JP2000512156A - 制御された側芽条形成性および／または離層形成性を有する植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、側芽条形成および／または花弁形成および／または離層形成の制御に寄与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびまたこのヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドおよびフミノ酸配列に関する。本発明はまた、制御された側芽条形成性および／または花弁形成性および／または離層形成性が制御された植物に関し、この植物では、側芽条形成および／または花弁形成および／または離層形成の制御に寄与する発現性ＤＮＡ配列、またはその断片もしくは誘導体が、安定に、植物細胞または植物組織のゲノム中に組込まれている。さらにまた、本発明は、側芽条形成性および／または花弁形成性および／または離層形成性が制御された植物の作製方法に関し、この方法は、側芽条形成および／または花弁形成および／または制御された離層形成の制御に寄与する発現性ＤＮＡ配列、またはその断片もしくは誘導体を、安定に、植物細胞または植物組織のゲノム中に組込み、次いでこのようにして得られた植物細胞または植物組織を再生させ、植物体を形成する方法である。本発明はまた、本発明の方法により得ることができる植物および植物種子に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 制御された側芽条形成性および／または離層形成性を有する植物 本発明は、側芽条（ｓｉｄｅ−ｓｈｏｏｔ）形成および／または花弁形成およ び／または離層形成の制御に寄与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配 列に関し、およびまたこのヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドお よびアミノ酸配列に関する。さらにまた、本発明は、側芽条形成性および／また は花弁形成性および／または離層形成性が制御された植物に関し、この植物では 、側芽条形成および／または花弁形成および／または離層形成の制御に寄与する 発現性ＤＮＡ配列あるいはその断片または誘導体が、安定に、植物細胞または植 物組織のゲノム中に組込まれている。さらにまた、本発明は、側芽条形成性およ び／または花弁形成性および／または離層形成性が制御された植物の作製方法に 関し、この方法では、側芽条形成および／または花弁形成および／または離層形 成の制御に寄与する発現性ＤＮＡ配列あるいはその断片または誘導体を、安定に 、植物細胞または植物組織のゲノム中に組込み、得られた植物細胞または植物組 織を再生させて、植物体を形成する。さらにまた、本発明は、本発明の方法に従 い得られる植物および植物の種子ストックに関する。 技術背景 実用植物（ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｐｌａｎｔｓ）および観賞植物の挙動特性は、 それらの原始構造（ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）により相当に決定される。植物 の基本構造は、胚発生期（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）に現 れるが、後胚発生期（ｐｏｓｔ−ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｐｈａｓｅ）は、端頂分 裂組織（ａｐｉｃａｌ ｍｅｒｉｓｔｅｍ）の活動により特徴づけられる。高等 植物の芽条端頂分裂組織（ＳＡＭ）の能力は、芽条分岐の形成およびそれらの生 長の制御にとって基本的に重要である。その結果として、植物の習性、すなわち 本質的挙動特性は、その側芽条形成の数、配置および発生強度により特徴づけら れる。芽条の分岐は、頂端で、また側面で生じることができる。ＳＡＭが主とし て２つの部分に分離する頂端分岐は主として、下等茎葉植物で生じ、数種の顕花 植物について開示されている［ＳｔｅｅｖｅｓおよびＳｕｓｓｅｘ，１９８９， Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２版、Ｃａｍ ｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）。顕 花植物に典型的な側面分枝は、ＳＡＭ細胞に起因する、葉腋（ａｘｉｌ）におけ る新規芽条端頂分裂組織の形成に基づいており、この細胞の分裂特性は、葉原体 の発現に関与する周辺細胞とは対照的に、保存されたまま残る。引き続く生長過 程において、この残存する分裂組織から、側芽が形成される。側芽は若干の葉原 体以外に、端頂分裂組織を含んでおり、またその活動は、主要芽条ＳＡＭにより 制御される。 植物変異体の分析は、芽条系の分岐が遺伝因子によって制御されることを示し た。すなわち、例えばトマト［リコペルシコン エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅ ｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）］では、側芽条の形成が、種々の段階で 抑制される多くの変異体について記載されてきた［例えば、ブラインド（ｂｌｉ ｎｄ）、ブラインド−２、トロサ（ｔｏｒｏｓａ）、ラテラルサプレッサー（ｌ ａｔｅｒａｌ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）］。形態学的特徴は、葉腋芽の生成がト マト変異体、ブラインド、ブラインド−２およびトロサにおいて、阻害されてい ることを示した（Ｔｕｃｋｅｒ，１９７９，Ａｎｎ．Ｂｏｔ．，４３：５７１〜 ５７７；ＭａｐｅｌｌｉおよびＬｏｍｂａｒｄｉ，１９８２，Ｐｌａｎｔ ＆ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２３：７５１〜７５７）。これに対して、劣性ラテラルサプ レッサー（Ｌｓ）変異を受けるホモ接合体である植物においては、大部分の側芽 の形成は生じない（Ｂｒｏｗｎ，１９５５，Ｒｅｐ．Ｔｏｍａｔｏ Ｇｅｎｅｔ ｉｃｓ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ，５：６〜７）。組織学的分析は（Ｍａｌａｙ ｅｒおよびＧｕａｒｄ，１９６４，Ａｍｅｒ．Ｊｏｕｒ．Ｂｏｔ．，５１：１４ ０〜１４３）、ラテラルサプレッサー変異体では、葉原体の葉稜においてＳＡＭ から直接に起因する細胞（側芽条の形成は、この細胞の分裂活性に基づいている ）が欠落していることを示した。全部の葉の葉腋における側芽条の欠落が、第一 花序（ｆｉｒｓｔ ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）における芽条軸の停止をもた らす場合、花発現への移行は、この変異体における葉腋分裂組織の確立能力が完 全には失われていないことを示す。花序期前に直接に確立される葉原体の葉腋で は、分裂組織がしばしば、ホモ接合Ｌｓ変異体（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ Ｌｓ ｍｕｔａｎｔｓ）でも確立される。この芽条軸の仮軸構造に必要である、この 分裂組織の確立はしばしば、次に古い葉の葉腋の側芽の形成を伴う。花相への移 行の後のＬｓ変異体の生長は、花序あたりの花の数が少ないこと（Ｗｉｌｌｉａ ｍｓ，１９６０，Ｈｅｒｅｄｉｔｙ，１４：２８５〜２９６）、花弁原体（ｐｅ ｔａｌ ｐｒｉｍｏｒｄｉａ）の確立の喪失（ＳｚｙｍｋｏｗｉａｋおよびＳｕ ｓｓｅｘ，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，４：１〜７）および異常な数の雄芯お よび雌芯葉の存在（Ｇｒｏｏｔ等、１９９４，Ｓｃｉ．Ｈｏｒｔ．，５９：１５ ７〜１６２）を特徴としている。さらにまた、この変異体においては、繁殖力の 減少が見出され、これはまた収穫の減少をもたらし、このことは、Ｌｓ変異体が 収穫率−志向栽培にとって有望なものには至っていない理由である。 Ｌｓ変異体のさらなる表現型の変化は、花茎および果実茎における離層の形成 に関与する。野生型植物は、小細胞からなる５〜１０層の領域を有し、その遠隔 末端における無受粉花または成熟果実は植物から落下するが（Ｒｏｂｅｒｔｓ等 、１９８４，Ｐｌａｎｔａ，１６０：１５９〜１６３）、Ｌｓ変異体では、この 離層は形成されず、収穫期間中に、果実は、果茎および萼片を残すことなく落下 する。 見出された表現型の変化は、生理学的レベルの特定の植物ホルモンの平衡の障 害と関連する。