JP2000512143A

JP2000512143A - 組換え大腸菌からのヒト・インターロイキン１レセプター・拮抗薬の精製方法

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Publication number: JP2000512143A
Application number: JP10501109A
Authority: JP
Inventors: ザネツテ，デイノ; サルビ，エドアルド・ジヤコモ; ソフイエンテイーニ，アドルフオ
Original assignee: グルポ・レペチツト・エス・ピー・エイ
Priority date: 1996-06-07
Filing date: 1997-05-21
Publication date: 2000-09-19
Also published as: DE69730041T2; ES2221688T3; IL127155A0; CA2257294C; CA2257294A1; EP0938501B1; IL127155A; EP0938501A1; ATE272072T1; WO1997047650A1; DK0938501T3; DE69730041D1; AU2958697A; AU717003B2; PT938501E

Abstract

(57)【要約】組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株を発酵することによって得られる、ヒト・インターロイキン１レセプター・拮抗薬（ＩＬ−１ｒａ）の精製方法であって：ａ）精製されるべき混合液を、ｐＨ値６．２以下において緩衝化し、そして場合によっては、そのイオン強度を低い値に低下させた後、カチオン交換マトリックスに負荷し、そしてｐＨ値約７．５〜９．０と低イオン強度をもつバッファー水溶液を用いて該マトリックスを溶出すること；そしてｂ）所望のＩＬ−１ｒａを含有する、カチオン交換段階からの溶出液を、アニオン交換マトリックスに直接適用し、そして上記範囲７．５〜９．０のｐＨ値と増加されたイオン強度をもつバッファー水溶液を用いて溶出することを含む方法。

Description

【発明の詳細な説明】組換え大腸菌からのヒト・インターロイキン１レセプター・拮抗薬の精製方法本発明は、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の菌株を発酵することによって得られるヒト・インターロイキン１レセプター・拮抗薬（ＩＬ−１ｒａ）の新規な精製方法に関する。周知のように、インターロイキン１（ＩＬ−１）ファミリーのメンバーは、炎症および免疫応答の重要な仲介物質である。これらの中で、インターロイキン１ αおよびβ（ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β）は、ＩＬ−１レセプターには作動薬として働き、炎症および免疫応答に関する多くの細胞活性の剌激に関与している。ＩＬ−１ｒａ（ＩＬ−１ファミリーの第３メンバー）は、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βに類似し、Ｔ細胞上のＩＬ−１レセプターＩ型（ＩＬ−１ＲＩ型）（ Cannon J.H．et al.，J．Infect．Dis.，1990，161，79およびHannum C．H．et al.，Nature，1990，343，336、参照）および多形核白血球とＢ細胞上のＩＬ− １ＲＩＩ型（Granowitz E.V．et al.，J．Biol．Chem.，1991，266，14147およびDripps D.J．et al.，J．Biol．Chem.，1991，266、20311、参照）の両方に結合するタンパク質である。それにもかかわらず、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βとは異なり、ＩＬ−１ｒａは、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βタンパク質の該レセプターへの結合を阻止する純粋な拮抗薬として働き、それによって全ＩＬ−１系への適切な制御を提供する。病原体に対する免疫学的応答を仲介するのに極めて重要ではあるけれども、ＩＬ−１（すなわちＩＬ−１αおよびＩＬ−１β）の過剰産生は、ある場合には、望ましくない病原状態をもらすこともある。例えば、これは、敗血症性ショック、移植片対宿主疾患または自己免疫疾患、例えば類リウマチ関節炎、インシュリン依存型真性糖尿病、多発性硬化症およびある種の白血病の場合である。多くの著者らによって示されたように、該病原状態において、ＩＬ−１ｒａによるＩＬ−１活性の阻害が、治療効果をもつことができた（例えば、Dinarello C.A.