝細胞を培養すること、そしてこのより分化の少ない細胞に導入細胞の特性を発生せしめることからなり、この肝細胞特性の発生が、細胞外マトリックス(matrix)物質を添加することおよびより分化の少ない細胞をコンフルーエンス（confluence）に達せしめることことからなるグループから選択される方法によって成し遂げられることを特徴とするるインビトロで肝細胞を製造する方法。２２．該マトリックスがフィブロネクチン、コラーゲン、ラミニンおよびポリリジンの1以上からなるクレイム２１の方法。２３．該マトリックスがエンタクチン(entactin)、ラミニン、およびコラーゲン型ＩＶからなるクレイム２１の方法。２４．クレイム１またはクレイム２いずれかの培地中に肝細胞を導入すること、そして該培地中で肝細胞を培養することにより細胞増殖およびクローン成長をおこすことからなるインビトロで肝細胞誘導細胞のクローン成長を生ぜしめる方法。２５．クレイム１またはクレイム２いずれかの細胞培養培地中に肝細胞を導入すること、十分な時間細胞増殖をさせることによりより分化の少ない段階まで該肝細胞を培養すること、そしてこのより分化の少ない細胞に導入肝細胞の特性を発生せしめることからなり、マトリックスが、該マトリックス上の細胞に1以上の成長因子を添加することにより該特性および該構造が形成されるように使用されることを特徴とする、インビトロで肝細胞から小管状または細葉構造を形成する方法。２６．クレイム１またはクレイム２いずれかの細胞培養培地中に細胞を導入すること、そして該培地中で細胞を培養することからなり、該細胞が膵島細胞、尿細管細胞、肝周皮細胞、および小腸上皮細胞からなるグループから選択されることを特徴とする、インビトロで細胞を増殖する方法。２７．クレイム１またはクレイム２いずれかの細胞培養培地中に細胞を導入すること、該培地中で該細胞を培養することにより細胞増殖を生ぜしめることからなり、該細胞が膵島細胞、尿細管細胞、肝周皮細胞、および小腸上皮細胞からなるグループから選択されることを特徴とする、インビトロで細胞を増殖する方法。２８．クレイム１またはクレイム２いずれかの細胞培養培地中に細胞を導入すること、細胞増殖がおこるように該培地中で導入した細胞を培養すること、導入した細胞よりも分化の少ない細胞を製造するのに十分な時間細胞増殖させておくことからなり、該細胞が膵島細胞、尿細管細胞、肝周皮細胞、および小腸上皮細胞からなるグループから選択されることを特徴とする、インビトロで細胞の表現型をより分化の少ない状態に修飾する方法。２９．クレイム１またはクレイム２いずれかの細胞培養培地中に細胞を導入すること、十分な時間細胞増殖をおこらしめより分化の少ない段階まで細胞を培養すること、そしてこのより分化の少ない細胞に導入細胞の特性を発生せしめることからなり、この細胞特性の発生が、細胞外マトリックス物質を添加することおよびより分化の少ない細胞をコンフルーエンス（confluence）に達せしめることことからなるグループから選択される方法によって成し遂げられ、該細胞が膵島細胞、尿細管細胞、肝周皮細胞、および小腸上皮細胞からなるグループから選択されることを特徴とする、インビトロで細胞を製造する方法。３０．クレイム１またはクレイム２いずれかの培地中に細胞を導入すること、そして該培地中で細胞を培養することにより細胞増殖およびクローン成長をおこすことからなり、該細胞が膵島細胞、尿細管細胞、肝周皮細胞、および小腸上皮細胞からなるグループから選択されることを特徴とする、インビトロで細胞誘導細胞のクローン成長を生ぜしめる方法。３１．クレイム１またはクレイム２いずれかの細胞培養培地中に細胞を導入すること、そして該培地中で細胞を培養することからなり、該細胞がＭＲＣ５、ＣａＣｏおよび３Ｔ３セルラインからなるグループから選択されることを特徴とする、インビトロで細胞を増殖する方法。３２．クレイム１またはクレイム２いずれかの細胞培養培地中に細胞を導入すること、該培地中で該細胞を培養することにより細胞増殖を生ぜしめることからなり、該細胞がＭＲＣ５、ＣａＣｏおよび３Ｔ３セルラインからなるグループから選択されることを特徴とする、インビトロで細胞を増殖する方法。３３．クレイム１またはクレイム２いずれかの培地中に細胞を導入すること、そして該培地中で細胞を培養することにより細胞増殖およびクローン成長をおこすことからなり、該細胞がＭＲＣ５、ＣａＣｏおよび３Ｔ３セルラインからなるグループから選択されることを特徴とする、インビトロで細胞誘導細胞のクローン成長を生ぜしめる方法。３４．クレイム１８の方法で製造された細胞。３５．クレイム３４の細胞からなる薬剤組成物。３６．細胞中で遺伝子を発現することができる核酸でクレイム３４のいずれかの細胞を形質転換することからなる、異種遺伝子を発現する組換え細胞を製造する方法。３７．細胞を患者に注入すること、および遺伝子を発現せしめること、かならるクレイム３６の細胞を使用する方法。３８．細胞を患者に注入すること、かならるクレイム３４の細胞を使用する方法。