野生型と比較して、Ｌｓ変異体の芽条頂端でのサイトキニンの低 濃度が測定されており（Ｍａｌｄｉｎｅｙ等、１９８６，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌ ａｎｔ，６８：４２６〜４３０；Ｓｏｓｓｏｕｎｔｚｏｖ等、１９８８，Ｐｌａ ｎｔａ，１７５：２９１〜３０４）、他方で、β−インドリル酢酸（ＩＡＡ）− 類似化合物の量ならびにギベレリン酸およびアブシジン酸の量は、格別に増加さ れている（Ｔｕｃｋｅｒ，１９７６，Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌ．，７７：５６１〜 ５６８）。アグロバクテリウム ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）からのイソペンテニルトランスフェラーゼ遺伝子 を導入することによって、Ｌｓ変異体の欠陥を補修する試みは、内生サイトキニ ン濃度の増加をもたらしたが、側芽条発生の正常化は生じさせなかった（Ｇｒｏ ｏｔ等、１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，１６： ２７〜３６）。 単茎トマト変種の栽培は格別に重要視されていることから、Ｌｓ変異体を商業 的栽培に使用できるようにする研究が、早くから行われている。側芽条形成およ び／または花弁形成および／または離層形成に寄与する遺伝子のＤＮＡ配列は、 いまだに未知であることから、受精能力および収穫に対する望ましくない作用か ら、側芽条形成に対する望ましい効果を分離するための遺伝子学的方法による研 究が繰り返されている。しかしながら、現在まで、これらの研究は成功していな い。 変異体表現型および遺伝子マップ上の位置によってのみ特徴づけられる遺伝子 を単離するためには、挿入変異誘発（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ ｍｕｔａｇｅｎ ｅｓｉｓ）および位置クローニング（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ） 戦略が、過去数十年間、好んで使用されてきた。挿入変異誘発は、この方法で分 子レベルで標識された遺伝子を単離するための公知配列の挿入によって形成され る変異体対立遺伝子（ｍｕｔａｎｔ ａｌｌｅｌｅｓ）を用いる。植物では、ア グロバクテリウム ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅ ｆａｃｉｅｎｓ）からのＴ−ＤＮＡ（Ｋｏｎｃｚ等、１９９２，Ｐｌａｎｔ Ｍ ｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０：９６３〜９７６）ならびに転置因子（Ｇｉｅｒｌおよ びＳａｅｄｌｅｒ，１９９２，Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９：３９〜 ４９）が、挿入変異誘発原として使用されている（Ｊｏｎｅｓ等、１９９４，Ｓ ｃｉｅｎｃｅ，２６６：７８９〜７９３）。トウモロコシからの転置因子Ａｃお よびＤｓは、同一染色体上の対をなす位置に転置することを好むことから（Ｋｎ ａｐｐ等、１９９４，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２４３：６６６〜６７３ ）、転置因子による変異誘発は、転置因子が対象遺伝子と厳密に対をなして存在 する出発系が利用できる場合、特に容易になる。このようなトマト系は入手でき ないため、Ｌｓ遺伝子の単離に転置因子による変異誘発を利用することはそれほ ど容易なことではない。 位置クローニング戦略は、哺乳動物の遺伝性疾病の分子機序の分析に開発され ており、中でも、デュシェン筋ジストロフィ（Ｋｏｅｎｉｇ等、１９８７，Ｃｅ １１，５０：５０９〜５１７）、嚢胞性線維症（Ｒｏｍｍｅｎｓ等、１９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：１０５９〜１０６５）およびハンチントン氏病（Ｈｕ ｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐｅ，１ ９９３，Ｃｅｌｌ，７２：９７１〜９８３）にかかわる遺伝子の単離に使用され た。図１は、位置クローニングの過程を示す図解図である。この戦略の場合、分 子マーカーのマップ中への古典的遺伝子座の組込みが、基本的に重要である。制 限断片長の多型体（ＲＦＬＰｓ）を遺伝子標識として使用すると（Ｂｏｔｓｔｅ ｉｎ等、１９８０，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，３２：３１４〜３３１） 、単離されるべき遺伝子の環境からの密接に対をなしたＤＮＡ断片の同定が可能 である。次いで、これらの断片を分離した高分子量ＤＮＡのパルス発生場ゲル電 気泳動（ｐｕｌｓｅｄ ｆｉｅｌｄ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ）（Ｃｈｅｕ等、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：１５８２〜１５８５）に よるサザン分析法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）でハイブリッド形成 プローブとして使用し、相対的遺伝子距離を、いわゆる「染色体歩行」（ｃｈｒ ｏｍｏｓｏｍｅ ｗａｌｋ）によって架橋されるべき物理的距離の絶対値に変換 する。出発点としてフランキングマーカー（ｆｌａｎｋｉｎｇ ｍａｒｋｅｒ） を用いて出発すると、所望の遺伝子の周辺が、重複したＤＮＡ断片の形態で単離 される。遺伝子マップのフランキングマーカーの距離に応じて、このＤＮＡ断片 は、ＹＡＣまたはコスミドクローンである（Ｂｕｒｋｅ等、１９８７，Ｓｃｉｅ ｎｃｅ，２３６：８０６〜８１２）。高いマーカー密度を有するＲＦＬＰマップ が、Ｎａｍ等により開発され（Ｎａｍ等、１９８９，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１ ：６９９〜７０５）、Ｔａｂｋｓｌｅｙ等（Ｔａｂｋｓｌｅｙ等、１９９２，Ｇ ｅｎｅｔｉｃｓ，１３２；１１４１〜１１６０）、ＧｒｉｌｌおよびＳｏｍｅｒ ｖｉｌｌｅ（ＧｒｉｌｌおよびＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、１９９１，Ｍｏｌ．Ｇｅ ｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２６：４８４〜４９０）は、ＹＡＣ−ライブラリーの作製 を開示している。 トマトの古典的遺伝子マップでは、Ｌｓ遺伝子座は、第７染色体の長い腕の上 に座位を有する（ＴａｙｌｏｒおよびＲｏｓｓａｌｌ，１９８２，Ｐｌａｎｔａ ，１５４：１〜５）。Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ等は、ＲＦＬＰマップ中へのＬｓ遺 伝子座の組込みを開示しており（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ等、１９９５，Ｍｏｌ． Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２４６：７６１〜７６６）、ここでは、Ｌｓ遺伝子座は 第７染色体の遠隔末端近くの０．８ｃＭ内に座位している。さらにまた、Ｓｃｈ ｕｍａｃｈｅｒ等は、Ｌｓ遺伝子座がＲＦＬＰマーカーＣＤ６１およびＣＤ６５ により結合されているものと開示している。パルス発生場ゲル電気泳動による物 理的マッピングは、ＣＤ６１およびＣＤ６５が相互に、３７５ｋｂより多くは離 れていないことを示した。 農業栽培の場合、側芽条形成は、種々の理由によりかなりの実用植物では望ま しくない： １．第一に、若い側芽条は、「シンク」器官（消費の器官）であり、従って主 芽条の生長を減少させる。 ２．高度に分岐した芽条系はしばしば、機械的処理（例えば機械による収穫） に対するほとんど克服できない障害物である。 これらの理由で、初期に、側芽条を有していない変種を常習的方法で栽培する ことが試みられた。この試みは、個別の実用植物（例えば、ヒマワリ）では成功 している。しかしながら、かなり多くの別種の双子葉実用植物（例えば、トマト 、キュウリ、リンゴの樹、ナシの樹）では、単茎が望まれる。しかしながら、こ れは効果的栽培種では実現にはほど遠い。また、単子葉実用植物（例えば、トウ モロコシ類およびサトウキビ）では、側芽条形成の抑制が商業用途において有利 であり、また高度に望ましい。現時点で、例えばトマトなどの単茎は、中央およ び北部ヨーロッパで慣用の温室栽培において、側芽条を手により除去することに よって達成されている。側芽条の除去は機械によっては達成することができない ことから、この方法は経済的に高価になる。さらにまた、傷つけられた部位で、 植物は病原体、例えば病原性細菌およびカビ類による感染を非常に受け易い。従 って、側芽条の除去は、温室内における病気の蔓延に関与する。 