JP2000512135A - エクジソン受容体リガンドの選別方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、エクジソン受容体リガンドをスクリーニングする方法に関する。エクジソン受容体を含む形質転換酵母細胞抽出物およびエクジソン受容体結合パートナーがエクジソン受容体リガンドを同定確認するために用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】 エクジソン受容体リガンドの選別方法発明の分野 本発明は殺虫剤または殺虫剤の開発に至る化合物として有用なエクジソン受容 体(ecdysone receptor;EcR)に結合する化合物の同定確認に関する。本発明はこ の様な化合物の同定確認方法および組成物を提供する。発明の背景 ショウジョウバエ(Drosophila)に於いては、完全変態には幼生段階の最後でス テロイド脱皮ホルモンである20-ヒドロキシエクジソン(20-hydroxyecdysone)を 必要とする(Richards，Biol．Rev.，56:501，1981)。エクジソン作用の分子機構 は、多糸染色体パフ(polytene chromosome puffing)に及ぼす作用の初期の観察 以降、詳細に研究されて来た(Ashburnerら、Cold Spring Harbor Symp．Quant． Biol.，38:655，1974)。ショウジョウバエのエクジソン受容体(EcR)遺伝子のク ローニングは、リガンドが活性化した転写因子のステロイド／甲状腺／網膜様受 容体の上科(superfamily)の一員であることを明らかにした(Koelleら、Cell，67 ：59，1991)。しかしながら、エストロゲン、アンドロゲンまたはプロゲステロ ン受容体の様な他の従来のステロイドホルモン受容体とは異なって、EcRのDNA- 結合および標的遺伝子の活性化には、そのヘテロ二量体パートナーであって、脊 椎動物の網膜様X受容体、および特異的リガンドの昆虫における同族体である上 気門(ultraspiracle)蛋白質(Usp)またはCF1の存在を要する(Oraら、Nature，347 :298，1990;Sheaら、Genes Dev.,4:1128，1990；Yaoら、Nature，366:476，1993 )。この観察はUspがEcR機能の必須成分であることを示唆するが、これらのヘテ ロ二量体複合体に依る標的遺伝子の活性化に先立つ明確なシグナルの発現は未知 である。 本発明者らは、異種組織細胞中で発現したEcRへのリガンド結合が、Uspと同一 種細胞中での共発現（co-expression）を要することを見出した。この発見前に は、EcRリガンドを同定確認する異種組織のEcR発現システムの 使用は不可能であった。本発明はEcR-Usp複合体に結合する物質を同定確認する さまざまな試験化合物を選別する方法を提供する。 昆虫の発生に於けるEcRおよびEcR-Usp複合体の決定的な役割は、昆虫の成長制 御因子(IGRs)として作用する環境的に安全な化合物の標的としてのEcRである(Gr af，Parasitology Today，9:471，1993)。エクジソン自体をこの様な用途に用い ることが提案されていたが、製造が非常に複雑で費用がかかり過ぎる。更に、昆 虫はエクジソンを異化する酵素系を有している(Kerkutら編Comprehensive Insec t Physiology，Biochemistry，and Pharmacology：Endocrinology I、7，363，1 985)。従って、より低価格で生産され、昆虫に依って代謝されない化合物を同定 確認するのは利点があると考えられる。この様な化合物の一つRH5849(Rohm & Ha ss)はエクジソン様活性を有する非ステロイド化合物であるが、この化合物は20- ヒドロキシエクジソンに比して、生物学的検定では少なくとも1/100の活性であ り、結合検定では少なくとも1/30の活性である為に、殺虫剤としての適用は限ら れている(Wing、Science 241：467，1988)。 従って、EcRに結合して、エクジソンの作用を模する、単位時間内の高い処理 方法を含む化合物の同定確認に有用な組成物および方法の技術が必要とされてい る。発明の概要 本発明はエクジソン受容体(EcR)リガンドを同定確認する方法を含む。この方 法は以下に依って実施される： （i）酵母の形質転換体から得られた、以下の組成を有する抽出物を提供する。 （a）EcRまたはその機能的誘導体 （b）EcRと結合するパートナーまたはその機能的誘導体 （ii）試験化合物の有無双方で、標準EcRリガンドの抽出物との特異的結合を測 定する。 （iii）標準EcRリガンドの抽出物への特異的結合を減じる試験化合物をEcRリガ ンドとして同定確認する。 