，Adv．Pharmacol.，1994，25，p.21およびDowerK.S．et al.，Therap．Imm unol.，1994，1，p.113、参照）。しかしながら、十分な臨床成績を達成するためには、比較的高いタンパク質量が必要であると思われる（Fisher C.J．et al. ，JAMA，1994，271，1836）。さらなる研究では、多量のヒト・ＩＬ−１ｒａを提供することの明らかな難しさのために、組換えＩＬ−１ｒａタンパク質の生産が、強く要望されている。 Schreuder et al.，Eur．Jour．Biochem.，227，838-847，(1995)によって開示されているように、本発酵法にしたがって組換え大腸菌によって生産されるＩＬ−１ｒａタンパク質は、約１７．５ｋＤａのグリコシル化されてないタンパク質であり、天然に存在するグリコシル化されたタンパク質の１つ（分子量約２２ｋＤａ）と同様のＩＬ−１ＲＩ型に対する親和力をもっている。さらにまた、該組換えＩＬ−１ｒａが、イン・ビトロ（Eisenberg S.P．et al.，Nature，199 0，343，341;Arend W.P．et al.，J．Clin．Invest.，1990，85，1694およびMcI ntyre K.W. et al.，J．Exp．Med.，1991，173，931、参照）およびイン・ビボ（R ambaldi A．et al.，Blood，1990，76，114;Cominelli F．et al.，J．Clin．In vest.，1990，86，972およびAlexander H.R．et al.，J．Exp．Med.，1991，173 ，1029，参照）の両方で種々のＩＬ−１依存プロセスを阻害することが示された。組換えＩＬ−１ｒａの発現、およびその発酵ブロスからの精製は、Schreuder et al.，Eur．Jour．Biochem.，227，838-847(1995)によって開示されている。簡単に言えば、ＩＬ−１ｒａを生産する組換えエシェリヒア・コリ（Escherichi a coli）は、ヒトＩＬ−１ｒａ遺伝子（ＢＢＬ−ＢｒｉｔｉｓｈＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬａｂｓ）をＴＡＣ−Ｂｓｐベクター中に挿入することによって作成される、すなわち、ＢＢＬＩＬ−１ｒａベクターをＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を単離し、そしてこの断片を、制限部位を連結するため、およびフレーム内に遺伝子を置くために２つのリンカーオリゴヌクレオチドを付加して、ＢｓｐＭＩ／ＢａｍＨＩ消化されたＴＡＣ−Ｂｓｐベクター中に挿入することにより作成される。そうして得られた組換え大腸菌は、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有のＬｕｒｉａブロス中、３７℃で一夜増殖される；次いで、細菌細胞は、遠心によって回収され、そして使用まで−８０℃で保存される。次いで、前記文献で開示されている回収操作にしたがって、細菌細胞は音波処理によって溶菌され、遠心、清澄化されて細胞砕片が除去される。精製目的では、清澄懸濁液は、最初に、塩濃度勾配溶出を用いて疎水的相互作用マトリックス（Ｐｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔ−Ｆｌｏｗ，Ph armacia）を通過される；ＩＬ−１ｒａを含有する画分がプールされ、透析され、そしてアニオンマトリックス（ＦＰＬＣシステムをもつＭｏｎｏＱ、Pharmacia）を通過され、次いで、硫酸アンモニウムがＩＬ− １ｒａを含有する画分に添加され、それが、疎水的相互作用マトリックスを再度通過され、そして最後にゲル濾過によって精製される。他の精製操作によれば、また、清澄化された溶液に含有される組換えＩＬ−１ｒａタンパク質は、D.B．Carter et al.，Nature，344(1990)，pp．633-638に開示されるように、２種のアニオン交換マトリックスとサイズ排除クロマトグラフィーを用いるか、または、O.M.P．Singh et al.，Spec．Publ．-R．Soc．Chem． (1994)，158(Biotechnology 3の分冊)，pp．474-481に開示されるように、アニオン交換クロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを用いることによって精製されてもよい。ＩＬ−１ｒａタンパク質の精製が、カチオン交換マトリックスとアニオン交換マトリックスを用いる簡単な２段階精製法を用いることによって、容易に達成できることが、ここに見い出された。