しかしながら、かなりの観賞植物では、追加の側芽条形成、すなわち増大され た花形成が望まれる。側芽条の増強された形成はまた、かなりの実用植物、例え ばジャガイモ、コーヒーまたは茶植物においても格別に有利である。従って、側 芽条形成が増大または抑制されている、価格的に効率的で、経済面において効果 的な実用植物および観賞植物が求められている。 離層形成の抑制は、多くの植物にとって重要である。すなわち、柑橘類植物の 果実の早すぎる離脱は、収穫の損失をもたらし、離層の形成が無くなれば防ぐこ とができる。同様の結果が、その他の果実種、例えばチェリイ、モモまたはブラ ックカレントにおいても見出される。さらにまた、離層形成の抑制、例えばトマ トの離層形成の抑制も有利である。離層が見出されない場合、果実は、果茎およ び萼片を残すことなく、収穫中に植物から落下する。この特徴は、機械による収 穫には望ましい。果茎および萼片はトマト製品の品質に対しては有害であること から、トマトピューレなどの製品に引き続いて処理することができる。 観賞植物では、離層形成の増大はまた有用である。この理由は、多くのバルコ ニー植物および庭園植物の場合などでは、花がしぼんだ後に自ら落下し、これら を手で除去する必要が無いことにある。このようなことが起こらなければ、新し い花の形成が抑制される。 発明の簡単な説明 Ｌｓ遺伝子の単離およびクローニングは、この遺伝子の活性を目標とする様相 で変化させる可能性を提供し、トランスジェニック植物における側芽条の形成を 抑制または増大させる可能性を提供する。さらにまた、Ｌｓ遺伝子の活性を目標 とする様相で変化させることによって、離層形成および／または花弁形成を抑制 または増大させることができる。従って、本発明が基づく目的は、Ｌｓ遺伝子ま たはこの遺伝子を含有するＤＮＡ断片を単離し、その配列を決定し、そしてＬｓ 遺伝子の活性を目標とする様相で、側芽条形成および／または離層形成および／ または花弁形成が抑制または増大されるように変化させた、トランスジェニック 植物の作製方法を提供することにある。 本発明の目的は、配列番号：１、９または１３に示されるヌクレオチド配列お よび配列番号：１、９または１３に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズ するヌクレオチド配列を提供することによって解消される。上記配列番号：１、 ９または１３に示されるヌクレオチド配列および上記配列番号：１、９または１ ３に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列は、側芽 条形成および／または花弁形成および／または離層形成の制御に寄与するポリペ プチドをコードする。本発明においては、「ハイブリダイゼーション」（ｈｙｂ ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の用語は、常習的ハイブリダイゼーションの形成条件を 表わし、好ましくは、「ハイブリダイゼーション」の用語は、Ｔ_M値がＴ_M４５℃ 〜Ｔ_M６８℃の範囲にあるようなハイブリダイゼーション条件を表わす。「ハイ ブリダイゼーション」の用語は、特に好ましくは、ストリンジェントなハイブリ ッド形成条件を表わす。本発明はまた、上記ヌクレオチド配列によりコードされ るポリペプチドおよびアミノ酸配列に関する。 本発明のもう一つの目的は、制御された側芽条形成性および／または花弁形成 性および／または離層形成性を有する植物を作製する方法により解消され、この 方法は、側芽条形成および／または花弁形成および／または離層形成の制御に寄 与する、発現性ＤＮＡ配列またはその断片あるいは誘導体を、安定に、植物細胞 または植物組織中に組込み、生成する植物細胞または植物組織を再生させ、植物 を形成する方法である。 本発明においては、組込まれたＤＮＡが側芽条形成および／または花弁形成お よび／または離層形成を制御する方法が、好ましい。特に好ましい方法は、組込 まれたＤＮＡを側芽条形成および／または花弁形成および／または離層形成を制 御する相補内在配列に対してアンチセンスに発現させる方法である。特に好まし い方法はまた、組込まれたＤＮＡを側芽条形成および／または花弁形成および／ または離層形成を制御する相補内在配列に対してセンスに発現させる方法にある 。さらにまた、特に好ましい方法は、側芽条形成および／または花弁形成および ／または離層形成を、本発明によるＤＮＡ配列またはその断片もしくは誘導体を 含有するリボザイムにより抑制する方法にある。特に好ましい方法はまた、本発 明によるＤＮＡ配列またはその断片もしくは誘導体を使用し、相同組換えにより 植物中の固有遺伝子のスイッチを切る（「ノックアウト」する）方法である。 本発明において、植物のゲノム中に組込まれたＤＮＡが側芽条形成および／ま たは花弁形成および／または離層形成を増強する方法は特に好ましい方法である 。特に好ましい方法は、本発明によるＤＮＡを、側芽条形成および／または花弁 形成および／または離層形成に寄与する内在配列に対してセンスに発現させる方 法にある。 本発明による特に好ましい方法は、トランスジェニックのトマト、セイヨウア ブラナ、ジャガイモまたはキンギョソウ植物の作製方法にある。本発明による特 に好ましい方法はまた、植物のゲノム中に組込まれたＤＮＡが、配列番号：１、 ９または１３に示される配列またはその断片もしくは誘導体、または上記配列ま たはその断片もしくは誘導体に対し相補的である配列、あるいは配列番号：１、 ９または１３に示される配列またはその断片もしくは誘導体とハイブリダイズし 、側芽条形成および／または花弁形成および／または離層形成の生物学的活性を 有するポリペプチドをコードする配列を有する、トランスジェニック植物の作製 方法にある。 本発明はまた、形質転換した植物細胞または形質転換した植物組織に関し、こ れらの細胞または組織においては、側芽条形成および／または花弁形成および／ または離層形成の制御に寄与する発現性ＤＮＡ配列またはその断片もしくは誘導 体が、安定に、植物細胞または植物組織のゲノム中に組込まれている。さらにま た、本発明は、本発明の方法により得ることができる植物および植物の種子スト ックに関する。 本発明を、下記図面によりさらに説明する。これらの図面において： 図１は、位置クローニングの過程を示す図解図である； 図２は、（ａ）Ｔａｎｋｓｌｅｙ等により公開されたＲＦＬＰマップ（Ｔａｎ ｋｓｌｅｙ等、１９９２，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３２：１１４１〜１１６０）の 一部を示している。（ｂ）では、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ等によるＬｓ領域（Ｓｃ ｈｕｍａｃｈｅｒ等、１９９５，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２４６：７６ １〜７６６）が、このマップに組込まれている。 図３は、Ｌｓ領域からのｃＤＮＡおよびコスミドクローンのマッピングを示し ている。コスミドクローンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＬ、ならびにＹＡ ＣクローンＣＤ６１−５が、バーにより記号化されている。ｃＤＮＡクローンｃ １０、ｃ２１、ｙ２５およびＥＴの位置が、開放長方形内に示されている。点線 はＦ２植物２３、２４、８６５および９４５の組換え部位を示す。 図４は、相違する植物種におけるＬｓ関連遺伝子を検出するためのサザンブロ ット分析のオートラジオグラフを示している。トマト［リコペルシコンエスクレ ンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）］、ジャガイモ［ ソラナム ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）］およびキンギ ョソウ［アンチルヒナム マジャス（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ ｍａｊｕｓ）］ からのゲノムＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し、次いでｃＤＮＡクローン ＥＴとハイブリッド形成させた。 図５は、トマト［リコペルシコン エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏ ｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）］からのＬｓ野生型遺伝子のヌクレオチド配列およ びそこから誘導されるアミノ酸配列を示している。 図６は、ジャガイモ［ソラナム ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏ ｓｕｍ）］からのＬｓ相同遺伝子のヌクレオチド配列およびそこから誘導される アミノ酸配列を示している。 