標準EcRリガンドとは、EcRおよび／または転写的に活性化するエクジソンの規 制する遺伝子に、高い親和性および特異性で結合する化合物である。試験化合物 とはEcRに結合する能力と、エクジソンの作用を模する能力で評価される化合物 である。好ましくは、EcRに結合するパートナーはUspである。標準EcRリガンド との結合能を保持する機能性複合体を形成出来る限り、EcRおよびUsp双方の誘導 体を用い得る。 本発明の実施態様の一つでは、EcRを含む抽出物とEcRに結合するパートナーを 放射能標識した標準EcRリガンドに接触させ、無標識の試験化合物は、酵母抽出 物と特異的結合する放射活性量を減じる為に用いられる。本発明の方法は単位時 間内の処理量の高い状態で用いられ、試験化合物の多重度の選択を単一の検定で 可能にするのが好ましい。図面の簡単な説明 図１AはDrosophila melanogasterのエクジソン受容体（EcR）および上気門蛋 白質（Usp）を発現するS．cerevisiaeから得た抽出物の免疫ブロット分析の写真 である。EcR(yE)、Usp（yU）またはその双方（yE/yU）を発現する酵母株から調 製した酵母抽出物（50μｇ蛋白質）を、10%ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリ ルアミドケル電気泳動(SDS-PAGE)で分解した。蛋白質をニトロセルロース膜上に 移し、Uspに対するモノクローナル抗体（AB11）で精査した。矢印はUspを発現し た酵母の分子の大きさを示す。 図１BはDrosophila melanogasterのエクジソン受容体（EcR）および上気門蛋 白質（Usp）を発現するS．cerevisiaeから得た抽出物の免疫ブロットの写真であ る。EcR(yE)、Usp（yU）またはその双方（yE/yU）を発現する酵母株から調製し た酵母抽出物（50μｇ蛋白質）を、10%SDS-PAGEで分解した。蛋白質をニトロセ ルロース膜上に移し、EcRに対するモノクローナル抗体（AD4.4）で精査した。矢 印はEcRを発現した酵母の分子の大きさを示す。 図２はEcRだけ、Uspだけ、EcRおよびUsp(EcR/Usp)、並びにEcRおよび網膜様X 受容体（EcR/RXR）を発現する酵母株から得た抽出物に対する³H-Ponasterone A の特異的結合の図式である。EcRおよびUspのみ（EcR+Usp）を発現する酵母から 得た抽出混合物に就いても検定を行った。 図３AはEcRとUspを共に発現する酵母株から得た抽出物に対する³H-Ponasteron e A結合の飽和分析の図式である。Tは総結合、Sは特異的結合、NSは非特異的結 合を表す。 図３BはEcRとUspを共に発現する酵母株から得た抽出物に対する³H-Ponasteron e A結合のスキャッタード プロットであり、K_dは1.8nMである。 図４は漸増量の無標識Ponasterone A(Pon．A)、Muristerone A(Mur．A)、エク ジソン、および化合物210,230(RH5949)の存在下における、EcRおよびUspを共に 発現する酵母株から得た抽出物に対する³H-Ponasterone A結合の図である。 図５はEcRおよびUspを共に発現する酵母株から得た抽出物に対する³H-Ponaste rone A結合に及ぼす種々な溶媒の効果の図である。 図６はEcRおよびUspを共に発現する酵母株から得た抽出物に対する³H-Ponaste rone A結合に及ぼす種々な発酵培地の効果を示す表である。 図７はEcRおよびUspを共に発現する酵母株から得た抽出物に対する³H-Ponaste rone A結合に及ぼす種々な試験化合物の効果を示す表である。発明の詳細な説明 本発明にはエクジソン受容体(EcR)に結合しかつ活性化するか或いはそのいず れかを行う化合物を特定するための方法および組成物が含まれる。本発明による 方法で特定される化合物は、in vivoでエクジソン及び他の標準EcRリガンドの作 用に類似するやり方でEcRと相互作用することが好ましい。本発明で用いたアゴ ニストも含む「標準EcRリガンド」は特異的にかつ高い親和力でEcRに結合するか 、昆虫のエクジソン調節性遺伝子の転写活性を高めるか或いは、その両作用を有 する化合物である。標準EcRリガンドは典型的なステロイド系主鎖構造をもつ分 子に限定されるものではない。理論上に拘束されなければ、本発明の方法により 特定された化合物が「昆虫成長調節物質(IGR)」として有用であり従って、殺虫 性を示すものであると考えてよい。 本件の発明者は、酵母細胞共発現性キイロショウジョウバエ由来EcR及び超気 門（ultraspiracle）タンパク質(Usp)がエクジソンまたはEcRリガ ンド結合特異的高親和性を示すことを発見した。この特性はEcRとUspとの機能的 複合体がin vivoで生成されたことを反映している。