特に、最初の溶出は、負荷する混合液のｐＨに較べて、溶離液のｐＨを増大することによって達成される。最初のクロマトグラフィーカラムからのＩＬ−１ｒａタンパク質を含有する溶出液は、次に、ダイアフィルトレーションや透析のようないかなる中間処理もなしに、第２のクロマトグラフィーカラム上に直接負荷される；次いで、第２の溶出が、最初のクロマトグラフィー段階から溶出される混合液のイオン強度に較べて溶離液のイオン強度を増大することによって達成される。当業者には認識されるように、本精製法は、組換え大腸菌の発酵マスの処理後、上記の発酵法によって得られた清澄懸濁液に、慣用のクロマトグラフィーシステムを用いて適用することができる。しかしながら、好適な実施態様によれば、カチオン交換マトリックスにおける第１の精製段階は、好ましくは、いわゆる「膨張床吸着技術（ｅｘｐａｎｄｅｄｂｅｄａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」の条件下で遂行される。流動化に基づくこの技術は、特定のカラムとイオン交換体の使用によっており、それは、細胞砕片除去のための前処理、例えば濃縮および／または清澄化を必要とせずに、粗供給液をカラムに供給することができる。所望のタンパク質が、マトリックスに吸着されている間、細胞砕片は、妨げられずにカラムを通過し、次いで、廃棄される（非結合タンパク質とともに）。したがって、細胞破壊後に得られるホモジネートは、細胞砕片を除去するための前記先行技術文献に開示されるように、清澄化され、濾過される必要はなく、直接、第１のカチオン交換マトリックスに負荷されてもよい（Hjorth et al.，Bioseparation，5(4)，217- 223，1995、参照）。かくして、膨張床吸着技術と改良２段階クロマトグラフィー精製を結び付けることによって、組換え大腸菌からのＩＬ−１ｒａを精製するための新規の簡単な操作が提供される；さらなる利点としては、少ない操作数のために、本精製法は、また、ＩＬ−１ｒａ組換えタンパク質の工業生産へと容易にスケールアップできる。一般的操作としては、カチオン交換マトリックスが、最初に、ｐＨ６．２以下、好ましくは約５．０〜約６．２、特に好適にはｐＨ約６．０をもつ適切なバッファー水溶液（バッファーＡ）の添加によって膨潤される。例えば、ＭＥＳ（４ −モルホリンエタンスルホン酸）、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ（２−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−２−（ヒドロキシメチル） −１，３−プロパンジオール）もしくはクエン酸塩を含有するバッファー溶液が使用されてもよい。所望であれば、さらなる化合物、例えばＥＤＴＡ（エチレンジアミノ−テトラ酢酸）もしくはＰＭＳＦ（フッ化ベンゼンメタンスルホニル）のようなプロテアーゼ阻害剤が、バッファー溶液に添加されてもよい。適切なバッファー溶液は、例えば、２０ｍＭＭＥＳおよび１ｍＭＥＤＴＡを用いて調製される（ｐＨ約６．０）。次に、カラムは、慣用のクロマトグラフィー技術が適用される場合における清澄化された溶液か、または膨潤床吸着技術が適切される場合における細胞砕片を含有するホモジネートかいずれかの、精製されるべき混合液を負荷される。精製されるべき混合液は、上記範囲内のｐＨ値（６．２以下、好ましくは５．０〜６．２）をもつバッファーを含む溶液として負荷されるが、そのバッファー溶液は、好ましくは、マトリックスの膨潤に用いられたものである。また、バッファー溶液の添加は、精製されるべき混合液を希釈する結果となり、負荷する溶液の低イオン強度を達成することになる；必要であれば、負荷する混合液のイオン強度は、脱イオン水で希釈して、さらに低下されてもよい。溶出前に、カラムは、適切なバッファー、好ましくはマトリックスを膨潤させるために使用された同じバッファーＡにより洗浄される；好ましくは、バッファーＡによる洗浄後、カラムは、次に、水で洗浄されて、カラム内の望ましくないｐＨの勾配を最小化させる。次いで、ＩＬ−１ｒａタンパク質は、ｐＨ値約７．５〜約９．０、好ましくは約８．０をもつ、その他のバッファー水溶液（バッファーＢ）により溶出される。例えば、ＴＲＩＳ（２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）もしくはリン酸塩を含有するバッファー溶液が使用されてもよい。また、この場合、バッファーＡについてと同様に、適切な添加物がバッファー溶液に添加されてもよい。適切な緩衝溶液は、例えば、２５ｍＭＴＲＩＳおよび１ｍＭＥＤＴＡを含んで調製されてもよい（ｐＨ約８．０）。