３９．クレイム１８の肝細胞を患者に導入すること、からなる肝細胞移植方法。４０．クレイム３６の細胞を培養すること、遺伝子生成物を回収することからなる、遺伝子生成物の製造方法。４１．クレイム３４のいずれかの細胞に薬剤を導入すること、および該薬剤の効果を検定することからなる、薬剤試験方法。４２．アルギニンおよび鉄キレート化トランスフェリンからなる肝細胞培養培地。４３．クレイム１またはクレイム２いずれかの細胞培養培地中で肝細胞を培養することからなる、分化肝細胞を維持する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳類肝細胞の維持、分化、および長期成長のための、化学的に明確にされたＨＢＭ培養培地であって、（ａ）哺乳類細胞培養のために設計された合成保存基礎培地；および（ｂ）肝細胞成長促進量の、ニコチンアミド、アミノ酸、トランスフェリン、ホルモン、デキサメタゾン、微量金属、およびＤ−グルコースおよびＤ−ガラクトースからなる群から選択される単純炭水化物から選択される成分およびそれらの組み合わせを含むＨＢＭ培養培地。２．さらに緩衝剤を含む請求項１に記載のＨＢＭ培養培地。３．緩衝剤がＨＥＰＥＳである請求項２に記載のＨＢＭ培養培地。４．さらに抗生物質を含む請求項２に記載のＨＢＭ培養培地。５．抗生物質がペニシリンおよびストレプトマイシンならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項４に記載のＨＢＭ培養培地。６．さらにアルブミンを含む請求項４に記載のＨＢＭ培養培地。７．アルブミンがウシ血清アルブミン、ヒトアルブミン、ラットアルブミン、ブタアルブミン、およびウマアルブミンからなる群から選択される請求項６に記載のＨＢＭ培養培地。８．合成保存基礎培地がＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ウィリアムズ・メディアＥ、ＢＭＥ、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、メディア１９９、Ｆ−１２（ハム（Ｈａｍ））ニュートリエント・ミクスチャー（Nutrient Mixture）、Ｆ−１０（ハム（Ｈａｍ））ニュートリエント・ミクスチャー、およびＲＰＭＩメディア１６４０からなる群から選択される請求項１に記載のＨＢＭ培養培地。９．アミノ酸がＬ−グルタミン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−プロリン、およびＬ−アルギニンならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項１に記載のＨＢＭ培養培地。１０．微量金属は亜鉛、マンガン、銅、およびセレンを含む請求項１に記載のＨＢＭ培養培地。１１．微量金属はさらに、ＺｎＣｌ₂、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、ＭｎＳＯ₄、ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、およびＮａＳｅＳＯ₄を含む請求項１に記載のＨＢＭ培養培地。１２．トランスフェリンが、鉄で３０％飽和されたホロートランスフェリンおよびグルコン酸第一鉄と組み合わせたアポートランスフェリンからなる群から選択される請求項１に記載のＨＢＭ培養培地。１３．ホルモンがインスリンおよびデキサメタゾンを含む請求項１に記載のＨＢＭ培養培地。１４．合成基礎培地がＤＭＥＭである請求項１に記載の培地。１５．ＤＭＥＭが約０．１〜５．０ｇ／Ｌ、好ましくは約２．０ｇ／ＬのＤ−グルコースを含む請求項１４に記載の培地。１６．肝細胞成長促進量の成長因子をさらに含む請求項１に記載のＨＢＭ培養培地。１７．成長因子がＨＧＦ／ＳＦ、ＥＧＦ、およびＴＧＦαからなる群から選択される請求項１６に記載のＨＢＭ培養培地。１８．肝細胞成長促進量の成長因子をさらに含む請求項６に記載のＨＢＭ培養培地。１９．成長因子がＨＧＦ／ＳＦ、ＥＧＦ、およびＴＧＦαからなる群から選択される請求項１８に記載のＨＢＭ培養培地。２０．表ＩおよびＩＩで記載されるようなＨＧＭの組成からなる哺乳類細胞培地であって、表Ｉの保存基礎培地は、Ｄ−グルコースの最終濃度が好ましくは約２．０ｇ／Ｌであり、Ｄ−ガラクトースの量が好ましくは約２．０ｇ／Ｌであるように、ブレンドＤＭＥＭを含む哺乳類細胞培養培地。２１．表ＩＩＩに列挙された成分をさらに含む請求項２０に記載の培養培地。２２．肝細胞成長促進量の成長因子をさらに含む請求項２０に記載の培養培地。２３．成長因子がＨＧＦ／ＳＦ、ＥＧＦ、およびＴＧＦαからなる群から選択される請求項２２に記載の培養培地。２４．肝細胞成長促進量の成長因子をさらに含む請求項２１に記載の培養培地。２５．成長因子がＨＧＦ／ＳＦ、ＥＧＦ、およびＴＧＦαからなる群から選択される請求項２４に記載の培養培地。