図７は、アラビドプシス タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａ ｎａ）からのＬｓ相同遺伝子の６８７ｂｐＤＮＡ断片のヌクレオチド配列および そこから誘導されるアミノ酸配列を示している。 図８は、アラビドプシス タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａ ｎａ）（ＬｓＡｔ）、リコペルシコン エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃ ｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）（ＬｓＬｅ）およびソラナム ツベロサム（Ｓｏ ｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）（ＬｓＳｔ）からのＬｓポリペプチドのアミ ノ酸配列の整列を示している。アミノ酸に関しては、１文字コードが使用されて いる。同一アミノ酸は、黒色で影が付けられており、類似アミノ酸は、灰色で影 が付けられている。ダッシュ印（−）は、配列情報の欠落を表わし、点印（．） は、ポリペプチド中の追加のアミノ酸を表わす。星印（＊）は、核酸レベル上の 停止コドンを表わす。 発明の詳細な説明 数百キロベース鎖長のＤＮＡ断片をサッカロマイセス セレビシー（Ｓａｃｃ ｈｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の人工酵母染色体（Ｙｅａｓｔ Ａ ｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）：ＹＡＣ］として、クローニング する方法（Ｂｕｒｋｅ等、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３６：８０６〜８１２ ）は、物理的マップを、単離されるべき遺伝子を包含する多数の重複ＹＡＣクロ ーンへ転換することを可能にする。トマトのＹＡＣライブラリー（Ｍａｒｔｉｎ 等、１９９２，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２３３：２５〜３２）から、Ｒ ＦＬＰマーカーＣＤ６１を含有するクローンを単離した。このＹＡＣ末端断片を 、Ｌｓ遺伝子に隣接するＲＥＬＰマーカーに対して、およびまた組換え切断点に 対して、およびＬｓ遺伝子それ自体に対して、マッピングすることによって、Ｌ ｓ領域の単離ＤＮＡ断片の位置を決定した。これにより、ＹＡＣクローンＣＤ６ １−５を見出し、ＣＤ６１およびＣＤ６５の両方とハイブリダイズした。従って 、これはＬｓ遺伝子を包含する完全ゲノム領域を含有する。図３には、マーカー およびＹＡＣクローンの位置が図解式に示されている。 ＹＡＣクローン内に限局化されているコード領域を同定するために、ｃＤＮＡ ライブラリーをスクリーニングするための放射性標識プローブとして、このクロ ーンを使用した（Ｓｉｍｏｎ，１９９１，博士論文，Ｃｏｌｏｇｎｅ大学，Ｃｏ ｌｏｇｎｅ，ドイツ国）。使用されたｃＤＮＡライブラリーは、野菜および花の 両方の頂端芽条のＲＮＡから作製される。従って、このライブラリーは、ＬＳ変 異体の表現型を表わす組織において発現している遺伝子を表わす。クロスハイブ リダイゼーションによって明らかになったｃＤＮＡクローンの特徴は、精製クロ ーンが全部で２９の異なる転写物を提供することである。ＣＤ６１−ＣＤ６５間 の組換え切断点に対するｃＤＮＡクローンの引続く細かいマッピングは、ｃＤＮ Ａクローンｙ２５のみが、Ｌｓ遺伝子とともに分離され、上記遺伝子の可能な候 補者であることを示した。コスミド ｃｏｎｔｉｇの確立後、コスミドクローン をプローブとして用いて、ＣＤ６１−ＣＤ６５間から追加のｃＤＮＡクローンを 単離した。これはＹＡＣクローンＣＤ６１−５をプローブとして使用するスクリ ーニングでは、このプローブが高度に複雑であることから検出できなかった。こ れらの実験において、追加の３種のｃＤＮＡクローン（ｃ１０、ｃ２１およびＥ Ｔ）が単離された。これらのクローンをまたＬｓ遺伝子とともに分離した。これ らは別種のＬｓ遺伝子の候補者であり得る。このようにして、全部で４種のｃＤ ＮＡクローンがＬｓ領域から同定された。これらのクローンはＬｓ遺伝子の候補 者であった。図３では、上記クローンが、開放長方形の区画により示されている 。 Ｌｓ遺伝子を、発現の調節に必要なプロモーター配列とともにクローン化する ためには、ｃＤＮＡクローンｙ２５をＬｓ領域の短鎖ゲノムＤＮＡ断片単離用の 出発点として使用した。この目的には、トマトからのゲノムコスミドライブラリ ーを、ベクターｐＣＬＤ０４５４１（Ｂｅｎｔ等、１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６５，１８５６〜１８６０）で確立した。上記ベクターは、植物形質転換に必 要なＴ−ＤＮＡボーダー配列を含有しており、従って追加のクローニング工程を 用いることなく、単離されたＤＮＡ断片を植物細胞中に導入することを可能にす る。このライブラリーから、多数の重複コスミドクローンが、数回の代表的クロ ーニング工程で単離された。被験区間の組換え切断点に関連する上記コスミドク ローンのマッピングは、単離ゲノムＤＮＡ断片が約６０ｋｂのゲノム領域を包含 することを示した。このコスミドクローンの位置は、図３の図解図に示されてい る。 コスミドクローンとして単離されたゲノムＤＮＡ領域からの遺伝子が、Ｌｓ変 異体で欠落している側芽条、花弁および離層の形成にかかわる生物学的機能を補 償することができるか否かという問題を検討するために、上記Ｌｓ変異体をコス ミドクローンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＬにより形質転換させた。コス ミドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦの導入によって作製された形質転換体の全部に おいて、表現型の変更は見出されなかった。これに対して、コスミドＧおよびＬ のどちらかを含有する８種の独立した形質転換植物では、野生型表現型の部分的 回復または完全回復を見出すことができた。この相補性の実験の結果を、表１に 示す。 表１：コスミド形質転換によるＬｓ変異体の相補性の実験 これらの形質転換植物は、生長段階中に側芽条を形成し、およびまた顕花段階 で花弁および離層を形成する。コスミドＧまたはコスミドＬを含有する形質転換 植物のサザンブロット分析は、無相補を示す植物では、Ｔ−ＤＮＡは不完全にの み伝達されることを示した。すなわち、この結果は、導入されたＤＮＡ断片が、 この変異体では見られない、側芽条、花弁および離層の形成にかかわる遺伝情報 を補償することができることを示している。 コスミドＧのサブフラグメントを用いる相補性実験を使用することによって、 Ｌｓ遺伝子が限局化されているＤＮＡ領域を、さらに詳細に決定することができ た。予め同定されている遺伝子ｃ２１を含有するＤＮＡ断片による形質転換では Ｌｓ変異体の相補は起こらなかったが、ＥＴ遺伝子を含有する約６ｋｂの断片の 導入によって、８種の独立した形質転換植物で、野生型表現型を回復させること ができた。ＤＮＡ配列分析は、このＬｓ¹変異体のＥＴ遺伝子は、上流に限局化 されている８６５ｋｂの配列および蛋白質の最初の１８５のアミノ酸を除去する １５５０ｋｂの欠落を隠蔽することを示した。第二の独立した変異体対立遺伝子 Ｌｓ²は、３ｂｐの挿入および短鎖ＤＮＡ部分における数点の変異点を有する。 この変異点の一つは、２４アミノ酸の後の蛋白質合成の停止をもたらす。このｃ ＤＮＡの相補性実験ならびに単離およびマッピング、およびまた野生型からのＥ Ｔ遺伝子および２種の独立したＬｓ対立遺伝子の配列分析によって、ｃＤＮＡク ローンＥＴが、Ｌｓ遺伝子のｍＲＮＡの完全コード配列を表わすことが見出され た。 類似または相同遺伝子がまた、別種の植物にも存在するか否かという問題を検 討するために、ｃＤＮＡクローンＥＴを、穏やかな条件下でのサザン法試験でハ イブリダイゼーション用プローブとして使用した。本明細書で使用されているも のとして、「植物」の用語は、単子葉および双子葉の実用および観賞植物を包含 する。本明細書で使用されているものとして、「穏やかな(reduced stringency) 」の用語は、ハイブリダイゼーション操作温度を５０℃〜５５℃に変更した、代 表的なハイブリダイゼーションの条件を表わす。ジャガイモ［ソラナム ツベロ サム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）］およびキンギョソウ［アンチル ヒナム マジアス（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ ｍａｊｕｓ）］において、数個の ＤＮＡ断片を検出した。