溶出液のモニターは、既知の技術、例えばＵＶ分析によって行われる。上記操作にしたがって、バッファーＢについて定められた上記範囲内のｐＨ値（すなわち、７．５〜９．０）と低イオン強度をもつであろう所望のＩＬ−１ｒａ含有溶出液は、アニオン交換樹脂に直接負荷することができる。かくして、所望のＩＬ−１ｒａタンパク質を含有する、カチオン交換カラムからの溶出液は、アニオン交換マトリックス上に直接負荷されるが、そのマトリックスは、適切なバッファー、好ましくは、カチオン交換マトリックスからＩＬ− １ｒａタンパク質を溶出するために使用された同じバッファーＢにより、予め平衡化されている。負荷されたマトリックスを、好ましくはバッファーＢにより洗浄後、次に、ＩＬ−１ｒａタンパク質が、バッファーＢと同じｐＨ（すなわち、約７．５〜９．０、好ましくは約８．０）をもつが、増加されたイオン強度（溶液の伝導率として測定される）をもつバッファー水溶液（バッファーＣ）により溶出される。一般的に言えるように、低イオン強度をもつバッファーＢ溶液は、一般に、伝導率３．０ｍＳ／ｃｍ²以下、好ましくは１．５ｍＳ／ｃｍ²以下、特に好ましくは伝導率約０．９〜１．０ｍＳ／ｃｍ²をもつであろう。また、上記のように、イオン交換マトリックス上に負荷される混合液のイオン強度は、低い値に維持されねばならない；かくして、また、上記伝導率の値は、これらの混合液についても望ましい。一方、増加された塩含量をもつバッファーＣ溶液は、一般に、伝導率９ｍＳ／ｃｍ²以上、好ましくは９〜１５ｍＳ／ｃｍ²、特に好ましくは伝導率約１０ｍＳ−ｃｍ²をもつであろう。技術上周知のように、バッファー溶液のイオン強度を増加するためには、バッファー作用のない塩、例えばＮａＣｌ，ＫＣｌなどが、それに添加される。バッファーＣのための緩衝剤および添加剤は、一般に、バッファーＢについて使用されるものと同じである。例えば、バッファーＣのための適切な溶液は、２５ｍＭＴＲＩＳ，１００ｍＭＮａＣｌおよび１ｍＭＥＤＴＡを用いて調製される（ｐＨ約８．０，伝導率約１０ｍＳ／ｃｍ²）。この場合にもまた、溶出液のモニターは、既知の技術、例えばＵＶ分析によって行われる。クロマトグラフィー精製の終了時に、得られる溶液は、次に、純ＩＬ−１ｒａ組換えタンパク質を回収するために、技術上周知のように処理される。例えば、純粋な生産物を回収するために適用できる典型的な操作は、また組み合わせにおいても、濃縮、濾過およびダイアフィルトレーションである。慣用のイオン交換クロマトグラフィーが使用される場合、第１のクロマトグラフィー段階に用いられる適切なカチオン交換体は、慣用のセルロース、デキストラン、アガロースもしくは架橋アガロース、合成有機ポリマー、被膜シリカマトリックスに、それぞれ基づくカチオン交換体であり、カルボキシメチル、スルホン酸、スルホエチルもしくはスルホプロピル基により機能化されている。好ましくは、架橋アガロースに基づくものか、または合成有機ポリマーに基づくカチオン交換体が用いられ、好ましくは、スルホン酸もしくはスルホプロピル基により機能化されている。入手できる市販のカチオン交換体の例は、セルロースに基づくＣＭ２３，ＣＭ３２およびＣＭ５２（Whatman）；デキストランに基づくＣＭ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５、ＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５，ＣＭ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−５０およびＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−５０（Pharmacia）；アガロースもしくは架橋アガロースに基づくＣＭＢｉｏ−ｇｅ１Ａ（Biorad）、ＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６ＢおよびＣＳ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ（Ph armacia）；合成有機ポリマーに基づくＭｏｎｏＳ（Pharmacia）、Ｓ−ＨｙｐｅｒＤ（Biosepra）、ＳＰ−５−ＰＷおよびＨＲＬＣＭＡ７Ｃ（Biorad）および被膜シリカマトリックスに基づく、例えばＣＭＳｉ３００およびＳＰＳｉ１００（Serva）である。好適なマトリックスは、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＭｏｎｏＳおよびＳ−ＨｙｐｅｒＤである。好適な実施態様によれば、「膨張床吸着技術」が、第１クロマトグラフィー段階に適用される場合は、特定のカラムおよびイオン交換体が用いられる。