本発明によれば、酵母をEcR とUspをコードする発現言プラスミドで形質転換し、次にこの形質転換酵母を、 高レベルにEcRポリペプチドとUspポリペプチドとを発現するような条件下で定温 培養する。次いで、培養細胞を回収し、細胞質ゾル抽出液を調製する。最後に、 競争的結合測定法を行い、抽出液に対するEcRリガンドの結合力に関する試験化 合物の競争力を測定する。酵母抽出液への結合について公知のEcRに対する競争 力をもつ化合物を新規のEcRリガンドとして特定する。 EcRは878個のアミノ酸から成るポリペプチドであり、A/B（トランス活性化） ドメイン、C（DNA結合・二量体化・トランス活性化）ドメイン、D（核局在化） ドメイン、E（二量体化）ドメイン及び、機能未知のFドメインを含む核ステロイ ド受容体族に典型的な明白なドメイン構造をもっている(Koelleら、Cell 67:59 、1991年)。本件の実施にあたり、(i)EcRの結合相手と機能的複合体の形成と(ii )EcRリガンド結合が可能なEcRのすべての同族体または誘導体を利用できる。上 述の通り、EcR-EcR結合相手となる機能的化合物はエクジソンまたはEcRリガンド に対して特異的に高結合力を示すものである。有効なEcR誘導体は、野生型配列 に対して最低一個のアミノ酸が付加または欠失しているポリペプチドまたは、最 低一個のアミノ酸が、EcR-EcR結合相手となる機能的化合物の形成を妨げないか 或いはEcRリガンド結合について阻害しない異種アミノ酸に置換しているポリペ プチドを含む。EcR同族体または誘導体がEcR-EcR結合相手となる機能的化合物を 形成できるのは、本発明の方法を用いて確認できる。 本発明におけるEcR結合相手は、EcR（またはEcR同族体若しくは誘導体）とヘ テロ二量体を形成できるすべてのポリペプチドで、そのヘテロ二量体中のEcRが エクジソン及び他の標準EcRリガンドに対して特異的な高親和性の結合力を示す 能力を有するものなどである。それだけに限定されるものではないが、EcR結合 相手の実施例には、EcR、RXR-alpha及び、RXT同族体などがある。好ましい実施 例には、EcR結合相手としてUspまたは その同族体若しくは誘導体が含まれる。Uspは508個のアミノ酸から成るポリペプ チドで、分子量は55,252ドルトンである(Henrichら、Nuc.Acids.Res.18:4143，1 990;Sheaら、Genes Dev．4:1128，1990;Yaoら、Cell 71:63，1992;Oroら、Natur e 347:298，1990)。本発明の実施にあたって、それがEcR-EcR結合相手となる機 能的化合物の形成能を保持している限り、すべてのUsp誘導体が利用できる。有 効なUsp誘導体またはその他のEcR結合相手には、野生型配列中で最低一個のアミ ノ酸が付加若しくは欠失したポリペプチドまたは、最低一個のアミノ酸が、EcR- EcR結合相手となる機能的化合物の形成を妨げないか或いはEcRリガンド結合につ いて阻害しない異種アミノ酸に置換しているポリペプチドが含まれる。EcR-EcR 結合相手となる機能的化合物を形成できるEcR結合相手となる誘導体の結合力は 、本発明の方法を用いて確認できる。 本発明の実施にあたって、分子生物学、微生物学、組換えDNA及び、タンパク 質生化学における数多くの従来技術が利用できる。上記技術は公知であり、以下 の文献例で詳述されている。即ち、Sambrookら、1989版、Molecular Cloning:A laboratory Manual，第２版、ニューヨーク；DNA Cloning:A Practical Approac h，第Ｉ及びＩＩ巻、1985（D.N．Gloverら）；Oligonucleotide Synthesis，198 4，(M.L．Gaitら)；Transcription and Translation，1984(HamesとHiggins版) ；A Practical Guide to Molecular Cloning；叢書、Methods in Enzymology(Ac ademic Press，Inc.)；及び、Protein Purification:Priciples and Practice， 第２版(Springer-Verlag，N.Y.)。 本発明の実施にあたって、所望の組換えクローニングベクターを用いて、EcR 及びEcR結合相手をコードする酵母DNA配列中に導入することができる。上記ベク ターには、クローニング若しくは発現のための最低一個の複製系、ホストから選 択するための最低一個のマーカー例えば、原栄養性や抗生物質耐性及び、最低一 個の発現カセットを含む場合が少なくない。挿入配列は標準法を用いて合成する こともできるし、天然資源から単離することもできる。好ましいベクターとして はそれらのみに制限されるものではない が、YEp及びYI_pベクターが含まれる(Hillら、Yeast 2:163，1986)。