キンギョソウからの数個のゲノムクローンを、５５℃に おけるハイブリダイゼーションにより単離した。ＤＮＡ配列分析により、この単 離されたキンギョソウのクローンがＬｓ遺伝子と相同の重要な配列を有すること が見出された。従って、トマトＬｓ遺伝子と相同の遺伝子を、ｃＤＮＡクローン ＥＴをプローブとして使用することによって、常習的方法に従い単離することが できる。遺伝子特異性プライマーを使用すると、Ｌｓ相同遺伝子がジャガイモ［ ソラナム ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）］のゲノムＤＮ ＡからＰＣＲにより単離される。このジャガイモからのＬｓ相同遺伝子は、ＤＮ Ａレベルで、およびまた蛋白質レベルでトマトのＬｓ遺伝子に対して約９９％の 配列同一性を示す。また、アラビドプシス［アラビドプシス タリアナ（Ａｒａ ｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）］のゲノムＤＮＡから、Ｌｓ相同遺伝子 の６８７ｂｐＤＮＡ断片を、縮重プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍ ｅｒｓ）を用いてＰＣＲにより単離した。ＤＮＡレベルについて、このアラビド プシス タリアナＤＮＡ断片は、トマトＬｓ遺伝子に対して約６３％の配列同一 性を示した。蛋白質レベルについては、アミノ酸の約５５％が同一である。 本発明はまた、植物ゲノムから誘導され、そして側芽条形成および／または花 弁形成および／または離層形成を制御する蛋白質をコードするＤＮＡ配列に関す る。植物細胞に導入し、発現させると、ヌクレオチド配列中に含まれる情報が、 リボ核酸の生成をもたらす。このリボ核酸を用いることによって、蛋白質活性を 細胞中に導入することができ、あるいは内在蛋白質活性を抑制することができる 。特に好ましいＤＮＡ配列は、図５に示されているリコペルシコン エスクレン タム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）からの配列番号：１ に示されるＤＮＡ配列、図６に示されているソラナム ツベロサム（Ｓｏｌａｎ ｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）からの配列番号：９に示されるＤＮＡ配列、および 図７に示されているアラビドプシス タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈ ａｌｉａｎａ）からの配列番号：１３に示されるＤＮＡ配列である。 さらにまた、本発明は、植物細胞の形質転換における挿入、欠失または置換に より、当該ＤＮＡ配列から誘導される、本発明によるＤＮＡ配列、またはその断 片もしくは誘導体の使用に関する。本発明によるＤＮＡ配列は、種々の方法を使 用して、側芽条形成の抑制、これによる芽条系分岐の抑制、および／または花弁 および／または離層形成の抑制に使用することができる： １．側芽条および／または花弁および／または離層の形成を抑制するためには 、本発明によるＤＮＡ配列を、慣用のベクター（例えば、プラスミド）中にアン チセンスまたはセンスにクローン化することができる。すなわち、プロモーター およびターミネーターなどの植物細胞における発現制御因子と組合わせる。作製 されたベクターを使用することによって、植物細胞を目的に応じて形質転換し、 内在蛋白質の合成を防止することができる。この目的には、本発明によるＤＮＡ 配列の短鎖部分、すなわち断片、あるいは５０％〜１００％類似する配列を有す るＤＮＡ配列、すなわち誘導体をまた、使用することができる。従って、アラビ ドプシスから単離されたＬｓ相同遺伝子を、関連植物種、ブラシカ ナパス（Ｂ ｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）（セイヨウアブラナ）において、例えば側芽条形 成を抑制し、これにより芽条系の分岐を抑制し、および／または花弁および／ま たは離層の形成を抑制するために使用することができる。アンチセンスまたはセ ンス構築物の導入による植物細胞における遺伝的活性の標的を定めた抑制は、常 習的方法であり、多くの場合に成功裏に採用されている（Ｇｒａｙ等、１９９２ ，Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９：６９〜８７）。 ２．さらにまた、本発明によるＤＮＡ配列を用いて、側芽条および／または花 弁および／または離層の形成を、この目的用に構築されたリボザイムを発現させ ることにより抑制することができる。リボザイムの作製および使用は、タバコモ ザイク病ウイルス耐性トマトおよびタバコ植物について開示されている（ｄｅＦ ｅｙｔｅｒ等、１９９６，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２５０：３２９〜３ ３８）。 ３．さらにまた、本発明によるＤＮＡ配列は、固有遺伝子の不活性化に使用す ることができる。本発明によるＤＮＡ配列を使用することによって、Ｌｓ遺伝子 における挿入体［例えば、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｏｆａｃｉｅｎｓ）からのＴ−ＤＮＡまたは転置因子 ］に対して、ＰＣＲ法を用いて、変異誘発実験の観点から、オリゴヌクレオチド を試験植物に合成させることができる。一般に、遺伝的活性は、このような挿入 により阻害される（Ｋｏｅｓ等、１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ，９２：８１４９〜８１４３）。 ４．本発明によるＤＮＡ配列はまた、相同的組換えによる内生Ｌｓ遺伝子のス イッチを切る（ノックアウトする）ために使用することができる。この方法は、 マウスにおいて使用され、成功しており、また植物における使用は、Ｍｉａｏお よびＬａｍによりＰｌａｎｔ，Ｊ．，７，３５９〜３６５，１９９５に記載され ている。 トマトまたはその他の実用植物に比較して、観賞植物（例えば、ゼラニウム、 フクシアおよびキク）では、側芽条の強力な発生による茂みの生長を示す表現型 がしばしば、好まれる。今日、この生長型を発生させるためには、植物の首部を 切るか（これは、側葉腋の発生を促進する）、あるいは特定の化学物質で処理し ている。しかしながら、この操作の実施にはまた、格別に費用がかかる。これら の場合、本発明による茂み生長型を有する形質転換した植物の作製は、価格的に 有効な別法である。 観賞植物では、増大された離層形成を用いて、しぼんだ後に花がそれら自体で 落花し、多くのバルコニイおよび庭園植物の場合のように、手で取り除く必要が ないようにすることができる。この離層形成が生じないと、新しい花の形成がし ばしば、抑制される。 強力な側芽条形成性および／または離層形成性を有する形質転換した植物を作 製する場合、本発明によるＤＮＡ配列、または当該配列からの挿入、欠失または 置換により誘導される、その断片もしくは誘導体を、センスにプラスミド中に導 入し、次いで植物細胞で発現用の制御因子と組み合わせる。このプラスミドを使 用することによって、側芽条および／または花弁および／または離層の形成およ び発現を刺激する蛋白質を合成することができる、翻訳可能なメッセンジャーリ ボ核酸（ｍＲＮＡ）が発現されるように、植物細胞を形質転換することができる 。 本発明によるＤＮＡ配列、または当該配列からの挿入、欠失または置換により 誘導される、その断片もしくは誘導体を使用することによって、トマトまたはそ の他の植物のゲノムからの相同または類似ＤＮＡ配列を単離することができる。 このＤＮＡ配列は、側芽条および／または花弁および／または離層の形成に影響 を及ぼす。この目的には、本発明によるＤＮＡ配列、または断片（例えば、オリ ゴヌクレオチド）、あるいは誘導体はまた、スクリーニングする植物のｃＤＮＡ ライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーを、常習的方法によりススクリー ニングするためのプローブ分子として使用することができる。別法として、縮重 または非縮重オリゴヌクレオチド（プライマー）を、本発明による配列から誘導 することもでき、これはＰＣＲに基づき、上記ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノ ムＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用することができる。本発明による ＤＮＡ配列と同様に、このようにして単離された関連ＤＮＡ配列を、植物におけ る側芽条形成および／または花弁形成および／または離層形成の抑制または刺激 に使用することができる。 植物細胞において、センスまたはアンチセンスに本発明によるＤＮＡ配列を発 現させるためには、一方で、転写プロモーターが、そして他方で、転写ターミネ ーターが必要である。