具体的には、カラムは、水圧で動かされる可動性のトップアダプターを備え、そして上部と底部にはネットを備えて、細胞砕片は通過させるがイオン交換体のビーズ粒子は通過させない。イオン交換マトリックスは、慣用技術において使用されるビーズに較べてより重く作られている特殊なビーズによって形成される。イオン交換マトリックスは、先に引用されたカチオン交換マトリックス、すなわち、カルボキシメチル、スルホン酸、スルホエチルもしくはスルホプロピル基により機能化されている、セルロース、デキストラン、アガロースもしくは架橋アガロース、合成有機ポリマーに、それぞれ基づくマトリックスである；該マトリックスは、ビーズに不活性材料、例えば石英を添加して、慣用のビーズに較べてより重く作られている。好ましくは、架橋アガロースに基づくカチオン交換体が用いられ、好ましくは、スルホン酸もしくはスルホプロピル基により機能化されている。例えば、修飾された架橋アガロースに基づくカチオン交換体を充填されたＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥカラム（Pharmacia）、例えばＳＰ−ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（修飾ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ，Pharmacia）が、都合よく使用することができる。第２のクロマトグラフィー段階に用いられる適切なアニオン交換体は、セルロース、デキストラン、アガロースもしくは架橋アガロース、合成有機ポリマーおよび被膜シリカマトリックスに、それぞれ基づくアニオン交換体であり、ジエチルアミノエチル、第４級アミノメチル、第４級アミノエチル、ジエチル−（２− ヒドロキシプロピル）アミノエチル、トリエチルアミノメチル、トリエチルアミノプロピルおよびポリエチレンイミン基により機能化されている。好ましくは、架橋アガロースに基づくものか、または合成有機ポリマーに基づくアニオン交換体が用いられ、好ましくは、第４級アミノメチル基により機能化されている。入手できる市販のアニオン交換体の例は、セルロースイオン交換体、例えばＤＥ２３，ＤＥ３２およびＤＥ５２（Whatman）；デキストランイオン交換体、例えばＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５、ＱＡＥ− ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５，ＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−５０およびＱＡＥ −ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−５０（Pharmacia）；アガロースもしくは架橋アガロース、例えばＤＥＡＥＢｉｏ−ｇｅ１Ａ（Biorad）、ＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６ＢおよびＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ（Pharmaci a）、合成有機ポリマー、例えばＭｏｎｏＱ（Pharmacia）、Ｑ−ＨｙｐｅｒＤ（Biosepra）、ＤＥＡＥ−５−ＰＷおよびＨＲＬＣＭＡ７Ｐ（Biorad）および被膜シリカマトリックス、例えばＤＥＡＥＳｉ５００およびＴＥＡＰＳｉ１００（Serva）である。好適なマトリックスは、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＭｏｎｏＱおよびＱ−ＨｙｐｅｒＤ；好ましくは、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅが、アニオン交換体として用いられる。次の実施例は、本発明の精製方法を、より詳細に具体的に説明する。バッファー溶液ｎ．ｅ．＝評価せず実施例１組換え大腸菌の発酵ＩＬ−１ｒａ発現のためのプラスミドを含有する組換え大腸菌Ｋ１２（ＡＢ１８９９）を、Schreuder et al.，Eur．Jour．Biochem.，227， 838-847，(1995)に記述されているように、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有のＬｕｒｉａブロスにおいて、３７℃で一夜、５０リッター容発酵槽中で増殖させる。実施例２細胞収穫発酵工程終了時、発酵ブロス５０ｌを排出し、そして細胞を、負荷流速１２ｌ／ｈにおけるＴＺ２８ゾーナルローター（ＳＯＲＶＡＬＬ）をもつＲＣ−５Ｂ冷凍超遠心（ＳＯＲＶＡＬＬ）によって回収する。