それらのみ に制限されるものではないが、EcR発現及びEcRの結合相手を誘導するため上記ベ クター内に存在し得る酵母プロモーターの例としては、メタロチオネイン・プロ モーター(CUP1)、トリオースリン酸デヒドロゲナーゼ・プロモーター(TDH3)，３ −フォスフォグリセレートキナーゼ・プロモーター、グリセルアルデヒド−３− リン酸脱水素酵素(GAPDH)プロモーター、ガラクトキナーゼ(GALI)プロモーター 、ガラクトエピメラーゼ・プロモーター及び、アルコール脱水素酵素(ADH)・プ ロモーターなどが含まれる。 ホスト酵母細胞はそれらに限定されるものではないが、リン酸カルシウム、リ チウム塩、エレクトロポレーション及び、スフェロプラスト形成を利用する方法 などの適当な方法によって形質転換できる(Shermanら、Methods in Yeast Genet ics，Cold Spring Harbor Laboratory，1982)。適するホスト細胞にはそれらに 限定されるものではないが、Saccharomyces cerevsiae（サッカロミセスセレビ シエ）及びSchizo saccharomyces pombeなどがある。エクジソンまたはエクジソ ン関連リガンドとの特異的高結合力の測定が可能なホスト細胞は、本発明を実施 する上で使用される。ホスト細胞は、公知の遺伝的方法または薬理学的方法を用 いて例えばリン酸化などの様に(Baiら、Vitamins Horm．51:289;1995)、異種類 のタンパク質の共有結合修飾能力についての修飾または操作を行うことも可能で ある。 本発明の実施にあたって、(i)EcRまたはEcR誘導体及び(ii)EcR結合相手または その誘導体を共発現する酵母細胞は、EcR及びEcR結合相手が高レベルで発現する 条件下で成育させる。細胞は回収後、抽出液にEcR源及びEcR結合の相手が含まれ る様に調製する。この抽出液はEcRリガンド結合測定用のEcR及びEcR結合相手源 として用いる。酵母抽出液の調製方法は当業者には公知であり、それらに限定さ れるものではないが以下の方法が含まれる。即ち、界面活性剤を添加してもよい が、ガラスビーズによる無傷の細胞を強撹拌法、機械的溶菌または低張性溶菌後 のスフェロプラスト形成法、音波処理法、抗底圧測定器法その他である。唯一の 不可欠条件は、EcR及びEcR結合相手が機能的複合体を形成する能力が抽出液中に 保持さ れることである。プロテアーゼ阻害剤反応混液（例えばPMSF,ロイペプチン、キ モスタチン、ペプスタチンを含有する）は溶菌緩衝液中に含まれるのが好ましい 。抽出液中のEcR及びEcR結合相手の最小有効濃度は、特異的結合測定法により決 定される（後段参照）。 本発明の実施にあたって、試験化合物が抽出液中に存在するEcR-EcR結合相手 ・複合体と特異的に結合する力を測定するための測定法はいかなる方法も利用可 能である。上記の代表的測定法は、標準EcRリガンドの結合力に対する試験化合 物の競合力を測定するものである。標準EcRリガンドを標識して、EcR-EcR結合相 手・複合物に関連する標識量を低減させる試験化合物の能力を測定するものが好 ましい。それらの例に限定されるものではないが、標準EcRリガンドに対する有 効標識としては、³H−ポナステロンA，¹²⁵I−ポナステロンA，³H−20−ヒドロキ シエクジソン、³H−ムリステロンA及び、³H−RH5849（Wing，Science 241:467， 1988）などがある。EcRに対する高結合力及び、トリチウム化されて特異的活性 が高いため、³H−ポナステロン^Aが望ましい(Yundら、Proc．Natl.Acad.Sci.USA 17 :6039，1978)。 代表的測定では、10mMトリス塩酸、pH8.0、0.1mM EDTA，２mMジチオトレイト ール、10%グリセロールが好ましいが、相溶性緩衝液に、(i)酵母 及び、(ii)標識EcRリガンド25nM，好ましくは10nM(トリチウム標識の場合、その 比活性が約20-500Ci/mmol、好ましくは150-250Ci/mmol)を各々 標識EcRリガンド（例えばポナステロンAまたはムリステロンAなど）の存在下で 行われる。試験資料は、EcR結合について標識リガンドに対するその競争力につ いて測定される試験化合物を含む。負の制御用の資料は、等量の試験資料溶媒の みが混合されたものである。 リガンド結合が平衡に達するのに適した時間・温度条件下（例えば室温で1hr または4Cで12-24hrなど）で定温培養した後、EcR-EcR結合相手・複合体は遊離状 の標識リガンドから物理的に分離し、複合体に結合した標識 量を定量する。それらに限定されるものではないが、分離方法として、ヒドロキ シアパタイト・クロマトグラフィー、ガラス繊維濾紙、デクストラン被覆の木炭 への吸収その他、当業者に公知の方法から、適切なあらゆる方法が利用できる。 