格別に多くのプロモーターおよびターミネーターが刊行物 に開示されている（例えば、Ｋｏｓｔｅｒ−Ｔｏｐｆｅｒ等、１９８９，Ｍｏｌ ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１９：３９０〜６；Ｒｏｃｈａ−Ｓｏｓａ等、１９ ８９，ＥＭＢＯ Ｊ．，８：２３〜２９）。転写開始および転写停止領域は、ホ スト植物から、または相同有機体から誘導することができる。転写開始および転 写停止領域のＤＮＡ配列は、合成により作製することができ、あるいは天然から 入手することができ、あるいは合成および天然ＤＮＡ構成要素の混合物を含有す ることができる。 遺伝的修飾（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）方法は、双子葉植 物および単子葉植物について開示されている（ＧａｓｓｅｒおよびＦｒａｌｅｙ 、１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２９３〜１２９９；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ，１９９１，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．Ｐ ｈｙｓｉｏｌ．，４２：２０５〜２２６）。アグロバクテリウム ツメファシエ ンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いる形質転 換（Ｈｏｅｋｅｍａ，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ，３０３：１７９〜１８０；Ｆｉ ｌａｔｔｉ等、１９８７，Ｂｉｏｔｅｃｈ．，５：７２６〜７３０）に加えて、 ＤＮＡは、原形質体の形質転換、マイクロインジェクション（ｍｉｃｒｏｉｎｊ ｅｃｔｉｏｎ）、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ） またはバリスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）法により、植物細胞中に導入する ことができる。形質転換した植物細胞を選別する場合、導入されたＤＮＡを、抗 生物質（例えば、カナマイシン、ハイグロマイシン、ブレオマイシン）に対する 耐性を植物に付与する選別マーカーと組み合わせる。形質転換された植物細胞か ら次いで、完全植物体を代表的選別培地で再生させることができる。植物細胞の 再生は、例えばＥＰ−Ｂ−０２４２２３６に記載されている（この記載を特に引 用してここに組み入れる）。このようにして得られた植物を、常習的分子生物学 的方法により、導入されたＤＮＡの存在および完全性について試験する。導入さ れたＤＮＡが一度、ゲノム中に組込まれると、一般に安定であり、そして子孫に 伝達される。慣用の方法を使用することによって、生成する植物から種子ストッ クを得ることができる。下記の例は本発明を例示するものであり、制限しようと するものではない。別段の記載がないかぎり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等により記載さ れたように（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、分子生物学的標準方法を使用した。サ ザンハイブリダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ）は、６ｘＳＳＰＥ（０．９Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄ｘＨ₂Ｏ、 ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、０．１％ＰＶ Ｐ、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ子牛胸腺ＤＮＡ）中で、ハイボンド（Ｈ ｙｂｏｎｄ）Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて行った。プラークハイブリダ イゼーション（ｐｌａｑｕｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）は、６ｘＳＳＰＥ （１．０８Ｍ ＮａＣｌ、６０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄ｘＨ₂Ｏ、６ｍＭ ＥＤＴＡ 、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、０．１％ＰＶＰ、０．１％ＳＤＳ、 ２００μｇ／ｍｌ子牛胸腺ＤＮＡ）中で、ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）Ｎ＋膜（ Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて行った。 例１ トマトのＬｓ領域からのＹＡＣクローンの単離 トマトＹＡＣライブラリー（Ｍａｒｔｉｎ等、１９９２，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇ ｅｎｅｔ．，２３３：２５〜３２）から、ＣＤ６１マーカーを含有するクローン を単離した（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ等、１９９５，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ ．，２４６：７６１〜７６６）。このためには、９６ＹＡＣクローンを有するミ クロタイタープレートから誘導されたＤＮＡ混合物を、先ず、常習的ＰＣＲ法を 用いて試験した。これにより、このような１４４のＤＮＡ混合物から、９を同定 することができ、これらはＣＤ６１−ＦおよびＣＤ６１−ＲプライマーとＰＣＲ 生成物を生成した（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ等、１９９５，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ ｎｅｔ．，２４６：７６１〜７６６）。１つのクローンの単離を、コロニーハイ ブリダイゼーションまたはＰＣＲにより行った。この場合、ミクロタイタープレ ートの列または行のクローンのＤＮＡを、混合物として使用した。これにより、 プレートの９６クローンから、１つのクローンが２０のＰＣＲ反応を用いて同定 された。合計して、５のＹＡＣクローンが同定された。これらのクローンの挿入 サイズは、パルス発生場ゲル電気泳動により、２８０〜３２０ｋｂであることが 測定された（Ｃｈｕ等、１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：１５８２〜１５８ ５）。ＣＤ６１に加えて、ＹＡＣ ＣＤ６１−５がまた、第二のフランキングマ ーカーＣＤ６５を担持し、従ってＬｓ遺伝子座を包含することが、ＰＣＲおよび サザン法試験で証明された。 例２ トマトからのＬｓ領域のｃＤＮＡクローンの単離 ハイブリダイゼーション用プローブを作製するために、ＹＡＣクローンＣＤ６ １−５からのＤＮＡは、パルス発生場ゲル電気泳動による分離後に単離された。 しかしながら、このパルス発生場ゲルにおける分離は、比較的粗い作製を可能に するのみであり、従って、ＹＡＣクローンＣＤ６１−５に加えて、使用したプロ ーブは、酵母染色体ＩＩＩ（３６０ｋｂ）およびＶＩ（２８０ｋｂ）からのＤＮ Ａの部分をまた含有するようにした。放射性標識した上記ＤＮＡをプローブとし て使用し、常習的プラークハイブリダイゼーションにおいて５ｘ１０５ｐｆｕ［ プラーク形成単位（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）］を選別した。 ＹＡＣプローブを用いるハイブリダイゼーションは、相違する強度の複数の信号 を提供した。再度スクリーニングするために、相違する信号強度を有する５０の プラークを選択し、次いで４４の精製クローンをクロスハイブリダイゼーション によりグループ分けした。再スクリーニングから得られた４４クローンのうちの ２２は、一度だけ存在していた。総合して、２９の相違する転写体が、このスク リーニングで同定された。コスミドｃｏｎｔｉｇを確立した後、このｃＤＮＡラ イブラリーを再度、コスミドクローンによりスクリーニングし、そのプローブの 複雑性の故に、プローブとしてＹＡＣ６１−５を用いるスクリーニングでは検出 できなかった追加のｃＤＮＡクローンを単離した。これらの実験において、３つ の追加のｃＤＮＡクローンが同定された。合計で、３２の相違する転写体が検出 された。 例３ トマトから単離されたｃＤＮＡクローンのＲＦＬＰマッピング ３０の同定された配列のうちの２２は、ＲＦＬＰマッピングが可能な単一また は低複写配列に対するハイブリダイゼーションパターンを示した。