細胞ベースト約３５０ｇを回収し、少量づつ分割し、そして−８０℃で保存する。実施例３細胞洗浄と回収実施例２からの細胞ペースト２５０ｇを融解する。その細胞ペーストをバッファーＡに懸濁する（約１５ｍｌ／細胞ペースト１ｇ）。この懸濁液を、細胞を破壊するために、流速約５ｌ／ｈで連続的にＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ装置（WAB AG，Ba sel）に通す。細胞の破壊を検鏡によって制御する。次いで、ホモジネートの容積を、バッファーＡを用いて約５６００ｍｌにして、伝導率を９００〜１０００ｍＳ／ｃｍ²に、そしてｐＨ値を約６．０にする。実施例４第１のイオン交換段階（膨張床原理） −クロマトグラフィーシステム：ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（Pharmacia）：ＳＰ −ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥカチオン交換体６００ｍｌを充填した５０ｘ１０００ｍｍＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥガラスカラム； −ＵＶ検出：ＵＶＩＣＯＲＤＳ１モニター＋工業セル（Pharmacia LKB）；レコーダーＲｅｃ１０２（Pharmacia）；λ＝２８０ｎｍ −流速：膨張、負荷４８００ｍｌ／ｈ洗浄、充填、溶出１１００ｍｌ／ｈこの第１段階は、膨張床吸着原理に基づいているので、実施例３により得られたホモジネートを清澄、濾過する必要がない。マトリックスを充填する場合、まず、それを、バッファーＡ（ｐＨ６．０）を用いてマトリックスの約２．５倍容量まで膨張させる。実施例３からのホモジネート（細胞砕片も含有している）を、直接、カラムの底部からイオン交換マトリックスに負荷する。カラムを、バッファーＡで徹底的に洗浄して、すべての砕片を除去し、次いで、水で洗浄してバッファーＡを除去する；最後に、カチオン交換マトリックスを、カラムのトップアダプターを水圧で押し下げることによって充填する。マトリックスを充填した後、ＩＬ−１ｒａを、バッファーＢを用い、流動方向を逆にして（すなわち、カラムの上部から底部へ）溶出する。この形式の溶出は、ＳＰ−ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥイオン交換体から得られる溶出液を、濃縮とダイアフィルトレーションする必要なしに、第２のイオン交換マトリックス上に直接負荷させることができる。実施例５第２のイオン交換段階 −クロマトグラフィーシステム：Ｂｉｏｐｉｌｏｔ（Pharmacia）：Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦアニオン交換体２００ｍｌを充填した５０ｘ３００ｍｍガラスカラム； −ＵＶ検出；λ＝２８０ｎｍにおいて −流速：平衡化、負荷、洗浄１０００ｍｌ／ｈ溶出２０００ｍｌ／ｈＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ含有カラムを、バッファーＢで平衡化する。ＳＰ−ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥから得られた溶出液を、この第２のマトリックス上に直接負荷する。次いで、マトリックスを、バッファーＢで洗浄する。吸着がベースラインに戻ったならば、ＩＬ−１ｒａをバッファーＣで溶出し、ＩＬ−１ｒａ組換えタンパク質を含有する溶出液約４００ｍｌを回収する。マトリックスに強固に結合している不純物を除去するために、最後に、カラムをバッファーＤで洗浄する。実施例６濃縮およびダイアフィルトレーション第２のクロマトグラフィーからの溶出液を、Ｓ１ＹＭ３メンブラン（ＡＭＩＣＯＮ）を用いて濃縮する。最初の溶出液の１０分の１量に減った後、濃縮液を、バッファーＥを用いてダイアフィルトレーションし、濾過された溶液のｐＨと伝導率をモニターする。精製工程の終了時、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（Pharmacia LKB−ＰＨＡＳＴＳＹＳＴＥＭ；ＰＨＡＳＴＧｅｌＳＤＳ−ＰＡＧＥ８〜２５％）によって測定した９５％以上の純度をもつＩＬ−１ｒａ組換えタンパク質約１．５ｇを回収する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成９年１２月１２日（１９９７．１２．１２）【補正内容】請求の範囲１．組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の菌株を発酵することによって得られる、ヒト・インターロイキン１レセプター・拮抗薬（ＩＬ−１ｒａ）の精製方法であって：ａ）精製されるべき混合液を、ｐＨ値６．