液体シンチレーション計数法、ガンマ線計数法（適当な場合）その他の適した方 法を含む公知の方法を用いて放射能を計測することができる。比結合力は、結合 した放射能全量対非特異的結合（即ち、過剰の非標識リガンドの存在下で観測さ れた結合力）として定義される。上記の方法を用いてEcRリガンドとして特定さ れる化合物は、最低約50%（好ましくは最低約60%、更に好ましくは最低約75%） の比結合力低下をもたらすものである。 本発明の方法の実施にあたっては、種々様々な化合物の同時測定が可能になる 様、高処理量スクリーニング方式によるのが好ましい。上記化合物は例えば、天 然物ライブラリー、発酵ライブラリー(植物及び微生物を包含する)、連合ライブ ラリー、化合物目録及び、合成化合物ライブラリーの中から見つけ出せる。例え ば、合成化合物ライブラリーはMaybridge Chemical社（イギリス、Cornwall，Tr evilet)，Comgenex(ニュージャージー州、プリンストン）、Brandon Associates (ニューハンプシャー州、メリマック）、Microsource（コネティカット州、ニュ ーミルフォード）から購入できる。希少種化合物ライブラリーはAldrich Chemic al Company社（ウィスコンシン州、ミルウォーキー）から購入できる。これらの 代わりに、細菌、真菌類、植物及び、動物からの抽出物としての天然化合物ライ ブラリーは例えば、Pan Laboratories Company社（ワシントン州、Bothell）ま たはMycoSearch（NC）から購入可能であるし、容易に調製可能でもある。更に、 天然物ライブラリー及び合成化合物ライブラリー並びに各種化合物は、公知の化 学的、物理的及び、生化学的方法(Blondelleら、TibTech 14:60;1996)によって 容易に修飾される。本件によるEcR結合力測定法は数多くの異種溶媒に適応させ 、従って数多くの資源に由来する化合物試験を実現できるという利点を有する。殺虫剤組成 本発明により特定されるEcRリガンド類は、脊椎動物または植物に何等影響を 与えることなく通常昆虫の発生過程に選択的な相互作用を及ぼす「昆虫成長調節 物」(IGR)を包含する。従って、上記化合物は環境にやさしいものと期待できる が故に殺虫剤の用途に最適であろうと考えられている。 本発明による方法を用いて特定されるEcRリガンド類の殺虫剤活性は、当業者 に公知の技術を用いて試験できる。例えば、特定された各化合物（下記参照）の 配合は昆虫幼生が適用されようとする植物に対し噴霧できる。適当な時間経過後 、植物の幼生による食害は緩和される。 殺虫剤としての使用に際しては、EcRリガンドを生物学的に不都合のない担体 中に配合する。適切な生物学的に不都合のない担体としてはそれらに限定される ものではないが、リン酸緩衝液塩類溶液、塩類溶液、脱イオン水などがある。好 ましい生物学的に不都合のない担体は生理的あるいは薬理学的に不都合のない担 体である。 殺虫剤組成物には殺虫有効量の活性物質が含まれる。殺虫有効量とは、動植物 に対する昆虫侵入を予防する効果をもたらしその結果として、動植物に対する既 存の昆虫侵入を改善させるか全快させるものである。この殺虫有効量は目標昆虫 、活性物質または、ホストにより異なる。殺虫有効量は、用量・頻度マトリック スを作成するとか、そのマトリックス中の各点に対する実験単位または被検者群 を比較するとかいった当業者に公知の実験法に基づいて決定できる。 農業用使用に際して、殺虫活性物質または殺虫活性組成物を、例えば乳化性濃 縮剤液(EC)，懸濁性濃縮剤(SC)、水分散性顆粒剤（WDG）などの単位剤形として 調製することが可能である。薬理的使用に際して、活性物質または活性構成物を 、例えば乳剤、軟膏剤、ローション剤、散剤、液剤、錠剤、カプセル剤、噴霧剤 その他などの単位剤形として調製することが可能である。殺虫性組成物を単位剤 形として調合する場合、単位剤形に殺虫有効量の活性物質を含有させるようにで きる。別法として、多剤形投与または多剤用量が活性物質の全用量的投与に用い られる場合は、単位剤形に 上記有効量より少ない量を含有させることができる。更に、単位剤形には各々最 低一種類の薬剤添加物、希釈剤、分解剤、離型剤、可塑剤、着色剤、賦形剤、吸 収強化剤、安定剤、殺菌剤などが含まれる。 本発明の殺虫剤及び殺虫組成物は動植物に対する昆虫侵入を予防したり処理し たりするのに有益である。予防には殺虫剤または殺虫組成物の予防的有効量を取 り入れている。予防的有効量とは侵入を予防するための有効量で、昆虫、殺虫剤 及び、ホストにより異なるものである。これらの量は当業者に公知の方法または 、前述の方法を用いた実験で決める。処理法には治療有効量の殺虫剤または殺虫 組成物が取り入れられている。治療有効量とは昆虫侵入を軽減するのに必要十分 な量である。