最初のＲＦＬ Ｐ分析において、単離されたｃＤＮＡクローンを、エル エスクレンタム（Ｌ． ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）からの、エル ペネリー（Ｌ．ｐｅｎｅｌｌｉｉ）から の、およびまた制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａｌ で消化された戻し交雑ラインＩＬ８３からのＤＮＡを担持するフィルターに対し てハイブリダイズした（Ｅｓｈｅｄ等、１９９２，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅ ｎｅｔ．，８３：１０２７〜１０３４）。このラインは、第７染色体の遠隔末端 がエル ペネリーから誘導されており、そして残りのゲノムがエル エスクレン タム染色体から構成されており、エル エスクレンタムとエル ペネリーとの間 の多形性の存在下における最初の粗いマッピングを可能にする。多形ＤＮＡ断片 がＬｓ領域から誘導された場合、ラインＩＬ８３はエル ペネリー対立遺伝子を 示し、他方、エル エスクレンタム対立遺伝子は、残りのゲノムからの断片に存 在していた。この方法で、第７染色体から誘導されない４つのｃＤＮＡクローン が同定された。第７染色体から誘導された、残りの１８のｃＤＮＡクローンの細 かいマッピングを、それぞれＣＤ６１−ＬｓおよびＬｓ−ＣＤ６５の間における 組換え事象を含む植物Ｗ２３およびＷ２４のＲＦＬＰ分析により行った。この分 析において、植物Ｗ２３中のＬｓ遺伝子にかかわる候補者が、エル エスクレン タムおよびエル ペネリー特異性断片を示し、一方で、植物Ｗ２４が、エル エ スクレンタム特異性断片のみの存在を示した場合、このｃＤＮＡクローンを両方 の親の種の、およびまた両方の組換えＷ２３およびＷ２４の、ＥｃｏＲＩ、Ｅｃ ｏＲＶまたはＸｂａｌで消化したゲノムＤＮＡを担持するフィルターに対してハ イブリダイズした。この方法で、全部で４つのｃＤＮＡクローンが同定された。 これらのクローンはＬｓ遺伝子とともに分離されており、従ってＬｓ遺伝子の候 補者であり得た。 例４ トマトのゲノムコスミドライブラリーの作製およびスクリーニング Ｔ−ＤＮＡ／コスミドベクタ−ｐＣＬＤ０４５４１（Ｂｅｎｔ等、１９９４， Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：１８５６〜１８６０）のＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ 等の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ ｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に従い単離し、２種のＣｓＣｌ勾配により 精製し、次いで３日間、ＴＥに対して透析した。このＤＮＡを、ＢａｍＨにより 完全に消化し、引続いてベクターの自己リゲーション（連絡反応）を防止するた めに、アルカリ性ホスファターゼにより脱ホスホリル化した。Ｍｂｏｌにより部 分的に消化したゲノムトマトＤＮＡ ２００ｎｇおよびベクターＤＮＡ ２ｍｇ を、１６℃で一夜かけて、１０ｍｌ中でＴ４ＤＮＡとリゲートした。このリゲー ション分析物３ｍｌをパッケージング（ゲノム詰め込み）に使用し、次いでＥｃ ｏｌｉ ＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に移した。この分析によって、６ ｘ１０⁶独立組換えバクテリアが得られた。１００プレートのそれぞれを、２５ ００ｃｆｕ（コロニー形成単位）でプレート形成し、次いでそれぞれ１０ｍｌの ＬＢメジウムですすいだ。各場合、この材料からグリセロール培養物を作り、Ｄ ＮＡ作製を行った。これらの１００のＤＮＡを、ＰＣＲ分析によりスクリーニン グした。陽性のものを集め、コロニーフィルターハイブリダイゼーションに付し 、陽性の単一クローンを同定した。 例５ トマトからのＬｓ遺伝子のクローニングおよびスクリーニング コスミドＧを用いるｃＤＮＡのスクリーニングでプローブとして単離されたｃ ＤＮＡクローンＥＴの挿入体をＥｃｏＲＩにより切り出し、ベクターｐＧＥＭ− １１Ｚｆ（＋）中にクローン化した。この遺伝子の欠失５’末端を、ＲＡＣＥ技 法により単離した（Ｆｒｏｈｍａｎ等、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８９９８〜９００２）。この場合、当該遺伝子の公 知領域に特異的に結合するオリゴヌクレオチドから出発して、ＲＮＡ（ｃＤＮＡ ）に対して相補的なＤＮＡが作製された。引続いて、デオキシシトシン分子を、 ターミナルトランスフェラーゼを用いてｃＤＮＡに付着させた。第二の遺伝子特 異性プライマーおよびポリデオキシシトシン末尾に結合するプライマーを用いて 、ｃＤＮＡの５’末端を、ＰＣＲにより増幅させ、次いでプラスミドベクターｐ ＧＥＭ−Ｔ中にクローン化した。引続いて、最長のＲＡＣＥクローンを配列決定 に付した。このｃＤＮＡクローンの分析と同時的に、コスミドＧの各ゲノム領域 のサブフラグメントを単離し、次いでプラスミドベクターｐＧＥＭ−４Ｚおよび ｐＳＰＯＲＴＩにクローン化した。次いで、重複サブフラグメントを配列決定し た。このゲノム配列は、ｃＤＮＡクローンの配列からいずれの差異も示さなかっ た。このことは、このＬｓ遺伝子がいずれのイントロンも含有していないことを 意味する。さらにまた、変異体Ｌｓ¹およびＬｓ²の両方の各ゲノム領域を、適当 なプライマーを用いるＰＣＲによりゲノムＤＮＡから増幅させ、次いでｐＧＥＭ −Ｔベクターにクローン化した。この生成物の配列分析は、野生型配列に比較し て、Ｌｓ¹対立遺伝子で１．５ｋｂの欠失を示した。オープンリーディングフレ ームの分子１〜６８５の欠失以外に、このＬｓ¹変異体はまた、オープンリーデ ィングフレームの５’に限局化されている領域の８６５塩基対を欠いていた。こ れは、発現のための調節機能（プロモーター）を有するものと考えられる。従っ て、Ｌｓ¹変異体は、Ｌｓ遺伝子からの機能的蛋白質をもはや形成することがで きないものと見做すことができる。Ｌｓ²対立遺伝子では、３塩基対の挿入およ び３塩基交換が、オープンリーディングフレームの５’領域で見出された。これ らの塩基交換の一つは、２４アミノ酸の後のアミノ酸鎖の停止を生じさせる停止 コドンに導く。いかなる機能も有していない蛋白質がまた、仮定される。ベクタ ーｐＧＥＭ−１１ｚｆ（＋）、ｐＧＥＭ−４ｚ、ｐＧＥＭ−Ｔは、Ｐｒｏｍｅｇ ａ Ｃｏｒｐ．社（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）から購買し、ベクターｐＳＰＯＲ ＴＩは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅs社（Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ）から 購入し、そして製造業者の指示に従い使用した。 例６ トマトのＬｓｃＤＮＡ構築物による植物の形質転換 Ｌｓ ｃＤＮＡを、常習的ＰＣＲ法により遺伝子特異性プライマーＣＤ６１− １３（５’−ＴＴＡＧＧＧＴＴＴＴＣＡＣＴＣＣＡＣＧＣ−３’：配列番号：３ ）およびＣＤ６１−２８（５’−ＴＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴＴＣＴＣＴ Ｃ−３’：配列番号：４）により単離し、プラスミドベクターｐＧＥＭ−４ｚ（ ＧＳＥＴ８）にクローン化した。形質転換構築物を作製するために、このＬｓｃ ＤＮＡを、Ｓａ１Ｉ／ＳｓｔＩ（センス構築物用）およびＸｂａｌ／ＳｓｔＩ（ アンチセンス構築物用）を用いてプラスミドＧＳＥＴ８から切り出し、次いでそ れぞれＳａ１Ｉ／ＳｓｔＩ（センス構築物用）およびＸｂａｌ／ＳｓｔＩ（アン チセンス構築物用）で消化した植物形質転換ベクターｐＢＩＲにリゲートした（ Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，１９９０，博士論文，Ｃｏｌｏｇｎｅ大学，Ｃｏｌｏｇｎｅ ）。生成するクローンには、ｃＤＮＡがプロモーターとカリフラワーモザイク病 ウイルスの３５５遺伝子のポリアデニル化部位との間に、センスまたはアンチャ ンスのどちらかで存在する。生成するセンスプラスミドおよびアンチセンスプラ スミドを、直接形質転換により、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Ａｇ ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株種ＧＶ３１０１（Ｋｏｎ ｃｚおよびＳｈｅｌｌ等、１９８６，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０４： ３８３〜３９６）中に導入した。