２以下において緩衝化し、そして場合によっては、そのイオン強度を伝導率値３．０ｍＳ／ｃｍ²以下に低下させた後、カチオン交換マトリックスに負荷し、そしてｐＨ値約７．５〜９．０と、伝導率値が３．０ｍＳ／ｃｍ²以下になるようなイオン強度とをもつバッファー水溶液を用いて溶出すること；そしてｂ）この溶出液を、アニオン交換マトリックスに直接適用し、そしてｐＨ値約７．５〜９．０と、伝導率値が９ｍＳ／ｃｍ²以上になるようなイオン強度とをもつバッファー水溶液を用いて溶出すること、そしてｃ）その溶出液からＩＬ−１ｒａを回収することを含む方法。２．第１のクロマトグラフィー段階が、膨張床吸着技術にしたがって遂行され、ここで発酵マスから細胞の収穫、洗浄および破壊によって直接得られる、細胞砕片を含有するホモジネートを、続いて清澄化と濾過をすることなく、カチオン交換カラムに負荷することを含む請求の範囲１記載の方法。３．カチオン交換マトリックスが、最初に、ｐＨ値６．２以下をもつバッファー水溶液を用いて膨張される、請求の範囲１または２記載の方法。４．精製されるべき混合液を、カチオン交換マトリックスに適用した後、そしてそれを溶出する前に、該マトリックスが、先ず、その膨張に使用された同じバッファーにより、次に、場合によっては水により洗浄される、請求の範囲３記載の方法。５．カチオン交換マトリックスを膨張するためと、その洗浄のために使用されるバッファーのｐＨ、およびカチオン交換マトリックスに負荷される緩衝化された混合液のｐＨが、約５．０〜約６．２である、前記請求の範囲のいずれか１つに記載の方法。６．カチオン交換マトリックスを溶出するために使用されるバッファーのｐＨ、およびアニオン交換マトリックスを溶出するために使用されるバッファーのｐＨが、約８．０である、請求の範囲１、２または３記載の方法。７．カチオン交換マトリックスに負荷される混合液の伝導率、溶出バッファーの伝導率、およびアニオン交換マトリックスに負荷される溶液の伝導率が、１．５ｍＳ／ｃｍ²以下である、前記請求の範囲のいずれか１つに記載の方法。８．該伝導率が、約０．９〜１．０ｍＳ／ｃｍ²である、前記請求の範囲のいずれか１つに記載の方法。９．アニオン交換マトリックスを溶出するために使用されるバッファーの伝導率が、９．０〜１５．０ｍＳ／ｃｍ²である、前記請求の範囲のいずれか１つに記載の方法。１０．該バッファーの伝導率が約１０．０ｍＳ／ｃｍ²である、請求の範囲９記載の方法。１１．カチオン交換マトリックスを膨張するためのバッファー溶液、精製されるべき混合液を緩衝化するためのバッファー溶液、および溶出前にカチオン交換マトリックスを洗浄するためのバッファー溶液が、２０ｍＭＭＥＳと１ｍＭＥＤＴＡを含有する、前記請求の範囲のいずれか１つに記載の方法。【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年９月１４日（１９９８．９．１４）【補正内容】請求の範囲１．組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の菌株を発酵することによって得られる、ヒト・インターロイキン１レセプター・拮抗薬（ＩＬ−１ｒａ）の精製方法であって：ａ）精製されるべき混合液を、ｐＨ値６．２以下において緩衝化し、そして場合によっては、そのイオン強度を伝導率値３．０ｍＳ／ｃｍ²以下に低下させた後、カチオン交換マトリックスに負荷し、そしてｐＨ値約７．５〜９．０と、伝導率値が３．０ｍＳ／ｃｍ²以下になるようなイオン強度とをもつバッファー水溶液を用いて溶出すること；そしてｂ）この溶出液を、アニオン交換マトリックスに直接適用し、そしてｐＨ値約７．５〜９．０と、伝導率値が９ｍＳ／ｃｍ²以上になるようなイオン強度とをもつバッファー水溶液を用いて溶出すること、そしてｃ）その溶出液からＩＬ−１ｒａを回収することを含む方法。２．第１のクロマトグラフィー段階が、膨張床吸着技術にしたがって遂行され、ここで発酵マスから細胞の収穫、洗浄および破壊によって直接得られる、細胞砕片を含有するホモジネートを、続いて清澄化と濾過をすることなく、カチオン交換カラムに負荷することを含む請求の範囲１記載の方法。３．カチオン交換マトリックスが、最初に、ｐＨ値６．２以下をもつバッファー水溶液を用いて膨張される、請求の範囲１または２記載の方法。４．精製されるべき混合液を、カチオン交換マトリックスに適用した後、そしてそれを溶出する前に、該マトリックスが、先ず、その膨張に使用された同じバッファーにより、次に、場合によっては水により洗浄される、請求の範囲３記載の方法。

Claims