この量も目標昆虫、殺虫剤及び、ホストにより異なり、上述のよう にして決定される。 予防的有効量または治療的有効量あるいは、その両方は、単回投与または反復 投与の形で与えることができる。治療的投与は当初の昆虫侵入が消退したら、引 き続き予防的投与に移行できる。 殺虫剤及び殺虫組成物の使用は植物に対し、局所的にも非局所的（即ち全身体 的）にも可能である。局所的使用は植物に散布することが好ましい。全身的投与 には葉身投与または土壌投与をしてやがて植物根から吸収されるのが好ましい。好適態様の説明 以下の例は本件を説明するものであるが、決してそれらのみに限定するもので はない。 実施例１；EcR及びUspを共発現するサッカロミセスセレビシエ株の構築 Ａ．酵母発現プラスミドの構築 EcoNI及びBspEIの制限部位直後の14個のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオ チドを酵母発現ベクターYEpV5のAfIII及びKpnI制限部位中に挿入した(Makら、Re c.Prog.Horm.Res 49:347，1994；Salernoら、Nuc．Acids Res．24:566，1996)。 このリンカーにより酵母プロモーター、TDH3の制御下で融合タンパク質インフレ ームなウビキチン−エクジソン融合タンパク質性受容体の発現が可能となる(Mak ら、Gene 145:129，1994)。EcR遺伝 子（1.93kb）のＮ末端部分をEcoNI及びBglII消化分解によりpMK1（Koelleら、Ce ll 67:59，1991）プラスミドから切り出した。受容体コーディング配列の残部（ 700bp）をPCRにより増幅し、5'末端及び3'末端に各々、Bgl II及びBspE1をユニ ーク制限部位として含ませる。これら二つの受容体フラグメントを酵母ベクター YEpV5のEcoNI及びBspE1部位と連結する。生成したEcR発現ベクターYEpEcRを用い て酵母株BJ2168を形質転換してから、形質転換細胞をトリプトファン独立栄養法 により選択する。 Usp発現には、メタロチオネイン・プロモーター（CUP1）−ユビキチン遺伝子 （76個のアミノ酸）−リンカー（CYCIターミネーター直後のEag1及びDRAIII制限 部位を含む）から成るカセットを酵母ベクターYEp351のBamHI部位及びSphI部位 の間に挿入した(Salernoら、Nuc．Acids Res．24:566;1996)。USP遺伝子の全コ ーディング配列（1-52kb）をプラスミドpCF1（Christiansonら、Biochem．Bioph y．Res．Comm．193:1318，1993）を、各々5'及び3'末端処理に適用されるEagI及 びDraIIIのユニーク制限部位をもつ鋳型として利用するPCRにより増幅した。こ のPCRフラグメントをYEp351のEagI及びDraIIIの制限部位と連結した。こうして 得られたUsp発現プラスミドYEpcUSPを用いて酵母株BJ2168またはYEpEcRを形質転 換してから、二重形質転換酵母株をトリプトファン・ロイシン独立栄養法により 選択した。 Ｂ．酵母株の形質転換 酵母形質転換は公知の方法（Shermanら、Methods in Yeast Genetics:A Labor atory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1982）を用いて行った。ホス ト酵母株はサッカロミセスセレビシエ株BJ2168であり、この表現型はMAT alpha leu2 trp1 ura3-52 prb1-1122 pep4-3 prcl-407 gal2である。 EcR−コード化プラスミド及びUsp−コード化プラスミドで形質転換されたBJ21 68において、EcRは構成的に発現される。Usp発現を誘導するた ターを活性化した。 EcR及びレチノイドX受容体（RXRalpha）を共発現させるため、発現プラ スミドYEcEcRを用いてヒトRXRalpha受容体を発現する性酵母株を前述の方法で形 質転換した(Makら、Gene 145:129，1994;Salernoら、Nuc．Acids Res．24:566， 1996)。 Ｃ．EcR及びUspの発現特性の決定 EcR、USPあるいはECR及びUSPの双方を発現するプラスミドを担った形質転換酵 母を一晩、滴下合成培地で培養し、その細胞密度がログ後期（600nmでOD=1.0） にした。細胞を回収し、酵母抽出液を標準プロトコールに従って調製した(Hakら 、J.Biol．Chem．264:21613，1989)。タンパク質資料を10%SDS-PAGE・ニトロセ ルロース法による電気泳動に掛けて、EcR特異的モノクローナル抗体（Koelleら 、Cell 67:59，1991）またはUsp（Christiansonら、Biochem.Biophys.Res.Comm ．193:1318，1993）をプローブとして使った。 