引続いて、これら２種の相違する構築物のＴ− ＤＮＡを、Ｆｉｌｌａｔｉ等に従い（Ｆｉｌｌａｔｉ等、１９８７，Ｂｉｏｔｅ ｃｈ．，５：７２６〜７３０）、トマトおよびタバコの葉片に形質転換した。Ｌ ｓアンチャンス構築物を含有する相違する形質転換植物は、側芽条形成の減少を 示す。 例７ キンギョソウ［アンチルハナム マジャス（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ ｍａｊ ｕｓ）］からのＬｓ関連遺伝子の単離 プローブとしてｃＤＮＡクローンＥＴを使用し、アンチルハナム マジャスか らのゲノムファージライブラリーをスクリーニングした。ハイブリダイゼーショ ンを、５５℃で、すなわち穏やかな条件下(reduced stringency)に行った。この 実験において、１４のクローンが単離された。これらのうちで最強のハイブリッ ド形成信号を示すクローンＨＨ１３を、さらに確認した。プラスミドベクターｐ ＧＥＭ−１１ｚｆ（＋）中に挿入した後に行われた配列分析は、単離されたアン チルハナム マジャス遺伝子がトマトからのＬｓ遺伝子に対して高い相同性を有 する配列を有することを示した。両方の配列において、誘導されたアミノ酸配列 が全体的に保存されている領域が同定された。 例８ ジャガイモ［ソラナム ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ） ］からのＬｓ関連遺伝子の単離 ５５℃の穏やかな条件下で(reduced stringency)、ハイブリダイゼーション用 プローブとしてＬｓ遺伝子のｃＤＮＡを使用したサザンブロット実験において、 ソラナム ツベロサムからのゲノムＤＮＡ中にＤＮＡ断片を検出することができ た（図４）。Ｌｓ遺伝子からの遺伝子特異的プライマーＣＤ６１−２４（５’− ＴＴＴＣＣＣＡＣＴＣＡＡＧＣＣＡＡＣＴＣ−３’：配列番号：５）、ＣＤ６１ −６（５’−ＧＧＴＧＧＣＡＡＴＧＴＡＧＣＴＴＣＣＡＧ−３’：配列番号：６ ）、ＰＯ１（５’−ＴＣＧＡＧＧＣＧＴＴＧＧＡＴＴＡＴＴＡＴＡＣ−３’：配 列番号：７）およびＰＯ５（５’−ＧＧＣＣＣＣＣＡＴＡＴＣＴＴＴＴＴＣＣ− ３’：配列番号：８）を使用し、重複ゲノムＤＮＡ断片を、ＰＣＲ法を用いるこ とによって、ソラナム ツベロサムから常習的に単離されたＤＮＡから単離した 。このＰＣＲ反応は、下記のとおりに行った：９５℃で３０秒間変性させ、６０ ℃で１分間アニーリングし、７２℃で２分間伸長させる。このサイクルを、３０ 回反復した。生成したＰＣＲ生成物を、プラスミドベクターｐＧＥＭ−Ｔにクロ ーン化した。配列分析により、ソラナム ツベロサムから単離されたＤＮＡ断片 が４３１個のアミノ酸をコードすることができるオープンリーディングフレーム に対する配列情報を保有していることが明らかになった（図６）。このＤＮＡ配 列は、配列番号：９に示されており、このＤＮＡ配列によりコードされるアミノ 酸配列は、配列番号：１０に示されている。ＤＮＡレベルおよび蛋白質レベルに おいて、ジャガイモのＬｓ相同遺伝子は、トマトのＬｓ遺伝子に対して約９８％ の配列同一性を示す。 例９ アラビドプシス タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）か らのＬｓ関連遺伝子の単離 アラビドプシス タリアナからＬｓ相同遺伝子を単離するために、縮重プライ マ−ＣＤ６１−３８（５’−ＣＡＲＴＧＧＣＣＮＣＣＮＹＴＮＡＴＧＣＡ−３’ ：配列番号：１１）およびＣＤ６１−４１（５’−ＴＧＲＴＴＹＴＧＣＣＡＮＣ ＣＮＡＲＲＡＡ−３’：配列番号：１２）を作製し、慣用の方法で単離されたア ラビドプシス タリアナからのゲノムＤＮＡとのＰＣＲ反応に使用した。このＰ ＣＲ反応は、下記のとおりに行った：９５℃で３０秒間変性させ、５０℃で１分 間アニーリングし、７２℃で１分間伸長させる。このサイクルを、３５回反復し た。この方法で、約７００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅させ、次いでプラスミドベク ターｐＧＥＭ−Ｔにクローン化した。配列分析は、アラビドプシス タリアナか ら単離されたＤＮＡ断片（配列番号：１３）が、６８７ｂｐの長さであり、また リコペルシコン エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎ ｔｕｍ）からのＬｓ遺伝子と高度の配列類似性を有することを示した。ＤＮＡレ ベルについて、アラビドプシス タリアナＤＮＡ断片は、トマトのＬｓ遺伝子に 対して約６３％の配列同一性を示す。蛋白質レベルについて、アミノ酸の約５５ ％が同一である。この単離されたＤＮＡ断片（配列番号：１３）によりコードさ れるアミノ酸配列は、配列番号：１４に示されている。この単離されたＤＮＡ断 片を使用することによって、アラビドプシス タリアナからのＬｓ相同遺伝子を 、常習的分子生物学的方法を用いて単離することができる。 ＊変性されたプライマーの描写において、ＷＩＰＯ標準Ｓｔ．２３を使用した ： Ｒ＝Ａ ＋ Ｇ Ｎ＝Ａ ＋ Ｇ ＋ Ｃ ＋ Ｔ Ｙ＝Ｃ ＋ Ｔ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．側芽条形成および／または花弁形成および／または離層形成の制御に寄与す る配列番号：１、９または１３に示されるヌクレオチド配列、または、 該ヌクレオチド配列の断片もしくは誘導体または該ヌクレオチド配列とハイブ リダイズするヌクレオチド配列であって、側芽条形成および／または花弁形成お よび／または離層形成の制御に寄与する断片もしくは誘導体またはヌクレオチド 配列。 ２．配列番号：１、９または１３に示されるヌクレオチド配列とストリンジェン トな条件下にてハイブリダイズする請求項１に記載のハイブリッド形成性のヌク レオチド配列。 ３．配列番号：１、９または１３で示されるヌクレオチド配列。 ４．配列番号：２、１０または１４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチ ド。 ５．請求項１〜３のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含有するベクター 。 ６．形質転換された植物細胞または形質転換された植物組織であって、請求項１ または２のいずれか一項に記載の側芽条形成および／または花弁形成および／ま たは離層形成の制御に寄与する発現性ＤＮＡ配列、またはその断片もしくは誘導 体が、安定に、植物細胞または植物組織のゲノム中に組込まれていることを特徴 とする、植物細胞または植物組織。 ７．種子産生性植物に再生させることができる、請求項６に記載の植物細胞また は植物組織。 ８．側芽条形成および／または花弁形成および／または離層形成が制御された植 物の作製方法であって、 請求項１または２のいずれか一項に記載の側芽条形成および／または花弁形成 および／または離層形成の制御に寄与する少なくとも１つの発現性ＤＮＡ配列ま たはその断片もしくは誘導体を植物細胞または植物組織のゲノムへ安定に組込む 行程および 該植物細胞または植物組織を植物体に再生させる行程を有することを特徴とす る、植物の作製方法。 ９．側芽条形成および／または花弁形成および／または離層形成を抑制するＤＮ Ａ配列、またはその断片もしくは誘導体を、組込みに使用する、請求項８に記載 の植物の作製方法。 １０．組込まれたＤＮＡ配列またはその断片もしくは誘導体を、側芽条形成およ び／または花弁形成および／または離層形成の制御に寄与する内在配列に対して 、アンチャンスに発現させる、請求項９に記載の植物の作製方法。 １１．組込まれたＤＮＡ配列またはその断片もしくは誘導体を、側芽条形成およ び／または花弁形成および／または離層形成の制御に寄与する内在配列に対して 、センスに発現させる、請求項９に記載の植物の作製方法。 １２．側芽条形成性および／または花弁形成性および／または離層形成性を、組 込まれたＤＮＡ配列、またはその断片もしくは誘導体を含有するリボザイムによ り抑制する、請求項９に記載の植物の作製方法。 １３．ＤＮＡ配列、またはその断片あるいは誘導体を、相同組換えによって相同 内在遺伝子のゲノム領域に組込む、請求項９に記載の植物の作製方法。 １４．側芽条形成性および／または花弁形成性および／または離層形成性を増強 するＤＮＡ配列、またはその断片もしくは誘導体を、組込みに使用する、請求項 ８に記載の植物の作製方法。 １５．組込まれたＤＮＡ配列またはその断片もしくは誘導体を、側芽条形成およ び／または花弁形成および／または離層形成の制御に寄与する内在配列に対して 、センスに発現させる、請求項１４に記載の植物の作製方法。 １６．植物として、トマト植物、セイヨウアブラナ植物、ジャガイモ植物もしく はキンギョソウ植物、またはそれらの細胞もしくは組織を使用する、請求項８〜 １５のいずれか一項に記載の植物の作製方法。 １７．請求項８〜１６のいずれか一項に記載の方法により得られる植物。 １８．請求項１７に記載の植物から得られる種子ストック。