【特許請求の範囲】１．組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の菌株を発酵することによって得られる、ヒト・インターロイキン１レセプター・拮抗薬（ＩＬ−１ｒａ）の精製方法であって：ａ）精製されるべき混合液を、ｐＨ値６．２以下において緩衝化し、そして場合によっては、そのイオン強度を伝導率値３．０ｍＳ／ｃｍ²以下に低下させた後、カチオン交換マトリックスに負荷し、そしてｐＨ値約７．５〜９．０と、伝導率値が３．０ｍＳ／ｃｍ²以下になるようなイオン強度とをもつバッファー水溶液を用いて溶出すること；そしてｂ）この溶出液を、アニオン交換マトリックスに直接適用し、そしてｐＨ値約７．５〜９．０と、伝導率値が９ｍＳ／ｃｍ²以上になるようなイオン強度とをもつバッファー水溶液を用いて溶出すること、を含む方法。２．第１のクロマトグラフィー段階が、膨張床吸着技術にしたがって遂行され、ここで発酵マスから細胞の収穫、洗浄および破壊によって直接得られる、細胞砕片を含有するホモジネートを、続いて清澄化と濾過をすることなく、カチオン交換カラムに負荷することを含む請求の範囲１記載の方法。３．カチオン交換マトリックスが、最初に、ｐＨ値６．２以下をもつバッファー水溶液を用いて膨張される、請求の範囲１または２記載の方法。４．精製されるべき混合液を、カチオン交換マトリックスに適用した後、そしてそれを溶出する前に、該マトリックスが、先ず、その膨張に使用された同じバッファーにより、次に、場合によっては水により洗浄される、請求の範囲３記載の方法。５．カチオン交換マトリックスを膨張するためと、その洗浄のために使用されるバッファーのｐＨ、およびカチオン交換マトリックスに負荷される緩衝化された混合液のｐＨが、約５．０〜約６．２である、前記請求の範囲のいずれか１つに記載の方法。６．カチオン交換マトリックスを溶出するために使用されるバッファーのｐＨ、およびアニオン交換マトリックスを溶出するために使用されるバッファーのｐＨが、約８．０である、請求の範囲１、２または３記載の方法。７．カチオン交換マトリックスに負荷される混合液の伝導率、溶出バッファーの伝導率、およびアニオン交換マトリックスに負荷される溶液の伝導率が、１．５ｍＳ／ｃｍ²以下である、前記請求の範囲のいずれか１つに記載の方法。８．該伝導率が、約０．９〜１．０ｍＳ／ｃｍ²である、前記請求の範囲のいずれか１つに記載の方法。９．アニオン交換マトリックスを溶出するために使用されるバッファーの伝導率が、９．０および１５．０ｍＳ／ｃｍ²である、前記請求の範囲のいずれか１つに記載の方法。１０．該バッファーの伝導率が約１０．０ｍＳ／ｃｍ²である、請求の範囲９記載の方法。１１．カチオン交換マトリックスを膨張するためのバッファー溶液、精製されるべき混合液を緩衝化するためのバッファー溶液、および溶出前にカチオン交換マトリックスを洗浄するためのバッファー溶液が、２０ｍＭＭＥＳと１ｍＭＥＤＴＡを含有する、前記請求の範囲のいずれか１つに記載の方法。１２．カチオンマトリックスから溶出するためのバッファー溶液が、２５ｍＭＴＲＩＳと１ｍＭＥＤＴＡを含有する、前記請求の範囲のいずれか１つに記載の方法。１３．アニオンマトリックスから溶出するためのバッファー溶液が、２５ｍＭＴＲＩＳ、１００ｍＭＮａＣｌおよび１ｍＭＥＤＴＡを含有する、前記請求の範囲のいずれか１つに記載の方法。１４．カチオン交換マトリックスが、セルロース、デキストラン、アガロースもしくは架橋アガロース、合成有機ポリマーおよび被膜シリカマトリックスに、それぞれ基づくカチオン交換体から選ばれ、場合によっては、それが、カルボキシメチル、スルホン酸、スルホエチルもしくはスルホプロピル基により機能化されている、前記請求の範囲のいずれか１つに記載の方法。１５．第１のクロマトグラフィー段階に使用されるカチオン交換マトリックスが、架橋アガロースに基づくか、または合成有機ポリマーに基づくカチオン交換体であり、それが、スルホン酸もしくはスルホプロピル基により機能化されている、前記請求の範囲のいずれか１つに記載の方法。１６．第２のクロマトグラフィー段階に使用されるアニオン交換体が、セルロース、デキストラン、アガロースもしくは架橋アガロース、合成有機ポリマーおよび被膜シリカマトリックスに、それぞれ基づくアニオン交換体から選ばれ、それが、ジエチルアミノエチル、第４級アミノメチル、第４級アミノエチル、ジエチル−（２−ヒドロキシ−プロピル）アミノエチル、トリエチルアミノメチル、トリエチルアミノプロピルもしくはポリエチレンイミン基により機能化されている、前記請求の範囲のいずれか１つに記載の方法。１７．第２のクロマトグラフィー段階に使用されるアニオン交換体が、架橋アガロースに基づくか、または合成有機ポリマーに基づくアニオン交換体であり、それが、第４級アミノメチル基により機能化されている、前記請求の範囲のいずれか１つに記載の方法。