ブロットのプローブとして抗USPモノクローナル抗体AB11を用いた場合、Usp発 現プラスミド単独または、EcR及びUspの共発現プラスミドを担う酵母株から調製 した酵母抽出液においてUspタンパク質の予測分子量（55kDa）に対応する明瞭な 抗体反応によるバンドが検出された(図1A、レーン1及び3)。EcR発現プラスミド を担う酵母株から調製した酵母抽出液において、この55kDaポリペプチドは検出 されなかった(図1A、レーン2)。55kDaポリペプチドの下の幾つかの微弱バンドは 分解産物である可能性が強い。同時に、同実験から得られた別のブロットのプロ ーブとして抗EcRモノクローナル抗体AD4.4を使った。無傷のEcR（100kDa）相当 の免疫反応性ポリペプチドが検出されたのは、EcR発現プラスミドを担う酵母株 の場合のみで(図1B，レーン１、レーン２)、USP発現プラスミドのみを担う酵母 株では検出されなかった(図1B、レーン3)。以上の観察は、EcR及びUspが酵母細 胞で共発現され得ることを示している。上記組換えタンパク質の分子体積が確認 されたタンパク質の予測分子量と極めて良い相関を示すことから、予想どおりホ スト酵素により融合タンパク質が急速に分解されたことを物語っている。実施例２：酵母抽出液中のEcRリガンドの結合力 本発明に基づいて調製した酵母抽出液の結合力の特性を決定するために以下の 実験を行った。 Ａ．抽出液の調製 EcR、Usp、EcR＋Usp及び、EcR＋RxRを発現する酵母株を一晩培養した液を１リ ッターの選択培地に接種し、30℃で16時間培養した。Uspを発現する株の場合、 培養液に硫酸銅を最終濃度が100μＭになる様添加し、３０℃でさらに４時間培 養した。遠心分離器にかけて細胞を回収し、TEDG緩衝液（10mMトリス塩酸、pH8. 0、0.1mM ＨEDTA，２mMヂチオトレイトール、10%グリセロール）で２回洗浄した 。次に細胞ペレットを0.4M食塩を含むTEDG緩衝液中に懸濁し、ガラスビーズを使 って30秒で10回強烈撹拌した。こうして得られた均一溶液を1000ｘｇで10分間遠 心分離した後、上清液を１00,000ｘｇで30分間遠心分離した。最終上清液を回収 し、TEDG緩衝液で12.5mg/mlのタンパク質濃度となる様、希釈し、適量に別けて- 80℃で保存した。 Ｂ．結合力の測定 以下の成分を各反応液に添加した。 (i)40μｌ酵母抽出液（12.5mg/mlタンパク質） (ii)20μｌ ³H-ポナステロンA（New England Nuclear，195Ci/mmol;20μｌに100 ,000cpmを含有し、反応液の最終濃度は2.5nM） (iii)以下のプロテアーゼ阻害剤を含有する120μｌ TEDG緩衝液：0.15mg/mlのPH SF(SigmaChemical社）、0.04mg/mlのロイペプシン(Bachem)、0.03mg/mlのキモス タチン(Bachem)、0.01mg/mlのペプスタチン(Sigma)、 (iv)20μｌ試験資料、25μＭムリステロンA、または対照希釈液 反応液は室温で１時間または、4℃で最低12時間反応させた。タンパク質に結合 したまたは、結合していない放射能をヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィ ーまたは濾過法を使って分離し、個々の資料をシンチレーション液に懸濁し、放 射能をシンチレーション計数法により測定した。 Ｃ．結合力の特異性 図２は³H−ポナステロンAが種々の酵母に結合する時の特異性を示して いる。EcRまたはUspを個別に発現する酵母由来の抽出液の場合、いかなる特異的 結合力も観察されなかった。対照的に、２種の抽出液（EcR+Usp）を混合したと ころ、特異的結合力が出現した。EcR及びUspを共発現する酵母由来の抽出液（Ec R/Usp）または、EcR及びレチノイドＸ受容体（EcR/RxR）の場合、されに高い結 合活性が観察された。 Ｄ．飽和分析およびスカチャード分析 ホルモンがEcR-Usp複合体に対してもつ結合親和力及び結合特異性を決定する ため、EcR及びUspを共発現する酵母由来の抽出液を用いて飽和分析法及び競合実 験を行った。抽出液は³H−ポナステロンAと、非標識ポナステロンＡの非存在下 または、100倍過剰の非標識ポナステロンA分子の存在下で定温反応させ各々、全 結合力(T)及び非結合力(NS)を決定した。特異的結合力(S)は全結合力と非結合力 との間で差異を生じる。図3Aは特異的結合力が15-20nM ³H-ポナステロンＡのに おいて飽和に近付くことを示している。スカッチャード分析（図3B）は1.8nMの 総合力K_dを明示しており、この値はEcR発現性の天然昆虫細胞で観察される値に 近い(Cherbasら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2096，1988)。上記酵母抽出液の 結合部位数は85-120fmol/mgの範囲に収まるが、この範囲は昆虫細胞に比べ約10 倍高いものである。 Ｅ．結合力の特異性 ４種の公知（非標識）EcRリガンドが³H−ポナステロン結合力を駆逐する能力 を試験することにより、酵母抽出液に対するホルモンの結合力の特異性を測定し た。図4に示す通り、ポナステロンA及びムリステロンAは共に、各々2.0nM及び15 nMをIC₅₀とする卓越した競合物質である。20−ヒドロキシエクジソンはIC₅₀を0. 5μＭとする様な阻害を示す一方、非ステロイドロイド系EcRアゴニストであるRH 5849はこの能力が著しく小さい(IC₅₀=12μＭ)。 Ｆ．溶媒相溶性 結合力測定反応液中で各溶媒が様々な比率を占める反応条件の下で結合力測定 に及ぼす種々の溶媒の効果を測定した。図５に示す通り、DMSOは10% 濃度まで結合力に対し何等影響を及ぼさなかった。2.5%アセトンは何等影響を及 ぼさなかったものの、その濃度を更に上げてゆくにつれてホルモン結合力の減少 を引き起こした。アセトニトリル、エタノール及び、メタノールはより劇的な効 果を示した。それにも拘らず、少なくとも40-50%の結合力を上記溶媒の存在下で 維持した以上、これらは適当な溶媒を調整用に併用してやれば利用に耐えるもの である。 Ｇ．発酵培養液の相溶性 5、10、20μｌの各肉汁または培養液ブランクを反応液に添加する方法を使っ て発酵肉汁及び発酵培養液が結合力測定に及ぼす影響を試験した(図6)。試験し た11種の培養液試料のうち、２種（AA及びL-1）が実質的な活性低下を引き起こ し、適当な培養液調整物の使用を余儀なくした。残りの培養液試料は少なくとも 70%の結合活性を維持した。 細菌及び真類菌の発酵培養液の存在下で、公知EcRリガンドであるムリステロ ンAが³H−ポナステロン^Aを駆逐する能力を試験した。しかし、培養液による影響 は何等観察されなかった。 実施例３：EcR結合力のための試験化合物のスクリーニング 上記実施例２で述べた方法を用いて、一団の天然物のEcR結合活性を試験した( 図７)。生成物は1及び10μｇ/mlで試験した。92種の試験化合物のうち、１種（H 8によく示されている）が10μｇ/ml濃度で、62％の³H−ポナステロン結合活性を 示した。 6592種の試料を包含する化合物ライブラリーについても上記の方法でスクリー ニングを行った。各試料は10μｇ/mlレベルで存在した。少なくとも75%の標識化 合物を駆逐した化合物は陽性として区分けした。次に上記化合物を用いて前述の 方法で競台結合曲線を描かせた。２種の陽性化合物がRH5849（公知のEcRリガン ド）の誘導体であることが見い出された。用量反応曲線測定から８種の陽性化合 物のうち７種が競合結合曲線を描き従って、ホルモン結合部位に働いていること を示した。 上記の結果は本件の方法がEcRリガンドの特定用として高処理量方式で利用可 能であることを明瞭に示している。 上記の特許、特許出願、論文、出版物及び、試験方法は参照によりすべてここ に組み入れられる。 本発明に関わる数多くの変更様態は上記の説明に照らして、当業者には自ずと 知られるところであろう。こうした自明の変更様態は本発明の十分に意図された 範囲内にある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．エクジソン受容体（EcR）リガンドを同定確認する方法であって、 (i)(a)EcRまたはその機能的誘導体、及び (b)EcRと結合するパートナーまたはその機能的誘導体、 を含む、形質転換酵母細胞から得られた抽出物を提供する、 (ii)試験化合物の有無双方で、標準EcRリガンドの該抽出物との特異的結合を測 定する、 ことを含む、前記方法。 ２．(iii)抽出物に対する標準EcRリガンドの特異的結合を減じる試験化合物をEc Rリガンドとして同定確認することを更に含む、請求項１に記載の方法。 ３．エクジソン受容体(EcR)リガンドを同定確認する方法であって、 (i)(a)EcRまたはその機能的誘導体、 (b)EcRと結合するパートナーまたはその機能的誘導体、 を含む、形質転換酵母細胞から得られた抽出物を提供する、 (ii)試験化合物の有無双方で、標準EcRリガンドの該抽出物に対する特異的結合 を測定して、該抽出物に対する該標準EcRリガンドの特異的結合を減じる試験化 合物を同定確認する、 ことを含む、前記方法。 ４．酵母がS．cerevisiaeである、請求項１に記載の方法。 ５.標準EcRリガンドが20-ヒドロキシエクジソン、ポナステロン(ponasterone)、 ムリステロン(muristerone)およびRH5849から成る群から選ばれる、請求項１に 記載の方法。 ６．測定が競争的結合検定法を用いて達成される、請求項１に記載の方法。 ７．EcR結合パートナーがUspまたはその誘導体である、請求項６に記載の方法。